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ITAJAÍ - 2005
2
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí
Como parte dos requisitos para a
Obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências
Farmacêuticas, Área de Concentração em Produtos Naturais, e aprovada em sua forma final
pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________
Valdir Cechinel Filho, Dr.
__________________________________________________________
Tania Mari Bellé Bresolin, Dra.
Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora:
______________________________________
Valdir Cechinel Filho, Dr.
Presidente
______________________________________
Brás H. de Oliveira, Dr.
______________________________________
Ângela Malheiros, Dra.
4
AGRADECIMENTOS
... Ao Ângelo, pelo amor, compreensão, dedicação e estímulo. Você foi o alicerce para
... À minha mãe por suas orações, força e pelo amor incondicional em todos os momentos de
minha vida.
... À família e aos amigos pelas orações e torcida, especialmente ao pessoal da farmácia e Pe
Alcides.
... Aos professores do NIQFAR por toda a amizade, por todos os ensinamentos e apoio na
farmacológicos.
... Aos professores da banca interna, em especial Ângela e Márcia pelas considerações.
.... Aos colegas de sala, pela amizade e apoio, especialmente Karina, companheira de
bancada.
... Ao professor e amigo Cechinel, pela parceria e confiança em mais uma etapa de minha
formação.
... A todos que de alguma forma me auxiliaram ou torceram por mim, cujos nomes são muitos
e que posso ter esquecido, todo o meu carinho e meu muito obrigada por tudo.
5
Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
RESUMO
Simaba ferruginea (Calunga) é uma espécie típica do cerrado brasileiro, cujos rizomas são
utilizados para tratar diarréias, úlceras gástricas, febres.Com este estudo objetiva-se investigar
a constituição química e atividade farmacológica das folhas e rizomas de S. ferruginea. Os
materiais vegetais foram macerados separadamente com metanol, de onde foram preparados
os extratos metanólicos brutos (EMB), que após particionados renderam as frações hexano
(H), diclorometano (DCM) e acetato de etila (AE) das folhas e rizomas. Dos rizomas foi
obtido também a fração alcaloídica (FA). As frações foram purificadas e analisadas através de
métodos cromatográficos. Os compostos puros foram identificados através de técnicas
espectroscópicas. Os EMB, frações e compostos isolados foram avaliados quanto à atividade
antiúlcera (úlcera induzida por etanol e indometacina) e atividade antinociceptiva (modelo de
contorções abdominais/ácido acético). Das frações H, DCM e FA dos rizomas, foram isolados
os alcalóides: cantin-6-ona e 4-metoxicantin-6-ona. Da fração H das folhas foi isolado o -
sitosterol e da fração AE a quercitrina. Na ulceração induzida por etanol, o EMB dos rizomas
e folhas apresentaram inibição acima de 80 % assim como a fração alcaloídica, que foi efetiva
em diferentes vias de administração, superando a ação dos alcalóides isolados ou associados.
Na ulceração induzida por indometacina somente a fração DCM-RA foi efetiva. Ambos os
alcalóides apresentaram significante antinocicepção. Conclui-se que a S. ferruginea apresenta
atividade antiulcerogênica, principalmente os rizomas cuja atividade é atribuída aos
alcalóides. Esses resultados confirmam os dados etnofarmacológicos sobre a planta.
6
Simaba ferruginea (calunga) is a typical species of Brazilian Cerrado, and the rhizomes are
used to treat diarrhea, gastric ulcer, fever, among other. The aim of the present study was the
examination of the chemical composition and pharmacological activity of leaves and rhizome
of S. ferruginea. The plant material was macerated with methanol, and the respective
methanolic extracts (EMB) were sucessively partitioned with n-hexane (H), dichloromethane
(DCM) and ethyl acetate (EA), giving the respective fractions of leaves and rhizome. From
rhizome it was obtained the alkaloid fraction (FA). The fractions were fractioned through
chromatographic methods, and the isolated compounds were identified by spectroscopic data.
The EMB, fractions and isolated compounds were examined for the possible gastric ulcer
activity (induced by ethanol and indomethacin) and antinociceptive activity (writhing test).
From H, DCM and FA (rhizome) were isolated the following alkaloids: canthin-6-one and
4-metoxicanthin-6-one. From H fraction (leaves) was isolated the β-sitosterol and from EA
fraction it was isolated the the quercitrin. In the ulceration induced by ethanol, the EMB from
rhizome and leaves presented approximately 80 % of inhibition in the ulceration. The FA
fraction was effective in the distinct administration form. The FA fraction was more effective
than isolated for associated alkaloids. In the ulceration induced by indomethacin, only DCM-
RA fraction was effective. The alkaloids presented significant antinociceptive activity. In
conclusion, S. ferruginea present promising antiulcerogenic activity, specially the rhizome,
which is related to the presence of the alkaloids. These results confirm and justify the
ethnophamacological data about this plant.
7
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................01
2 OBJETIVOS ...................................................................................................................03
2.1 Objetivo geral................................................................................................................03
2.2 Objetivo específico........................................................................................................03
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...................................................................................04
3.1 Importância das plantas medicinais............................................................................04
3.2 Biomas brasileiros: Cerrado ...................................................................................... 08
3.3 Família Simaroubaceae .............................................................................................. 09
3.3.1 Simaba multiflora ...................................................................................................... 10
3.3.2 Simaba orinocensis ................................................................................................... 10
3.3.3 Simaba guianensis …………………………….……………………………………11
3.3.4 Simaba cuspidata ……………………………….…………………………………. 11
3.3.5 Simaba cedron …………………………………………………………………....... 11
3.3.6 Simaba polyphylla .....………………………….………………..…………………. 14
3.3.7 Simaba subcymosa .................................................................................................... 14
3.3.8 Simaba ferruginea St. Hil.......................................................................................... 14
3.3.9 Outros gêneros relevantes da família Simaroubaceae .......................................... 15
4 METODOLOGIA .......................................................................................................... 17
4.1 Análise fitoquímicados rizomas.................................................................................. 17
4.1.1 Material vegetal......................................................................................................... 17
4.1.2 Preparação do extrato bruto.................................................................................... 17
4.1.3 Obtenção das frações................................................................................................ 17
4.1.4 Análise cromatográfica............................................................................................. 18
4.1.5 Separação e purificação dos compostos.................................................................. 18
4.1.6 Identificação e elucidação estrutural dos compostos isolados............................... 19
4.2 Análise fitoquímica das folhas .................................................................................... 19
4.2.1 Material vegetal ........................................................................................................ 19
4.2.2 Obtenção dos extratos ... .......................................................................................... 19
4.2.3 Preparação das frações ............................................................................................ 20
4.2.4 Análise cromatográfica ............................................................................................ 20
4.2.5 Separação e purificação dos compostos ................................................................. 20
4.2.6 Identificação dos compostos isolados...................................................................... 20
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LISTA DE FIGURAS
1 INTRODUÇÃO
2 OBJETIVOS
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
o uso racional, já que são empregados para tratar diversas patologias, sendo as mais comuns:
problemas alérgicos, respiratórios, digestivos, insônia, ansiedade, depressão e outros
(SIMÕES; SCHNKEL, 2001; ANVISA, 2004).
Para o desenvolvimento de um fitoterápico ou sua adequação às leis vigentes, a
indústria farmacêutica necessita de pessoas com qualificação em diversas áreas, muitas vezes
estabelecendo parcerias com universidades, a fim de reunir pesquisadores que trabalhem com
grupos multidisciplinares. Estes trabalhos de cooperação, visam agilizar e garantir o sucesso
no desenvolvimento das pesquisas, as quais iniciam com a identificação da espécie vegetal até
o desenvolvimento final do fitoterápico, envolvendo diversas áreas do conhecimento como:
botânica, química orgânica, farmacologia, química medicinal, farmacotécnica e outras
(MARQUES, 1999; MACIEL et al., 2002; CAÑIGUERAL, 2002; MORAES, 2003).
Cabe ressaltar que, o uso indiscriminado de fitoterápicos e de plantas medicinais in
natura para fins curativos tem ocasionado muitas intoxicações, sendo a hipersensibilidade e a
hepatotoxicidade os efeitos indesejáveis mais comuns. Pesquisas demonstram que
determinadas plantas são potencialmente perigosas devido aos efeitos tóxicos de algumas
substâncias naturalmente presentes nestas. As intoxicações podem ocorrer ainda por
adulterações, pelo uso errado de uma planta devido ao equívoco na identificação das espécies
(RATES, 2001a,b; SARDESAI, 2002; VEIGA JUNIOR et al., 2005).
O consumo exacerbado e predatório de plantas medicinais tem promovido à
degradação do meio ambiente e a extinção de muitas espécies, ainda que a diversidade da
flora brasileira seja imensa, porém não consegue regenerar-se tão fugazmente quanto à mão
destruidora do homem (RATES, 2001a,b; KINGHORN, 2002; SIMÕES et al., 2002).
A biodiversidade vegetal do Brasil tem atraído investimentos de grandes grupos de
indústrias farmacêuticas com o propósito de obterem novos medicamentos, mas tem sido alvo
também, da biopirataria, especialmente de espécies vegetais da Amazônia. Tal evento
demonstra a necessidade de uma política governamental que incentive os grupos de pesquisa
do país, a explorarem de forma sustentável, a biodiversidade vegetal, e criar formas de
fiscalizar e punir a degradação da fauna e flora brasileira e o envio de plantas para o exterior
(KATO, 2001).
Quanto a biopirataria, deve-se salientar também, a dificuldade em realizar trabalhos de
colaboração com determinados grupos estrangeiros, os quais nem sempre visam o mesmo
objetivo. No entanto, muitos trabalhos realizados em colaboração são essenciais devido a
equipamentos e metodologias de alta tecnologia, disponíveis nos países desenvolvidos, onde
os grupos de pesquisa recebem apoio financeiro do governo e instituições privadas. Outro
17
O Brasil, por ser detentor de uma grande diversidade vegetal, possui um enorme
potencial para o desenvolvimento de novos medicamentos (sejam fitoterápicos ou moléculas
isoladas) a partir de suas plantas medicinais. O Brasil abriga cerca de 50 mil espécies de
plantas superiores, distribuídas em grandes biomas, como a Amazônia com 25-30 mil
espécies, a Mata Atlântica com 16 mil, o Cerrado com 7 mil, e as demais espécies distribuídas
na Caatinga e na Floresta Subtropical (VIEIRA; MARTINS, 2002).
Além da floresta Amazônica, bioma brasileiro com maior destaque nacional e
internacional devido à diversidade biológica, e principalmente pela grande área territorial e
reserva de água doce, o Cerrado e a Mata Atlântica destacam-se pela biodiversidade, e
também, pelas imensas áreas de matas destruídas pelo avanço da ocupação humana e suas
atividades exploratórias (VIEIRA, 1999; VIEIRA; MARTINS, 2002).
O cerrado é o segundo maior bioma do Brasil. Ocupa uma área de aproximadamente 2
milhões de km2, e apenas 1,5 % desta extensão está protegida por lei. “É considerado um
complexo vegetacional de grande heterogeneidade fito fisionômica” (GUARIM NETO;
MORAIS, 2003).
A diversidade de táxons no Cerrado ressalta ainda mais a importância de pesquisas
com plantas, porque quanto maior a diversidade taxonômica em níveis superiores, maior é o
distanciamento filogenético entre as espécies e maior a diferença e diversidade química entre
as plantas, indicando o forte potencial desta região para a descoberta de novos agentes
terapêuticos (Ibidem).
No Brasil, o número de pesquisadores que atuam nessa nova realidade de pesquisa é
expressivo, e pode ser comprovado pela considerável quantidade de artigos publicados por
autores brasileiros em revistas nacionais e internacionais do ramo. Isso mostra que há uma
consciência sobre o potencial da biodiversidade brasileira, portanto um celeiro para a busca de
novas substâncias. Embora os pesquisadores tenham a mão a matéria-prima mais abundante e
diversificada do planeta, deve-se priorizar os estudos nas áreas com elevada degradação
18
ambiental, cujas espécies que apresentam maior risco de extinção concentram-se no Cerrado e
Mata Atlântica (PINTO et al., 2002).
A importância de se estudar estes ecossistemas, visa não somente o conhecimento do
seu perfil químico e a descoberta de novas substâncias úteis ao homem, mas também sua
preservação (PINTO et al., 2002; GUARIM NETO; MORAIS, 2003).
A flora do Estado de Mato Grosso caracteriza-se por uma grande diversidade de
espécies sendo formada pelas áreas biogeográficas do Cerrado, Pantanal, Amazônia e áreas de
transição, sendo que a presença de árvores de médio e grande porte é uma das características
mais significantes da região (LEITZKE; GUARIM NETO, 2002).
Visto o alto grau de endemismo que cada estado possui em relação a certas espécies do
cerrado, algumas espécies são comuns a todos os estados e outras são particulares de cada um.
São relatadas 561 espécies vegetais para este bioma (GUARIM NETO; MORAIS, 2003).
(13) poliandrol
A espécie Eurycoma longifolia Jack vem sendo amplamente citada na literatura devido
à presença de vários constituintes com atividade citotóxica e antimalárica, sendo esta última
propriedade terapêutica mencionada na medicina tradicional. Das raízes desta planta foram
isolados inúmeros compostos: quassinóides (euricomanona, 13,21-dihidroeuricomanona, 13-α
-(21)-epoxieuricomanona, euricomalactona, euricolactona D, E, F) e os alcalóides (9-
hidroxicantin-6-ona (15), 9-metoxicantin-6-ona (16), 1-hidroxi-9-metoxicantin-6-ona (17), 5-
hidroximetil-9-metoxicantin-6-ona (18), 9-metoxicantin-6-ona-N-oxide), (KARDONO et al.,
1991; ANG et al., 2002; CHOO et al., 2002; TAN et al., 2002; KUO et al., 2003; CHAN
et al., 2004).
Das folhas de Eurycoma longifolia foram isolados alguns quassinóides como: 14,15β-
dihidroxikalaineanona, 15-β-O-acetil-14-hidroxikalaineanona, longilactona, os quais
apresentaram atividades antiesquistossomal, antitumoral e antimalárica (JIWAJINDA et al.,
2002).
Estudos com o lenho da Quassia amara L. tem demonstrado atividade inibitória da
secreção basal do hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH) e também redução
25
dos níveis de testosterona pelas células Leydig em teste in vitro e in vivo, cujo efeito biológico
foi similar entre os compostos 2-metoxicantin-6-ona (19) e quassina, ambos isolados desta
planta e que demonstraram efeitos antifertilidade (NJAR et al., 1995; RAJI, BOLARINWA,
1997).
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(19) 2-metoxicantin-6-ona
26
4 METODOLOGIA
estacionária. Para purificação de subfrações muito polares, foi utilizado como fase
estacionária o polímero Sephadex LH-20, cujo mecanismo de separação é a exclusão de
tamanho.
Os eluentes da fase móvel foram selecionados de acordo com a análise feita em CCD,
tendo aumento gradual de polaridade conforme a fração utilizada. O eluente mais o produto
carreado foram recolhidos por gotejamento em frascos de aproximadamente 10 mL,
numerados seqüencialmente, sendo que cada frasco foi analisado por CCD. Após a análise do
perfil cromatográfico, os frascos semelhantes foram reunidos formando uma subfração, sendo
que as que se encontravam com maior grau de pureza e bom rendimento, foram novamente
cromatografadas até obtenção de compostos puros.
Simaba ferruginea
(rizoma- 1kg)
Fração AE (0,6 g)
Fração Hexano (4,16 g) Fração DCM (1,53 g)
CC sílica gel CC sílica gel
1,5 g 1g
4-9
(450 mg) 66-110 12-54 (87 mg)
(127 mg) 55-174 (83 mg)
5 sub-frações 4 sub-frações
C
C
A
175-246
(136 mg)
10-40
(250 mg)
140-179
(45 mg)
D
5 sub-frações
B
D
Figura 2: Fluxograma dos processos realizados com o extrato bruto dos rizomas de Simaba
ferruginea (DCM: diclorometano, AE: acetato de etila).
31
Simaba ferruginea
(rizomas- 1kg)
Fração de Clorofórmio
Resíduo Ext. Bruto Alcalino Alcalina (500 mL)
CHCl3 Fração
ácido Aquosa
Res. Ext. Bruto Fr. AE ( 467 mg) Alcalinização e extração
com CHCl3
Simaba ferruginea
(folhas – 400 g)
Fração DCM
Fração Hexano (2,2 g) (0,857 g) Fração AE (4,42 g)
FB FB + outro
composto
Vários FA Vários
Compostos Compostos
FB
Figura 4: Fluxograma dos processos de preparação das frações e purificação dos compostos
isolados das folhas de Simaba ferruginea.
Quadro 1: Escores para avaliação das lesões gástricas induzidas por indometacina
ÍTENS ATRIBUIÇÕES DE
ANALISADOS ESCORES
a) Coloração da Normal Hiperêmica Descorada
mucosa (0 ponto) (1 ponto) (1 ponto)
b) Perda de pregas (1ponto)
da mucosa
c) Petéquias Leve Moderado Intenso
(1ponto) (2 pontos) (3 pontos)
d) Edema Leve Moderado Intenso
(1ponto) (2 pontos) (3 pontos)
e) Hemorragia Leve Moderado Intenso
(1ponto) (2 pontos) (3 pontos)
f) Perda de muco Leve Moderado Intenso
(1ponto) (2 pontos) (3 pontos)
g) Lesões necro- Até 1 mm Maior que 1mm Perfuradas
hemorrágicas (úlcera (ponto) (1,5pontos x mm) (5pontos x mm)
Foi considerado o grau de lesão leve quando a área afetada foi < 25 %, moderado =50% e
intensa > 50 %.
Os dados dos gráficos foram expressos em Média ± Erro Padrão Médio. Aos dados
não paramétricos, usou-se a mediana com os limites mínimo e máximo.
A comparação entre duas médias foi realizada através do teste “T” de Student, não
pareado, bicaudal. Para comparação múltipla dos dados paramétricos foi utilizada a análise de
variância (ANOVA), seguida de Student-Newman-Keuls.
Em todas as análises estatísticas, considerou-se o nível crítico para rejeição da hipótese
de nulidade menor que 0,05 (p<0,05). Os asterísticos (* p< 0,05; ** p < 0,01 e *** p <0,001)
serviram para caracterizar o grau de significância estatística entre o grupo controle e o grupo
analisado (STUDENT, 1908; SNEDECOR, 1963).
36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Quadro 2: Perfil fitoquímico das frações das folhas e rizomas de S. ferruginea observados em
CCD através de reveladores específicos para algumas classes de compostos.
Frações Anisaldeído FeCl3 Dragendorff KOH
Hexano rizomas XXX - XX -
DCM rizomas XX - XXX -
AE rizomas X X - -
Hexano folhas XXX - - -
DCM folhas XXX - - -
AE folhas - XXX - -
Desenvolvimento de “n” manchas coloridas: X (1-2 ), XX (até 4), XXX (várias e ou predominantes)
A) Fração Hexano
A partir de processo cromatográfico em coluna aberta (CC) com sílica gel como fase
estacionária, e proporções distintas e crescentes de hexano/ acetona como fase móvel, obteve-
se 9 subfrações que foram analisadas por CCD, e as que apresentaram maior rendimento e
melhor perfil, foram recromatografadas.
38
A subfração 4-9 (450 mg) rendeu mais 5 subfrações (A-E) após recromatografada,
sendo que a subfração 4-9 B (78 mg) que apresentava-se mais pura, tratava-se de uma mistura
de ácidos graxos insaturados (A), assim como as demais subfrações oriundas desta CC.
A subfração 10-40 (250 mg) quando recromatografada também rendeu 5 subfrações
(A-E), sendo que a subfração 10-40 A (82 mg), foi novamente recromatografada, mas não
houve sucesso na purificação, mas provavelmente há presença de resíduos de ácidos graxos e
esteróides (B), pois algumas manchas reveladas com anisaldeído, apresentaram o mesmo Rf
de esteróides comumente encontrados nas plantas.
Após recromatografar a subfração 66-110 (127 mg) com sílica gel e hexano / acetona,
obteve-se 17 mg do composto C, encontrado posteriormente com maior rendimento nas
frações DCM, DCM-RA, AE-RA e fração alcaloídica. Da subfração 140-179 (45 mg) após
cromatografia obteve-se o composto D (9 mg), o qual também foi isolado nas frações citadas
acima.
B) Fração DCM
Esta fração (1 g) foi cromatografada em CC de sílica gel, hexano / acetona, rendendo 5
subfrações: 1-11 (21 mg), 12-54 (87 mg), 55-174 (83 mg), 175-246 (136 mg), 247-300 (49
mg). Três destas subfrações foram novamente recromatografadas, devido melhor rendimento
e melhor perfil fitoquímico observado em CCD.
Da subfração 12-54 (87 mg) obteve-se 4 subfrações (A-D), cuja subfração 12-54 C foi
lavada com metanol gelado, e o composto obtido provavelmente é uma mistura dos esteróides
estigmasterol e β-sitosterol (22 mg).
A subfração 55-174 (83 mg) quando purificada rendeu 5 subfrações, sendo a subfração
A foi identificada como sendo o composto C (12 mg), e as demais subfrações 55-174 B-E não
apresentaram-se puras.
Obteve-se 6 subfrações da subfração 175-246 (136 mg), sendo a subfração 175-246 C
(11 mg) identificada como sendo o composto D, e a subfração 175-246 E, uma mistura do
composto D com outro alcalóide não identificado, que devido Rf muito semelhante não foi
possível isolar.
// /
/6 0
5
4
3 1
2
(20) Cantin-6-ona
- sinais em 135,23; 139,6; 124,4; 130,3; 132,0 correspondem aos respectivos carbonos
quaternários C3a, C7a, 11 a,b,c, sendo os carbonos mais próximos ao nitrogênio com maior
deslocamento.
- o sinal em 159,5 ppm é relativo ao C6 (carbonila).
Tabela 01: Valores dos deslocamentos químicos (ppm) de 13C e 1H para o alcalóide cantin-6-
ona conforme dados da literatura e valores obtidos para o composto C.
13 1
Carbono C H (J=Hz) Composto C Composto C
13 1
DMSO-d6 CDCl3 CDCl3 - C CDCl3 - H (J=Hz)
C
3a 135,53 136,23
6 158,21 159,5
7a 138,24 139,6
11a 123,63 124,4
11b 129,43 130,3
11c 130,91 132,0
CH
1 115,90 7,59 (d J =5,0) 116,42 7,97 (d J= 5,0)
2 145,33 8,58 (d J = 5,0) 145,85 8,83 (d J= 5,0)
4 139,00 7,77 (d J = 9,7) 144,08 8,01 (d J= 9,8)
5 128,37 6,75 (d J = 9,7) 128,94 7,00 (d J= 9,8)
8 116,60 8,28 (d J = 7,7) 117,32 8,69 (d J= 7,7)
9 130,29 7,45 (t J =7,7) 130,89 7,53 (td J= 7,5; 1,1)
10 125,13 7,28 (t J =7,7) 125,67 7,71 (td J= 7,5; 1,1)
11 122,03 7,73 (d J = 7,7) 122,66 8,12 (d J= 7,7)
Fonte: KOIKE; OHMOTO, 1985; FACUNDO et al., 2002.
41
Este alcalóide foi isolado sob a forma de pó amorfo e cristais de coloração amarela,
solúvel em acetona. Detectado em CCD quando eluído com hexano/acetona (6:4) e revelado
com Dragendorff, cuja reação demonstrava forte cor laranja.
88 8
<
9
; 7
:
(21) 4-metoxicantin-6-ona
13
Tabela 02: Valores dos deslocamentos químicos (ppm) de C e 1H para o alcalóide 4,5-
dimetoxicantin-6-ona conforme dados da literatura e valores obtidos para o composto D.
13 1
Carbono C H (J= Hz) Composto D Composto D
13 1
CDCl3 CDCl3 CDCl3 - C CDCl3 - H (J = Hz)
C
3a 132,71 136,28
4 152,05 154,34
6 157,43 155,2
7a 138,22 139,81
11a 123,96 124,88
11b 129,15 129,58
11c 127,61 127,20
CH
1 114,89 7,47 (d J =5,0) 113,87 8,07 ( d J= 5,0)
2 144,48 8,54 (d J = 5,0) 145,33 8,77 ( d J= 5,0)
5 127,98 - 109,73 7,31
8 116,24 8,16 (d J = 7,7) 117,07 8,64 (d J= 7,7)
9 130,01 7,37 (t J =7,7) 130,47 7,78 (dt J= 7,5; 1,1)
10 124,59 7,19 (t J =7,7) 125,77 7,63 (dt J= 7,5; 1,1)
11 121,78 7,54 (d J = 7,7) 122,57 8,33 (d J= 7,7)
CH3
4-OCH3 61,17 4,40 (s) 56,63 4,07
Fonte: KOIKE; OHMOTO, 1985; FACUNDO et al., 2002.
48
A) Fração alcaloídica
Foi cromatografado 300 mg desta fração em CC de sílica gel, eluída com hexano /
acetona, onde obteve-se 4 subfrações: 2-7 (19 mg), 8-16 (10 mg), 17-80 (34 mg) e 81-113 (29
mg). Devido ao baixo rendimento, ficou inviável a purificação destas subfrações, mas através
de CCD, eluída sempre com a mistura Hexano / Acetona 6:4 e revelada com Dragendorff,
constatou-se que a subfração 2-7 continha 4-metoxicantin-6-ona e outro alcalóide, assim
49
como a subfração 17-80 é constituída por cantin-6-ona mais outro alcalóide, com Rf distinto
do alcalóide observado na subfração 2-7.
Mesmo não sendo possível o isolamento e a identificação destes dois alcalóides
presentes nesta fração, a constatação da presença de outros alcalóides foi muito importante,
pois justificam as atividades farmacológicas encontradas e discutidas mais adiante, visto que,
os alcalóides cantin-6-ona e 4-metoxicantin-6-ona são os compostos majoritários na planta,
mas podem ter suas propriedades terapêuticas potencializadas por outros alcalóides, mesmo
que estes encontrem-se em quantidade muito pequena, o que é muito comum para esta classe
de metabólitos, que muitas vezes até são relatados como ausentes em determinadas plantas
devido ao baixo rendimento e difícil detecção.
B) Fração PPT
Utilizou-se 2,5 g desta fração para cromatografia em coluna aberta com sílica gel,
eluída com hexano / acetona com aumento gradativo de polaridade. Obteve-se 10 subfrações:
1-6 (369 mg), 7-13 (110 mg), 14-56 (225 mg), 57-69 (46 mg), 70-99 (130 mg), 100-102 (4
mg), 103-140 (31 mg), 141-159 (12 mg), 160-221 (90 mg), 222-250 (497 mg). Estas
subfrações foram analisadas em CCD com vários reveladores, onde detectou-se a presença
majoritária dos dois alcalóides já identificados e também da presença de outros alcalóides,
sendo que alguns provavelmente são os mesmos obtidos na fração alcaloídica segundo Rf
destes.
Da subfração 14-56 após recromatografada obteve-se o alcalóide cantin-6-ona (179
mg) e, da subfração 70-99, 188 mg de 4-metoxicantin-6-ona.
C) Fração DCM-RA
D) Fração AE-RA
E) Fração Butanólica
Esta fração foi cromatografada em sílica gel, eluída com clorofórmio / metanol em
diversas proporções, ainda que a grande maioria dos compostos ficaram retidos na sílica,
devido à alta polaridade destes. Obteve-se 6 subfrações: 1-14 (24 mg), 15-27 (26 mg), 28-40
(92 mg), 41-62 (234 mg), 63-74 (209 mg), 75-111 (30 mg).
A subfração 41-62 foi recromatografada em CC com Sephadex LH-20 que rendeu
mais 7 subfrações (A-G), sendo que a subfração 41-62 E, foi novamente recromatografada em
Sephadex LH-20, que assim como as demais, não houve sucesso no isolamento de compostos,
senão açúcares, detectados através de análises espectroscópicas.
Os resultados obtidos da análise fitoquímica dos rizomas da S. ferruginea, permitem
afirmar que a constituição majoritária desta parte da planta são os alcalóides cantin-6-ona e 4-
metoxicantin-6-ona, além de outros alcalóides evidenciados em CCD, porém alguns não
foram isolados e dois obtiveram rendimento de 2 mg, não sendo possível identificá-los.
Observou-se através da revisão bibliográfica, que a família Simaroubaceae, bem como
o gênero Simaba, apresentam inúmeros triterpenóides do tipo quassinóides, geralmente
responsáveis pelo sabor amargo da planta e por inúmeras atividades biológicas, como:
antiinflamatória, antiparasitária, antitumoral, antimalárica, citotóxica, amebicida, fungicida,
inseticida, etc (MORETTI et al., 1994; OZEKI et al., 1998; JIWAJINDA et al., 2003;
TAMURA et al., 2003).
A S. ferruginea, provavelmente deve apresentar compostos do tipo quassinóides em
sua constituição, mas em concentração relativamente baixa, pois foi observado em CCD, a
presença de compostos terpenóides, ainda que não foram isolados, devido ao baixo
rendimento das subfrações após procedimento cromatográfico de purificação em sílica. Além
disso, o intenso sabor amargo da S. ferruginea, é outro indicativo da presença destes
compostos, característica organoléptica atribuída a esta classe de compostos, explicando o
porquê da denominação féo-da-terra.
Sendo assim, a composição química dos rizomas de S. ferruginea, diferem
significativamente da maioria das espécies do gênero Simaba, pois na literatura, apenas outras
duas espécies, S. multiflora e S. polyphylla, apresentam relatos de que em sua constituição
química são encontrados alcalóides, pois nestas espécies, os compostos predominantes
também são os quassinóides. Outro aspecto importante, é a concentração destes alcalóides nos
rizomas, dos quais foram isolados mais de 200 mg de cada, quantidade considerada
51
A) Fração Hexano
A partir de 1,5 g desta fração foi realizada CC de sílica gel eluída com hexano /
acetona, onde obteve-se 7 subfrações: 1-11 (189 mg); 12-18 (81 mg); 19-31 (29 mg); 32-45
(25 mg); 46-153 (127 mg); 154-187 (128 mg) e 188-224 (45 mg). Todas foram analisadas em
CCD, cujos resultados demonstraram a presença de inúmeros compostos em cada subfração.
As subfrações com maior rendimento ou que se encontravam mais puras (22) foram
novamente recromatografadas em CC de sílica gel, sendo que apenas houve êxito na
purificação da subfração 12-18 (81 mg) que rendeu 14 mg do composto FA.
B) Fração DCM
Devido ao baixo rendimento desta fração (0,857 g) não foi realizado procedimento de
purificação, pois em análises de CCD esta fração também apresentou uma diversificada
composição química e nenhum composto majoritário que propiciasse sua purificação.
C) Fração AE
Esta fração foi a que melhor apresentou rendimento (4,42 g), dos quais 2 g foram
utilizados para purificação em CC de sílica gel eluída com CHCl3/ metanol, onde obteve-se 9
subfrações: 1-3 (15 mg); 4-13 (48 mg); 14-24 (146 mg); 25-54 (635 mg); 55-70 (444 mg); 71-
87 (146 mg); 88-144 (298 mg); 145-200 (61 mg).
Algumas subfrações apresentaram um bom rendimento e quando analisadas em CCD
constatou-se a presença majoritária de um composto fenólico dentre os demais. A primeira
subfração eleita para processos de purificação foi a subfração 25-54 (635 mg) por apresentar
maior rendimento e também pelo interesse em isolar o composto majoritário desta subfração.
52
Esta subfração foi eluída com clorofórmio / metanol e rendeu mais 7 subfrações, sendo
uma delas um precipitado de 50 mg do composto FB. Após novos processos de purificação
destas subfrações obteve-se mais 106 mg de FB.
Posteriormente foi cromatografada a subfração 55-70 (200 mg) em CC de sílica gel
eluída com clorofórmio / metanol, mas grande parte da amostra ficou retida na fase
estacionária, obtendo-se 5 subfrações com rendimento muito baixo e ainda impuras.
Visando ainda isolar os compostos fenólicos presentes na amostra, cromatografou-se
os 244 mg restantes da subfração (55-70), em CC com Sephadex LH-20 a fim de separar os
dois compostos majoritários desta subfração, sendo um deles o composto FB. Obteve-se 5
subfrações, sendo a subfração 8-20 (55-70) com rendimento de 130 mg. Esta foi então
recromatografada através de cromatografia em camada delgada centrífuga, utilizando o
aparelho Cromatotron e os eluentes clorofórmio/ metanol num fluxo contínuo de 3,2 mL/
minuto. Deste procedimento cromatográfico obteve-se 6 subfrações, sendo uma delas o
composto FB (26 mg), e novamente insucesso no isolamento do outro composto fenólico
presente na amostra. A subfração que continha a mistura dos dois flavonóides (31 mg) foi
então submetida à cromatografia em camada delgada preparativa, eluída com
clorofórmio/metanol (7:3), da qual também não houve êxito na separação.
A subfração 88-144 (298 mg) foi cromatografada em CC de sílica gel com pressão
(CC “flash”), cuja granulometria da sílica é menor e confere maior resolução e rapidez no
processo de purificação. Obteve-se 8 subfrações, sendo uma delas o composto FB (29 mg), e
as demais subfrações permaneceram impuras e com rendimento inferior a 10 mg, sendo então
reservadas.
> A= ?
=
= ?> > =A?
> =? = > =A?
> =? =
= =
=A@
(22) β-sitosterol
(23) quercitrina
A quercitrina é um flavonóide heterosídico cujo núcleo fundamental apresenta
substituição na posição C-3 por uma hidroxila, por isso, denominado de flavonol. Isolado sob
a forma de pó amorfo e cristais de coloração amarela, com ponto de fusão entre 176-179 ºC.,
num rendimento total de 211 mg.
A identificação deste composto foi realizada através de análises espectrais comparadas
com as citadas em literatura.
Observa-se no espectro de IV (Fig. 10) banda de deformação axial de OH em 3400
cm , em 1656 cm-1 sinal correspondente à deformação axial C= O e em 1610 cm-1
-1
13 1
Tabela 03: Valores dos deslocamentos químicos (ppm) de C e H para a quercitrina
conforme dados da literatura e valores obtidos para o composto FB (piridina-d5).
13 1
Carbono C H (J=Hz) Composto FB Composto FB
CD3OD (100 MHz) DMSO-d6 (600 MHz) 13 1
C H (J=Hz)
2 158,6 - 157,5 -
3 136,3 - 135,8 -
4 179,7 - 178,9 -
5 163,3 - 162,7 13,4
6 99,8 6,3 (d J= 2,0) 99,5 6,7 (d J= 2,0)
7 165,9 - 165,6 -
8 94,7 6,4 (s J= 2,0) 94,3 6,6 (d J= 2,0)
9 159,3 - 158,0 -
10 105,9 - 105,2 -
1` 122,9 - 122,1 -
2` 116,9 7,4 (d J= 2,3) 116,3 8,0 (d J= 2,1)
3` 146,4 - 147,1 -
4` 149,8 - 150,3, -
5` 116,4 7,1 (d J= 8,2) 116,9 7,3 (d J= 8,3)
6` 123,0 7,4 (dd J= 8,2; 2,3) 121,9 7,7 (dd J= 8,3; 2,1)
1a 103,6 5,48 (d J= 1,6) 103,8 6,3 (d J= 1,4)
2a 72,1 4,3 (dd J= 1,6; 3,0) 73,1 5,1 (dd J= 1,5; 2,5)
3a 72,1 3,9 (dd J= 3,2; 9,5) 72,3 4,6 (dd J= 3,3; 9,0)
4a 73,3 3,5 (t J= 9,5) 71,9 4,32 (t)
5a 71,9 3,5 (dd J= 9,5; 6,2) 71,8 4,35 (m)
6a 17,7 1,1 (d J= 6,2) 18,2 1,5 (d J= 6,0)
Fonte: ZHONG et al., 1997.
58
25
20
Índ. Ulceração
15 Controle
MeOH 5 mg/Kg
10
MeOH 20 mg/Kg
82 %
5 *** 95 %
***
Figura 13: Atividade antiúlcera do extrato metanólico bruto de Simaba ferruginea nas doses
de 5 mg/kg e 20 mg/kg administradas via intraperitoneal em relação à ulceração induzida por
etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e
as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01,
p*** < 0,001.
30
20 % 20 %
25 16 %
20 Controle
40 %
Índ. Ulceração
Hex 5 mg/kg
15 Hex 20 mg/kg
DCM 5 mg/kg
10 DCM 20 mg/kg
0
Fração Hexano Fração DCM
(5, 20 mg/kg) (5,20 mg/kg)
Figura 14: Atividade antiúlcera das frações hexano e diclorometano nas doses de 5
mg/kg e 20 mg/kg administradas via oral em relação à ulceração induzida por etanol
50 % (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e
as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p <
0,01.
63
16
14
12
Controle
Índ. Ulceração
10 50 % AE 5 mg/kg
50 %
8 AE 20 mg/kg
DCM-RA 5 mg/kg
6
DCM-RA 20 mg/kg
4 92 %
2
**
0
Fração AE Fração DCM-RA
(5, 20 mg/kg) (5, 20 mg/kg)
Figura 15: Atividade antiúlcera da Fr. AE e DCM-RA de Simaba ferruginea nas doses de 5
mg/kg e 20 mg/kg administradas via oral em relação à ulceração induzida por etanol 50% (10
mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras
verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01, p*** <
0,001.
20
18
16
14
índ. Ulceração
12 Controle
10 66 % F. Alc. 5 mg/kg
8 ** F. Alc. 20 mg/kg
6 80 %
**
4
2
0
Figura 16: Atividade antiúlcera da fração alcaloídica de Simaba ferruginea nas doses de 5
mg/kg e 20 mg/kg administradas via oral em relação à ulceração induzida por etanol 50% (10
mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras
verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01, p*** <
0,001.
25
20 18 %
Índ.Ulceração Controle
15 35 % Fr. Alc.
10 Cantin
76 %
*** 4-MeO-Can
5
Figura 17: Atividade antiúlcera da fração alcaloídica de Simaba ferruginea e dos alcalóides
cantin-6-ona e 4-metoxicantin-6-ona na dose de 5 mg/kg administrados via intraperitoneal em
relação à ulceração induzida por etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo
representa a média de 5 a 7 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente
do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01, p*** < 0,001.
25
20
Índ. Ulceração
Controle
15 53 % Fr. Alc.
* Cantin
10 83 % 76 %
*** *** 4-MeO-Cant
5
0
Figura 18: Atividade antiúlcera da fração alcaloídica de Simaba ferruginea e dos alcalóides
cantin-6-ona e 4-metoxicantin-6-ona na dose de 20 mg/kg administrados via intraperitoneal
em relação à ulceração induzida por etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo
representa a média de 5 a 7 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente
do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01, p* ** < 0,001.
resultado alerta para o fato de que em estudos químico-biológicos os efeitos esperados não
devem concentrar-se somente nos compostos isolados.
Daí a importância de testes com frações semi-purificadas, que por conterem vários
compostos podem apresentar ação sinérgica, seja pela potencialização do efeito de
determinado composto ou por agir através de outros mecanismos, cujo advento final, é uma
resposta terapêutica eficaz e potente, valorizando assim a utilização de fitoterápicos para o
tratamento de muitas enfermidades, e não somente o consumo de fármacos e fitofármacos
(BUTLER, 2005).
A utilização de fitofármacos apresentam-se mais atraentes à indústria farmacêutica e
aos prescritores porque geralmente apresentam propriedades químicas, farmacodinâmicas e
farmacocinéticas amplamente conhecidas e comprovadas, visto que, tais informações nem
sempre podem ser esclarecidas quando há uma mistura de substâncias (fitoterápicos), as quais
podem agir em diversos alvos farmacológicos (MORAES et al., 2003) .
Em decorrência dos diferentes resultados obtidos entre a fração alcaloídica e os
alcalóides, procurou-se avaliar o efeito antiulcerogênico (em camundongos no modelo de
indução por etanol) da associação dos dois alcalóides cantin-6-ona (C) e 4-metoxicantin-6-
ona (D) administrados por diferentes vias (intraperitoneal e oral) a fim de verificar possível
ação sinérgica destes compostos.
O tratamento que associou 2,5 mg/kg de cada alcalóide via intraperitoneal (Fig. 19),
apresentou significativa inibição da ulceração (62 %) quando comparado com o tratamento de
5 mg/kg de cada alcalóide administrado separadamente pela mesma via (C 35 % e D 18 %).
Estes dados demonstram que ocorreu sinergismo, isto é, houve uma potenciação do efeito
antiulcerogênico, já que a inibição da ulceração ocasionada pela interação dos dois alcalóides
foi maior que a soma dos efeitos de cada um, podendo ou não agir pelo mesmo mecanismo de
ação (BARBOSA, YOEM, 2001).
Ainda, na mesma figura (19), observa-se que a outra associação de C + D na dose de
10 mg/kg cada, apresentou uma inibição de 69 % no processo ulcerogênico, não diferindo
muito do tratamento com menor dose (62 %).
67
16
14
Índ. Ulceração 12
10
Controle
61,2 %
8 Cpto C + D (2,5 mg/kg)
** 69,2 %
Cpto C + D (10 mg/kg)
6 **
4
Figura 19: Atividade antiúlcera dos alcalóides cantin-6-ona + 4-metoxicantin-6-ona nas doses
de 2,5 mg/kg cada e 10 mg/kg cada, administradas via intraperitoneal em relação à ulceração
induzida por etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a
7 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, **
p < 0,01, p* ** < 0,001.
Ainda, ao comparar-se os dados da figura acima com as figuras 16,17 e 18, pode-se
constatar que nas duas diferentes vias de tratamento e dose, a fração alcaloídica demonstrou-
se mais efetiva do que os tratamentos com os alcalóides isolados administrados tanto de forma
individual como associados. A provável explicação para o melhor desempenho
antiulcerogênico da fração alcaloídica, deve-se provavelmente a ação sinérgica entre os
demais compostos presentes na fração, mesmo que estes se encontrem em baixíssima
concentração.
Foi avaliada ainda, a atividade antiulcerogênica do tratamento associando os dois
alcalóides (10 mg/kg cada) administrados por vias diferentes (Fig. 20), onde a via oral
demonstrou ser mais efetiva, inibindo 76,9 % da ulceração, sendo somente um pouco menos
efetiva que a fração alcaloídica 20 mg/kg v.o. que inibiu 80%.
68
16
14
12
Índ. Ulceração
10
Controle
8 Cpto C + D (10 mg/kg i.p)
69,2 %
76,9 % Cpto C + D (10 mg/Kg v.o)
6 **
**
4
Figura 20: Atividade antiúlcera dos alcalóides cantin-6-ona + 4-metoxicantin-6-ona nas doses
de 10 mg/kg cada administradas via intraperitoneal e oral em relação à ulceração induzida por
etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e
as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01, p*
** < 0,001.
Os resultados obtidos no modelo de úlcera induzida por etanol, indicam que a fração
alcaloídica, na dose de 20 mg/kg, administrada via oral ou intraperitoneal, é a mais efetiva, e
seu perfil farmacológico assemelha-se ao perfil exibido pela associação dos alcalóides cantin-
6-ona e 4-metoxicantin-6-ona na dose 10 mg/kg cada.
Em um estudo citado em literatura, a atividade antiulcerogênica do extrato etanólico e
das frações hexano e DCM de Quassia amara, são atribuídas aos alcalóides indólicos e β-
carbolinas e aos quassinóides, ambos presentes nos extratos e frações, que inibiram entre 50 à
90 % o processo ulcerogênico induzido por etanol e indometacina (TOMA et al., 2002).
Em outro estudo, Toma e colaboradores (2004), testaram a atividade antiulcerogênica
de um extrato rico em alcalóides pirrolizidínicos administrados via oral frente ao etanol,
indometacina e betanecol, e hipotermia. O extrato alcaloídico apresentou resultados
significativos em todos os testes, sendo que os autores sugeriram que tais efeitos devem-se a
uma cito-proteção e também por outros mecanismos ainda não elucidados.
Deve-se ressaltar que somente os relatos citados acima referiam-se a atividade
antiulcerogênica dos alcalóides. Entretanto, atividades analgésicas, anticolinesterásicas,
colinérgicas, antimaláricas, antineoplásicas e outras, encontram-se amplamente citadas em
literatura (RASKIN et al., 2002).
69
50
45
40
19 % 20 %
35 32 %
Nro contorções
Controle
*
30 Ext. MeOH
25 Fr. Alc.
20 Cantin
15 4-OMe-Cantin
10
5
0
45
40
27 %
35
Nro contorções
30 47 % Controle
20
18
16
14
Índ. Ulceração
12 Controle
10 MeOH 5 mg/kg
8 MeOH 20 mg/kg
6 80 % 80 %
** **
4
2
0
Figura 23: Atividade antiúlcera do extrato metanólico bruto das folhas de Simaba ferruginea
nas doses de 5 mg/kg e 20 mg/kg administrada via oral em relação à ulceração induzida por
etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e
as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01.
16
14
12
Índ. Ulceração
10 41,6 %
Controle
8 66 % Quercitrina 5 mg/kg
** Quercitrina 20 mg/kg
6
Figura 24: Atividade antiúlcera da quercitrina nas doses de 5 mg/kg e 20 mg/kg administrada
via oral em relação à ulceração induzida por etanol 50% (10 mL/kg) em camundongos. Cada
grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere
significativamente do controle, *p < 0,05, ** p < 0,01.
último passo da morte celular induzida pela cascata do glutamato (ISHIGE et al., 2001;
REPETTO, LLESUY, 2002).
Estudos com flavonóides isolados como rutina, quercetina e kaempferol,
demonstraram a inibição dose-dependente dos danos na mucosa gástrica induzida por etanol,
demonstrando o significativo efeito protetor destes compostos sobre a mucosa gástrica
(NARAYANA et al., 2001).
Segundo Sannomiya e colaboradores (2005), num estudo com as folhas de Byrsonima
crassa, os flavonóides presentes no extrato metanólico são os compostos responsáveis pela
inibição de até 93 % da ulceração induzida por etanol para a dose 500 mg/kg. Ainda, deve-se
ressaltar, que os flavonóides isolados neste estudo são todos derivados da quercetina, além da
amentoflavona, catequina e epicatequina.
No modelo de úlcera induzida por indometacina, o extrato, as frações e o composto
quercitrina das folhas, foram administrados via oral, não inibiram a ulceração nas duas doses
testadas. Houve redução dos índices de ulceração, mas não foram significativos
estatisticamente (Quadro 5). Provavelmente, a atividade antiúlcera da quercitrina deve-se
principalmente ao efeito antioxidante, seqüestrando os radicais livres do oxigênio, não sendo
tão efetiva sobre a secreção de muco gástrico, não apresentando atividade neste modelo
(NARAYANA et al., 2001).
Mesmo a composição química das folhas diferindo dos rizomas, observou-se neste
trabalho, que ambas as partes estudadas apresentaram atividade antiúlcera, sendo os alcalóides
isolados dos rizomas mais eficazes e potentes que a quercitrina isolada das folhas, assim como
as respectivas frações dos rizomas e folhas.
Evidencia-se por este estudo, que mais uma vez, são confirmadas as indicações
populares (etnofarmacologia), que apontaram a parte da planta e utilização terapêutica de
77
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8 ANEXOS
8.1 Artigo
87
88
89
90
91