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MECANISMOS DE RECOMBINAO GENTICA Adriana Stein Cardoso Uma importante propriedade do DNA das clulas a sua capacidade de sofrer

r rearranjos, que podem ocasionar desde novas combinaes entre os genes presentes em qualquer genoma individual at alteraes qualitativas e quantitativas na expresso desses genes. Trata-se de uma fonte de variao gentica fundamental para permitir que os organismos evoluam em resposta a mudanas ambientais. Esses rearranjos do DNA so realizados pela recombinao gentica. Duas amplas classes de recombinao so comumente reconhecidas: a recombinao geral e a stio-especfica. Na recombinao geral (ou recombinao homloga), a troca gentica envolve seqncias homlogas (complementares) de DNA. Um dos exemplos mais importantes desse tipo de troca entre cromossomos homlogos (denominado crossing over) acontece na meiose. O crossing-over ocorre entre cromossomos altamente relacionados nos estgios iniciais de desenvolvimento de vulos e espermatozides. A vantagem desse tipo de mistura gnica to grande que cruzamentos e reagrupamentos de genes pela recombinao geral so tambm encontrados em bactria. Na recombinao stio especfica no necessria homologia extensa do DNA. Nesse caso, as trocas ocorridas so curtas. Seqncias especficas de nucleotdeos so reconhecidas por uma enzima de recombinao stio-especfica que altera a posio relativa das seqncias de nucleotdeos nos genomas. RECOMBINAO GERAL Esse tipo de recombinao pode ocorrer em qualquer local ao longo de 2 molculas complementares de DNA. O principal resultado desse processo sempre o mesmo: duas molculas de DNA homlogas sobrepem-se e trocam partes (cross-over), isto , suas hlices duplas quebram-se e as duas extremidades quebradas unem-se com suas parceiras opostas para formar, novamente, duas hlices intactas, cada uma composta por partes das 2 molculas de DNA iniciais. O stio de troca pode ocorrer em qualquer lugar da seqncia homloga de nucleotdeos das 2 molculas de DNA envolvidas. Uma fita de uma das molculas faz pareamento de bases com uma das fitas da outra molcula, criando a juno alternativa (staggered joint), usualmente chamada de juno heterodplex, entre as duas diferentes hlices duplas. (Fig. 1)

Fig. 1 No h alterao nas seqncias de nucleotdeos no stio de troca; a quebra e os eventos de religao ocorrem de uma forma to precisa que no h perda, ganho ou alterao de um nico nucleotdeo. A freqncia de recombinao no constante ao longo de todo o genoma e influenciado por efeitos tanto globais quanto locais ( X , e de ntro do me smo ge noma ). A recombinao necessita de um mecanismo que permita que um dplex interaja com outro dplex homlogo (fitas simples envolvidas) (fig. 2). O mecanismo utilizado provm do modo pelo qual os cidos nuclicos reconhecem um ao outro (complementaridade). Um pareamento extensivo de bases entre dois dplices homlogos s poder ocorrer se um corte primeiramente feito em um deles, deixando a fita livre para os eventos de desenrolamento e enrolamento necessrios formao de um heterodplex com a outra molcula de DNA. Portanto, qualquer evento de troca requer pelo menos duas clivagens, uma em cada uma das fitas das hlices duplas que iro interagir. Finalmente, cada uma das quatro fitas deve ser clivada para permitir que cada uma seja ligada a uma parceira diferente. Na recombinao geral, esses eventos s ocorrem quando duas hlices de DNA dividem uma extensa regio de homologia. Acredita-se que qualquer evento que resulte em quebras na cadeia de DNA estimule o incio de um processo de crossing-over. Por isso, por exemplo, radiao UV aumenta a freqncia de crossing-over na clula, ao criar quebras na fita dupla ou regies de fita simples do DNA. ENZIMAS E MECANISMOS MOLECULARES DA RECOMBINAO GENTICA A ao de conectar 2 molculas de DNA de fita dupla o ponto principal do processo de recombinao. A troca recproca entre as extremidades livres cria uma conexo entre os dois dplices, que formam uma molcula unida. O ponto no qual uma fita de DNA cruza de um ponto para outro chamado de juno recombinante. Uma caracterstica importante de uma juno recombinante a sua capacidade de mover-se ao longo do dplex. Tal mobilidade chamada de migrao da ramificao.(fig. 3) O ponto de ramificao pode migrar em ambas as direes, medida que uma fita deslocada pela outra. Quando a molcula unida rota um dplex em relao ao outro, isso pode ser visualizado em um plano como uma estrutura de Holliday (fig. 4).

Fig.2

Fig. 3

Fig. 4 A molcula unida, formada pela troca de fitas, deve ser resolvida em dois dplices separados. A resoluo necessita de um par de clivagens adicional. Se os cortes forem feitos no par de fitas que no foram originalmente clivadas (o par de fitas que no iniciou a troca), todas as 4 fitas originais so clivadas. Isso resulta em molculas de DNA recombinantes combinada s. Se as mesmas duas fitas envolvidas nas clivagens originais forem clivadas novamente, as outras duas fitas permanecero intactas. As clivagens liberam os dplices parentais, os quais permanecem intactos, salvo que cada um possuir um vestgio do evento de recombinao, na forma de uma regio de heterodplex. Esses recombinantes so chamados de recombinantes remendados. (fig. 5)

Fig. 5 Protena RecA Muito do conhecimento sobre o mecanismo de recombinao homloga devido aos estudos realizados in vitro coma protena RecA de E. coli. RecA possui um papel central na recombinao, atuando tanto como uma protena estrutural como em reaes catalticas. Essa enzima capaz de parear duas molculas de DNA homlogas e catalisar as reaes de trocas de fitas, levando formao do heterodplex de DNA. RecA reconhece especificamente DNA de fita simples e anela esse segmento a uma seqncia complementar de um dplex homlogo, substituindo, simultaneamente, a fita original complementar pela nova fita. Se ATP est presente, a protena RecA do filamento pode, ento, ir desenrolando sucessivamente diferentes partes do dplex, na tentativa de anelar o filamento de fita simples a uma regio desenrolada. Uma vez que uma pequena poro corretamente pareada, usando como molde a cadeia intacta, a energia do ATP direciona a reao de pareamento at o final. A protena RecA deslocada quando a nova molcula de DNA hbrida formada. (fig. 6) A protena RecA possui um papel central na regulao da recombinao gentica, na reparao do DNA e na mutagnese induzida por UV. Estudos demonstraram que a protena RecA ATPase DNA-dependente. No entanto, a reao de troca de fitas isoenergtica (para cada par de bases quebrado, outro par formado) e ocorre mesmo na ausncia de ATP. A protena RecA pode atuar guiando a formao de uma hlice com quatro fitas, composta pelas duas molculas de DNA, acelerando o processo de troca de fitas e permitindo que a juno se mova ao longo de toda a regio do dplex. (fig. 7)

Fig. 6

Fig. 7 Enzimas Acessrias # Protenas RecBCD Complexo protico com potentes atividades nuclesica, de helicase e de ATPase. Uma carcterstica importante dessas protenas que iniciam o processo de desenrolamento e degradao do DNA somente em uma molcula que contenha uma extremidade livre. Tambm foi demonstrado que o complexo RecBCD promove a recombinao com maior freqncia em cadeias de DNA que contm o chamado stio chi, com seqncia 5GCTGGTGG-3. Quando essa seqncia reconhecida, uma atividade endonuclesica especfica de RecBCD cliva uma das fitas de DNA em uma regio prxima ao stio chi. O

reconhecimento desse stio faz com que a subunidade RecD dissocie-se do complexo ou torne-se inativa, ficando o complexo apenas com sua atividade de helicase. # Outras enzimas: - RuvA e RuvB: reconhece junes Holliday, e atua como helicase - RecG: helicase - RuvC: endonuclease, reconhece junes Holliday (tetranucleotdeo ATTG): direciona a resoluo - SSB: protegem o segmento de fita simples da degradao por nucleases at que o processo de pareamento homlogo inicie; - DNA polimerase: preenche as lacunas deixadas quando 2 molculas de DNA recombinantes so clivadas separadamente. - DNA ligase: une os fragmentos deixados pela DNA-polimerase. RECOMBINAO STIO-ESPECFICA Pela sua natureza, o crossing-over geralmente preserva a ordem das seqncias de DNA em cromossomos homlogos. Em casos excepcionais, no entanto, as clulas tambm utilizam um elaborado processo recombinacional de regulao, que tem como conseqncia o rearranjo de seqncias atravs da recombinao direta entre stios especiais. Segmentos de DNA podem ser movidos pela recombinao stio-especfica, resultando, freqentemente, na expresso de diferentes genes ou grupos de genes. A recombinao stio-especfica no envolve extensa homologia entre as seqncias de DNA, como ocorre no crossing-over. Ela necessita apenas que as seqncias de ligao sejam localizadas por enzimas especializadas, que catalisam a quebra e a reunio das molculas. Esse tipo de recombinao iniciado por processos reguladores que tornam as enzimas corretas disponveis. Na recombinao stio-especfica conservativa, uma molcula de DNA clivada em ambas as fitas em dois locais especficos e as extremidades so religadas s suas novas parceiras. O primeiro passo na recombinao stio-especfica a ligao de protenas (recombinases) a alguns ou a todos os elementos de reconhecimento de um ou ambos os stios que iro recombinar. Depois disso esses stios fazem uma sinapse (ou troca de fitas). No necessria homologia entre as partes recombinantes nessa etapa. A complexidade dos sistemas de recombinao stio-especfica varia muito, e cada sistema tem uma recombinase especfica que reconhece as seqncias de DNA. Freqentemente, a regio codificadora dessa recombinase est relacionada com seus stios de reconhecimento e, algumas vezes, com um elemento reforador (enhancer) recombinacional. A estrutura qumica das junes aps a troca de fitas idntica estrutura do substrato inicial, de forma que as etapas de troca de fitas so energeticamente neutras. Regulao da Expresso Gnica atravs da recombinao stio-especfica A recombinao entre os stios de uma nica molcula de DNA pode ter duas conseqncias possveis, dependendo de como os stios envolvidos esto orientados. A recombinao pode remover segmentos intermedirios ou invert-los. (fig. 8) As clulas, em alguns momentos, utilizam a inverso recombinacional para escolher entre dosi arranjos alternativos de DNA, que permitem que diferentes protenas ou grupos de protenas sejam expressados.

Um exemplo bem estudado envolve a expresso alternada de duas protenas flagelares da bactria Salmonella, chamadas H1 e H2, que nunca so expressas simultaneamente. A regio do DNA com repeties (26pb) orientadas em direes opostas ao redor do promotor de H2 parece ser utilizada como guia para a recombinao. Devido s orientaes opostas, o segmento invertido em cada troca. Conforme a sua orientao, o promotor do gene H2 fica frente do gene H2, permitindo sua transcrio, juntamente com outro gene que codifica uma protena que reprime a expresso do gene da protena H1, ou ento fica escondido antes do loco Hin, permitindo a expresso do gene H1. O segmento que invertido codifica a enzima Hin que catalisa a inverso. (Fig. 9)

Fig. 8

Fig. 9 REFERNCIAS 1. STRACHAN T, READ AP. Human Molecular Genetics. Reino Unido. Editora Wiley-Liss, 1997. 2. ZAHA A. Biologia Molecular Bsica. 3 edio, Mercado Aberto; Porto Alegre, 2003. 3. Slides de aula