Regulao da Expresso Gnica em Procariotos

Leila de Mendona Lima Fundamentos da Biologia Molecular 2004

Legionella

E. coli Staphilococcus

De acordo com o conceito estrutural estrito, o genoma considerado como um mosaico de mapas moleculares independentes para a construo de constituintes celulares individuais. Entretanto, na execuo destes mapas, a coordenao evidentemente de valor absoluto para a sobrevivncia. A descoberta de genes reguladores e operadores, e da regulao repressora da atividade de genes estruturais, revela que o genoma contem no somente uma srie de mapas, mas um programa coordenado de sntese de protenas e os meios para controlar sua execuo.
Franois Jacob e Jacques Monod, 1961

Porque regular?
Qual o custo (em termos de energia e recursos) para fazer uma protena? Para uma protena de tamanho mdio (300 aminocidos): 1350 molculas de ATP 1650 tomos de carbono 540 tomos de nitrognio

Escherichia coli tem cerca de 4000 genes que codificam aproximadamente 2000
protenas. Imaginem o custo se todas estas protenas fossem produzidas todo o tempo!

Quem, quando, quanto: J que a sntese de protenas requer grandes quantidades de energia e recursos, as bactrias (e eucariotos) desenvolveram mecanismos elaborados para controlar a escolha de quais proteinas so feitas em diferentes momentos, sob diferentes condies ambientais. Isso regulao gnica.

DNA

replicao

transcrio

RNA
traduo

proteina

Elementos da sequncia de DNA

5 ou upstream +1 (inicio de transcrio)
-35 -10 RBS ATG TAA term

3 ou downstream

DNA

promotor transcrio

5 UTR

mRNA

3 UTR
AUG UAA

traduo

protena

RNA Polimerase Bacteriana

gene
rpoA

produto

Funo
Montagem da enzima Reconhecimento promotor Ligao a ativadores

rpoB

Centro cataltico rpoC

Especificidade promotor

rpoD

Nvel de Metabolismo
DNA

Mecanismo de Controle
Mudana na estrutura do gene (poucos) Modulao da frequncia de transcrio de genes (muitos) Modulao da frequncia de traduo (alguns)

Exemplo
Variao de fase

mRNA

Induo ou Represso

protena

Protenas ribossomais

protena modificada

A funo da protena controlada pela modificao ps-traducional

Adenilao da glutamina sintetase

atividade enzimtica

A funo cataltica de algumas protenas (protenas alostricas) modulada pela concentrao de pequenos ligantes

Vrias enzimas de vias biosintticas ou reguladoras

PROMOTORES

5 ou upstream +1 (inicio de transcrio)

-35 -10 RBS ATG TAA

3 ou downstream

term

DNA

promotor

O reconhecimento do promotor depende de uma sequncia consenso

A conservao de sequncias consenso curtas uma caracterstica tpica de regies reguladoras (como promotores) tanto no genoma de procariotos quanto eucariotos Existem 4 elementos conservados nos promotores bacterianos: o incio de transcrio a regio -10 a regio -35 a distncia entre as regies -10 e -35

-35

-10

TTGACA

16 - 19bp

TATAAT

5 - 9 bp

+1

A substituio de fatores sigma pode controlar a iniciao

O reconhecimento de sequncias promotoras controlado por fatores que auxiliam ou interferem com a RNA Polimerase Mudanas no tipo de fator sigma acontecem nos casos aonde h uma reorganizao global do padro de transcrio. Isso permite RNA Polimerase iniciar a transcrio em promotores que no so normalmente reconhecidos pelo 70: esporulao mudanas ambientais resposta choque trmico Gene rpoD rpoH rpoE rpoN fliA MW Uso -35 espaador -10

TATAAT geral 16-18 70 kD TTGACA CCCGATNT 13-15 32 kD choque trmico CCCTTGAA 24 kD choque trmico not known desconhecido desconhecido TTGCA nitrognio 6 54 kD CTGGNA GCCGATAA flagelar 15 28 kD CTAAA

Nvel de Metabolismo
DNA

Mecanismo de Controle
Mudana na estrutura do gene (poucos)

Exemplo
Variao de fase

Variao de Fase
A variao de fase uma forma de regulao que produz populaes contendo uma mistura de clulas que expressam (fase ligada) ou no (fase desligada). Este tipo de controle provavelmente permite uma otimizao da sobrevivncia em ambientes onde a vantagem seletiva da expresso do gene regulado por variao de fase no uma garantia.

Variao de fase na expresso da adesina em Escherichia coli

+
recombinases

A maioria dos genes bacterianos so expressos em mensagens policistrnicas

leader

intercistronic

trailer

coding

coding

start

stop

start

stop

A transcrio e a traduo ocorrem simultaneamente nas bactrias

Iniciao de transcrio Terminao de transcrio Processamento do RNA Estabilidade do mRNA Iniciao de traduo Velocidade de elongao (traduo) Mudana de fase de leitura Velocidade de degradao da proteina Modificao da atividade da proteina: associao de ligantes modificaes covalentes interaes proteina-proteina

Controle da expresso gnica nvel transcricional:

Iniciao da transcrio: a energia no disperdiada transcritos desnecessrios mas o organismo tem que ser capaz de mudar o padro de expresso gnica rapidamente. Terminao da transcrio: pode ser utilizado para evitar que a transcrio prossiga aps um terminador, transcrevendo o prximo gene (por outro lado, protenas antiterminadoras podem permitir a continuao da transcrio) Disponibilidade dos transcritos (mRNAs): estabilidade do mRNA estrutura secundria em torno do cdon de iniciao de traduo produzindo

Jacques Monod

Franois Jacob

Franois Jacob & Jacques Monod Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins J Mol Biol 3:318-356, 1961

Lactose operon

lacI

lacZ

lacY

lacA

repressor

-galactosidase

permease

acetylase

lactose

glucose + galactose

O operon lac controlado por regulao negativa

Genes so transcritos exceto quando desligados por uma protena reguladora

lacI

lacZ

lacY

lacA

O gene lacI sintetiza o monmero do repressor, que forma tetrmeros O tetrmero LacI se liga sequncia operadora bloqueando a transcrio

O indutor liga os genes

lacI

lacZ

lacY

lacA

O indutor converte o repressor lac a uma forma inativa, incapaz de ligar o operador O promotor lac fica livre para ligao da RNA Pol - a transcrio ocorre

Mensagem lac : Induo

Flexibilidade Economia

a bactria precisa responder rapidamente a mudanas ambientais alto custo de produo desnecessria de todas as enzimas de uma via metablica na ausncia de seus substratos

A sntese de enzimas em resposta ao aparecimento de um substrato especfico se chama

induo

Crescimento na ausncia de -galactosdeos: <5 molculas de -Gal Crescimento na presena de -galactosdeos: at 5000 molculas

Controle positivo ou negativo

Sistemas de controle positivo ou negativo so definidos pela resposta do operon na ausncia de protenas reguladoras

Controle Negativo:

os genes so expressos a no ser que sejam desligados por uma protena repressora os genes so expressos somente quando uma protena reguladora ativa est presente

Controle Positivo:

Controle Negativo: os genes so expressos

a no ser que sejam desligados por uma protena repressora

Controle Positivo:
os genes so expressos somente quando uma protena reguladora ativa est presente

Represso Catablica:

Glicose, quando disponvel como fonte de energia, utilizada preferencialmente a outros acares por E. coli; a glicose leva a um maior rendimento de ATP por unidade de energia gasta. Operons para catabolismo de outros acares (como lactose, arabinose e galactose) sao reprimidos na presena de glicose. A represso catablica resulta da reduo nos nveis de cAMP na clula pela presena de glicose.

ATP

adenilato ciclase

cAMP

[cAMP]

glicose

[cAMP]

cAMP

CAP ativa

CAP inativa

CAP se liga ao DNA ativando a transcrio a partir de promotores CAP-dependentes

CAP: Catabolite Activator Protein

CAP (catabolite activator protein), tambm conhecidada como CRP, se liga ao DNA quando sente a presena de AMP ciclico na clula. No operon lac, aonde esta proteina foi estudada pela primeira vez, a regio de ligao cobre aproximadamente 62 pb acima do sitio de inicio de transcrio. A ligao de CAP curva o DNA significativamente, trazendo o complexo RNA Pol + sigma (ligado ao promotor) em contato com CAP devido a esta curvatura. Este contato intensifica a transcrio. Este motivo, uma helice curta que se encaixa na dobra maior do DNA, frequentemente encontrado em proteinas que se ligam ao DNA, como o repressor Cro de .

Controle positivo e negativo: o operon de arabinose

controle positivo

Na presena de arabinose, a protena AraC se liga regio araI ; a protena CAP, ligada a cAMP, se liga a um stio adjacente regio araI; TRANSCRIO DE araB, araA e araD

controle negativo

Na ausncia de arabinose, a protena AraC se liga a ambas as regies araI e araO, formando um loop de DNA IMPEDE A TRANSCRIO DO OPERON

Esporulao em Bacillus subtilis: cascata de fatores sigma

O processo de espurulao resultado de uma mudana drstica nas atividades biosintticas da bactria, envolvendo mais de 50 genes diferentes, sob o controle de 8 genes de esporulao.

O controle bsico est ao nivel da transcrio

No final do processo cerca de 40% do mRNA especfico da fase de esporulao

A cada etapa do processo, um novo fator sigma substitui o antigo, acarretando na transcrio de um grupo diferente de genes (sigma = reconhecimento do promotor)

Etapas da esporulao:

Bactria vegetativa

Esporo inicial

Replicao do DNA

Esporo tardio

Lise da clula me

Formao do septo Esporo liberado

Condies ambientais Cascata de fosforilao

F 43 H F
pro-E
Transcrio de genes esporulao-especficos (iniciais)

SpoOA

SpoOA*
Regulador de transcrio

+ E

Transcrio de genes especficos (tardios)

Transcrio de genes esporulao-especficos (tardios) Pr-esporo

Clula mae

Atenuao
Vrios operons so controlados por atenuao: um mecanismo que controla a capacidade da RNA Pol de transcrever atravs de um atenuador (terminador intrnsico), localizado no incio de uma unidade de transcrio. Algum evento externo controla a formao da estrutura secundria em grampo necessria para a terminao intrnsica. As mudanas na estrutura secundria do mRNA que controlam a atenuao so determinadas pela posio dos ribosomas no mRNA

Terminadores Intrnsicos
Contm regies palindrmicas que formam grampos variando em extenso de 7 a 20 bp O grampo contem uma regio rica em G+C e seguido de uma carreira de Us Formao do grampo no RNA leva a RNA Polimerase a diminuir sua velocidade, ou at parar a sntese de RNA. Esta pausa d uma oportunidade para ocorrer a terminao de transcrio. Mas. Uma carreira de Us bem localizada essencial para levar a Polimerase a se dissociar do molde durante a pausa.

Biosntese de Triptofano
Exemplo de regulao por atenuao

Controle por atenuao: o operon triptofano

trpE

trpD

trpC

trpB

trpA

Regiao reguladora

Promotor Operador lder atenuador

Trp

Codifica peptdeo lder de 14 aminocidos Terminador intrnsico causa terminao pela RNA Polimerase

Terminao no atenuador dependente dos nveis de triptofano: na presena de trp, terminao eficiente na ausncia de trp, RNA Pol transcreve resto do operon

A regio lder codifica para vrios resduos de triptofano. A concentrao de triptofanil-tRNA na clula determina a velocidade de traduo do peptdeo lder. Desta forma, a velocidade de movimento do ribosoma na regio lder do mRNA reflete a concentrao de Trp-tRNA no citoplasma da bactria.

Alta concentrao de Trp = alta concentrao de Trp-tRNA ribosoma passa rapidamente pela regio lder chegando regio 1 e 2 Regio 3 s pode parear com regio 4 Terminador intrnsico formado (grampo rico em G/C seguido de Us)

Baixa concentrao de Trp = baixa concentrao de Trp-tRNA ribosoma demora na regio 1 esperando Trp-tRNA regio 2 capaz de parear com regio 3 Terminador intrnsico no se forma e operon transcrito

3 1 2

4
UUUUUU

2 1

Title: Lambda cookie , Artist: Brandi Baros, University of Pittsburgh Medium: Gingerbread, icing, displayed on aluminum foil-covered support. This work is a to-scale genetic map of bacteriophage Lambda, in which block length indicates the length of the ORF, and blocks are decorated with gene name labels. This work was disincorporated on the day of its international debut at the holiday party of the University of Pittsburgh Department of Biological Sciences in December 1998, when it was transmogrified into the bodies of various biologists. Subsequently the various media of which it was composed (except for the plastic) were decomposed to CO2 and at this moment of your viewing it its atoms may be in the very air you are breathing.

LAMBDA

LISE

LISOGENIA

CAPSDEO CAUDA RECOMBINAO REGULAO REPLICAO LISE

Ciclo Lisognico Ciclo Ltico Ciclo Ltico

Ciclo Ltico

CAPSDEO CAUDA RECOMBINAO REGULAO REPLICAO LISE

tL1
cIII N cI cro

tR1
cII

pL

pR

N
(antiterminador)

Ciclo Lisognico

CAPSDEO CAUDA RECOMBINAO REGULAO REPLICAO LISE ativador

tL1

antiterminador
nutL PLOL

repressor

antirepressor

ativador
nutR tR1 PRE

PRM OR PR

cIII

cI

cro

cII

CAPSIDEO CAUDA RECOMBINACAO REGULACAO REPLICACAO LISE ativador

tL1

antiterminador
nutL PLOL

repressor

antirepressor

ativador
nutR tR1 PRE

PRM OR PR

cIII

cI

cro

cII

CI Regula negativamente PL e PR PL OL1 OL2 OL3 Regula positivamente PRM PRM OR3 OR2 OR1 PR

O repressor um dmero
C dimerizao espaador N ligao ao DNA

O repressor s se liga ao DNA como um dmero A estrutura dimrica crucial para manuteno de lisogenia Clivagem no espaador resulta em entrada no ciclo ltico

O equilbrio entre lisogenia e ciclo ltico depende da concentrao do repressor

baixa concentrao = monmeros alta concentrao = dmero

Como estabelecida a sntese de repressor?

ja que a presena de repressor necessria para sua prpria sntese?

Quando infecta uma clula, CI no sintetizado j que no h CI disponvel para auxiliar a ligao da RNA Pol ao PRM

Genes N e cro so transcritos a partir de PL e PR

A protena N permite transcrio de cIII e cII, graas a sua ao de antiterminador em tR e tL

CIII e CII : estabelecimento da sntese de repressor CI

tL1 nutL PLOL PRM OR PR nutR tR1 PRE

cIII

cI

cro

cII

N CI
CIII protege CII contra degradao CII ativa transcrio a partir de PRE

CIII

CII

Anti-cro

Hibridiza com cro mRNA e impede sua traduo

Um segundo repressor necessrio para o ciclo ltico

Cro responsvel por impedir a sntese do repressor CI Esta ao impede o estabelecimento de lisogenia Cro impede a sntese de repressor a partir de PRM Cro impede a transcrio a partir de PL e PR (mas no totalmente) Cro forma um dmero e se liga simetricamente aos mesmos operadores do que CI

A diferena entre Cro e CI est na diferente afinidade pelos operadores.

Impede RNA Pol de se ligar a PRM

Cro
PRM OR3 OR2 OR1 PR

CI

Impede RNA Pol de se ligar a PR Auxilia RNA Pol a se ligar a PRM

O delicado equilbrio entre lise e lisogenia

O estgios iniciais da infeco por so idnticos A deciso entre lise e lisogenia depende de quem vai ocupar primeiro os operadores: Cro ou CI ? A influncia crtica sobre esta deciso depende de CII

Exemplos
Bactrias crescidas em meio rico produzem mais proteases que degradam CII, levando a preferir o ciclo ltico. Ao contrrio, em condies de falta de nutrientes, a lisogenia favorecida (falta de nutrientes para um crescimento ltico eficiente). Resposta SOS: A protena RecA necessria para o reparo do DNA por recombinao, mas sua atividade protesica induzida por agentes mutagnicos (como luz UV), levando clivagem da protena LexA (um repressor) de modo a ativar os genes necessrios para o reparo. Mas RecA tambm cliva o espaador da protena CI de , liberando-o dos operadores e ativando a transcrio a partir de PL e PR. Cro ento produzido, reprimindo a sntese de CI e desencadeando o ciclo ltico. O fago pode ento escapar da clula danificada em vez de morrer com ela.

Cro: Repressor do bacteriofago

A proteina Cro um dmero, reconhecendo uma sequncia de DNA que ocorre 2 vezes, separadas por 10pb. A regio reconhecida por Cro ocorre prxima ao stio de ligao da RNA Polimerase. A ligao de Cro a esta regio interfere fisicamente com a transcrio de genes adjacentes pela RNA Pol. Cro um REPRESSOR. O motivo mostrado comum em protenas que se ligam ao DNA e conhecido como helix-turn-helix.

T7
Classe I promotores de E. coli 5 genes T7 RNA Pol interferncia com o hospedeiro Classe II promotores de T7 7 genes sntese de DNA lisozima 13 genes empacotamento maturao de DNA Classe III promotores de T7

A transcrio do fago T7 subdividida em 3 classes: I, II e III. Classe I: a fase inicial e ocorre nos 3 primeiros minutos da infeco. Um dos genes transcritos codifica uma RNA Polimerase

A T7 RNA Pol tem especificidade de promotor muito diferente da RNA Pol de E. coli. Tem apenas uma subunidade (E. coli RNA Pol tem 4) No tem um fator

associado

Reconhece promotores diferentes dos de E. coli

2-component regulatory systems

Procariotos desenvolveram sistemas complexos para responder mudanas no seu meioambiente. Sistemas regulatrios de 2-componentes so uma forma de efetivar esta resposta. - quase universais entre espcies bacterianas - Em E. coli mais de 40 sistemas de 2-componentes j foram identificados Atendem s seguintes necessidades celulares: - Quimiotaxia: Deslocamento da clula para uma localizao mais favorvel - Regulao osmtica (resposta da bactria diferentes concentraes de solutos no meio ambiente - Transporte de magnsio - Tolerncia a pH - Esporulao - etc...

A primeira o sensor (kinase)- percebe um aspecto do meio ambiente e gera um sinal A segunda um regulador de resposta, que recebe o sinal da primeira protena e ento age de alguma forma.

2 protenas diferentes

Sensor (kinase)

Tem 2 domnios: transmembrana

Sensorial: frequentemente um sensor

Transmissor: uma protena kinase

especfica

Regulador de Resposta

Conduz o sinal gerado pelo sensor para a destinao final do estmulo; para facilitar este trabalho, esta protena um difusor citoplasmtico. 2 domnios:

Receptor: Localizado na poro N-terminal. Recebe um grupamento fosfato em um

resduo de histidina altamente conservado; transfere este fosfato para um resduo de asprtico interno. Esta transformao ativa o domnio regulador da resposta. transcrio. Uma vez desencadeado o sinal, a protena retorna ao seu estado original, esperando pelo prximo sinal.

Regulador da Resposta: est de alguma forma envolvido na ativao de

meio externo

citoplasma
HH KH D DD

Uma mudana no ambiente leva estimulao do sensor que causa uma mudana conformacional na poro transmembrana do sensor e ativa a atividade kinase do domnio transmissor, fosforilando o resduo de histidina altamente conservado do domnio receptor da protena reguladora de resposta que leva o domnio receptor a autocatalizar a transferncia deste fosfato da posio de alta energia na histidina para um posio de baixa energia no aspartato, e esta mudana conformacional permite a ativao do domnio regulador O domnio regulador se liga ento a um stio especfico no genoma, promovendo a transcrio de um novo produto naquele local

Osmoregulao

A habilidade para responder a mudanas na concentrao de solventes do meio

O sensor deste sistema regulatrio de 2-componentes a protena EnvZ O regulador de resposta a protena OmpR

"Somos uma temvel mistura de cidos nuclicos e lembranas, de desejos e de protenas. O sculo que termina ocupou-se muito de cidos nuclicos e de protenas. O seguinte vai concentrar-se sobre as lembranas e os desejos. Saber ele resolver essas questes?"

O Ratinho, a Mosca e o Homem, de Franois Jacob Traduo de Margarida Srvulo Corrreia Reviso cientfica de Leonor Parreira Gradiva, 1997, 183 pp.

FIM

Promotor Operador lder atenuador

http://www.science.siu.edu/microbiology/micr460/460%20Pages/460.cAMP.html

Quando a glicose transportada para dentro da clula convertida em glicose-6-fosfato. O grupamento fosfato vem da forma fosforilada da HPr, que transfere o fosfato obtido da forma fosforilada da IIA-Glc.

Assim, quando a glicose se encontra disponvel na clula, a protena IIA-Glc se encontra na forma defosforilada e inativa a adenilato ciclase e outras permeases de acares. Na ausncia de glicose, a protena IIA-Glc se encontra na forma fosforilada, ativando a adenilato ciclase e permeases de acares. Assim, quando a glicose est ausente, o cAMP sintetizado pela adenilato ciclase.