Jnior, Jos Maciel Rodrigues, et al. possvel uma vacina gnica auxiliar no controle da tuberculose?

possvel uma vacina gnica auxiliar no controle da tuberculose?*

Could a DNA vaccine be useful in the control of tuberculosis?
JOS MACIEL RODRIGUES JNIOR, KARLA DE MELO LIMA, ARLETE APARECIDA MARTINS COELHO CASTELO, VNIA LUIZA DEPERON BONATO MARTINS, SANDRA APARECIDA DOS SANTOS, LUCIA HELENA FACCIOLI, CLIO LOPES SILVA.

Vacinas de DNA, ainda em fase de experimentao e testes clnicos, podem se tornar uma importante ferramenta de combate a doenas infecciosas para as quais, at hoje, no existe preveno segura e eficaz, como a tuberculose. Nos ltimos anos vrios estudos tm sido dedicados ao desenvolvimento de vacinas de DNA que codificam protenas de micobactrias, entre as quais destacam-se as que codificam o antgeno 85 (Ag 85) e a protena de choque trmico de 65 kDa (hsp65). Estes dois antgenos foram os mais estudados apresentando resultados bastante satisfatrios em ensaios prclnicos e com grande volume de dados registrados na literatura. Alm de proteger contra infeco experimental por Mycobacterium tuberculosis virulenta, a vacina DNA-hsp65 tambm apresenta atividade teraputica, ou seja, capaz de curar os animais previamente infectados, inclusive aqueles com bacilos resistentes a mltiplas drogas. Esta vacina, hoje em avaliao clnica no Brasil tambm para o tratamento de cncer, capaz de induzir a produo de citocinas de padro Th1 tal como IFN- interferon-gama, associadas ao controle da doena. Alm disso, a vacina de DNA-hsp65 capaz de estimular clones de clulas CD8 citotxicos e CD4 que podem ser caracterizados como clulas de memria sendo responsveis por conferir imunidade duradoura contra a infeco. Quando utilizada na terapia da infeco, a vacina de DNA-hsp65 faz com que haja uma mudana no padro de resposta imune, induzindo a secreo de citocinas de padro Th1 criando um ambiente favorvel erradicao do bacilo. Os resultados demonstram ainda que a via de administrao e a formulao na qual a vacina administrada exerce fundamental influncia no padro e durao da resposta imune desencadeada. O conjunto de resultados hoje disponveis mostra que uma vacina de DNA contra a tuberculose contribuir de maneira significativa no controle desta doena.
J Bras Pneumol 2004; 30(4) 468-77

The DNA vaccines currently under pre-clinical and clinical development may prove to be important tools in combating infectious diseases, such as tuberculosis, for which no safe and effective form of prevention has yet been developed. In recent years, several studies have aimed to develop a DNA vaccine encoding mycobacterial proteins such as antigen 85 (Ag85) and the 65-kDa mycobacterial heat shock protein (hsp65). The latter is protective against virulent infection with Mycobacterium tuberculosis (including multidrugresistant strains). The hsp65 DNA vaccine, currently under clinical evaluation in Brazil for cancer therapy, is able to induce the secretion of Th1 cytokines, such as gamma-interferon, associated with disease control. Furthermore, this vaccine stimulates cytotoxic CD8 and CD4 T-cell clones that can be characterized as memory cells, which are responsible for effective and longlasting immunity against tuberculosis. When used as a therapeutic agent in inoculated mice, the hsp65 DNA vaccine promotes changes in the immunity profile, triggering the secretion of Th1 cytokines and establishing a favorable environment for the elimination of bacilli. The results also demonstrate that the route of administration, as well as the formulation in which the vaccine is administered, fundamentally influence the pattern and duration of the immune response induced. Taking all currently available data into account, we can conclude that a DNA vaccine against tuberculosis could contribute significantly to the control of the disease.

Descritores: uberculose/epidemiologia. Vacina de DNA/uso teraputico. Protenas do choque trmico. Auto-imunidade.

Key words: Tuberculosis/epidemiology. Vaccines, DNA/ therapeutic use. Heat shock proteins. Auto-immunity.

* Trabalho realizado pela Rede Brasileira de Pesquisa em Tuberculose na Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, SP, Brasil.

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Endereo para correspondncia: Clio Lopes Vieira. Rua Clvis Vieira, 24 - Campus da USP de Ribeiro Preto. CEP 14049-900 - Ribeiro PretoSP, Brasil. Email: clsilva@cpt.fmrp.usp.br Recebido para publicao, em 29/4/04. Aprovado, aps reviso, em 27/5/04.

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O que vacina de DNA

Nas ltimas dcadas, os avanos na tecnologia de vacinas permitiram a introduo de novas estratgias para a obteno e produo de antgenos, assim como foram otimizadas novas maneiras de se administrar e apresentar esses antgenos para as clulas do sistema imune. Essas estratgias abriram caminhos para inovaes, particularmente no contexto do desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes. Entre estas esto as vacinas, consideradas de segunda gerao, de sub-unidades constitudas de antgenos purificados ou recombinantes provenientes da cultura dos agentes infecciosos, ou obtidos por meios sintticos. Mais recentemente, surgiram as vacinas gnicas ou de terceira gerao, onde os genes ou fragmentos de genes que codificam antgenos potencialmente imunizantes so carreados por DNA plasmidial. A vacina de DNA, ainda em fase de experimentao e testes clnicos, pode se tornar a maior ferramenta de combate a doenas infecciosas para as quais, at hoje, no existe preveno segura e eficaz, como herpes, sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS), malria, tuberculose, hepatite, esquistossomose e dengue, dentre outras. Alm disso, elas tm grande potencial de aplicao na preveno e cura de determinados tipos de cncer. O isolamento de genes um processo de domnio da comunidade cientfica devido ao grande desenvolvimento de tcnicas de biologia molecular. Para a construo da vacina de DNA, os genes, freqentemente relacionados com a expresso de molculas associadas com a virulncia ou patogenia dos agentes infecciosos, so clonados e inseridos em um fragmento de DNA circular denominado plasmdeo. Os plasmdeos usados em vacinas gnicas devem ter: origem de replicao em bactrias, o que permite a sua eficiente duplicao, chegando a centenas de cpias por clula; um gene de seleo, que geralmente confere resistncia a um antibitico, permitindo assim a seleo dos clones de clulas que carregam o plasmdeo; um stio mltiplo de clonagem que pode ser clivado com enzimas de restrio, permitindo a insero do gene de interesse, que no caso das vacinas um gene que codifica um antgeno; um promotor, geralmente um promotor viral, que permite a transcrio do

Siglas e abreviaturas utilizadas neste trabalho:

AIDS - Sndrome da imunodeficincia adquirida Ag 85 - Antgeno 85 TB - Tuberculose BCG - Bacilo Calmette-Gurin RT-PCR - Reverse transcription polymerase chain reaction AIDS - Sndrome da imunodeficincia adquirida OMS - Organizao Mundial da Sade Hsp65 - Protena de choque trmico de 65 KDa PLGA - cido poli-ltico e gliclico DMT - Dimicolato de trealose MHC - Complexo principal de histocompatibilidade IL - Interleucina IFN - Interferon

gene de interesse em clulas eucariotas. Aps a clonagem do gene que codifica o antgeno vacinal no plasmdeo, ele introduzido em uma bactria hospedeira, geralmente Escherichia coli, por um processo denominado de transformao bacteriana, com a finalidade de se produzir plasmdeos em larga escala e haver quantidade suficiente de DNA para a vacinao propriamente dita (1). A administrao da vacina de DNA pode ser feita em vrias espcies animais e no homem por diversas vias e esquemas. Alm da injeo intramuscular, que a via mais utilizada, as vacinas gnicas tambm podem ser administradas por via intranasal, na forma de aerossol, por via oral ou por via intradrmica por meio de bombardeamento de micropartculas de ouro cobertas com o material gentico. Embora a injeo intramuscular seja um processo simples e de baixo custo, sua utilizao na maioria das vezes requer uma quantidade elevada de plasmdeo para estimular uma resposta imune adequada. Soluo de glicose hipertnica para edemaciar o tecido muscular (2) , ou de anestsicos locais, como a bupivacana, que so capazes de lesar o tecido e causar uma reao inflamatria (3-5), tm sido empregados como alternativas para aumentar a transfeco de antgenos, para os macrfagos e clulas dendrticas, aps a injeo intramuscular. Entretanto, tais procedimentos no so aceitveis para utilizao em clnica humana devido aos seus efeitos colaterais. A injeo intramuscular do plasmdeo uma tcnica simples, mas expe o DNA a uma srie de inconvenientes no local de administrao como a presena de enzimas (nucleases) capazes de degradar o DNA plasmidial, tornando-o ineficaz para induzir a resposta imune. Outro fato relevante refere-se ao tamanho da

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molcula de DNA e sua carga negativa superficial, que limitam sua penetrao na clula-alvo, sendo necessrias doses maiores de DNA para induo de uma resposta imune significativa. Um prrequisito para a eficcia do uso de DNA como vacina ou terapia gnica est relacionado liberao efetiva do cido nuclico na clula-alvo. O cido nuclico deve atingir o ncleo da clula e isto tem sido viabilizado pelo uso de vetores vivos (bacterianos e virais) e no vivos (sistemas sintticos). Existe uma estimativa de que apenas uma em cada 1.000 molculas de plasmdeo administradas capaz de atingir o ncleo e expressar a mensagem para a sntese da protena desejada, fazendo com que um tratamento usual exija a administrao de doses elevadas de DNA plasmidial, da ordem de algumas centenas de microgramas a miligramas. O DNA recombinante com grau farmacutico pode ser obtido por meio de expresso em bactrias transformadas e purificado por uma srie de mtodos cromatogrficos, permitindo sua obteno em grande escala(6).

Perspectivas de uma vacina de DNA contra tuberculose

Ateno especial vem sendo dada para o desenvolvimento de vacinas mais efetivas contra a tuberculose. A tuberculose (TB) persiste como a doena infecciosa que mais causa mortes em todo o mundo e, recentemente, atingiu a marca de 10 milhes de novos casos e 3 milhes de mortes por ano, 18,5% de todas as mortes em adultos entre 15 e 59 anos, o que corresponde fase mais produtiva da populao mundial. Segundo a Organizao Mundial da Sade (OMS) 32% da populao mundial esto infectados. Na ltima dcada, 300 milhes de pessoas foram infectadas, 90 milhes de novos casos da doena foram notificados e cerca de 30 milhes morreram. Em 1993 a tuberculose foi declarada emergncia global pela OMS e o M. tuberculosis agora considerado o agente infeccioso responsvel por mais mortes em adultos do que qualquer outro. Vrias vacinas candidatas ao combate tuberculose vm sendo estudadas. Dentre elas destacam-se as que codificam o antgeno 85 (Ag 85) e a protena de choque trmico de 65 kDa (hsp65). Esses dois antgenos foram os mais estudados, e apresentaram resultados bastante

satisfatrios em ensaios pr-clnicos, com grande volume de dados registrados na literatura. Neste artigo sero abordados os resultados obtidos com a hsp65. Para o desenvolvimento de uma vacina de DNA contra a tuberculose, Silva et al. introduziram nos plasmdeos pCDNA3 ou pHMG o gene de um dos antgenos imunodominantes de micobactrias, a protena de estresse hsp65 de M. leprae . Efetivamente, ambos os plasmdeos dirigem a expresso do gene hsp65 micobacteriano em clulas de mamferos(7-9). Os plasmdeos contendo o gene micobacteriano foram inoculados por via intramuscular em camundongos. Todos os testes de vacinao foram comparados com um grupo de animais inoculados somente com BCG intradrmico ou com plasmdeos sem o gene hsp65. A produo de anticorpos especficos no soro dos animais imunizados com o DNA hsp65 foi observada duas semanas aps a terceira dose do plasmdeo. A induo da resposta imune celular foi detectada por um teste especfico, que a medida da capacidade proliferativa dos linfcitos presentes nos ndulos linfticos, quando colocados na presena do antgeno hsp65. Mediadores e reguladores da resposta imune, como as interleucinas, tambm foram detectados no sobrenadante de cultura, ou nos prprios linfcitos dos animais imunizados, tanto por tcnicas de ELISA quanto por RT-PCR. Nestes, estava aumentada a liberao de interferon-gama (IFN), e de interleucina (IL-2 e IL-12), consideradas citocinas estimulatrias da resposta imune celular do tipo Th1, mas no de IL-4, IL-10 e IL-13, que so supressoras dessa resposta. Portanto, o padro de resposta imunolgica induzida nos camundongos, pela imunizao com o DNA hsp65, foi demonstrado ser do tipo Th1, o qual altamente favorvel para a eliminao de agentes infecciosos.

Proteo induzida pela vacina de DNA

A imunizao de camundongos com DNA hsp65 foi altamente efetiva para proteger os animais contra posterior infeco com M. tuberculosis , sendo o efeito protetor muito semelhante quele apresentado pelos animais vacinados com BCG(10). Com base nestes dados, foram clonados outros antgenos micobacterianos (hsp70, hsp10, 36 KDa e ESAT6) nos plasmdeos

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pCDNA3 e pHMG e posteriormente testadas as suas atividades protetoras. Os DNAs que codificam os antgenos hsp70 e ESAT6 induziram proteo significativa, porm menor que aquela mostrada pela hsp65. Por outro lado, as imunizaes com DNA que expressa hsp10 e 36 KDa no mostraram atividade protetora contra infeco por M. tuberculosis . Em resumo, esses estudos demonstraram que as inoculaes das vacinas de DNA que codificam os genes das protenas imunognicas hsp65, hsp70 e 36 KDa por via intramuscular, associados aos promotores do CMV e da hidroxi-metil-glutaril-CoA redutase, conferem proteo significativa contra infeco por M. tuberculosis em camundongos (11).

Clulas envolvidas com a proteo e estudos sobre memria imunolgica

Vrios estudos foram conduzidos por Silva et al. no sentido de melhor caracterizar as subpopulaes celulares associadas ao controle do processo infeccioso, bem como aos mediadores envolvidos (interleucinas) e s funes efetoras desencadeadas no decorrer do processo de ativao celular. A compreenso destes fatores contribui para o entendimento dos mecanismos imunes envolvidos na patogenia da tuberculose, permitindo novas perspectivas para o controle da enfermidade. Estudos comparando animais infectados com M. tuberculosis e vacinados com DNA-hsp65 foram realizados para estabelecer relaes entre o fentipo das sub-populaes de clulas T, os mediadores liberados por estas clulas, e a expresso de molculas relacionadas com migrao celular e memria imunolgica (CD44). Clulas T de animais previamente vacinados foram transferidas para animais no imunizados e desafiados concomitantemente com M. tuberculosis H37Rv. Estes animais controlaram melhor a infeco quando comparados com animais que foram somente infectados com os bacilos. O fentipo celular associado proteo foi caracterizado por clulas que apresentaram elevada expresso de CD44 em sua superfcie (CD44 hi ). Estas clulas CD44 hi de animais imunizados foram capazes de controlar melhor a proliferao dos bacilos quando comparadas s clulas CD44lo destes mesmos animais imunizados e s clulas CD44hi ou CD44lo de animais infectados. Verificou-se tambm que entre as clulas CD44hi,

as clulas CD8 +/CD44hi foram mais eficientes que as clulas CD4+/CD44hi no controle da infeco, impedindo a multiplicao dos bacilos. Ainda com relao ao fentipo celular que confere proteo na infeco pelo M. tuberculosis, foi demonstrado que as clulas CD44 hi produziam predominantemente IFN-, enquanto as clulas CD44 lo produziam preferencialmente IL-4(7,12). Com a finalidade de melhor definir o fentipo das clulas que conferiam proteo na infeco micobacteriana, foram selecionados clones T CD4+/ CD44hi, T CD4+/CD44lo, T CD8+/CD44hi e T CD8+/ CD44 lo, provenientes de animais vacinados e infectados. As clulas T CD4 + e T CD8 + foram obtidas por seleo negativa e separadas por FACSort em sub-populaes CD44hi e CD44lo. Por meio da tcnica de diluio limite, foram selecionados 16 clones T CD4 + e 16 clones T CD8+ de animais imunizados e de animais vacinados com o DNA hsp65. Estes clones foram caracterizados quanto expresso de CD44 (CD44hi ou CD44 lo), produo de IFN- ou IL-4 e capacidade citotxica. Os resultados mostraram que os quatro clones CD8 + /CD44 hi, obtidos de animais imunizados, produziam IFN- e eram citotxicos. Estes clones conferiam maior proteo aos animais infectados quando comparados aos clones T CD8+/CD44lo. Todos os quatro clones T CD4+/CD44hi tambm secretavam IFN- e trs eram citotxicos. No entanto, a capacidade de proteo destes clones foi inferior dos clones T CD8+/CD44hi. Quanto aos clones obtidos de animais infectados, verificouse que dos quatro clones T CD8+/CD44hi, somente dois produziam IFN- e eram citotxicos, enquanto os outros dois produziram IL-4 e no apresentaram capacidade citotxica (7,12,13). Nesse contexto, a vacinao com DNAhsp65 resultaria na formao de um conjunto de clones de clulas CD4 e CD8 que expressariam altos nveis de CD44. Os clones CD44 hi poderiam estar relacionados com funes de memria imunolgica e, possivelmente, com uma migrao mais rpida para o local de infeco, onde poderiam encontrar a clula apresentadora de antgeno adequada. Assim, estes resultados indicam que a imunizao prvia, atrvs de veculos e vias adequadas, seria importante para desencadear resposta imune especfica, tanto local como sistmica, eficiente no controle da infeco micobacteriana.

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Uso de carreadores na vacina gnica contra tuberculose

Em relao vacina de DNA baseada na protena hsp65, at ento utilizada como DNA nu e administrada por via intramuscular, mltiplas doses de grandes quantidades de plasmdeo so necessrias, no mnimo 3 doses de 100 g, para promover a proteo ou cura efetiva em modelo experimental de tuberculose em camundongos14. Entretanto, no que diz respeito s vacinas em desenvolvimento, existe uma necessidade de simplificar os esquemas de imunizao, reduzindose o nmero de doses necessrias para estimular imunidade protetora. Para isso, diferentes estratgias tm sido empregadas envolvendo a utilizao de diferentes tipos de adjuvantes(15). A fim de otimizar a vacina visando a reduo da quantidade de DNA injetada, avaliou-se a sua administrao pela via intradrmica com o uso de gene gun . Entretanto, dados de estudos comparativos mostram que a injeo intramuscular de DNA induz preferencialmente um padro Th1 de resposta imune, enquanto que o bombardeamento com gene gun apresenta uma tendncia para o desencadeamento de padro Th2 de resposta. De fato, a administrao de DNAhsp65 por gene gun estimulou ambos os tipos de resposta humoral e celular com uma dose 100 vezes menor do que a utilizada nos protocolos convencionais de injeo intramuscular. Os nveis de imunoglobulinas das subclasses IgG1 e IgG2a apresentaram diferenas, sendo que o gene gun estimulou preferencialmente anticorpos da subclasse IgG1, o que sugere uma ativao de resposta de padro Th2. Alm disso, os camundongos BALB/c imunizados com DNA-hsp65 por injeo intramuscular produziram altos nveis de IFN-, enquanto que a imunizao por gene gun no induz a produo de IFN-, mas sim de citocinas de padro Th2 como IL-10 e IL-4, podendo tal resposta ser associada pequena quantidade de DNA utilizada nesta tcnica. A reduo na quantidade de DNA vem acompanhada da reduo da quantidade de motivos CpGs. De fato, os camundongos imunizados com DNA-hsp65 por injeo intramuscular apresentaram reduo da carga bacilar nos pulmes. J os animais imunizados por gene gun no foram capazes de reduzir a carga bacilar, o que indica que esta tcnica, embora permita o desencadeamento de

resposta imune especfica com doses significativamente menores de DNA, no adequada para a administrao da vacina de DNAhsp5 visando ao combate tuberculose(16). Uma segunda estratgia para otimizar a vacina de DNA-hsp65 consistiu no seu encapsulamento em microesferas polimricas biodegradveis. Os resultados demonstraram que o DNA pode ser encapsulado nas microesferas de cido poli-ltico e gliclico (PLGA) sem o comprometimento da sua funcionalidade. O mtodo utilizado permitiu a obteno de partculas com um tamanho adequado para promover a vetorizao para clulas fagocitrias, alm de apresentar uma boa eficincia de encapsulao do DNA. Os estudos in vitro demonstraram que clulas fagocitrias capturam as microesferas de PLGA, que por sua vez liberam o DNA encapsulado, o qual dirige a sntese da protena antignica. Ento, a utilizao de microesferas de PLGA pode ser uma importante ferramenta para o direcionamento do DNA para clulas apresentadoras de antgenos profissionais, aps injeo intramuscular ou subcutnea. A capacidade de transfectar as clulas apresentadoras de antgeno profissionais diretamente pode ser interessante visto que vrios trabalhos demonstram que peptdeos antignicos, envolvidos na estimulao de linfcitos T citotxicos aps vacinao com DNA, so apresentados no contexto de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I de clulas derivadas de medulassea e no pelos micitos transfectados (17-19). Ento, quando diretamente transfectadas in vivo, estas clulas que expressam molculas coestimulatrias na sua superfcie apresentam antgenos fornecendo os sinais necessrios para a estimulao de linfcitos T. Aps a injeo intramuscular, as microesferas ainda formam um depsito tecidual recrutando clulas apresentadoras de antgeno para o stio de administrao, o que facilita a captura das partculas pelas mesmas e, conseqentemente, a sua transfeco. As microesferas so capazes de melhorar a apresentao do antgeno, mas no apresentam nenhuma propriedade imunoestimulante. Portanto, a formulao de microesferas contendo DNA foi capaz de estimular resposta imune especfica, mas esta no foi suficiente para proteger camundongos BALB/c contra infeco desafio por M. tuberculosis. A fim de melhorar a capacidade imunognica da

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formulao de microesferas, utilizou-se como estratgia a combinao de adjuvantes com propriedades imunoestimulantes e carreadoras empregando a tecnologia de microencapsulao. Foi elaborada uma nova formulao contendo a vacina de DNA-hsp65 e um composto imunoestimulante, o dimicolato de trealose (DMT), ambos encapsulados em microesferas biodegradveis(20). A capacidade das microesferas de PLGA de liberar o plasmdeo encapsulado lentamente sugere sua potencialidade em sustentar a expresso da protena por um perodo mais prolongado sem a necessidade de doses de reforo, em comparao com a injeo intramuscular do DNA nu. Dados de RT-PCR mostraram a expresso do RNA mensageiro para hsp65 no bao e linfonodos dos animais imunizados com uma nica dose de DNA em microesferas, 15 dias aps a imunizao. Entretanto, no se verificou a mensagem para hsp65 nestes rgos linfides secundrios onde ocorre a estimulao dos linfcitos em animais imunizados com trs doses de DNA nu. No que concerne resposta imune, observouse uma mudana significativa na qualidade dos anticorpos aps imunizao com microesferas contendo DNA-hsp65/DMT. Nestes animais, a resposta humoral foi caracterizada por altos nveis de IgG2a, enquanto que animais imunizados com DNA nu apresentaram um padro misto com altos nveis de IgG1 e IgG2a. A resposta imune celular foi caracterizada pela produo de altos nveis de IFN-. Trinta dias aps o desafio, os animais imunizados com microesferas contendo DNAhsp65 e DMT apresentavam altos nveis de IFN- no pulmo(21). Este perfil pode ter sido favorecido pelo DMT. Ryll et al. (2001) mostraram que o DMT pode estimular uma resposta imune evidenciada pela proliferao de clulas NK e que ele tambm pode iniciar uma resposta imune precoce com liberao de IFN- levando ativao de macrfagos com regulao positiva da expresso de molculas de MHC classe II e CD1(22). Portanto, o DMT pode fornecer as condies timas para iniciar a resposta imune, o que o torna um bom componente estimulador de resposta Th1 em uma formulao candidata a vacina contra tuberculose. Uma proteo significativa contra infeco com M. tuberculosis H37Rv foi alcanada quando camundongos foram vacinados com DNA-hsp65 nu por injeo intramuscular ou com DNA-hsp65

e DMT encapsulados em microesferas. Porm, cabe ressaltar que a formulao composta por microesferas contendo DMT e DNA-hsp65 foi capaz de estimular a resposta imune protetora aps uma nica administrao, enquanto que a injeo intramuscular do DNA nu requer trs doses para conferir a mesma proteo. Esta vacina baseada em microesferas permitiu ainda a reduo da dose de plasmdeo em dez vezes quando comparada quela com DNA nu. Estes dados demonstram que a resposta imune para um determinado antgeno, utilizando-se uma cepa particular de camundongo, diretamente influenciada pelo mtodo de administrao do DNA. O desenvolvimento de formulaes envolvendo a combinao de adjuvantes com diferentes mecanismos de ao pode representar uma alternativa para a obteno de vacinas mais efetivas.

Explorando a estratgia prime-boost

A durao da proteo conferida por uma vacina tem sido associada com a permanncia do antgeno no organismo. Desta forma, em alguns esquemas de vacinao se faz necessria a administrao de doses de reforo para sustentar a imunidade estimulada pela dose inicial. Recentemente, o princpio de dose inicial-reforo ( prime-boost) tem sido bastante explorado dentro de um conceito de reforo heterlogo. Neste caso, o mesmo antgeno apresentado de forma diferente para o sistema imune durante a dose inicial e a de reforo. Nesse tipo de estratgia fundamental que a formulao utilizada na dose inicial induza a resposta com o padro requerido para conferir proteo ao indivduo vacinado. J a dose de reforo tem como funo apenas a expanso e manuteno da resposta inicialmente estimulada. Os protocolos mais comuns envolvem a utilizao de vacinas de DNA ou sub-unidade durante a dose inicial, e carreadores vivos, tais como vrus ou bactrias recombinantes expressando o antgeno em questo, nas doses de reforo. Apesar de haver alguns resultados bem sucedidos, este tipo de protocolo traz de volta os vetores vivos, cujo uso se tentou evitar com o desenvolvimento das vacinas de DNA e subunidades. A estratgia de vacinao prime-boost envolve o uso de duas vacinas diferentes, cada uma codificando o mesmo antgeno, administrado em intervalos de algumas semanas. Tal estratgia

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tem sido capaz de aumentar a resposta imune celular em diferentes modelos animais de infeces23. Como dito anteriormente, a maioria dos protocolos para imunizao por prime-boost em desenvolvimento inclui a induo da resposta imune com um vetor gnico, como um DNA plasmidial, utilizando vetores vivos virais24. Na preveno da tuberculose, a estratgia prime-boost tem sido avaliada combinando-se a dose de induo da resposta imune com DNA com a manuteno da resposta imune com BCG atenuado ou protenas recombinantes25,26. Esses protocolos normalmente requerem mais de uma dose de DNA para a induo da resposta imune, que sero seguidas das doses de reforo. Com o intuito de tornar vacinas gnicas produtos viveis, o vetor gnico deve atingir as clulas alvo na sua forma ativa, o que significa que este tem que vencer as diferentes barreiras do organismo. O encapsulamento do plasmdeo em microesferas polimricas biodegradveis uma das estratgias que tm sido propostas com sucesso para resolver esse desafio 27,28 . Entretanto, utilizando-se um modelo experimental murino, observou-se que a resposta imune induzida por microesferas contendo DNA-hsp65 diminui 90 dias aps a vacinao. A fim de aumentar a durao da resposta imune desencadeada pelo DNA encapsulado em microesfera, avaliou-se o efeito do reforo com protena recombinante tambm encapsulada em microesferas e administrada conjuntamente com o DNA. Entretanto, numa formulao de microesferas contendo DNA e protena, a liberao do DNA antes da liberao da protena fundamental para assegurar o sucesso na preveno da tuberculose devido sua capacidade de estimular resposta Th1, o que no se d com as microesferas contendo hsp65 recombinante. Alm disso, o co-encapsulamento do DMT como imunoestimualnte favorece o desenvolvimento do padro Th1 de resposta, uma vez que capaz de induzir a secreo de citocinas, como IL-12, contribuindo para criar um microambiente favorvel diferenciao de linfcitos Th1 durante a apresentao do antgeno(20). A hsp65 recombinante foi inicialmente encapsulada em microesferas de PLGA 75:25, que sustentam sua liberao por um perodo de 90 dias. Esta capacidade pode ser atribuda ao

maior nmero de monmeros de cido ltico na cadeia polimrica, o que a torna menos hidroflica, reduzindo sua degradao hidroltica se comparada s microesferas de PLGA 50:50 que encapsulam o DNA. A combinao de microesferas de PLGA 50:50 contendo DNAhsp65 e DMT com microesferas de PLGA 75:25 contendo hsp65 recombinante (prime-boost ) foi capaz de induzir a produo de altos nveis de anticorpos anti-hsp65. Os nveis sricos desses anticorpos so mantidos elevados por 90 dias aps a vacinao. Observou-se tambm alta produo de IFN- pelas clulas esplnicas dos animais vacinados durante todo o perodo avaliado (90 dias). Esses resultados sugerem o promissor potencial deste sistema de prime-boost baseado em vetores no vivos para aumentar a durao da resposta imune e transpor riscos relacionados toxicidade.

Terapia gnica na tuberculose: Atividade teraputica da vacina DNA hsp65

At recentemente, no havia perspectivas de se eliminar o bacilo da tuberculose do grande nmero de indivduos infectados um tero da populao mundial. O bacilo aloja-se com maior freqncia no pulmo, por tempo indefinido, mas pode infectar outros rgos permanecendo contido pelas clulas de defesa do organismo. Em decorrncia da diminuio da resistncia orgnica (desnutrio, subnutrio, estresse ou associao de outras doenas), o bacilo tende a se reproduzir intensamente e pode levar o indivduo morte, caso no seja devidamente tratado. A partir dessa fase de reproduo, considera-se instalada a doena, podendo ocorrer a contaminao de outras pessoas. A doena pode provocar graves leses que perduram mesmo aps o extermnio do bacilo, causando grande sofrimento ao paciente. Desenha-se um quadro de aumento da letalidade da tuberculose, que precisa ser equacionado com rapidez nos prximos anos. Assim, a evoluo de um modelo adequado de combate ou controle da tuberculose uma necessidade iminente. Os experimentos tm mostrado que a administrao da vacina DNAhsp65, em animais previamente infectados com M. tuberculosis virulenta, no s previne o desenvolvimento da doena como tambm elimina a infeco(29). Este

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fato torna-se realmente relevante quando se considera que cerca de dois bilhes de pessoas j esto infectadas pelo bacilo da TB. No Brasil so cerca de 60 milhes de pessoas. Alm disso, a vacina tem a propriedade de cura mesmo quando administrada em estados mais avanados da doena ou aps sua disseminao por todo o organismo do animal. A infeco por M. tuberculosis faz com que o sistema imunolgico dos animais passem a no responder contra o agente agressor e permite o crescimento acelerado dos bacilos e o estabelecimento da doena. Nessas condies a terapia gnica com a vacina de DNA hsp65 permitiu uma mudana radical e profunda da resposta imunolgica, passando do padro Th2 para o Th1, criando condies para o organismo combater os bacilos e curar a doena, mesmo sem a administrao de quimioterpicos antimicobacterianos (29). Esta foi a primeira demonstrao de que uma vacina gnica seja capaz de curar uma doena infecciosa.

Imunoterapia da tuberculose multidroga resistente

Um dos problemas mais srios relacionados com o controle da TB o aparecimento de bacilos que apresentam resistncia a vrios medicamentos utilizados no tratamento como a isoniazida, a pirazinamida, a estreptomicina e a rifampicina, dentre outros. J foram isolados bacilos que so resistentes no s a um desses medicamentos como tambm a combinaes de dois, trs e mesmo a todos ao mesmo tempo. Esses pacientes, portadores de bacilos denominados multidroga-resistentes, contam com poucas alternativas de tratamento e, s vezes, com nenhuma opo. Trabalhos recentes mostraram que animais infectados com bacilos resistentes a essas drogas tambm so curados pela administrao da vacina gnica (29).

Imunoterapia da tuberculose latente

Outro problema associado ao alto ndice de indivduos infectados correlaciona-se com o alto grau de adaptao dos bacilos ao homem. A infeco normalmente se estabelece aps a inalao dos bacilos e entrada dos mesmos nas clulas de defesa do organismo. Dentro dos macrfagos, que so clulas com alto potencial

microbicida, os bacilos tm a habilidade de desativar seus sistemas de defesa e conseguem sobreviver e se multiplicar no seu interior. O sistema de defesa imune do homem identifica a presena dos bacilos e estabelece uma resposta contra os mesmos, caracterizada por uma reao inflamatria crnica e granulomatosa que tem a finalidade de circunscrever e delimitar a infeco. Nestas condies os bacilos podem sobreviver por anos em estado de latncia ou dormncia e o indivduo infectado pode no manifestar a doena. A doena manifesta-se quando h um desequilbrio dessa relao mtua e est freqentemente associada com estados de supresso da resposta imunolgica. Entre os casos mais comuns de imunossupresso associados com a tuberculose esto os indivduos com a sndrome da imunodeficincia adquirida (AIDS), estressados, que utilizam frmacos imunossupressores, dependentes qumicos (como os dependentes de lcool) e desnutridos, dentre outros. O estado de latncia ou dormncia das micobactrias, que podem sofrer uma reativao e manifestar a doena em estados de imunossupresso, tambm foi analisado com o uso da terapia gnica. Foi desenvolvido um modelo experimental em camundongos que mimetiza as condies observadas no desenvolvimento da doena humana em indivduos imunossuprimidos. Nos grupos de animais controle, que no foram vacinados (infectados, tratados com frmacos antibacterianos para estabelecer um estado de latncia e tratados com corticosteride para causar imunossupresso), observou-se reativao da infeco e estabelecimento da doena. Nos grupos experimentais que foram tratados com a vacina de DNA, no foram observados reativaes e desenvolvimento da doena, principalmente quando foram administradas trs doses da vacina 29. A eliminao das bactrias dormentes pela vacina de DNA pode trazer benefcios significativos para o controle da TB e mesmo a sua erradicao. A vacina gnica foi utilizada no tratamento da doena, em conceito diferente em relao s vacinas convencionais, que so utilizadas somente como preveno instalao da doena. Essa vacina de DNA cura a infeco, cura a doena estabelecida e impede que ocorra a reativao da

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Jnior, Jos Maciel Rodrigues, et al. possvel uma vacina gnica auxiliar no controle da tuberculose?

doena, sem perder a sua caracterstica profiltica. Os benefcios prticos e estratgicos resultantes do desenvolvimento dessa vacina com atividade teraputica contra a tuberculose so inmeros. Ela segura, eficaz, pode ser dada em uma nica dose, estimula amplamente a resposta imunolgica, tem efeito protetor duradouro e pode contribuir significativamente para a diminuio da incidncia da doena.

reduo do perodo de tratamento da tuberculose com o uso de drogas e vacina de DNA

Frmacos bactericidas eliminam os bacilos susceptveis que esto se multiplicando normalmente, mas a alterao da imunidade na tuberculose clnica impede a destruio adequada dos bacilos remanescentes. Estes organismos seriam responsveis pela reativao da doena, prolongando o perodo de tratamento. A associao da imunoterapia com vacina de DNA quimioterapia convencional tem como objetivo o restabelecimento das funes do sistema imune aps a remoo da maior parte dos bacilos. Os mecanismos imunes devem reconhecer e destruir os bacilos persistentes, reduzindo desta forma o perodo de tratamento da quimioterapia a ser administrada para preveno de uma re-incidncia. Vrios protocolos e esquemas teraputicos foram usados com quimioterpicos e imunoterpicos como o DNA-hps65, concomitantemente, na tentativa de reduzir o perodo de tratamento contra a tuberculose. Animais foram infectados por via intravenosa, com aerossol e por via intratraqueal com M. tuberculosis e aps estabelecimento da infeco (presena de bacilos no bao, pulmo e fgado) o tratamento consistiu na associao da vacina de DNA-hsp65 com drogas como rifampicina, estreptomicina, isoniazida e pirazinamida. A vacina BCG foi usada para comparao da resposta. A avaliao foi realizada pela contagem do nmero de bacilos presentes nos rgos dos animais, principalmente no pulmo, e estudo da resposta imunolgica por dosagens de citocinas. Em um experimento piloto, o uso concomitante da vacina de DNA-hsp65 juntamente com a isoniazida e a pirazinamida foi eficaz e permitiu uma reduo significativa do perodo de tratamento dos animais infectados com M. tuberculosis.

Os benefcios prticos e estratgicos resultantes do desenvolvimento de vacinas gnicas so inmeros e absolutamente desejveis no contexto dos problemas de sade pblica de pases em desenvolvimento. O impacto sobre o controle das doenas infecciosas que podem ser prevenidas por imunizao gnica ser, provavelmente, uma das aquisies mais importantes advindas do domnio desta nova tecnologia. O desenvolvimento de novas vacinas que evitem, num futuro prximo, o aumento descontrolado de doenas infecciosas de fundamental importncia para a humanidade. Uma vacina de DNA contra a tuberculose contribuir de maneira significativa para o controle desta doena.

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