UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE NCLEO DE PS-GRADUAO EM QUMICA

RESUMO

JACIARA NASCIMENTO SANTOS

SO CRISTOVO 2011

JACIARA NASCIMENTO SANTOS

RESUMO:
Analysis of volatile aldehyde biomarkers in human blood by derivatization and dispersive liquid-liquid microextraction based on solidification of floating organic droplet method by high performance liquid chromatography

Resumo apresentado ao Prof. Haroldo Silveira Drea, da disciplina de Tpicos Especiais em Qumica I: Mtodos de Preparao Amostras Orgnicas.

SO CRISTOVO 2011

Nos ltimos anos, o interesse na anlise de aldedos de baixa massa molecular tem aumentado. Estes compostos orgnicos relativamente volteis desempenham um papel relevante a nvel fisiolgico e alguns aldedos so reconhecidos como biomarcadores do cncer. Determinados aldedos volteis so sintetizados pelo prprio organismo como produto de peroxidao lipdica. Entre os aldedos analisados, hexanal e heptanal eram comumente detectados como produtos do estresse oxidativo e biomarcadores de algumas doenas. Como resultado, uma srie de estudos tm se concentrado na identificao da presena de aldedos sob muitos aspectos, especialmente pelo ar exalado de indivduos. Assim, espera-se que a deteco de aldedos volteis de baixa massa molecular no sangue humano se torne uma abordagem alternativa e assistente na deteco precoce para o rastreio de doenas e no diagnstico para aplicao clnica no futuro. Devido a sua instabilidade qumica, elevada polaridade e ausncia de cromforos ou fluorforos, a determinao direta de aldedos se torna bastante complicada. Em vista disso, reaes de derivatizaes antes de sua deteco por tcnicas cromatogrficas so preferveis. Alguns reagentes de derivatizao incluem 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH), o-(2,3,4,5,6 pentafluorobenzil) hidroxilamina (PFBHA) e outros reagentes, sendo dentre eles, o mais utilizado para a separao por cromatografia lquida e deteco no ultravioleta o DNPH com o grupo de hidrazina (-NH-NH2) atuando como stio reativo na reao de derivatizao. Assim, o procedimento de extrao com solvente muitas vezes adotado para melhorar a separao e a deteco no mtodo. Inmeros mtodos tm sido aplicados para extrao de compostos volteis potenciais biomarcadores em amostras biolgicas, especialmente a microextrao em fase slida (SPME), a extrao em fase slida (SPE) e a extrao lquido-lquido (LLE). A microextrao em fase slida (SPME), desenvolvida por Pawliszyn e colaboradores, apresenta vrias vantagens relativamente a outras, das quais se destacam a combinao de extrao e prconcentrao num procedimento nico sem a necessidade de preparao da amostra e por, principalmente, no requerer o uso de solventes prejudiciais ao meio ambiente. Biomarcadores de aldedos volteis no sangue humano foram extrados com sucesso atravs da SPME aps derivatizao e analisados por GC-MS. Recentemente, um novo mtodo de microextrao em fase lquida chamado de microextrao lquido-lquido em fase dispersiva (DLLME), introduzido por Rezaee, foi desenvolvido. A tcnica simples e rpida, baseada no uso de solvente extrator e dispersivo apropriados. Esse mtodo tem alcanado sucesso em muitas aplicaes. No entanto, os solventes de extrao no mtodo so bastante limitados. Os solventes amplamente utilizados

so o clorobenzeno, clorofrmio, tetraclorometano e disulfeto de carbono, porm todos eles so txicos e ofensivos ao meio ambiente. Considerando-se os problemas relacionados, a microextrao lquido-lquido dispersiva, baseada na solidificao da gota orgnica flutuante usando compostos orgnicos de baixa densidade na fase extratora, foi desenvolvida e aplicada anlise ambiental. Neste trabalho, a DLLME-SFO foi introduzida para analisar amostras complexas de sangue. A viabilidade do novo mtodo foi investigada por acoplamento em cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) e foi aplicado para determinar a concentrao de hexanal e heptanal no soro das pessoas saudveis e de pacientes com cncer de pulmo. Amostras de sangue de quatro pessoas saudveis e de nove pacientes com cncer de pulmo foram obtidas do Hubei Cancer Hospital, Wuhan, China. A aprovao tica para os estudos foi obtida antes da coleta e anlise das amostras de sangue a partir do Comit da Etnia Hubei Cancer Hospital, que foram armazenadas a 20C antes do uso. Na anlise do soro, foram adicionados 750 L de metanol para remover protenas e outras substncias. 500 L do lquido sobrenadante foi diludo com gua ultra pura para a determinao dos aldedos. O reagente utilizado na derivatizao foi 2,4-DNPH. Durante o curso de derivatizao, a quantidade de reagente muito importante. A fim de investigar a influncia da quantidade de 2,4-DNPH na eficincia da derivatizao, foram realizados estudos com vrios volumes na faixa de 10-40 L. Assim, o melhor resultado foi obtido utilizando o volume de 30 L de 2,4DNPH. Pelo fato de a derivatizao de aldedos com 2,4-DNPH necessitar de um ambiente cido, foi adicionado cido frmico como catalisador na soluo da amostra e seu volume foi otimizado no experimento. Os resultados mostraram que as reas de picos dos derivados de aldedos aumentaram com o aumento do volume de cido frmico. O tempo e a temperatura da reao de derivatizao na eficincia da extrao foram tambm avaliados. A temperatura ideal e o tempo de derivatizao foram 40C e 10min, respectivamente. No procedimento da DLLME-SFO, a perfeita seleo do solvente vital, devendo ter baixa solubilidade em gua, grande afinidade com os analitos, baixo ponto de fuso, densidade mais baixa que a d gua e comportamento cromatogrfico bom. Neste estudo, o solvente extrator selecionado como mais excelente na eficincia da extrao foi o dodecanol. O solvente extrator para o mtodo DLLME-SFO deve ser imiscvel em gua e miscvel no solvente dispersor, e o solvente dispersor deve ser miscvel em gua, bem como ter tambm um bom comportamento cromatogrfico quando injetado diretamente para a anlise cromatogrfica. Neste experimento, os solventes dispersores selecionados para

avaliao foram: metanol, etanol e ter etlico. Os resultados obtidos demonstraram que o metanol como solvente dispersor, possui melhor eficincia de extrao, e, como volume ideal de metanol, a melhor eficincia de extrao obtida foi com 50 L. Na observao do efeito salino, a eficincia da extrao foi alcanada ao utilizar cloreto de sdio com concentrao de 0,15 g.mL-1. O tempo de extrao definido como sendo o intervalo de tempo entre a injeo da amostra de solvente dispersor e de solvente extrator e o tempo em que a amostra centrifugada. Ao injetar os solventes orgnicos na amostra aquosa, uma soluo turva foi formada, que consistia de gotculas dispersas. Aps a centrifugao, a gota do solvente extrator lanada na superfcie da soluo. Posteriormente, o frasco contendo a amostra colocado em banho de gelo e, assim, a gotcula do solvente orgnico foi solidificada e coletada para anlise em HPLC. Os derivados de aldedos foram extrados nas gotculas solidificadas de dodecanol em poucos segundos e se chegou ao equilbrio de extrao rapidamente. Os resultados obtidos pelo mtodo DLLME-SFO neste trabalho mostraram que as concentraes de hexanal e heptanal detectadas no soro de pacientes com cncer de pulmo variaram de 2,28 a 25,34 molL-1 e de 0,16 a 3,91 molL-1, respectivamente. J no soro das pessoas normais, as concentraes de hexanal e heptanal foram bem menores. Como as concentraes dos aldedos no sangue dos pacientes com cncer de pulmo foram mais elevadas, isso sugere que hexanal e heptanal no sangue podem ser considerados como potenciais biomarcadores de cncer de pulmo. A proposta do mtodo de DLLME-SFO demonstrou ser uma excelente rota para a determinao de traos de biomarcadores de aldedos em amostras biolgicas, pois os resultados indicam que esse procedimento de extrao notvel devido s suas vantagens, incluindo o consumo mnimo de solventes orgnicos, simplicidade, baixo custo, rapidez, alta eficincia e ser amigvel ao ambiente. Portanto, o mtodo DLLME-SFO demonstrou ter um grande potencial na investigao de biomarcadores volteis (aldedos) de doenas em amostras biolgicas complexas e tornou-se uma ferramenta til no diagnstico precoce do cncer de pulmo.