Relatrio de Bioqumica

Ano Lectivo 2011/2012

Resumo
Esta actividade experimental teve como objectivo a separao das protenas do soro de coelho. O soro de coelho constitudo por uma grande variedade de protenas, 15 no total, entre as quais se destacam a Albumina, as Globulinas -1, -2, e . Para tal, utilizmos o mtodo convencional de electroforese por zona que se baseia no movimento de protenas a partir de um ponto de aplicao por aco de um campo elctrico, de acordo com a sua carga global e massa molecular relativa. As protenas deslocam-se ao longo de um meio de suporte poroso, que no nosso caso foi uma tira de acetato de celulose, gerando um electroferograma simples de ser analisado. No final da experincia, que decorreu sem problemas, foi-nos possvel observar com alguma clareza as 5 tiras resultantes da electroforese e faz-las corresponder s diferentes protenas contidas no soro de coelho.

Resultados

1 4 5 2 3

Ilustrao 1: Fotografia e ampliao da tira obtida por electroforese

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C T O D O

N O D O 6 5 4 3 2 1

Ilustrao 2: Esquema da tira apresentando as faixas correspondentes a cada protena separada bem como o ponto de aplicao da soluo

Legenda: 1 Albumina 2 - Globulinas -1 3 - Globulinas -2 4 - Globulinas 5 - Globulinas 6 Pondo de Aplicao

Discusso/Concluso
Tal como referido no resumo, nesta actividade experimental fizemos uma electroforese por zona. Comemos por colocar a tira de celulose na tina de electroforeses (ilustrao 4) e ligamo-la fonte de alimentao de forma a que se criasse uma diferena
Ilustrao 3: Tina de electroforese e respectiva fonte de alimentao

de potencial entre os dois compartimentos da tina, um com carga negativa e outro com carga positiva.

Sem esta diferena de cargas no se criaria o campo elctrico necessrio para a migrao das protenas ao longo da tira. Sabendo que ao pH da soluo tampo todas as protenas teriam carga global negativa e se deslocariam para o nodo, a amostra de soro foi colocada na ponta da tira que se encontrava do lado do ctodo de forma a melhor se visualizar as diferenas entre as bandas. Depois de retirada da tina de electroforeses, a tira de acetato de celulose foi embebida num reagente especfico para a preparao de corantes para electroforese, o Ponceau S. Este reagente, cuja estrutura pode ser vista ao lado, liga-se aos grupos amina positivamente carregados das protenas bem como s suas regies apolares (mas com ligaes no 2

Relatrio de Bioqumica covalentes) e confere-lhes a caracterstica colorao vermelha. A tira foi depois mergulhada em cido actico de forma a retirar o excesso de reagente de Ponceau S. Seguidamente, o observar a tira de celulose que obtivemos, verificmos que existiam apenas 5

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Ilustrao 4: Estrutura qumica do reagente

riscas, correspondentes s protenas predominantes de Ponceau S no soro de coelho. O aparecimento de apenas estas 5 protenas deve-se ao facto de a elas se agregarem as restantes protenas que possuem cargas e massas semelhantes s suas. Assim, possvel estabelecer a seguinte sequncia, do ctodo para o nodo: uma primeira risca correspondente s Globulinas , uma segunda que corresponde s Globulinas seguida das riscas das Globulinas -2 e -1, respectivamente, e por ltimo a risca formada pela Albumina. Este padro pode explicar-se conhecendo o pH da soluo, o ponto isoelctrico de cada protena e as suas massas relativas. Isto porque, para saber o movimento de cada protena em relao ao campo elctrico necessrio conhecer a carga global das protenas ao pH de trabalho. No nosso caso, utilizmos uma soluo tampo cujo pH de 8.6. O uso de uma soluo tampo para este mtodo de separao de protenas indispensvel uma vez que impede mudanas bruscas de pH que seriam prejudiciais aos resultados da experincia. Por outro lado, esta soluo apresenta uma zona tampo cujo pH se situa relativamente distante dos pontos isoelctricos das protenas, condio necessria para que se possa inferir a carga das protenas quele pH. Se o pH da soluo for inferior ao pI (ponto isoelctrico), a protena adquire carga global positiva fazendo com que esta seja atrada para o ctodo (plo negativo). Se o pH da soluo for superior ao pI, a protena ficar com carga global negativa e mover-se- para o nodo (plo positivo). Se, por outro lado, o pH for igual ao pI, a protena no se desloca, mantm-se no ponto de aplicao. De acordo com a tabela apresentada ao lado, os pontos isoelctricos das protenas presentes no soro do coelho so inferiores ao pH da soluo, ou seja, tm carga global negativa deslocando-se para o nodo. Uma das razes pela qual as Globulinas terem sido as que menos se deslocaram do ponto de aplicao Protenas Albumina Globulinas -1 Globulinas -2 Globulinas Globulinas Ponto isoelctrico (intervalo) 4.7 a 5.4 4.7 a 5.4 4.7 a 5.4 5.4 a 5.8 6.3 a 8.3

Tabela 1: Pontos isoelctricos das protenas contidas a forma de intervalos uma vez que as protenas

no soro de coelho. Os pontos isoelctricos esto sob

precisamente o facto de o seu ponto isoelctrico sricas no tm valores fixos para os mesmos.

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ser to prximo do pH de trabalho e, por isso, algumas das suas molculas podero estar j no estado neutro tornado a carga global da protena menos negativa que a das restantes. Para alm do pH e dos pontos isoelctricos, a massa molecular de cada protena tambm influencia o seu movimento em relao ao ponto de aplicao, sendo inversamente proporcional velocidade de migrao da respectiva protena. As protenas de menor massa movem-se mais facilmente ao longo da tira, afastando-se mais rapidamente do ponto de aplicao. As protenas de maior massa molecular, pelo contrrio, apresentam uma velocidade de migrao muito menor. Assim, e tendo em conta que a albumina a protena de menor tamanho e que as globulinas so as maiores, natural que a primeira se tenha afastado mais do ponto de aplicao e que as segundas pouco se tenham movido. Combinando estes trs factores podemos concluir que quanto menor for a massa molecular relativa da protena e maior for a diferena entre o seu ponto isoelctrico e o pH da soluo mais rapidamente migra a protena, como sucedeu com a albumina nesta situao particular. O inverso deste princpio tambm verdade sendo, nesta situao, o caso das globulinas . Assim, podemos concluir que cumprimos maioritariamente os objectivos traados para o desenvolvimento desta actividade experimental e mencionados anteriormente no resumo e que os resultados foram satisfatrios.

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Bibliografia Electroforese

In: Scribd

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Ponceau S Staining Solution

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