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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC

CURSO DE FARMCIA

WILLIAN BONELI DE ALMEIDA

ATIVIDADE NUCLESICA DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl2(nic)4] SOBRE O CIDO DESOXIRRIBONUCLICO IN VITRO E IN VIVO

CRICIMA, NOVEMBRO DE 2006.

WILLIAN BONELI DE ALMEIDA

ATIVIDADE NUCLESICA DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl2(nic)4] SOBRE O CIDO DESOXIRRIBONUCLICO IN VITRO E IN VIVO

Trabalho de Concluso de Curso, apresentado para obteno do grau de Farmacutico no curso de Farmcia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC. Orientador: Prof. Msc. Claus Trger Pich

CRICIMA, NOVEMBRO DE 2006.

WILLIAN BONELI DE ALMEIDA

ATIVIDADE NUCLESICA DO COMPLEXO trans-[Ru(II)Cl2(nic)4] SOBRE O CIDO DESOXIRRIBONUCLICO IN VITRO E IN VIVO

Trabalho de Concluso de Curso aprovado pela Banca Examinadora para obteno do Grau de Farmacutico, no Curso de Farmcia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC, com Linha de Pesquisa em Interao de complexos organometlicos com DNA.

Cricima, 29 de novembro de 2006.

_____________________________________________________ Profa. Msc. Tatiana Barichello Coordenadora do curso de Farmcia

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________________ Prof. Msc. Claus Trger Pich Bilogo - (UNESC) - Orientador

______________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Marques da Silva Paula - Qumico - (UNESC)

______________________________________________________ Prof. Dr. Ernandes Benedito Pereira - Engenheiro Qumico Industrial - (UNESC)

Dedico esse trabalho para toda a minha famlia, aos meus colegas pesquisadores do Grupo de Pesquisa em Imunolgia e Gentica Ambiental GPIGA, e para todos que de alguma maneira contriburam para minha formao profissional.

AGRADECIMENTOS

Deixo expressos meus sinceros agradecimentos s seguintes pessoas e instituies, das quais ajudaram em muito, durante o perodo da minha graduao e no desenvolvimento deste trabalho. Agradeo especialmente ao professor orientador e amigo Claus Trger Pich pelo apoio e incentivo prestados durante toda minha permanncia na pesquisa e alm de sua participao ativa neste trabalho. Agradeo ao Professor Marcos Marque da Silva Paula pelo fornecimento do complexo que possibilitou a realizao do projeto e tambm pela amizade. Agradeo ao Grupo de Pesquisa em Imunolgia Gentica Ambiental GPIGA, pela oportunidade de trabalho e pela verba destinada realizao deste trabalho. Agradeo aos colegas pesquisadores do GPIGA: Bruno Castro Caurio, Geverson Teixeira Jean Borges Bertoldo, Juliano Urbano Bobassaro, Luceli Ficagna, Rodrigo Costa Zeferino, Tiago Bortoloto, Juana Villatore, Larissa Pavei, que contriburam em muito na realizao deste trabalho e principalmente pela amizade. Agradeo ao professores integrantes do GPIGA: Silvio vila Junior, Tatiana Shoenfelder, Reginaldo Geremias e Cludio Ricken. Agradeo aos tcnicos do Laboratrio de Bioqumica, Sinara Colonetti, Tiago Incio, Mara e Geovana pela amizade destes anos todos. Agradeo a minha famlia, meu pai Joo Batista de Almeida, minha me Rosania Boneli de Almeida e a meu irmo Lucas Boneli de Almeida, pelo estmulo e apoio incondicional desde h primeira hora; pela pacincia e grande amizade com que sempre me ouviram, e sensatez com que sempre me ajudaram.

Costumvamos pensar que nosso futuro estava nas estrelas. Agora sabemos que ele est nos nossos genes. James Watson

RESUMO

A qumica sinttica dos complexos coordenados por ons metlicos de transio, tem possibilitado diversas combinaes por sua capacidade de afinidade com diversos ligantes. Atualmente resultado de trabalho intenso por parte de vrios grupos de pesquisa, com especial ateno ao seu potencial teraputico e a compreenso das atividades desempenhadas por metais e metaloenzimas em sistemas naturais. Complexos de rutnio so de grande interesse, devido a forte estabilizao do campo ligante e afinidade e habilidade de ajustar diversos tipo de ligantes e apresentam um grande potencial redox. O complexo trans[Ru(II)Cl2(piridina-3-cido carboxlico)4] foi descrito como agente antioxidante, onde demonstrou interferncia em reaes envolvendo espcies qumicas como NO e H2O2, apresentou atividade genotxica em testes ''in vitro'', entre outras caractersticas. Levando em considerao estes resultados, este trabalho objetivou aumentar o conhecimento dos efeitos biolgicos deste complexo atravs de testes de genotoxicidade e mutagnese in vivo, alm de testes de sua interao com DNA plasmidial in vitro.Aps a aprovao pelo comit de tica desta universidade a genotoxicidade (teste cometa) e mutagnese (teste de microncleo), utilizando-se 6 camundongos CF1 para o teste cometa e 3 para o teste de microncleo. Os animais foram tratados com complexo via intraperitoneal nas concentraes de (45,2; 90,4; 180,7M/Kg) e com o respectivo controle. O perodo de exposio para todos os camundongos foi de 0 a 120 minutos para o teste cometa (sangue perifrico) e de 24 horas para o teste de microncleo (clulas de medula ssea). Na anlise de interao do complexo e do ligante com molculas de DNA, foi analisada em incubaes contendo plasmdeo pBSK-II com complexo nas concentraes de (250, 500 e 1000M) para os respectivos pHs (6,0; 7,0 e 8,0) foram realizadas 37C por 16h, para anlise do possvel mecanismo de clivagem foram analisadas em incubaes contendo DMSO. A cintica de cataltica do complexo sobre o DNA foi realizada com incubaes em pH 6,5 monitoradas por 480 minutos. O teste estatstico utilizado para todos as anlises foi anlise de varincia ANOVA atravs do programa Microcal Origin 6.0.O complexo foi capaz de clivar o DNA, porem essa atividade diferente em cada pH testado, observando-se uma maior atividade em pH 6,0. Em incubaes de complexo e DNA contendo DMSO a atividade de clivagem foi diminuda mais no inibida sugerindo um possvel mecanismo oxidativo envolvendo as reaes de Fenton e Haber-Weiss, e uma possvel atividade hidroltica. Na incubao de DNA com ligante no complexado, os resultados obtidos foram nulos, demonstrando ser a atividade nuclesica caracterstica do complexo. Os resultados de cintica realizados a partir da reao de Michaelis-Menten, demonstraram os valores para os seguintes parmetros analisados, Vmax= 1,4x10-3 mol min-1, Km= 457,14M e Kcat= 8,4x10-2 h-1. A eficincia cataltica observada foi de 183,75M-1.h-1 e o valor de Enhancement para a acelerao da reao foi de 2,33x106. Efeitos genotxicos in vivo foram observados, levando em considerao que esses efeitos so diferentes para cada concentrao testada e o tempo de exposio dos animais ao complexo. Foi observada tambm uma atividade mutagnica do complexo nas concentraes testadas. Palavras-chave: Complexos de Rutnio; Clivagem de DNA; Genotoxicidade e Mutagnese.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Bases nitrogenadas ............................................................................................. 15 Figura 2 Ligaes fosfodister entre nucleotdeos ............................................................ 16 Figura 3 Estrutura qumica de um nucleotdeo. O R pode ser um Hidrognio no caso do DNA ou uma Hidroxila no caso do RNA. ............................................................................ 17 Figura 4 Modelo Watson-Crick para Estrutura do DNA ................................................... 18 Figura 5 Pareamento de bases ......................................................................................... 19 Figura 6 Pareamento de Hoogsteen .................................................................................. 20 Figura 7 Representao esquemtica da desnaturao e renaturao do DNA.................... 21 Figura 8 O espectro de absorbncia ao UV do DNA de E. coli nativo e desnaturado pelo calor. Observe que a desnaturao no muda o formato geral da curva de absorbncia, mas apenas aumenta sua intesidade. ............................................................................................ 22 Figura 9 Formas do DNA................................................................................................ 23 Figura 10 Conformao da pentose .................................................................................. 23 Figura 11 Supertoro do DNA........................................................................................ 24 Figura 12 Medida do superenrolamento. Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etdeo. O DNA aparece como bandas claras(fluorescente) na presena de UV. (a) 0Mol de topoisomerase I (b) 0,25Mol de topoisomerase I; (c) 0,50Mol de topoisomerase I; (d) 1,0Mol de topoisomerase I; (e) 2,0Mol de topoisomerase I. .................................... 25 Figura 13 Mecanismo hidroltico da endonucleases sobre os cido nuclicos. .................. 26 Figura 14 Leses provocadas por radical hidroxila (OH) nas bases purnicas.................. 27 Figura 15 Leses provocadas por radical hidroxila (OH) nas bases pirimidnicas ............ 28 Figura 16 dmeros de pirimidinas CPD (Dmero de pirimidina ciclobutano) e o 6-4 (Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto)............................................................................... 28 Figura 17 Leses geradas pelo radical hidroxila (OH) na pentose do DNA. ..................... 29 Figura 18 Juno Holliday ............................................................................................... 30 Figura 19 Anlogos de Base............................................................................................. 32 Figura 20 Agentes qumicos intercalantes de DNA........................................................... 32 Figura 21 Estrutura da Cisplatina e Carboplatina.............................................................. 36 Figura 22 Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78 H2O........... 38 Figura 23 Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6-butiladenina)]].................... 38 Figura 24 estrutura do complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III) Cl4(DMSO-S)] ................. 39

Figura 25 Estrutura do Complexo de Rutnio(III) KP1019 (FFC14A) ................................ 39 Figura 26 Estrutura proposta para os complexos de rutnio trans-[RuCl2(nic)4] (A) e trans[RuCl2(i-nic)4] (B). .............................................................................................................. 40 Figura 27 Estrutura proposta para os complexos de rutnio trans-[Ru (II)Cl2(dinic)4] (A) e trans-[Ru(II)Cl2(i-dinic)4] (B) .............................................................................................. 41 Figura 28 Distribuio de espcies protonadas correspondente ao complexo (I) em funo do pH. H4C(espcie tetraprotonada), H3C(espcie triprotonada), H2C(espcie diprotonada), HC (espcie monoprotonada) e C(espcie sem prton)......................................................... 43 Figura 29 Esquema de Corte da Molcula de DNA Plasmidial ......................................... 45 Figura 30 Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separao das formas do DNA plasmidial ............................................................................................................................ 45 Figura 31 Mapa do Plasmdio pBSK-II ............................................................................. 45 Figura 32 Esquema representativo do mtodo da estrao do DNA. ................................. 47 Figura 33 Mostra um esquema representativo da eletroforese em gel de agarose. (A) a matriz solidificada deixando forma os poos. (B)as amostra so depositadas no poos. (C) so submetidas a um campo eltrico.(D) os fragmentos apresentam uma migrao diferencial. ............................................................................................................................................ 50 Figura 34 Descrio simplificada do teste cometa. ........................................................... 52 Figura 35 Classificao do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3; (c) dano classe 4................................................................................................................... 53 Figura 36 Diferena na colorao de PCE e NCE: (a) eritrcito policromtico micronucleado (PCEMN); (b) eritrcito policromtico; (c) eritrcito normocromatico. ........ 53 Figura 37 Mdia da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentraes crescentes do ligante (cido nicotnico) descomplexado, nos pHs(6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no grfico. ..................................................................................................... 57 Figura 38 Mdia da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentraes crescentes do complexo, nos pHs (6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no grfico. (**p<0,01 e ***p<0,001). .................................................................................................... 59 Figura 39 Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 6,0, na presena ou no de 10% DMSO. (***p<0,001). ............................................ 60 Figura 40 Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 7,0, na presena ou no de 10% DMSO. ................................................................... 61 Figura 41 Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 8,0, na presena ou no de 10% DMSO. (***p<0,001; **p<0,01 e *p<0,05). ........... 62

Figura 42 Atividade cataltica de diversas concentraes do complexo sobre o DNA plasmidial pBSK-II em 480 minutos de incubao a um temperatura de 50C em pH 6,5. .... 64 Figura 43 Constante cataltica do complexo calculado em base a concentraes crescentes de complexo e a quantidade em moles de substrato degradado por minuto. .......................... 64 Figura 44 modelo de Lineweaver-Burk ............................................................................ 65 Figura 45 ndice de fragmentao do DNA de clulas sangneas de camundongos CF1.. 66 Figura 46 Percentual de clulas sangneas de camundongos CF1, com o seu DNA

fragmentado......................................................................................................................... 68 Figura 47 Percentual de microncleo encontrados em eritrcitos policromticos, da medula ssea de camundongos CF1. (*p<0,05). ............................................................................... 69 Figura 48 Reao de Fenton adaptada para o on de Ru(II)............................................... 71 Figura 49 Reao proposta de hidrolise da ligao fosfodister do DNA plasmidial (pBSKII) causado pelo complexo de rutnio trans-[RuCl2(nic)4]. .................................................. 72

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Fotos dos gis das incubaes do ligante e complexo . ....................................... 55 Tabela 2 Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do ligante com o DNA plasmidial ............................................................................................................................ 56 Tabela 3 Porcentagem da formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA plasmidial. ........................................................................................................................... 58 Tabela 4 Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 6,0. ........................................................................... 60 Tabela 5 Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 7,0. ........................................................................... 61 Tabela 6 Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 8,0. ........................................................................... 62 Tabela 7 Fotos do Gis do experimento de cintica cataltica do complexo....................... 63 Tabela 8 Valores do ndice de fragmentao do DNA....................................................... 66 Tabela 9 Valores da freqncia de clulas com DNA danificado. ..................................... 68 Tabela 10 Porcentagem de microncleos .......................................................................... 69

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

C graus Celsius A - adenina Ax absorbncia C -citosina CaCl2 cloreto de clcio DMSO - dimetil sulfxido DNA cido desoxirribonuclico E.coli Escherichia coli EDTA cido etilenodiaminotetractico FI - forma superenrolada do plasmdio FII - forma circular aberta do plasmdio FIII - forma linear do plasmdio G -guanina HEPES - N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-cido etanosulfnico Mg2+ - on magnsio mL - mililitros mM - milimolar NaCl - cloreto de sdio NaOH hidrxido de sdio NCE eritrcito normocromtico OH - radical hidrolixa PBS Cloreto de sdio/cloreto de potssio/ fosfato de sdio dibsico/ fosfato de sdio monobsico pBSK-II - plasmdio pBluescript II SK(+) PCE eritrcito policromtico pH potencial hidrognionico PIPES piperazina-N-N-bis(cido 2-etano sulfnico). RNA - cido ribonuclico RPM rotaes por minuto T - timina TBE - tampo Tris/borato/EDTA

trans-[RuCl2(nic)4] - trans-Dicloro Tetraquis cido-3-piridina Carboxlico Rutnio Tris - tris(hidroximetil) aminometano Triton X-100 - ter p-t-octilfenil polioxietileno U uracila uM micromolar UV-Vis ultravioleta - visvel comprimento e onda g microgramas L - microlitros K obs constante observada

SUMRIO

1 INTRODUO............................................................................................................... 12 2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 13 3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 14 3.1 Geral ............................................................................................................................. 14 3.2 Especifico ...................................................................................................................... 14 4 FUNDAMENTAO TERICA .................................................................................. 15 4.1 cidos nuclicos............................................................................................................ 15 4.1.1 Propriedades Fsicas e Qumicas do DNA ................................................................ 16 4.1.1.1 Modelo WatsonCrick para estrutura do DNA.......................................................... 17 4.1.1.2 Desnaturao e Renaturao do DNA....................................................................... 20 4.1.1.3 Formas Tridimensionais de DNA ............................................................................. 22 4.1.1.4 Supertoro do DNA ................................................................................................ 24 4.1.2 Degradao do DNA por Nucleases .......................................................................... 25 4.1.3 Danos e Sistemas de Reparo...................................................................................... 26 4.1.3.1 Reparo Por Exciso de Bases.................................................................................... 26 4.1.3.2 Reparo Por Exciso de Nucleotdeos ........................................................................ 28 4.1.3.3 Reparo Por Recombinao........................................................................................ 29 4.1.3.4 Reparo Sujeito a Erros.............................................................................................. 30 4.1.4 Genotoxicidade .......................................................................................................... 31 4.1.4.1 Mutao e Cncer..................................................................................................... 31 4.2 Complexos organometlicos......................................................................................... 34 4.2.1 Complexos de Lantandeos ....................................................................................... 35 4.2.2 Complexos de metais de transio ............................................................................ 36 4.2.2.1 Complexos de Rutnio.............................................................................................. 37 4.2.2.1.1 Complexo polipiridnico de Rutnio trans-[RuCl2(L)4] .......................................... 39 5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................... 44 5.1 Local. ............................................................................................................................ 44 5.2 Obteno do complexo trans-[RuCl2(nic)4] ................................................................. 44 5.3 Anlise de Interao com Molculas de DNA plasmidial ........................................... 44 5.3.1.1 Preparao de bactrias competentes ........................................................................ 46 5.3.1.2 Transformao das bactrias competentes................................................................. 46

5.3.1.3 Extrao do DNA plasmidial das bactrias transformadas......................................... 47 5.3.1.3.1 Anlise da Pureza do DNA plasmidial ................................................................... 47 5.3.2.1 Interao do ligante com molculas de DNA ............................................................ 48 5.3.2.2 Interao do complexo com molculas de DNA........................................................ 48 5.3.2.3 Interao do complexo com molculas de DNA na presena de DMSO.................... 49 5.3.2.4 Cintica cataltica do complexo sobre o DNA........................................................... 49 5.3.3 Confeco do gel de agarose e corrida eletrofortica............................................... 49 5.4 Anlise de Genotoxicidade e Mutagnese.................................................................... 50 5.4.1 Animais e Tratamento............................................................................................... 50 5.4.2 Anlise de Genotoxicidade ........................................................................................ 51 5.4.2.1 Teste cometa ............................................................................................................ 51 5.4.3 Analise de Mutagnese .............................................................................................. 53 5.4.3.1 Teste de microncleo................................................................................................ 53 5.5. Anlise Estatstica ....................................................................................................... 54 6 RESULTADOS ............................................................................................................... 55 6.1 Anlises de Interao com Molculas de DNA plasmidial.......................................... 55 6.1.1 Interao do ligante com molculas de DNA............................................................ 56 6.1.2 Interao do complexo com molculas de DNA ....................................................... 57 6.1.3 Interao do complexo com molculas de DNA em presena de DMSO...................... 59 6.1.4 Cintica cataltica do complexo sobre molculas de DNA ....................................... 63 6.2. Anlise de Genotoxicidade e Mutagnese................................................................... 65 6.2.1 Teste Cometa ............................................................................................................. 65 6.2.1.1 ndice de Fragmentao ao DNA.............................................................................. 65 6.2.1.2 Freqncia de dano ao DNA..................................................................................... 67 6.2.2 Teste Microncleo ..................................................................................................... 68 7 DISCUSSO DOS RESULTADOS................................................................................ 70 7.1 Clivagem do DNA......................................................................................................... 70 7.1.1 Atividade de clivagem do Ligante............................................................................. 70 7.1.2 Atividade de clivagem do complexo.......................................................................... 70 7.1.3 Atividade de clivagem do complexo em presena de DMSO ................................... 71 7.4 Cintica Cataltica do Complexo ................................................................................. 72 7.2 Teste Cometa ................................................................................................................ 73 7.2.1 ndice e freqncia de dano ao DNA ........................................................................ 73 7.3 Teste Microncleo ........................................................................................................ 73

8 CONCLUSO................................................................................................................. 75 9 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 76 REFERNCIAS................................................................................................................. 77 APNDICES ...................................................................................................................... 82 APNDICE A ANLISE ESTATSTICA DO TESTE DE INTERAO .................. 83 APNDICE B VALORES DOS RESULTADOS DE CINTICA CATALTICA ....... 87 APNDICE C ANLISE ESTATSTICA DO TESTE COMETA. ............................. 88 APNDICE D ANLISE ESTATSTICA DO TESTE MICRONCLEO.................. 90 ANEXO .............................................................................................................................. 91 ANEXO A APROVAO DO TRABALHO PERANTE O COMIT DE TICA DESTA UNIVERSIDADE. ................................................................................................ 92

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1 INTRODUO

Torna-se cada vez maior o interesse no esclarecimento de processos qumicos que ocorrem em sistemas biolgicos, para aumentar o conhecimento sobre a atividade de diversas macromolculas em processos fisiolgicos e patolgicos. Para o entendimento desses sistemas biolgicos, hoje tem acontecido a troca viva de idias entre qumicos inorgnicos e os bioqumicos, que tm conduzido ao crescimento e ao reconhecimento da rea interdisciplinar de Qumica Bioinorgnica. Assim a Qumica Bioinorgnica tem como principal objetivo elaborao, da sntese e da caracterizao estrutural e fsico-qumica de stios ativos de protenas, membranas e cidos nuclicos. Atualmente vm sendo muito estudados compostos coordenados por metais, para a compreenso das atividades desempenhadas por metais e metaloprotenas em sistemas biolgicos. Especialmente aqueles que so capazes de clivar cidos nuclicos em condies mais prximas das fisiolgicas, de forma hidroltica que possibilita uma clivagem do DNA com terminais religveis enzimaticamente. Tornaram-se objeto de grande interesse por vrios grupos de pesquisas, por servir como ferramenta em biologia molecular e bioqumica, e tambm na teraputica. As caractersticas qumicas adotadas pelos complexos coordenados por metais, de ter uma estrutura tridimensional, carter catinico e tendncia para fazer reaes redox, de hidrlise, ou fotorreaes, torna-os conhecidos por interferir em processos celulares, como diviso celular e expresso de gnica. Tambm podem desempenhar atividades em processos no naturais como toxicidade e carcinogenicidade. Um dos primeiros complexos coordenados por metais a serem utilizados na teraputica contra o cncer, foram os complexos a base de platina. A partir dessa descoberta houve uma procura maior de novos complexos coordenados por metais de transio com atividade contra o cncer Entre os compostos a base de platina, entra os complexos coordenados por ons de Rutnio (II, III) que apresentam caractersticas semelhantes, e atravs de alguns testes in vitro, indcios de interao com o DNA, havendo possibilidade, em um futuro prximo, destes tambm se tornarem uma referncia na terapia contra o cncer. O Complexo polipiridnico trans-dicloro tetraquis cido-3-piridina carboxlico Rutnio (trans-[Ru(II)Cl2(nic)4]) em estudo nesse presente trabalho, apresentou em outros trabalhos indcios de influenciar em certos sistemas biolgicos.

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2 JUSTIFICATIVA

A sntese de novos compostos que interagem com o DNA, com a funo de clivar ou de impossibilitar a transcrio e/ou reparo desta estrutura de grande interesse na busca de agentes antitumorais. Diante dos resultados encontrados em experimentos prvios j descrito na literatura referentes ao complexo trans-[RuCl2(nic)4], que demonstrou atividade sobre sistemas biolgicos, incluindo, atividade antioxidante e genotoxicidade in vitro, atividade reguladora de NO e atividade analgsica in vivo de interesse prosseguir nos estudos afim de verificar a sua atividade genotxica e mutagnica in vivo e sua capacidade de interao com molculas de DNA in vitro.

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3 OBJETIVOS

3.1 Geral

Avaliar a atividade nuclesica do complexo, trans-[RuCl2(nic)4], quanto ao seu potencial de ligao com molculas de DNA plasmidial in vitro, e conseqentemente sua capacidade de promover dano aos cidos nuclicos de clulas sanguneas e medulares de camundongos CF1 in vivo.

3.2 Especifico

Avaliar em diferentes concentraes e pHs o potencial de ligao e clivagem do complexo com molculas de DNA plasmidial in vitro, utilizando tcnica de eletroforese em gel de agarose; Analisar em diferentes concentraes e pHs o potencial de ligao e clivagem do ligante no complexado com molculas de DNA plasmidial in vitro, utilizando tcnica de eletroforese em gel de agarose; Verificar o mecanismo de clivagem hidroltico ou oxidativo do complexo sobre molculas de DNA plasmidial, utilizando varias concentraes do complexo e pHs, na presena de DMSO(quelante de radicais livres) seguida de visualizao em corrida eletroforetica de gel de agarose; Calcular a cintica cataltica do complexo sobre molculas de DNA plasmidial, utilizando o modelo matemtico Lineweaver-Burk para equao pseudo-MichaelisMenten e a tcnica de corrida eletroforetica de gel de agarose; Avaliar o potencial genotxico do complexo em diferentes concentraes e tempo de exposio em sistema biolgico, utilizando o ensaio cometa de clulas de sangue perifrico de camundongos CF1; Analisar a atividade mutagnica do complexo em diferentes concentraes, utilizando teste de microncleo em medula ssea de camundongos CF1; Relacionar os resultados decorrentes com a estrutura do complexo e suas propriedades qumicas.

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4 FUNDAMENTAO TERICA

4.1 cidos nuclicos

Os cidos nuclicos so macromolculas de enorme importncia biolgica. Todos os seres vivos possuem dois tipos de cidos nuclicos, chamados cido desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA). (DE ROBERTIS e HIB, 2001). O DNA ocupa uma posio central entre as macromolculas biolgicas como um repositrio da informao gentica. As seqncias nucleotdicas do DNA codificam as estruturas primarias de todos os RNAs e protenas celulares e, por meio das enzimas, podem afetar indiretamente a sntese de todos os constituintes celulares. Essa passagem da informao do DNA para o RNA e as protenas direciona o tamanho, a forma e a funo de todos os seres vivos. (NELSON e COX, 2002). Toda informao gentica de um organismo encontra-se acumulada na seqncia linear das quatro bases. A estrutura bsica de todas as protenas deve estar codificada por um alfabeto formando por quatro letras (A, T, G e C) na molcula de DNA e na molcula de RNA substituda timina (T) por uma Uracila (U). Onde a quantidade de adenina igual de timina (A = T) e de citosina, idem a de guanina (C = G), podemos disser que o numero total de purinas (A+G) igual ao de pirimidinas (T+C), onde essa relao (AT/GC) possa variar espcie por espcie conforme figura 1. (ZAHA et al, 2001).

NH2 N NH N N N NH

O NH N NH2

O NH NH O

NH2 N NH H3C O

O NH NH O

Adenina Guanina

Uracila Citosina Timina

Figura 1 - Bases nitrogenadas Fonte: modificado de Nelson e Cox (2002).

Diferente dos procariticos o DNA de eucariticos encontra-se no ncleo constituindo os cromossomos (uma pequena quantidade se encontra no citoplasma, dentro de mitocndrias e cloroplastos). O RNA se localiza tanto no ncleo, onde sintetizado como no citoplasma onde se dirige para reger a sntese protica. (DE ROBERTIS e HIB, 2001).

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4.1.1 Propriedades Fsicas e Qumicas do DNA

Uma molcula de DNA um polmero linear cujos monmeros (nucleotdeos) se encontram unidos pelas ligaes fosfodister, conforme figura 2. Os desoxirribonucleotdeos possuem trs componentes caractersticos: (1) uma base nitrogenada heterocclica (que podem ser purinas ou pirimidinas), (2) uma pentose (2-desoxi-D-Ribose) e (3) um ou at trs grupos fosfatos (PO4-). (VOET, VOET e PRATT, 2002).

Extremidade 5'
O O
-

R O O

P O

Ligao Ofosfodister

P O

O R O

OH

Extremidade 3'
Figura 2 - Ligaes fosfodister entre nucleotdeos Fonte: Modificado de Voet, Voet e Pratt (2002).

A base de nucleotdeo une-se covalentemente (pelo N -1 das pirimidinas e pelo N -9 das purinas), por meio de uma ligao N- glicosdica, ao carbono-1 da pentose, e o fosfato est esterificado ao carbono-5. A ligao N- glicosdica formada pela remoo dos elementos da gua (um grupo hidroxila da pentose e o hidrognio da base), como na formao da ligao fosfodister (ligao O glicosdica). A molcula composta pela base e o acar, sem o grupo fosfato denominada nucleosdeo, como mostra a figura 3. (NELSON e COX, 2002).

17 NH2

Fosfatos
O HO P OH O O P OH O O P OH O O N

Base
O

Pentose
OH R

Nucleosdeo Nucleotdeo
Figura 3 - Estrutura qumica de um nucleotdeo. O R pode ser um Hidrognio no caso do DNA ou uma Hidroxila no caso do RNA. Fonte: modificado de Zaha et al (2001).

Como foi comentado anteriormente os nucleotdeos esto ligados entre si por pontes dos fosfodister, esto ligados ao carbono 3 da pentose de um nucleotdeo, bem como ao carbono 5 da pentose do nucleotdeo seguinte. Em conseqncia, o eixo do cido nuclico est constitudo por pentoses, fosfatos, e bases nitrogenadas que se origina das pentoses. A extremidade da molcula que contem a pentose ligada no Carbono 5 livre, chama-se extremidade 5, ao passo que aquela possui a pentose ligada no Carbono 3 livre denominada extremidade 3. O cido fosfrico utiliza dois de seus trs grupos cidos para formar as ligaes 3, 5dister. O grupo restante confere ao cido nuclico suas propriedades cidas, e permite a formao de ligao inica com protenas bsicas conhecidas como histonas, com as quais forma o complexo ncleoprotico denominado cromatina. (DE ROBERTIS e HIB, 2001).

4.1.1.1 Modelo WatsonCrick para estrutura do DNA

A molcula de DNA formada por duas cadeias polinucleotdicas helicoidal, com giro para a direita, formando uma dupla hlice em torno de um eixo central, mostrado na figura 4. As desoxirriboses ficam externas em relao s bases nitrogenadas, expostas ao meio aquoso. As ligaes fosfodister nas duas fitas esto em direes opostas (uma na direo 5

18

3 e a outra 3

5) sendo antiparalelas. Os anis aromticos das bases nitrogenadas so

hidrofbicos e ficam orientados para o interior, quase perpendiculares ao eixo da hlice. As bases esto pareadas entre as duas fitas da molcula, mantendo a sua estrutura. (WATSON e CRICK, 1953).

Figura 4 Modelo Watson-Crick para Estrutura do DNA Fonte: retirado de Watson e Crick (1953).

O pareamento das bases fundamental para a manuteno da dupla-hlice. Duas caractersticas das bases nitrogenadas so importantes: sua estrutura qumica e seu tamanho. A presena de grupos funcionais nas pirimidinas e purinas so os nitrognios do anel, os grupos carbonila e os grupos aminoexocclicos, conforme mostrado na figura 5, permite a formao de ponte de hidrognio entre as bases dessa forma T, que contm um grupo carbonila, pode parear com A, que contem um grupo aminoexocclicos, atravs de ponte de hidrognio. C e G, que contem tanto grupo carbonila e aminoexocclicos, podem formar duas pontes de hidrognio. Alem disso, uma ponte de hidrognio adicional pode ser formada entre os nitrognios dos anis aromticos em todos os pares. Assim, entre T e A so formados duas pontes de hidrognio e entre C e G so formadas trs pontes. (ZAHA et al, 2001) Interaes hidrofbicas de empilhamento representam outro importante mecanismo de interao de bases, em que duas ou mais bases so posicionadas com os planos de seus anis em paralelo. O empilhamento envolve uma combinao de interaes de Van der Waals e dipolo-dipolo entre as bases. Finalmente, as cadeias de acar-fosfato, que so carregadas negativamente, interagem com ctions (principalmente Mg2+) em soluo, o que neutraliza a repulso entre as duas cadeias e estabiliza a dupla-hlice. A carga negativa da ponte fosfodister protege o ataque de agente nucleoflicos, tais como on hidrxido. Em

19

conseqncia, as ligaes fosfodister so muito menos susceptveis ao ataque hidroltico que outros steres, tais como os de cido carboxlico. Esta resistncia crucial para manter a integridade da informao armazenada nos cidos nuclicos. A ausncia de hidroxila 2 no DNA aumenta ainda mais sua resistncia hidrolise. A maior estabilidade do DNA provavelmente explica seu uso em vez do RNA como o material hereditrio em todas as clulas modernas e em muitos vrus. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004 e NELSON E COX, 2002).

Figura 5 - Pareamento de bases Fonte: Almeida et al (2005).

As bases possuem tamanhos distintos, as pirimidinas so menores que as purinas. Entretanto, os pares AT e CG tm aproximadamente o mesmo tamanho e dimenses semelhantes. Desta maneira, os dois pares de ocupam o mesmo espao, permitindo uma dimenso uniforme ao longo da molcula de DNA. Assim, no existe nenhuma restrio quanto seqncia de nucleotdeos ao longo do DNA. Essas caractersticas de pareamento explicam o fato de que, em qualquer seqncia de DNA, a relao molar entre A/T seja igual a 1,0 e mesmo ocorrendo com a relao C/G, embora as concentraes molares entre AT e CG variem com a seqncia de DNA analisado. Essa caracterstica de pareamento tem grande significncia fisiolgica e, devido a ela, as duas fitas de DNA so ditas complementares. Essa

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propriedade garante a replicao precisa de cadeias longas de DNA e a transmisso de informao s protenas, via transcrio. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX, 2002). Alm dos pareamentos AT e CG, outros pareamentos podem ser encontrados. O pareamento de Hoogsteen, que ocorre em fitas triplas e quatros fitas de DNA, ver (figura 6). (NELSON E COX, 2002).
CH3 H3C 1'-C N O N O H N H N O N C-1' N 1'-C H O H N N N C-1' C-1' H

H N N

N N

N O N
H

T
1'-C

A.T
H H H N

N N O
H

N HN N
H H

NH

O
H

NH N N

O N N
C-1'

N N

N
C-1'

O N N N
H

O N

N N H
H

N H

O
C-1'

N
C-1'

G.C

Guanosina tetraplex

Figura 6 - Pareamento de Hoogsteen Fonte: modificado de Nelson e Cox (2002).

4.1.1.2 Desnaturao e Renaturao do DNA

Os termos desnaturao e renaturao so sinnimos de fuso e reanelamento, respectivamente. Esses fenmenos fsicos que ocorrem com o DNA dupla-hlice so fundamentais para os processos de replicao, transcrio e recombinao. Solues de DNA nativo cuidadosamente isolados so altamente viscosas em pH 7,0 e temperatura ambiente (25C). Quando a tal soluo exposta a extremos de pH ou temperaturas acima de 80C, sua viscosidade diminui rapidamente, indicando que o DNA sofreu uma alterao fsica. Da mesma forma que o calor e os extremos de pH causam desnaturao em protenas globulares, esse fatores tambm provocam desnaturao e fuso da dupla hlice do DNA. A ruptura das

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pontes de hidrognio entre as bases pareadas e do empilhamento de bases induz o desenrolamento da dupla hlice para formar duas fitas simples, completamente separadas entre si ao longo de toda a extenso, ou parte da extenso (desnaturao parcial), da molcula. Nenhuma ligao covalente quebrada, como mostrado na figura 7. A desnaturao da estrutura secundaria do DNA pode ser obtida em soluo por aumento da temperatura, titulao de cidos ou lcalis e por agentes desnaturantes como a formamida e o dimetil sulfxido (DMSO). Os cidos protonizam os anis nitrogenados de A, G e C, e os lcalis desprotonizam os anis nitrogenados de G e T. Esses tratamentos geram grupos carregados no interior da dupla fita, o que leva ao rompimento das pontes de hidrognio entre as bases complementares. Como as ligaes glicosdicas nas purinas so sensveis a pH baixo, a desnaturao por cidos tem pouca aplicao prtica. O processo inverso ocorre na renaturao. Esses processos podem ser desencadeados in vitro. Quando a temperatura, ou pH retorna ao nvel em que a maioria dos organismos dos organismos vive, os segmentos deserolados das duas fitas se enrolam novamente ou se anelam para produzir o dplex intacto. Entretanto as duas fitas esto totalmente separadas, a renaturao ocorre em dois passos: (1) relativamente lento, porque as duas fitas devem primerio se encontrar pela coliso ao acaso e formar um seguimento curto de dupla hlice complementar, (2) muito mais rpido, as bases despareadas remanescentes entram sucessivamente em registro como pares de bases e as duas fitas se fecham, formando a dupla hlice. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX, 2002).

Figura 7- Representao esquemtica da desnaturao e renaturao do DNA Fonte: Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

A desnaturao pode ser acompanhada pela medida em espectrofotmetro da absorbncia da luz ultravioleta (UV) em 260nm. Como as bases so a responsveis pela

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absoro pelo UV, quando o DNA desnatura totalmente aumenta em 37% sua absoro, esse efeito chamado de efeito hipocrmico. Os pares GC so mais estveis que os pares AT, isso se da pelo o numero de pontes de hidrognio entre eles. Assim a temperatura, o pH, o comprimento da dupla fita e os tipos de pares de bases so fatores que modificam a velocidade de desnaturao, conforme figura 8. (ZAHA et al, 2001, e NELSON E COX, 2002).

Figura 8 O espectro de absorbncia ao UV do DNA de E. coli nativo e desnaturado pelo calor. Observe que a desnaturao no muda o formato geral da curva de absorbncia, mas apenas aumenta sua intesidade. Fonte: Voet, Voet e Pratt (2002).

4.1.1.3 Formas Tridimensionais de DNA

O DNA pode assumir diferentes conformaes, dependendo da sua composio de bases e do meio em que se encontra. Os tipos de DNA encontrados em condies fisiolgicas so o B, A e o Z-DNA. O Tipo B a estrutura referida como a estrutura de Watson -Crick, uma forma mais estvel para uma seqncia ao acaso da molcula de DNA em condies fisiolgicas e, portanto o padro de referencia em qualquer estudo das propriedades do DNA. O B-DNA a forma mais abundante encontrada nas clulas, na presena de 92% de unidade relativa e em solues de baixa fora inica. A forma A do DNA aparece quando a unidade reduzida a menos de cerca de 75%. O A-DNA, como o B-DNA, uma dupla hlice dextrosa, constituda de filamentos com sentidos inverso mantidos juntos por pareamento de bases do tipo de Watson-Crick. A hlice A mais larga e mais curta do que a B, e seus pares

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de bases so inclinados em vez de perpendiculares ao eixo da hlice. A dupla hlice de BDNA conclui uma volta a cada 10,5 pares de bases e essa diferena aumenta da forma A para a cada 11 pares de base. A cavidade maior torna-se mais estreita e mais profunda, e a cavidade menor torna-se mais larga e mais rasa na forma A em comparao com a forma B, como mostra a figura 9. Muitas das diferenas estruturais entre B-DNA e A-DNA surgem de franzimentos diferentes de suas unidades de ribose, conforme representado na figura 10. No A-DNA, o C-3 fica fora do plano (uma conformao chamada de C-3 endo) formado pelos outros quatro tomos do anel furanose. No B-DNA, o C-2 fica fora do plano (uma conformao chamada de C-2 endo). O enrugamento C-3-endo no A-DNA leva a 19 graus de toro dos pares de bases em relao perpendicular hlice. Os fosfatos e outros grupamentos na hlice A ligam-se menos com molculas de H2O do que o B-DNA, portanto, a desidratao favorece a forma A, ver. (ZAHA et al, 2001; BERG, TYMOCZKO e STRYER, 2004; NELSON e COX, 2002).

Figura 9 - Formas do DNA Fonte: Almeida et al (2005).

Figura 10 - Conformao da pentose Fonte: Oliveira (2006).

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Outro de tipo de DNA conhecido como Z-DNA, esse tipo mais longo e mais fino que as formas A e B. Uma volta completa da hlice ocorre a cada 12 pares de base. So necessrias altas concentraes de sais para diminuir a repulso eletrosttica entre os fosfatos do arcabouo, que esto mais prximos uns dos outros do que no A e B-DNA. Essa conformao do Z-DNA torna o sulco maior achatado e o sulco menor muito estreito e profundo, como mostra a figura 9. (ZAHA et al, 2001; BERG, TYMOCZKO e STRYER, 2004).

4.1.1.4 Supertoro do DNA

O DNA nem sempre est na forma at aqui apresentada, aquela de um basto de dupla-hlice. Essa forma linear pode ter suas extremidades ligadas covalentemente formando estruturas circulares. Bactrias tm seu cromossomo na forma circular e podem possuir formas extracromossomais tambm em forma circular, os plasmdeos. As mitocndrias, os cloroplastos e alguns vrus e bacterifagos tambm possuem DNA na forma circular. Alm da estrutura secundria da dupla-hlice, o DNA assume uma conformao tridimensional denominada supertorcida, superenrolada, super-hlice ou simplesmente forma I (FI), como ilustrado na figura 11a-e. Quando a estrutura da dupla hlice fica perfeitamente assentada em uma superfcie plana, sem alterar a geometria da dupla-hlice, ela denominada relaxada, circular aberta ou forma II (FII), como na figura 11-a. Existem enzimas que realizam este processo so conhecidas como topoisomerases. Sabe-se que esses tipos de arranjos geomtricos no DNA so essenciais para diversos processos, como: transcrio, recombinao e expresso gnica. (ZAHA et al, 2001).

Figura 11 - Supertoro do DNA Fonte: Nelson e Cox (2002).

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Como descrita anteriormente a FI mais compacta que a FII. Assim, um DNA supertorcido move-se mais rapidamente do que um relaxado quando analisado por eletroforese, como mostrado na figura 12. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

Figura 12 - Medida do superenrolamento. Eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etdeo. O DNA aparece como bandas claras(fluorescente) na presena de UV. (a) 0Mol de topoisomerase I (b) 0,25Mol de topoisomerase I; (c) 0,50Mol de topoisomerase I; (d) 1,0Mol de topoisomerase I; (e) 2,0Mol de topoisomerase I. Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer (2004).

4.1.2 Degradao do DNA por Nucleases

As enzimas que tem como atividade a degradao de cidos nuclicos so conhecidas como Nucleases ou Dnases, se forem especificas para DNA. As nucleases so classificadas como Exonucleases ou Endonucleases. As exonucleases degradam o cido nuclico na direo 5 3 ou na direo 3 5, removendo apenas nucleotdeos das

extremidades 5 ou 3, de uma fita de cido nuclico de dupla hlice, respectivamente. As endonucleases, essas enzimas podem degradar os cidos nuclicos em qualquer lugar da fita, reduzindo a fragmentos cada vez menores. Existem algumas classes importantes que clivam apenas seqncias especificas de nucleotdeos, essas enzimas so muito aplicadas em biotecnologia, e so conhecidas como endonucleases de restrio. (NELSON E COX, 2002). A principal reao catalisada pelas endonucleases de restrio a hidrolise ao arcabouo de fosfodister do DNA. Especificamente, rompida a ligao entre o tomo de oxignio 3 e o fsforo, os produtos desta reao so terminaes de DNA com uma hidroxila 3 livre e uma fosforila em 5 , que podem ser religadas com ajuda de outros tipos de enzimas chamadas de ligases no qual no o enfoque desse trabalho. Esta reao de hidrolise acontece por um ataque nucleoflico ao tomo de fsforo. As endonucleases podem clivar o DNA como representado na figura 13. Neste mecanismo o nuclefilo ataca o tomo de fsforo, e se forma um estado de transio pentacovalente. Esta forma tem uma geometria de dupla pirmide triangular, centralizada no tomo de fsforo, com nucleoflico que chega em um dos vrtices e um grupamento e deslocado. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

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Figura 13- Mecanismo hidroltico da endonucleases sobre os cido nuclicos. Fonte: Modificado de Berg; Tymoczko e Stryer (2004).

O tomo de magnsio (Mg) essencial para atividade da endonuclease, ele foi encontrado unido a seis ligantes: trs so molculas de gua, dois so carboxilatos de aspartatos da enzima, e um um tomo de oxignio da fosforila no local da clivagem. O tomo de magnsio mantm uma molcula de gua em uma posio a partir da qual ela pode atacar a fosforila e, junto com os aspartatos, ajuda a polarizar a molcula de gua para a desprotonao. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).

4.1.3 Danos e Sistemas de Reparo

A sobrevivncia em longo prazo de uma espcie pode ser aumentada atravs de mudanas genticas, mas a sobrevivncia de um indivduo demanda estabilidade gentica. A manuteno da estabilidade gentica necessita no apenas de um mecanismo extremamente preciso para replicao do DNA, antes da clula se dividir, mas tambm de mecanismos para reparao das muitas leses acidentais que ocorrem continuamente no DNA. A maioria das mudanas no DNA temporria, por que so rapidamente corrigidas por mecanismos enzimticos complexos, denominado sistema de reparao (ALBERTS et al, 1997). O DNA pode se tornar lesado por diversos processos, alguns espontneos, outros catalisados por agentes ambientais e a apropria replicao do DNA pode ocasionalmente deixar bases desemparelhadas. A qumica das leses do DNA diversa e complexa, nesse trabalho vamos dar nfase em processos de reparo desempenhados por clulas eucariticas. (NELSON E COX, 2002).

4.1.3.1 Reparo Por Exciso de Bases

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As modificaes de bases so produtos de reaes simples como desaminaes espontneas, oxidaes e alquilaes do DNA. (RIBEIRO et al, 2003). Alguns tipos de leses, nas bases nitrogenadas envolvem oxidaes realizadas pelo radical hidroxila (OH), pela sua alta eletrofilicidade, que possibilita sua interao com as bases nitrogenadas por adio as insaturaes em stios de alta densidade eletrnica. Assim reage com bases pricas formando diversos produtos como 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina (Figura 14-a), 4,6diamino-5-formamidopirimidina (Figura 14-b), 8-oxo-7,8-diidro-2-desoxiguanosdeo (8oxoG) (Figura 14-c), 8-oxoA (Figura 14-d). O ataque s bases pirimidnicas produz produtos como 5-hidroxi-6-hidrocitosina (Figura 15-a), 6-hidroxi-5-hidrocitosina (Figura 15-b), citosinaglicol (Figura 15-c), 5-hidroxi-6-hidrotimina (Figura 15-d), 6-hidroxi-5- hidrotimina (Figura 15-e), 5-hidroxi-6-oxotimina (Figura 15-f) e timinaglicol (Figura 15-g) como principais produtos. (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 14 - Leses provocadas por radical hidroxila (OH) nas bases purnicas. Fonte: Modificado de Barreiros, David, E David (2006).

Toda clula possui uma classe de enzimas chamadas de DNA glicosilases que reconhecem leses particularmente comuns do DNA e removem a base afetada clivando a ligao N-glicosdica. Essa clivagem hidroltica forma um sitio apurco ou apirimidnico no DNA, ambos comumente referidos como stios AP ou absicos (lcali-lbeis). (NELSON E COX, 2002). Existem diferentes tipos de DNA glicosilases e cada uma age em uma leso especifica. (ALBERTS et al, 1997).

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Figura 15 - Leses provocadas por radical hidroxila (OH) nas bases pirimidnicas Fonte: Modificado de Barreiros, David, E David (2006).

4.1.3.2 Reparo Por Exciso de Nucleotdeos

O reparo por exciso de nucleotdeo (NER, nucleotide excision repair) um dos sistemas de reparo mais versteis, pois atua em vrios tipos de leses no DNA. Esse sistema basicamente capaz de reparar quase todos os tipos de leses que produza distores na duplahlice do DNA. Alguns tipos de leses podem ser os dmeros de pirimidinas (Dmero de pirimidina ciclobutano CPD e a Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto - 6,4 PP), como representado na figura 16, induzidas pela radiao UV, leses causadas por adultos, como os gerados pela formao de ligaes covalentes entre as bases do DNA e hidrocarbonetos (exemplo benzopireno). (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 16 dmeros de pirimidinas CPD (Dmero de pirimidina ciclobutano) e o 6-4 (Pirimidina 6,4 pirimidona fotoproduto). Fonte: Modificado de Ribeiro et al (2003).

Esta via de reparao tambm atua em leses geradas pelo radical hidroxil (OH.), pela a oxidao de pentoses do DNA gerando como principais produtos 5-8-ciclo-2-

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desoxiadenosina 8OHdA (Figura 17-a) e 5-8-ciclo-2-desoxiguanosina 8OHdG 8OHdA (Figura 17-b). (BARREIROS, DAVID, e DAVID, 2006).

Figura 17 - Leses geradas pelo radical hidroxila (OH) na pentose do DNA. Fonte: Barreiros, David, E David (2006).

O reparo funciona por uma varredura no DNA, realizado por uma exonuclease (endonuclease), constitudo por trs subunidades, denominadas (UvrA, UvrB e UvrC), a procura de uma distoro na dupla-fita, mais do que uma procura por uma mudana especifica de base. (ALBERTS et al, 1997). Quando o complexo enzimtico encontra a distoro na dupla fita, hidrolisa a sexta ligao fosfodister no lado 3 e a vigsima ligao fosfodister, no lado 5 produzindo um fragmento de 27 a 29 nucleotdeos. Aps a inciso, os oligonucleotdeos excisados so liberados da dupla fita pela atividade da uma helicase, e a lacuna resultante preenchida pela DNA polimerase , o corte selado pela DNA ligase, reconstituindo a fita lesada. (NELSON E COX, 2002).

4.1.3.3 Reparo Por Recombinao

Diferente das outras vias comentadas acima que utilizavam a fita complementar para reparar danos, essa via de reparo recombinacional utiliza informao de um cromossomo homologo. (ZAHA et al, 2001). Os principais danos que ativam essa via so quebras de fita dupla do DNA, causados por exposies a radiao ionizantes, raios-X, radiacais livres, agentes qumicos, durante replicao de DNA simples fita ou, ainda, como intermedirio durante certos processos de recombinao stio especifica. Alm de ser potencialmente mutagnica, este tipo de leso particularmente txica uma vez que pode induzir vrios tipos de aberraes cromossmicas como aneuplodias, inverses, delees (perda de

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heterozigozidade) e translocaes, eventos que esto altamente associados com carcinognese e apoptose. (RIBEIRO et al, 2003). Esta via atua tanto em leses que provocam quebras com em leso que bloqueiam a replicao como os dmeros de pirimidinas. (ZAHA et al, 2001). O reparo recombinante normalmente envolve uma permuta de uma nica fita entre duas duplas hlices. Uma importante estrutura intermediaria formada nesse processo, conhecido como fita cruzada permutada ou Juno de Holliday, mostrado na figura 18. (ALBERTS et al, 1997). O mecanismo funciona aps ser detectada uma leso, que dispara uma cascata de reaes cuja finalidade bloquear o clico celular e recrutar as protenas de reparo especificas. (RIBEIRO et al, 2003).

Figura 18 Juno Holliday Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

4.1.3.4 Reparo Sujeito a Erros

A existncia de sistemas de reparao que envolve sntese de DNA leva a um questionamento importante, no qual se discute a o controle de qualidade destes sistemas. onde se sabe os sistemas de reparo por exciso no diferem da replicao, na freqncia de erros. (LEWIN, 2001). Muitas das leses letais, bloqueadoras da replicao, so reparadas pelo processo de exciso de nucleotdeos ou de bases. Se estes sistemas esto saturados ou so incapazes de reparar estes danos antes da fase S do clico celular, a morte celular pode ocorrer. Para escapar da morte, todas as clulas possuem mecanismos de tolerncia a essas leses. Como as leses em geral no so codificadoras, podem ser geradas mutaes. Esse processo, portanto sujeito a erro, conhecido como sntese de DNA transleso ou tambm chamada de resposta SOS. (RIBEIRO et al, 2003). Essa via de reparo parte de uma resposta celular ao estresse a leses extensas do DNA. Essa resposta envolve a participao de muitas enzimas. Uma DNA polimerase especializada (DNA polimerase V), que pode replicar sobre muitas leses no DNA que, normalmente, bloqueiam a replicao. O prprio pareamento de bases impossvel no

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local de tais leses, de forma que essa replicao est sujeita a erros. incoerente que exista um sistema que aumente a taxa de mutao, mas devemos pensar nesse sistema como uma estratgia desesperada para a clula conservar a integridade gentica. As mutaes resultantes matam muitas clulas, mas esse o preo biolgico que as clulas pagam para contornar uma barreira, de outra forma intransponvel para a replicao, medida que ela permite que algumas poucas clulas mutantes sobrevivam. (NELSON E COX, 2002).

4.1.4 Genotoxicidade

A genotoxicidade o setor da gentica que estuda os processos que alteram a base gentica da vida, sendo na estrutura fsico-qumica do DNA, processo este classificado de mutagnese; seja na alterao do determinismo gentico ao nvel celular ou orgnico, onde so identificados respectivamente como carcinognese e teratognese. A mutagnese, carcinognese e teratognese so agrupadas em uma rea de estudo porque um mesmo processo ou produto pode produzir os trs efeitos. Cada rea destas tem suas peculiaridades, e possuem os seus especialistas, em funo da complexidade dos processos e nvel de conhecimentos destas reas da cincia. A genotoxicidade estuda, sob o aspecto gentico, o que perturba a vida ou induz a morte tanto a nvel celular como orgnico. (ERDTMANN 2003 apud, SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003).

4.1.4.1 Mutao e Cncer

Durante a vida, o DNA sofre modificaes sbitas e hereditrias no material gentico que so denominadas de mutaes, que nada mais que alterao permanente de uma determinada seqncias nucleotdica, que podem ser causadas por erros durante a duplicao, reparao do DNA, radiaes ionizantes, agentes qumicos. (NELSON E COX, 2002). Todos os seres vivos sofrem um certo nmero de mutaes como resultado de funes celulares normais ou interaes aleatrias com o ambiente, essas mutaes so denominadas espontneas. A taxa de ocorrncia destas mutaes espontneas caracterizada para um determinado organismo e constitui o chamado nvel basal (background). (ZAHA et al, 2001). Compostos qumicos chamados de agentes mutagnicos podem alteram a seqncia das bases no DNA, causando mutaes induzidas, assim podem acelerar ou aumentar o aparecimento de mutaes. (RIBEIRO et al, 2003). Alguns mutgenos qumicos so bem especficos, como os anlogos de bases, como 5-bromouracil e 2-aminopurina, representados na figura 19, podem

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ser incorporados ao DNA e tem mesmo maior probabilidade do que as bases normais de cido nuclicos de formar tautomeros temporrios que levam a mutaes de transio. Outros mutgenos atuam modificando quimicamente as bases do DNA, como o cido nitroso (HNO2) reage com bases que contm aminas, provocando desaminao. (BERG; TYMOCZKO e STRYER, 2004).
-

Br N N

Br

NH
NH N NH2

NH N H O

N H

2-Amino purina 5-Bromo uracil 5-Bromo uracil Forma cetonica Forma Enlica
Figura 19 Anlogos de Base Fonte: modificado de Zaha et al (2001).

Um tipo diferente de mutao produzido por molculas de corantes aromticos como acridinas, Brometo de etdeo e por antibiticos macrociclicos como a dactinomicina, ilustrados na figura 20. Estes compostos se intercalam no DNA, isto , eles se introduzem entre pares de bases adjacentes da dupla hlice do DNA conseqentemente causam a insero ou deleo de um ou mais pares de bases. (ZAHA et al, 2001).
L-Meval O L-Thr D-val O O L-Pro Sar L-Meval Br N H 2N N
+ -

Sar L-Pro

D-val

NH2

L-Thr O

CH2 CH3

O CH3 CH3

Dactinomicina

Brometo de Etdeo

H 3C N CH3 N N CH3

CH3

Laranja de acridina
Figura 20 Agentes qumicos intercalantes de DNA Fonte: modificado de Zaha et al (2001) e Almeida et al (2005).

33

Considerando os stios de mutaes dentro de uma seqncia de DNA, alguns stios sofrem um nmero de mutaes muito maior que o esperado pela distribuio aleatria; podem existir 10 ou at 100 vezes mais mutaes que o previsto por impactos aleatrios. Estas posies so chamadas de stios quentes (hotsposts). Mutaes podem ocorrer em stios quentes e diferentes agentes mutagnicos podem atuar em diferentes stios quentes. (LEWIN, 2001). O aparecimento de mutaes est associado ao desenvolvimento de neoplasias, aps passar por vrias divises, uma clula poder acumular mutaes que, se em nmero elevado, podero determinar a perda do controle de sua diviso, determinando, assim, o aparecimento do cncer. (RIBEIRO et al, 2003). Os mecanismos de mutagnese e carcinognese parecem estar intrinsecamente ligados. A mutao uma conseqncia do dano no DNA e este pode ser o estgio inicial no processo pelo qual a maioria dos carciongenos qumicos inicia a formao do tumor. Muitos estudos tm mostrado que mutaes em vrios genes crticos tm sido encontradas nas neoplasias. Os primeiros genes identificados foram os protooncogenes, nos quais mutaes ocorrendo em um ou poucos cdons crticos, podem gerar um produto gnico ativado que causa a transformao celular. Por outro lado h os genes supressores de turmor que codificam protenas essenciais para o controle do crescimento celular. Quando esses genes so inativados por perda da seqncia ou mutao, podem resultar em crescimento celular aberrante. (RIBEIRO et al, 2003). Os primeiros eventos no processo da carcinogenese qumica incluem a exposio ao carcingeno, seu transporte clula alvo, sua ativao em metablitos ativos (caso o agente seja um pr-carcingeno), e o dano no DNA, levando a mudanas que resultam em uma clula iniciada. O homem exposto repetidamente a misturas qumicas variveis e complexas. Essas misturas ambientais contm tanto agentes iniciadores como promotores. A maioria dos carcinogenos genotoxicos que comprovadamente causam tumores em seres humanos considerada prcarcingeno, so composto estveis em no pH fisiolgico e, portanto, incapazes de reagir com o DNA. Esses carcingenos so biotranformados por enzimas como citocromos P450 (CYP) e glutationa s-transferese (GST), em compostos mais hidrossolveis e, portanto passveis de serem excretados. Os produtos gerados so extremamente eletroflicos e iro reagir com centros nucleoflicos das clulas, dentre eles regies do DNA, levando formao de produtos de degradao. (RIBEIRO et al, 2003).

34

4.2 Complexos organometlicos

Ao contrario do mundo mineral e mais esttico, a matria viva baseia-se em estruturas muito mais intricadas como as clulas, que persistem nos estados fora do equilbrio, mantendo um fluxo constante de nutrientes e energia. Os organismos usam muitos dos elementos para manter esse estado constante, assim os princpios da qumica inorgnica so relevantes para o entendimento dos sistemas biolgicos. Como resultado, h uma troca viva de idias entre qumicos inorgnicos e os bioqumicos, que tm conduzido ao crescimento e ao reconhecimento da rea interdisciplinar de qumica bioinorgnica. (SHRIVER e ATKINS, 2003). Drogas ou molculas que interagem com cidos nuclicos vem sendo o objeto de grande interesse em pesquisas, por servir como ferramenta em biologia molecular e bioqumica, e tambm na teraputica, especialmente aqueles capazes de clivar cidos nuclicos.(OLIVEIRA et al, 2005). Os Complexos coordenados metais so conhecidos por interferir em processos celulares de maneira drstica. O efeito desses metais no esta somente em interferir em processos naturais, tais como a diviso de clulas e a expresso de genes, mas tambm processos no naturais, como toxicidade, carcinogenicidade. (REEDIJK, 2003). Complexos de organometlicos apresentam uma caracterstica catinica, estrutura tridimensional, por estas caractersticas demonstra propenso para realizar reaes de hidrolise, redox e/ou fotoreao, tem uma aptido natural para interagir com DNA. Certamente, a necessidade para a regulao celular do DNA conduziu evoluo das metalonucleases (enzimas que clivam o DNA e possuem ncleo metlico). (BOERNER E ZALESKI, 2005). Essas enzimas sintticas empregam ons metlicos como cofatores para baixar a energia de ativao da quebra de ligaes qumicas. O mecanismo pelo qual isso acontece depende de cada metalonuclease. Dentre esta classe de enzimas, pode-se citar as fosfatases, que usam ons metlicos para facilitar a quebra da ligao P-O de cidos nuclicos. O tempo de meia vida (t1/2), para a clivagem hidroltica do DNA, em pH 7 e a 25 C, tem sido estimado em milhes de anos. Por outro lado, o DNA e o RNA so clivados em apenas alguns segundos em condies fisiolgicas quando enzimas ativadas por um, dois ou mais ons metlicos esto presentes.(DOMINGOS et al, 2003). Outra possibilidade seria atravs de um ataque oxidativo ao anel da ribose, mecanismo este caracterstico de complexos tais como 1,10-fenantrolina-cobre (II), Fe-EDTA

35

e seus derivados, metalporfirinas, complexos octahdricos contendo 4,7-difenil-1,10 fenantrolina e Bleomicina, por exemplo. No entanto estes compostos apresentam a desvantagem da gerao de radicais livres e a gerao de fragmentos que no podem ser enzimaticamente ligados, o que limita a sua possibilidade de uso em biologia molecular e Bioqumica. (CLARKE, 2003). Uma variedade bastante grande de substncias j foi testada no que se refere a estes resultados, compostos a base de metais de transio e lantandeos apresentaram resultados que, no mnimo, sugerem a necessidade de continuidade dos estudos com estas substncias (SCARPELLINI et al, 2003).

4.2.1 Complexos de Lantandeos Nos ltimos anos, os lantandeos1 tm despertado a ateno dos pesquisadores como catalisadores em reaes de hidrlise de steres fosfricos. A carga total do on metlico e a sua habilidade para polarizar as ligaes (P-O), so fatores importantes no estudo dos mecanismos de reaes promovidas por metais. Os lantandeos (Ln3+) apresentam vantagens sobre os metais de transio na eficincia cataltica devidas, em grande parte, ao efeito da carga, ao elevado nmero de coordenao em soluo (entre 8 e 9) e sua restrio geomtrica relativamente livre se comparada aos metais de transio. (DOMINGOS et al, 2003).1 Recentemente, um grande nmero de complexos macrociclicos binucleares de lantandeos tem mostrado atividade hidroltica na clivagem do DNA. Complexos macrociclicos coordenados por Ho3+ (on Hlmio) e Er3+ (on rbio) tem mostrado atividade hidroltica em temperatura de 37C em pH neutro, de converso da F I para as formas II e III(linear) do DNA. (SREEDHARA e COWAN, 2001). Outro complexo Macrociclico binuclear de Ce4+ (on Crio) com ligantes de perxido, tem um mecanismo de reao hidroltica, envolvendo o ataque nucleoflico do ligante perxido ao cido nuclico.(LIU et al, 2004).

Os lantandeos so tambm freqentemente chamados de elementos das terras-raras, embora as "terras" possuam os seus xidos, no so particularmente raros: ocorrem em grandes quantidades e geralmente juntos. Todos os elementos so metais reativos e prateados, eles esto classificados na Tabela Peridica, aps o lantnio (Z = 57), com nmeros atmicos de 57 (lantnio) a 71 (lutcio). Todos eles tm dois eltrons na camada mais externa, numa configurao 6s2. (RUSSELL, 1981).

36

4.2.2 Complexos de metais de transio

A qumica sinttica dos compostos coordenados por ons metlicos de transio, tem possibilitado diversas combinaes por sua capacidade de afinidade com diversos ligantes. Atualmente resultado de trabalho intenso por parte de vrios grupos de pesquisa, com especial ateno ao seu potencial teraputico e a compreenso das atividades desempenhadas por metais e metaloenzimas em sistemas naturais.(CLARK, 2003). Compostos de coordenao com platina, como a cisplatina e carboplatina (Figura 21), alquilam o DNA. O mecanismo de ao est relacionado com a inibio seletiva da sntese do DNA. As propriedades citotxicas destes compostos, assim como de numerosos anlogos, tm sido atribudas sua habilidade de formar ligaes cruzadas do tipo interfilamentares como tambm intrafilamentares. Mais recentemente, tem-se dado particular nfase capacidade da cisplatina em provocar mutaes no DNA e alterar a ligao DNAprotena. (ALMEIDA et al, 2005).

Figura 21 - Estrutura da Cisplatina e Carboplatina Fonte: retirado de Almeida et al, (2005).

Complexos Bi e Multinuclear de ferro vem sendo freqentemente reportados como capacidade de clivagem hidroltica no DNA. Um desses complexos o Bi-nuclear de ferro Fe2 (N,N,N,N- tetrakis(2-benzimidazolymethyl)-2-hydroxyl-1,3-diaminopropane)) (OH)(NO3)4.(LIU et al, 2004). Outro complexo descrito em literatura um macrocclico bi-nuclear de cobre Cu2BMXD tem uma grande afinidade por DNA, sendo ativo na clivagem oxidativa destas molculas. Esta atividade est relacionada com um ciclo cataltico que envolve a formao de Cu+ e radicais HO (OLIVEIRA et al, 2005). Segundo Rossi et al (2002) outro complexo vem sendo reportado em literatura, o complexo bi-nuclear de cobre(II,II) [Cu2(H2bbppnol)(-CH3COO)(H2O)2)]Cl2 .2H2O, possui

37

um mecanismo hidrolitico de clivagem de ligaes fosfoditer em condies de temperatura e pHs variados Compostos coordenados por ons de Rutnio (II, III) que apresentaram atravs de alguns testes in vitro, indcios de interao com o DNA. (CLARK, 2003).

4.2.2.1 Complexos de Rutnio

De muito compostos de metal de transio, os complexos octadricos de Rutnio atraram grande interesse para seu uso como agente anticancer e representam a classe de compostos mais extensamente estudas no grupo da platina. (ALESSIOA et al, 2004). A produo de metalofrmacos a base de Rutnio pode conceder ao complexo um potencial de mltiplas aplicaes, entre elas podemos destacar a atividade anti-tumoral; a atenuao da reperfuso, do nmero de infartos e diminuio de dano; a inibio da proliferao em linhas de clulas no cncer do clon retal e a habilidade de interagir com protenas, tais como, albumina, apotransferinas e polimerases. (CRECZYNSKI-PASA et al, 2001). A qumica sinttica do Rutnio particularmente bem desenvolvida no que se refere utilizao de ligantes do tipo amina e imina, fornecendo novas e interessantes possibilidades para a indstria farmacutica. Devido a forte estabilizao do campo ligante, os estados mais comuns de oxidao so (Ru II; Ru III; e Ru IV) em soluo aquosa se mostra geralmente octadrico e razoavelmente inerte substituio do ligante. Vantagens so atribudas no desenvolvimento de complexos a base de Rutnio so respectivamente, mtodos de confiana na sntese de complexos com estruturas estveis, afinidade e habilidade de ajustar o ligante, taxas de transferncia de eltrons e da substituio, e potencias da reduo; e um conhecimento crescente dos efeitos biolgicos de complexos de Rutnio. (CLARK, 2003). Interao entre derivados purnicos com ons de Rutnio tem atrado interesse em um grande numero de complexos de adenina, hipoxantina e guanina, estes derivados tem sido estruturalmente descritos, na qual a coordenao mais freqentemente feita no Nitrognio 7. Em outra mo sabe-se que os derivados de adenina so importantes substratos para atividade de citoquinas. Elas so citoxicas e poderia exibir atividade anticancer e/ou inibir o crescimento e diferenciao de diferentes linhagens de clulas tumorais. (GARCA-RASO et al, 2005).

38

Figura 22 - Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78 H2O. Fonte: Garca-Raso et al (2005).

Reao entre [(DMSO)2H][trans-RuCl4(DMSO)2] e o correspondente derivado de purina, em condies cidas, tem permitido o isolamento de dois novos complexos [Ru(III)Cl4(DMSO)(H-Hipoxantina)].1,78H2O (Figura 22) e [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6butiladenina)]] (figura 23). Em ambos as estruturas uma ligeira distoro octadrica ao redor do on de coordenao Rutnio(III) com quatro ons de cloros ligados em plano equatorial e dois ons ligadas em plano axial ocupados por um enxofre e um nitrognio. O primeiro complexos de Ru(III)-hipoxantina a coordenao feita pelo nitrognio 3 e no complexo dois feito no nitrognio 9. Esse complexos em teste de mobilidade eletrofortica, mostraram modificar a corrida do DNA plasmidial pBR322 e atravs de microscopia de fora atmica observou-se que modificou a morfologia do plasmdeo. (GARCA-RASO et al, 2005).

Figura 23 - Estrutura do complexo [Ru(III)Cl4(DMSO)[H-N6-butiladenina)]] Fonte: Garca-Raso et al (2005).

complexo

NAMI-A

(ImH)[trans-Ru(III)Cl4(DMSO-S)]

(Im=imidazol,

DMSO=dimetilsufoxido) (Figura 24). (BACAC et al, 2004). NAMI-A um complexo de Rutnio dotado com um seletivo efeito em metstases do pulmo. NAMI-A aplicado em ratos por seis dias no reduziu a massa do tumor mais diminuo a proliferao de metstases na qual demonstra uma seletividade a clulas cancergenas com alto taxa de diviso. (SAVA et al, 2003).

39

Figura 24 - estrutura do complexo NAMI-A (ImH)[trans-Ru(III) Cl4(DMSO-S)] Fonte: Sava et al (2003).

Depois do sucesso na atividade contra metstases2 do NAMI-A, hoje j esto sendo desenvolvidos diversos complexos originados do NAMI-A. O complexos NAMI-UMtipo dinuclear e o NAMI-A [H2Im[trans-RuCl4 (DMSO)HIm], onde mudam-se apenas a natureza dos ligantes. Esse complexos j demonstraram uma atividade antimetstase in vivo. (ALESSIOA et al, 2004). Complexo de Rutnio (III) KP1019 (FFC14A) (figura 25) induz a formao de perxido de hidrognio(H2O2) em clulas de tumor de coloretal. Casou tambm rupturas no DNA e induzido a apoptose das clulas tumorais por clivagem caspase-dependente de poly(ADPribose)- polimerase (PARP). Esses resultados indicaram que o papel principal do complexo KP1019 a induo de estresse oxidativo. (KAPITZA et al, 2005).

Figura 25 - Estrutura do Complexo de Rutnio(III) KP1019 (FFC14A) Fonte: Kapitza et al (2005).

4.2.2.1.1 Complexo polipiridnico de Rutnio trans-[RuCl2(L)4] Os complexos de rutnio trans-[RuCl2(nic)4] (complexo I) como ilustrado na figura 26(A), trans-[RuCl2(i-nic)4] (Complexo II) como mostra a figura 26(B) , trans-[Ru
Metstases, do grego metstatis que significa mudana de lugar, tranferncia a formao de uma nova leso tumoral a partir da primeira, mas sem continuidade entre as duas. Isso implica que as clulas neoplsicas se desprendem do tumor primario caminham atrvs do intersticio , ganham uma via de desseminao, so levadas para um local distante e l formam uma nova colnia neoplasica. (ROBBINS et al, 2005).
2

40

(II)Cl2(dinic)4] (Complexo III), mostrado na figura 27(A) e trans-[Ru(II)Cl2(i-dinic)4] (complexo IV) representado na figura 27(B), participam da famlia de complexos de rutnio tendo como ligantes os anis piridnicos associados a outras molculas. (CRECZYNSKIPASA et al, 2001; SEIFRIZ et al, 1999; MEZZARI, 2005 e FERMIANO, 2005).

O OH Cl

OH O HO Cl HO

N
Ru
2+

N
Ru
2+

N
Cl

N
Cl O

N
OH

HO

O (A)

HO

OH

O (B)

Figura 26 Estrutura proposta para os complexos de rutnio trans-[RuCl2(nic)4] (A) e trans-[RuCl2(i-nic)4] (B). Fonte: Modificado de Paula et al (1998).

Os complexos (I e II), so complexos caracterizados pela presena de um grupo carboxlico ligado ao anel piridnico, sendo respectivamente na posio 3 e 4. Estes so capazes de diminuir os nveis de nitrito em cultura mdia de macrfagos, tambm atuando como capturador de monxido nitrognio e protegendo os hepatcitos contra a peroxidao lipdica. (CRECZYNSKI-PASAet al, 2001). Esse complexos apresentaram respostas anti-nocepitiva significativas nas concentraes de (45,2 - 180,7M/Kg) para o complexo I e (0,08 13,6M/Kg) para o complexo II. (BEIRITH et al. 1999). Esses complexos tm como provvel ao atividade de interao com DNA e podem interferir diretamente no metabolismo de NO em sistemas biolgicos.

(MARCONDES, 2002). Segundo Amboni (2003) o complexo I (trans-[RuCl2(nic)4]) e o complexo II (trans-[RuCl2(i-nic)4]) quando incubados por 90 minutos em cultura de clulas de sangue perifrico de indivduos humanos, ambos apresentaram atividade genotxica ou prgenotxica, em todas as concentraes testadas.

41

Naspoline (2004) avaliou sua atividade genotxica e antigenotxica perante a soluo de leuccitos isolados, tendo uma atividade genotxica na concentrao de 1000M para o complexo I e, para o complexo II a atividade genotxica em todas as concentraes avaliadas. Sua atividade antigenotxica foi observada no complexo I na concentrao de 1000M e no complexo II esta atividade foi observada atravs de uma grande queda no ndice de dano na concentrao de 1000M, mas, que ainda permaneceu significativamente elevado quando comparado com o controle negativo.

OH

OH OH O

O OH Cl

OH O OH

Cl HO O HO

N
Ru
2+

O OH O

N
Ru
2+

N
O Cl

OH HO

N
Cl

N
O

HO

O (A)

HO

HO

O (B)

HO

HO

Figura 27 - Estrutura proposta para os complexos de rutnio trans-[Ru (II)Cl2(dinic)4] (A) e trans-[Ru(II)Cl2(idinic)4] (B) Fonte: Modificado de Seifritz et al (1999) e Mezzari (2005).

Os complexos (III e IV), diferentemente dos dois anteriores possuem dois cidos carboxlicos por anel piridinico. (SEIFRITZet al, 1999). O complexo III no apresenta citotoxicidade, pelo menos em macrfagos, e no afeta significativamente a resposta motora de animais quando avaliados em teste rota-rod, nem aumenta a latncia da resposta em ensaio Hot-Plate. Ele no tem ao considervel sobre iNOS ou nNOS, porm capaz de capturar radicais hidroxila, sendo esta uma importante propriedade, pois esta espcie reativa de oxignio uma das mais agressivas em nvel biolgico. Este radical o principal produto da alta energia de ionizao da gua, e sua mais importante fonte a reao de Haber-Weiss envolvendo O2 e H2O2. Estas propriedades tornam o complexo um possvel agente antioxidante com provvel ao protetora do DNA. (SEIFRITZ et al, 1999). Mas em baixas concentraes (8M) quando incubado em conjunto com perxido de hidrognio, o complexo III apresentou efeito protetor diferente dos anteriores, sendo este

42

mais pronunciado, provavelmente pela presena de dois cidos carboxlicos na estrutura de cada um de seus ligantes. (FERMIANO, 2005). J o complexo IV, ismero do complexo anterior, tem ao significativa na concentrao de 8M, avaliado pelo Teste Cometa, porm em experimento

espectrofotomtrico, que observa a interao do complexo com o perxido de hidrognio, no observada uma interao direta com essa espcie qumica, sugerindo que a queda do ndice de dano ao DNA observada referente a uma ao indireta seja pelo metabolismo celular ou pela oxidao do complexo de Rutnio no observada no espectrofotmetro. (MEZZARI, 2005).

4.2.2.1.1.1 Caracterizao Qumica do Complexo em Estudo

Como foi abordado anteriormente o complexo trans-Dicloro Tetraquis cido-3piridina Carboxlico Rutnio ou trans-[Ru(II)Cl2(nic)4] apresentou atividade biolgica tanto in vitro como in vivo. A sntese do complexo foi realizada utilizado a metodologia do azul de Rutnio.(PAULA et al, 1998). A analise espectroscpica do complexo (I) apresentou uma banda na regio de 399,70nm no pH 3,00, em pH 5,60 a banda sofreu um deslocamento hipsocrmico se localizado em 397,30nm, alcanou um pico mximo de 395,40nm no pH 12,00. A principal mudana observada em espectroscopia eletrnica para complexos que apresentam grupos carboxlicos o deslocamento que as bandas sofrem em virtude da variao do pH. (PAULA, 1994). A espectroscopia de Ressonncia Magntica Nuclear
1

H apresenta picos

caractersticos do complexo. A integrao relativa dos picos do espectro revela a presena dos hidrognios caractersticos no anel pirdinico e do hidrognio cido do grupo carboxlico. Para ajudar na identificao foi realizada a espectroscopia vibracional onde o espectro infravermelho apresentou as bandas caractersticas dos Ligantes. (PAULA, 1994). Estudos voltametria cclicos repetitiva demonstram que o complexo apresenta um potencial catdico em pH mais baixo e que medida que o pH do meio aumenta, o complexo apresenta um potencial andico, que demonstrou ser um sistema quase reversvel para reaes de ox-reduo, que se assemelha as resultados de UV-vis discutido anteriormente. (PAULA et al, 1998).

43

Segundo Paula et al (1998) na anlise de titulao potenciometrica os resultados mostram as espcies qumicas do complexo em determinados pHs analisados, como representado na figura 28. medida que o pH aumenta ocorrer uma deprotonao do Complexo.

Figura 28 Distribuio de espcies protonadas correspondente ao complexo (I) em funo do pH. H4C(espcie tetraprotonada), H3C(espcie triprotonada), H2C(espcie diprotonada), HC (espcie monoprotonada) e C(espcie sem prton). Fonte: Paula et al (1998).

44

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5.1 Local.

Os testes de interao com molculas de DNA foram realizados no Laboratrio de Expresso Gnica da Universidade Federal de Santa Catarina UFSC, coordenado pelo Professor Dr. Hernan Francisco Terenzi. As anlises de genotoxicidade e mutagnese foram realizadas no Laboratrio de Bioqumica da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC, utilizado pelo Grupo de Pesquisa em Imunologia e Gentica Ambiental (GPIGA), coordenado Pelo Professor Msc. Claus Trger Pich.

5.2 Obteno do complexo trans-[RuCl2(nic)4] O complexo de Rutnio foi gentilmente fornecido pelo Professor Dr. Marcos Marques da Silva. Paula do Laboratrio de Sntese de Complexos Multifuncionais LASICOM da Universidade do Extremo Sul Catarinense UNESC, tendo o mesmo sido sintetizado nas dependncias desta Universidade.

5.3 Anlise de Interao com Molculas de DNA plasmidial Este teste aplicado para a separao de produtos da clivagem do DNA plasmidial. Aspectos de funcionamento: (1) Como j foi abordado anteriormente o DNA adota diferentes formas tridimensionais, quando o DNA est na forma superenovelada (FI), ela se encontra tencionada e no momento que sofre um corte em uma das fitas, a molcula perda a teso e assim desenrolando e forma uma estrutura circular aberta (FII), agora se a molcula sofrer outro corte na fita oposta a que foi cortada, esta assume outra forma conhecida como forma linear (FIII), o esquema de corte est ilustrado na figura 29. (2) As diferentes formas da molcula de DNA plasmidial possuem mobilidade eletrofortica distintas umas da outras, o que possibilita a sua separao e quantificao, como mostrado na figura 30. (OLIVEIRA, 2006).

45

Figura 29- Esquema de Corte da Molcula de DNA Plasmidial Fonte: modificado de Berg; Tymoczko e Stryer, (2004).

Figura 30 Fotografia de um gel de agarose demonstrando a separao das formas do DNA plasmidial

5.3.1 Obteno do Plasmdeo Foi utilizado o plasmdio33 pBluescript II SK(+) (pBSK-II), como modelo de molcula de DNA. Esse plasmdio derivado do pUC19, possui 2961 pares de bases e contm um gene para resistncia a ampicilina, como ilustrado na figura 31 do mapa do plasmdio.

Figura 31Mapa do Plasmdio pBSK-II Fonte: kit HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM
3

Plasmdeos so elementos extracromossomais com capacidade de replicao autnoma, constitudos por uma molcula de DNA fita dupla circular. Qualquer plasmdeo contm todas as seqncias para sua autoduplicao, incluindo uma origem de replicao (oriC) e, usualmente, um gene que codifica uma protena que regula o processo. Alm disso, muitos plasmdeos carregam uma considervel quantidade de informaes genticas adicional, grande parte da qual pode ser importante para a clula bacteriana em seu ambiente natural. (ZAHA et al, 2001).

46

5.3.1.1 Preparao de bactrias competentes Essa metodologia empregada com a finalidade de tornar cepas bacterianas capazes de incorporar facilmente fragmentos de DNA, atravs de tratamento qumico. Essa preparao foi realizada pelo Laboratrio de Expresso Gnica da UFSC, no qual utilizou uma cepa de bactria E.coli DH5.(AUSUBEL, 1995). Conforme o protocolo utilizado pelo laboratrio, a tcnica funciona da seguinte maneira: (1) as cepas bacterianas foram inoculados em 4 mL de uma cultura de bactria prcrescida overnigth (durante a noite) 37C, em 50 mL de meio LB lquido (peptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1% em pH = 7,5). Esta cultura foi incubada a 37 C, sob agitao (140RPM), at atingir A590 = 0,4 (aproximadamente 18 horas).(2) esse passo a cultura bacteriana dividida em alquotas em eppendorfs, e mantidas em banho de gelo por 10 minutos.(3) as alquotas foram centrifugadas por 7 minutos a 1600g 4C, o sobrenadante foi desprezado, foi acrescentado 10mL de soluo de CaCl2 gelada(CaCl2 60 mM, glicerol 15%, tampo PIPES 10 mM pH = 7,0)ao precipitado.(3) os tudos com as alquotas foram centrifugados novamente agora por 5 minutos e 1600g 4C, onde o sobrenadante foi desprezado e o precipitado restante foi suspenso em 10mL de soluo de CaCl2, onde foi mantido em banho que gelo por 30 minutos, (4) o material foi centrifugado mais uma vez em 5 minutos em 1600g 4C, onde o sobrenadante foi desprezado e o precipitado suspendido em 1,5mL de soluo de CaCl2, onde foram divididas em alquotas e armazenadas em freezer (-80C), para posterior utilizao experimental. (AUSUBEL, 1995).

5.3.1.2 Transformao das bactrias competentes

Essa metodologia tambm foi realizada pelo Laboratrio de Expresso Gnica da UFSC, A transformao bacteriana tem por objetivo introduzir o plasmdio desejado nas bactrias competentes, atravs do choque trmico. Com esse mtodo obtmse em placas de petri com meio slido, colnias de bactrias transformadas com quantidades grandes do plasmdeo desejado. (AUSUBEL, 1995). O funcionamento da metodologia descrito agora: (1) as bactrias competentes e o plasmdio desejado foram retirados do freezer -80C e descongelados em banho de gelo. (2) foram transferidos 10-100ng do plasmdio para um tubo de ensaio com 50 l de bactrias, onde este foi colocado em repouso por 15 minutos em banho de gelo, em seguida, foi transferido para banho Maria a 37-42C por 1 minuto.(3) foi adicionado ao tubo 1mL de

47

meio LB lquido, onde o mesmo foi levado para uma estufa 37C por 60 minutos. Aps o termino do tempo o tubo foi centrifugado por 2 minutos a 5000g, onde se retirou 750L do sobrenadante, e as clulas bacterianas foram suspensas com aproximadamente 250L restante.(4) a suspenso de bactrias foi plaqueada com ajuda de uma ala de vidro, em uma placa de petri contendo o meio LB slido (peptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, agar 1,5% em pH = 7,5) e ampicilina (100 g/ml de meio LB antibitico utilizado para a seleo das bactrias portadoras do plasmdio). Essa placa pronta foi levada para estufa a 37C com a tampa para cima, por 60minutos, ao termino da incubao a placa foi virada com a tampa para cima, deixada overnight, para o crescimento bacteriano.(5) O ultimo passo foi armazenar a placa em geladeira por no mximo 10 dias. (AUSUBEL, 1995).

5.3.1.3 Extrao do DNA plasmidial das bactrias transformadas A extrao foi realizada pelo Laboratrio de Expresso Gnica da (UFSC) que utiliza um kit comercial, o HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM, onde se seguiu o protocolo padro do fabricante, como representado na figura 32, onde mostra esquematicamente o processo de extrao do DNA plasmidial.

Figura 32 Esquema representativo do mtodo da estrao do DNA. Fonte: kit HiSpeedTM Plasmid Maxi Kit, QIAGEM

5.3.1.3.1 Anlise da Pureza do DNA plasmidial

A quantificao e pureza do DNA plasmidial, foi realizado em um espectrofotmetro Ultrospec 2100 pro, Amersham Biosciences, que pertence ao Laboratrio de Expresso Gnica da (UFSC). Como as bases nitrogenadas do DNA absorvem energia em uma faixa de 260nm e os principais contaminantes so RNAs e protenas (absorvem em 280nm). Esta avaliao

48

feita atravs do valor da relao A260/A280, onde valores entre 1,8 e 1,9 indicam uma soluo de DNA com alta pureza. (OLIVEIRA, 2006).

5.3.2 Incubaes

Primeiramente foram preparadas solues de complexo trans-[RuCl2(nic)4] e do ligante(cido nicotnico) descomplexado com uma molaridade de 2000M. Forma feitas 4 solues com os determinados tampes( PIPES pH 6,0 ; PIPES pH 6,5; PIPES pH 7,0 e HEPES pH 8,0), todas essas solues de complexo e ligante continha seus respectivos tampes com uma molaridade de 50mM. As incubaes das solues de complexo e do ligante com o DNA plasmidial pBSK-II foram realizadas em temperaturas controlada de 37C e 50C. Ao trmino do perodo de incubao as reaes foram interrompidas pela adio de 2 L de tampo de corrida 6X concentrado (EDTA 0,25 M, glicerol 50% e azul de bromofenol 0,01% - pH 8,0), para cada 20 L de reao, e imediatamente resfriadas em banho de gelo. Em seguida, as amostras foram submetidas eletroforese em gel de agarose ou armazenadas a -20C para uso posterior.

5.3.2.1 Interao do ligante com molculas de DNA

Foi realizado com reaes contendo um volume final de 60L, o que possibilitou a realizao da anlise em triplicatas.A reaes foram incubadas por um perodo de 16 horas 37C, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0). Para cada uma das incubaes realizadas nesses pHs, foram utilizadas concentraes de 25mM do respectivo tampo. As concentraes do ligante (cido nicotnico) utilizadas no teste foram 0M(controle); 250M; 500M e 1000M, incubadas com aproximadamente 25M de DNA pBSK II.

5.3.2.2 Interao do complexo com molculas de DNA

Foi realizado com reaes contendo um volume final de 60L, o que possibilitou a realizao da anlise em triplicatas. A reaes foram incubadas por um perodo de 16 horas 37C, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0). Para cada uma das incubaes realizadas nesses pHs, foram utilizadas concentraes de 25mM do respectivo tampo. As concentraes do complexo

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utilizadas no teste foram 0M(controle); 250M; 500M e 1000M, incubadas com aproximadamente 25M de DNA pBSK II.

5.3.2.3 Interao do complexo com molculas de DNA na presena de DMSO

As reaes foram preparadas na presena de 10% de DMSO, que age como capturador de radicais hidroxila (OH.), que podem aparecer com uma atividade oxidativa do complexo na presena de oxignio. Da mesma forma que na outras reaes esta foi incubada por 16horas 37C, nos pHs (6,0; 7,0 e 8,0), contendo 25mM do respectivo tampo e utilizando as concentraes de complexo 0M(controle); 250 M; 500M e 1000M incubadas com aproximadamente 25M de DNA pBSK-II. Da mesma forma que nas outra reao, esta foi realizado com um volume final de 60L o que possibilitou sua anlise em triplicata.

5.3.2.4 Cintica cataltica do complexo sobre o DNA

Para a verificao da atividade cataltica as reaes foram realizadas a 50C em tampo PIPES pH 6,5 e monitorada por 8 horas. As concentraes utilizadas foram s mesmas da outras reaes comentadas acima 0 M(controle); 250M, 500M e 1000M de complexo. Cada tubo de reao foi planejado para ter um volume final de 240L o que possibilitou a retirada de 6 pontos (60L cada), que corresponde a tempos de 0h, 1h, 2h, 4h, 6h e 8h. Os resultados obtidos foram analisados utilizando o modelo matemtico de Lineweaver-Burk para equao de pseudo-Michaelis-Meten, para obteno dos parmetros: Km, Vmax, Kcat e Kcat/Km.

5.3.3 Confeco do gel de agarose e corrida eletrofortica

A preparao dos gis de agarose foi feita a partir da dissoluo, sob aquecimento em forno de microondas, da quantidade de agorase necessria para um gel com concentrao de 0,8 %, em soluo de TBE 0,5x concentrado (Tris 44,5 mM, cido brico 44,5 mM, EDTA 1 mM pH 8,0 ). Aps resfriamento da soluo at 60C, adicionado o brometo de etdio (concentrao final de 0,3 g/ml). Colocou-se a soluo em uma forma plana contendo os pentes, sendo preciso esperar em torno de uma hora para polimerizao da agarose e a fixao

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dos poos. Foram aplicados 20L de cada amostra nos poos do gel, para em seguida ser aplicado a uma corrida eletrofortica em (100V e 30 mA), por aproximadamente 2horas ou at que a frente de migrao (azul de bromofenol) atingisse o final do gel. As fontes de corrente contnua Life Technologies modelo 250 ou 250EX foram utilizadas ver (figura 33), mostra de maneira ilustrativa a realizao deste tipo de eletroforese. Com o trmino da corrida foi feita a visualizao atravs de um transiluminador (Biorad) e programa de computador adequado para comparar as massas de DNA. Por fim, os gis resultantes so digitalizados num sistema de fotodocumentao DigiDoc.It System (UVP), basicamente composto por um transiluminador UV ( = 302 nm) e uma cmera digital acoplada a um microcomputador. Em seguida so analisados as bandas formadas com o software LabWorks 4.0, UVP.

Figura 33 Mostra um esquema representativo da eletroforese em gel de agarose. (A) a matriz solidificada deixando forma os poos. (B)as amostra so depositadas no poos. (C) so submetidas a um campo eltrico.(D) os fragmentos apresentam uma migrao diferencial. Fonte: modificado de Oliveira (2006).

5.4 Anlise de Genotoxicidade e Mutagnese

5.4.1 Animais e Tratamento

Aps a aprovao do projeto pelo comit de tica os animais foram obtidos no biotrio da UNESC. Para realizao dos experimentos foram utilizados camundongos CF1 (Mus muscullus), machos (25 40 g de peso), que foram pesados e divididos em 4 (quatro) grupos e mantidos em gaiolas plsticas sobre condies controladas (ciclo claro-escuro de 12 h, temperatura 25C (60% umidade do ar), e receberam rao comercial e gua ad libitum para adaptao).

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Os animais foram tratados com complexo via intraperitoneal nas concentraes de 45,2M/Kg (grupo teste 1); 90,4M/Kg (grupo teste 2); 180,7M/Kg (grupo teste 3) que j se demonstraram efetivas na regulao de NO segundo Beirith et al (1999), e com o respectivo grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). Na anlise de genotoxicidade para cada concentrao e controle foi utilizado um n=6 para cada grupo, para a anlise de mutagnese foram utilizados um n=3 para cada grupo. O perodo de exposio para todos os camundongos foi de 0 a 120 minutos para anlise de genotoxicidade (sangue perifrico) e de 24 horas para Mutagnese (clulas de medula ssea). Para o primeiro procedimento o sangue perifrico foi coletado por puno ocular e para o ltimo procedimento os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e a medula retirada por processo cirrgico.

5.4.2 Anlise de Genotoxicidade

5.4.2.1 Teste cometa

O Teste Cometa ou SCGE (Single Cell Gel Assay), que tem sido cada vez mais utilizado, pois permite a avaliao de danos causados no DNA e o reparo do mesmo, o potencial genotxico de substncias variadas pode ser avaliado pelo teste cometa. (GUECHEVA et al. 2001). Pode-se realizar o teste em qualquer organismo vivo ou tipo celular, apresentando algumas vantagens quando comparado a outros testes para deteco de substncias que promovem dano ao DNA, porem, no utilizado para detectar mutao, mas sim leses genmicas que, aps serem processadas podem resultar nesta. (RIBEIRO, 2003). Este mtodo pode ser realizado em tempo que varia de horas a dias, alm de poder ser aplicado a qualquer clula de organismo vivo, tornando-o um excelente mtodo para avaliaes ambientais, de frmacos e produtos qumicos. (SILVA et al., 2000; MALUF e ERDTMANN, 2000). Tambm pode ser avaliado o nmero de clulas que tiveram ou no o seu DNA afetado e este valor, chamado de freqncia de dano ao DNA, expresso como porcentagem de clulas que tiveram algum dano mensurvel ao seu cdigo gentico. O teste Cometa em pH alcalino est representado na figura 34. Aps os tratamentos, as clulas foram colhidas e dissolvidas em agarose low-melting point (0,75%) e ento plaqueadas sobre uma lmina de microscopia com pr-cobertura de agarose (1,5%). As lminas foram feitas em duplicata para cada tratamento. As clulas foram lisadas com uma soluo de lise (2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10% DMSO pH 10) por no mnimo duas horas. Aps a lise, as lminas foram colocadas em uma cuba de

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eletroforese horizontal contendo uma soluo tampo (300mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 13,00-13,50 a 4C) que permite o desenrolamento do DNA, as laminas ficaram incubadas por 20 minutos nesta soluo alcalina feito na hora do uso. Uma corrente eltrica de 300mA e 25V foi aplicada por 15 minutos a 4C. As lminas foram ento neutralizadas com 0.4M Tris, pH 7.5. Aps estarem secas, as lminas foram fixadas por uma soluo contendo cido tricloroactico 15%, sulfato de zinco 5% e glicerol 5% e ento coradas com soluo de colorao contendo carbonato de sdio 5% mais nitrato de amnio 0,1%, nitrato de prata 0,1%, cido tungstosilicico 0,25% e formaldedo 0,15%. A reao foi parada com acido actico 1%. (SINGH et al. 1988, HARTMANN; SPEIT, 1997).

Figura 34 Descrio simplificada do teste cometa. Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann, Henriques (2003).

Foram analisados num total de 100 clulas para cada grupo teste, 50 por lamina, em microscpio ptico NIKON, com aumento de 400x, onde se observaram os ncleos contendo DNA intacto se apresentam redondos, nas clulas lesadas observa-se migrao de DNA para fora do ncleo, apresentando forma similar a um cometa, de onde se origina a nomenclatura do teste (Figura 35). As clulas so classificadas visualmente em cinco classes, de acordo com o tamanho da cauda, sem danos - classe 0 at danos mximos - classe 4. Assim, o ndice de danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0; 100 clulas observadas completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 clulas observadas com dano mximo).(VILLELA et al apud SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES 2003).

53

Figura 35 - Classificao do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes 2 e 3; (c) dano classe 4. Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann, Henriques (2003).

5.4.3 Analise de Mutagnese

5.4.3.1 Teste de microncleo

O teste do microncleo o ensaio in vivo mais amplamente utilizado para a deteco de agentes clastognicos (que quebram Cromossomos), e de agentes aneugnicos (que induzem aneuploidia ou segregao cromossmica anormal). (RIBEIRO, et al, 2003). Este teste foi inicialmente desenvolvido em eritrcitos de medula ssea de camundongo, mas tambm realizado em ratos. (SCHMID, 1976). As caractersticas bsicas do teste so: (1) o efeito do qumico observado em eritrcitos policromticos (PCEs) anucleados; (2) os (PCEs) tem um tempo de vida relativamente curto, de modo que qualquer microncleo que ele contenha deve ter sido gerado como resultado de danos cromossmicos induzidos recentemente; (3) os microncleos so facilmente identificveis e a sua distribuio bem definida; como na figura 36 e (4) a freqncia de microncleo induzida em (PCEs) dependente do tempo de amostragem. (RIBEIRO et al, 2003).

Figura 36 - Diferena na colorao de PCE e NCE: (a) eritrcito policromtico micronucleado (PCEMN); (b) eritrcito policromtico; (c) eritrcito normocromatico. Fonte: Ribeiro et al (2003).

O teste funcionou da seguinte maneira: (1) aps 24 horas do tratamento os 12 (doze) camundongos foram sacrificados, e atravs de procedimento cirrgico retirou-se o

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fmur do animal; (2) a extremidade final proximal do fmur foi cortada para expor o canal da medula; (3) o canal foi previamente preenchido com soro fetal bovino com ajuda de uma agulha de uma seringa de 1mL, foi inserida firmemente na abertura do fmur, injetando-se o soro, de modo a empurrar a medula para cima de uma lamina de microscopia onde se fez uma homogeneizao e esfregao com uma lamnula; (4) deixou-se secar as laminas em temperatura ambiente (25C), logo depois foram fixadas em uma soluo contendo metanol puro por 10 minutos, e novamente foram deixadas para secar em temperatura ambiente (25); (5) a colorao das lminas foi feita com o corante Giemsa diludo em soluo tampo fosfato (1x) com (pH 6,8), na proporo de 1:10, durante 15 minutos; (6) aps a colorao, as lminas foram lavadas com gua destilada, onde se removeu o excesso de corante e foram deixadas para secar em temperatura ambiente (25C). A colorao serve para diferenciar eritrcito policromtico (PCE) de eritrcito normocromtico (NCE). Os (PCE) ou jovens se coram de azul claro e os (NCE) se coram de vermelho-telha. (RIBEIRO et al, 2003).

5.5. Anlise Estatstica

As anlises estatsticas dos resultados obtidos foram realizadas atravs de anlise de varincia (ANOVA) e do Teste t de Student, para ambos os testes foi utilizado o software Microcal Origin 6.0, admitindo nveis de significncia de p<0,05; p<0,01 e p<0,001.

55

6 RESULTADOS

6.1 Anlises de Interao com Molculas de DNA plasmidial

Na Tabela 1 mostrado as fotos dos gis das incubaes do DNA com o ligante no complexado e o complexo, em ausncia e presena de DMSO 37C por 16 horas.

Tabela 1 Fotos dos gis das incubaes do ligante e complexo .

pH

Ligante

Complexo Em ausncia de DMSO Em presena DMSO


(0M) (250M) (500M) (1000M)

(0M) (250M) (500M) (1000M)

(0M) (250M) (500M) (1000M)

6,0

7,0

8,0

56

6.1.1 Interao do ligante com molculas de DNA

Na figura 37 mostra a porcentagem das formas plasmidiais induzido por concentraes variadas do ligante no complexado a uma temperatura de 37C por 16 horas, nos seguintes pHs (6,0; 7,0 e 8,0) testados. Os resultado em pH 6,0 apresentou ambas as formas de DNA, no controle (0M), manteve 78,451% na FI e 21,548% na FII. A concentrao de 250M teve 77,181% na FI e 22,818 na FII. Na incubao com 500M apresentou 77,430% da FI e 22,569% na FII. No pH 7,0 o controle (0M) mostrou 95,804% na FI e 4,196% na FII, a concentrao de 250M teve 93,348% do DNA plasmidial na FI e 6,52% na FII. A concentrao de 500M manteve 91,813% na FI e 8,187% na FII. A concentrao de 1000M teve 93,149% na FI e 6,851% na FII. No pH 8,0 o DNA plasmidial se apresentou em diferentes formas para todas as concentraes. Na incubao controle (0M) apresentou 89,443% na FI e 10,557% na FII, a concentrao de 250M apresentou o DNA com 88,443% na FI e 11,284% na FII, A concentrao de 500M apresentou 90,117% de FI e 9,883% FII do DNA. Em 1000M de complexo o DNA manteve 89,334% na FI e 10,656% na FII.
Tabela 2 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do ligante com o DNA plasmidial

pH 6,0 [] 0M 250M 500M 1000M %FI 78,451 77,181 77,430 77,526 %FII 21,549 22,819 22,570 22,474 %FI 95,804 93,348 91,813 93,149

pH 7,0 %FII 4,196 6,652 8,187 6,851 %FI 89,443 88,716 90,117 89,344

pH 8,0 %FII 10,557 11,284 9,883 10,656

57
100 90 80

FI FII

% da Forma plasmidial

70 60 50 40 30 20 10 0
[0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M]

pH=6,0

pH=7,0

pH=8,0

Figura 37 - Mdia da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentraes crescentes do ligante (cido nicotnico) descomplexado, nos pHs(6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no grfico.

6.1.2 Interao do complexo com molculas de DNA

A figura 38 mostra a porcentagem das plasmidiais causado por concentraes variadas de complexo trans-[RuCl2(nic)4] a 37C por 16 horas, nos seguintes pHs (6,0; 7,0 e 8,0) testados. A anlise dos gis das incubaes feitas no pH 6,0 mostrou que no controle (0M), as porcentagens das FI e FII de DNA plasmidial foram respectivamente, 70,872%2,23 e 36,504%3,07. Na concentrao de 250M ocorreu uma diminuio na forma FI para 47,383%0,84 e ocorreu um aumento na FII para 60,853%0,98. Em 500M tambm ocorreu uma diminuio da FI para 51,407%0,75 e um aumento na FII para 56,957%0,90. A maior atividade de clivagem do DNA plasmidial ocorreu na concentrao de 1000M onde reduziu a forma FI para 47,046%1,03 e aumentou a FII para 61,174%1,21. A diferena estatstica notada nas concentraes de 250M, 500M e 1000M com p<0,001 tendo como referencia para comparao com controle negativo contendo 25mM de tampo PIPES pH 6,0. Os gis do pH 7,0 mostraram que ocorreu a clivagem do DNA plasmidial da FI para FII em todas as concentraes. No controle a porcentagem da FI foi de 89,850%1,02 e o da FII foi de 10,150%1,25.Na concentrao de 250M teve uma reduo na FI para

58

86,486%1,58 e um aumento na FII para 13,514%1,9. Em 500M ocorreu tambm uma reduo da FI para 85,776%1,24 e um aumento para FII em 14,224%1,51. Na maior concentrao 1000M a FI foi reduzida para 83,509%0,98 e a FII aumentou para 16,491%1,20. A diferena estatstica notada nas concentraes de 250M, 500M e 1000M com p<0,01 tendo como referencia para comparao com controle negativo contendo 25mM de tampo PIPES pH 7,0. No pH 8,0 a clivagem do DNA plasmidial ocorreu em todas as concentraes analisadas. No controle (0M) a FI teve uma porcentagem de 86,663%0,26 e a FII uma porcentagem de 13,337%0,32. Na incubao contendo 250M de complexo a FI foi reduzida para 85,633%0,37 e a FII aumentou para 14,367%0,45. Na concentrao de 500M ocorreu diminuio da FI para 84,359%0,52 e um aumento da FII para 15,641%0,64. Em 1000M a porcentagem da FI diminui para 83,166%0,89 e a FII aumentou para 16,834%1,09. A diferena estatstica notada nas concentraes de 250M, 500M e 1000M com p<0,01 tendo como referencia para comparao com controle negativo contendo 25mM de tampo HEPES pH 8,0.
Tabela 3 - Porcentagem da formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA plasmidial.

pH 6,0 [] 0M 250M 500M %FI %FII %FI

pH 7,0 %FII %FI

pH 8,0 %FII

70,8722,23 36,5043,07 89,8501,02 10,1501,25 86,6630,26 13,3370,32 47,3830,84 60,8530,98 86,4861,58 13,5141,93 85,6330,37 14,3670,45 51,4070,75 56,9570,90 85,7761,24 14,2241,52 84,3590,52 15,6410,64

1000M 47,0461,03 61,1741,21 83,5090,98 16,4911,20 83,1660,89 16,8341,09

59
100

**
80

FI FII

**

**

**

**

**

% da forma plasmidial

***
60

***

***

40

20

0
[0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M]

pH=6,0

pH=7,0

pH=8,0

Figura 38 Mdia da clivagem de DNA plasmidial pBSK-II, quando incubado com concentraes crescentes do complexo, nos pHs (6,0; 7,0; 8,0) demonstrados no grfico. (**p<0,01 e ***p<0,001).

6.1.3 Interao do complexo com molculas de DNA em presena de DMSO

A figura 39 mostra a comparao da porcentagem das formas plasmidiais causado por concentraes variadas de complexos trans-[RuCl2(nic)4] no pH 6,0, a 37C por 16 horas em presena e ausncia de DMSO. Em presena de DMSO os seguintes resultados foram apresentados, no controle a porcentagem da FI foi de 70,913%0,35 e a de FII foi de 29,089%0,432. Na concentrao de 250M a porcentagem da FI foi de 56,618%0,82 e aumentou em relao a essa mesma concentrao em ausncia de DMSO, j a FII em comparao com esta diminuiu para 43,382%1,01. Em 500M de complexo com a presena de DMSO a porcentagem da FI aumento em relao concentrao sem DMSO para 62,356%0,94 e a FII diminui para 37,643%1,15. A concentrao de 1000M em presena de DMSO aumentou a porcentagem da FI e diminuiu a FII respectivamente para 56,652%1,09 e 43,348%1,34; em relao concentrao de 1000M em ausncia de DMSO. A diferena estatstica notada nas concentraes de 250M, 500M e 1000M contendo DMSO, com p<0,001 tendo como referencia para comparao com as mesmas concentraes e controle em ausncia de DMSO.

60 Tabela 4 Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 6,0.

Ausncia de DMSO [ ] 0M 250M 500M 1000M %FI 70,8722,23 47,3830,84 51,4070,75 47,0461,03 %FII 36,5043,07 60,8530,98 56,9570,90 61,1741,21

Presena 10% de DMSO %FI 70,9110,35 56,6180,82 62,3570,95 56,6521,01 %FII 29,0890,43 43,3821,01 37,6431,16 43,3481,34

100

FI FII

80

% da forma plasmidial

***
60

***

***

40

20

0
[0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M]

Sem DMSO

Com DMSO

Figura 39 - Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 6,0, na presena ou no de 10% DMSO. (***p<0,001).

Na figura 40 mostrado a porcentagem das formas plasmidiais causado por concentraes variadas de complexos trans-[RuCl2(nic)4] no pH 7,0, a 37C por 16 horas em presena e ausncia de DMSO. Em presena de DMSO os seguintes resultados foram apresentados, no controle a porcentagem da FI foi de 91,993%4,25 e a de FII foi de 8,007%5,21. Na concentrao de 250M a porcentagem da FI foi de 89,143%3,05 e a FII apresentou uma porcentagem de 10,857%3,74. Em 500M de complexo a porcentagem da FI foi de 87,461%2,44 e a FII se apresentou com 12,539%2,99. A concentrao de 1000M apresentou uma porcentagem

61

para FI de 87,247%2,55 e para a FII a porcentagem foi de 12,753%3,12. A diferena estatstica no foi notada em nenhuma das concentraes testadas, contendo DMSO, tendo como referencia para a comparao com as mesmas concentraes e controle em ausncia de DMSO.
Tabela 5 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 7,0.

Ausncia de DMSO [ ] 0M 250M 500M 1000M %FI 89,8501,02 86,4861,58 85,7761,24 83,5090,98 %FII 10,1501,25 13,5141,93 14,2241,52 16,4911,20

Presena 10% de DMSO %FI 91,9934,25 89,1433,05 87,4612,44 87,2472,54 %FII 8,0075,21 10,8573,74 12,5392,99 12,7533,12

100

FI FII

80

% da forma plasmidial

60

40

20

0
[0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M]

Sem DMSO

Com DMSO

Figura 40 - Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 7,0, na presena ou no de 10% DMSO.

A figura 40 mostra a porcentagem das formas plasmidiais causado por concentraes variadas de complexo trans-[RuCl2 (nic)4] no pH 8,0, a 37C por 16 horas em presena e ausncia de DMSO. Os resultados obtidos a partir dos gis em pH 8,0, na presena de DMSO, mostrou

62

os seguintes resultados, o controle apresentou uma porcentagem para FI de 89,317%0,23 e para FII de 10,683%0,29. Em 250M apresentou 87,752%0,42 para FI e 12,224%0,44 para FII. Na concentrao de 500M a porcentagem da FI foi de 87,776%0,36 e a FII se apresentou com 12,223%0,43. Na concentrao de 1000M mostrou uma porcentagem de DNA plasmidial na FI de 85,982%0,39e 14,018%0,48 para FII. A diferena estatstica notada no controle com p<0,001 e nas concentraes de 250M e 500M com p<0,01 e na concentrao de 1000M com p<0,05, contendo DMSO, tendo como referencia para comparao com as mesmas concentraes e controle em ausncia de DMSO.
Tabela 6 - Porcentagem das formas plasmidiais das incubaes do complexo com DNA em ausncia e presena de DMSO em pH 8,0.

Ausncia de DMSO [ ] 0M 250M 500M 1000M %FI 86,6630,26 85,6330,37 84,3590,52 83,1660,89 %FII 13,3370,32 14,3670,45 15,6410,64 16,8341,09

Presena 10% de DMSO %FI 89,3170,23 87,7520,42 87,7760,36 85,9820,39 %FII 10,6830,29 12,2480,52 12,2240,44 14,0180,48

100

***
80

FI FII

**

**

% da forma plasmidial

60

40

20

0
[0M] [250M] [500M] [1000M] [0M] [250M] [500M] [1000M]

Sem DMSO

Com DMSO

Figura 41 - Comparao da atividade do complexo de clivagem de DNA plasmidial pBSK-II em pH 8,0, na presena ou no de 10% DMSO. (***p<0,001; **p<0,01 e *p<0,05).

63

6.1.4 Cintica cataltica do complexo sobre molculas de DNA

Na Tabela 2 mostrado as fotos dos gis da anlise de cintica cataltica do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre molculas de DNA plasmidial em uma temperatura de 50C em pH 6,5 monitorada por 480 minutos (8 horas).
Tabela 7 - Fotos do Gis do experimento de cintica cataltica do complexo. [] 1gel
0min 60min 120min 240min 360min 480min

2gel
0min 60min 120min 240min 360min 480min

0M

250M

500M

1000M

Na figura 42 mostra a atividade cataltica do complexo sobre o DNA plasmidial em diferentes concentraes do complexo trans-[RuCl2(nic)4] a 50C por 480minutos (8horas) horas no pH 6,5. A degradao do DNA por diversas concentraes de complexo foi demonstrada no grfico como escala logartmica. Sendo que o valor da degradao do controle foi utilizado para normatizar a degradao natural do DNA nesse meio e no interferir nos resultados. Foram obtidas as seguintes equaes de reta para cada concentrao utilizada no teste. Em 250M y=-0,0005x-0,1159 com o coeficiente de correlao linear de R2=0,6572, em 500M

64

y= -0,0007x-0,0991 e R2=0,7591 e em 1000M y=-0,0001x-0,0723 e R2=0,9043.

Tempo em minutos 0,00 0 -0,10 ln (S/S0) -0,20 -0,30 -0,40 -0,50 -0,60 60 120 180 240 300 360 420 480

Controle 250M 500M 1000M Linear (Controle) Linear (250M) Linear (500M) Linear (1000M)

Figura 42 Atividade cataltica de diversas concentraes do complexo sobre o DNA plasmidial pBSK-II em 480 minutos de incubao a um temperatura de 50C em pH 6,5.

Na figura 43 mostra a constante cataltica observada para as concentraes de complexo trans-[RuCl2(nic)4] analisadas a 50C por 480minutos (8horas) horas no pH 6,5. A figura 43 foi construdo em base aos valores de a da equao da reta da figura anterior.

0,0012 0,001

kobs min -1

0,0008 0,0006 0,0004 0,0002 0 0 250 500 750 1000

[complexo](M)
Figura 43 - Constante cataltica do complexo calculado em base a concentraes crescentes de complexo e a quantidade em moles de substrato degradado por minuto.

Na figura 44 usou-se o modelo de Lineweaver-Burk para a equao pseudoMichaelis-Menten, para determinar a velocidade mxima (Vmax) e constante mdia de reao (Km) do complexo, que a sua concentrao necessria para obteno da metade da velocidade mxima de reao. Os valores obtidos da equao foram os seguintes: Vmax=1,4x10-3 Mol/ min-1 e um Km =457,14M.

65

2500 2000 1500 1000 500 0 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 0,0035 0,004 y = 326531x + 714,29 R2 = 0,9884

1 / Vo

1 / [complexo]
Figura 44 modelo de Lineweaver-Burk

6.2. Anlise de Genotoxicidade e Mutagnese

6.2.1 Teste Cometa

6.2.1.1 ndice de Fragmentao ao DNA

A figura 45 demonstra a mdia do ndice de fragmentao no DNA causado pelo complexo trans-[RuCl2(nic)4] em clulas sangneas dos seis camundongos testados, durante um perodo de 120 minutos. No tempo 0 minuto retirada antes da aplicao do complexo, o grupo controle e os grupos teste 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg apresentaram ndices de fragmentao ao DNA de 22,6674,55, 23,3335,28, 25,004,23 e 22,6675,01 respectivamente. Em base a estes dados obtidos no foi notada nenhuma diferena estatstica tendo como referencia a comparao das dos grupos testes com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 30 minutos o ndice de fragmentao ao DNA para o grupo controle e os grupos teste 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg foram de 30,1677,31,

60,6673,09, 66,50010,75 e 71,50016,61 respectivamente para cada grupo. A diferena estatstica notada nas concentraes de 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg com p<0,001, tendo como referncia para comparao com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 60 minutos, o ndice de fragmentao ao DNA apresentado pelo grupo controle e grupos teste 45,2; 90,4 e 180,7M/Kg forma os seguintes 36,6675,13, 68,1678,64, 70,66710,09 e 109,66730,10 respectivamente. Com os seguintes dados

66

obtidos foi possvel notar uma diferena estatstica nas concentraes de 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg com p<0,001, tendo como referncia para comparao com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 120 minutos, o ndice de fragmentao ao DNA das clulas analisadas para o grupo controle e grupos teste 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg foram de 34,66711,43, 37,0014,70, 38,66713,41 e 37,83314,19 respectivamente. No foi observada diferena estatstica no ndice de fragmentao dos grupos testes, tendo como referncia a comparao como o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0).
Tabela 8 - Valores do ndice de fragmentao do DNA.

Tempo em minutos [ ] Controle 45,2M/Kg 90,4M/Kg 180,7M/Kg 0 22,6674,55 23,3335,28 20,504,23 22,6675,01 30 30,1677,31 60,6673,09 66,5010,75 71,5016,61 60 36,6675,13 68,1678,64 70,66710,09 109,66730,10 120 34,66711,43 37,0014,70 38,66713,41 37,83314,19

importante relembrar que o ndice de dano ao DNA varia de 0 (0x100 numero de clulas analisadas) 400 (4x100 numero de clulas analisadas).
160

140

Controle [45,2]M/Kg [90,4]M/Kg [180,7]M/Kg

ndice de fragmentao do DNA

120

100

80

60

40

20

0 0 30 60 Tempo em Minutos 90 120

Figura 45 ndice de fragmentao do DNA de clulas sangneas de camundongos CF1.

67

6.2.1.2 Freqncia de dano ao DNA

A freqncia de dano ao de DNA realizado por um calculo simples de porcentagem, das clulas analisadas no teste cometa que tenham o seu DNA fragmentado (danificado). Na figura 46 mostrado as mdias das porcentagens de clulas sanguneas com o DNA danificado, dos seis camundongos analisados, causado pelo complexo trans[RuCl2(nic)4], durante um perodo de exposio de 120 minutos. No tempo 0 minuto retirada antes da aplicao do complexo, o grupo controle e os grupos teste 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg apresentaram respectivamente 21,833%4,83, 22,500%4,64, 20,00%3,85 e 20,500%4,85 de clulas com DNA danificado. No foi notada nenhuma diferena estatstica tendo como referencia a comparao das dos grupos testes com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 30 minutos, o grupo controle e os grupos teste 45,2; 90,4 e 180,7M/Kg apresentaram respectivamente 25,667%5,57; 47,667%4,50; 51,667%5,59 e 51,500%10,07 de clulas com o DNA danificado. A diferena estatstica notada nas concentraes de 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg com p<0,001, tendo como referncia para comparao com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 60 minutos, a porcentagem de clulas com fragmentao no DNA no grupo controle e nos grupos teste 45,2; 90,4 e 180,7M/Kg apresentaram respectivamente 33,0005,76; 50,1676,18; 54,0005,76 e 66,66713,50. A diferena estatstica notada nas concentraes de 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg com p<0,001, tendo como referncia para comparao com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0). No tempo de 120 minutos, foi observado que no grupo controle e nos grupos teste 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg apresentam respectivamente porcentagem de clulas com DNA danificado de 28,167%7,25; 32,000%10,47; 29,000%7,70 e 32,5000%10,47. No foi observada diferena estatstica no ndice de fragmentao dos grupos testes, tendo como referncia a comparao como o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0).

68 Tabela 9 - Valores da freqncia de clulas com DNA danificado.

Tempo em minutos [ ] Controle 45,2M/Kg 90,4M/Kg 180,7M/Kg 0 21,8334,83 22,504,64 20,003,85 20,504,85 30 25,6675,57 47,6674,50 51,6675,60 51,5010,07 60 33,0005,76 50,1676,18 54,0005,76 66,66713,50 120 28,1677,25 32,00010,47 29,0007,70 32,50010,47

100

% de clulas com fragmentao no DNA

Controle [45,2]M/Kg [90,4]M/Kg [180,7]M/Kg

80

60

40

20

0 0 30 60 Tempo em Minutos 90 120

Figura 46 - Percentual de clulas sangneas de camundongos CF1, com o seu DNA fragmentado.

6.2.2 Teste Microncleo

A porcentagem de microncleos realizada atravs do numero de microncleos encontrados na analise de 2000 eritrcitos policromticos (PCEs) anucleados. A figura 44 mostra as medias das porcentagens encontradas de microncleos dos (PCEs) anucleados da medula ssea de trs camundongos testados, com concentraes do complexo trans[RuCl2(nic)4] e seu respectivo controle. Analisando os resultados, o controle apresentou uma porcentagem de microncleos de 0,033%0,06, a concentrao de 45,2M/Kg mostrou uma porcentagem de 0,517%0,25, na concentrao de 90,4M/Kg foi de 0,400%0,10 e na concentrao de

69

180,7M/Kg a porcentagem observada foi de 0,567%0,20. Com os dados obtidos foi notada uma diferena estatstica nas concentraes de 45,2M/Kg; 90,4M/Kg e 180,7M/Kg com p<0,05, tendo como referncia para comparao com o grupo controle (Tampo PIPES pH 7,0).
Tabela 10 - Porcentagem de microncleos

Indivduos 1 2 3 Mdia Desvio padro

Controle 0,100% 0,000% 0,000% 0,033% 0,058

45,2M/Kg 0,250% 0,550% 0,750% 0,517% 0,252

90,4M/Kg 0,300% 0,500% 0,400% 0,400% 0,100

180,7M/Kg 0,450% 0,450% 0,800% 0,567% 0,202

1,00

*
0,80

*
0,57

0,52

% de Microncleo

0,60

*
0,40

0,40

0,20

0,03

0,00 Controle [45,2M/Kg] Tratamento [90,4M/Kg] [180,7M/Kg]

Figura 47 Percentual de microncleo encontrados em eritrcitos policromticos, da medula ssea de camundongos CF1. (*p<0,05).

70

7 DISCUSSO DOS RESULTADOS

7.1 Clivagem do DNA

7.1.1 Atividade de clivagem do Ligante

No foi notada uma a clivagem do DNA plasmidial na presena de concentraes crescentes do ligante e em pHs diferentes. notada a formao de bandas mais intensa de DNA FII no pH 6,0; que devido prpria instabilidade do DNA plasmidial nesse pH que pode acelerar sua degradao natural. No pH 7,0 a formao de bandas de DNA FII no foi significativa, em nenhuma concentrao testada e estas formaram muito menos intensas que no pH 6,0. No pH 8,0 no diferente dos outros pHs testado a formao de bandas de DNA FII no aumentou significativamente com o aumento das concentraes. As bandas de DNA FII, nesse pH foram mais intensas quando comparadas com o pH 7,0 e menos intensas do que quando comparadas com as do pH 6,0, levando a se observar uma pequena instabilidade do DNA em meio cido.

7.1.2 Atividade de clivagem do complexo

Analisando os gis, observou-se que em pH 6,0 houve uma reduo das bandas de DNA FI e um aumento das bandas de DNA FII. Para todas as concentraes testas no pH 6,0; em comparao com seu respectivo controle. Observou-se que a concentrao de 1000M de complexo para esse mesmo pH teve uma maior reduo das bandas de DNA FI e um aumento acentuado das bandas da FII. Nos pHs 7,0 e 8,0 houve tambm a clivagem do DNA plasmidial FI para a FII, cuja atividade aumenta com a concentrao, tendo seu valor mximo em 1000M de complexo. Comparando se a atividade do complexo nos pHs testados, nota-se que o mesmo tem sua atividade cataltica diminuda com o aumento do pH. Sendo assim possui uma maior atividade em pH 6,0. Segundo Paula et al, (1998), o complexo sofre uma deprotonao conforme com o meio mais alcalinizado. Tambm sugere um rearranjo geomtrico na estrutura da molcula, conforme ocorra a deprotonao. Analisando essas caractersticas j observadas em literatura, podemos sugerir que sua atividade diferenciada em determinados pHs devido a uma conformao geomtrica adotada pela molcula nesses pHs.

71

Levando em considerao atividade que o complexo e do ligante sobre o DNA, podemos pensar que a clivagem do DNA pelo complexo, dependa primeiramente da presena do tomo de coordenao Rutnio e em segundo lugar o tipo de alinhamento que essa coordenao est exercendo sobre os ligantes, j que o ligante no complexado no demonstrou uma atividade significativa sobre a clivagem do DNA.

7.1.3 Atividade de clivagem do complexo em presena de DMSO

Houve uma diminuio significativa da atividade de clivagem de molculas de DNA plasmidial causado pelo complexo em presena de 10% de DMSO nas incubaes. Com a diminuio da atividade do complexo em presena de DMSO (quelante de radicais OH), analisando esse resultado pode-se sugerir que o complexo tenha um mecanismo oxidativo de clivagem do DNA. Esse mecanismo pode estar ligado com o tomo de coordenao no caso Ru (II) que segundo Paula et al (1998) demonstram grande potencial oxreduo. Por essa caracterstica apresentada, o tomo de Ru poderia estar evolvido com o O2 molecular em uma via cataltica de formao de radicais OH. Uma possibilidade de formao de radicais OH seria no envolvimento do on Ru(II) nas reaes de Fenton e Haber-Weiss, que segundo Macyk, Franke e Stochel (2005) metais de transio tem a habilidade de catalisar essas reaes e aumentar a formao de diferentes tipos de espcies reativas de oxignio. A figura 48 representa o mecanismo oxidativo proposto de clivagem do DNA plasmidial pelo on de Ru(II) presente no centro de coordenao do complexo.

Reao de Fenton
Ru
2+

Reao de Haber-Weiss
O2

+ +

O2 2H
+

Ru

3+

. .

Ru Ru

3+

+ O2

Ru Ru O2

2+

+ O2
-

2O 2 Ru
2+

O2 Ru
3+

+ +

H2O 2 OH-+ OH

2+

+ H2O 2 + H2O 2

3+

+ OH + OH

. .

+ H2O 2

O2

+ OH + OH

Figura 48- Reao de Fenton adaptada para o on de Ru(II).

A formao de produtos como Ru3+ e OH nas reaes comentadas na figura 48 podem ser os responsveis pela clivagem do DNA. O on de Ru3+ pode estar sendo reduzindo para Ru2+ pelo prprio DNA que se oxida formando diversos produtos. O radical OH formado

72

nas reaes, segundo Macyk, Franke e Stochel (2005) o radical mais lesivo que pode reagir com diversas molculas incluindo o DNA. Notou-se que a clivagem do DNA causada pelo complexo em presena de DMSO nas incubaes foi diminuda mais no inibida. Essa pequena atividade observada pode estar relacionada com um mecanismo hidroltico de clivagem. De acordo com Creczynski-Pasa (2001) o complexo em soluo substitui os cloros na posio trans por molculas de H2O. Essas molculas podem ser ativadas a um nucleoflico, por polarizao da mesma e atacar os grupos fosfatos da estrutura do DNA. A figura 49 mostra o mecanismo hidroltico proposto de clivagem do DNA plasmidial.
Base O R O

O OH

H HO
+

OH

Base

N
Ru
2+

N
O
-

O P O O HO O Base O P OH

OH

+
O O Base

N
Cl

HO

HO

R R

Figura 49 - Reao proposta de hidrolise da ligao fosfodister do DNA plasmidial (pBSK-II) causado pelo complexo de rutnio trans-[RuCl2(nic)4].

7.4 Cintica Cataltica do Complexo

Os resultados de cintica demonstraram que o complexo na maior concentrao 1000M comeou a saturar a reao, pela formao do complexo enzima-substatrato que talvez esteja impedindo que a velocidade de catalise aumente devido a uma competitividade ao substrato. A constante cataltica (Kcat), observada para o complexo foi a seguinte Kcat=8,4x10-2 h-1. A eficincia cataltica Kcat/Km(M-1.h-1 observada para o complexo em 183,75M-1.h-1. A degradao natural do DNA foi aumentada em 2,33x106 vezes, onde esse numero corresponde o nmero de Enhancement. Este aumento promovido pelo complexo se apresenta prximo de muitas nucleases sintticas, como a nuclease Rh-P-Zn que apresenta um Enhancement de 2,50x106

73

muito prximo do complexo e outro exemplo tambm demonstrado por Sreedhara e Cowan (2001) a nuclease Mg-MutT dGTPase que apresenta um valor de 4,00x1011 , muito maior que o valor observado pelo complexo.

7.2 Teste Cometa

7.2.1 ndice e freqncia de dano ao DNA

O complexo de rutnio em estudo, trans-[RuCl2(nic)4], quando analisado pelo teste cometa, apresentaram ndice de fragmentao e freqncia de clulas com DNA danificado alteados. Levando em considerao que o teste foi realizado em um perodo de exposio de 120 minutos dos animais ao complexo, e que as retirada de sangue forma feitas em intervalos de tempo de 0 minuto (antes da aplicao do complexo), 30 minutos aps a aplicao do complexo, 60 minutos e por final 120 minutos. Notou-se que o ndice de fragmentao e a freqncia de clulas com DNA lesado, teve um aumento proporcional as doses e o tempo de exposio ao complexo, esse aumento foi efetivo at um perodo de 60 minutos, aps esse perodo chegando em 120 minutos de exposio, foi notada uma diminuio significativa de ambos os parmetros avaliados. Com o aumento progressivo da atividade do complexo em um perodo de 60 minutos no organismo dos camundongos, podemos sugerir que o complexo possa estar sofrendo algum tipo de ativao no organismo desses. E pelo fato das concentraes utilizadas neste experimento serem menores do que aquelas que causaram um efeito genotxico nos experimentos de Amboni (2003) e Naspoline (2004), onde foram utilizadas apenas clulas sangneas em cultura in vitro. A diminuio da atividade do complexo sobre o DNA das clulas sanguneas dos animais analisados aps um perodo de exposio ao complexo. Pode ser explicada observando-se que, a quantidade de complexo no organismo dos camundongos poderiam estar diminuindo com a ativao de algum mecanismo de metabolizao e/ou de eliminao, como sugerido por Ribeiro (2003) para ativao de pr-genotxicos. Com essa suposta diminuio do complexo o sistema de reparo do DNA j ativo pelas leses causadas pelo complexo, poderia ser mais eficiente no que diz respeito da reparao do DNA lesado.

7.3 Teste Microncleo

74

Quando analisado a freqncia de microncleo em eritrcitos policromaticos anucleados dos animais tratados com o complexo trans-[RuCl2(nic)4], durante um perodo de 24 horas, observou-se que a freqncia aumentou nos grupos testes quando comparado com o grupo controle. Mas esse aumento no foi significativo entre os grupos testes. O resultado apresentado pode ser conseqncia de concentraes muito elevadas que poderia estar extrapolando a dose resposta da substancia. Como o complexo apresentou atividade genotxica, talvez seja um dos motivos pelo qual a possa estar provocando a atividade mutagnica, como o aumento da freqncia de microncleos em eritrcitos policromaticos anucleados. O DNA pode estar sofrendo leses extensas em sua estrutura, que passa ser responsvel por fatores que formem microncleos, como as quebras cromossmicas e o desvio de cromossomos do fuso mittico na diviso celular, j que o teste feito 24 horas aps a exposio do qumico. Em leses extensas no DNA um sistema de reparao do DNA pode estar sendo ativado como o Sistema de Reparo Sujeito a Erros que aumento a taxa de mutao, e pode estar inferindo na formao de clulas micronucleadas.

75

8 CONCLUSO

O complexo trans-[RuCl2(nic)4], apresentou uma atividade de clivagem no DNA plasmidial, sendo essa mais efetiva em pH 6,0. Essa caracterstica fundamenta na busca de quimioterpicos mais especficos para tumores, sabendo que tecidos tumorais devido a hipxia apresentam um pH inferior ao fisiolgico. Foram propostos dois mecanismos para a clivagem do DNA plasmidial pelo complexo, sendo um oxidativo e o outro hidroltico. O primeiro mecanismo esta envolvido em um ciclo cataltico de reao com o Oxignio e o centro metlico do complexo. Esse mecanismo de oxidao no de grande vantagem para o uso em biotecnologia, pois forma produtos irreversveis e terminais que no podem ser religados enzimaticamente. O Mecanismo hidroltico, menos ativo que o primeiro o resultado de uma coordenao de molculas de H2O e a polarizao da mesma, e formao de um nucleoflico para o ataque as ligaes fosfodister do DNA. Esse mecanismo forma terminais com hidroxilas (OH) livres que podem se religados por enzimas especificas como exemplo, uma T4 ligase. A velocidade de degradao natural do DNA plasmidial foi aumentada pelo complexo, com valores muito prximos de algumas nucleases sintticas j conhecidas. Esse resultado observado apresenta uma possibilidade futura na teraputica contra o cncer j que acelera a velocidade de degradao do DNA, que em tumores a sntese de DNA est muito intensa. O complexo apresentou efeitos genotxicos in vivo em concentraes bem menores que quando comparada s que produziram dados signitivamente diferentes in vitro. Desta forma pode-se inferir que um processo de ativao metablica do complexo quando este se faz presente em sistema biolgico, semelhante ao proposto por CreczynskiPasa (2001) para regulao de NO, j que o mesmo apresentou um pico de ativao e uma reduo de atividade ao logo do tempo testado. Uma atividade Mutagnica foi notada no teste de microncleo de clulas de medula de camundongos tratados com o complexo aps 24 horas, devido talvez pela quantidade de danos genmicos causado pelo complexo, acumulado durante todo o tempo de incubao. Esse efeito no teve diferena nas concentraes testas, devido talvez pelo excesso de complexo e do nvel de acumulao do mesmo no tecido estudado, assim tornado txico para as clulas analisadas.

76

9 PERSPECTIVAS

recomendvel mais experimentos que venham a contribuir para o entendimento do complexo trans-[RuCl2(nic)4] frente a reaes biolgicas. Teste de clivagem com molculas de DNA sob atmosfera de argnio, para verificar mais precisamente o tipo de mecanismo de clivagem que o complexo esta desempenhando. Separao dos produtos de clivagem do DNA causado pelo complexo, utilizado cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC). Teste de genotoxicidade in vitro e in vivo com diferentes linhagens de clulas tumorais, para verificar se o complexo o tipo de atividade desempenhada nessas linhagens celulares. Aumentar o n do teste de mutagnese (teste de microncleo) para verificao detalhada da atividade do complexo sobre mecanismo de mutao.

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APNDICES

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APNDICE A ANLISE ESTATSTICA DO TESTE DE INTERAO

As Tabelas 1 3 apresentam respectivamente as anlises de varincia ANOVA dos resultados encontrados de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre molculas de DNA plasmidial, nos pHs 6,0; 7,0 e 8,0; utilizando o software Microcal Origin 6.0.
Tabela 1 Valores do teste ANOVA no pH 6,0. [30/9/2006 10:49 "/Data1" (2454008)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(sem0) -> Col(sem1000): Data Mean Variance 0M(controle) 70,87171 7,48779 250M 47,38309 1,05226 500M 51,40747 0,84189 1000M 47,04627 1,59681 F = 139,6838 p = 3,00788E-7 At the 1E-3 level, the means are significantly different.

N 3 3 3 3

Tabela 2 Valores do teste ANOVA no pH 7,0. [30/9/2006 10:52 "/Data1" (2454008)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(sem0) -> Col(sem1000): Data Mean Variance 0M(controle) 89,84955 1,56186 250M 86,48557 3,72577 500M 85,77573 2,30202 1000M 83,50921 1,43918 F = 9,1498 p = 0,00578 At the 0,01 level, the means are significantly different.

N 3 3 3 3

Tabela 3 Valores do teste ANOVA no pH 8,0. [30/9/2006 10:53 "/Data1" (2454008)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(sem0) -> Col(sem1000): Data Mean Variance 0M(controle) 86,66338 0,10384 250M 85,63278 0,20715 500M 84,35911 0,4104 1000M 83,16609 1,18889 F = 14,51771 p = 0,00134 At the 0,01 level, the means are significantly different.

N 3 3 3 3

As Tabelas 4 7 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre molculas de DNA plasmidial no pH 6,0 na presena de DMSO, comparando com os resultados em ausncia de DMSO, utilizando o software Microcal Origin 6.0.

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Tabela 4 Valores do Teste t dos controles no pH 6,0. [29/9/2006 20:18 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 70,87167 7,48692 3 Ausncia de DMSO 70,91133 0,18599 3 t = 0,0248 p = 0,9814 At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

Tabela 5 Valores do Teste t das concentraes 250M no pH 6,0. 29/9/2006 20:57 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 47,383 1,05311 3 Ausncia de DMSO 56,618 1,02078 3 t = 11,10722 p = 3,73782E-4 At the 1E-3 level, the two means are significantly different.

Tabela 6 Valores do Teste t das concentraes de 500M no pH 6,0. [29/9/2006 21:02 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 51,40733 0,84184 3 Ausncia de DMSO 62,35667 1,34161 3 t = 12,83443 p = 2,12456E-4 At the 1E-3 level, the two means are significantly different.

Tabela 7 Valores do Teste t das concentraes de 1000M no pH 6,0. [29/9/2006 21:07 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 47,046 1,59721 3 Ausncia de DMSO 56,652 1,8051 3 t = 9,0202 p = 8,36594E-4 At the 1E-3 level, the two means are significantly different.

As Tabelas 8 11 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre molculas de DNA plasmidial no pH 7,0 na presena de DMSO, comparando com os resultados em ausncia de DMSO, utilizando o software Microcal Origin 6.0.

85 Tabela 8 Valores do Teste t dos controles no pH 7,0. [29/9/2006 20:20 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 89,84933 1,56119 3 Ausncia de DMSO 91,99333 27,1063 3 t = 0,69357 p = 0,52612 At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

Tabela 9 Valores do Teste t das concentraes de 250M no pH 7,0. [29/9/2006 20:59 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 86,48567 3,7273 3 Ausncia de DMSO 89,143 13,98014 3 t = 1,09378 p = 0,3355 At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

Tabela 10 Valores do Teste t das concentraes de 500M no pH 7,0. [29/9/2006 21:04 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 85,77567 2,30281 3 Ausncia de DMSO 87,46067 8,94036 3 t = 0,87039 p = 0,4332 At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

Tabela 11 Valores do Teste t das concentraes de 1000M no pH 7,0. [29/9/2006 21:09 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 83,509 1,43912 3 Ausncia de DMSO 87,2474 9,71562 3 t = 1,93873 p = 0,12456 At the 0,05 level, the two means are NOT significantly different.

As Tabelas 12 15 apresentam os valores do Teste-t, dos resultados encontrados da atividade de clivagem do complexo trans-[RuCl2(nic)4] sobre molculas de DNA plasmidial no pH 8,0 na presena de DMSO, comparando com os resultados em ausncia de DMSO, utilizado o software Microcal Origin 6.0.

86 Tabela 12 Valores do Teste t dos controles no pH 8,0. [29/9/2006 20:32 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 86,66333 0,10372 3 Ausncia de DMSO 89,31733 0,08175 3 t = 10,67383 p = 4,3639E-4 At the 1E-3 level, the two means are significantly different.

Tabela 13 Tabela 11 Valores do Teste t das concentraes de 250M no pH 8,0. [29/9/2006 21:00 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 85,63267 0,20736 3 Ausncia de DMSO 87,75167 0,26921 3 t = 5,31655 p = 0,00602 At the 0,01 level, the two means are significantly different.

Tabela 14 Tabela 11 Valores do Teste t das concentraes de 500M no pH 8,0. [29/9/2006 21:05 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 84,359 0,41034 3 Ausncia de DMSO 87,776 0,1923 3 t = 7,62388 p = 0,00159 At the 0,01 level, the two means are significantly different.

Tabela 15 Tabela 11 Valores do Teste t das concentraes de 1000M no pH 8,0. [29/9/2006 21:10 "/Data1" (2454007)] Independent t-Test on Data1 col(Presena de DMSO) and col(Ausncia de DMSO): Data Mean Variance N Presena de DMSO 83,166 1,18812 3 Ausncia de DMSO 85,98167 0,23226 3 t = 4,09204 p = 0,01495 At the 0,05 level, the two means are significantly different.

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APNDICE B VALORES DOS RESULTADOS DE CINTICA CATALTICA As Tabelas 16 e 17 mostram os valores de degradao do DNA plasmidial de cada concentrao testadas ao longo de 480 minutos em pH 6,5

Tabela 16 valores da degradao do DNA plasmidial expressados em porcentagem.


[ ] 0M 250M 500M 1000M 0 0,90 0,91 0,90 0,89 60 0,90 0,75 0,77 0,78 120 0,90 0,72 0,70 0,71 240 0,90 0,66 0,63 0,60 360 0,90 0,68 0,63 0,56 480 0,90 0,66 0,62 0,55

Tabela 17 valores da degradao do DNA plasmidial expressados em logaritmo (In).


[ ] 0M 250M 500M 1000M 0 0,000 0,000 0,000 0,000 60 0,000 -0,195 -0,154 -0,135 120 0,000 -0,237 -0,250 -0,224 240 0,000 -0,320 -0,351 -0,393 360 0,000 -0,298 -0,361 -0,466 480 0,000 -0,331 -0,366 -0,486

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APNDICE C ANLISE ESTATSTICA DO TESTE COMETA.

As Tabelas 18 21 mostram os valores da anlise ANOVA dos ndices de dano ao DNA, utilizado o software Microcal Origin 6.0.
Tabela 18 Valores anlise ANOVA no tempo 0. [28/9/2006 13:35 "/Data1" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 22,66667 20,66667 6 45,2M/kg 23,33333 27,86667 6 97,4M/kg 20,5 17,9 6 180,7M/kg 22,66667 25,06667 6 F = 0,40012 p = 0,75441 At the 0,05 level, the means are NOT significantly different.

Tabela 19 Valores anlise ANOVA no tempo 30. [28/9/2006 14:04/Data5 (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 30,16667 53,36667 6 45,2M/kg 60,66667 11,46667 6 97,4M/kg 66,5 138,7 6 180,7M/kg 71,5 275,9 6 F = 17,25034 p = 9,05168E-6 At the 1E-3 level, the means are significantly different.

Tabela 20 Valores anlise ANOVA no tempo 60. [28/9/2006 14:19 "/Data6" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 36,66667 26,26667 6 45,2M/kg 68,16667 74,56667 6 97,4M/kg 70,66667 101,8667 6 180,7M/kg 109,6667 905,8667 6 F = 19,35247 p = 3,95143E-6 At the 1E-3 level, the means are significantly different.

Tabela 21 Valores anlise ANOVA no tempo 120. [28/9/2006 14:29 "/Data7" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controleind) -> Col(teste3ind): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 34,66667 130,6667 6 45,2M/kg 37,00 216,00 6 97,4M/kg 38,66667 179,8667 6 180,7M/kg 37,83333 201,3667 6 F = 0,09792 p = 0,96026 At the 1E-3 level, the means are NOT significantly different.

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As Tabelas 22 25 mostram os valores da anlise ANOVA das freqncia de clulas com DNA fragmentado, utilizado o software Microcal Origin 6.0.
Tabela 22 Valores anlise ANOVA no tempo 0. [28/9/2006 13:38 "/Data1" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 21,83333 23,36667 6 45,2M/kg 22,5 21,5 6 97,4M/kg 20 14,8 6 180,7M/kg 20,5 23,5 6 F = 0,38677 p = 0,76372 At the 0,05 level, the means are NOT significantly different.

Tabela 23 Valores anlise ANOVA no tempo 30. [28/9/2006 14:14 "/Data5" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 25,66667 31,06667 6 45,2M/kg 47,66667 24,26667 6 97,4M/kg 51,66667 37,46667 6 180,7M/kg 51,5 101,5 6 F = 19,12592 p = 4,30677E-6 At the 1E-3 level, the means are significantly different.

Tabela 24 Valores anlise ANOVA no tempo 60. [28/9/2006 14:21 "/Data6" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 33,00 33,20 6 45,2M/kg 50,16667 38,16667 6 97,4M/kg 54,00 33,20 6 180,7M/kg 66,66667 182,2667 6 F = 16,15243 p = 1,43625E-5 At the 1E-3 level, the means are significantly different.

Tabela 25 Valores anlise ANOVA no tempo 120. [28/9/2006 14:30 "/Data7" (2454006)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 28,16667 52,56667 6 45,2M/kg 32,00 109,60 6 97,4M/kg 29,00 60,80 6 180,7M/kg 32,50 109,50 6 F = 0,33487 p = 0,80026 At the 1E-3 level, the means are NOT significantly different.

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APNDICE D ANLISE ESTATSTICA DO TESTE MICRONCLEO.

A Tabela 26 mostra os valores da anlise do teste ANOVA da porcentagem de microncleos.


Tabela 26 Anlise ANOVA da atividade Mutagnica do complexo pelo software Microcal Origin 6.0 [26/9/2006 10:19 "/Data1" (2454004)] One-Way ANOVA on columns selected between Col(controlefre) -> Col(testefreq): Data Mean Variance N 0M/kg(controle) 0,03333 0,00333 3 45,2M/kg 0,51667 0,06333 3 97,4M/kg 0,4 0,01 3 180,7M/kg 0,56667 0,04083 3 F = 5,92671 p = 0,01977 At the 0,05 level, the means are significantly different.

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ANEXO

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ANEXO A APROVAO DO TRABALHO PERANTE O COMIT DE TICA DESTA UNIVERSIDADE.