Identificao de ciclotdeos em algumas espcies de Violceas brasileiras.

Jenny Z. G. Najas Angelo C. Pinto - Orientador.

Contedo
Ciclotdeos Famlia Violaceae Extrao Purificao Identificao Analises MALDI-TOF HPLC

Concluses

Ciclotdeos

Massa: 28-37 resduos de aminocido, 2500 e 4000 Da.

Apresentam ciclizao conhecida como cabea-cauda

Ligao de Cisteina cclica ou Cyclic Cysteine Knof,

Atividades Biolgicas
Atividade Antagonista de neurotensina Inibitria da tripsina Hemoltica Ref. Witherup e col., 1994 Hernndez e col., 2000 Claeson e col.,1998; Gransson y col., 1999; Chen e col., 2006.

Atividade
Uterotnica Antimicrobi ana Inseticida anti-HIV

Ref.
Gran, 1973a; 1973b; Gran e col., 2000 Tam e col., 1999 Jennings e col., 2001; 2005 Gustafson e col., 1994; Daly e col., 1999a; Bokesch e col., 2001; Gustafson e col., 2004; Daly e col., 2004

Anticncer
Cardiotxica

Lindholm e col., 2002; Gransson e col., 2004b

Gran, 1973c.

Famlia Violaceae
Norte Acre, Amazonas, Roraima,Tocantins Amap, Par, Rondnia,

Nordeste
Centro-oeste Sudeste

Alagoas, Bahia, Pernambuco, Piau,

Cear, Maranho, Paraba, Rio Grande do Norte,Sergipe

Distrito Federal, Gois, Mato Grosso do Sul. Esprito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, So Paulo.

Sul

Paran, Rio Grande do Sul, Santa Catarina.

Domnios Fitogeogrficos
Amaznia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlntica, Pampa, Pantanal

Gneros: 13 (3 so endmicos). Espcies: 73 (26 ocorrem

somente no Brasil).

Avanos

Extrao

Pre purificao

Identificao

Avancos

Cyclotides from Hybanthus calceolaria (L.) Schulze-Menz: Comparing of expression patterns in seeds, leaves and stem

Meri Emily Pinto Doutoranda

Vanderlan Bolzani Orientadora

Avanos
Prof. Christian W, Gruber Center for Physiology and Pharmacology Medical University of Vienna Bioactive peptides from natural sources.

Prof. David Craik Institute for Molecular Bioscince University of Queensland

Application of NMR spectroscopy in drug design and development.

Avanos
Prof. Christian W, Gruber Center for Physiology and Pharmacology Medical University of Vienna Bioactive peptides from natural sources.

Prof. David Craik Institute for Molecular Bioscince University of Queensland

Application of NMR spectroscopy in drug design and development.

10

Extrao
Especie 1. Viola subdimidiata A. St.-Hil. 2. Viola cerasifolia A. St.Hil. 3. Noisettia orchidiflora (Rudge) Ging. Codigo 1F 1G 1R 2F 2G 2R 3F 3G 3R 4F 4G 4R (A:B) 4RGr 4S 4Sf M. Partida (g) 70,3 85,2 59,3 62,7 71,3 53 75,8 57,3 43,5 10 E 10 E 45,6 22,5 1,68 E 2E

4. Hybanthus calceolaria (L.) Oken

11 Folha, galho, raiz, semente, fruto MeOH:H2O 60% Filtrao Resduo Fase Hidrometanlica

Extrao

CH2Cl2

Frao aquosa

Fase polar

Fase apolar

12

Extrao alternativa, screening.

Raiz MeOH:CH2Cl2 1:1 Filtrao Resduo

Fase diclorometanlica
MEOH ou H2O

Frao aquosa

Fase polar

Fase apolar

13

Pre purificao
Extrao em fase slida (SPE)

Amostra

Ativao/acon dicionamento

Adio de amostra

Lavado

Eluio do analito

14

15

CARTUCHO: Strata C18, 1g/6mL ACTIVADOR: MEOH ELUENTE: 20% sln B , 80% sln B, 100% sln B

Sln A: H2O miliQ , 0.1% cido trifluoroacetico (TFA) Sln B: Acetonitrila 90%, H2O miliQ , 10% , TFA 0.08%.

200 mL Amostra

2. MeOH 3. Sln A

Adio de amostra

20% sln B (12 mL)

6. 80% sln B 7. 100% sln B

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Identificao
Massa: 28-37 resduos de aminocido, 2500 e 4000 Da.

Apresentam ciclizao conhecida como cabeacauda

Ligao de Cisteina cclica ou Knof, Cyclic Cysteine

17

Identificao
Reduo
DTT

Alquilao Iodoacetamida
S

18

6 Cys

Ganho de 348 Da

58 Da

19

Reduo
0.5g frao 80% 0.1 M NH4HCO3

buffer (pH 8.2)

Incubar 20 / 30 min.

20 L + 2 L de10 mM Ditiotreitol

20

Acetilao
Frao Reducida 4 L de Iodoacetamida 100 mM

1L A. frmico conc. Parar a reao Incubar 20 / 10 min.

21

MALDI-TOF
Ionizao e dessoro a laser assistida por matriz (MALDI) (ingls:Matrix assisted laser desorption/ionization)

22

Universidade de So Paulo, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Departamento de Fsica e Qumica. Prof. Norberto Peporine Lopes.

23

Universidade de So Paulo, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Departamento de Fsica e Qumica. Prof. Norberto Peporine Lopes.

24

Universidade de So Paulo, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Departamento de Fsica e Qumica. Prof. Norberto Peporine Lopes.

25

Universidade de So Paulo, Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Departamento de Fsica e Qumica. Prof. Norberto Peporine Lopes.

26

Parmetros do experimento
Equipo Reflector mode MALDI-TOF/TOF 4AP17 Bruker Daltonics flexAnalysis Positive ion

Rango massas
Total shots Matriz

1500-4500 Da
2000 cido -ciano-4-hidroxicinamnico (5 mg/mL-1 em 50 % (v/v) acetonitrila.)

Amostra
Calibrante Laser energy

0.5L + 3L matriz
PeptideCalibStandard mono 1kV

27

Espectro MS (MALDI-TOF), folhas Viola subdimidiata -nativo-.

28

Fr 80% 1F NATIVA

Nativa (m/z) 3150.2 3182.2

Acetilada (M/z) 3498,4 3529,45

Diferencia de massa

348,2 348,2

3249,29
3346,34

3597,4
3694,4

348,2
348,1

Fr 80% 1F ACETILADA

29
Fr 80% 3F NATIVA

Fr 80% 3F ACETILADA

30

Analise da informao
Planilha em Excel Banco de dados CYBASE: http://www.cybase.org.au

31

Resultados preliminares
VIOLA SUBDIMIDIATA Picos positivos Folha 20 Base de datos cycloviolacin Y1, Hyfl M Hyfl E Vhr1, Vpl-1

Galho Raiz
N. Picos comunes

6 8
3

32

Resultados preliminares
VIOLA CERASIFOLIA Picos positivos Folha Galho 1 (8 Cys) 16 Cter J, Cter I Panitide L5, cycloviolacin O25 , Cter K, kalata B7, kalata B11 Vpl-1 Base de datos

Raiz N. Picos comunes

1 0

33

Resultados preliminares
NOISETTIA ORCHIDFLORA Picos positivos Folha Galho Raiz N. Picos comunes 0 5 0 0 Hyfl M Base de dados

34

Resultados preliminares
HYBANTHUS CALCEOLARIA Picos positivos Folha Galho Raiz A 16 7 12 Base de dados vibi E, kalata B5, kalata B3, viphi C, varv peptide B, cycloviolacin O1 Hyfl M

kalata B3 varv peptide B cycloviolacin O25

cycloviolacin O24 varv peptide B viphi C kalata B5

Raiz B

14

N. Picos comune

35

Perfil cromatogrfico Viola Subdimidiata

36

Perfil cromatogrfico Viola cerasifolia

37

Perfil cromatogrfico Noisettia Orchidflora

38

Perfil cromatogrfico Hybanthus calceolaria

39

Conclusiones
Os analises indicam a presena de ciclotdeos nas quatro espcies estudadas. E necessrio repetir os ensaios de reduo e acetilao na Viola cerasifolia e em Noissetia Orchidflora. Fazer uma melhora na adaptao dos mtodos de analises, por causa da possvel perdida de material. O mtodo de extrao hidrometanlica permite extrair uma mais quantidade de sustncias mas a diversidade menor em comparao com o mtodo MEOH:DCM

40

Perspectivas
Avaliar atividade: Trypanosoma cruzi contra Malaria, Leshmania,

Focalizar o trabalho ( Noisettia Orchid flora)

Sequenciar (estrutura secundaria)

Propor uma estrutura 3D.

41

Obrigada!!!!!