AULA 01 - Introdução

Ncleo de
Bioensaios, Biossntese
e Ecofisiologia de Produtos Naturais
MTODOS ANALTICOS EM
QUMICA ORGNICA II

- CROMATOGRAFIA -
Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro
Instituto de Qumica de Araraquara UNESP
Departamento de Qumica Orgnica
Introduo s principais
tcnicas cromatogrficas
utilizadas na anlise qualitativa
e/ou quantitativa de
substncias orgnicas em
mistura, com nfase em
cromatografia lquida (CL).
Objetivo
Metodologia
AULAS

Expositivas
Prticas

AVALIAES

(P) 2 Provas escritas (individuais) 45%
(S) 2 Seminrios (dupla) 30%
(R) Relatrios das prticas (dupla) 20%
(A) Avaliao de aproveitamento das aulas (individual) 5%
Mdia = 0,45P + 0,3S + 0,2R + 0,05A
INTRODUO CROMATOGRAFIA
1. Braithwaite, A. Chromatographic Methods, 4 ed. 1985.
2. Scott, R. P. W. Techiques and practice of chromatography. v. 70, 1995.
3. Miller, J. M. Chromatography, 1988.
4. Poole, C. F. and Poole, S. K. Chromatography today. 1991.
5. Sewell, P. A. Chromatographic separactions, 1987.
6. Collins, H. C. Introduo a mtodos cromatogrficos. Ed. Unicamp. 7 ed.
1995.

CLAE
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Glajch, J. L. Practical HPLC Method
Development. 2a. Ed. John Wiley. 1997.
Bibliografia
Fase Extratora
a + B
A + b
A + B
Mistura
Heterognea
F1
F2
Mistura
Homognea
(Amostra)
a + b
A + b
a + B
a + b
A + b
a + B
n etapas
[A]
F2

[A]
F1
K
A
=
[B]
F2

[B]
F1
K
B
=
Princpio Geral
Tcnica de anlise de substncias em
mistura, que envolve a distribuio diferencial
dessas substncias em um sistema
heterogneo bifsico.
SISTEMA CROMATOGRFICO:
Heterogneo e bifsico
Fase Mvel (FM) Fase Estacionria (FE) Configurao
gs (CG) slido ou lquido coluna
lquido (CL) slido ou lquido coluna/planar
Cromatografia
CC = cromatografia em coluna
CCD = cromatografia em camada delgada (planar)
Tcnica de anlise de substncias em
mistura, que envolve a distribuio diferencial
dessas substncias em um sistema
heterogneo bifsico.
Cromatografia Analtica:
Anlise qualitativa e/ou quantitativa de
substncias em mistura.
Cromatografia Preparativa:
Purificao de substncias em mistura.
Cromatografia
Fase Extratora
a + B
A + b
A + B
Mistura
Heterognea
F1
F2
Mistura
Homognea
(Amostra)
a + b
A + b
a + B
a + b
A + b
a + B
n etapas
[A]
F2

[A]
F1
K
A
=
[B]
F2

[B]
F1
K
B
=
Princpio Geral
Cromatografia
Processo dinmico em que a separao cromatogrfica obtida a partir
de interaes diferenciais entre os analitos componentes da mistura,
fase estacionria e fase mvel.
CC
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
CC
Cromatografia
Cromatograma
Registro grfico
do processo cromatogrfico

Resoluo (Rs)
2 1
1 2
) .( 2
w w
tr tr
Rs
+
=
CC
Cromatograma
t
0
= momento da aplicao da amostra na coluna
t
m
= tempo morto
tr = tempo de reteno
w = largura do pico
h = altura do pico
AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA AMOSTRA
Rf = d/D
1,00
0,00 (ORIGEM)
0,73
0,36
0,08
D d
10,0 cm
7,3 cm
3,6 cm
0,8 cm
Rf = fator de reteno
D = distncia percorrida pela FM
D = distncia percorrida pela mancha
Origem = ponto de aplicao da amostra
Cromatografia
Cromatografia em Camada Delgada
CCD ou TLC
Adsoro Absoro Permeao
(dissoluo)
Lquido/gs slido
Lquido slido
+
+
+
-
-
Lquido/gs lquido Lquido/gs gel/slido
INTERAES INTERMOLECULARES
Inicas
Ponte de Hidrognio
van der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
Debye (dipolo/dipolo induzido)
London (dipolo induzido/dipolo induzido)
Mecanismos
Antes 1965 - Colunas de vidro
Partculas > 100 m
Fase Normal (silica, alumina, etc.)
Amostras pouco polares
Fluxo induzido por gravidade
Tempo: horas - dias
Deteco: off-line (UV, pH, gravimetria, etc)
1965 a 1970 - Partculas 30-50 m
Bombas para impulsionar FM
Primeiros detetores on-line: I R, UV.
Depois 1975 - Fase Reversa (C18, C8, C2, etc.)
Compatibilidade com amostra biolgicas polares
Tempo: minutos
Depois 1980- Automao completa
CC - Instrumentao
Micheal S. Tswett (ou Tsvett)
Botnico Russo
Pai da cromatografia
1906 - _eo o|io
croma grafia
Separao de pigmentos vegetais
Kuhn, Wintertein e Lederer
1931 Reinveno da tcnica
Separao de carotenides e xantofilas
A. J. P. Martin
1944 Cromatografia em papel
Separao substncias polares, como
amino cidos, carboidratos e
pigmentos
PRIMEIRAS APLICAES:
ESTUDO DE METABLITOS VEGETAIS
J . Chem. Ed. 1967, 44, 238.
Cromatografia em Coluna Aberta
Algodo

Disco de
papel
filtro
Empacotamento:
- Suspenso
- Seco
Anlise das fraes:
- CCD
15 30 cm
60200 m
Cromatografia
SOLVENTES
BOMBA
INJETOR COLUNA
DETETOR COLETOR
DESCARTE
Cromatografo Lquido
CCD - Instrumentao
Simplicidade
Baixo custo
Suporte slido
Adsorvente (FE)
Espalhador
Cuba
Revelador
CCD - Instrumentao
At 31 canais diferentes (190-800 nm)
Cromatograma
t
0
= momento da aplicao da amostra na coluna
t
m
= tempo morto
tr = tempo de reteno
w = largura do pico
h = altura do pico
Fluxo (F): vazo da FM, geralmente em mL/min.

Tempo morto (t
m
): tempo necessrio para eluir uma substncia
que no interage com a FE.

Volume morto (V
m
): volume de FM necessrio para preencher
todos os interstcios e poros da FE, ou volume de FM necessrio
para eluir uma substncia que no interage com a FE.
t
m
= V
m
/F

Tempo de reteno (t
R
): tempo necessrio para eluir uma
substncia de um determinado sistema cromatogrfico.

Volume de reteno (V
R
): volume de FM necessrio para eluir
uma substncia de um determinado sistema cromatogrfico.
t
R
= V
R
/F
DEFINIES
Nomenclature for Chromatography. Pure & Appl. Chem. 65:819-872 (1993)
) (
) (
. 2
2 1
1 2
w w
tr tr
Rs
+
=
Resoluo (Rs)
Indica a qualidade da separao entre duas bandas cromatogrficas.
Para resoluo completa, Rs > 1,25
Mapa de Resoluo
Resoluo (Rs)
Fatores envolvidos na resoluo cromatogrfica:
2
2
1
2
. 54 , 5 ou . 16
|
|
.
|
\
|
=
|
.
|
\
|
=
w
tr
N
w
tr
N
N: Fator de eficincia
Relao entre tempo de permanncia do analito no
sistema e alargamento da banda cromatogrfica.
Quanto mais difcil a separao (a pequeno), maior
N necessrio.

k: Fator de capacidade ou de reteno
a razo da distribuio do analito entre FE/FM
Quanto maior, maior a afinidade do analito pela FE,
em relao FM.
tm
tm tr
k
n
n
k
FM
FE
= = ' ou '
1
2
'
'
k
k
= o
o: Fator de seletividade
a razo entre os fatores de reteno de dois
analitos.
Quanto maior, mais fcil a separao.
N: Fator de eficincia (Pratos Tericos)
Relao entre tempo de permanncia do analito no
sistema e alargamento da banda cromatogrfica.
Quanto mais difcil a separao (a pequeno), maior N
necessrio.
Ajustar atravs de:
comprimento da coluna ou placa
tamanho e forma da partcula
fluxo da FM
volume da amostra
quantidade de amostra
2
2
1
2
. 54 , 5
ou . 16
|
|
.
|
\
|
=
|
.
|
\
|
=
w
tr
N
w
tr
N
Resoluo (Rs)
k: Fator de capacidade ou de reteno
a razo da distribuio do analito entre FE/FM
Quanto maior k, maior a afinidade do analito
pela FE, em relao FM.

Ajustar atravs de:
fora de eluio da FM
polaridade da FE
tm
tm tr
k
n
n
k
FM
FE
= = ' ou '
Resoluo (Rs)
o: Fator de seletividade
a razo entre os fatores de reteno de dois analitos.
Quanto maior, mais fcil a separao.

Ajustar atravs de :
tipo de componente da FM
tipo de FE
1
2
'
'
k
k
= o
Resoluo (Rs)
) 1 ' (
'
.
) 1 (
.
4
2
2
+
=
k
k N
Rs
o
o
EFICINCIA
Depende da
configurao
do sistema
SELETIVIDADE RETENO
Dependem das caractersticas da
FM e FE do sistema
FATORES QUMICOS
FATORES FSICOS
Resoluo (Rs)
0 2 4 6 8 10
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
I
n
f
l
u
n
c
i
a

n
a

R
e
s
o
l u
o
n N
N Rs
0 2 4 6 8 10
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
(
o

-

1
/
o
)
o
o
o 1
Rs
0 2 4 6 8 10 12 14
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
K
' /
(
1
+
K
' )
K'
1 '
'
+
k
k
Rs
) 1 ' (
'
.
) 1 (
.
4
2
2
+
=
k
k N
Rs
o
o
k
(RETENO)
TEMPO
(SELETIVIDADE)
o
N
(EFICINCIA)
Resoluo (Rs)
Dificultar o espalhamento da banda
Aumentar a rea da FE
Diminuir volume da FM
N
Diminuir tamanho das partculas (mm)
Partculas esfricas
Aumentar comprimento da coluna (L)
Otimizar fluxo da FM
Otimizar temperatura
Otimizando a Resoluo
1. Eficincia (N) . 16
2
|
.
|
\
|
=
w
tr
N
Coluna, tubulao, injetor, detetor
2
= L h / o
C
B
A h + + =
A = Difuso de Eddy
B = Difuso molecular na FM
C = Efeitos da transferncia de massas
1. Eficincia (N)
Fatores que afetam o espalhamento da banda cromatogrfica.
h = N/L
h: altura de um prato terico
ou
d
L
N . 4 , 0
max
=
Comprimento grande causa espalhamento e anlise longa
Partcula muito pequena necessita presso muito alta
40 60
m
5 m
DIMETRO PARTCULA L=15cm L=25 cm
60 200 m (130 m) 460 770
40 - 60 m (50 m ) 1.200 2.000
20 m 3.000 5.000
10 m 6.000 10.000
5 m 12.000 20.000
3 m 20.000 33.300
1. Eficincia (N)
2
= L h / o
C
B
A h + + =
A = Difuso de Eddy
1. Eficincia (N)
h = N/L ou
2
= L h / o
C
B
A h + + =
A = Difuso de Eddy
1. Eficincia (N)
h = N/L ou
C
B
A h + + =
Equao de van Demmter
A = Difuso de Eddy
m
t
L
=
F
V
t
m
m
=
L
V
F
m
. =
1. Eficincia (N)
2. Reteno (k) e Seletividade (o)
Fatores que afetam a interao relativa entre analitos
e fase estacionria (FE) e fase mvel (FM).
Para otimizar esses fatores, preciso conhecer as caractersticas
dessas duas fases e a maneira como os analitos interagem com elas:

FASE ESTACIONRIA
FASE NORMAL
FASE REVERSA

FASE MVEL
SOLVENTES, caractersticas e compatibilidade
FORA DE ELUIO

2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN)
FE mais polar que FM.
Interaes ANALITO X FE e FM X FM
(em ordem decrescente de intensidade):
- Inica (indesejveis)
- Ponte de Hidrognio
- Van der Waals
Dipolo dipolo
Dipolo dipolo induzido
ADSORVENTES p/ FN (exemplos):
-Slica
-Alumina
-Poliamida
-Fases ligadas polares (CN, NH
2
, Diol)
Superfcie da
FE polar.
2.1 Cromatografia de Fase Normal (FN)
FE mais polar que FM.
ORDEM DE ELUIO (crescente)

APOLAR POLAR
SOLVENTES MAIS COMUNS:
- Hexanos (ter de petrleo pe 60-80
o
C)
- AcoEt ou acetona
- Et
2
O ou MTBE
- i-PrOH ou MeOH
- CHCl
3
ou CH
2
Cl
2
(DCM)
Superfcie da
FE polar.
Slica gel
Si O
O H
O
O H
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O H
C H
3
Si
O H
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
O
H
H
O
H
H
Mecanismo de adsoro:
-Si-OH: Interaes polares por ponte de
hidrognio, como doador ou aceptor de H.
-Si-OH e Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou
dipolo/dipolo induzido
Esfricas Irregulares
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
Slica gel
Si O
O H
O
O H
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O H
C H
3
Si
O H
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
O
H
H
O
H
H
Vantagens:
Elevada resistncia mecnica
Grande porosidade e rea superficial
Gel duro (intumescimento no varia
em funo do solvente).
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
PAREI AQUI
Slica gel
Si O
O H
O
O H
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O H
C H
3
Si
O H
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
O
H
H
O
H
H
Influncia do teor de gua da FM
sobre a eficincia (H) e reteno (k).
FE: Slica FM: DCM
Amostra: Fenilpropanol
Desvantagens:
Difcil controle da atividade de gua
Forte adsoro de substncias polares
Forte adsoro de substncias bsicas
Limite operacional de pH (2 a 8)
Stios com energia de adsoro
diferentes.
Alumina
Atividade: capacidade de adsoro em
funo do teor de gua adsorvida
Atividade, segundo escala
de Brockmann & Schadder

Ativ.
% de gua
Alumina Slica
I - -
II 3 10
III 6 12
IV 10 15
V 15 20
O Al
Al O
Cl Al C H
3
Cl
CH
3
Cl
CIDA
pH 4,0
O Al
Al O
ONa Al C H
3
ONa
CH
3
ONa
BSICA
pH 9,0
O Al
2+
Al O
Al C H
3
O
NEUTRA
pH 7,0
CLAE
CCD
Alumina
110
0
C 400
0
C
II ou III I
Alumina
O Al
Al O
Cl Al C H
3
Cl
CH
3
Cl
CIDA
pH 4,0
O Al
Al O
ONa Al C H
3
ONa
CH
3
ONa
BSICA
pH 9,0
O Al
2+
Al O
Al C H
3
O
NEUTRA
pH 7,0
Mecanismo de adsoro:
Al
3+
: campo positivo favorece interao
com molculas polarizveis
(p. ex. sistemas conjugados)
O
2-
: stios bsicos favorecem a interao
com doadores de H
+

Vantagens:
Elevada resistncia mecnica
Faixa operacional de pH maior (2 a 12)
Gel duro (intumescimento no varia em
funo do solvente).
Reteno menos pronunciada de
substncias bsicas.
Alumina
O Al
Al O
Cl Al C H
3
Cl
CH
3
Cl
CIDA
pH 4,0
O Al
Al O
ONa Al C H
3
ONa
CH
3
ONa
BSICA
pH 9,0
O Al
2+
Al O
Al C H
3
O
NEUTRA
pH 7,0
Desvantagens (em relao Slica):
Catalisa reaes (p. ex. aldlicas)
Partculas irregulares e maiores (+ N)
Menor reprodutibilidade
Reteno pronunciada de substncias
cidas (p. ex. c. carboxilicos).
Alumina
O Al
Al O
Cl Al C H
3
Cl
CH
3
Cl
CIDA
pH 4,0
O Al
Al O
ONa Al C H
3
ONa
CH
3
ONa
BSICA
pH 9,0
O Al
2+
Al O
Al C H
3
O
NEUTRA
pH 7,0
Aplicaes:
Anlises em condies mais bsicas
que as suportadas por slica (> 9);
Poliaromticos, alcalides, aminas e
vitaminas lipossolveis.
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
Fases Ligadas (BPC)
Si O
O H
O
O H
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O H
C H
3
Si
O H
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
O
H
H
O
H
H
Si R
C H
3
Cl CH
3
+
Slica
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
Fases Ligadas (BPC)
Si O
O H
O
O
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O
C H
3
Si
O H
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
Si
R
CH
3
H
3
C
Si
R
CH
3
H
3
C
SILANOL
RESIDUAL
S i O S i
S i O S i
S i O S i
S i O S i
S i O S i
N
S i O S i
N H
2
S i O S i
O H
O H
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
CN, Cianopropil
NH
2
,Propilamino
TMS, C-1
Diol
APOLARES
POLARES
Si CH
3
C H
3
Cl CH
3
+
Cloreto de
trimetilsilano
Fase ligada
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
Fases Ligadas (BPC)
S i O S i
S i O S i
S i O S i
S i O S i
S i O S i
N
S i O S i
N H
2
S i O S i
O H
O H
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
CN, Cianopropil
NH
2
,Propilamino
TMS, C-1
Diol
APOLARES
POLARES
Si O
O H
O
O
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O
C H
3
Si
O
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
Si
R
CH
3
H
3
C
Si
R
CH
3
H
3
C
Si C H
3
C H
3
C H
3
Fase ligada capeada
Fases Ligadas (BPC)
Si O
O H
O
O
Si
O
C H
3
Si O
C H
3
C H
3
Si
O
O
C H
3
Si
O
C H
3
C H
3
O H
Si H
3
Si
R
CH
3
H
3
C
Si
R
CH
3
H
3
C
Si C H
3
C H
3
C H
3
Fase ligada capeada
Vantagens:
- Equilbrio mais rpido
- Menor adsoro irreversvel
- gua no influi na reprodutibilidade
- Stios de adsoro mais homogneos
- Eluio em gradiente facilitada
Dimetro: 3 a 200 m
Poro: 60 a 120
Partculas
Fases Ligadas (BPC)
CH
3
C H
3
CH
3
TOLUENO
NAFTALENO
BIFENILA
ACENAFTENO
2,3-DIMETILNAFTALENO
COLUNA 100 x 8 mm
Fluxo: 2,0 mL/min
Detetor UV 254 nm
C18 10% carbono
Esfrica 5 m
No capeada
C18 7% carbono
Esfrica 5 m
Capeada
C18 10% carbono
Irregular 10 m
No capeada
C8
5% carbono

CN
2% carbono

Fenil
5% carbono

Para amostra APOLAR
+ Polaridade da FE, + reteno dos analitos
FM: ACN/gua 70:30
Fases Ligadas Polares - FN
- Inica (indesejveis)
- Ponte de Hidrognio
- Van der Waals
Dipolo dipolo

APOLAR POLAR
-Hexanos
(ter de petrleo pe 60-80
o
C)
- AcoEt ou acetona
- Et
2
O ou MTBE
- i-PrOH ou MeOH
- CHCl
3
ou CH
2
Cl
2
(DCM)
S i O S i N
S i O S i
N H
2
S i O S i
O H
O H
CN, Cianopropil
NH
2
, Propilamino
Diol
Fase Ligada Amino (NH
2
)
AMOSTRA: ESTERIDES
O
O
CH
3
CH
3
OH
1. Desoxicorticosterona
O
O
OH
CH
3
CH
3
OH
2. Desoxicortisona
O
O
CH
3
O H
CH
3
OH
3. Corticosterona
O
O
O
OH
CH
3
CH
3
OH
4. Cortisona
O
O
OH
CH
3
O H
CH
3
OH
5. Hidrocortisona
O
O
O
OH
CH
3
CH
3
OH
6. Prednisona
FM quaternria
MTBE 40%
DCM 15%
CHCL
3
42%
MeOH 3%
COLUNA: Zorbax-NH
2
10 m
250 x 4,6 mm
Fluxo 3,0 mL/min
Detetor UV 254 nm
1
2 3
6
4
5
Fase Ligada Amino (NH
2
)
Aplicao: anlise de monossacardeos FASE NORMAL
Coluna: Hypersil 5 APS
100 x 3,0 mm
FM: ACN/gua 80:20
Fluxo: 0,5 mL/min
Detector: RI
O
OH OH
OH OH
CH
3
O
OH OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O H
O
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH OH
OH
O H
OH
O H
O
O
O
OH OH
OH OH
OH
OH
O H O H
O
O
O
OH OH
OH OH
OH OH
O H O H
H
H
1. Raminose 2. Ribose 3. Xilose
4. Arabinose 5. Frutose
6. Glicose 7. Sacarose
8. Maltose 9. Lactose
Aplicao: anlise de monossacardeos FASE NORMAL

Amostra: suco de frutas (tomate, uva, framboesa, etc)
O
OH
OH
OH
OH
1. Xilose
O
OH
OH
OH
OH
O H
2. Frutose
O
OH
OH
OH
OH
OH
3. Glicose
O
O
O
OH
OH
OH OH
OH
O H
OH
O H
4. Sacarose
O
O
O
OH OH
OH OH
OH
OH
O H O H
5. Maltose
Coluna: Hypersil 5 APS
100 x 3,0 mm
FM: ACN/gua 80:20
Fluxo: 0,5 mL/min
Detector: RI
2.2 Cromatografia de Fase Reversa (FR)
FE menos polar que FM.
Superfcie da
FE apolar.
C H
3
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
CH
3
C H
3
O H
C H
3
OH
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
ADSORVENTES p/ FR (exemplos):
S i O S i
S i O S i
S i O S i
S i O S i
ODS, RP-18, C-18
RP-8, C-8
Fenil
TMS, C-1
- gua
- Acetonitrila (ACN)
- MeOH
- Tetraidrofurano (THF)

POLAR APOLAR
Superfcie da
FE apolar.
C H
3
Si
O
Si
O
Si
O
Si
O
CH
3
C H
3
O H
C H
3
OH
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Van der Waals
Dipolo dipolo
Dipolo induzido dipolo induzido
Interaes residuais: pte. H
Vantagens:
- Equilbrio mais rpido
- Menor adsoro irreversvel
- gua no influi na reprodutibilidade
- Stios de adsoro mais homogneos
- Eluio em gradiente facilitada
Coluna Fase Reversa C18:
Aplicao quase universal
(~ 70% das aplicaes na literatura)
Permite anlise desde substncias hidrossolveis
e/ou inicas at substncias lipoflicas (NARP).
Supresso da Ionizao
Coluna: BONDAPAK C18
30 cm X 3,9 mm
FM: gua, com 5% HOAc
Deteco: UV 254nm
Tempo: 30 min.
R-COOH R-COO
-
+ H
+
pKa 4-5
u-OH u-O
-
+ H
+
pKa 10-12
OH O
OH
OH
OH O
OH
O HO
OH
OH
O OH
O OH
OH
O OH
OH
OH
O OH
O
OH
HO
OH
OH
OH
1. cido glico
2. c. protocatecuico
3. c. p-OH-benzico
6. c. saliclico
5. c. cafeico 7. c. p-coumrico
8. c. o-coumrico
9. c. ferlico
10. c. cinmico
O OH
OH
OMe
4. d-Catequina Amostra: cidos Carboxlicos Fenlicos
O
N
C H
3
CH
3
N
NH
C H
3
N
C H
3
CH
3
CH
4
N
N
C H
3
CH
3
CH
3
1 2
3 4
Coluna: Zorbax ODS 5m, 150 x 0,46 mm
FM: ACN/Tampo 30:70 + 0,2% TEA e 0,2% TFA
Tampo Fosfato 25 mM pH 2,5
Fluxo: 1,0 mL/min Detector: UV
C18
Aplicao: antidepressivos tricclicos FASE REVERSA
C18
Coluna: Inertisil ODS 250 x 4,6 mm
FM: MeOH a 1,0 mL/min
Detector: UV (
e
: 295 nm)
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
3. o-tocoferol (vitamina E)
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
2. |-tocoferol
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
1. o-tocoferol
O
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
C H
3
O
4. Vitamina E - acetato
Aplicao: anlise de tocoferis FASE REVERSA
Coluna: Inertisil 5 Si 150 x 4,6 mm
FM: EtOH 0,3% em n-Hexano
Fluxo: 1,0 mL/min
Detector: FLU
(
ex
: 300 nm;
em
:330 nm)
Aplicao: anlise de tocoferis em margarina FASE NORMAL
Slica gel
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
O
CH
3
CH
3
CH
3
O H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
C H
3
1. o-tocoferol (vitamina E)
2. |-tocoferol
3. -tocoferol
4. o-tocoferol
AMOSTRA
Sol. em gua
Insol. em gua
Inica ou
Ionizvel
No-inica
PM =
Sol. em
solv. orgnico
PM =
APOLAR*
POLAR**
FASE
NORMAL
FASE
REVERSA
GPC
Inica ou
Ionizvel
No-inica
GPC
FASE
REVERSA
ON-PAR ou
TROCA INICA
ON-PAR ou
TROCA INICA
FASE
REVERSA
SUPRESSO
SUPRESSO
FASE
NORMAL
Sephadex
C1
8
C8
C18
C8
CN
Si
CN
NH
2

C1
8
C8
C18
C8
CN
Si
CN
NH
2

C1
8
C8
Sephadex - LH20
CHAVE PARA ESCOLHA
DO ADSORVENTE (FE)
* Hexano, CHCl
3

** AcOEt, MeOH
+ Substncias com grupos funcionais diferentes
Valor de o maior em Slica do que em C18
Valor de o menos distinto entre fases ligadas FN e FR

+ Homlogos ou substncias que diferem no n
o
. de carbonos
Valor de o maior em FR

+ Ismeros
Valor de o maior em FN
2.2 Fase Normal (FN) X Fase Reversa (FR)
Cromatografia em Fase Normal
VANTAGENS DESVANTAGENS
1. Permite grandes variaes na seletividade atravs
da variao da composio da FM
.
1. Amostras inicas so mais facilmente separadas
por RPC.
2. Colunas so muito estveis em FM no aquosa 2. Controle da fora de eluio da FM mais difcil
do que em RPC
.
3. Muitas substncias orgnicas so mais solveis
nos solventes de NPC (vantagem em Crom. Prep.)
3. Menor p. e. dos solventes usados na FM causam
formao de bolhas.
4. Presso necessria menor devido menor
viscosidade dos solventes.
4. Reteno pode variar em funo de gua
adsorvida pela FE.
5. til para anlise de amostras que podem
decompor em solues aquosas.
5. Eluio em gradiente limitada pelo demixing
da FM e pela adsoro de gua.
6. Adsorventes mais baratos. 6. Solventes mais caros. Descarte mais caro.
Ncleo de
MTODOS ANALTICOS EM
QUMICA ORGNICA II

- CROMATOGRAFIA -
Prof. Dr. Alberto J. Cavalheiro
Ms. Tamara R. Calvo
Instituto de Qumica de Araraquara UNESP
Departamento de Qumica Orgnica
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
O
N O
O
O
O
O
O
CH
3
C H
3
CH
3
C H
3
H
H
2
N
O
O
O
O
CH
3
C H
3
C H
3
C H
3
3
N
N
N
N
O
O
CH
3
C H
3
CH
3
4
O
N
O O
CH
3
CH
3
H
C H
3
O 5
O
N
O O
O O
CH
3
CH
3 C H
3
6
O
N
OH O H
CH
3
H
7
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
Ncleo de
EXPLICAR MELHOR FR E FN
AMPLIAR OS TIPOS DE COLUNAS
EXPLICAR MELHOR MECANISMO DE RETENAO NOS VARIOS TIPOS DE FE

AULA 01 - Introdução

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