Bibliografia Marcadores

Moleculares
Killops, S, Killops, V. 2005. Introduction
to organic geochemistry 2
nd
Edition
Chapter 5 Chemical stratigraphic
concepts and tools p 166-245 Blackwell
U.K
Poynter, J, Eglington, G 1991 The
biomarker concept-strenghts and
weaknesses . Fresenius J Anal. Chem
339:725-731
Bibliografia
Brocks J.J, Summons, R.E 2005
Sedimentary hydrocarbons, biomarkers
for early life Chapter 8.03 p 64-114 IN
Vol 8 Biogeochemisrty - Treatise on
Geochemistry. Elsevier 701p

Geoqumica orgnica
Bsicamente o estudo das
reaes e processos que ocorrem
com as molculas orgnicas no no
Sistema Terra.
Os processos so tanto mediados
biolgicamente ou ainda controlados pelas
variveis simples como a Temperatura e
Presso, no caso dos orgnicos ocludos no
interior da Terra.
Vida , molculas e registros
geolgicos
A vida deixa tanto registros fsicos visveis a
olho n( esqueletos, carapaas), ou ao
microscpio(microalgas) ou ainda molculas
orgnicas fsseis no registro sedimentar.
Os fsseis quimicos* ou marcadores
moleculares, podem dar indicaes precisas
da sua origem biolgica inicial a partir da
sua composio isotpica e da estrutura
molecular.Podem ainda estimar as condies
ambientais reinantes no passado geolgico.

Marcadores Moleculares Orgnicos
So molculas orgnicas encontradas em
sedimentos,rochas, betume ou petrleo que
no sofreram alteraes significativas na sua
estrutura bsica original que apresentavam
nos organismos vivos.
Em outras palavras a assinatura qumica
original preservada apesar dos processos
biolgicos ou geoqumicos a que foram
submetidas.
Marcadores Moleculares- Histrico

O primeiro relato de um marcador
molecular de 1934 quando Treibs
isolou molculas de porfirinas tanto do
petrleo como de sedimentos marinhos
antigos e associou os fatos. A origem
das porfirinas de ambas matrizes a
mesma : a molcula original da
clorofila.
Papel biolgico porfirinas
O ncleo bsico da porfirina, que um anel
plano com 12 tomos de C e 4 de N no
centro, a base da construo de vrios
pigmentos de grande importncia bioqumica.
No caso da clorofila o Mg o metal
complexado no centro do anel. Na hemina, o
pigmento do nosso sangue e bile, o Fe o
tomo complexado no anel porfirnico.
As cadeias laterais esterificadas podem ser
lcoois de cadeia longa como o fitol no caso
da clorofila.
Esta descoberta levou Treibs acertadamente
a propor a origem biolgica para o petrleo e
que os compostos precursores do petrleo
no poderiam ter sido submetidos a
temperaturas muito altas, pois seno as
porfirinas teriam sido completamente
destrudas.
Isto significa que algumas molculas
orgnicas complexas podem sobreviver
milhes de anos dentro de rochas ou
sedimentos.
Marcadores Orgnicos em
Geoqumica: fsseis qumicos
Devido a eficincia da remineralizao
da matria orgnica ,poucas molculas
conservam sua estrutura inteira intacta
ou mesmo seu esqueleto carbnico
original. Assim compostos orgnicos que
resistem a destruio parcial das suas
estruturas originais pelo processos
biogeoqumicos foram chamados de
Fsseis Quimicos por Eglinton(1967).

Aps o trabalho pioneiro de Treibs com as
porfirinas , a identificao de novos
marcadores na dcada de 60 foi possvel
graas cromatografia em fase gasosa. Esta
tcnica permite a separao de misturas
complexas de compostos orgnicos em
matrizes naturais.
O acoplamento da cromatografia de gs
espectrometria de massa nos anos 70,
facilitou mais ainda identificao de inmeros
novos marcadores moleculares.

CROMATOGRAFIA
Cromatografia
Mtodos de resoluo de
substncias em uma mistura
Separao cromatogrfica
Fase mvel
Fase estacionria
Gas Chromatograph
Data System
or Recorder
Carrier Gas
Supply
Oven
Capillary Column
Injection Port
Detector
0
40
80
120
160
200
240
0 10 20 30 40 50 60
Time (min)
T
e
m
p

(
d
e
g

C
)
(c.1)
(a) (b)
(c.2)
detetores
Cromatgrafo
A
B
C
D
E
Sample: mixture of
volatile liquids (~1L)
Gas Chromatography
Gas Chromatogram
0 5 10 15 20
Time (minutes)
A
b
u
n
d
a
n
c
e

A
B
C
D
E


Gas
Chromatograph


Cromatografia com DIC ou com
Espectroscopia de Massa
No caso de detectores como o de ionizao
de chama a identificao feita com base no
tempo de reteno do pico , comparado com
o de padres comerciais ou sintetizados no
prprio laboratrio. Assim precisamos de um
nmero enorme de padres que so de alto
custo ou investir tempo nas snteses
J com acoplamento CG-EM a identificao
feita pela razo massa/ carga do on
comparada com as M/z s de uma biblioteca
de espectros.
Ion
Source
Mass
Analyzer
Ion
Detector
Inlet
Data
System
Vacuum
Pumps
Sample
Introduction
Data
Output
Mass Spectrometer
~70 Volts
+
_
+
_
e
-
e
-
e
-

+
+ + +
+
+
_
Electron Collector (Trap)
Repeller
Extraction
Plate
Filament
to
Analyzer
Inlet
Electrons
Neutral
Molecules
Positive
Ions
Electron Impact
Ionization Source
ion trajectory
not in register
(too heavy)
Ion
Source
Detector
ion trajectory
not in register
(too light)
ion trajectory
in register
S
N
Magnetic Sector Mass Analyzer
Electromagnet
Detector
Ion
Source
+
_
_
DC and AC
Voltages
Quadrupole Ion Filter
resonant ion
non-resonant ion
+
Ion
Source
Mass
Analyzer
Ion
Detector
Inlet
Data
System
Vacuum
Pumps
Sample
Introduction
Data
Output
Mass Spectrometer
194
67
109
55
82
42
165 136
94
40 60 80 100 120 140 160 180 200
Mass (amu)
Mass Spectrum
N
C
C
N
H
C
O
C
O
N
N
C H
C
3
H
C
3
H
Mass
Spectrometer
Mass Spectrometry
Typical sample: isolated
compound (~1 nanogram)
Uso de marcadores moleculares
como traadores de origem
Em 1967 Eglington passou a usar
hidrocarbonetos encontrados em sedimentos
marinhos ou organismos como traadores de
origem do material
Uma das primeiras aplicaes foi no estudo
da contaminao por petrleo de organismos
e sedimentos. Pela distribuio dos alcanos
(parafinas) possvel determinar a origem
destes compostos.
Hidrocarbonetos como traadores
Hidrocarbonetos biognicos ou seja os
naturais, apresentam predominnica
de parafinas com nmero par de
tomos de carbonos no seu esqueleto.
J os hidrocarbonetos de petrleo, ou
seja de origem antropognica,
apresentam uma distribuio equitativa
de hidrocarbonetos de nmero par e
impar de carbonos.
FID1 A, (TEBAGO08\SEDTEB5.D)

C
1
2

C
1
3

T
e
t
r
a
d
e
c
e
n
o

C
1
4

C
1
5

H
e
x
a
d
e
c
e
n
o

C
1
6

C
1
7

P
r
i
s
t
a
n
o

C
1
8

F
i
t
a
n
o

C
1
9

E
i
c
o
s
e
n
o

C
2
0

C
2
1

C
2
2

C
2
3

C
2
4

C
2
5

C
2
6

C
2
7

C
2
8

C
2
9

C
3
0

C
3
1

C
3
2

C
3
3

C
3
4

C
3
5
Amostra de sedimento com n-alcanos naturais
FID1 A, (RLAMAH09\CURVTHP1.D)

C
1
2

C
1
3

C
1
4

C
1
5

H
e
x
a
d
e
c
e
n
o

C
1
6

C
1
7

P
r
i
s
t
a
n
o

C
1
8

F
i
t
a
n
o

C
1
9

E
i
c
o
s
e
n
o

C
2
0

C
2
1

C
2
2

C
2
3

C
2
4

C
2
5

C
2
6

C
2
7

C
2
8

C
2
9

C
3
0

C
3
1

C
3
2

Amostra de petrleo da Baa de Todos os Santos
Cromatograma de uma amostra de sedimento com UCM
A anlise dos hidrocarbonetos polinucleares
aromticos(HPAs) de uma amostra ambiental
tambm auxilia na identificao da sua
origem . Pela distribuio relativa dos HPAs
no alquilados e alquilados no cromatograma
ou no EM d para saber se estes compostos
vieram da combusto de biomassa, carvo
ou de derivados do petrleo.
O Laboratrio de Qumica Orgnica Marinha
do IOUSP utiliza em rotina os marcadores
moleculares como traadores de origem.
Razes isotpicas acoplada a CG-
MS
Com o acoplamento da cromatografia
de gs simultaneamente a
determinao das razes isotpicas
numa s injeo, como o caso do
equipamento IRCGMS que foi mostrado
a vocs no laboratrio da Geoqumica
Marinha, fica ainda mais facilitada a
identificao da origem do material se
marinho ou terrestre ou mista.

Definio atual de Marcador
Molecular
Uma molcula orgnica cujo esqueleto
carbnico pode ser ligado inequivocamente
um precursor biolgico definido

Algumas molculas smente so produzidas
por certas espcies ou classes de organismos
, assim sendo sua ocorrncia pode ser
associada a existncia prvia destes
organismos naquele ambiente.

reas de aplicao dos
marcadores moleculares
Explorao de petrleo e gs
Paleoceanografia
Explorao da biosfera, origem da
vida
Arqueologia
Estudos microbiolgicos
Exobiologia
Requisitos para uso de
marcadores moleculares
Os compostos devem ser possveis de
serem determinados quantitativamente
em matrizes naturais complexas
fornecendo:
-Identificao das estruturas moleculares
-Composio isotpica
-Origem biolgica claramente associada
a um grupo de organismos.
Requisitos para marcadores
moleculares
Isso implica num o esqueleto carbnico bem
definido e com caractersticas prprias devido
a especificidade do processo biossnttico.
Blocos de Construo bem definidos
Exemplo sequncia isoprnica C=C-C=C
C
Isopreno elemento bsico de construo de
vrios compostos com 10,15 ou 20 Cs.So os
terpenos( do Grego terebinthos, Portugues.
terebentina). No ambiente marinho o
esqualeno um exemplo de terpenide
sendo o precursor do colesterol.
Diterpenos importantes na ambiente
marinho
Phytol derivado da clorofila


Paleo-oceanografia Clssica
Antes do uso generalizado de marcadores
moleculares a forma clssica de avaliar a
contribuio sedimentar para os ambientes
atuais, era o estudo dos fsseis marinhos,
visveis pela microscopia como restos de
esqueletos calcreos ou silicosos.
Posteriormente passou-se a usar as razes
isotpicas de C 13, N15 e O16 eO18 nestas
carapaas.
Estratigrafia qumica
Qumiotaxonomia Paleoceanografia
O exemplo clssico so os esqueletos
de foraminferos marinhos.
Ocorre que nem sempre os sedimentos
mais antigos preservaram estes restos
de organismos.
Em contraste os lipdeos so bem
preservados fazendo parte da
constituio bioqumica original do
Requisitos de Biomarcadores
organismo. Os hidrocarbonetos em
geral, cidos graxos e alcoos
superiores so bem preservados
nos sedimentos marinhos e nas
rochas geradoras de leo. Deste
modo na prtica so os marcadores
moleculares mais utilizados em
rotina.
Caractersticas dos Biomarcadores
.Mas isto no significa que qualquer
lipdeo ou hidrocarboneto sirva como
marcador ideal. O marcador no precisa
conservar todos seus grupos funcionais
originais como COOH, OH, NH2, etc
durante os processos de diagenese,
metagenese mas precisa conservar seu
esqueleto principal.
Alteraes da estrutura original dos
marcadores moleculares
Durante a diagnese nos sedimentos os
marcadores sofrem as mesmas reaes
que os outros orgnicos do sedimento:
Perda dos grupos funcionais
Aromatizao( perda de Hs)
Isomerizao
A diferena que o esqueleto
carbnico bsico conservado
Paleo-oceanografia Clssica
Tradicionalmente a relao O18:O16 do
restos de fsseis de invertebrados marinhos
( testas carbonceas), encontrados no
sedimentos tem sido usada na determino
das paleotemperaturas dos oceanos, mas a
extenso das glaciaes, o balano da
evaporao e precipitao, a profundidade.
de compensao do carbonato e a diagnese
afetam a exatido destas determinaes
Marcadores moleculares e a
paleotemperatura dos oceanos
Tradicionalmente os marcadores
moleculares so muito utilizados pela
industria de petrleo para caracterizar
os diversos tipos de leo e sua
maturidade. Uma nova e fascinante
aplicao dos marcadores moleculares
nos estudos da paleotemperatura dos
oceanos
Uso das alquenonas
Uma alternativa ao uso das testas
de fossis e a relao O16/O18
usar um marcador molecular. As
alquenonas so cetonas
insaturadas de cadeia longa, C37-
C39, presentes em algas halofitas,
como a Emiliana huxleyi.
Emiliana huxleyi
Esta alga ubqua em todos oceanos e
suas assinaturas moleculares esto
presentes em praticamente todos
sedimentos marinhos e lacustres,
registrando assim as variaes dos
blooms de fitoplncton que ocorreram
no passado geolgico.

Ocorrncia das alquenonas

A maior fonte das alquenonas o coclitoforito
Emiliana Huxley Estudos com culturas destas algas
mostraram que o nmero de duplas ligaes era
funo da temperatura de cultivo.
O grau de insaturao, isto o, nmero de duplas
ligaes entre os Cs , das alquenonas encontradas
nos sedimentos, esta associada as quedas de
temperatura ocorridas nos oceanos no passado.
Aumentando as duplas ligaes diminui o ponto de
fuso destes lipdeos permitindo a sobrevivncia
desta alga em temperaturas mais baixas.
Isto porque so os lipdeos que
garantem a fluidez celular. As
alquenonas resistem bem aos processos
diagenticos, sendo os lipideos mais
estveis que conhecemos;
Para calibrao do mtodo usada a
relao das alquenonas C 37:2 e C
37:3. Esta notao refere-se a posio
das duplas ligaes
Aplicaes dos marcadores
moleculares no Atlntico Sul
Tese de Livre Docncia da Prof.a Mrcia
Caruso Bcego em 2007 IOUSP
Reconstruo paleoceanogrfica dos
ltimos 7500 anos na plataforma
continental do Atlntico Sudoeste
baseada em marcadores geoqumicos
orgnicos
Tese de Doutorado de Rafael Loureno
2007 IOUSP
Aplicao de marcadores orgnicos
moleculares em estudos oceanogrficos
e paleoceanogrficos: Estudo de caso
na Margem Continental Superior do
Sudeste do Brasil 142p

Em ambos trabalhos foram usados os
hidrocarbonetos, alquenonas, esteris,
cidos graxos e lcoois superiores como
marcadores moleculares nos
testemunhos de sedimentos. Foi
possvel inferir claramente mudanas de
temperatura e de produo primria no
perodo de alguns milhares de anos
com estes marcadores.
Lipdeos como Marcadores:
Metodologia Analtica
Os lipdeos na coluna de gua,
sedimentos ou organismos esto na
forma livre ou qumicamente ligados.
Dependendo do tipo de estudo
necessria um extrao diferenciada
dos dois da matriz original.
A extrao simples com um nico
solvente remove os lipdeos livres. *
Definio de Lipdeos
* Lipdeos so todas substncias produzidas
por organismos, que so praticamente
insolveis em gua, mas facilmente solveis
em em solventes de gorduras tais como
clorofrmio, tetracloreto de carbono, teres,
hidrocarbonetos aliftico e aromticos e
acetona apud Bergmann, 1963
A definio OPERACIONAL no definindo
classe pelos grupos funcionais
Lpideos saponificveis e
insaponificveis
Os cidos Graxos e seus steres (Gorduras)
so solubilizados pela saponificao em meio
alcalino forte.
J Alcoois, Esterodes e hidrocarbonetos no
so afetados pelos alcalis
J na extrao da matriz original(sed/org)
podemos usar esta diferena para uma
separao prvia por tipos .


Lipdeos Polares e Apolares
Apolares ou neutros:Cras, steres
de cidos carboxlicos(
gorduras),esteris hidrocarbonetos.
Polares: Principalmente
fosfolipdeos mas tambm inclui as
lipoprotenas, carotenides,
pigmentos da clorofila.

Papel Biolgico dos Lipideos
Neutros e Polares

Os polares constituem os principais
componentes das membranas celulares dos
seres vivos, servindo ainda de agentes de
transmisso e recepo nervosa.
Os neutros tem como funo principal
estocar energia nos organimos.
Os lipdeos esto entre os compostos
orgnicos mais abundantes dos organismos.
Estruturas qumicas do lpideos
usados como marcadores
Extremamente diversificadas
Hidrocarbonetos simples
cidos graxos livres
lcoois superiores
Terpenides
Esteris
Hopanos
Etapas do procedimento analtico
Extrao
Purificao dos extratos Clean Up
Derivatizao(Opcional).
Analise final por cromatografia de
gs com Detector de Ionizao de
Chama ou acoplada a
Espectrometria de Massas
Extrao
Clean up
Cromatografia
Lipdeos predominantes em
matrizes biolgicas
So os hidrocarbonetos e cidos graxos
No Fito e Zooplncton marinhos:
cido Graxo predominante o n-C16
Hidrocarbonetos: n-C17 e n-C18
Nas Plantas Terrestres Superiores temos
cidos graxos pares de maior PM como n-
C28, C30 e C32. J nas cras cuticulares
hidrocarbonetos mpares n- C27, C29 e C31
Unidades bsicas de esqueletos de C
dos lpideos marcadores
Os lipdeos marcadores apresentam
dois tipos principais de cadeias
C
Poli-isoprenos (C=C-C-C) n

Poliquetdeos
Lipdeo de plantas terrestres