Coleta de Dados de Difração de

Monocristais
Coleta de Dados de Difração de
Monocristais Protéicos
• Grande referência:
- http://mcl1.ncifcrf.gov/dauter_pubs/199.pdf
– Zbigniew Dauter, Data-collection strategies,
Acta Cryst., D55, 1703-1717, (1999).
– http://eagle.mmid.med.ualberta.ca/tutorials/data
_collection/oscillation.html

1
• As características dos Cristais de
Proteínas são:
– Celas unitárias muito grandes
– Cristais pequenos
– Degeneração dos cristais por radiação
– Desordem intrínseca
que resultam em ...
– Grande quantidade de dados (104 – 106)
– Possível superposição de reflexões
– Fraca intensidade de difração

2
 Conceitos de completeza e
multiplicidade
• Completeza: qual a porcentagem do espaço
recíproco que foi efetivamente medida?
• Multiplicidade: quantas vezes uma
reflexão (ou sua equivalente) foi medida?
• Ver saída do XDS: como é calculada a
completeza? E a multiplicidade?
• Quanto maior (ambas), melhor!

3
 Saída XDS:
SUBSET OF INTENSITY DATA WITH SIGNAL/NOISE >= -3.0 AS FUNCTION OF RESOLUTION
RESOLUTION NUMBER OF REFLECTIONS COMPLETENESS R-FACTOR R-FACTOR COMPARED I/SIGMA R-meas Rmrgd-F Anomal SigAno Nano
LIMIT OBSERVED UNIQUE POSSIBLE OF DATA observed expected Corr

6.41 19079 2508 2570 97.6% 1.9% 1.9% 19079 75.45 2.1% 1.6% 3% 0.846 1737
5.09 18795 2373 2393 99.2% 3.6% 3.4% 18795 54.76 3.9% 2.3% -3% 0.825 1874
4.44 18105 2370 2398 98.8% 3.1% 2.9% 18105 63.92 3.3% 1.8% -2% 0.836 1899
4.04 17310 2292 2306 99.4% 3.9% 3.6% 17310 54.59 4.1% 2.1% 1% 0.844 1870
3.75 17313 2323 2341 99.2% 4.6% 4.4% 17313 47.45 5.0% 2.6% 0% 0.829 1893
3.53 16795 2306 2319 99.4% 5.0% 4.8% 16795 41.78 5.4% 2.8% 2% 0.827 1876
3.35 17061 2338 2355 99.3% 6.4% 6.1% 17061 33.71 6.9% 3.6% 1% 0.838 1910
3.21 16201 2201 2210 99.6% 8.1% 7.6% 16201 26.96 8.7% 4.6% 1% 0.833 1820
3.08 17548 2409 2425 99.3% 9.9% 9.4% 17548 22.38 10.6% 5.8% 2% 0.842 1998
2.98 15670 2144 2151 99.7% 12.2% 11.5% 15670 18.60 13.1% 6.6% 3% 0.842 1785
2.88 17911 2462 2480 99.3% 13.0% 12.4% 17911 17.14 14.0% 7.2% 0% 0.829 2038
2.80 15055 2166 2209 98.1% 15.1% 14.4% 15055 14.31 16.3% 9.0% 2% 0.839 1710
total 206843 27892 28157 99.1% 5.3% 5.0% 206843 39.71 5.6% 3.6% 1% 0.836 22410

Pegar outras tabelas, mais tipicas

4
• 0a) O que é completeza?
• 0b) O que é multiplicidade?
• 0c) Qual deve ser sacrificado: completeza
ou multiplicidade, se não é possível obter
tudo?
• 0d) O que são reflexões únicas?

5
 Coleta de Dados de Difração
Monocromática
• Experimento: Método de Rotação/Oscilação
– Montagem em capilar ou loop para crio-cristalografia
– Determinação dos parâmetros de coleta de dados
(ângulo e rotação, distância cristal-detector, tempo de
exposição)
• Processamento de dados
– Parâmetros de cela, indexação e orientação
– Integração das imagens
– Estimativa da intensidade e escalonamento

6
• 0) Por que falamos coleta de dados
monocromática?
• 00) Em que circunstâncias faríamos uma
coleta de dados policromática? Pode esta
ser realizada numa fonte caseira?

7
 Montagens
• Em capilar
• Em loop, para criocristalografia.

8
Montagem de cristal em capilar

9
Algumas outras ferramentas

10
Montagem de cristal em loop (p/ criocristalografia)

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13
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Cryocrystallography

15
• 1) Quais as vantagens de coleta de dados de
difração no chamado "crio"? Quais as
potenciais desvantagens?
• 2) No que consiste o processo de annealing
de um cristal resfriado?

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 Fontes de Raios X
• Home (caseira)
• Synchrotron (Síncrotron)

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Caseira (no lab)

Fontes convencionais: tubos de raios-X selados e ânodo rotatório

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Geração de radiação síncrotron

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Radiação Síncrotron
Maior intensidade
Menor divergência (vertical)
Maior brilho e brilhança
Policromático (ou a escolher)
Pulsado (estrutura temporal)

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• 3) Quais as vontagens de uma fonte de
radiação Síncrotron?
• 4) Quais as vantagens de uma fonte de
radiação caseira?
• 5) Por que a radiação gerada num
difratômetro caseiro é nomalmente
chamada radiação de cobre?
• 6) Por que um alvo de Mo pode ser usado
para monocristais de moléculas pequenas
mas é desaconselhável para proteínas?
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• 3) Quais as vontagens de uma fonte de
radiação Síncrotron?
• 4) Quais as vantagens de uma fonte de
radiação caseira?
• 5) Por que a radiação gerada num
difratômetro caseiro é nomalmente
chamada radiação de cobre?
• 6) Por que um alvo de Mo pode ser usado
para monocristais de moléculas pequenas
mas é desaconselhável para proteínas?
45
 Relação entre a Esfera de Ewald e
a Lei de Bragg

Figure 1: Diffraction from a lattice

plane. The angle between the
incoming and diffracted beams and Figure 2: For various theta
the plane are both equal angles, the diffracted beam
to theta. describes a circle.

Figure 3: The Ewald sphere

construction shares the properties
of Bragg's law. 46
 Estratégias de coleta de dados. Construção de Ewald.

Cristal está parado -> Poucas reflexões 47

Modo de oscilação
-> Deve girar ->
48
49
50
 projeção de visão superior

Figure 4: Diffraction occurs when a reciprocal lattice point intersects the Ewald sphere.
51
 compare com a projeção da figura anterior

eixos de giro
do cristal
(e do espaço
recíproco,
conseqüentemente)
(mas só um é usado,
na prática (exceto
geometria kappa para
moléculas pequenas,
sobretudo)

Figure 5: Three-dimensional drawing of the Ewald sphere construction.

52
53
 Aspectos Importantes
• A Esfera de Ewald permite visualizar o
experimento de difração
• Difração somente ocorre quando um ponto da rede
recíproca intercepta a Esfera de Ewald
• O feixe difratado tem a direção da linha que une a
origem do espaço recíproco (onde está este?) e o
ponto da rede recíproca que intercepta a Esfera de
Ewald.
• O raio da Esfera de Ewald é 1/λ

54
 The oscillation method
projeção superior - (onde está o eixo de rotação do cristal?)

Figure 1: After 30 degrees of counterclockwise rotation of the crystal, starting

from the left-hand side situation, all reflections in the gray area will have passed
the Ewald sphere and, thus, will have diffracted.
(OK, mas qual o ângulo medido em cada imagem ?) 55
Figure 3: Schematic depiction of an oscillation method diffraction pattern. Solid lines
indicate the location of diffraction spots at the beginning of exposure, whereas the
dashed lines give the situation at the end of the exposure (after a 5 degree
counterclockwise rotation). The left hand side shows the Ewald sphere construction and
the right side shows what the diffraction pattern will look like on the detector. 56
 The cusp
onde está o eixo de rotação do cristal? Paralelo ao plano de projeção e perpendicular
ao feixe, mas, depois perpendicular ao plano de projecao
Cusp que
pode ser
coberto
por giro
em
outro eixo

Figure 4: After 180 degrees of data collection the area filled with diagonal lines will have
passed the upper half of the Ewald sphere. The area filled with vertical lines will have
passed the bottom half of the Ewald sphere. Together this covers a volume equal to that of
the limiting sphere, with only one small wedge on the top not measure. This wedge is
related by Friedel symmetry to the wedge below that has been measured twice. 57
58
‘Região cega’ (blind region)

reflections that coincide with the

oscillation axis, and those that are very
close to it, never intersect the Ewald sphere59
 onde está o eixo de rotação do cristal?

olhando de uma outra

projeção

Figure 5: The Ewald sphere and

limiting sphere seen in 3D and from
the top. Reflections in the gray area
are too close to the oscillation axis to
ever intersect the Ewald sphere. This
is the blind region or cusp. Its width
is 2theta.
60
Efeito da simetria cristalina na coleta
de dados de difração
Grupos espaciais polares com eixo de
simetria paralelo ao eixo de rotação do
cristal

Figure 7: The red reflections HKL and

onde está o eixo de rotação do cristal?
-H-KL are related by 2-fold crystallographic
symmetry. The blue reflections are related
to the red reflections by Friedel symmetry.
If the 2-fold symmetry axis is parallel to the
oscillation axis, reflections HKL and HK-L
will diffract simultaneously. In this situation,
all reflections on the left half of the detector
will be related (indirectly) by
Friedel symmetry to reflecions on the right
half. In other words the diffraction pattern
shows a mirror symmetry. 61
Efeito da simetria cristalina na
coleta de dados de difração
Grupos espaciais polares com eixo de
simetria perpendicular ao eixo de rotação
do cristal

Figure 8: When there is

crystallographic symmetry
perpendicular to the oscillation axis,
you have to collect only 90 degrees of
data; e.g. one of the quadrants shown
in the figure.

onde está o eixo de rotação do cristal? 62

Efeito da simetria cristalina na coleta
de dados de difração
Quando o eixo de simetria tem uma
orientação qualquer em relação ao eixo
de rotação do cristal

Figure 9: When a crystallographic

symmetry axis is tilted away from the
oscillation axis by at least theta
degrees, then all reflections in the
cusp will be symmetry related to
reflections outside the cusp.
(isto então quando você tem simetria
cristalina, pode evitar o problema do
cusp)
onde está o eixo de rotação do cristal? 63
 Higher symmetry space groups

For crystals with 222, 322, 622, or cubic space groups life gets
increasingly easier as the high symmetry will ensure that you obtain
complete data with a relatively small rotation range. The basic rule is
that if you have the highest symmetry axis parallel to the
oscillation axis, you have to collect only half the amount of data
compared to the situation with polar space groups outlined above.
Unfortunately, you then still have to collect cusp data separately. If
the highest symmetry operation is perpendicular to the
oscillation axis you still have to collect 90 degrees of data and,
except for the 222 symmetry case, you don't have to worry
about cusp data. Data collection should start with a symmetry
axis parallel to the X-ray beam (specially if your time is short).
64
Ângulo total de rotação
O ângulo total de rotação necessário para coletar dados com alta completeza depende da simetria
do cristal (e pode depender de como esta esta orientado no difratometro). Quanto maior for a
simetria, menor será ângulo necessário.
Em princípio sempre será vantajoso coletar 360 de rotação, mas nem sempre isto é possível
(tempo disponível, danos de radiação, etc.).

(exclui cusp region no "rationale",

considerar ângulos extras conforme 65
o caso)
 Estratégias de coleta de dados.
A construção de Ewald é idealizada para raios X sem divergência (δ) e com cristais sem
mosaicidade (η).
Na pratica ~0.2-0.4 (ânodo rotatório) e  ~0.3-1.5.
Além disso, divergência do comprimento de onda dos raios X:  /  = 2*10-4-10-3
(síncrotron).

há que se
considerar também
a divergência
espectral!

Em função disto, as reflexões ficam em posição de difração por mais tempo (on
pontos de difração não são pontos adimensionais).

66
• 40) Quais são os fatores que levam ao
“spread” dos pontos de difração?
• 41) O que podemos fazer para diminuir o
“spread” dos pontos de difração?

67
Reflexões ‘parciais’ e ‘completas’.

Efeito da mosaicidade.
Quanto maior a mosaicidade, mais reflexões parciais serão detectadas em uma
mesma imagem.

O aumento do ângulo de
rotação vai eventualmente
causar a superposição
(overlap) de algumas
reflexões: 68
• 42) Aponte fatos para justificar que quanto
menor a mosaicidade de um cristal, melhor
ele é.

69
 Ângulo máximo de rotação (para coleta em uma imagem)

O ângulo máximo de rotação pode ser estimado pela equação

180 d
    
 a
onde d é a máxima resolução dos dados, a é o parâmetro de célula na direção dos raios-X
incidentes,  é mosaicidade do cristal e  é divergência dos raios-X.

Cristais com grandes parâmetros de célula

Para cristais com um parâmetro de célula muito grande, é sempre vantajoso
orientá-lo de tal maneira que seu maior parâmetro de célula fique paralelo ao eixo
de rotação do cristal (minimiza em média os overlaps).

Comprimento de onda
Depende do tipo de coleta (conjunto de dados nativo; MAD; derivado)
Deve servir para otimizar a qualidade dos dados (sinal anômalo, por exemplo, e/ou
intensidade das reflexões)
Normalmente 1.54 Å no ânodo rotatório e entre 0.9 Å - 1.6 Å em um síncrotron.

70
 Redução de dados
Transformação das imagens em reflexões (hkl) (localização), intensidade (I) e desvio
padrão da intensidade [σ(I)].

Determinação dos parâmetros de rede

Sabendo as posições (x, y, i, j) de um conjunto de reflexões, podemos determinar a
matriz de orientação do cristal e também seus parâmetros de rede.

Integração
Uma vez definido o perfil de reflexão, podemos determinar o número de fótons de
raios-X que incidiram sobre aquela área, correspondente a cada ponto da rede
recíproca. Correções de Lorentz e de absorção pelo ar são aplicadas.
Escalonamento
- Fator de escala. As intensidades das reflexões de uma dada imagem são
multiplicadas por um fator de escala de tal forma que as diferenças entre as
mesmas reflexões e reflexões simetricamente relacionada medidas em imagens
distintas sejam minimizadas.

- B-factor (distingüir do B-factor atômico). Os cristais de proteínas sofrem

danos de radiação durante uma coleta de dados reduzindo de forma não linear seu
poder de espalhamento: reflexões de alto resolução são mais afetadas que as
baixa resolução.
71
Dados de difração. Parâmetros qualitativos.

Tempo de coleta de dados. I /  (I ) ~ N

I/(I) melhora 1,4 vezes se dobramos o tempo de coleta.
Se o tempo de coleta é limitado, as vezes é melhor coletar um conjunto de dados mais
completo e um pouco menos intenso do que apenas uma parte do conjunto com excelente
qualidade.
Overloads. A intensidade máxima que um detector pode registrar é limitada. Intensidade de
reflexões muito fortes pode ser estimada através de profile-fitting, o que na maioria das vezes
é aceitável para a determinação de uma estrutura por substituição molecular. Em princípio, o
melhor seria medir as reflexões de baixa resolução (geralmente as mais fortes) e as de alta
resolução separadamente (duas coletas de dados).

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Redução de dados
=Transformação das imagens em reflexões (hkl), intensidade (I) e desvio padrão da intensidade
[(I)].
Determinação dos parâmetros de rede e orientação do cristal (posições de reflexões, D,
orientação e parâmetros do cristal)

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74
 Perfil de reflexão e caixa de integração

Integração (determinação as intensidades das reflexões hkl nas imagens).

Escalonamento
Fator de escala
B-fator
Avaliação de qualidade (Razão I//(I), R-fator, redundância, completeza, número de
reflexões rejeitadas, as regras de extinção, etc.) e determinação do grupo do espaço.

75
• 50) Quais são os índices (números) aos
quais temos que olhar para avaliar a
qualidade de um conjunto de dados?

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R-factor

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 Take home message
• A complete data set is obtained by rotating the crystal
• The rotation per image should be limited to prevent
overlap of lunes
• The angular range of data needed is determined by the
space group symmetry
• Try to offset a symmetry axis by at least theta degrees
from the oscillation axis and then collect 180 degrees of
data
• For triclinic space groups collect another 180 degrees
with the crystal offset by at least two theta degrees from
the oscillation axis
• Use the data collection software to help guide your
strategy

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79
80
81
82
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• Block

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85
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87
88
89
90
91
92
93
94
95
Coleta de Dados de Difração

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• former material on proteins …

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98
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100
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124