Fundao Faculdade Federal de Cincias Mdicas de Porto Alegre Disciplina de Gentica Bsica

Doenas Mitocondriais - uma Reviso sobre MERRF

Lucas Spanemberg Manuela Meinhardt Peixoto Marianne de Aguiar Possa Ramiro Ronchetti Niara Bichara de Oliveira

Porto Alegre, 25 de outubro de 2001.

1. Introduo

A Epilepsia Mioclnica com Fibras Rotas Vermelhas (MERRF) uma doena mitocondrial que junto com as outras citopatias mitocondriais constituem um grupo de doenas de expresso clnica heterognea decorrentes de alteraes do metabolismo energtico celular (1). Epilepsia mioclnica so convulses peridicas incomuns inicialmente focais, progredindo a contraes musculares generalizadas e cclicas(2). Ao eletroencefalograma mostra descargas de polipontas-ondas, sobretudo na regio occipital, com alentecimento progressivo e um ritmo de fundo desorganizado. A formao de fibras vermelhas rotas resulta da proliferao mitocondrial, que ocorre em MERRF, e parece ser desencadeada por um desequilbrio entre a necessidade de energia e a eficincia da oxidao/fosforilao da fibra muscular (3). A mitocndria, organela responsvel pela produo de energia armazenada em trifosfato de adenosina (ATP), atravs do processo de fosforilao oxidativa, possui DNA prprio (DNAmt), que apresenta caractersticas prprias (1, 3, 4, 5, 6, 7, 8) que sero desenvolvidadas ao longo do trabalho. As mutaes do DNAmt podem causar falhas no processo de obteno de energia nas clulas, o que caracteriza as doenas mitocondriais
(1, 2, 4, 9)

. Os tecidos mais acometidos so

aqueles com maior necessidade de ATP como por exemplo o sistema nervoso central que consome 20% da produo corprea de ATP (4). As manifestaes mais comuns da doena podem ser epilepsia mioclnica, ataxia e nistagmo (3). A expresso fenotpica da doena muito varivel pois DNAmt mutado e normal coexistem na mesma clula (heteroplasmia) e a proporo de mutantes pode mudar em clulas-filhas durante a diviso celular (3, 4). Os defeitos moleculares encontrados so basicamente rearranjos de grande escala (delees e duplicaes), depleo e mutaes de ponto
(1)

.A maioria das mutaes de DNA em

ponto ocorrem em genes de RNA trnasportador (RNAt). Dentre elas, talvez a mais estudada seja

3 a transio AG na posio 8344 no gene de RNAt de lisina (RNAtLys), a mutao que causa MERRF
(10)

. A maioria dos pacientes com MERRF apresentam essa mutao, porm no

exclusiva de MERRF (3). Como o DNAmt est localizado no citoplasma sua herana no segue as leis mendelianas, sendo herdado exclusivamente atravs da linhagem materna mas ambos os sexos so afetados igualmente (3, 4). As doenas mitocondrias so relativamente novas. Os primeiros relatos dessas doenas so da dcada de 60 mas somente na dcada de 90 que houve maior avano nos mtodos diagnsticos mais eficientes. Portanto, difcil a realizao de pesquisas epidemiolgicas relatos de casos de grande amostragem. O objetivo deste trabalho realizar uma reviso bibliogrfica a respeito de MERRF e doenas mitocondriais em geral, enfocando principalmente aspectos genticos e as bases das doenas. Outros aspectos desenvolvidos sero diagnstico, aspectos clnicos e tratamento.
(1)

2. Histrico

2.1.O Nascimento da Medicina Mitocondrial (1959-1962) Em 1959, os primeiros estudos bioqumicos de uma organela celular foram realizados seguindo observaes feitas na beira do leito de um paciente com sintomas neurolgicos nunca antes vistos. Constatado que tal paciente possua uma taxa de metabolismo basal muito elevada, partiu-se para a hiptese de acometimento de mecanismos que regulavam o consumo de oxignio a nvel celular. Os estudos passaram a se concentrar na mitocndria do msculo esqueltico. Em 1960, estudos com ratos comprovaram que a mitocndria era responsvel pela respirao celular e pela fosforilao oxidativa. Observou-se ainda, a importncia da produo de ATP e sua relao com a respirao mitocondrial. Apesar desta estar normal, o ATP mostrava-se em nveis muito diminudos (11). A microscopia eletrnica demonstrou acmulo mitocondrial de diferentes tamanhos em clulas musculares. Os achados bioqumicos e estruturais da Doena de LUFT tiveram grande impacto no desenvolvimento das bases da patofisiologia mitocondrial na dcada de 70. A presena de DNA na mitocndria foi inicialmente mostrada em 1963 por Nass e Nasss
(12)

em embries de galinhas.

2.2. O Crescimento no Campo da Doena Mitocondrial No incio da dcada de 70, constatou-se que as aberraes na cadeia respiratria com ou sem as alteraes estruturais na mitocndria encontradas na doena de LUFT, tambm ocorriam

5 em outras miopatias. Em 1970 1972, foram notificadas doenas envolvendo sistema nervoso central e msculo esqueltico associadas a deficincias na cadeia respiratria. No ano seguinte, foram notificados os primeiros casos de deficincia isolada de carnitina muscular. Tais descobertas clnicas foram o ponto inicial para a rpida expanso da pesquisa da patofisiologia mitocondrial. Em 1981, a sequncia completa do DNA mitocondrial foi elucidada(13). Em 1988, uma reviso compreensiva(14) das bases bioqumicas da doena mitocondrial classificou mais de 120 entidades. Desde ento inmeras revises passaram a elucidar as alteraes, no apenas bioqumicas, bem como estruturais e moleculares das doenas mitocondriais. A idia de doena multissistmica associada a um defeito especfico na funo mitocondrial, porm dependente de variao gentica e fatores ambientais, passou a ser aceita e estudada mais profundamente.

2.3. Futuro Os desafios para os que trabalham no campo das doenas mitocondriais incluem um melhor entendimento da patognese inicial que atinge o DNA mitocondrial e, principalmente, o desenvolvimento de tratamentos efetivos. A produo de modelos animais com mutaes no DNA mitocondrial muito importante (15).

3. Epidemiologia

Pouco se sabe sobre a freqncia das doenas mitocondriais, em parte porque os primeiros relatos de distrbios desse grupo so da dcada de 60 (ver Histrico). Na verdade, somente na dcada de 90 que houve um avano na identificao, caracterizao e classificao dessas doenas por meios diagnsticos mais eficientes. Em estudo recente de 204 e pacientes realizado no Instituto Nazionale Neurolgico C. Besta, em Milo, a freqncia de distrbios mitocondriais em relao aos de outros grupos de patologias neurometablicas (doenas lisossmicas de depsito, doenas dos peroxissomos, acidrias orgnicas, por exemplo) foi de 25%. Hoje, estima-se que a freqncia de doenas mitocondriais seja de aproximadamente 1:10.000 nascidos vivos, porm anlises estatsticas mais precisas da populao devem ser feitas, buscando nmeros mais recentes em diferentes populaes (1).

4. Aspectos Gerais da Mitocndria

4.1. A Mitocndria As mitocndrias so organelas encontradas em todas as clulas dos eucariontes e que tm a funo de transformar a energia qumica dos metablitos em energia facilmente acessvel clula(2, 8, 16). Essa energia acumulada em compostos lbeis ricos em ligaes energticas, dos quais o principal o trifosfato de adenosina (ATP), que prontamente cede sua energia quando a clula necessita dela para trabalho, quer seja hosmtico, mecnico eltrico ou qumico. As mitocndrias so organelas esfricas ou alongadas, medindo de 0,5 a 1,0 m de largura e at 10 m de comprimento. Sua distribuio na clula varia, tendendo a se acumular no citoplasma onde o gasto de energia mais intenso, por exemplo, no plo apical das clulas ciliadas ou na pea intermediria de espermatozides. A mitocndria constituda principalmente por protenas, e em segundo lugar por lipdios(8). Existem tambm pequena quantidade de RNA e DNA, sendo que a mitocndria possui sistema gentico prprio(1,
2, 4, 5, 6, 7, 8)

. Como quase todos os

componentes celulares, a mitocndria tem vida curta, sendo constantemente renovada. Experimento feitos em clulas de fgado de ratos mostram que a vida mdia das protenas mitocondriais de aproximadamente 10 dias(8). As mitocndrias mostram, no microscpio eletrnico, uma estrutura caracterstica. Apresentam-se constitudas por duas membranas: a externa lisa, ao passo que a interna apresenta invaginaes que podem assumir a forma de cristas ou tbulos, que servem para aumentar consideravelmente a superfcie da membrana(2, 8, 17,
18)

. A maior parte das mitocndrias tem cristas no seu interior. Fazem exceo s das clulas que

sintetizam esterides, que apresentam principalmente formaes tubulares, alm de cristas. Entre

8 as cristas ou tbulos da mitocndria existe uma matriz amorfa, rica em protenas. Em muitos tipos celulares observam-se, na matriz, grnulos arredondados e eltron-densos, que so ricos em clcio e magnsio. Estes esto relacionados com a capacidade mitocondrial de concentrar ctions(8). As molculas energticas (glicdios, lipdios) so inicialmente degradadas no citoplasma e a degradao continua nas mitocndrias pelas enzimas do ciclo do cido ctrico (Ciclo de Krebs) e da fosforilao oxidativa, produzindo gua, CO2 e energia. Foram descritas pequenas partculas arredondadas de mais ou menos 9 nm de dimetro, que se prendem por um pednculo face interna da membrana interna da mitocndria. So as partculas elementares, que contm as enzimas da fosforilao de ADP (difosfato de adenosina) transformando-a em ATP. As partculas elementares so constitudas por vrias protenas formando um complexo que apresenta atividade ATP sintetase capaz de formar ATP a partir de ADP e fsforo inorgnico(8, 17). A teoria mais aceita sobre o funcionamento das mitocndrias (teoria quimiosmtica) admite que a sntese de ATP ocorre s expensas de um fluxo de prtons atravs das partculas elementares(8, 17). A quantidade de mitocndrias e o nmero de cristas por organela so proporcionais ao metabolismo das clulas. As que apresentam alto metabolismo, como o caso das clulas do msculo estriado cardaco, tm grande quantidade de mitocndrias, com elevado nmero de cristas dispostas compactamente. (8) As mitocndrias podem ter funes especializadas em tipos particulares de clulas. O ciclo da uria, por exemplo, a rota metablica central pela qual os mamferos eliminam os produtos finais do metabolismo celular que contenham nitrognio. Esses produtos so excretados na urina na forma de uria. Enzimas da matriz mitocondrial codificadas pelo ncleo so responsveis por vrias etapas do ciclo. A sntese de uria ocorre somente em alguns tecidos, como o fgado, e as enzimas necessrias so sintetizadas e importadas para as mitocndrias somente nestes tecidos. Adicionalmente, os complexos enzimticos respiratrios da membrana mitocondrial interna de mamferos contm vrias subunidades proticas, que so tecidoespecficas e codificadas pelo ncleo, acreditando-se que atuem como reguladoras do transporte de eltrons. Assim, alguns seres humanos com certa doena muscular gentica apresentam uma subunidade defectiva na citocromo-oxidase; como o subunidade especfica s clulas

9 musculares esquelticas, as suas outras clulas, incluindo as clulas musculares cardacas, funcionam normalmente, permitindo aos indivduos sobreviverem(7).

4.2. Origem da Mitocndria O carter peculiar do sistemas genticos das mitocndrias sugerem que elas evoluram, assim como o cloroplasto, de bactrias endocitadas h mais de um bilho de anos. De acordo com essa hiptese endossimbitica, as clulas eucariticas iniciaram suas existncias como organismos anaerbicos, sem mitocndrias ou cloroplastos, e ento estabeleceram uma relao endossimbitica com uma bactria, cujo sistema de fosforilao oxidativa foi subvertido pelas clulas para seu prprio uso. O evento endoctico que levou ao desenvolvimento das mitocndrias presumivelmente ocorreu quando o oxignio entrou na atmosfera em quantidades substanciais, h cerca de 1,5 x 109 anos, antes que animais e plantas tenham surgido(7, 19). Uma vez que a maioria dos genes codificantes das atuais protenas mitocondriais est no ncleo celular, parece claro que uma extensa transferncia de genes ocorreu do DNA das organelas para o DNA nuclear durante a evoluo eucaritica. Isso explicaria porque alguns genes nucleares codificantes de protenas mitocondriais assemelhan-se a genes bacterianos: a seqncia de aminocidos da enzima mitocondrial seperxido dismutase de pintos, por exemplo, assemelha-se muito mais enzima mitocondrial enzima bacteriana correspondente do que a outras enzimas superxido dismutases encontradas no citosol da mesmo clula eucaritica. Outra evidncia de que tais transferncias de DNA tenham ocorrido durante a evoluo vem da descoberta de que algumas seqncias no-codificantes do genoma nuclear parecem ser de origem mitocondrial recente; elas parecem ter se integrado ao genoma nuclear como DNA lixo(7). O mais provvel que as mitocndrias sejam descendentes de um tipo particular de bactria prpura fotossintetizante que perdeu a habilidade de conduzir a fotossntese, tendo remanescido com somente uma cadeia respiratria. No est claro, entretanto, se as mitocndrias se originaram a partir de um nico evento endoctico, pois algumas das caractrsticas das mitocndrias de protozorios, por exemplo, diferem o suficiente das mitocndrias animais e vegetais para sugerir uma origem tambm diferente(7).

10 Segundo a hiptese endossimbitica, um sistema gentico prprio para as mitocndrias pode ser explicado por contingncias evolutivas. Isso significaria que o processo pelo qual os endossimbiontes transferiram a maior parte dos seus genes para o ncleo (mais de 90 protenas mitocondriais so codificadas por genes nucleares(4, 7) terminou antes que tivesse completo. As transferncias seguintes devem ter sido descartadas pelas alteraes recentes do cdigo gentico mitocondrial, que tornou os genes mitocondriais no-funcionantes quando transferidos para o ncleo(7).

4.3. A Fosforilao Oxidativa Como j visto, as mitocndrias tm a funo de transformar a energia qumica dos metablitos em energia facilmente acessvel clula(2,
7, 8)

. Assim, membrana mitocondrial

interna pode ser separada em cinco complexos enzimticos responsveis pela fosforilao oxidativa mitocondrial, chamados complexos I, II, III, IV e V (Quadro 1), compostos por subunidades responsveis pelo transporte de eltrons atravs da membrana intramitocondrial(1, 2, 6,
17, 20)

. Os complexos respiratrios contm ainda subunidades que so codificadas pelo DNA

nuclear, as quais so sintetizadas nos ribossomos citoplasmticos e, depois, importadas para as mitocndrias, onde vo ser conjugadas com as subunidades codificadas pelo mtDNA nas respectivas holoenzimas(1,4, 7). Segundo a hiptese quimiosmtica (hiptese de Mitchell), a energia livre gerada pelo transporte de eltrons pela cadeia respiratria usada para produzir ATP a partir de ADP + Pi(2, 8,
17)

. O complexo I remove eltrons do NADH enquanto o complexo II coleta eltrons do

succinato. Ambas as enzimas, ento, transportam os eltrons para a coenzima Q (CoQ). Da CoQ, os eltrons circulam atravs do complexo III para o citocromo c, em seguida para o complexo IV, e finalmente o oxignio produz gua corporal de oxignio
(17) (2, 6)

. Esta necessidade de oxignio torna o processo de

transporte de eltrons uma cadeia respiratria, a qual responde pela maior parte da utilizao . A energia gerada liberada por esta cadeia transportadora de eltrons, sendo usada para a bomba de prtons por intermdio da membrana mitocondrial interna, criando

11 um gradiente eletroqumico. Este gradiente utilizado pelo complexo V como uma fonte de energia potencial para condensar ADP e Pi e fabricar ATP. O ATP formado ento trocado por ADP atravs da membrana mitocondrial interna pelo transportador de adenina nucleotdio, sendo que o ADP pode ser ressintetizado em ATP (2, 6
, 17)

Quadro1: Complexos enzimticos que compem a cadeia respiraria mitocondrial Complexo Enzimtico I (NADH) - coenzima Q xidoredutase II - succinato desidrogenaseCoQ-xido-redutase III - coenzima Q citocromo Cxido-redutase IV - citocromo c oxidase ou COX V - ATP sintetase
1.

Nmero de Subunidades Nucleares Aproximadamente 40 4 11 13 14

Nmero de Identificaes das Subunidades Mitocondriais 7 (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6) 0 1 (citocromo b) 3 (COXI, COXII, COIII) 2 (ATPase 6 e 8)

(Adaptado de Souza AFM, Giugliani R. Doenas Mitocondriais. In: Carakushanski E. Doenas Genticas em Pediatria. Ed. Guanabara Koogan, RJPp: 189-195, 2001.).

4.4. DNA e Herana Mitocondrial As mitocndrias tm suas prprias molculas de DNA, ocorrendo em vrias cpias por organela e consistindo de 16.569 pares de bases dispostos em uma molcula bifilamentar circular(1, 2, 4, 5, 6, 7, 20). A transcriodo DNA mitocondrtial (mtDNA) ocorre nas mitocndrias, independentemente do ncleo(4). As molculas de mtDNA contm 37 genes
(1)

que codificam

codificam 2 RNAs ribossmicos, 22 RNAs transportadores e 13 RNS mensageiros (RNAm) que so traduzidos em 13 polipeptdios envolvidos na fosforilao oxidativa(1, 2, 4, 6, 7, 19, 20, 21) (outros 90 ou mais genes do DNA nuclear tambm codificam polipeptdios que so transportados para as mitocndrias para participar da fosforilao oxidativa) mitocondrial
(1, 2, 6) (1, 4, 7)

. Essas protenas codificadas so

essenciais componentes de 4 dos 5 complexos responsveis pela fosforilao oxidativa . O complexo II formado exclusivamente por subunidades codificadas pelo DNA nuclear (nDNA) (1). O genoma mitocondrial compacto e sem ntrons (1, 7).

12 A segregao e transmisso do genoma mitocondrial em humanos compem-se de complicados processos, que so particularmente importantes na compreenso da herana e anormalidades clnicas das doenas mitocondriais (5). A gentica do mtDNA possui marcantes diferenas com a dos cromossomos nucleares (Quadro 2). Em primeiro lugar, ao contrrio do DNA nuclear, o mtDNA herdado exclusivamente atravs da linhagem materna
(1, 4, 7, 17, 18)

, no seguindo os princpios da gentica

mendeliana, mas sim os da gentica das populaes(22). O zigoto s possui mitocndrias provenientes do vulo, que possui cerca de 100.000 cpias de DNA, uma vez que os espermatozides s possuem algumas molculas de DNAmt (cerca de 100 cpias) (16, 22) que no entram no ovcito
(1, 4, 7, 17, 18)

. A questo ainda controversa, visto que um pequeno nmero de

16)

molculas de mtDNA paterno pode escoar at o zigoto(5, mecanismos ainda desconhecidos

(1, 16)

,sendo diluda ou excluda por

. Para fins didticos, podemos considerar que a maioria das

alteraes patognicas no mtDNA tem associao com hereditariedade materna, ou seja, as mes transmitem a deficincia para toda a sua descendncia, mas somente as filhas transmitiro a doena adiante
(1, 4, 5)

. Entretanto, ao contrrio de mutaes de ponto no RNAmt, transmitidas

maternamente, mltiplas delees so transmitidas como herana autossmica dominante ou, mais raramente, autossmica recessiva. Essas desordens de herana mendeliana tm sido descritas como defeitos na sinalizao intergenmica, isto , mutaes nos genes nucleares que predispem a rearranjos no DNAmt(23). Um segundo aspecto da gentica do mtDNA que cada clula humana possui centenas de mitocndrias, e cada uma contm muitas molculas de mtDNA(1, 2, 6, 18). O nmero de molculas de DNAmt por clula varia consideravelmente, mas clulas somticas mononucleares contem tipicamente na ordem de 1000 a 5.000 cpias
(5, 16)

. Durante a diviso celular, a mitocndria

(1, 2, 5, 16, 22)

distribuda randomicamente para as clulas-filhas, que, em condies normais, so compostas por uma nica espcie de DNAmt, situao chamada de homoplasmia . Porm, com uma alta taxa de divises e mutaes, podem coexistir, dentro da mesma clula, molculas normais e molculas mutadas, condio denominada de heteroplasmia (1, 2, 4, 5, 16, 22). Devido a poliploidia mitocondrial durante a meiose, ocorre uma distribuio aleatria do DNAmt mutado pelas clulas-filhas durante cada diviso celular, fenmeno conhecido como

13 segregao mittica
(1, 3)

. As mudanas na proporo de alelos mutantes podem ocorrer por

variao aleatria (idntico ao conceito de deriva gentica) ou devido a uma vantagem seletiva (por exemplo, delees produzem uma molcula de DNAmt mais curta que pode replicar mais rapidamente que uma molcula inteira).(4) A heteroplasmia do DNAmt uma causa importante de expressividade varivel das doenas mitocondriais. Quanto maior a proporo de molculas mutantes de DNAmt, mais grave ser a expresso da doena(4), denotando a existncia de um limiar de expresso(1). A expresso fenotpica de uma mutao mitocondrial tambm depende da natureza da mutao, da sua distribuio tecidual, bem como da necessidade energtica do rgo no qual ocorre o dano molecular. Por exemplo, msculo, crebro, olhos e corao so mais vulnerveis, pois dependem mais da energia gerada na mitocndra. Genes nucleares, polimorfismos mitocondriais, bem como idade, sexo, fatores ambientais, apesar de pouco estudados, tambm tm um papel na expresso fenotpica das mutaes do DNAmt (1). Outra diferena que, ao contrrio do genoma nuclear, que organizado linearmente(24), o genoma mitocondrial se dispe em molcula circular (1, 2, 4, 5, 6, 7). Tambm destaca-se a ausncia de ntrons, presentes no DNA nuclear
(1, 4, 7, 19)

. Alm disso, em contraste com o DNA nuclear,

ambos os filamentos do DNA so transcritos e traduzidos. J no cdigo gentico, o DNAmt difere do cdigo universal em muitos aspectos: UGA (expresso, habitualmente, em termos de cdigo do RNAm) codifica triptofano e no trmino. AUA codifica metionina, e no isoleucina; AGA e AGG so de trmino e no cdons de arginina. Alm disso, as terceiras posies - que so a principal fonte de redundncia do cdigo - mais freqentemente so A e C (e menos G ou T) que no genoma nuclear(18). A taxa de mutao do DNAmt cerca de dez vezes maior que a do DNA nuclear. Isto causado pela falta dos mecanismos de reparo do DNA no DNAmt, e tambm possivelmente pelos danos causados pelos radicais livres de oxignio liberados durante o processo de forsforilao oxidativa (4, 17).

14 Quadro 2: Principais diferenas entre o DNA mitocondrial e o DNA nuclear DNA mitocondrial Circular Sem ntrons Herana maternal 16.569 pares de bases 37 genes DNA nuclear Linear Com ntrons Herana mendeliana 7 bilhes de pares de bases 100.000 genes

4.5. Transcrio e Replicao do DNAmt A transcrio da cadeia pesada (H-strand) inicia no promotor de cadeia-H (HSP) e procede em sentido anti-horrio comeando com os 2 RNAs ribossomais, e inclui 12 RNAs mensageiros que codificam protenas da fosforilao oxidativa, assim como 14 RNAs transportadores. A transcrio de cadeias leves (L-strand) inicia no promotor de cadeia leve (LSP) e procede em sentido horrio, comeando com primers de RNA para replicao e, aps a ala D, codificando 8 dos 22 RNAs transportadores e 1 RNA mensageiro. Cadeias longas de RNA policistrnicas so formadas e subseqentemente clivadas precisamente em espcies separadas de RNA (21). Quadro 3: Produtos da Transcrio Genmica Mitocondrial Transcrio da Cadeia Leve Primers de RNA 8 RNAs transportadores (P, E, S, Y, C, N, A, Q) 1 RNA mensageiro (ND6) Transcrio da Cadeia Pesada 2 RNAs ribossomais (12s e 16s) 14 RNAs transportadores (F, V, L, I, M, W, D, K, G, R, H, S, L, T) 12 RNAs mensageiros

15 A replicao de RNAmt requer primers de RNA sintetizados ao longo do promotor de cadeia. As cpias das cadeias so replicadas como as cadeias progenitoras, sendo as molculasfilhas liberadas como crculos livres. A nova molcula de DNAmt de cadeia dupla formada pela remoo dos primers de RNA, introduo de anis super-helicais e fechamento do crculo. Na traduo, os 13 genes codificadores de protena compreendem: complexo I ou NADH desidrogenase: 7 subunidades (ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6); compexo III: citocromo b; complexo IV ou citocromo c oxidase: subunidaades I, II, e III; e complexo V ou ATP sintetase: subunidades 6 e 8.Os 22 genes de RNA para 20 aminocidos compreendem: cadeia leve: prolina, cido glutmico, serina, tirosina, cistena, asparagina, alanina, glutamina; cadeia pesada: fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, triptofano, cido asprtico, lisina, glicina, arginina, histidina, serina, leucina, treonina(21).

16

5. Doenas Mitocondriais 5.1. Etiologia O grupo de doenas relacionado as alteraes nas mitocndrias, podem ter uma origem ligada defeitos na estrutura gentica do DNA mitocondrial (excludos, aqui os defeitos no DNA nuclear que ir levar, posteriormente as mutaes no DNA mitocondrial, e, da mesma forma, os defeitos da sinalizao intergenmica) e a fatores externos. Sendo aqueles muito mais freqentes que estes. Algumas outras causas, entretanto, podem ser citadas como possveis causas de mutaes no DNA mitocondrial porm, ainda devem ser elucidadas.

5.2. Defeitos Genticos A doena mitocondrial quando originada exclusivamente do DNA mitocondrial propriamente dito, pode ser resultada de mutaes de ponto ou rearranjos de grande escala (delees e duplicaes): Deleo a perda de um segmento cromossmico, resultando em desequilbrio do cromossomo; Duplicao originada, freqentemente, de um crosing-over desigual resultando, tambm em um desequilbrio cromossmico; Mutaes de Ponto substituio de um nico nucleotdio numa seqncia de DNA, podendo alterar o cdigo de uma trinca de base e levar substituio de um aminocido por outro no produto gnico(24). As mutaes mais freqentes em determinado gene do DNA mitocondrial variam conforme a doena (Quadro 4).

17 Quadro 4. Aspectos clnicos e moleculares de algumas doenas mitocondriais Doenas Caractersticas Clnicas Gene Mitocondrial ND1, ND4, ND6 Mutaes De ponto: 3460 A, 11778 A, 14484C

Atrofia ptica Perda visual (central) na hereditria de Leber segunda ou terceira dcada de vida AVCs antes dos 40 anos, demncia, enxaqueca, convulses

MELAS

RNAtleu(UUR)

De ponto: 3243 G, 3271

MERRF

Epilepsia mioclnica, ataxia, miopatia, neuropatia, demncia Ptose, fraqueza dos msculos extra-oculares e membros

RNAtlys

De ponto: 8344G 8356C De ponto: 5692G Delees mltiplas De ponto: 4317G, 4269G

Oftalmoplegia externa progressiva Miopatia com cardiomiopatia hipertrfica

RNAtAsn

Fraqueza muscular, miopatia

RNAtIle

Diabetes melito II, surdez Diabete com Surdez neurossensorial

RNAtleu(UUR)

De ponto: 3243G, Delees e Duplicaes do DNA mitocondrial

(Adaptado livremente de Carakushanski, Everson Doenas genticas em pediatria; Ed Guanabar Koogan, RJ 2001)

As mutaes no DNA mitocondrial podem ocorrer em clulas somticas ou germinativas. Nos casos de mutaes em clulas da linhagem somtica, h uma notvel relao entre grau de mutao (tanto mutaes de ponto como rearranjos de grande escala) e idade do paciente acometido. Mutaes em tais clulas so causadas, provavelmente, pelo efeito direto dos radicais oxignio, conforme discutido posteriormente. Assim, quanto mais velho o indivduo, maior a

18 probabilidade de apresentar mutaes nas clulas somticas, de maneira suficientemente expressiva a ponto de apresentar alguma expresso fenotpica (6). Enquanto mutaes somticas determinam o tempo e a progresso da doena mitocondrial, mutaes no DNA mitocondrial herdado definem a natureza e a severidade das manifestaes clnicas. Assim, a variao gentica em clulas da linhagem germinativa produto tanto de novas quanto de antigas mutaes, que agiram na seleo de um mesmo organismo(6). Portanto, a maioria das manifestaes polimrficas que existem na populao, ocorreram h muito tempo e, desde ento, segregaram-se para homoplasmia. Contrastando com esta observao, diversas mutaes deletrias severas so eliminadas atravs da seleo natural, na forma de doenas incompatveis com a vida ou com a reproduo da espcie

5.3. Fatores Externos Embora sejam inmeros os fatores externos apontados como possveis causadores de doenas mitocondriais, poucos apresentam explicaes cientficas plausveis. Dentre eles, est o tratamento para o Vrus da Sndrome da Imonodeficincia Adquirida (AIDS). A replicao do DNA mitocondrial promovida pela DNA-polimerase ; esta enzima, por sua vez, inibida pelos inibidores da transcriptase reversa. As drogas utilizadas no tratamento da AIDS, por atuarem de tal forma, podem induzir uma deleo no DNA mitocondrial, resultando em defeitos na cadeia respiratria e na fosforilao oxidativa. Tais efeitos foram inicialmente observados em pacientes tratados com Zidovudina, que desenvolveram miopatia com fibras vermelhas rotas e baixos nveis de DNA mitocondrial. Ainda, corroboram estudos que relacionam lipodistrofia como efeito adverso do tratamento para AIDS, bem como sinal de doena mitocondrial (15).

5.4. Relao com Infeces Em estudo recente (15) observou-se uma alta freqncia de infeces de repetio do trato genito-urinrio e respiratrio, em pacientes portadores de doenas mitocondriais. A maioria dos

19 episdios neurodegenerativos clinicamente importantes associados com doenas mitocondriais ocorreram durante ou logo aps episdios de infeces comuns como otite mdia, sinusite e gastroenterite. A hiptese apresentada a existncia de uma relao entre as citocinas de defesa do organismo e a apoptose da mitocndria. Entretanto, o mecanismo especfico continua desconhecido, o que requer maiores investigaes sobre o assunto(15).

20

6. Gentica de MERRF

6.1. Etiologia Dentre as 50 mutaes em ponto do DNA mitocondrial (DNAmt) j reportadas, que causam doena em humanos, 35 ocorrem em genes de RNAt. Dentre elas, talvez a mais estudada seja a transio AG na posio 8344 do gene do RNAt
Lys (1)

, mutao que ocorre na maioria

dos pacientes com MERRF(80 a 90% dos casos), altamente especfica para esta doena mas no exclusiva(2, 3, 10, , 23, 26, 27). Muitos dos casos restantes so devidos a uma transio TC na regio 8363 do mesmo gene.(2, 9). Ambas as mutaes so consistentemente heteroplsmica em pacientes e nunca foram encontradas em controles.(2) Outra mutao ocorre no gene RNAt
Leu

, uma

transio AG na regio 3243 que usualmente ligada Encefalopatia Mitocondrial, Acidose Ltica e Acidente Vascular Cerebral (MELAS), outra doena mitocondrial.(9) Existe ainda um relato de famlia com MERRF que carregava uma mutao no mesmo gene no nucleotdeo 8356(28) e casos de mutao na regio 3243 do gene de RNAt sintomas mistos de MERRF e oftalmoplegia progressiva externa.
Leu(UUR) (29)

, a ltima apresentando

Recentemente foram descobertas outras mutaes relacionadas ao MERRF, uma transio GA na regio 8363 no gene RNAt Lys e uma transio AG na regio 8296 no gene RNAt Lys, que ocorre em associao com a mutao G8363A anlise de fibras musculares mostrou nveis significativamente aumentados de genomas G8363A em citocromo c oxidase-negativas (indicativo de MERRF) do que em fibras normais, e nveis quase homoplsmicos da mutao A8296G em ambas as fibras. As duas mutaes no foram encontradas em controles. A mutao

21 G8363A dita patognica e a co-ocorrncia com mutao A8296G de pouco claro significado e um raro polimorfismo.(30). A figura a seguir mostra as mutaes citadas no RNAt Lys:
A - G. 8363A - T G 8296 - G - A -C - A - T C AC A A T T C T C A T C G C A A A G A G C T A G C T TT A A C Ala TC A . A A T - A G T - A 8344G A - T A - T C- G A C A T T T T
-

5 C A C T G T A

Fig.1. Representao esquemtica do RNAt Lys mitocondrial, mostrando a posio das mutaes e a ala universal TC, onde ocorre a mutao A8344G.(Adaptado de Arenas J, Campos MS, Bornstein MD et al. A double mutation (A8296G and G8363A) in the mitochondrial DNA tRNA Lys gene associated with myoclonus epilepsy with ragged-red fibers. Neurology 52:377-382, 1999.

6.2. Bases Moleculares A mutao A8344G no gene de RNAt

Lys

causa uma terminao prematura da traduo

em cada ou perto de cada cdon de lisina, sendo a deficincia na aminoacilao do RNAt Lys (em geral, de 50 a 60%) a principal causa do fenmeno(9, 29, 30). Esse fenmeno leva a uma severo defeito na sntese proteica mitocondrial , que foi encontrado associado mutao A8344G em mioblastos e fibroblastos de msculo esqueltico de pacientes(2).H acmulo de peptdeos mitocondriais truncados pelo trmino prematuro da traduo afetando preferencialmente

22 polipeptdeos maiores(2, 9). A diminuio da sntese proteica leva a um dficit geral na taxa de respirao mitocondrial e do consumo de oxignio em clulas e tecidos(9). Um efeito da mutao na acurcia do processamento do transcrito policistrnico do qual o RNAt Lys derivado foi estudado pelos resultados de anlise de RNA gel-blot. Ambos o RNAm maduro correspondente aos genes adjacentes e o RNAt Lys eram do tamanho correto em mutantes. Entretanto, o mesmo tipo de anlise revelou que o nvel do RNAt
Lys

em mitocndrias mutantes
Lys

estava diminudo em 18 a 35%. E ainda, usando condies de isolamento e eletroforese que detecta a ligao aminocido e RNAt, foi encontrado que a proporo de RNAt que foi mutado estava diminuda em clulas mutantes em 30 a 40%. Em resumo, a combinao dos dois fatores (quantidade e eficincia da aminoacilao) produz um nvel de lysil-RNAtLys 50 a 60% menor em clulas mutantes do que em controles.(10) No caso do polipeptdeo menos afetado na sua taxa de sntese, ND6, que possui apenas dois resduos de lisina, a taxa de formao da protena madura em clulas com 98% de RNAtLys mutado, foi de apenas 40% em relao linhagem celular controle. improvvel que a pequena quantidade de gene RNAt Lys normal poderia contar com a sntese de protena observada nessas clulas. Essas clulas eram capazes de incorporar 3H-lisina em vrios produtos de traduo mitocondrial exceto ND4L, que no tem cdon de lisina na sua matriz de leitura. Esses resultados indicam um funcionamento substancial do RNAt mutante na elongao e tambm sua capacidade de no incorporar resduos de lisina em cdons de outros aminocidos ou outros aminocidos em cdons de lisina.(10) Assim como a mutao na posio A8344G do MERRF, uma mutao na posio 8356 no gene RNAt
Lys

produz uma traduo anormal do tamanho do produto RNAt alterado. Alm

Lys

dessas 2 mutaes no RNAt

, nenhuma outra mutao mitocondrial no RNAt tem causado

trmino prematuro da traduo. Portanto, no sistema mitocondrial humano, cdons de lisina parecem ser os nicos que tm habilidade de causar trmino prematuro da traduo quando o suprimento de RNAt carregado baixo.(1)

23 6.3. Bases Bioqumicas e Fisiopatolgicas Anlise enzimtica do material da bipsia muscular de pacientes com MERRF revelou atividades reduzidas de enzimas da cadeia respiratria. Especialmente afetadas so a NADH desidrogenase, ou complexo I, que contm 7 subunidades sintetizadas na mitocndria, e a citocromo c oxidase, ou complexo IV, que contm 3 dessas subunidades(9, 10). A ATP sintase e o complexo III so geralmente menos afetados(9). Entretanto tem-se encontrado resultados inconsistentes nos estudo bioqumicos musculares, incluindo defeitos do complexo III; complexos II e IV; complexos I e IV; complexos I, III e IV; ou apenas comlexo IV.(3) Os efeitos da mutao na sntese proteica da mitocndria revelou que alm das 13 protenas normalmente sintetizadas na mitocndria, vrios peptdeos anormais eram tambm produzidos. E ainda, a taxa dos 13 produtos de traduo normais em clulas mutantes era consideravelmente diminuda, um achado no surpreeendente, considerando que a mutao ocorreu em um gene de RNAt. Polipeptdeos com um grande nmero de resduos de lisina tm apenas uma pequena probabilidade de serem completos. Trs subunidades do complexo I e uma subunidade do complexo IV tm 10 resduos de lisina e eram sintetizados em 10% da taxa normal em clulas com RNAt mutantes, o que explica o grande defeito respiratrio e bioqumico observados em bipsias musculares de pacientes com MERRF.(10) Durante a respirao aerbica normal a mitocndria consome O2 e forma gua. Durante esse processo, 4 eltrons so adicionados e a energia liberada conservada em forma de ATP. Os oxidantes qumicos, -O2 e OH so produtos normais do processo oxidativo. Entidades com eltrons no pareados e com propriedades reativas so denominadas radicais. Esses radicais podem ser prejudiciais quando produzidos em grande quantidades e no neutralizados pelos antioxidantes (superxido dismutase, catalase, glutatatio peroxidase, vitamina E, coenzima Q, carotenides, vitamina C). Esse processo pode levar ao dano de lipdios de membranas celulares, DNA, protenas e outras macromolculas.(11) Tem sido proposto que mutaes no DNAmt e mudanas na bioenergtica celular contribuem para o processo de envelhecimento e ao desenvolvimento de doenas degenerativas. A capacidade de fosforilao oxidativa diminui com a idade devido ao acmulo de DNA mitocondrial e/ou nuclear defeituoso. A produo de ATP pode cair abixo do nvel crtico de

24 funcionamento da clula. Alm disso, a concentrao de RNAm e RNAr mitocondrial diminui com a idade em corao e crebro de ratos e est associada com diminuio de 50% da taxa de transcrio. Como sinal do envelhecimento, o nmero de fibras dos msculos esquelticos e cardaco citocromo c oxidase negativas aumentam com a idade, e a atividade enzimtica dos complexos I e IV diminuem progressivamente no msculo esqueltico humano e fgado. Alm disso, evidncias tm sido apresentadas para mudanas relacionadas idade nos nveis de coenzima Q em diversos tecidos humanos e de ratos.(11) A falncia de rgos em uma doena com dficit na fosforilao oxidativa est relacionada maior ou menor necessidade de ATP do tecido. Nesses casos os rgo mais afetados so: sistema nervoso central (SNC), msculo esqueltico, rim, fgado, retina e ilhotas pancreticas(11). No MERRF, as manifestaes clnicas so principalmente relacionadas falncia de tecidos nervoso e muscular.(31) O SNC obtm sua energia quase exclusivamente da fosforilao oxidativa e consome uma grande quantidade de oxignio. O perxido de hidrognio produto de vrias enzimas de importncia no SNC e da autooxidao de diversas substncias endgenas. Qualquer distrbio no equilbrio entre oxidao e antioxidao no SNC pode comprometer a eficincia do transporte de eltrons. Isso poderia diminuir a disponibilidade de funes celulares como as do canais de K ATP-dependente, bombas de Ca, bombas de Na/K, exocitose e vrios processos de fosforilao. Outro possvel processo que leva ao stress oxidativo no SNC poderia envolver o neurotransmissor excitatrio glutamato. Ativao de receptores de glutamato em culturas de tecido leva a um desbalano na oxidao/antioxidao, oque pode acompanhar um dano acumulativo ao DNA, protenas e lipdios e eventualmente degenerao neuronal.(11) Sabe-se que no mecanismo das convulses, participam as sinapses excitatrias que empregam glutamato e reas de morte celularpode desenvolver sinapses hiperexcitveis novas que so capazes de gerar convulses.(3) No msculo esqueltico, a proliferao mitocondrial leva formao de fibras vermelhas anfractuosas parece ser desencadeada por um desequilbrio entre a necessidade de enregia e a eficincia da oxidao/ fosforilao da fibra muscular.(3)

25 Mutaes deletrias do DNAmt apresentaria, como seu ltimo efeito, uma diminuio da produo de ATP. Nesse sentido, uma das mais intrigantes questes como uma especfica mutao de ponto produz uma perda de funo celular em um tecido especfico causando uma doena diferente da causada por outra mutao do DNAmt.(10)

6.4. Herana A mutao G8344A classificada como uma mutao do DNAmt moderadamente deletria, portanto com severidade moderada dos sintomas. Uma mutao moderadamente deletria apresenta prognstico pior do que mutaes menos deletrias e mais rapidamente eliminada por seleo. So, portanto, mutaes relativamente recentes, que aparecem em diferentes hapltipos de DNAmt, e so freqentemente heteroplsmicas.(6) genes nucleares, polimorfismos mitocondriais, idade, sexo e fatores ambientais, apesar de pouco estudados, tambm tm um papel na expresso fenotpica das mutaes de DNAmt.(1) As mutaes em ponto do DNAmt, so herdadas exclusivamente pela linhagem materna
(1, 32)

, ao contrario de rearranjos de DNAmt que so espordicos e no so transmitidos a geraes

subseqentes7. As mutaes de genes de RNAt so geralmente heteroplsmicas e assim como outras mutaes de DNAmt necessitam que o nvel crtico de DNAmt mutante deve ser excedido para a expresso da doena (limiar de expresso). Uma mulher que apresenta uma mutao heteroplsmica do DNAmt pode transmitir uma pequena quantidade de DNAmt mutante para um filho (que pode no ser clinicamente afetado) e uma alta carga de mutao para outro filho ( que pode desenvolver achados clnicos de doena do DNAmt)
(1, 32)

. Como resultado, existe uma

variao extensiva genotpica e fenotpica entre os componentes de uma mesma famlia. Em mes com <40% de DNAmt mutante para A8344G no RNAtLys no sangue, a prole no foi afetada. Acima desse nvel, mes com maiores nveis de DNAmt mutante em seu sangue apresentaram uma maior proporo de filhos afetados, atingindo um mximo de 78% de prole afetada para mes com 80% ou mais de DNAmt mutado no sangue. Mes com 80% ou mais de DNAmt mutante no sangue apresentaram 22,56 vezes mais chances de terem um filho afetado do que mes com <60% de DNAmt mutante no sangue. Esses resultados indicam tambm que mes com alto nvel de A8344G so ainda capazes de terem filhos.(32)

26 As mutaes A3243G (MELAS) e A8344G (MERRF), ambas envolvem genes de RNAt mitocondrial e elas tm efeitos similares sobre a funo da cadeia respiratria mas apresentaram diferenas entre o risco de transmisso da mutao de me para filho. Essas diferenas podem ser reflexo de diferentes expesses das duas mutaes em indivduos afetados, e no por diferentes mecanismos de transmisso das molculas de DNAmt. Mecanismos moleculares patognicos diferentes ou diferentes padres de segregao tecidual podem contribuir para essas diferenas.essa variabilidade pelo menos em parte devida reduo e posterior proliferao dos genomas mitocondriais no ocito em desenvolvimento.(32, 33)

6.5. Correlao Gentipo/Fentipo A mutao 8344 RNAtLys como muitas mutaes RNAt, ocorre em um estado heteroplsmico: o paciente com MERRF carrega alelos mutantes e normais do gene. Essa mutao tambm est sujeita segregao replicativa, ento as manifestaes clnicas variam marcadamente entre os parentes maternos.(6) A proporo de DNA mutante varia entre indivduos com MERRF e entre tecidos do mesmo indivduo. Os parentes do probando que carrega a mutao no so freqentemente afetados, ou podem exibir somente sintomas mais leves como perda de audio e ataxia. Esses parentes geralmente tm uma menor proporo de DNAmt mutante do que o probando(6,
10)

. Essas diferenas podem ser explicadas por duas variveis: a

porcentagem de DNAmt mutante herdada e a idade do paciente.(6) Uma anlise detalhada das associaes entre apresentao clnica, defeito bioqumico e gentipo do DNAmt em uma grande famlia com MERRF e mutao G8344A revelou uma forte correlao entre gentipo e fentipo quando a idade fosse tambm uma varivel. Dentre os que tivessem 19 a 24 anos de idade nesta famlia, um indivduo com 15% do DNAmt normal no msculo esqueltico obteve uma capacidade enrgetica mitocondrial muscular, como determinado atividade enzimtica de fosforilao oxidativa e fentipo normal, exibindo somente leves mudanas ao eletroencefalograma. Em contraste, um com 20 anos de idade com somente 5% de DNAmt muscular obteve reduzida capacidade de energia mitocondrial e sintomas mais severos, com o probando apresentando menos de 25% da capacidade energtica muscular normal. Similarmente, parentes maternos com 40 a 50 anos de idade com 10% de DNAmt normal

27 mostrou maior capacidade de energia muscular e fentipos mais leves comparado com indivduos mais velhos com metade do nvel de DNAmt normal que exibiram metabolismo energtico diminudo e sintomas severos.(2) Essas observaes suportam a hiptese de que em famlias que carregam mutaes moderadamente deletrias, como a G8344A, os parentes da me permanecem relativamente noafetados at que a segregao meitica ou mutao somtica aumente a porcentagem de DNAmt mutante para atingir o limiar de expresso(6).A maior severidade dos problemas clnicos de um sujeito mais velho com o mesmo gentipo de DNAmt reflete um achado geral de doenas devidas a mutaes no DNAmt comprometendo a sntese proteica, mostrando retardo no aparecimento das manifestaes e aumento progressivo com a idade, com a idade de incio refletindo a porcentagem de DNAmt mutante na herana individual.(2) Estudos in vitro com linhagens de clulas com RNAt mutante e normal coexistindo na mesma mostraram que a mutao A8344G causa um defeito na cadeia respiratria mitocondrial e dficit na sntese proteica mitocondrial, promovido quando um especfico limiar (~85%) de DNAmt mutante atingido. Como o nvel de DNA mutante varia entre os indivduos, e tambm entre rgos e tecidos em um indivduo, geralmente aceitvel que a variao na proporo do DNAmt mutante o principal fator responsvel pela variada expresso clnica dos defeitos de DNAmt. Entretanto um estudo mostrou uma discrepncia entre o limiar de 85% para a expresso bioqumica do DNAmt mutante e o limiar para a expresso clinica. Essa disparidade provavelmente resultado do mosaicismo celular dos nveis de DNAmt mutante. A funo tima de qualquer rgo dependente da interao de numerosas clulas. A disfuno de um pequeno grupo de clulas interagindo pode, no entanto, levar falncia do rgo, e embora os nveis de DNAmt mutante possa ser alto em clulas mal funcionantes, o nvel mdio no tecido pode ser baixo. Por isso, indivduos com <60% DNAmt mutante no tecido nervoso central e msculo esqueltico podem ter uma profunda sndrome neurolgica incapacitante.(31)

28

7. Aspectos Clnicos

Os pacientes com MERRF podem ser normais durante os anos iniciais do desenvolvimento. Contudo, com o tempo desenvolvem epilepsia mioclnica e ataxia progressiva associadas disartria e nistagmo; alguns tem atrofia ptica. Alguns pacientes apresentam anormalidades da sensibilidade profunda e p cavo. Sinais menos comuns incluem demncia, perda auditiva, neuropatia perifrica e espasticidade. A deteriorao intelectual lentamente progressiva . A exemplo da MELAS , um nmero significativo de pacientes tem histria familiar positiva e baixa estatura. (1) Em um estudo comparativo entre as frequncias dos sintomas entre MELAS e MERRF observou-se que haviam diferenas estatisticamente significativas entre os seguintes sintomas: AVC de repetio, diabetes melito , retinopatia pigmentar, miopatia , lipoma, atrofia tica, neuropatia, ataxia e mioclonia. No foram detectadas diferenas significativas entre fraqueza, demncia , epilepsia e estatura baixa. (31) As frequncias observadas para cada manifestao clnica do MERRF foram as seguintes: acidente vascular cerebral de repetio l%: CPEO (oftalmo plegia crnica progressiva externa) 6%; diabetes melito 3%; retinopatia pigmentar 0%, fraqueza 39%, demncia 25%; epilepsia 43%, miopatia 70%, estatura baixa 13%, lipoma 8%, atrofia tica 13%, neuropatia 24%, ataxia 50% e mioclonia 61%.(31)

29

8. Diagnstico nas Doenas Mitocondriais

8.1. Diagnstico Clnico A suspeita clnica diante de possvel doena mitocondrial deve ser incitada no profissional da rea da sade sempre que determinados sinais e sintomas estiverem presentes. Como as doenas mitocondriais atingem inmeros rgos, a apresentao geralmente sistmica. Praticamente todos os tecidos do organismo dependem, em diferentes graus, do metabolismo oxidativo, podendo ser afetados por mutaes no DNA mitocondrial. Desta forma, os pacientes freqentemente procuram auxlio devido s manifestaes sistmicas, sendo esta a primeira chance de se considerar a doena mitocondrial como hiptese diagnstica (22). No caso da apresentao multissistmica, um paciente com acidose ltica congnita, que estivesse, hipoteticamente, associada disfuno no transporte intramitocondrial de eltrons, manifestaria logo nos primeiros dias de vida: dificuldades para ganhar peso, hipotonia generalizada, atraso nas aquisies neurolgicas e, provavelmente, hospitalizao por descompensao metablica. Alm disso, poderia se apresentar com cardiomiopatia, ptose, surdez neurossensorial, disfuno tubular renal e progredir para o bito por insuficincia ventilatria at os 18 meses de vida (1). As manifestaes neurolgicas das doenas mitocondriais, envolvendo tanto os sistemas nervoso central e perifrico so amplamente conhecidas, uma vez que o crebro o rgo mais suscetvel privao de oxignio. A sintomatologia clnica pode incluir atraso do

30 desenvolvimento psicomotor, convulses, encefalopatia, mioclonias, surdez, acidente vascular cerebral, ataxia cerebelar e neuropatia perifrica (1). Menos conhecidos so os sinais no-neurolgicos das doenas mitocondriais. Manifestaes oftalmolgicas so muito comuns, envolvendo praticamente todo o sistema visual: da crnea at os msculos extra-oculares e o crtex occipital. Os principais sinais so oftalmoplegia, neuropatia tica, retinopatia pigmentar e defeitos no campo visual cortical(22).. Achados relacionados ao sistema cardaco tambm so comuns, podendo representar risco vida. Tais achados se relacionam com os achados musculares da doena, que tambm podem se manifestar por, apenas, intolerncia a exerccios e mioglobinria. Na musculatura cardaca, apresentam-se as arritmias, bloqueio cardaco, morte sbita e miocardiopatia hipertrfica, que se inicia com hipertrofia septal e se acompanha de apnia, dispnia, cianose e bronquite no perodo neonatal. A evoluo desfavorvel e rapidamente fatal(22).. As manifestaes endcrinas so freqentes e a incidncia do diabete melitus alta. Clulas da ilhota pancretica so extremamente ativas metabolicamente sendo, portanto, suscetveis falha na fosforilao oxidativa. Diabetes associado mutaes no DNA mitocondrial principalmente causado por um defeito na secreo de insulina (22). Manifestaes gastrointestinais das doenas mitocondriais incluem pseudo-obstruo colnica, hepatopatia e perda de peso. Manifestaes renais que sugerem tais doenas so nefrite tubular intersticial, sndrome nefrtica e insuficincia renal, dificilmente como achado isolado e sim, associado a manifestaes neuromusculares. Entretanto, o achado renal mais freqente a tubulopatia renal proximal (Fanconi renal) (1). Finalmente, doenas mitocondriais podem apresentar-se hematologicamente atravs da Sndrome de Pearson, uma doena rara, com incio na infncia, e que cursa com anemia sideroblstica, insuficincia do pncreas excrino, em muitos casos evoluindo para pancitopenia com xito letal.

31 8.2. Diagnstico Histopatolgico O msculo o tecido ideal para a investigao morfolgica e bioqumica dos efeitos patognicos das mutaes no DNA mitocondrial, por terem essas clulas grandes necessidades energticas e um ndice muito baixo de renovao. Os doentes com doenas mitocondriais apresentam freqentemente as fibras vermelhas rotas (ragged red fibers), obtidas atravs de cortes de criostato, corados pelo tricrmio de Gomori, ficando com aparncia avermelhada pelo acmulo anormal de mitocndrias sob a membrana sarcolemal, destacando-se nitidamente da colorao normal esverdeada do sarcoplasma. A presena de fibras vermelhas rotas no ocorre em todos os casos, mas, quando aparece, quase patognmonico de patologia mitocondrial.(1).

8.3. Diagnstico Bioqumico Determinao do Estado de Oxirreduo no Plasma: A alterao neste estado conseqncia da deficincia funcional do ciclo de Krebs, devido ao excesso de NADH e falta de NAD com elevao secundria do lactato srico, corpos cetnicos e da relao lactato/piruvato nos afetados. Isso particularmente notado nos perodos ps absortivos, quando mais NAD necessrios para adequado metabolismo dos substratos glicolticos. Da mesma maneira, em conseqncia da deficincia do ciclo de Krebs, a sntese de corpos cetnicos aumenta aps as refeies, ao invs de diminuir, devido ao direcionamento da acetilCoA para cetognese. Portanto, a triagem para os defeitos genticos da fosforilao oxidativa, como j foi descrito, deve incluir a determinao de lactato, piruvato e corpos cetnicos. Quando a acidemia ltica estiver elevada, haver indicao para determinao do lactato no lquor e para determinao da respectiva razo L/P aps o teste de sobrecarga de glicose. (1) Atividade das Enzimas Respiratrias Mitocondriais: Diante dos ndices de oxirreduo alterados, deve-se seguir para a investigao da atividade enzimtica, idealmente realizada em tecido muscular fresco. Essas investigaes incluem a medida do consumo de oxignio pela mitocndria isolada, chamada de polarografia e a dosagem da atividade enzimtica de cada complexo da cadeia respiratria por espectrofotometria. Simultaneamente dosagem enzimtica

32 dos complexos, importante determinar a atividade da enzima do ciclo de Krebs, citrato sintetase. (1)

8.4. Diagnstico Molecular Deteco de Delees, Duplicaes e Deplees: habitualmente realizadas pela tcnica de Southern Blot que fornece informao quanto quantidade de DNA mitocondrial presente, presena/ausncia de delees ou duplicaes e sobre a proporo de DNA mitocondrial mutado no caso de uma mutao heteroplsmica. A quantificao do DNA mitocondrial presente num determinado tecido tambm efetuada pelo mtodo de Southern-Blot . (1) Mutaes de Ponto: detectveis atravs do estudo de polimorfismos de comprimentos de fragmentos de restrio (RFLP) de regies do DNA mitocondrial que tenham sido amplificadas por PCR. As mutaes novas podem ser detectadas atravs do estudo de polimorfismos de conformao de cadeia nica e seqenciamento do DNA mitocondrial. O diagnstico diferencial deve levar em conta outras doenas multissistmicas que cursam com cardiopatia, cardiomiopatias, surdez neurossensorial e surdez induzida por aminoglicosdeos. (1) Sobre o estudo de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrio: pouco aps a aplicao do Southern-blot no final da dcada de 70, descobriu-se que nem todas as pessoas possuem a mesma distribuio de stios de enzima de restrio. Embora se pudesse predizer a existncia de alguma variao de nucleotdios pelo que se sabia sobre mutao e polimorfismos de protenas, o grau de variao detectado pelo Southern-blot foi uma surpresa. (1) Como as enzimas de restrio tm seqncias de reconhecimento especficas no DNA, as alteraes da seqncia do DNA genmico que decorrem de mutao hereditria ou nova acarretam a criao ou abolio de stios de clivagem, desse modo alterando o tamanho de um ou mais fragmentos de DNA evidentes aps o Southern-blot e hibridizao com uma sonda de DNA clonada. Como se dispe de vrias centenas de enzimas de restrio para deteco de uma grande variedade de seqncias de reconhecimento de quatro a oito pares de bases, esse mtodo permite um exame extenso da seqncia de nucleotdios na vizinhana imediata de uma dada sonda de DNA clonado. As variaes nos stios de restrio do DNA detectadas desta maneira

33 que se denominam polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrio. Os variados comprimentos dos fragmentos constituem alelos codominantes num locus do DNA. Assim, podese examinar um Southern-blot e interpretar esses diferentes comprimentos como um reflexo do gentipo (a seqncia de DNA) num determinado stio de restrio. Os RFLPs tambm podem surgir de deleo ou insero de DNA, em vez de alteraes de nucleotdios isolados. Se um segmento de DNA entre dois stios de restrio for deletado ou inserido, o resultante tamanho do fragmento de restrio diferente.(24)

8.5. Diagnstico Imagtico Geralmente feito por Tomografia Computadorizada ou Ressonncia Magntica; em tais estudos, observam-se alteraes patolgicas como leucodistrofia, calcificaes, atrofia cortical e leses simtricas em gnglios da base, sendo estas tpicas da encefalopatia de Leigh. A atrofia do nervo ptico pode ser observada em pacientes com LHON, NARP e MILS (1).

8.6. Diagnstico Pr-Natal O diagnstico pr-natal uma rea pouco abordada na literatura atual que versa sobre doenas mitocondrias. cadeia respiratria Mtodos moleculares para diagnstico pr-natal ainda no esto disponveis. Cogita-se que o diagnstico pr-natal poderia ser feito analisando atividades da que, por sua vez, seriam melhor demonstradas atravs da cultura de amnicitos e do vilo corinico, colhidos atravs da amniocentese e fragmentos de vilosidades corinicas, respectivamente(34). Mesmo assim, o diagnstico pr-natal mostraria-se confivel apenas para investigao de doenas mitocondriais em famlias que os pais so consagneos e o defeito fosse demonstrado em cultura de fibroblastos. Um vis observvel em tais casos o fato da amostra no abranger todas as mitocndrias das clulas, uma vez que as doenas mitocondriais obedecem um limiar de expresso, e seria necessrio observar a porcentagem total de clulas mutantes, e no apenas uma amostra(34).

34

9. Aconselhamento Gentico

Aconselhamento gentico para desordens da cadeia respiratria permanece como uma das mais desafiadoras reas no campo da gentica humana. Quando a desordem aparece somente em um membro da famlia afetada, no h histria familiar de consaguinidade e no identificada mutao em outro DNA mitocondrial ou nuclear, impossvel predizer com confiana o provvel risco de recorrncia e precisa-se de outros recursos para obter dados de riscos empricos (34). sugerido que o risco de recorrncia para descendncia de mulheres afetadas onde a mutao no conhecida na ordem de 10 a 20%, enquanto que o risco para descendncia de homens afetados de 1 a 2% (34). Uma mulher na qual uma mutao especfica do DNA mitocondrial foi identificada teria um alto risco de recorrncia na sua descendncia , mas como nvel de heteroplasmia no sempre relacionado com a severidade da doena, tem sido impossvel prever com confiana a severidade da doena em um feto identificado com esta mutao (34). Com tecnologias mais refinadas na manipulao tecidual e tecnologias reprodutivas agora possvel analisar o genoma mitocondrial de um nico ovcito ou em embries em fase de pr-implantao para auxiliar na previso do risco de recorrncia em mulheres (34) . De qualquer forma, impossvel dizer com certeza se a criana apresentar ou no a doena quando for identificada mutao no DNAmt. Isso ocorre porque no sabemos se todas as mitocndrias de uma clula esto mutadas ou se todas as clulas apresentam mutao no seu DNAmt.

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10. Tratamento

Tratamentos efetivos e especficos para doena mitocondrial ainda no esto disponveis. Tratamentos como o diettico com suplementao de vitaminas e co-fatores e o tramento com frmacos parecem ajudar alguns pacientes, mas no tem sucesso com outros (35). As estratgias de tratamento visam corrigir o funcionamento anormal da cadeia respiratria , reduzindo a presena dos agentes txicos ou corrigindo a deficincia de co-fatores essenciais (1). O principal objetivo aumentar a produo de ATP. Para isso, uma variada gama de substncias tem sido usada, tanto em casos nicos quanto em estudos de casos- controles. O grupo de medicamentos mais investigado o da coenzima Q e seus derivados quinona, com vrias observaes relatando regularizao do piruvato e do lactato nos pacientes com diversas formas de mitocondriopatias. Entretanto, diversos relatos no evidenciaram resposta laboratorial ou clnica ao uso destes compostos. Os aceptores de eltrons como a menadiona (vitamina K 3) e filoquinona (vitamina K1) e o cido ascrbico (vitamina C) tem sido usados no sentido de melhorar o transporte de eltrons na cadeia respiratria, porm com resultados clnicos insatisfatrios. A riboflavina (vitamina B2) na dose de 50-100 miligramas dia age como co-fator nos complexos I e II. O dicloroacetato originalmente usado como hipoglicemiante oral tambm tem sido usado com algum sucesso na reduo das taxas de lactato e piruvato, sendo conhecido por estimular o metabolismo oxidativo do tecido cardaco (1). O dicloroacetato estimula a piruvato desidrogenase, resultando em diminuio dos nveis de cido ltico em quase todos os pacientes tratados. Seu uso restrito a crianas e adultos com altos nveis de cido ltico no sangue ou lquido cerebroespinhal. Tratamento com dicloroacetato

36 apropriado somente em casos de acidose ltica primria. Alguns tipos de doena mitocondrial so particularmente responsivas a esse tratamento, especialmente a MELAS. Infelizmente, o tratamento tem efeitos adversos significativos, como leso de nervos perifricos, necessitando de cuidadosa monitorao. Em alguns pacientes, estes efeitos adversos limitam o uso do dicloroacetato.(35)

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