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Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

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Published by: Dalvania Pinho Domingues on May 14, 2009
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PCR e Eletroforese de Nucleotídeos

Dalvania Pinho Domingues Fralini dos Santos Marcilio Gabriel Machado Carvalho Leonardo Teles Faber Patricia de Sá Almeida Rita de Cássia Costa de Carvalho

Kary Banks Mullis

PCR

PCR=Polymerase Chain Reaction
Reação em Cadeia da Polimerase –técnica que utiliza a enzima DNA polimerase ,responsável pela síntese de DNA ,para amplificar in vitro,qualquer segmento de DNA utilizado como molde através de ciclos .

PCR amplifica uma sequência alvo:

Sequência alvo

Histórico

 

1983 – Kary Banks Mullis. Reação em cadeia da polimerase. Conceito de primer 1987– Primeira publicação:Science. 1989 – Automação do processo pelo uso do primeiro termociclador automático. 1983 – Prêmio Nobel de Química:Kary Banks Mullis

Princípios

Consiste de três etapas: Denaturação– 95 ºC por 30 segundos Anelamento-ligação dos primers(64ºC) Polimerização-síntese de cadeia complementar de DNA

Princípios
Requer: DNA molde DNA polimerase termoestável 2 primers Deoxinucleotídeos trifosfato(dNTPs) Cátion divalente(MgCl2) Tampão Termociclador

Ciclos:são repetidos de 30 a 45 vezes.

Limitações
  

 • • • • • •

Contaminação por DNA estranho Incorporação errônea de bases Difícil aplicação a sequências maiores que 500 Daltons Inibidores: Fenol Proteinase K Agentes quelantes em excesso(EDTA) Hemoglobinas e outras proteínas das hemácias SDS(dodecil sulfato de sódio) Elevadas concentrações de sal

Aplicações
1.Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros) 2.Seleção de clones recombinantes, com primers complementares a seqüências do vetor. 3.Sequenciamento direto de produtos amplificados

Aplicações

4.Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas) 5.Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos 6.Diagnóstico pré-natal em caso de risco

Aplicações

7.Elucidar relações evolutivas entre espécies, utilizando material arqueológico 8.Na Medicina Forense,análises em cenas de crimes (impressão digital de DNA-Fingerprint) 9.Teste de paternidade

Avanços

Utilização de DNA polimerase termoestável(Taq polimerase) Novas DNA polimerases(Pfu DNA polimerase,Tli DNA polimerase,Vent DNA polimerase) Novas estratégias de análise(Nested PCR,Touchdown PCR,Inverse PCR,PCRELISA,Multiplex PCR,HotStart PCR,RT-PCR,PCRCompetitiva.)

Eletroforese

Eletroforese de Nucleotídeos
Método padrão para análise,identificação e purificação de fragmentos de DNA ou RNA que diferenciam-se em tamanho ou conformação.

Histórico
1933-Tiselius:eletroforese para separar proteínas em solução 1955-Smithies:géis de amido para separar proteínas do soro Frederick Sanger:análise completa da insulina bovina 1956-Ingran:primeiro mapa peptídico 1959-Raymond:géis de poliacrilamida 1966-Maizel:uso de SDS 1975-O´Farrel:gel bidimensional 1981-Jorgenson e Lukacs :Eletroforese Capilar(EC)

Princípios

 

Aplicação de uma diferença de potencial Migração de partículas em um determinado gel Separação molecular na amostra Visualização das “bandas”

Princípios
 • • •

• •

Requer: Amostra(livre de contaminação) Gel (agarose ou poliacrilamida) Tampão(TBE:Tris-Borato EDTA e TAE:TrisAcetato EDTA) Equipamento para Eletroforese Corantes:Prata,Ponceau,Azul de Bromofenol,Xileno-Cianol. Ladders(marcadores de tamanho)

Visualização

Eletroforese Capilar

Limitações

Taxa de migração do DNA nos géis de agarose 1.Tamanho molecular do DNA 2.Concentração da agarose 3.Conformação do DNA 4.Presença de Brometo de Etídio 5.Voltagem aplicada 6.Tipo de agarose 7.Tampão

Limitações

Não é adequada para determinação de compostos voláteis,não-polares e de massa molar baixa(menores que 200 Daltons) Não é adequada para polímeros nãoiônicos com massa molar alta(maiores que 500 Daltons)

Aplicações

Sequenciamento de DNA(eletroforese capilar) Separação de misturas complexas de macromoléculas

Avanços
 

  

Western blotting Eletroforese Capilar em Solução Livre(ECSL) Eletroforese Capilar em Gel(ECG) Eletrocromatografia Capilar Micelar(ECCM) Eletroforese Capilar com Focalização Isoelétrica(ECFI) Isotacoforese Capilar(IC)

Vídeos

PCR Teste de paternidade

Referências
Alberts B, Jonhson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004. http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf (Acesso em 08 de agosto de 2008) http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm (Acesso em:18 de agosto de 2008 http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html (Acesso em 18 de agosto de 2008) http://www.etall.hpg.com.br (Acesso em 18 de agosto de 2008)

Discussão

Porque foi tão importante o desenvolvimento da PCR? É possível extrair-se DNA de um fio de cabelo,uma célula do epitélio oral ou de uma gota de sangue? A eletroforese de nucleotídeos é mais simples do que a de proteínas?

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