Manual de Bacteriologia Da Tuberculose (81 080909 SES MT)

Manual de Bacteriologia
da Tuberculose
Ministrio da Sade
Secretaria de Vigilncia em Sade
Centro de Referncia Professor Hlio Fraga
Manual de Bacteriologia da Tuberculose
3 Edio
Edio comemorativa
Rio de Janeiro
2005
Produo
Paisagem Editorial
Projeto Grfico
Noel Rabacov
Reviso
Beatris Nunes da Silva
Fotografias
Csar Duarte
Catalogao na fonte
Maria de Lourdes Lima
Coordenao:
Centro de Referncia Professor Hlio Fraga
Estrada da Curicica, 2000 Jacarepagu - Rio de Janeiro/RJ
Tel.: (55) (021) 2448-6872
e-mail - crphf@saude.gov.br
angela.werneck@saude.gov.br
FICHA CATALOGRFICA

Brasil. Ministrio da Sade. Secretaria de Vigilncia em Sade. Centro de Referncia Prof. HlioFraga.
Manual de Bacteriologia da Tuberculose / Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade,
Centro de Referncia Prof. Hlio Fraga, Departamento de Vigilncia Epidemiolgica, Coordenao
Geral de Laboratrios de Sade Pblica. 3 ed. Edio comemorativa Rio de Janeiro: 2005.

240p. il.

1.Tuberculose. 2. Laboratrio - Diagnstico clnico. 3. Biossegurana. I. Brasil. Ministrio da Sade.
II. Secretaria de Vigilncia em Sade. III. Centro de referncia Prof. HlioFraga. IV. Departamento de
Vigilncia Epidemiolgica . V. Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica . VI.Ttulo.

CDD: 616.995076 - 19 ed.

3 EDIO - EDIO COMEMORATIVA - COORDENAO E ELABORAO
TCNICOS DO CENTRO DE REFERNCIA PROFESSOR HLIO FRAGA
Angela Maria Werneck Barreto
Carlos Eduardo Dias Campos
Ftima Moreira Martins
Paulo Csar de Souza Caldas
COLABORAO
Helio Lionel
Marinez Francisco da Silva
2 EDIO - COORDENAO E ELABORAO -
TCNICOS DO CENTRO DE REFERNCIA PROFESSOR HLIO FRAGA
Carlos Eduardo Dias Campos
Ftima Moreira Martins
Clara Leda Gonalves Menezes (digitao)
COLABORAO
Clara Eliane do Nascimento Barreto - Laboratrio Central de Sade Pblica Noel Nutels Dalair
Antonia Neto de Souza Coordenao Geral do Sistema de Laboratrios de Sade Pblica
Francisco Jos de Almeida Oliveira - Laboratrio Central de Sade Pblica Noel Nutels
Leila de Souza Fonseca - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Lizete Schaefer Bezem - Laboratrio Central de Sade Pblica de Santa Catarina
Luzia Tavares Marques Vieira - Laboratrio Central de Sade Pblica de Santa Catarina
Obaida Ale Freire - Coordenao Nacional do Sistema de Laboratrios de Sade Pblica
Paulo Pinto Gontijo Filho - Universidade Federal do Rio de Janeiro
Terezinha de Jesus Maia Vieira - Instituto de Sade do Distrito Federal
1 EDIO - ELABORAO
Alonso Favero Kopke - Fundao Ezequiel Dias
Augusto da Costa Santiago - Instituto de Tisiologia e Pneumologia da UFRJ
Ernesto Leibovich - Diviso Nacional de Pneumologia Sanitria
Ivo de Paula Soares - Sanatrio Partenon
Jos Bencio Nunes de Miranda - Instituto Adolfo Lutz
Jos Messias Dias Filho - INAMPS
Laerte Manhes de Andrade - Diviso Nacional de Pneumologia Sanitria
Milton Fontes Magaro - Fundao Ataulpho de Paiva
Paulo Pinto Gontijo Filho - Instituto de Microbiologia da UFRJ
Srgio Magaro - Faculdade de Cincias Mdicas do Rio de Janeiro
in memorian
MINISTRIO DA SADE
Humberto Costa Lima
SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE
Jarbas Barbosa da Silva Jr.
CENTRO DE REFERNCIA PROFESSOR HLIO FRAGA
Miguel Aiub Hijjar
SERVIO DE LABORATRIO
APRESENTAO
Neste ano o Laboratrio de Referncia Nacional comemora seus 21 anos com a 3 edio do
Manual de Bacteriologia da Tuberculose, em plena maturidade, abordando as tcnicas utilizadas em
sua rotina com uma roupagem que antev atender s tendncias da sociedade globalizada no mbito
da qualidade total.
No decorrer destes anos, nossas atividades permitiram desenvolver projetos de interesse nacional
de vigilncia da tuberculose, alm da capacitao de recursos humanos da rede pblica, assim como
a introduo e o aprimoramento das tcnicas fundamentais para o diagnstico bacteriolgico da
tuberculose nestes laboratrios de sade pblica. As pesquisas realizadas em colaborao com esta
rede permitiu, alm da gerao de conhecimento especfico, uma real integrao e consolidao
destas unidades.
Esta rede mantm-se atravs de um trabalho de fortalecimento e aprimoramento constante destas
atividades e sobretudo da nossa prpria experincia, sendo repassada para estes laboratrios.
A biossegurana e a gesto da qualidade so os componentes essenciais que esto sendo perseguidos
pela rede de laboratrios na busca pela qualidade total, dentro dos requisitos gerais para competncia
de laboratrios de ensaio e calibrao, que a norma NBR ISO/IEC 17025 dispe. Neste particular o
laboratrio de referncia vem trabalhando na elaborao e implementao de procedimentos
operacionais padronizados, utilizando tambm reagentes de qualidade comprovada, certificada, assim
como instrumentos aferidos e com o selo da Rede Brasileira de Calibrao.
Com a implantao do laboratrio em novas dependncias segundo os padres internacionas de
biossegurana em 2005, vamos dar um passo decisivo para servir como um novo paradigma para a
rede laboratorial de sade pblica, preocupado com a segurana humana e ambiental nos aspectos
mais amplos possveis.
Chefe do Laboratrio de Referncia Nacional
O controle da tuberculose no pas, hoje definido como prioridade de governo, vem sendo
acompanhado de implementao nas reas de preveno, diagnstico e tratamento.
As recomendaes de Programa Nacional de Controle da Tuberculose PNCT- de realizar culturas
e testes de sensibilidade para todos os pacientes de retratamento, reforam a necessidade de um
manual que oriente adequadamente os procedimentos laboratoriais.
Esperamos que este Manual de Bacteriologia contribua para o esforo do PNCT, difundindo
conhecimento e garantindo a qualidade.
Miguel Aiub Hijjar
Diretor do CRPHF
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1- BIOSSEGURANA
1.1- INTRODUO...................................................................................................................................................... 17
1.2- RISCO DE INFECO NO PESSOAL DO LABORATRIO............................................................................. 17
1.3- COMISSO DE BIOSSEGURANA E COMIT DA QUALIDADE .................................................................. 17
1.4- GERENCIAMENTO DE RESDUOS .................................................................................................................... 18
1.5- RECOMENDAES GERAIS ............................................................................................................................... 18
1.5.1- PARA O PESSOAL ............................................................................................................................................ 18
1.5.2- REFERENTES AO LABORATRIO ............................................................................................................... 19
1.6- SEGURANA BIOLGICA .................................................................................................................................. 19
1.6.1- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL (EPIS) ........................................................................... 19
1.6.2- EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA (EPCS) ............................................................................. 20
1.6.3- ANTI-SPTICOS E DESINFETANTES ........................................................................................................... 20
1.6.4- COMO PROCEDER EM CASO DE ACIDENTE ........................................................................................... 20
1.7- PROJETO ARQUITETNICO DO LABORATRIO (BARREIRA SECUNDRIA) ....................................... 21
1.8- SEGURANA QUMICA ....................................................................................................................................... 22
1.8.1- MANIPULAO DE PRODUTOS QUMICOS ........................................................................................... 22
1.8.1.1- Produtos Txicos ........................................................................................................................................................... 22
1.8.1.2- Produtos Corrosivos ..................................................................................................................................................... 22
1.8.1.3 - Produtos Qumicos Especiais (perxidos, cloratos, percloratos, nitratos, etc.) .......................................................... 23
1.8.1.4- Produtos Pirofricos ...................................................................................................................................................... 23
1.8.1.5- Cilindros de Gs Comprimido .................................................................................................................................... 24
1.8.1.6- Armazenamento de Produtos Qumicos ....................................................................................................................... 24
1.8.1.7- Derramamentos Acidentais de Produtos Qumicos ..................................................................................................... 24
1.8.2- EQUIPAMENTOS DE SEGURANA E EMERGNCIA ............................................................................... 25
1.8.3- EQUIPAMENTO DE PROTEO COLETIVA ............................................................................................ 25
1.8.3.1- Cabines de Exausto de Gases ....................................................................................................................................... 25
1.8.3.2- Chuveiro de Emergncia ............................................................................................................................................... 25
1.8.3.3- Lavador de Olhos .......................................................................................................................................................... 25
1.8.3.4- Extintores de Incndio .................................................................................................................................................. 26
1.8.4- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL ...................................................................................... 26
1.8.4.1- Aventais ......................................................................................................................................................................... 26
1.8.4.2- Luvas ............................................................................................................................................................................. 26
1.8.4.3- Botas de Segurana ........................................................................................................................................................ 26
1.8.4.4- culos de Segurana e Protetores Faciais ....................................................................................................................... 27
1.8.4.5- Mscara de Proteo Respiratria ................................................................................................................................... 27
1.8.4.6- Mantas Corta-Fogo ........................................................................................................................................................ 27
1.8.5- PROCEDIMENTOS EM SITUAES DE EMERGNCIA .......................................................................... 27
1.8.5.1- Recomendaes Gerais ................................................................................................................................................... 27
1.8.5.2- Incndio: Fontes, Classes e Combate ............................................................................................................................ 29
1.9- BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................................... 29
ANEXOS
FIGURA 1- CABINE DE SEGURANA BIOLGICA CLASSE II - BII .......................................................................................... 30
FIGURA 2- PICTOGRAMAS INDICATIVOS DO TIPO DE PERICULOSIDADE DOS REAGENTES ...................................... 30
FIGURA 3- PLANTA DE UM LABORATRIO NB3 ......................................................................................................................... 31
TABELA 1- SUBSTNCIAS QUMICAS PERIGOSAS E USO DE EPIs ............................................................................................ 32
TABELA 2- SUBSTNCIAS QUMICAS, CLASSIFICAO E INCOMPATIBILIDADE ............................................................. 33
TABELA 3- TIPOS DE EXTINTORES DE INCNDIO E SUA UTILIZAO............................................................................... 34
2- GERENCIAMENTO DE AMOSTRAS
2.1- INTRODUO...................................................................................................................................................... 37
2.2- COLHEITA DE ESCARRO .................................................................................................................................... 37
2.2.1- ESCARRO DE EXPECTORAO .................................................................................................................. 37
2.2.1.1- Qualidade e Quantidade da Amostra ............................................................................................................................ 37
2.2.1.2- Recipiente ...................................................................................................................................................................... 37
2.2.1.3- Local da Colheita ........................................................................................................................................................... 37
2.2.1.4- Momento da Colheita e Nmero de Amostras ............................................................................................................. 37
SUMRIO
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2.2.1.5- Orientao ao Paciente ................................................................................................................................................... 38
2.2.1.6- Lavado Gstrico ............................................................................................................................................................. 38
2.2.1.7- Lavados Brnquicos (trqueo-brnquico, broncoalveolar) ........................................................................................... 38
2.2.1.8- Expectorao Induzida ................................................................................................................................................... 38
2.3- COLHEITA DE OUTROS MATERIAIS................................................................................................................ 39
2.3.1- URINA ............................................................................................................................................................... 39
2.3.2- LQUIDOS ASSPTICOS (Lquor, Lquidos Pleural, Asctico, Sinovial, Pericrdico, Peritoneal) .................... 39
2.3.3- MATERIAL DE RESSECO, BIPSIA ......................................................................................................... 39
2.3.4- PUS .................................................................................................................................................................... 39
2.3.5- SANGUE ............................................................................................................................................................ 39
2.3.6- FEZES ................................................................................................................................................................ 39
2.4- CONSERVAO E TRANSPORTE....................................................................................................................... 40
2.5- RECEPO DE AMOSTRAS ................................................................................................................................ 40
2.5.1- MATERIAL CLNICO ...................................................................................................................................... 40
2.5.2- CULTURAS ....................................................................................................................................................... 40
2.6- CRITRIOS DE ACEITAO E REJEIO DE AMOSTRAS ............................................................................ 40
2.7- ARMAZENAMENTO ............................................................................................................................................ 41
2.8- ENVIO DE MATERIAIS ......................................................................................................................................... 41
2.9- AMOSTRAS-TIPO ................................................................................................................................................. 41
2.10- BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................................................... 43
3- BACILOSCOPIA
3.1- IMPORTNCIA ..................................................................................................................................................... 47
3.2- PREPARAO ....................................................................................................................................................... 47
3.3- RECOMENDAES DE BIOSSEGURANA .................................................................................................... 48
3.4- PROCEDIMENTOS ............................................................................................................................................... 48
3.4.1- MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN................................................................................... 48
3.4.1.1- Princpio ........................................................................................................................................................................ 48
3.4.1.2- Solues ......................................................................................................................................................................... 48
3.4.1.2.1- Fucsina Fenicada a 0,3% .................................................................................................................................... 48
3.4.1.2.2- Fenol Aquoso ...................................................................................................................................................... 48
3.4.1.2.3- Azul de Metileno a 0,1%.................................................................................................................................... 48
3.4.1.2.4- Soluo Descorante .............................................................................................................................................. 48
3.5- TCNICA ................................................................................................................................................................ 49
3.6- LEITURA E INFORME DE RESULTADOS ...................................................................................................... 49
3.7- MATERIAL UTILIZADO ...................................................................................................................................... 50
3.8- CONTROLE DE QUALIDADE............................................................................................................................. 51
3.8.1- FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR O RESULTADO GERAL DO EXAME ...................................... 52
3.9- ILUSTRAES ...................................................................................................................................................... 52
3.10- BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................................... 53
ANEXOS
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DO FENOL LQUIDO PARA O MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN .. 54
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES PARA O MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN.......... 55
4- CULTURA
4.1- INDICAO........................................................................................................................................................... 59
4.2- PROCEDIMENTOS DE ISOLAMENTO.............................................................................................................. 59
4.3- MTODOS DE DESCONTAMINAO .............................................................................................................. 59
4.3.1- MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO ............................................................................................ 60
4.3.1.1- Indicao ........................................................................................................................................................................ 60
4.3.1.2- Solues ......................................................................................................................................................................... 60
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4.3.1.2.1- Soluo Descontaminante e Fluidificante (Soluo A) ..................................................................................... 60
4.3.1.2.2- Soluo Neutralizante (Soluo B) ................................................................................................................... 60
4.3.1.2.3- Soluo de Azul de Bromotimol ou Prpura de Bromocresol a 0,4% (Soluo C) ....................................... 60
4.3.1.3- Procedimento ................................................................................................................................................................. 60
4.3.2- MTODO DE CORPER & STONER, MODIFICADO (6) ........................................................................... 61
4.3.2.1- Indicao ........................................................................................................................................................................ 61
4.3.2.2- Solues ......................................................................................................................................................................... 61
4.3.2.2.1- Soluo de Fosfato Trissdico a 23% (Soluo A) ........................................................................................... 61
4.3.2.2.2- Soluo de Fosfato Monossdico a 20% (Soluo B) ...................................................................................... 61
4.3.2.2.3- Procedimento ...................................................................................................................................................... 61
4.4- MEIOS DE CULTURA ........................................................................................................................................... 61
4.4.1- MEIO DE LOWENSTEIN JENSEN (LJ) ......................................................................................................... 62
4.4.1.1- Preparao de 1 Frmula (1.600ml de meio base) ...................................................................................................... 62
4.4.2- MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM PIRUVATO (PI) ................................................................................ 62
4.4.3- MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL (CFA) ..................................... 63
4.4.3.1- Preparao ...................................................................................................................................................................... 63
4.4.4- MEIO LQUIDO 7H9 DE MIDDLEBROOK ................................................................................................ 63
4.4.4.1- Preparao da Base ......................................................................................................................................................... 63
4.4.4.2- Enriquecimento ADC ................................................................................................................................................... 63
4.4.4.2.1- Preparao ........................................................................................................................................................... 63
4.4.5- MEIO LQUIDO 7H9 DE MIDDLEBROOK COM SPS .............................................................................. 64
4.4.5.1- Preparao ...................................................................................................................................................................... 64
4.4.6- INCUBAO E LEITURA DE RESULTADOS ............................................................................................... 64
4.5- BIOSSEGURANA ................................................................................................................................................ 65
4.6- MATERIAL NECESSRIO..................................................................................................................................... 65
4.7- ILUSTRAES ...................................................................................................................................................... 66
4.8- BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................................... 67
ANEXOS
QUADRO 1- COMPOSIO DOS PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO E CRESCIMENTO
DE MICOBACTRIAS ......................................................................................................................................................................... 68
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES PARA O MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO.............. 69
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAODO INDICADOR DE pH PARA O MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO .. 70
FICHA 3- CONTROLE DO REAGENTE A PARA O MTODO DE CORPER-STONER................................................................. 71
FICHA 4- CONTROLE DO REAGENTE B PARA O MTODO DE CORPER-STONER ................................................................ 72
FICHA 5- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA LOWENSTEIN JENSEN ......................................................... 73
FICHA 6- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE LOWENSTEIN JENSEN COM PIRUVATO DE SDIO .......................... 74
FICHA 7- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL........ 75
FICHA 8- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9 ............................................................ 76
FICHA 9- CONTROLE DA PREPARAO DO ENRIQUECIMENTO ADC ..................................................................................... 77
FICHA 10- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9 COM SPS ................................ 78
FICHA 11- LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS .................................................................................................................. 79
5- IDENTIFICAO DE MICOBACTRIA
5.1- CARACTERSTICAS GERAIS DAS MICOBACTRIAS ...................................................................................... 83
5.2- ESPCIES DE INTERESSE EM PATOLOGIA HUMANA ................................................................................... 83
5.3- BIOSSEGURANA ................................................................................................................................................ 83
5.4- IDENTIFICAO DAS ESPCIES ........................................................................................................................ 84
5.5- TEMPO DE CRESCIMENTO E PRODUO DE PIGMENTO......................................................................... 85
5.5.1- PRINCPIO ....................................................................................................................................................... 85
5.5.2- TCNICA........................................................................................................................................................... 85
5.5.3- LEITURA E INTERPRETAO ...................................................................................................................... 85
5.5.4- RESULTADO .................................................................................................................................................... 86
5.6- CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES INIBIDORES ......................................................................... 86
5.6.1- INDICAO ..................................................................................................................................................... 86
5.6.2- PREPARAO E TCNICA ............................................................................................................................. 86
5.6.4- CONTROLE DE QUALIDADE ....................................................................................................................... 87
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5.7- CRESCIMENTO EM GELOSE NUTRITIVA ........................................................................................................ 87
5.7.1- INDICAO ..................................................................................................................................................... 87
5.7.2- PREPARAO .................................................................................................................................................. 87
5.7.2.1- Meio de Cultura ............................................................................................................................................................ 87
5.7.3- TCNICA........................................................................................................................................................... 87
5.7.4- LEITURA ........................................................................................................................................................... 87
5.8- CRESCIMENTO EM AGAR MacCONKEY .......................................................................................................... 88
5.8.1- INDICAO ..................................................................................................................................................... 88
5.8.2- PREPARAO .................................................................................................................................................. 88
5.8.2.1- Meio de Cultura ............................................................................................................................................................ 88
5.8.3- TCNICA........................................................................................................................................................... 88
5.9- CRESCIMENTO EM MEIO COM CLORETO DE SDIO A 5%....................................................................... 88
5.9.1- PRINCPIO ....................................................................................................................................................... 88
5.9.2- PREPARAO .................................................................................................................................................. 89
5.9.3- TCNICA........................................................................................................................................................... 89
5.10- PRODUO DE NIACINA ................................................................................................................................. 89
5.10.1- PRINCPIO E INDICAO........................................................................................................................... 89
5.10.2- PREPARAO ................................................................................................................................................ 90
5.10.2.1- Soluo Salina a 0,85% ............................................................................................................................................... 90
5.10.3- TCNICA ......................................................................................................................................................... 90
5.10.4- LEITURA E INTERPRETAO .................................................................................................................... 90
5.10. 5- CONTROLE DE QUALIDADE .................................................................................................................... 90
5.11- REDUO DO NITRATO .................................................................................................................................. 91
5.11.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 91
5.11.2- SOLUES .................................................................................................................................................... 91
5.11.2.1- Soluo Substrato (soluo de nitrato de sdio 0,01 M em tampo fosfato 0,022 M, pH 7,0) ............................... 91
5.11.2.2- Reativos ....................................................................................................................................................................... 91
5.11.2.3- Escala Padro Para Leitura ........................................................................................................................................... 91
5.11.3- TCNICA ......................................................................................................................................................... 92
5.11.5- CONTROLE DE QUALIDADE..................................................................................................................... 93
5.12- CATALASE A 68C ............................................................................................................................................... 93
5.12.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 93
5.12.2- SOLUES .................................................................................................................................................... 93
5.12.2.1- Soluo de Tampo Fosfato M/15, pH 7,0 segundo Soerensen ................................................................................ 93
5.12.2.2- Perxido de Hidrognio a 30% ou 110 volumes (Superoxol, Perhidrol) ................................................................. 93
5.12.2.3- Soluo de TWEEN 80 a 10%................................................................................................................................... 93
5.12.2.4- Soluo Reveladora ...................................................................................................................................................... 93
5.12.3- TCNICA ......................................................................................................................................................... 94
5.13- BETA-GLICOSIDASE .......................................................................................................................................... 94
5.13.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 94
5.13.2- SOLUES .................................................................................................................................................... 94
5.13.2.1- Soluo Substrato ........................................................................................................................................................ 94
5.13.2.2- Soluo de Tampo TRIS a 0,05 m ............................................................................................................................ 95
5.13.3- TCNICA ......................................................................................................................................................... 95
5.14- HIDRLISE DO TWEEN 80 ............................................................................................................................... 95
5.14.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 95
5.14.2- PRINCPIO ..................................................................................................................................................... 95
5.14.3- SOLUES .................................................................................................................................................... 96
5.14.3.1- Soluo Substrato ........................................................................................................................................................ 96
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5.14.4- TCNICA......................................................................................................................................................... 96
5.14.5- LEITURA......................................................................................................................................................... 96
5.15- CAPTAO DO FERRO ..................................................................................................................................... 96
5.15.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 96
5.15.2- PREPARAO ................................................................................................................................................ 97
5.15.3- TCNICA......................................................................................................................................................... 97
5.16- UREASE ................................................................................................................................................................ 97
5.16.1- INDICAO E PRINCPIO........................................................................................................................... 97
5.16.2- PREPARAO ................................................................................................................................................ 97
5.16.3- TCNICA......................................................................................................................................................... 97
5.17- UTILIZAO DE ACARES (INOSITOL- MANITOL- CITRATO DE SDIO) ......................................... 98
5.17.1- INDICAO ................................................................................................................................................... 98
5.17.2- PREPARAO ................................................................................................................................................ 98
5.17.2.1- Meio Base .................................................................................................................................................................... 98
5.17.2.2- Soluo de Acares ..................................................................................................................................................... 99
5.17.2.2.1- Soluo de Inositol ou Manitol ......................................................................................................................... 99
5.17.2.2.2- Soluo de Citrato de Sdio .............................................................................................................................. 99
5.17.3- TCNICA......................................................................................................................................................... 99
5.18- REDUO DO TELURITO DE POTSSIO...................................................................................................... 99
5.18.1- PRINCPIO DO TESTE ................................................................................................................................. 99
5.18.2- INDICAO ................................................................................................................................................. 100
5.18.3- PREPARAO .............................................................................................................................................. 100
5.18.3.1- Meio Lquido de 7H-9 de Middlebrook. ................................................................................................................. 100
5.18.3.2- Soluo de Telurito de Potssio a 0,2%..................................................................................................................... 100
5.18.4- TCNICA....................................................................................................................................................... 100
5.18.5- LEITURA E INTERPRETAO .................................................................................................................. 100
5.18.6- CONTROLE DE QUALIDADE................................................................................................................... 101
5.19- ARILSULFATASE ................................................................................................................................................ 101
5.19.1- INDICAO ................................................................................................................................................. 101
5.19.2- SOLUES .................................................................................................................................................. 101
5.19.2.1- MEIO LQUIDO DE 7H-9 DE MIDDLEBROOK ............................................................................................ 101
5.19.2.2- SOLUO SUBSTRATO ....................................................................................................................................... 101
5.19.2.3- SOLUO REVELADORA (Carbonato de sdio 2N) ......................................................................................... 101
5.19.3- PREPARAO .............................................................................................................................................. 101
5.19.4- TCNICA....................................................................................................................................................... 102
5.19.5- LEITURA E INTERPRETAO .................................................................................................................. 102
5.19.6- CONTROLE DE QUALIDADE................................................................................................................... 102
5.20- ILUSTRAES................................................................................................................................................... 102
5.21- BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................................................. 105
ANEXOS
ESQUEMA 1- PREPARAO DA ESCALA PADRO PARA A LEITURA DO NITRATO ......................................................... 107
ESQUEMA 2- PREPARAO DOS REATIVOS DA -GLICOSIDADE ........................................................................................ 107
ESQUEMA 3- PREPARAO DO MEIO PARA UTILIZAO DOS AUCARES ..................................................................... 107
TABELA 1- IDENTIFICAO DAS MICOBACTRIAS CLINICAMENTE MAIS IMPORTANTES ........................................ 108
FICHA 1- RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA ................................................................................................. 109
FICHA 2- CONTROLE DOS REAGENTES PARA CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES INIBIDORES ............. 110
FICHA 3- RESULTADO DE LEITURA DO TESTE DE CRESCIMENTO EM AGENTES INIBIDORES .................................. 111
FICHA 4- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE GELOSE NUTRITIVA ........................................................................ 112
FICHA 5- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE GAR MacCONKEY SEM CRISTAL VIOLETA .............................. 113
FICHA 6- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM NaCl ................................................. 114
FICHA 7- CONTROLE DE PREPARAO DA SOLUO SUBSTRATO PARA A PROVA DA REDUO DO NITRATO ... 115
FICHA 8- CONTROLE DE PREPARAO DOS REAGENTES REVELADORES DA PROVA DA REDUO DO NITRATO ... 116
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FICHA 9- CONTROLE DA PREPARAO DO AZUL DE BROMOTIMOL A 1%................................................................... 117
FICHA 1O- CONTROLE DE PREPARAO DOS REAGENTES PARA LEITURA DA PROVA DA REDUO DO NITRATO . 118
FICHA 11- CONTROLE DA PREPARAO DO TWEEN 80 PARA A PROVA DA CATALASE .......................................... 119
FICHA 12- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES PARA A PROVA DA CATALASE ...................................... 120
FICHA 13- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES PARA A PROVA DA BETA-GLICOSIDASE ................. 121
FICHA 14- CONTROLE DA PREPARAO DO TAMPO PARA A PROVA DA BETA-GLICOSIDASE........................ 122
FICHA 15- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DO VERMELHO NEUTRO A 0,1% ........................................ 123
FICHA 16- CONTROLE DA PREPARAO DO SUBSTRATO PARA A PROVA DA HIDRLISE DO TWEEN 80 ....... 124
FICHA 17- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL... 125
FICHA 18- CONTROLE PREPARAO DO MEIO DE CULTURA PARA A PROVA DA UTILIZAO DE AUCARES ... 126
FICHA 19- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DOS ACARES ........................................................................ 127
FICHA 20- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9 ................................................ 128
FICHA 21- CONTROLE DA PREPARAO DO REAGENTE PARA A PROVA DA REDUO DO TELURITO DE POTSSIO . 129
FICHA 22- CONTROLE DA PREPARAO DO SUBSTRATO PARA A PROVA ARILSULFATASE....................................... 130
FICHA 23- CONTROLE DA PREPARAO DO CARBONATO DE SDIO PARA A PROVA DA ARIL SULFATASE .... 131
FICHA 24- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO DE CULTURA COM SUBSTRATO DA PROVA ARILSULFATASE .... 132
6- TESTE DE SENSIBILIDADE DE M.TUBERCULOSIS AOS ANTIBITICOS E QUIMIOTERPICOS
6.1- INTRODUO.................................................................................................................................................... 135
6.2- INDICAO......................................................................................................................................................... 135
6.3- METODOLOGIA................................................................................................................................................. 135
6.4- MTODO DAS PROPORES ......................................................................................................................... 135
6.4.1- PRINCPIO ..................................................................................................................................................... 135
6.4.2- PREPARAO DO MEIO COM DROGAS ................................................................................................. 136
6.4.2.1- Meio com Pirazinamida ............................................................................................................................................... 136
6.4.3- TCNICA......................................................................................................................................................... 137
6.4.3.1- Preparao da Suspenso Bacilar, Diluio e Semeadura ............................................................................................. 137
6.4.3.1.1- Teste Indireto .................................................................................................................................................... 137
6.4.3.1.2- Teste Direto ....................................................................................................................................................... 138
6.4.3.2- Incubao ..................................................................................................................................................................... 138
6.4.3.3- Leitura e Interpretao ................................................................................................................................................. 138
6.4.3.4- Controle de Qualidade ................................................................................................................................................ 139
6.5- BIOSSEGURANA .............................................................................................................................................. 140
6.6- MATERIAL UTILIZADO .................................................................................................................................... 140
6.7- BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................... 142
ANEXOS
ESQUEMA 1- PREPARAO DO MEIO COM DROGAS ............................................................................................................. 143
ESQUEMA 2- PREPARAO DE INCULO E SEMEADURA DO TESTE INDIRETO .......................................................... 145
ESQUEMA 3- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE DIRETO .............................................................................. 146
ESQUEMA 4- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE ............................................................................................... 146
ESQUEMA 5- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE DIRETO .............................................................................. 146
FICHA 1- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AS DROGAS ... 148
FICHA 2- CONTROLE DOS REAGENTES PARA CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES INIBIDORES ............. 149
FICHA 3- CONTROLE DOS RESULTADOS DE LEITURA DO TESTE DE SENSIBILIDADE/AGENTES INIBIDORES .... 150
7- MTODO AUTOMATIZADO (MB/BacT) PARA O TESTE DE SENSIBILIDADE
7.1- INTRODUO.................................................................................................................................................... 153
7.2- PRNCIPIO E INDICAO................................................................................................................................. 153
7.3- TESTE DIRETO ................................................................................................................................................... 153
7.3.1- TCNICA......................................................................................................................................................... 154
7.4- TESTE INDIRETO ............................................................................................................................................... 154
7.4.1- TCNICA......................................................................................................................................................... 154
7.5- CONCENTRAO DAS DROGAS .................................................................................................................... 155
7.6- LEITURA E INTERPRETAO.......................................................................................................................... 156
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7.7- CONTROLE DE QUALIDADE........................................................................................................................... 156
7.8- BIOSSEGURANA .............................................................................................................................................. 156
7.9- MATERIAL ........................................................................................................................................................... 157
7.10- ILUSTRAES................................................................................................................................................... 158
7.11- BIBLIOGRAFIA.................................................................................................................................................. 158
ANEXOS
ESQUEMA 1- PREPARAO DO INCULO E SEMEADURA NO TESTE DIRETO ............................................................... 160
ESQUEMA 2- PREPARAO DO INCULO E SEMEADURA NO TESTE INDIRETO .......................................................... 161
ESQUEMA 3- DROGAS USADAS NO MB/BACT............................................................................................................................ 162
ESQUEMA 4- DROGAS ESPECIAIS PARA USO NO MB/BACT ................................................................................................... 163
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DE REAGENTES PARA TESTE DE SENSIBILIDADE S DROGAS ................ 164
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO ACIDIFICADORA PARA TESTE DO PZA (MB/BacT) .......... 165
FICHA 3- LEITURA DO TESTE NO MB/BACT .............................................................................................................................. 166
8- CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO DE MICOBACTERIOLOGIA
8.1- INTRODUO.................................................................................................................................................... 169
8.2- RECOMENDAES GERAIS ............................................................................................................................. 169
8.3- EQUIPAMENTOS DO LABORATRIO ........................................................................................................... 170
8.3.1- AUTOCLAVE .................................................................................................................................................. 170
8.3.2- CABINE DE SEGURANA BIOLGICA (CSB) .......................................................................................... 171
8.3.2.1- Descontaminao da CSB............................................................................................................................................ 171
8.3.3- CENTRFUGA ............................................................................................................................................... 171
8.3.4- CABINE DE EXAUSTO QUMICA (CEQ) ................................................................................................. 172
8.3.5- ESTUFA BACTERIOLGICA (36 1 C) ................................................................................................... 172
8.3.6- MICROSCPIO............................................................................................................................................. 173
8.3.7- COAGULADOR ............................................................................................................................................. 173
8.3.8- GELADEIRA (2-8C) ...................................................................................................................................... 173
8.3.9- FREEZERS (0 A -70C) .................................................................................................................................. 173
8.3.10- BALANA ANALTICA DE PRECISO ...................................................................................................... 173
8.3.11- MB/BACT ...................................................................................................................................................... 174
8.4- VIDRARIA ............................................................................................................................................................ 174
8.5- MANUTENO DE AMOSTRAS-TIPO DE MICOBACTRIAS .................................................................... 174
8.6- TCNICAS LABORATORIAIS ............................................................................................................................ 175
8.6.1- BACILOSCOPIA ............................................................................................................................................. 175
8.6.2- MEIO DE CULTURA ..................................................................................................................................... 175
8.6.3- DESCONTAMINAO DE ESPCIMES .................................................................................................... 175
8.6.4- TESTE DE SENSIBILIDADE.......................................................................................................................... 176
8.6.5- IDENTIFICAO ........................................................................................................................................... 176
8.7- BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................... 176
ANEXOS
FICHA 1- CONTROLE DE QUALIDADE DA GUA DEIONIZADA ......................................................................................... 177
FICHA 2- CONTROLE DE ESTERILIZAO POR AUTOCLAVE ............................................................................................... 178
FICHA 3- MANIPULAO NA CSB ................................................................................................................................................ 179
FICHA 4- CONTROLE DA DESCONTAMINAO DA CSB ...................................................................................................... 180
FICHA 5- MANIPULAO NA CEQ............................................................................................................................................... 181
FICHA 6- CONTROLE DE TEMPERATURA DA ESTUFA BACTERIOLGICA ....................................................................... 182
FICHA 7- CONTROLE DE TEMPERATURA DO SOROCOAGULADOR .................................................................................. 183
FICHA 8- CONTROLE DE TEMPERATURA DA GELADEIRA ..................................................................................................... 184
FICHA 9 - CONTROLE DE TEMPERATURA DO FREEZER......................................................................................................... 185
FICHA 10- CONTROLE DA SOLUO DE FENOL LQUIDO PARA O MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN .. 186
FICHA 11- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES PARA O MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN... 187
FICHA 12- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA LOWENSTEIN JENSEN .............................................. 188
FICHA 13- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9 ................................................. 189
FICHA 14- NDICE DE CONTAMINAO .................................................................................................................................... 190
FICHA 15- CONTROLE DOS REAGENTES PARA TESTE DE SENSIBILIDADE S DROGAS ............................................... 191
FICHA 16- LEITURA DE RESULTADO DO TESTE DE SENSIBILIDADE ................................................................................... 192
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9- REGISTRO DE EXAMES E FLUXO DE RASTREABILIDADE
9.1- REGISTRO DE INFORMAO ......................................................................................................................... 195
9.2- FLUXO E RASTREABILIDADE DOS EXAMES REALIZADOS ....................................................................... 195
9.2.1- FICHA 1 ESPCIME CLNICO PARA CULTURA, IDENTIFICAO E/OU TESTE DE SENSIBILIDADE .. 195
9.2.2- FICHA 2 CULTURAS ENCAMINHADAS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE E/OU IDENTIFICAO ..... 196
9.2.3- FICHA 3 CULTURAS PARA REALIZAO DO TESTE DE SENSIBILIDADE ...................................... 196
9.2.4- FICHA 4 LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS DE CULTURA ................................................ 196
9.2.5- FICHA 5 LEITURA E REGISTRO DE RESULTADO DE TESTE DE SENSIBILIDADE ........................ 196
9.2.6- FICHA 6 RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA .............................................................. 196
9.2.7- FICHA 7 RESULTADO DE LEITURA DO TESTE DE CRESCIMENTO EM AGENTES INIBIDORES 196
9.2.8- FICHA 8 RESULTADO DOS EXAMES DO LABORATRIO ................................................................. 197
9.2.9- FICHAS PARA PEDIDO DE EXAMES .......................................................................................................... 197
9.3- BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................................... 197
ANEXOS
FICHA 1- ESPCIME CLNICO PARA CULTURA, IDENTIFICAO E /OU TESTE DE SENSIBILIDADE ....................... 198
FICHA 2- CULTURAS ENCAMINHADAS PARA: ........................................................................................................................... 199
FICHA 3- CULTURAS PARA REALIZAO DO TESTE DE SENSIBILIDADE ......................................................................... 200
FICHA 4- LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS DE CULTURA ....................................................................................... 201
FICHA 5- LEITURA E REGISTRO DE RESULTADO DO TESTE DE SENSIBILIDADE ............................................................ 202
FICHA 6- RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA ................................................................................................. 203
FICHA 7- RESULTADOS DE LEITURA DO TESTE DE SENSIBILIDADE AOS AGENTES INIBIDORES ............................. 204
FICHA 8- RESULTADO DOS EXAMES DO LABORATRIO ....................................................................................................... 205
FICHA 9- SOLICITAO DE BACILOSCOPIA E DE CULTURA ................................................................................................ 206
FICHA 10- SOLICITAO DE IDENTIFICAO E/OU TESTE DE SENSIBILIDADE .......................................................... 207
10- SOLUES E REAGENTES. MATERIAL UTILIZADO NO LABORATRIO
10.1- INTRODUO.................................................................................................................................................. 211
10.2- SEGURANA QUMICA ................................................................................................................................... 211
10.3- LCOOL ETLICO A 70% (3) ........................................................................................................................... 211
10.3.1- SOLUO .................................................................................................................................................... 211
10.3.1.1- Preparao .................................................................................................................................................................. 211
10.4- LCOOL ETLICO A 70% (4) ........................................................................................................................... 211
10.4.1- SOLUO .................................................................................................................................................... 211
10.4.1.1- Preparao .................................................................................................................................................................. 212
10.5- SOLUO DE HIPOCLORITO DE SDIO A 2% (3) .................................................................................... 212
10.5.1- SOLUO .................................................................................................................................................... 212
10.5.1.1- Preparao .................................................................................................................................................................. 212
10.6- SOLUO DE LCOOL IODADO .............................................................................................................. 212
10.6.1- SOLUO ESTOQUE ................................................................................................................................ 212
10.6.1.1- Preparao .................................................................................................................................................................. 212
10.6.1.2- Soluo de Uso .......................................................................................................................................................... 212
10.7- SOLUO TAMPO FOSFATO, SEGUNDO SOERENSEN ( 1 ) .................................................................. 213
10.7.1- PREPARO DAS SOLUES ....................................................................................................................... 213
10.7.1.1. Soluo de Fosfato de Sdio M/15 ............................................................................................................................ 213
10.7.1.2- Soluo de Fosfato de Potssio M/15 ........................................................................................................................ 213
10.7.2- MONTAGEM DO TAMPO ....................................................................................................................... 213
10.8- ESCALA DE McFARLAND................................................................................................................................. 214
10.8.1- PREPARO DAS SOLUES ....................................................................................................................... 214
10.8.1.1- Soluo de Cloreto de Brio a 1%............................................................................................................................. 214
10.8.1.2- Soluo de cido Sulfrico a 1% .............................................................................................................................. 214
10.8.2- PREPARAO DA ESCALA......................................................................................................................... 214
10.9- SOLUO DE HCL 2 N ................................................................................................................................... 215
10.9.1- CLCULOS ................................................................................................................................................... 215
10.9.2- PREPARAO DA SOLUO DE HCl a 2N (200 ml) CIDO SOBRE A GUA ................................... 215
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10.10- UNIDADES DE MEDIDA ................................................................................................................................ 216
10.11.1- MEDIDAS DE COMPRIMENTO ............................................................................................................. 216
10.10.2- MEDIDAS DE PESO .................................................................................................................................. 216
10.10.3- MEDIDAS DE VOLUME ........................................................................................................................... 216
10.11- MATERIAL UTILIZADO NO LABORATRIO............................................................................................ 217
10.11.1- EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA .................................................................................... 217
10.11.2- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL ................................................................................ 217
10.11.2- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL ................................................................................ 218
10.11.3- OUTROS EQUIPAMENTOS .................................................................................................................... 218
10.11.4- REAGENTES ............................................................................................................................................... 219
10.11.5- MEIOS DE CULTURA ............................................................................................................................... 220
10.11.6- VIDRARIA ................................................................................................................................................... 220
10.11.7- OUTROS .................................................................................................................................................... 221
10.11.8- DESCRIO DETALHADA DOS PRINCIPAIS EQUIPAMENTOS ...................................................... 221
10.11.8.1- Cabine de Segurana Biolgica ............................................................................................................................... 222
10.11.8.2- Pipetador Automtico ............................................................................................................................................. 222
10.11.8.3- Microscpio Binocular ............................................................................................................................................ 223
10.11.8.4- Geladeira Para Laboratrio ...................................................................................................................................... 223
10.11.8.5- Freezer Para Laboratrio .......................................................................................................................................... 223
10.11.8.6- Centrfuga de Bancada ............................................................................................................................................ 223
10.11.8.7- Agitador de Tubos .................................................................................................................................................. 224
10.11.8.8- Autoclave Dupla Porta ............................................................................................................................................ 224
10.11.8.9- Bico Bunsen ............................................................................................................................................................ 225
10.11.8.10- Estufa de Bancada ................................................................................................................................................. 225
10.11.8.11- Cmara Para Sorocoagulao ................................................................................................................................. 225
10.11.8.12- Sistema de Esterilizao de Ar ............................................................................................................................... 225
10.12- PREVISO DE MATERIAL PARA COLORAO DE 1.000 LMINAS UTILIZANDO O MTODO
DE ZIEHL-NEELSEN ................................................................................................................................. 226
10.12.1- SUBSTNCIAS ............................................................................................................................................ 226
10.12.2- SOLUES ................................................................................................................................................ 226
10.13- BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................................ 226
ANEXOS
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DO LCOOL ETLICO A 70%.............................................................................. 227
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DE HIPOCLORITO DE SDIO A 2% ..................................... 228
FICHA 3- CONTROLE DA PREPARAO DO LCOOL IODADO ......................................................................................... 229
FICHA 4- CONTROLE DA PREPARAO DO TAMPO FOSFATO......................................................................................... 230
FICHA 5- CONTROLE DA PREPARAO DA ESCALA DE MacFARLAND ............................................................................. 231
FICHA 6- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DE HCl A 2N ................................................................................ 232
11- REDE NACIONAL DE LABORATRIOS DE SADE PBLICA
PARA A VIGILNCIA DA TUBERCULOSE
11.1-INTRODUO................................................................................................................................................... 235
11.2 - COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA NACIONAL..................................................... 235
11.3 - COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA REGIONAL ..................................................... 235
11.4- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA ESTADUAL ...................................................... 236
11.5- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA MUNICIPAL..................................................... 236
11.6- COMPETNCIAS DO LABORATRIO LOCAL............................................................................................ 237
11.7- COMPETNCIAS DOS CENTROS COLABORADORES .............................................................................. 237
11.8- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE FRONTEIRA ............................................................................ 237
11.9- REQUISITOS DE ELEGIBILIDADE PARA LABORATRIOS NOS DIVERSOS NVEIS ............................ 238
11.10- BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................................ 239
Captulo 1
BIOSSEGURANA
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1.1- INTRODUO
O laboratrio manipula o agente etiolgico da tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, M. bovis)
que est classificado como CLASSE III segundo a resoluo n. 1 de 1988 do Conselho Nacional de
Sade, Captulo X, Artigo 64 e pela Instruo Normativa n. 7 quando trata da classificao de riscos
de organismos geneticamente modificados e que tambm serve como guia para orientao nas medidas
de biossegurana para sua manipulao. As demais espcies desse gnero, que tm apresentado relevncia
em patologia humana no Brasil, esto includas no risco II e so geralmente manipuladas em
laboratrios de tuberculose. O CDC (Centers for Disease Control and Prevention) e o NIH (National
Institutes of Health) classificam os laboratrios para diagnstico clnico e/ou pesquisa de M. tuberculosis
no nvel 3 de biossegurana (NB3 ), nvel onde os agentes patognicos causam doenas que podem
ser fatais e que so transmitidas pela via aergena.
As precaues sobre segurana, sade e trabalho compreendem o uso de procedimentos de rotina
com normas de conduta bem estabelecidas, para que possam assegurar a validade e a preciso nos
resultados, a integridade dos tcnicos envolvidos, das instalaes fsicas, dos equipamentos e da
comunidade.
1.2- RISCO DE INFECO NO PESSOAL DO LABORATRIO
Estudos realizados no Brasil e no exterior demonstram que o pessoal da sade tem o risco de
infeco maior que o da populao geral e a incidncia de tuberculose no pessoal do laboratrio,
numa instituio de sade, trs a cinco vezes maior que entre o restante do pessoal. A principal via
de infeco a area, pois o indivduo se infecta atravs de aerossis - gotculas dessecadas de material
lquido contendo bacilos, com dimenses de 0,3 m e que ficam em suspenso no ar. Estes aerossis
so produzidos em grau variado pela manipulao no laboratrio, desde a abertura de potes de
escarro at a quebra de um tubo durante a centrifugao. O risco depende de quantos materiais ele
manipula, da concentrao de bacilos nesses e das boas prticas de biossegurana adotadas no
laboratrio.
O pessoal de laboratrio de NB3 deve ter um treinamento especfico para manipular agentes
patognicos e ser supervisionado por tcnicos competentes e com experincia nesse tipo de trabalho.
Ao serem admitidos, esses profissionais devem realizar a prova tuberculnica, segundo recomendao
das normas de controle da tuberculose.
1.3- COMISSO DE BIOSSEGURANA E COMIT DA QUALIDADE
Essas comisses, formadas por membros do laboratrio e outros da Instituio, so formadas para
assegurar a manuteno da qualidade do trabalho em bons nveis todo o tempo. A comisso da
biossegurana deve ter dois tcnicos em comum com o comit da qualidade. Na composio do
comit da qualidade esto tambm os chefes pelos setores do laboratrio, que esto certificados pelo
INMETRO. Todos os procedimentos operacionais padronizados (POPs), o Manual da Qualidade, o
Livro de Registro de Ocorrncias e outros registros estaro sempre a disposio dos tcnicos, nesta
setor. Alm disso, reunies peridicas de seus membros vo permitir os ajustes para garantir a qualidade
do trabalho.
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1.4- GERENCIAMENTO DE RESDUOS
O laboratrio de tuberculose tem que ter um plano de gerenciamento de resduos compatvel
com sua atividade, que vai integrar o processo de gerenciamento ambiental baseados nos princpios
da no gerao de resduos e na minimizao da gerao de resduos, que podem ser slidos e
lquidos de risco biolgico ou no, qumicos e aerossis.
O descarte dos resduos produzidos em um servio de sade esto regulamentados por dispositivos
legais que podem ser de mbito municipal, estadual e federal. As resoluo do CONAMA n 283/
2001 define procedimentos para o gerenciamento de resduos dos servios de sade e ainda est
em aprimoramento, atualizao e complementao.
Os resduos produzidos pelo laboratrio de tuberculose esto classificados no grupo A e B, pois
apresentam risco potencial a sade pblica e ao meio ambiente devido a presena de agentes
biolgicos (A) e produtos qumicos (B). As culturas semeadas e descartadas, assim como o material
clinico devero ser autoclavados e rejeitados como resduos slidos urbanos. Os reagentes das
reaes bioqumicas, depois de autoclavados e os corantes precisam ser diludos e neutralizados
para o descarte final no esgoto de guas servidas, segundo interpretao da Resoluo RDC ANVISA
n 33/2003.
1.5- RECOMENDAES GERAIS
1.5.1- PARA O PESSOAL
no permitido fumar, comer, beber, nem levar qualquer objeto boca, aos olhos ou ao nariz
nas reas de conteno do laboratrio ou em qualquer outro local que possa pr em perigo a
segurana ou a sade dos funcionrios e instalaes;
nunca pipetar com a boca;
trabalhar sempre com avental, luvas e mscaras adequados quele tipo de trabalho, assim como
pr-ps, toucas e proteo para barba tambm podem ser usados. Assim que se deixam as reas
de manipulao, esses equipamentos de proteo individual (EPIs) so colocados em cemitrio
para esterilizao;
no usar roupa de tecido sinttico, facilmente inflamvel. Usar calados fechados de couro ou
similar;
usar culos de segurana nos laboratrios, onde for obrigatrio;
no colocar materiais de laboratrio dentro de seu armrio de roupas e no utilizar vidraria de
laboratrio como utenslio domstico;
lavar cuidadosamente as mos, com bastante gua e sabo, antes de tomar qualquer refeio;
no colocar nenhum alimento nas bancadas, armrios e geladeiras dos laboratrios;
lentes de contato devem ser evitadas, pois podem ser danificadas por produtos qumicos,
causando leses graves; assim como proibido manipular usando anis, relgios, pulseiras etc;
no se expor a radiaes ultravioleta, infravermelha ou de luminosidade muito intensa, sem
proteo (culos com lentes filtrantes);
deve ser proibido testar amostras ou reagentes pelo gosto e pelos odores;
brincadeiras grosseiras so absolutamente proibidas nos laboratrios;
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pessoas com cabelos compridos devero prend-los atrs da cabea, ou usar algum tipo de
gorro ou touca; a barba deve ser mantida curta;
proibido trabalhar sozinho; uma outra pessoa serve como apoio para quem est manipulando,
principalmente se houver um acidente;
manter em todos os momentos uma atitude calma e cuidadosa. Devem-se usar sempre material
e equipamentos adequados;
proibido o uso de equipamentos sonoros. Os funcionrios de reas crticas precisam estar
atentos a qualquer rudo estranho sua volta, principalmente dos equipamentos que estejam
operando.
1.5.2- REFERENTES AO LABORATRIO
manter as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao trabalho;
rotular imediatamente qualquer reagente ou soluo recm-preparados, colocando a data da
preparao e o prazo de validade;
as amostras ou culturas recebidas devem ser imediatamente identificadas;
o acesso de visitantes ao laboratrio deve ser restrito. Caso haja visitas, elas devem ser
acompanhadas por um membro da equipe de trabalho e devem usar avental, proteo de ps e
cabea; nunca permitir a presena de visitas na reas de manipulao, assim como crianas em
laboratrios;
descartar vidrarias lascadas ou trincadas em recipientes assinalados e lacrados, assim como
agulhas e seringas, para serem recolhidos por pessoal da coleta de lixo urbana especializado;
utilizar sinais de advertncia apropriados quando condies perigosas puderem ocorrer;
sinalizar portas de salas de manipulao de agente etiolgico e de manipulao e estocagem de
produtos qumicos com os avisos internacionais que sero apresentados anexos.
1.6- SEGURANA BIOLGICA
Todo o material contaminado recebido na recepo dever ser registrado e transportado em carrinho,
em caixas de ao, fechadas com tampa, para ser classificado e armazenado em geladeiras, para
processamento posterior.
A manipulao deste material dever ser feita em rea NB3, com tcnica assptica apropriada e
EPIs e equipamentos de proteo coletiva (EPCs) compatveis (BARREIRAS PRIMRIAS).
1.6.1- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL (EPIS)
avental descartvel de mangas compridas, com punho sanfonado, sem botes, amarrado atrs,
fabricado com tyvek. Esse equipamento dever ser colocado no vestirio contguo rea NB3,
aps a retirada das roupas sociais, e dever ser descartado ao trmino do trabalho, num cemitrio,
imediatamente sada da rea NB3, passando pela barreira de conteno, quando o tcnico se
encaminhar para o banho. O pr-p, a touca etc. devero ser do mesmo material e colocados e
retirados da mesma maneira.
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luvas de ltex sem talco para manuseio de qualquer material na rea NB3, que devero ser
retiradas e colocadas no cemitrio na mesma ocasio da retirada do avental. Para as pessoas
alrgicas ao ltex, as luvas devero ser de vinil ou nitrila.
importante verificar se os EPIs tm CA (Certificado de Autorizao dado ao fabricante pelo
Ministrio do Trabalho);
os respiradores devem ter qualidade similar a N95 ou N99.
1.6.2- EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA (EPCS)
cabine de segurana biolgica classe II, B2 ou B3 (ver figura 1);
cabine de exausto de gases;
centrfuga com rotor fechado (aerossol free);
pipetador automtico;
autoclave de dupla porta;
cemitrios de ao inoxidvel;
extintores de incndio;
chuveiro de emergncia;
lava-olhos;
estantes e porta-tubos de ao inoxidvel;
carrinhos de ao inoxidvel;
caixas de ao inoxidvel para transportar culturas e espcimes.
1.6.3- ANTI-SPTICOS E DESINFETANTES
As solues anti-spticas mais utilizadas so o lcool etlico a 70%, o lcool-iodado ou uma
soluo degermante base de polivinil-iodo-pirrolidona (PVPI), adquirida no comrcio. Podem
ser utilizadas aps a retirada das luvas ou, se houver algum respingo de material contaminado na
pele. Para a desinfeco de bancadas e artigos recomenda-se soluo de hipoclorito de sdio com
2% de cloro livre, recm-preparada a partir de uma soluo concentrada (como a de 5% de cloro
livre), deixando em contato por pelo menos 30 minutos. Para as bancadas que sofrem com a ao
do hipoclorito de sdio, a desinfeco pode ser feita com o lcool etlico a 70%.
1.6.4- COMO PROCEDER EM CASO DE ACIDENTE
Um dos mais graves acidentes que ocorrem no laboratrio a quebra de um tubo contendo
cultura lquida, pela grande formao de aerossis. Em qualquer caso de quebra de frasco
contaminado, deve-se abandonar imediatamente o recinto para permitir que os aerossis se
assentem. Depois de transcorridos 30 minutos, retirar o tubo e os restos da cultura com a ajuda
de uma p de metal e de uma pina e colocar o contedo em cemitrio com tampa. Cobrir o
local com papel absorvente para fazer a conteno do material lquido que derramou e colocar
soluo de hipoclorito de sdio a 2% de modo que o o papel fique embebido, mas que no
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escorra. Deixar agir por 30 minutos. Depois desse tempo, retirar o papel e colocar no cemitrio.
Lacrar e rotular avisando da presena de cacos de vidro, para o pessoal da lavagem no se ferir
quando for abrir para descarte. Esterilizar a 121C por 20 minutos. Usar luvas, mscara e avental
para realizar esta operao. Mesmo com as mos enluvadas use uma vareta de madeira ou pina
de ao inox para recolher os cacos. No tente peg-los com as mos, pois poder se cortar e se
contaminar por perfurao, que um acidente mais grave ainda. Ao manusear material
contaminado contido em seringas, observar a regra principal, que a de no colocar a mo
oposta da seringa no frasco antes de introduzir a agulha para aspirar ou inocular suspenses, e
sim logo aps.
Ex: Antes de coletar suspenso num tubo 13x100mm de rosca, abrir a tampa com a mo esquerda
primeiramente. Introduzir a seringa dentro do tubo, e somente depois segurar o tubo para
completar a aspirao com segurana. Para inocular, repetem-se esses mesmos cuidados. As seringas
devem ser desprezadas num frasco de boca larga, com tampa de rosca, contendo hipoclorito de
sdio a 2%, colocando a agulha para baixo. Nunca tentar colocar a capa da agulha de volta.
Nunca tentar pegar a seringa de volta. Esse material (vidro + seringas), aps esterilizao a
121C em autoclave, descartado na coleta seletiva de lixo urbano para material hospitalar.
1.7- PROJETO ARQUITETNICO DO LABORATRIO
(BARREIRA SECUNDRIA)
Todo laboratrio deve ser projetado de acordo com normas e padres de segurana biolgica,
qumica, ergonmica etc., com especial ateno contaminaao do pessoal, a perigos com incndios
e exploses e tratamento de rejeitos biolgicos, qumicos, radioativos etc. Os aspectos a serem
considerados no projeto, relacionados com segurana, so a instalao de:
reas de manipulao de Nvel de Biossegurana 3 (NB3) com barreiras de conteno apropriadas;
reas de manipulao NB2, laboratrio qumico;
sala de recepo e armazenamento de amostras clnicas e culturas de microrganismos;
vestirios e banheiros para troca de roupas para manipulao;
fluxos de material e pessoal dentro do laboratrio;
sistema de comunicao interna, rede de computadores e software para controle de aparelhos,
material e exames realizados;
um sistema para deteco, extino prematura de incndio;
sala de estocagem de reagentes por categoria de perigo;
portas prova de fogo nas salas de manipulao e estocagem qumica;
luzes de emergncia e gerador;
uso de aparelhos prova de exploso (geladeira, freezer etc);
Cabines qumicas controladas por vlvulas e interruptores instalados fora da mesma e cabines de
segurana biolgica classe II B2 para manipulao de material contaminado;
chuveiros e lavaolhos;
reas e fluxos apropriados a coleta, armazenamento e processamento de rejeitos biolgicos, qumicos,
etc.
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1.8- SEGURANA QUMICA
Ao iniciar um trabalho em que sejam manipulados produtos qumicos importante conhecer
procedimentos de segurana que permitam uma atuao com um mnimo de riscos. As regras de
segurana funcionam melhor se as pessoas conhecem os equipamentos e mtodos empregados.
necessrio certificar-se de que os envolvidos entendem o significado das normas de segurana, para
criar atitudes uniformemente corretas no laboratrio. Alm do que importante um planejamento
prvio. Um trabalho que no foi submetido a um planejamento gera situaes de risco, alm de
causar prejuzos.
1.8.1- MANIPULAO DE PRODUTOS QUMICOS
1.8.1.1- Produtos Txicos
A manipulao de produtos txicos em laboratrio inevitvel e pode ser feita com
elevado grau de segurana, desde que se reconhea a toxicidade do produto que vai ser
manipulado. Na tabela 2 anexa -Substncias qumicas, classificao e incompatibilidades-
apresentamos os principais produtos qumicos utilizados num laboratrio de tuberculose,
como so classificados e como devem ser manipulados:
no manipular produtos txicos sem se certificar da toxicidade de cada um deles e dos
mecanismos de intoxicao;
trabalhar com produtos txicos somente na cabine;
no jogar qualquer produto txico nas pias sem o devido cuidado;
evitar o contato de produtos txicos com a pele.
Interromper o trabalho imediatamente caso tenha qualquer sintoma de intoxicao.
Dirigir-se ao ambulatrio mdico, acompanhado, e informar sobre as caractersticas do produto
envolvido.
1.8.1.2- Produtos Corrosivos
Lquidos corrosivos so responsveis tambm por incndios, quando postos em contato
com a matria orgnica e/ou determinados produtos qumicos.
s manipular produtos corrosivos usando culos de segurana e luvas de PVC;
no jogar produtos corrosivos concentrados na pia. Eles s podem ser descartados depois
de diludos;
Tomar os seguintes cuidados para diluir produtos corrosivos:
verter o diludo e nunca o contrrio;
fazer a diluio lentamente em proporo mnima de 1:1000;
usar basto de vidro para homogeneizao.
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1.8.1.3 - Produtos Qumicos Especiais (perxidos, cloratos, percloratos, nitratos, etc.)
Perxidos pertencem a uma classe especial de compostos qumicos, que apresentam
problemas especiais de estabilidade e periculosidade potencial. So classificados entre os
compostos mais perigosos normalmente mais utilizados em laboratrio. Alguns perxidos
manipulados em laboratrio so mais sensveis ao choque do que o TNT.
Outras classes de produtos qumicos, como os cloratos, percloratos e nitratos tambm
apresentam periculosidade devido a sua sensibilidade ao impacto, luz e centelha.
no usar esptula de metal para manipular perxidos;
no retornar ao frasco original qualquer quantidade de perxido ou compostos formadores
de perxidos no utilizados;
no jogar perxidos puros na pia. Eles devem ser altamente diludos para isso; resfriar
solues com perxidos abaixo da temperatura de congelamento dos mesmos. Na forma
cristalina, eles so mais sensveis ao choque;
absorver imediatamente com vermiculite solues de perxidos derramados.
1.8.1.4- Produtos Pirofricos
So aqueles que, em condies ambientais normais (atmosfera, temperatura e umidade),
reagem violentamente com o oxignio do ar ou com a umidade existente, calor, gases
inflamveis e fogo. Dentre estes, podem-se citar metais alcalinos e alguns derivados organo-
metlicos.
ltio, sdio e potssio (metais alcalinos) so slidos. Devem ser manipulados sob um
lquido inerte, geralmente querosene, sob o qual vm imersos. Exposio prolongada ao ar
provoca ignio espontnea;
no jogar aparas de metais alcalinos na pia, eles provocam incndio. Conserv-las longe da
gua;
conservar os produtos pirofricos slidos longe de solventes inflamveis, a fim de evitar
propagao do fogo;
alguns derivados organo-metlicos so lquidos. So adicionados em recipientes metlicos,
munidos com uma vlvula. A manipulao destes produtos s deve ser feita sob a orientao
do qumico responsvel;
nunca abrir a vlvula para a atmosfera. Os recipientes s devem ser abertos para uma
atmosfera de gs inerte (nitrognio ou orgnico) seco, ou uma cmara seca, tambm provida
de gs inerte;
transferir esses produtos diretamente sobre o solvente que ser utilizado durante a reao,
para diminuir o perigo de incndio. Os mesmos, quando diludos, tornam-se menos
inflamveis;
nunca utilizar gua para apagar o incndio. Usar extintor de p qumico seco ou areia.
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1.8.1.5- Cilindros de Gs Comprimido
no solicitar a instalao de cilindros de gs comprimido dentro do laboratrio, sem
autorizao prvia do responsvel;
manter os cilindros instalados sempre presos por correntes; No permitir que sejam
instalados cilindros de gs comprimido sem identificao;
providenciar a remessa dos cilindros vazios para local adequado;
certificar se o capacete de proteo est bem roscado, antes de movimentar um cilindro de
gs comprimido;
no transportar cilindros de gs comprimido, cheios ou vazios, sem o uso de carrinhos
apropriados;
conservar os cilindros de gs comprimido, quando fora de uso, cheios ou vazios, com o
capacete de proteo.
1.8.1.6- Armazenamento de Produtos Qumicos
Devem ser seguidos critrios rgidos para o armazenamento de produtos qumicos variados.
Deve-se levar em conta que produtos qumicos podem ser volteis, txicos, corrosivos separados
por famlias com distncias de 0,5 a 1,0 metro.
o local de armazenamento de produtos qumicos deve ser amplo, bem ventilado, com
exausto, com duas sadas, dotado de prateleiras seguras e largas;
as instalaes eltricas devem ser prova de exploso. No se deve permitir estocar produtos
no identificados;
deve-se promover a verificao dos prazos de validadedos produtos e descartar os vencidos;
no se deve armazenar vidraria juntamente com reagentes;
devem-se estocar produtos separados por famlias, com distncias de 0,5 a 1,0m.
Devem-se reforar os cuidados com produtos corrosivos, explosivos e peroxidveis. Os
corrosivos, cidos e bases devem ficar em armrios e prateleiras prximos do cho, se possvel
com exausto. O mesmo pode-se dizer para os inflamveis e explosivos, que devem manter
grande distncia em metros de produtos oxidantes. Sinalizar as prateleiras, armrios com os
pictogramas alusivos a cada grupo de substncia (ver figura 2 Pictogramas Indicativos do
Tipo de Periculosidade dos Reagentes).
1.8.1.7- Derramamentos Acidentais de Produtos Qumicos
Embora os derramamentos involuntrios de produtos qumicos no sejam freqentes no
laboratrio, algumas precaues se fazem necessrias, principalmente quando se trabalha
com produtos de alta toxicidade. Em caso de derrame, recomenda-se:
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isolar a rea e comunicar a todos que esto no laboratrio;
comunicar o responsvel pela segurana;
proteger-se com mscara de respirao, luvas, culos e outros EPIs adequados;
apagar as chamas;
desligar aparelhos, aquecedores eltricos, estufas, muflas, etc.;
permitir ventilao e/ou exausto no ambiente;
adicionar um absorvente tipo terra diatomcea ou Ca(OH)2 em caso de cidos, terra
diatomcea no caso de lcalis e carvo ativo para solventes orgnicos;
remover com uma p a massa resultante em sacos plsticos ou recipientes metlicos
convenientes, caso o produto reaja ou dissolva o plstico;
providenciar a limpeza do local e deixar ventilar at no haver mais vapores residuais no ar.
1.8.2- EQUIPAMENTOS DE SEGURANA E EMERGNCIA
Os equipamentos de segurana, tanto os de proteo coletiva (EPCs), como os de proteo
individual (EPIs), devem estar disponveis para os usurios dos laboratrios, assim como devem
ser oferecidas instrues para seus usos. Ver tabela 1 e 2 Substncias Qumicas Perigosas e Uso
de EPIs. Os EPCs vo eliminar ou minimizar os riscos, beneficiando a todos os funcionrios e o
ambiente.
1.8.3- EQUIPAMENTO DE PROTEO COLETIVA
1.8.3.1- Cabines de Exausto de Gases
Com bancada em ao inox permitem que sejam executadas todas as tarefas de laboratrio
em condies adequadas de salubridade.
1.8.3.2- Chuveiro de Emergncia
Todo laboratrio deve ser equipado com chuveiro, localizado prximo rea de
manipulao e ser fcil e rapidamente alcanado. Tanto o chuveiro quanto a rea adjacente
devero estar desimpedidos e prontos para utilizao a qualquer momento. O chuveiro deve
ser de fcil manejo e ter boa vazo dgua.
1.8.3.3- Lavador de Olhos
Como as operaes laboratoriais requerem observao e controle contnuos, possvel
ocorrerem respingos no rosto e olhos dos laboratoristas, em virtude da proximidade deles
com os reagentes. Da a importncia dos lavadores de olhos perto da rea de manipulao e
junto ao chuveiro, devendo ser possvel o funcionamento de ambos ao mesmo tempo.
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1.8.3.4- Extintores de Incndio
Os extintores mais usados em laboratrio so do tipo CO
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ou P Qumico, que so
utilizados no controle dos incndios classe B e C, que correspondem aos inflamveis e
eletricidade, respectivamente. (Consular Tabela 3 anexa)
1.8.4- EQUIPAMENTOS DE PROTEO INDIVIDUAL
1.8.4.1- Aventais
So utilizados para proteger as roupas e fornecer proteo adicional ao corpo. Devem
apresentar as seguintes caractersticas:
a melhor opo a seleo de aventais de puro algodo, que no reativo a muitos produtos
qumicos e resistente chama;
cobrir completamente as vestimentas;
ser fechado nas costas, conferindo maior proteo ao operador;
ser desprovido de bolsos;
ter mangas compridas;
aventais de borracha protegem o corpo do pessoal envolvido com a manipulao de grandes
volumes de solues. Para o pessoal responsvel pela lavagem, limpeza de vidrarias e
equipamentos o uso obrigatrio.
1.8.4.2- Luvas
As luvas oferecem proteo contra riscos biolgicos, contra queimaduras qumicas, calor
ou frio excessivos, cortes e outros riscos fsicos. Alm disso as luvas fornecem um elevado
grau de proteo contra dermatites. Um teste simples para verificar a eficincia de uma luva
na proteo contra um determinado material encher parcialmente a luva com a substncia-
teste e pendur-la em uma cabine por 24 horas. Aps esse tempo verificar se ocorreu corroso
e avaliar o grau de proteo que se poder esperar. Existem vrios tipos de luvas de proteo,
uma para cada finalidade, mas todas devem apresentar as seguintes caractersticas: alta
resistncia; baixa permeabilidade; boa flexibilidade para permitir manter o tato e segurar
com firmeza. Os principais usos:
manipulao de solventes e reagentes qumicos;
manipulao de recipientes com temperaturas extremas: fornos, autoclaves, freezer.
1.8.4.3- Botas de Segurana
So destinadas a proteger os ps e membros inferiores de impacto, perfuraes,
queimaduras, choques, etc.
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1.8.4.4- culos de Segurana e Protetores Faciais
A utilizao de culos de segurana e protetores faciais recomendada quando da execuo
de procedimentos envolvendo a possibilidade de respingos de reagentes qumicos, de emisso
de vapores e de ocorrncia de refluxos.
1.8.4.5- Mscara de Proteo Respiratria
Essas mscaras so usadas em operaes que envolvem a gerao de vapores txicos. Desse
modo, necessrio primeiramente conhecer os vapores que so gerados nos trabalhos do
laboratrio e as concentraes que determinam o limite de exposio a esses vapores, para
depois procurar uma firma especializada em equipamentos desse tipo para aquisio.
mscara semifacial com dois filtros: os filtros devem ser substitudos quando se observar
um aumento na resistncia respirao e sempre no perodo de validade especificada pelo
fabricante;
mscara semifacial descartvel: seu uso muito difundido em locais onde ocorrem grandes
concentraes de material particulado.
1.8.4.6- Mantas Corta-Fogo
Estas mantas so utilizadas em casos de incndio onde ocorre derramamento de lquidos,
e tenha ocorrido derramamento de lquidos inflamveis nas roupas dos operadores.
1.8.5- PROCEDIMENTOS EM SITUAES DE EMERGNCIA
1.8.5.1- Recomendaes Gerais
devem-se conhecer muito bem as caractersticas dos reagentes com respeito sua toxicidade,
inflamabilidade e explosividade antes de utiliz-los;
as substncias inflamveis devem ser manejadas em locais distantes de fontes de
aquecimento;
os cilindros de gs devem ser amarrados com correntes ou protegidos antes das tampas de
proteo serem removidas;
devem-se tomar precaues especiais quando se trabalha com substncias reconhecidas ou
com potencial carcinognico, tais como asbesto em todas as suas formas, benzeno,
clorofrmio, hidrazina e aminas;
limpar imediatamente qualquer derramamento de produtos qumicos. Proteger-se, se
necessrio, para fazer essa limpeza e usar os materiais e os recursos adequados. Para produtos
de petrleo, absorver o material derramado com estopa, que deve ser descartada em
vasilhame destinado a material inflamvel. No caso de cidos e bases fortes, o produto
deve ser neutralizado antes de se proceder limpeza. Em caso de dvida sobre a toxicidade
e os cuidados especiais em relao ao produto derramado, consultar tabela no final do
captulo.
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EM CASO DE DERRAMAMENTO DE LQUIDOS INFLAMVEIS, PRODUTOS
TXICOS OU CORROSIVOS, TOMAR AS SEGUINTES PROVIDNCIAS:
interromper o trabalho;
advertir as pessoas prximas sobre o ocorrido;
solicitar ou efetuar a limpeza imediata;
alertar seu supervisor;
verificar e corrigir a causa do problema;
o pessoal de apoio que responsvel pela limpeza geral do laboratrio deve receber, por
parte dos funcionrios, todas as informaes pertinentes ao procedimento de limpeza;
frascos contendo substncias qumicas e equipamentos no podem ser movimentados por
esse pessoal. Outro ponto a considerar quanto ao descarte de frascos vazios de substncias
qumicas. Os mesmos devem sofrer um tratamento prvio de limpeza e ser depositados
em locais prprios e protegidos para que no sejam utilizados para outras finalidades.
Todo laboratrio significa rea de risco que pode ser minimizado por um bom
gerenciamento, treinamento e uso de equipamentos de proteo adequados. Deve-se ter um
plano por escrito que abranja fogo, combate a incndios e instrues para evacuao, elaborado
pelo grupo de combate ao fogo e para outras emergncias elaborado pelo grupo de laboratrio.
Pequenos incndios em bancadas so emergncias das mais comuns e na maioria das vezes
podem ser extintos pelo pessoal do laboratrio. Contudo, numa situao de incndio, antes
de se tentar extingui-lo deve-se chamar o Corpo de Bombeiros, uma vez que qualquer
incndio, no importando sua dimenso, pode-se alastrar com uma rapidez inesperada.
Aes imediatas podem consistir no uso de cobertores contra fogo ou de extintores
adequados, enquanto o responsvel (coordenador da biossegurana) deve reavaliar a situao
e decidir se continua combatendo o fogo ou se necessrio evacuar o prdio e chamar o
grupo de combate a incndios.
Todos os usurios do laboratrio devem conhecer o plano de combate ao fogo e de
evacuaes e ser treinados a executar as tarefas que lhes forem designadas. O treinamento
deve ser conduzido pelo menos duas vezes ao ano, devendo os participantes avaliar por
escrito o treinamento e o plano, indicando as correes necessrias.
O plano deve incluir mapas de evacuaes dos prdios com indicaes das portas de
sada apropriadas e deve ser fixado em vrios locais bastante comuns e visveis. Listas de
telefones de emergncia (mdicos, hospitais, ambulncias, Corpo de Bombeiros e outros)
devem ser afixados prximos de cada telefone e mantidos atualizados.
Os equipamentos de segurana dos laboratrios requerem verificaes regulares para
assegurar que esto em locais apropriados e que funcionam adequadamente (ver instrues
do fabricante).
Todo laboratrio deve ter pessoas treinadas em primeiros socorros e em ressuscitao
cardiopulmonar, em nmero suficiente para assegurar as suas presenas durante todo o
tempo de trabalho.
Devem-se preparar relatrios de todos os acidentes nos quais ocorreu injria, ou houve a
possibilidade de injria, incidentes ou quase acidentes por questes de segurana, como
documento para possveis investigaes e para rever as medidas preventivas e a educao em
segurana dos usurios do laboratrio.
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2 9
1.8.5.2- Incndio: Fontes, Classes e Combate
As principais fontes causadoras de incndio no laboratrio so:
equipamentos eltricos mal conservados, mal operados ou conectados em rede eltrica
errada;
sobrecarga da rede eltrica por conectar vrios aparelhos;
operao indevida com lquidos inflamveis, cilindros de gs ou nas tubulaes;
estocagem de lquidos inflamveis e volteis em refrigeradores cujo sistema eltrico de
partida produza fascas;
substncias qumicas explosivas ou relativas: ex.: cido perclrico, quando em contato
com madeira, ladrilhos ou tecido, explode. cido pcrico e os picratos detonam pela ao
do calor e dos impactos;
agentes oxidantes: as substncias oxidantes so capazes de gerar incndios quando em
contato com outras substncias ou material combustvel.
Os incndios so agrupados em 4 classes, com medidas particulares de controle e combate
(ver tabela 3):
CLASSE A: Materiais de fcil combusto e que deixam resduos, como tecidos, madeiras,
papis, fibras. etc. Nesse caso utilizar gua e espuma para combater o fogo. Se o fogo estiver
no incio, pode-se utilizar p qumico seco ou gs carbnico.
CLASSE B: Produtos que queimam somente na superfcie e no deixam resduos, como
vernizes, solventes, etc. O controle pode ser feito por abafamento, com gs carbnico, p
qumico e espuma.
CLASSE C: Ocorre em equipamentos eltricos energizados, como motores, trasformadores,
quadros de distribuio, etc. Utilizar no controle, extintores de gs carbnico, p qumico
seco. Com a corrente desligada, combater este incndio como se fosse das classes A ou B.
CLASSE D: Inclui produtos pirofricos como o magnsio, zircnio, titnio, etc. Combater
por abafamento, com p qumico especial , limalha de ferro fundido ou areia.
1.9- BIBLIOGRAFIA
1- BRASIL. Instruo normativa n. 7 de 06 de junho de 2003. Dispe sobre as normas para o trabalho em conteno com
organismos geneticamente modificados. Dirio Oficial da Unio, Braslia, p.11827, de 09 junho de 1997, Seo 1.
2- BRASIL. Resoluo n. 283 de 12 de julho de 2001. Dispe sobre o tratamento e a destinao final dos resduos dos servios
de sade. Dirio Oficial da Unio, Braslia,p. de 01de outubro de 2001, Seo 1.
3- BRASIL. Resoluo n. 306 de 07 de dezembro de 2004. Dispe sobre o regulamento tcnico para o gerenciamento de
resduos de servios de sade. Dirio Oficial da Unio, Braslia, p. 49, de 10 de dezembro de 2004, Seo 1.
4- CARVALHO, PR. Boas Prticas Qumicas em Biossegurana. 1 ed. Rio de Janeiro: Intercincia Ltda; 1999.
5- LACEN PR- Manual de Biossegurana e Segurana Qumica em Laboratrio de Sade Pblica, Curitiba, 2000.
6- Oxford University - Chemical Resistant gloves guide.
http://ptcl.chem.ox.ac.uk/MSDS/glovesbymaterial.html
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3 0
FIGURA 1- CABINE DE SEGURANA BIOLGICA CLASSE II - BII
FIGURA 2- PICTOGRAMAS INDICATIVOS DO
TIPO DE PERICULOSIDADE DOS REAGENTES
7-Pereira, JDM- Boas prticas para laboratrio, Escola Tcnica Federal de Qumica do Rio de Janeiro,
8- Teixeira P, Valle S. Biossegurana. Uma abordagem multidisciplinar. Rio de Janeiro: FIOCRUZ, 1996.
9-UNESP - Guia de neutralizao de resduos qumicos, 2002
http://www.ibilce.unesp.br/servicos/prevencao/protocolo.htm
10-US Department of Health and Human Services/Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of
Health - Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4 ed. Washington: CDC, 1999.
B
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N
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3 1
FIGURA 3- PLANTA DE UM LABORATRIO NB3
M
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3 2
TABELA 1- SUBSTNCIAS QUMICAS PERIGOSAS E USO DE EPIs
A I C N T S B U S S A V U L A R A C S M S O L U C / L A T N E V A E T N E D I C A E D O S A C M E
O D I C
O C I R D R O L C
a h c a r r o B / A V P
l a r u t a n
m e l a i c a f i m e s r o d a r i p s e r
M 3 - 2 5 2 7 / e n o c i l i s
a l u v l v m o c s o l u c
R B K E V Y T e d l a t n e v A
a u g m o c r a v a L
O C I R F S O F O D I C A
a h c a r r o B
a c i l r t i n / l a r u t a n
M 3 - 2 5 2 7 / e n o c i l i s
e d l a t n e v A m o c s o l u c
R B K E V Y T
r e v r o s b a o b a s m o c a u g m o c r a v a L
a l i g r a e d a i e r a u o / e s a t n a m m o c
A L I R T I N O T E C A
l a r u t a n
M 3 - S 0 0 2 7 / e n o c i l i s
A D I M A L I R C A
a h c a r r o B / C V P
a c i l t u b
u o / e o b a s e a u g m o c r a v a L
a c i r t s g m e g a v a l
E D O T E M O R B
O I D T E
a c i l r t i n a h c a r r o B
o r i z u d n i e t n e r r o c a u g m o c r a v a L
o t i m v
S E T N A R O C
A D S O D A V I R E D
A N I L I N A
a c i l t u b a h c a r r o b
a r a p l a i c a f i m e s r o d a r i p s e r
s o m u f e a o v n , a r i e o p
o b a s e a u g m o c r a v a L
O I M R F O R O L C e n e r p o e n / A V P
M 3 - S 0 0 2 7 / e n o c i l i s
e t n e r r o c a u g m o c r a v a L
O S M D l a r u t a n a h c a r r o B
L O C I L G O N E L I T E
a h c a r r o B
a u g m o c r a v a l o c i l t e l o o c l r a z i l i t U
L O N E F
l a r u t a n
M 3 - S 0 0 2 7 / e n o c i l i s
e t i e l r e b e b , o b a s e a u g m o c r a v a L
O D E D L A M R O F
a h c a r r o B / C V P
l a r u t a n
M 3 - 2 5 2 7 / e n o c i l i s
e t n e r r o c a u g m o c r a v a L
E D O D I X R D I H
O I D S / O I S S T O P
s o m u f e a o v n , a r i e o p
r e v r o s b a e o b a s e a u g m o c r a v a L
a i e r a e s a t n a m m o c l a i r e t a m
E D O T I R O L C O P I H
% 5 a O I D S
e d l a t n e v A m o c s o l u c
R B K E V Y T
O D O I a c i l r t i n a h c a r r o B
o r e v r o s b a e e t n e r r o c a u g m o c r a v a L
a i e r a m o c l a i r e t a m
O I R U C R E M a c i l r t i n a h c a r r o B
a h l i r b e u q l a i c e p s e o b a s m o c r a v a L
l a i r e t a m r e v u o h o t n a u q n e
L O N A T E M l a r u t a n a h c a r r o B
M 3 - S 0 0 2 7 / e n o c i l i s
o c i l t e l o o c l r a z i l i t U
E D O D I X R E P
% 0 3 O I N G O R D I H
l a r u t a n
m o c r e v r o s b a e a u g m o c r a v a L
a i e r a e s a t n a m
O N E L I P O R P
L O C I L G
a h c a r r o B
E D O T A F L U S
O I S N G A M
, s o m u f e a o v n a r i e o p
e t n e r r o c a u g r a z i l i t U
S I R T R B K E V Y T e d l a t n e v A
e t n e r r o c a u g r a z i l i t U
A I R U R B K E V Y T e d l a t n e v A e t n e r r o c a u g r a z i l i t U
L O L I X
a c i l r t i n
M 3 - S 0 0 2 7 / e n o c i l i s
o b a s e e t n e r r o c a u g r a z i l i t U
B
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E
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3 3
TABELA 2- SUBSTNCIAS QUMICAS, CLASSIFICAO E INCOMPATIBILIDADE
A I C N T S B U S O P U R G E D A D I L I B I T A P M O C N I E T N E D I C A E D O S A C M E
O D I C
O C I R D R O L C
o v i c o N / e t n a t i r r I
, s o t a f l u S , s o t e n a i C
, s e t r o F s e s a B , o d e d l a m r o F
. s o d i x r d i H e s o d i x , s i a t e M
r o p 1 : 1 : 1 a r u t s i m a m u m o c o d a m a r r e d o d i u q i l o a r b u C
, o i c l C e d o t a n o b r a C u o o i d S e d o t a n o b r a C e d o s e p
. a i e r a e ) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g e d a i e r a
O D I C A
O C I R F S O F
o v i s o r r o C
e o t a r t i N , o t a r o l C , s e t r o F e s a B
o i c l C e d o t e b r a C
u o o i c l C e d o t a n o b r a C m o c o t n e m a z a v o a r b u C
) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g e d a i e r a , o i d S e d o t a n o b r a C
. 1 : 1 : 1 o s e p e d o r o p o r p a n , a i e r a e
A L I R T I N O T E C A o c i x T
, s o t a r o l c r e P , s o t a r t i N , s o d i c
. o i s s t o P e o i d S
E S O R A G A
e t n a t i r r I
l e v m a l f n I
s e t n a d i x O
E D O T E M O R B
O I D T E
e t n a t i r r I s e t r o F s e t n a d i x O
o d a v i t a o v r a c m o c o i d i t e e d o t e m o r b o a v r o s b A
e d o t s o p e r t n e o a r a p o v r a c o e h n i m a c n e e ) l m / g m 1 (
o c i m u q o x i l
O I M R F O R O L C
o c i x T / e t n a t i r r I
o c i t c r a N
l e v m a l f n I
, o i s n g a M e d P ; o i n m u l A
. a n o t e c A , o i s s t o P , o i d S
l o n a t e M
r o p 1 : 1 : 1 a r u t s i m a m u m o c o d a m a r r e d o d i u q l o a r b u C
, o i c l C e d o t a n o b r a C u o o i d S e d o t a n o b r a C e d o s e p
a r i f s n a r t e a i e r a e ) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g e d a i e r a
o a r e n i c n i a r a p e l u t o r e o d a i r p o r p a e t n e i p i c e r o a r a p
L O N E F
o c i t c r a N
o c i x T
o v i s o r r o C
o d i c A / o t e r o l C / o i n m u l A
o i c l C e d o t i r o l c o p i H / o c i r t N
O D E D L A M R O F o c i x o T / e t n a t i r r I
/ s e t r o F s e t n a d i x O / s o d i x r e P
. s o d i c e s e t r o F s e s a B
E D O D I X R D I H
O I D S / O I S S T O P
o v i s o r r o C
a r a p o c i t s u C
s o h l o s o
/ o c n i Z / o i n m u l A / s o d i c / a u g
e s o t e n o b r a c o r d i H
s o d a n e g o l a H
. o l a r o l e p e o c s e e % 5 o c i r o l c o r d i h . c m o c e z i l a r t u e N
. a u g m o c l a c o l o e t n e m l a t o t e v a l
E D O T I R O L C O P I H
O I D S
e t n a t i r r I
o v i s o r r o C
/ a i n m A / a l i r t i n o t e c a i n e F
s e t r o F . c
O D O I o v i s o r r o C
/ o i n g o r d i H / a i n m A / o n e l i t e c A
o c a i n o m A
O I R C R E M
o c i x T
o c i t c r a N
/ o c i l x O o d i c / a i n m A
o n e l i t e c A / o i n g o r d i H
a r a p a b m o b a m u a o d a t c e n o c r a l i p a c o b u t m u r a z i l i t U
p a v n o c r e m t i k m o c r a t a r t e o i r u c r e m e d s a t o g r a g u s
L O N A T E M
l e v m a l f n I
e d a i e r a , o i d s e d o t a n o b r a c m o c o t n e m a z a v o a r b u C
o s e p e d o r o p o r p a n , a i e r a e ) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g
, m e t n e s s a s o d i l s s o e u q t a o s u o p e r m u e x i e d 1 : 1 : 1
o u d s e r o m o c o d i l s o e t a r t e o l a r o n o d i u q l o e j e p s e d
a r a p o - e l u t o r e o d i l s o e l a b m e , o i r r t n o c o d . l a m r o n
. o a r e n i c n i
E D O D I X R E P
% 0 3 O I N G O R D I H
o v i s o r r o C
e d o t a n a g n a m r e P / e r b o C
/ o m o r C / o m o r B / a n i l i n A / o i c l C
s i e v i t s u b m o C e s i a t e M / o r r e F
r o p 1 : 1 : 1 a r u t s i m a m u m o c o d a m a r r e d o d i u q i l o a r b u C
a l i g r a e d o t a g e d a i e r a , a C e d u o a N o t a n o b r a c e d o s e p
. o l a r o l e p o d i u q i l o e t r a c s e D . a i e r a e ) a t i n o t n e b (
E D O T A F L U S
O I S N G A M
e t n a t i r r I
o c i t c r a N
/ s o t a f s o F / o i c n r t s E / o i c l C
l i t e - i x t E l o o c l
S I R T e t n a t i r r I l a t e M / o i n m u l A / e r b o C
L O L I X
o c i t c r a N
l e v m a l f n I
s o d i c e s e t r o f s e t n a d i x O
o a r b u c . o i n g i e d s e t n o f s i e v i s s o p s a s a d o t e u g i l s e D
a i e r a , o i c l C e d u o o i d S e d o t a n o b r a C m o c o t n e m a z a v
e d o r o p o r p a n , a i e r a e ) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g e d
1 : 1 : 1
O D I C
O C I R F L U S
e t n a t i r r I
o v i s o r r o C
/ a n o t e c A / s o t a r t i N
/ o i c l C e d o t a n a g n a m r e P
/ o i c l C e d o t a r o l C
o i c l C e d o t a r o l c r e P
e d u o o i d S e d o t a n o b r a C m o c o t n e m a z a v o a r b u C
a n , a i e r a e ) a t i n o t n e b ( a l i g r a e d o t a g e d a i e r a o i c l C
1 : 1 : 1 o s e p e d o r o p o r p
O R O L C o v i s o r r o C
/ o n e l i t e c A / o c a i n o m A
e a n i z n e B / o i n e g o r d i H
o e l r t e p e d s o d a v i r e d
A D I M A L I R C A
o v i s o l p x E
o n e g t a r E
o n e g r e c n a C
, s e t n a d i x O / s e s a B / s o d i c
e l a t e M / o i n m u l A / e r b o C / o r r e F
o r r e F e d s i a S
L O C I L G O N E L I T E
o c i x T
l e v m a l f n I
e d o d i x r e P / o c i r l c r e P . o d i c
e d s o t a n a g n a m r e P / o i d S
s o t a r t i N e o i s s a t o P
O N E L I P O R P
L O C I L G
l e v m a l f n I
o i m r f o r o l C / o c i r d r o l C o d i c
O N A T E M O R O L C I D
o v i c o N
o c i t c r a N
o n e g r e c n a C
o c i n e g a t u M
s i a t e M / o i n t i T / o i n m u l A
e d s a m r o f s a m u g l a , s o n i l a c l a
s o c i t s l p
A N I L I N A o n e g r e c n a C
e d o d i x r e P / o c i r t N o d i c
s e t n a d i x O / o i n g o r d i H
M
A
N
U
A
L

D
E

B
A
C
T
E
R
I
O
L
O
G
I
A

D
A

T
U
B
E
R
C
U
L
O
S
E
3 4
OBS.: Aps a utilizao de extintores de BFC (BROMOCLOROFLUORMETANO),
o ambiente deve ser bastante ventilado.
TABELA 3- TIPOS DE EXTINTORES DE INCNDIO E SUA UTILIZAO
S E R O T N I T X E E D S O P I T M E R A Z I L I T U M E R A Z I L I T U O N
A U G E D S E R O T N I T X E a r i e d a m e l e p a p m e o g o F
, s o c i r t l e s o t n e m a p i u q E
m e s i a t e m e s i e v m a l f n i
o t s u b m o c
E D O D I X I D E D S E R O T N I T X E
) 2 0 C ( O N O B R A C
s o i d n c n i e s i e v m a l f n i s o d i u q L
s o c i r t l e s o t n e m a p i u q e m e
s o n i l a c l a s i a t e M
O C I M U Q P E D R O T N I T X E
O C S
, s i e v m a l f n i s e s a g e s o d i u q L
m e o i d n c n i e s o n i l a c l a s i a t e m
o c i r t l e o t n e m a p i u q e
a g a p a s s a m , o d a z i l i t u r e s e d o P
e i c f r e p u s e d o g o f
A M U P S E E D R O T N I T X E s i e v m a l f n i s o d i u q L s o c i r t l e s o t n e m a p i u q E
C F B E D R O T N I T X E
o i d n c n i e s i e v m a l f n i s o d i u q L
o c i r t l e o t n e m a p i u q e m e
a g a p a s s i o p , a r i e d a m e l e p a P
e i c f r e p u s e d o g o f
GERENCIAMENTO DE AMOSTRAS
Captulo 2
M
A
N
U
A
L

D
E

B
A
C
T
E
R
I
O
L
O
G
I
A

D
A

T
U
B
E
R
C
U
L
O
S
E
G
E
R
E
N
C
I
A
M
E
N
T
O

D
E

A
M
O
S
T
R
A
S
3 7
2.1- INTRODUO
O laboratrio de referncia estadual tanto pode receber como processar espcimes clnicos para
realizao da baciloscopia, cultura, identificao e teste de sensibilidade.
Para que o laboratrio possa dar um resultado confivel, no basta que execute as tcnicas de forma
correta; necessrio que receba uma amostra adequada. Entende-se como boa amostra clnica a que
provm do local da leso, obtida em quantidade suficiente em um recipiente adequado, bem
identificada, conservada e transportada corretamente.
No caso de receber culturas, estas devem estar ntegras, sem contaminao, com crescimento
abundante de colnias que propiciem o repique. Culturas acidificadas ou alcalinizadas, apresentando
rachaduras, ou em cultura mista, com crescimento disgnico ou insuficiente de colnias, podem no
ser adequadas a realizao de testes posteriores. Neste captulo vamos abordar o gerenciamento de
amostras no laboratrio desde a colheita at o armazenamento. Estas amostras podem ser culturas
semeadas ou espcimes clnicos.
2.2- COLHEITA DE ESCARRO
2.2.1- ESCARRO DE EXPECTORAO
2.2.1.1- Qualidade e Quantidade da Amostra
Uma boa amostra de escarro a que provm da rvore brnquica, obtida aps esforo de
tosse, e no a que se obtm da faringe ou por aspirao de secrees nasais, nem tampouco
a que contm somente saliva. O volume de 5 a 10ml o ideal. Esse o material mais
adequado para ser processado quando o paciente vem para o diagnstico. No caso de pacientes
que estejam sob tratamento e que no tenham escarro purulento, mas com aspecto e
consistncia de saliva, deve-se processar a baciloscopia, assim mesmo, para que estes recebam
alta por cura comprovada.
2.2.1.2- Recipiente
O material deve ser colhido em potes plsticos, de preferncia com as seguintes
caractersticas: descartveis, com boca larga (50 mm de dimetro), transparente, com tampa
de rosca, altura de 40 mm, capacidade entre 35 a 50ml. O pote deve ser identificado com
fita gomada ou com caneta para retroprojetor, onde sero inscritos o nome do paciente e a
data da colheita. A identificao deve ser no corpo do pote e nunca na tampa.
2.2.1.3- Local da Colheita
As amostras devem ser colhidas em local aberto, de preferncia ao ar livre ou em sala bem
arejada, e pelo prprio paciente.
2.2.1.4- Momento da Colheita e Nmero de Amostras
O diagnstico deve ser feito a partir de pelo menos duas amostras de escarro, sendo a
primeira geralmente colhida no momento da consulta,para aproveitar a presena do doente.
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A segunda amostra deve ser colhida no dia seguinte ao despertar, e geralmente abundante
porque provm das secrees acumuladas na rvore brnquica durante a noite. Se uma
terceira amostra solicitada, aproveita-se o momento de entrega da segunda amostra.
2.2.1.5- Orientao ao Paciente
Cabe ao pessoal da Unidade de Sade orientar o paciente de modo claro e simples quanto
colheita do escarro, procedendo da seguinte maneira:
antes de entregar o recipiente ao paciente, deve-se verificar se o frasco fecha bem e se o
mesmo j est devidamente identificado, com o nome do paciente e a data da colheita no
corpo do pote;
ao despertar pela manh o paciente deve lavar bem a boca, inspirar profundamente, deter
por um instante o ar nos pulmes e lan-lo fora pelo esforo da tosse. Deve repetir essa
operao at obter trs eliminaes de escarro, evitando que esse escorra pela parede externa
do pote;
o paciente deve, ento, tampar o pote firmemente, e em seguida coloc-lo em um saco
plstico com a tampa para cima. Tendo cuidado para que permanea nessa posio. No
final, o paciente deve lavar as mos.
NOTA: Se no se consegue escarro atravs da expectorao, outros mtodos podem ser
utilizados para a obteno das secrees pulmonares. Como esses espcimes so paucibacilares
devero ser processados para o cultivo. Recomenda-se indicar no pote o modo de obteno
dos mesmos para no serem confundidos com saliva. A colheita desses materiais feita por
profissional de sade especializado.
2.2.1.6- Lavado Gstrico
A obteno desse espcime requer hospitalizao, pois colhido logo que o paciente
acorda, antes mesmo de se levantar e comer. Adicionar carbonato de sdio 1mg/1ml de
lavado para neutralizar o suco gstrico. Este mtodo indicado para crianas, pois essas
deglutem o escarro. Deve-se colher pelo menos duas amostras em dias consecutivos, em
recipiente limpo.
2.2.1.7- Lavados Brnquicos (trqueo-brnquico, broncoalveolar)
So colhidos por pessoal mdico, e como esses procedimentos induzem a expectorao
por vrios, dias recomenda-se a colheita sucessiva desses materiais. O lavado broncoalveolar
pode ser processado para cultura sem descontaminao prvia, pois material colhido
assepticamente de stio estril.
2.2.1.8- Expectorao Induzida
Obtida pela inalao de soluo salina hipertnica,aerossolizada, que irrita os pulmes e
induz a tosse.
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2.3- COLHEITA DE OUTROS MATERIAIS
2.3.1- URINA
Deve-se colher toda a urina da primeira mico da manh em frasco limpo, de boca larga (de
300 a 500ml), aps higiene ntima com gua. Utiliza-se um nmero mnimo de trs e mximo
de seis amostras colhidas em dias consecutivos.
2.3.2- LQUIDOS ASSPTICOS
(Lquor, Lquidos Pleural, Asctico, Sinovial, Pericrdico, Peritoneal)
Esses materiais so colhidos assepticamente por pessoal mdico, no maior volume possvel, e
colocados em frascos estreis. Recomenda-se a semeadura direta do material em meio de cultura
no momento da colheita para se obter maior positividade.
2.3.3- MATERIAL DE RESSECO, BIPSIA
Esses materiais so colhidos assepticamente por pessoal mdico, em frasco com gua destilada
ou salina fisiolgica estril. No utilizar formol. Em caso de pleuris o fragmento de pleura deve
ser colhido sempre que possvel, pois apresenta positividade em cultura notoriamente superior
ao lquido pleural.
2.3.4- PUS
Esse material, quando proveniente de cavidade fechada, colhido atravs de puno, por
pessoal mdico, e semeado diretamente em meio de cultura, no laboratrio. Quando o material
de cavidade aberta geralmente colhido atravs de swab.
Todo espcime colhido com swab deve ser imerso em gua destilada ou salina fisiolgica,
num tubo estril. Antes de a amostra ser processada, esgotar o contedo do swab, atritando-o
contra a parede do tubo. O material diludo no lquido do tubo dever ser semeado aps
tratamento.
2.3.5- SANGUE
A pesquisa de micobactrias no sangue est particularmente indicada nos casos de bacteremia,
e, depois da medula ssea, o material mais indicado para o diagnstico em pacientes com a
sndrome da imunodeficincia adquirida. Esse material deve ser colhido assepticamente com
anticoagulante (heparina e no EDTA) em volume de at 5ml. O sangue menstrual no mais
usado para o diagnstico de tuberculose uterina, sendo indicada a bipsia de endomtrio.
2.3.6- FEZES
No so mais utilizadas para o diagnstico de tuberculose intestinal. Neste caso, est indicado
a bipsia. Alguns estudos relatam o isolamento de outras micobactrias de fezes de pacientes
com AIDS.
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2.4- CONSERVAO E TRANSPORTE
Os espcimes clnicos devem ser, preferencialmente, enviados e processados no laboratrio
imediatamente aps a colheita. Para o transporte de amostras devem-se considerar trs condies
importantes: MANTER SOB REFRIGERAO; PROTEGER DA LUZ SOLAR; E ACONDICIONAR DE FORMA ADEQUADA
PARA QUE NO HAJA RISCO DE DERRAMAMENTO.
NOTA: Para transportar potes de escarro de uma unidade sanitria da periferia, para outra de maior
complexidade, para a realizao da baciloscopia, recomenda-se a utilizao de caixas de isopor (por
serem leves, protegerem do calor e da luz solar) acondicionadas com gelo reciclvel ou cubos de gelo
dentro de um saco plstico. Nunca coloque a requisio de exame juntamente com o pote, dentro do
isopor.
2.5- RECEPO DE AMOSTRAS
2.5.1- MATERIAL CLNICO
Antes de iniciar o registro do material clnico recebido fazer a desinfeco da parte externa do
recipiente, utilizando gaze ou algodo embebido em hipoclorito de sdio a 2%. obrigatrio
que o tcnico proteja suas mos de um possvel contato com agentes infecciosos atravs do uso de
luvas, alm de usar respirador e avental. Comprovar se a amostra est corretamente identificada,
de acordo com a requisio enviada, e se a quantidade e a qualidade do material esto adequados.
Se for insuficiente ou inadequada, solicitar de imediato novo material.
Registrar os dados completos do paciente e os de solicitao de exames e fornecer o nmero
ao portador. Rotular o recipiente. Armazenar em geladeira a 4C.
2.5.2- CULTURAS
As caixas contendo culturas devem ser abertas dentro de uma Cabine de Segurana Biolgica
por um tcnico, vestindo luvas, avental e respirador. H que se ter cuidado especial para no se
cortar com tubos quebrados. Se a aparncia externa da embalagem denotar que o envio est fora
dos padres de segurana ou que foi enviado pelo correio, o cuidado deve ser maior. Essas culturas
devem ser registradas e armazenadas em geladeira a 4C, principalmente para evitar a
contaminao por formigas, fungos etc. A tampa deve ser lacrada com fita adesiva para evitar
ressecamento e contaminao. As culturas positivas produzidas pelo labotatrio podem ser
armazenadas da mesma maneira, para manipulao posterior.
2.6- CRITRIOS DE ACEITAO E REJEIO DE AMOSTRAS
As amostras (espcimes clnicos e culturas) sero aceitas se fizerem parte de projetos, acordos e
convnios estabelecidos pelo Laboratrio Central. Os dados pessoais, clnicos e epidemiolgicos do
paciente e a justificativa para a solicitao do exame devem ser informados. A requisio deve estar
assinada e carimbada de modo legvel. Tanto o material clnico quanto a cultura devem estar
adequadamente rotulados, embalados e transportados. Se a embalagem ou recipiente com o material
no estiverem ntegros o material ser rejeitado. Se as culturas apresentarem alterao de pH,
crescimento de contaminantes, crescimento disgnico de colnias, sero rejeitadas. Qualquer
irregularidade ser informada a quem enviou o material. Todo o material rejeitado ser esterilizado
em autoclave a 121C e descartado no lixo.
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2.7- ARMAZENAMENTO
O material ficar armazenado no laboratrio o tempo necessrio previsto na legislao prpria. Os
materiais analisados podem ser utilizadas como amostras para compor painel para validao de testes
diagnsticos ou outros projetos, caso tenha sido acordado previamente por ambas as partes.
No captulo 9 CONTROLE DE Qualidade NO LABORATRIO DE MICOBACTERIOLOGIA encontra-se descrito
o procedimento para armazenamento das amostras em freezer a -70C.
2.8- ENVIO DE MATERIAIS
Devero ser observadas as regras internacionais da IATA (International Air Transport Association)
para o envio areo. O material deve ser colocado em um frasco bem vedado, prova de vazamento
(recipiente primrio) que o prprio tubo de rosca no caso da cultura, ou um recipiente com material
clnico, que ser colocado em um segundo recipiente (secundrio) prova de vazamentos e
inquebravvel (metal, plstico). Entre esses dois colocar material absorvente (papel). O terceiro
recipiente pode ser de papelo, madeira, isopor e dever conter rtulo de material infeccioso (ver
anexo) com instrues de seu manuseio (frgil), a posio para o transporte da embalagem e o telefone
da autoridade sanitria a ser contactada em caso de acidente (vazamento, quebra da embalagem etc)
e/ou o laboratrio que est enviando a amostra. Essas embalagens devem ser compradas prontas e ter
o registro no INMETRO. Culturas de micobactrias podem ser transportadas em meio slido em
tubos de rosca ou ento liofilizadas.
2.9- AMOSTRAS-TIPO
O laboratrio que identifica micobactrias necessita ter uma coleo de amostas-tipo indispensveis
para serem utilizadas como controles nos testes bioqumicos. Essas culturas so mantidas em freezer a
-70C em suspenses e precisam ser repicadas a cada 2 anos. Ao comprar estas culturas, ou mesmo
quando fornecidas pelo laboratrio de referncia nacional, precisam estar acompanhadas do certificado
de anlise da coleo que a mantm e de onde foi originalmente adquirida. Ver nas tabelas abaixo as
amostras que o LACEN necessita manter (Tab. 1) e as amostras que o laboratrio de referncia mantm
e fornece para os laboratrios que necessitam de amostras-padro para suas experincias (Tab. 2).
Tabela 1- Amostras-tipo que devem fazem parte da micobacterioteca do LACEN
ESTIRPES DESIGNAO OFICIAL
M.tuberculosis ATCC 27294 (H R )
37 V
M.tuberculosis ATCC 25177 (H R )
37 A
M.bovis (BCG) cepa Moreau
M.bovis ATCC 19210
M.kansasii ATCC 12478
M.gordon
ATCC 14.470
M.intracellulare ATCC 13.950
M.avium ATCC 25.291
M.terr ATCC 15.755
M.fortuitum ATCC 6841
M.peregrinum
ATCC 14.467
M.chelon NCTC 946
M.abscessus ATCC 19.977
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Tabela 2- Amostras-padro que fazem parte da micobacterioteca do laboratrio de referncia nacional

M. tuberculosis CC.01.00 ATCC 27294 (H
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)
M. tuberculosis CC.02.00 ATCC 25177 (H
37
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M. bovis CC.03.00 ATCC 19210
M. kansasii CC.08.00 ATCC 12478
M. marinum CC.09.00 ATCC 927
M. gordon CC.10.00 ATCC 14.470
M. scrofulaceum CC.11.00 ATCC 19.981
M. flavescens CC.12.00 ATCC 14.474
M. szulgai CC.13.00 NCTC 10.831
M.intracellulare CC.14.00 ATCC 13.950
M. avium CC.15.00 ATCC 25.291
M. terr CC.16.00 ATCC 15.755
M. triviale CC.17.00 ATCC 23.292
M. gastri CC.18.00 ATCC 15.754
M.xenopi CC.19.00 NCTC 10.042
M.fortuitum CC.20.00 ATCC 6841
M.peregrinum CC.21.00 ATCC 14.467
M.chelon CC.22.00 NCTC 946
M.simi CC.24.00 ATCC 25.275
M.nonchromogenicum CC.26.00 ATCC 19.530
M.asiaticum CC.27.00 ATCC 25.276
M.ulcerans CC.28.00 ATCC 19.423
M.chit CC.30.00 ATCC 19.627
M.diernhoferi CC. 31.00 ATCC 19.340
M.duvalii CC.32.00 NCTC 358
M.gilvum CC.33.00 NCTC 10.742
M.vacc CC.34.00 ATCC 15.483
M.aurum CC.35.00 ATCC 23.366
M.obuense CC.37.00 ATCC 27.023
M.rhodesi CC.38.00 ATCC 27.024
M.neoaurum CC.39.00 ATCC 25.795
M.chubuense CC.40.00 ATCC 27.278
M.aichiense CC.41.00 ATCC 27.280
M.gadium CC.42.00 ATCC 27.726
M.phlei CC.43.00 ATCC 11.758
M.thermoresistibile CC.44.00 ATCC 19.527
M.agri CC.45.00 ATCC 27.406
M.smegmatis CC.46.00 ATCC 19.420
M.senegalense CC.47.00 NCTC 10.956
M.fallax CC.48.00 ATCC 35.219
M.komossense CC.49.00 ATCC 33.013
M.porcinum CC.50.00 ATCC 33.776
M.farcinogenes CC.51.00 NCTC 10.955
M.lentiflavum CC.54.00 ATCC 51.985
M.mageritense CC.55.00 ATCC 700.351
M.mucogenicum CC.56.00 ATCC 49.650
M.abscessus CC.58.00 ATCC 19.977
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2.10- BIBLIOGRAFIA
1- BRASIL/MS/ FUNASA/CENEPI/CRPHF - Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro; 1994. 2 ed. revisada e
ampliada.
2- DAVID, HL; LVY-FRBAULT, V & Thorel, MF. Mthods de Laboratoire pour Mycobacteriologie Clinique. Paris: Institute
Pasteur; 1989.
3- KENT, PT & KUBICA, GP. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. Atlanta: Centers for Disease
Control, 1985.
4- ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD/Organizacion Mundial de la Salud/Centro Panamericano de
Zoonosis. La muestra. El Examen Microscopico (Parte I). IN: Manual de Normas y Procedimientos Tecnicos para la
Bacteriologia de la Tuberculosis. Nota Tecnica n 26/ Rev.1, Martinez: CEPANZO;1988.
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BACILOSCOPIA
Captulo 3
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3.1- IMPORTNCIA
A baciloscopia o exame bsico para o diagnstico bacteriolgico da tuberculose, especialmente
na forma pulmonar. Por ser de execuo rpida, fcil e de baixo custo, favorece uma ampla cobertura
diagnstica, identificando a principal fonte de infeco (doentes bacilferos) permitindo a pronta
atuao na interrupo da cadeia de transmisso.
utilizada para acompanhar a eficcia do tratamento atravs da reduo bacilar e negativao do
escarro em exames mensais, enquanto o paciente tiver expectorao.
Para obter um resultado positivo na baciloscopia, necessrio pelo menos 5.000 a 10.000 bacilos
por mililitro de escarro, em contraste com a cultura que uma metodologia mais sensvel e que pode
detectar a partir de 10 a 100 clulas viveis por amostra. No entanto, o exame microscpico do
escarro considerado a mais importante atividade do programa de controle da tuberculose, na busca
e deteco dos casos bacilferos.
3.2- PREPARAO
Por ser o material clnico mais utilizado no diagnstico da tuberculose pulmonar, descreveremos
a seguir a preparao do esfregao para o exame microscpico do escarro:
aps a preparao do local de trabalho identificar os potes de escarro no corpo dos mesmos. A
numerao da lmina pode ser feita com fita crepe;
colocar as amostras em ordem crescente e as respectivas lminas em frente de cada pote. Essas
devem ser novas e desengorduradas por imerso em soluo de lcool. Numer-las do lado oposto
ao do esfregao. Fazer uma linha divisria que corresponda a 1/3 da lmina, sendo o restante
destinado ao esfregao. Deve-se ter o cuidado para no tocar os dedos na parte destinada ao esfregao;
abrir somente o pote da amostra que se vai fazer o esfregao;
com o aplicador de madeira partido em dois e utilizando o lado das pontas farpadas, escolher a
partcula mais densa ou mais purulenta do escarro ou uma mistura da amostra, quando s existirem
pequenas partculas purulentas ou mucosas;
colocada a partcula prxima linha divisria, estender com o mesmo aplicador at o extremo
oposto. Evitar os espaos vazios. Desprezar o excesso no prprio frasco da amostra. No se deve
aquecer a lmina enquanto o esfregao estiver sendo preparado, pois ocorre a formao de crculos
e precipitados granulosos com o calor, prejudicando com isso os resultados da leitura, alm do que
projeta aerossis;
ao trmino do esfregao, desprezar o aplicador de madeira no recipiente para autoclavao ou
incinerao e colocar o pote bem fechado na geladeira para ser guardado at a sada dos resultados;
evitar confeccionar esfregao com ala metlica, pois h grande formao de aerossis durante a
flambagem no bico de Bunsen;
colocar as lminas sobre estante para secagem natural (sem aquecimento);
aps a secagem fixar trs vezes no fogo rapidamente, mantendo o esfregao na parte superior da
lmina;
nunca deixe as lminas sem fixar, aps a realizao do esfregao, mesmo que se v cor-las no dia
seguinte, por exemplo. Desta forma no se perde o material da lmina;
as lminas fixadas podem conter bacilos viveis. O ideal que se core logo depois de confeccionado
o esfregao. Se for armazenar embrulhe a lmina num papel alumnio e coloque na geladeira.
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3.3- RECOMENDAES DE BIOSSEGURANA
Este teste dever ser executado segundo a tcnica assptica, em cabine de segurana biolgica
classe II B2 ou B3. O tcnico dever estar utilizando equipamentos de proteo individual como
luva, respirador N 95, avental descartvel para realizar o esfregao e a colorao. A manipulao de
corantes, fenol, xilol necessitam de EPIs prprios, pois apresentam risco ao serem manipulados. Ver
captulo BIOSSEGURANA.
3.4- PROCEDIMENTOS
3.4.1- MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN (6)
3.4.1.1- Princpio
Este mtodo est baseado na capacidade das micobactrias em reter a fucsina aps colorao
e no se deixar descorar pela ao do lcool-cido e amplamente utilizado em todo o
mundo.
3.4.1.2- Solues
3.4.1.2.1- Fucsina Fenicada a 0,3%
Fucsina bsica ...................................................................................................3g
lcool etlico a 95% PA ...............................................................................100ml
Dissolver por agitao a fucsina no lcool e juntar 55ml de fenol lquido e gua
destilada quente at completar 1.000ml. Deixar repousar por 24 horas.
Filtrar com o auxlio de papel de filtro e estocar em frasco escuro identificado.
3.4.1.2.2- Fenol Aquoso
Pesar 1.000g de fenol cristalizado e dissolv-lo em 100ml de gua destilada. Aquecer
em banho-maria e deixar esfriar. Anotar a preparao na ficha 1 Controle da Preparao
do fenol lquido para o mtodo de colorao de Ziehl-Neelsen.
3.4.1.2.3- Azul de Metileno a 0,1%
Pesar em balana de preciso 1g de azul de metileno, dissolver por agitao com
100ml de lcool etlico PA e juntar gua destilada at completar um litro.
Deixar repousar por 24 horas, filtrar e estocar em frasco escuro.
3.4.1.2.4- Soluo Descorante
Colocar em um frasco 970ml de lcool etlico, e em seguida com uma pipeta deixar
escorrer pela parede do frasco 30ml de cido clordrico PA. Agitar suavemente. Anotar
esses procedimentos na ficha 2 Controle da Preparao dos Reagentes Para o Mtodo
de Colorao de Ziehl-Neelsen.
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IMPORTANTE: Cada vez que as solues corantes forem transferidas para os frascos
conta-gotas, devem ser filtradas. Este procedimento particularmente necessrio para a
fucsina fenicada, porque com o tempo formam-se pequenos cristais que se depositam
nas lminas formando artefatos, causando erro nas leituras. Os frascos conta-gotas e
suas tampas devem ser lavados cada vez que se reponha seu contedo.
3.5- TCNICA
colocar as lminas fixadas, conservando a ordem numrica, sobre o suporte para colorao. Esse
suporte pode ser feito com varas de vidro ou alumnio, que so colocadas sobre a pia. As lminas
devem ficar com o esfregao para cima, separadas uma da outra e com o nmero voltado para o
operador. conveniente que a vara mais prxima do operador esteja ligeiramente mais alta que a
outra. Essa pequena diferena de nvel permite que os reativos no deslizem para a parte da lmina
destinada ao nmero, evitando que este se apague. Alm disso, permite tomar a lmina entre o
polegar e o indicador, quando no se dispe de pina;
cobrir a totalidade da superfcie do esfregao com soluo de fucsina fenicada previamente filtrada.
os corantes tambm podem ser filtrados sobre as lminas no momento da colorao;
aquecer suavemente com a chama de algodo umedecido em lcool ou com a chama do bico de
Bunsen eltrico, passando lentamente por baixo das lminas, at que se produza emisso de vapores
e, quando estes so visveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operao at completar trs emisses
sucessivas. No total essa operao no deve durar mais de cinco minutos a contar da primeira
emisso de vapores. A fucsina no deve ferver, e, se diminuir por evaporao ou derrame, deve ser
reposta, porque o esfregao precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento. Eliminar
a fucsina tomando a lmina pelo extremo numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um
jato de gua de baixa presso sobre a pelcula corada, de maneira que essa no se desprenda;
cobrir toda a superfcie do esfregao com a soluo de lcool-cido. Tomar a lmina entre o polegar
e o indicador e fazer um movimento de vai e vem, de modo que o lcool-cido v descorando
suavemente a fucsina. Se o esfregao estiver ainda com cor vermelha ou rosada, descore-o novamente.
Considera-se descorado o esfregao quando suas partes mais grossas conservarem somente um ligeiro
tom rosado. Essa operao dura, em geral, dois minutos. Uma vez eliminado o lcool-cido, lavar as
lminas da mesma forma como se procedeu depois da colorao com a fucsina, com cuidado para
no desprender a pelcula;
cobrir toda a superfcie do esfregao com soluo de azul de metileno durante trinta segundos.
Lavar, da mesma forma como se indicou para a fucsina, tanto o esfregao como a parte inferior da
lmina. Colocar as lminas com o esfregao para cima, sobre o papel limpo, para secar a temperatura
ambiente, conservando sempre a ordem estabelecida;
Uma vez secos os esfregaos corados rever a numerao das lminas.
3.6- LEITURA E INFORME DE RESULTADOS
Com a tcnica de Ziehl-Neelsen, as micobactrias apresentam-se como bastonetes delgados,
ligeiramente curvos, isolados, aos pares ou em grupos, corados em vermelho com fundo azul (ver
anexo) e, portanto referidos como bacilos lcool-cido resistentes (BAAR). A leitura deve ser feita no
mnimo em cem campos microscpicos, o que corresponde, aproximadamente, leitura de uma
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linha reta que vai do extremo onde est a numerao at o extremo oposto, isso correspondendo a
mais ou menos 5 minutos de observao. Recomenda-se um intervalo de 10 minutos de descanso
para cada dez lminas lidas. Aps a leitura, as lminas que no forem enviadas para o controle de
qualidade devem ser desprezadas num cemitrio ou num frasco contendo hipoclorito de sdio a 1%.
Recomenda-se utilizar um desenho quadriculado para ir anotando o nmero de bacilos encontrados
em cada campo microscpico e o resultado deve ser informado em nmero de cruzes segundo a escala
apresentada abaixo:
Escala semiquantitativa:
( - ) No foram encontrados BAAR em 100 campos observados
(1-9 )N de bacilos em 100 campos observados
( + ) Presena de menos de 1 BAAR por campo em 100 campos observados
( ++ ) Presena de 1 a 10 BAAR por campo em 50 campos observados
( +++ ) Presena de mais de 10 BAAR por campo em 20 campos observados
3.7- MATERIAL UTILIZADO
cido clordrico concentrado PA;
cido sulfrico;
lcool etlico 95% PA;
lcool etlico comercial 95GL/92,5 INPM;
algodo hidrfobo;
aplicador de madeira;
avental de policarbonato;
azul de metileno;
balana analtica;
balana de prato superior;
balo de fundo chato, de 250 a 2.000ml;
balo volumtrico de 10, 100, 500 e 1000ml;
becher de 50 a 1.000ml;
bico de Bunsen;
cabine de segurana biolgica classe II B2/B3;
caixa de madeira para guardar lminas;
despertador de bancada;
dessecador;
destilador, deionizador;
erlenmeyer de 250 a 2.000ml;
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esptula para pesagem de ps;
fenol em cristais;
fita adesiva para controle de autoclavao;
frasco conta-gotas para corantes de 250ml;
frasco escuro para estocar reagentes de 100 a 1.000ml;
fucsina bsica;
funil de 100 a 500ml;
gaze 8 fios tipo queijo;
geladeira;
graal de porcelana com pistilo;
hipoclorito de sdio a 5%;
lmina de vidro para microscopia;
luva de borracha natural;
luva de vinil;
microscpio binocular;
culos;
leo de cedro;
pina anatmica;
pipeta sorolgica graduada ao dcimo e ao centsimo de 1,2,5,10ml;
potes plsticos para colheita de escarro;
proveta graduada de 100 a 2.000ml;
recipientes de ao inoxidvel com tampa para descarte, transporte e armazenamento temporrio de
material contaminado;
respirador N95 ou N99;
sacos plsticos para autoclavao;
suporte de ao para colocar lminas;
xilol.
3.8- CONTROLE DE QUALIDADE
Ao trmino da leitura deve-se retirar o leo de cedro com xilol, vertendo o frasco conta-gotas de
maneira delicada e fazendo movimento de vai e vem para que o leo seja retirado, mas tendo o
cuidado de deixar o esfregao intacto. Deixar secar ao ar e acondicionar as lminas em caixas de
madeira apropriadas para tal ou ento embrulh-las individualmente em papel alumnio ou papel
toalha. Guardar em geladeira, protegendo sempre o esfregao contra a abraso, a luz, o calor e contra
os insetos.
Todas as lminas realizadas pela unidade de sade, tanto as positivas quanto as negativas, devero
ser guardadas para serem sorteadas e enviadas ao laboratrio de referncia (regional ou estadual) para
controle de qualidade.
A cada colorao e leitura, uma lmina positiva e outra negativa devero ser colocadas para sofrer
todo o processo de colorao e leitura do esfregao, para controle de qualidade.
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NOTA: Todos os laboratrios pblicos e privados que fazem a Baciloscopia da Tuberculose devem
utilizar o Livro de Registro de Baciloscopia da Tuberculose e o aplicativo SILTB para registrar os
exames dos pacientes.
Ao final da baciloscopia, os resultados devero ser transcritos para o Livro de Registro e digitados no
aplicativo SILTB.
3.8.1- FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR O RESULTADO GERAL DO EXAME
amostra insuficiente em quantidade ou qualidade;
identificao descuidada no pote. No se deve identificar a tampa e sim o corpo do pote;
rea de trabalho inadequada ou mal iluminada;
troca das lminas por falta de disciplina no trabalho;
processamento de uma srie muito grande de amostras simultaneamente. Recomenda-se no
mximo uma srie de doze;
esquecer de misturar os escarros se as eliminaes so poucas e se esto separadas dentro do
pote;
esfregaos muitos espessos ou muito delgados;
uso de lminas arranhadas ou que tenham sido utilizadas anteriormente, que podem simular
bacilos pela deposio de corantes nas ranhuras;
fucsina seca e cristalizada no fundo do frasco. Deve-se usar fucsina recentemente filtrada e
colocada em frasco bem lavado;
descuido no aquecimento da fucsina, permitindo que seque e cristalize no esfregao;
o descoramento insuficiente das lminas pode deixar corado em vermelho outros bacilos, que
assim se confundem com o bacilo da tuberculose;
tempo de descoramento muito prolongado pode levar ao descoramento do bacilo da Tuberculose.
no revisar a numerao das lminas ou no renumer-las caso os nmeros se apaguem durante
a colorao;
no limpar a lente de imerso depois de cada exame positivo;
existncia de bacilos no leo de imerso devido ao mau costume de tocar o esfregao com o
conta-gotas do frasco;
anotao errada do resultado na folha de trabalho dirio;
confundir os resultados ao transcrever da folha de trabalho dirio para o impresso a ser fornecido
ao setor.
3.9- ILUSTRAES
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3.10- BIBLIOGRAFIA
1- BRASIL/MS/ FUNASA/CENEPI/CRPHF. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 1994. 2 ed. revisada e
ampliada.
2- CARDOSO, CL; GIACOMELLI, LRB; HELBEL, C [ET ALII]. Survival of tubercle bacilli in heat-fixed and stained smears.
Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 2001; 96 (2): 277-280.
3- DAVID, HL; LVY-FRBAULT, V. & Thorel, MF. Mthods de Laboratoire pour Mycobacteriologie Clinique. Paris: Institute
Pasteur; 1989.
4- KENT, PT. & KUBICA, GP. Public Health Mycobacteriology. A Guide for the Level III Laboratory. Atlanta: Centers for Disease
Control, 1985.
6- UNION INTERNACIONAL CONTRA LA TUBERCULOSIS. Guia tcnico para recoleccin, conservacin y transporte de las
muestras de esputo y examen por microscopia directa para la tuberculosis. Bol. Un. Int. Tuberc, 1978.
BACILOSCOPIA PELO MTODO ZIEHL-NEELSEN
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SUBSTNCIA PROCEDNCIA N DO LOTE VALIDADE
Fenol Cristalizado
SUBSTNCIA
QUANTIDADE
Fenol Cristalizado
H 0 destilada
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PESAGEM / VOLUME
CONTROLE DE QUALIDADE
APROVADO ( ) REPROVADO ( )
RESPONSVEL
OBSERVAES
DATA DE PREPARAO QUANTIDADE PRODUZIDA VALIDADE N DE PARTIDA
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DO FENOL LQUIDO
PARA O MTODO DE COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN
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FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DOS REAGENTES
PESAGEM / VOLUME
Fucsina Bsica
lcool etlico 95% PA
Azul de Metileno
Hcl
Fenol Cristalizado
Fucsina Bsica
Azul de Metileno
Hcl
SUBSTNCIA CORANTES FENOL LQUIDO H 0 DESTILADA
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RESPONSVEL
OBSERVAES
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Captulo 4
CULTURA
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4.1- INDICAO
A cultura o mtodo bacteriolgico mais acurado disponvel at o momento para o diagnstico da
tuberculose pulmonar e extrapulmonar. Enquanto o diagnstico da forma pulmonar pela baciloscopia
requer 5.000 a 10.000 bacilos por mililitro de escarro, o diagnstico atravs da cultura pode ser
realizado a partir de 10 bacilos por mililitro de escarro. A cultura possibilita dessa forma, diagnosticar
mais precocemente os casos novos de tuberculose pulmonar, nos quais a eliminao bacilar no
suficiente para ser detectada pela baciloscopia, evitando o aparecimento dos bacilferos que so a
fonte de transmisso da doena. Alm de que, o cultivo permite posterior identificao da micobactria
isolada, assim como a realizao do teste de sensibilidade, o que no possvel quando se realiza
somente a baciloscopia.
Alm da cultura estar indicada para o diagnstico das formas paucibacilares da tuberculose
pulmonar, dever ser usada tambm rotineiramente em todas as formas extrapulmonares, para o
diagnstico das micobacterioses e nos servios que recebam material para o diagnstico de pacientes
co-infectados com o vrus HIV.
4.2- PROCEDIMENTOS DE ISOLAMENTO
Os espcimes utilizados para o isolamento de micobactrias podem ser contaminados, isto ,
aqueles que apresentam flora microbiana associada, como escarro, lavados, aspirados, urina, material
de cavidade aberta e espcimes no contaminados, ou seja, aqueles provenientes de cavidades fechadas,
como os lquidos orgnicos etc.
Espcimes contaminados devem ser tratados com a finalidade de eliminar os microrganismos
contaminantes, que, por se desenvolverem muito mais rapidamente que as micobactrias, impedem
a multiplicao dessas. Esse tratamento feito com agentes qumicos aos quais as micobactrias so
conhecidamente mais resistentes, e, alm disso, possibilita a digesto da matria orgnica do material.
Nos espcimes no contaminados o tratamento no necessrio desde que os mesmos tenham
sido colhidos assepticamente e colocados em frasco estril. Para evitar a possibilidade de perda da
cultura por contaminao recomendvel semear metade do material, aps concentrao por
centrifugao. No caso de lquidos, guardar a outra parte na geladeira e observar os tubos semeados
nas 48 horas seguintes. Se houver contaminao, tratar o material como em 4.3 e, se no houver,
semear o restante. Para material de bipsia, deve-se macerar em graal com areia e juntar gua destilada
estril. O isolamento de micobactrias a partir do sangue comeou a ser realizado aps o advento da
AIDS, para o diagnstico de formas disseminadas.
4.3- MTODOS DE DESCONTAMINAO
Os espcimes devem ser processados para a cultura preferencialmente em tubo de polipropileno,
autoclavvel com capacidade para 30ml, com tampa de rosca. No caso de urina, deve-se centrifugar
todo o volume, em vrios tubos. Juntar os sedimentos e submeter descontaminao. Nesse processo,
o tempo de contato do agente qumico com o espcime, assim como a concentrao do agente
qumico, a neutralizao e a centrifugao (fora centrfuga e tempo) so procedimentos crticos para
o isolamento de micobactrias.
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4.3.1- MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO (9)
4.3.1.1- Indicao
Este mtodo recomendado para o tratamento de espcimes paucibacilares, por utilizar
uma concentrao mais baixa de hidrxido de sdio (1%) que a utilizada em outros mtodos
e, um agente tensoativo que facilita a homogeneizao dos espcimes.
4.3.1.2- Solues
4.3.1.2.1- Soluo Descontaminante e Fluidificante (Soluo A)
Pesar em balana de preciso 30g de lauril sulfato de sdio e 10g de hidrxido de
sdio, dissolver em 1 litro de gua destilada, previamente aquecida a 60C. Autoclavar a
121C por 15 minutos. Conservar essa soluo temperatura ambiente. Anotar na ficha
1 Controle da Preparao dos Reagentes Para o Mtodo do Lauril Sulfato de Sdio.
4.3.1.2.2- Soluo Neutralizante (Soluo B)
Juntar 6,5 ml de cido fosfrico (H
3
PO
4
) PA e 2,0ml de azul de bromotimol ou
prpura de bromocresol a 0,4% (soluo C) a 1litro de gua destilada. Autoclavar a
121C por 15 minutos.
4.3.1.2.3- Soluo de Azul de Bromotimol ou Prpura de Bromocresol a 0,4% (Soluo C)
Pesar em balana de preciso 0,4g de azul de bromotimol ou prpura de bromocresol,
e dissolver em 20ml de lcool etlico comercial. Aquecer e completar com gua destilada
at 100ml. Anotar na ficha 2 Controle da Preparao do Indicador de pH Para o
Mtodo do Lauril Sulfato de Sdio toda vez que preparar o corante.
4.3.1.3- Procedimento
Antes de tratar o material, calcular previamente o volume da soluo B necessrio para
neutralizar a soluo A. Assim que as solues forem preparadas, autoclavadas e resfriadas,
juntar 3ml de cada uma delas e medir o pH no potencimetro. A partir da fazer correes
contnuas, aumentado o volume da soluo B, at chegar ao pH 7,0, calculando-se quanto
de B neutraliza 2ml, 3ml, 4ml e 5ml da soluo A. Anotar na ficha 1 Controle da Preparao
dos Reagentes Para o Mtodo do Lauril Sulfato de Sdio.
Adicionar 3ml da Soluo A a aproximadamente 2ml do espcime contido em tubo de
centrfuga com capacidade para 30ml. No caso de escarro muito purulento deve-se aumentar
o volume da Soluo A (3,5 a 4,0ml), a fim de fluidificar o espcime. O volume de 2ml do
espcime dever ser obtido a partir da parte mais purulenta.
Agitar periodicamente por 30 minutos.
Juntar a Soluo B em volume suficiente para neutralizar a soluo A. Centrifugar a
3.000g durante 30 minutos.
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Desprezar o sobrenadante, em recipiente prova de respingos. Semear todo o sedimento
em volumes de 0,1ml por tubo de meio de cultura.
Colocar os tubos em estantes, na posio horizontal, em estufa a 36C 1C, durante
45 dias.
4.3.2- MTODO DE CORPER & STONER, MODIFICADO (6)
4.3.2.1- Indicao
Este mtodo utilizado para tratamento de espcimes paucibacilares pois a atuao do
fosfato trissdico sobre as micobactrias menor, quando comparado com outros mtodos.
4.3.2.2- Solues
4.3.2.2.1- Soluo de Fosfato Trissdico a 23% (Soluo A)
Pesar em balana de preciso 23g de Na
3
PO
4.
12H
2
O e dissolver em 100ml de gua
destilada. Esterilizar em autoclave a 121C durante 15 minutos. Anotar na ficha 3
Controle do Reagente A Para o Mtodo de Corper & Stoner.
4.3.2.2.2- Soluo de Fosfato Monossdico a 20% (Soluo B)
Pesar em balana de preciso 20g de NaH
2
PO
4
e dissolv-lo em 100ml de gua
destilada. Esterilizar em autoclave a 121C durante 15 minutos.
Anotar na ficha 4 Controle do Reagente B Para o Mtodo de Corper & Stoner
4.3.2.2.3- Procedimento
Adicionar a Soluo A em volume igual ao do espcime a ser tratado em tubo com
capacidade para 30 ml. Agitar. Deixar na estufa a 36C 1C por 24 horas. Neutralizar
com a Soluo B com volume igual ao utilizado na Soluo A. Agitar. Centrifugar a
3000 x g durante 30 minutos. Desprezar o sobrenadante em recipiente a prova de
respingos.Ressuspender o sedimento com gua destilada estril.
Semear todo o sedimento em volumes de 0,1 ml por tubo com meio de cultura.
Colocar os tubos em estantes, na posio horizontal, em estufa a 36C 1C, durante
45 dias.
4.4- MEIOS DE CULTURA
O meio mais utilizado para o isolamento de micobactrias o de Lowenstein Jensen (LJ), que
um meio solidificado base de ovo e contm glicerol e asparagina como fontes de carbono e nitrognio,
respectivamente. Esse meio permite o crescimento da maioria das espcies micobacterianas de interesse
mdico. A utilizao de piruvato de sdio como fonte de carbono ao invs de glicerol recomendado
para o isolamento de M. bovis e M. africanum. Outros meios solidificados base de gar como 7H10
e 7H11 de Middlebrook tambm podem ser utilizados para antibiogramas, estudos de morfologia
colonial, alm do cultivo primrio.
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O meio lquido 7H9 de Middlebrook bastante utilizado para o isolamento de materiais
paucibacilares inclusive sangue, quando adicionado de substncias anticoagulantes. o meio ideal
para repiques, conservao de amostras no freezer, preparao de inculos padronizados e o principal
meio de cultura dos mtodos automatizados.
A composio de diversos meios de cultura utilizados para o isolamento e/ou crescimento de
micobactrias est apresentada no quadro 1 anexo e a preparao segue as normas estabelecidas pelo
fabricante. Todos eles so encontrados no comrcio, sendo que a qualidade dos meios est diretamente
relacionada com a tradio de qualidade dos fabricantes.
Os meios podem ser utilizados em sistemas bifsicos para aumentar a chance de isolamento de
materias paucibacilares. O meio de 7H9 geralmente funciona como a fase lquida conjugado com os
solidificados inclusive o LJ.
4.4.1- MEIO DE LOWENSTEIN JENSEN (LJ)
4.4.1.1- Preparao de 1 Frmula (1.600ml de meio base)
Dissolver o meio desidratado em gua destilada, num balo de 2.000ml, segundo
recomendao do fabricante. Adicionar o glicerol. Esterilizar em autoclave a 121 C por 15
minutos. Esfriar o balo em gua corrente, agitando-o para que a fcula de batata no fique
agarrada no fundo do frasco, formamdo uma crosta branca e assim possa se distribuir
homogeneamente no meio de cultura.
Limpar, cuidadosamente, 20 ovos de tamanho mdio, com o auxlio de escova, gua e
sabo. Enxaguar bem em gua corrente e submergir em uma soluo de lcool etlico a 70%
durante 30 minutos. Retirar e secar com um pano estril.
Quebrar os ovos, um a um, separadamente, em um becher estril, para observar a qualidade
dos mesmos. Transferi-los para um copo estril de liquidificador ou mixer (para uso em
laboratrio) ou para um balo de 1.000ml com prolas de vidro. Homogeneizar.
Transferir o homogeneizado para uma proveta de 1.000ml, com o auxlio de um funil
provido de gaze estril.
Adicionar o homogeneizado ao meio base. Agitar o balo suavemente. Distribuir em
volumes de 4 ml em tubos de ensaio com 20 x 150mm.
Coagular a 80-85C por 45 minutos.
Incubar a 36C 1C por 24 horas para fazer a prova de esterilidade.
Estocar na geladeira. Anotar todo o processo na ficha 5 Controle da Produo de Meio
de Lowenstein Jensen anexa.
4.4.2- MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM PIRUVATO (PI)
Dissolver o meio desidratado em gua destilada, num balo de 2.000ml, segundo
recomendao do fabricante. Adicionar o piruvato de sdio na concentrao de 500 g/ml no
lugar do glicerol. Esterilizar em autoclave a 121 C por 15 minutos. Esfriar o balo em gua
corrente, agitando-o. Todo o restante da preparao segue como no item 4.4.1., descrito acima.
Anotar a preparao na ficha 6 Controle da Produo de Meio de Lowenstein Jensen com
Piruvato anexa.
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4.4.3- MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL (CFA)
Este meio utilizado para o isolamento de micobactrias que so exigentes de ferro/hemina
como o caso de M. hmophilum. Esta espcie isolada principalmente de leso de pele,
necessitando de temperatura de incubao de 30C 1C para seu crescimento e no Brasil j
foram relatados alguns casos isolados.
4.4.3.1- Preparao
Preparar a base segundo recomendao do item 4.4.1. Adicionar o CFA na concentrao
de 2,5 % (5 g para 200ml de meio total, adicionado de ovos). Distribuir em tubo de rosca
20 x 150 mm, em volume de 5 ml. Coagular a 80-85C durante 45 minutos. Anotar na
ficha 7 Controle da Preparao do Meio Lowenstein Jensen com Citrato Frrico Amoniacal.
4.4.4- MEIO LQUIDO 7H9 DE MIDDLEBROOK
O meio lquido 7H9 de Middlebrook o mais utilizado para repiques de cultivos, estocagem
em freezer, padronizao de inculo por turvao e semeadura de materiais liquefeitos como
sangue, macerados de tecidos, fluidos orgnicos em geral etc, e o meio de cultura utilizado nos
sistemas automatizados disponveis no mercado. Anotar as observaes do preparo na ficha 8
Controle de Produo de Meio de Cultura Middlebrook 7H9
4.4.4.1- Preparao da Base
Seguir a recomendao do fabricante em relao preparao da base. Adicionar
assepticamente o enriquecimento aps esterilizao e resfriamento do meio, na proporo
de 20 ml de aditivo para cada180 ml do meio base.
4.4.4.2- Enriquecimento ADC
O enriquecimewnto ADC parte integrante da preparao do meio 7H9 de Midlebrook.
Os fabricantes do meio base fornecem o aditivo j pronto para uso, mas pelo armazenamento
e transporte at o consumidor no ser adequado muitas vezes o crescimento das culturas
neste meio deixa a desejar. Na nossa rotina trabalhamos igualmente com o aditivo pronto e
com este preparado, dando bons resultados.
4.4.4.2.1- Preparao
Albumina bovina frao V ..............................................................................5,0g
Dextrose ........................................................................................................2,0g
Catalase .....................................................................................................0,003g
H
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O destilada qsp ......................................................................................100ml
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pesar os sais e dissolver em gua destilada numa proveta graduada;
esterilizar por filtrao em membrana esterilizante;
distribuir em volumes de 20ml, assepticamente, em frascos de tampa de rosca;
fazer o teste de esterilidade;
guardar na geladeira a 4 C por at 6 meses;
este enriquecimento utilizado na composio do meio 7H9 de Middlebrook;
anotar a preparao na Ficha 9 Controle de Preparao do Enriquecimento ADC.
4.4.5- MEIO LQUIDO 7H9 DE MIDDLEBROOK COM SPS (2)
Este meio adicionado do anticoagulante polianetol sulfonato de sdio na concentrao de
0,025%, que rompe os leuccitos e favorece a liberao de bacilos para o meio de cultura. O
sangue deve representar 1/10 ou 1/20 em relao ao meio de cultura.
4.4.5.1- Preparao
Seguir a recomendao do fabricante em relao preparao da base. Adicionar 0,05g
de SPS base antes da autoclavao, para o volume de 200ml de meio final. Aps esterilizao
e resfriamento do meio, adicionar assepticamente o enriquecimento na proporo de 20ml
de aditivo para cada180 ml do meio base. Distribuir em volumes de 10ml em tubos ou
erlenmeyer estreis. Anotar as observaes do preparo na ficha 9 Controle de Produo de
Meio de Cultura Middlebrook 7H9 com SPS.
4.4.6- INCUBAO E LEITURA DE RESULTADOS
Aps a semeadura em meio solidificado, inclinar os tubos, em uma bandeja, com as tampas
afrouxadas para permitir a secagem do inculo. A temperatura tima de incubao varia de 35 a
37 C. Para espcimes obtidos de pele e de leses superficiais e para crescimento de culturas de
M. fortuitum, M. chelon, M. marinum, M. ulcerans, M.hmophilum, a temperatura de incubao
dever ser de 30 1C. Os tubos devem ser examinados nas primeiras 48 horas para a verificao
da secagem do inculo e quanto presena de contaminao, sendo que a cor esbranquiada
indica alcalinizao e a cor verde intensa indica acidificao. Fazer inspees dirias dos tubos
durante 48 horas, sem remov-los da estufa, para a verificao de contaminaes. Fazer leituras
semanais at a 6 semana e aps 20 dias fazer a primeira leitura e retirar os tubos com crescimento
eugnico de colnias. Anotar os resultados na ficha 10 Anotao dos Resultados das Culturas
e reincubar os tubos sem crescimento.
Informar os resultados das culturas positivas, relatando aspecto (forma, cor) e quantidade de
colnias crescidas, segundo a escala semiquantitativa abaixo:
(+++) Colnias confluentes
( + + ) Colnias separadas (mais de 100)
( + ) 20 a 100 colnias
( 0 ) Sem crescimento
( C ) Contaminado
As colnias de M. tuberculosis apresentam cor creme, so rugosas, desenvolvem na superfcie
do meio e no alteram a cor do LJ.
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As leituras dos meios lquidos so baseadas na turvao que apresentam nos tubos (resultado
positivo) e na evidncia ou no da presena de grumos no fundo do tubo.
4.5- BIOSSEGURANA
Este teste dever ser executado segundo a tcnica assptica, em rea de biossegurana nvel 3 em
cabine de segurana biolgica classe II B2 ou B3. O tcnico dever estar utilizando equipamentos de
proteo individual como luva, respirador N 95/N99, avental descartvel, pipetador automtico.
Aps a execuo das semeaduras ou leitura das culturas, descartar todo o material em recipiente
de ao com tampa, para ser esterilizado em autoclave a 121
o
C durante 15 minutos. Aps este processo
o contedo lquido dos frascos de ensaio ser descartado no esgoto da pia sob fluxo de gua corrente
e os restos de meio de cultura no lixo adequado, segundo plano do LACEN.
4.6- MATERIAL NECESSRIO
autoclave;
cido fosfrico PA;
agitador de tubos;
lcool etlico a 70%;
lcool etlico comercial 95% GL/92,5 INPM;
avental;
azul de bromotimol em p;
balana de preciso;
balo com prolas de vidro;
balo;
batedeira;
becher;
cabine de segurana biolgica classe II B2 ou B3;
caneta hidrogrfica;
carrinho de ao;
centrfuga refrigerada;
citrato frrico amoniacal;
coagulador;
contador de colnias;
deionizador de gua;
erlenmeyer;
esptula de pesagem;
estantes de madeira;
estufa bacteriolgica;
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6 6
fosfato monossdico em p;
fosfato trissdico em p;
frasco de reagentes, com tampa de rosca, 2.000ml;
funil de ao;
gaze;
geladeira;
glicerol;
hidrxido de sdio em lentilhas;
lauryl sulfato de sdio em p;
luva de ltex ou vinil;
meio de Lowenstein Jensen em p;
meio 7H9 de Middlebrook em p;
ovos;
pipetas de borosilicato;
piruvato de sdio PA;
polianetol sulfonato de sdio;
potencimetro;
proveta de 1000ml;
prpura de bromocresol em p;
recipiente a prova de respingo;
recipiente de ao para descarte de material contaminado;
tubos de borosilicato, 20x150mm;
tubos com meio de Lowenstein Jensen;
tubos com meio 7H9 de Middlebrook;
tubos de polipropileno de 30ml.
4.7- ILUSTRAES
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A
6 7
4.8- BIBLIOGRAFIA
1- BRASIL/MS/FUNASA/CENEPI/ CRPHF - Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 1994. 2 ed revisada e
ampliada.
2- DAVID, H; BRUM, P & PRIETO, E. Manual de Microbacteriologia em Sade Pblica: Princpios e Mtodos. Lisboa: Instituto
de Higiene e Medicina Tropical, 1994.
Pasteur; 1989.
4- DIFCO. Manual DIFCO. Detroit. 10 ed.
Control, 1985.
6- MAGARO, MF & LINHARES, H. Diagnstico bacteriolgico da tuberculose. Rio de Janeiro: Campanha Nacional Contra
a Tuberculose,1949.
7- NOLTE, FS & METCHOCK, B. Mycobacterium. IN: MURRAY, PR; BARON, EJ [ET ALII]. Manual of Clinical
Microbiology. Washington: American Society for Microbiology; 1994. 6
th
ed; pp: 400-437.
9- SAMPAIO, JLM; ALVES, VAF; LEO, SC [ET ALII]. Mycobacterium hmophilum: emerging or undiagnosed in Brazil?
Emerg Infect Dis, 2002; 8:1359.
10-TISON, F. & CARBONELLE, B. Recherche, isolement et tude du bacille tuberculeux et des autres mycobactries en pratique
courant. Sille: Crouan et Roques (ed), 1972.
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6 8
*Para prepa rar LJ com piruvato de sdio, basta adicionar o sal na concentrao de 500ug/ml de meio
base. No adicionar glicerol.
QUADRO 1- COMPOSIO DOS PRINCIPAIS MEIOS DE CULTURA
UTILIZADOS PARA O ISOLAMENTO E CRESCIMENTO DE MICOBACTRIAS
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6 9
PESAGEM / VOLUME
NEUTRALIZAO
Laurilsulfato de Sdio
Hidrxido de sdio
QUANTIDADE
GUA DESTILADA
Laurilsulfato de Sdio
Hidrxido de sdio
SUBSTNCIA
Azul de bromotimol
SOLUO A
SOLUCO B
1 ml
2 ml
3 ml
4 ml
5 ml
6 ml
RESPONSVEL
OBSERVAES
PARA O MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO
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7 0
Azul de bromotimol
Purpura de Bromocresol
lcool Etlico Comercial 95
Azul de bromotimol
Purpura de Bromocresol
SUBSTNCIA QUANTIDADE
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAODO INDICADOR
DE pH PARA O MTODO DO LAURIL SULFATO DE SDIO
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PESAGEM / VOLUME
Na PO .12 H O
3 4 2
Na PO .12 H O
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H O destilada
2
RESPONSVEL
OBSERVAES
FICHA 3- CONTROLE DO REAGENTE A PARA O MTODO DE CORPER-STONER
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PESAGEM / VOLUME
Na H PO
2 4

H O destilada
2
Na H PO
2 4

RESPONSVEL
OBSERVAES
FICHA 4- CONTROLE DO REAGENTE B PARA O MTODO DE CORPER-STONER
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7 3
FICHA 5- CONTROLE DE PRODUO DE
MEIO DE CULTURA LOWENSTEIN JENSEN
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FICHA 6- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE
LOWENSTEIN JENSEN COM PIRUVATO DE SDIO
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FICHA 7- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO
LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL
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FICHA 8- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9
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Catalase
Dextrose
Albumina Frao V
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Catalase
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Albumina Frao V
SUBSTNCIA QUANTIDADE GUA DESTILADA
FICHA 9- CONTROLE DA PREPARAO DO ENRIQUECIMENTO ADC
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FICHA 10- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO
DE CULTURA MIDDLEBROOK 7H9 COM SPS
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SUPERVISOR
DATA
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LEITURA DE DIAS
N DA CULTURA RESULTADO OBSERVAES
NMERO
RESPONSVEL
FICHA 11- LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS
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Captulo 5
IDENTIFICAO DE MICOBACTRIA
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5.1- CARACTERSTICAS GERAIS DAS MICOBACTRIAS
As micobactrias esto posicionadas taxonomicamente na Ordem Actinomycetales, Subordem
Corynebacterine Famlia Mycobacteriace, sendo Mycobacterium tuberculosis a espcie-tipo do Gnero
Mycobacterium, que apresenta aproximadamente 100 espcies descritas. Esse constitudo por bacilos
imveis, no esporulados, no encapsulados, medindo de 1 a 10 micrmetros de comprimento por
0,2 a 0,6 micrmetros de largura, sendo a propriedade morfotintorial do lcool-cido resistncia a
mais importante desse gnero. O alto contedo lipdico da sua parede celular, que pode atingir at
40 % do peso seco das clulas, responsvel por importantes efeitos biolgicos no hospedeiro, como
a induo da formao de granuloma, atividade adjuvante, induo da formao de zona
eletrotransparente, antigenicidade etc. A maioria das espcies cultivada in vitro e no requer fatores
de crescimento para sua nutrio, sendo o glicerol e a asparagina as principais fontes de carbono e
nitrognio, respectivamente. Algumas espcies patognicas apresentam exigncias nutritivas como o
caso de M. hmophilum em relao hemina ou hemoglobina, e outras so incultivveis, como o
caso de M. lepr. De modo geral as clulas apresentam crescimento lento, sendo que M. tuberculosis
tem o tempo de gerao de 18 horas em meio de Lowenstein Jensen(LJ). A maioria das micobactrias
de interesse humano e animal tem como temperatura tima de crescimento 35/37C. So resistentes
s aes de agentes qumicos, mas sensveis ao de agentes fsicos, como a radiao ultravioleta e o
calor. So aerbias ou microaerfilas. A pigmentao que algumas espcies de micobactrias apresentam
determinada pela sntese de -carotenos.
5.2- ESPCIES DE INTERESSE EM PATOLOGIA HUMANA
M. tuberculosis a espcie cultivvel de maior importncia mdica por ser o principal agente
etiolgico da tuberculose, e, juntamente com M. bovis, M. africanum e M. microti formam o Complexo
M. tuberculosis. A incluso de outras espcies no complexo ainda est em discusso. Embora outras
espcies patognicas e potencialmente patognicas sejam isoladas em uma freqncia baixa em nosso
meio, importante que laboratrios de referncia possam identific-las corretamente para orientar o
tratamento. As micobactrias no tuberculosas (MNT) mais isoladas no Brasil so as do Complexo
M.avium-intracellulare, M. fortuitum, M. kansasii e M. abscessus e causam principalmente doena
pulmonar e ganglionar. Essas e outras formas tm sido encontradas em pacientes soropositivos para o
vrus da imunodeficincia adquirida, sendo que esse grupo contribui hoje com a metade da casustica
das micobacterioses no Brasil. Outras espcies de interesse humano tm sido isoladas em algumas
regies do mundo como M. marinum, M. xenopi, M. ulcerans, M. szulgai, M. hmophilum, M.
malmoense, M.africanum, mas at o momento so pouco conhecidas no nosso meio.
Como essas espcies podem ser isoladas tambm do meio ambiente (solo, gua, etc.) deve-se ter
cautela em atribuir a elas a responsabilidade pela etiologia da doena. Para tal necessrio que se isole
repetida e sucessivamente a espcie em meio de cultura (pelo menos 3 isolamentos), com crescimento
superior a 20 colnias ou isolamento a partir de material de leso fechada. O isolamento de M.
tuberculosis mesmo em cultura mista com outra espcie exclui a possibilidade de uma micobacteriose.
5.3- BIOSSEGURANA
Estes testes de identificao de micobactrias devero ser executados assepticamente em rea de
biossegurana NB3 em cabine de segurana biolgica Classe II B2 ou B3. O operador dever estar
utilizando equipamentos de proteo individual como luva, respirador N 95/99, avental descartvel,
pipetador automtico para o manuseio de culturas de microrganismos.
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Ao preparar os reagentes qumicos, os tcnicos devero observar as recomendaes contidas no
captulo BIOSSEGURANA, j que para cada produto qumico existe recomendao especfica quanto
ao uso de EPIs. Aps a execuo de cada teste, o material dever ser colocado em recipiente de ao
com tampa para ser esterilizado em autoclave a 121C por 15 minutos. O contedo dos frascos
poder ser descartado no esgoto da pia, sob gua corrente ou obedecendo ao plano de rejeitos do
LACEN.
5.4- IDENTIFICAO DAS ESPCIES
Em 1958, Runyon props uma diviso das micobactrias mais freqentemente isoladas no
laboratrio, baseada em caractersticas simples de serem observadas: o tempo de crescimento e a
pigmentao das colnias. Originalmente constava de 4 grupos e no inclua as espcies tpicas como
M. tuberculosis e as no cultivveis como M. lepr.
Essa classificao ainda de grande utilidade e, juntamente com as provas de crescimento em
presena de agentes inibidores, permitem constituir grupamentos preliminares antes da escolha dos
testes bioqumicos para a identificao em espcies, dentro de cada grupo.
A seguir se descrever uma metodologia bsica para se identificarem os principais membros do
Complexo M.tuberculosis (grupo 0) e as demais espcies de interesse mdico e epidemiolgico no
Brasil, grupadas de acordo com as propriedades de tempo de crescimento e presena de pigmentao
(grupos de I a IV). Ver tabela 1 anexa Identificao das Micobactrias Mais Importantes Clinicamente.
Existem outros mtodos, que so utilizados, para a identificao de micobactrias. Alguns se
baseiam em caractersticas fenotpicas e outras genotpicas. Entre os primeiros se destaca o estudo dos
cidos miclicos, que se encontram na parede celular de todas as micobactrias. A anlise desses
cidos efetuada atravs de cromatografia, sendo que a de camada fina j vem sendo usada h muitos
anos, conjuntamente com os testes culturais e bioqumicos, para auxiliar na identificao final. A
cromatografia gasosa e a lquida so metodologias mais sofisticadas, que se propem a identificar
todas as espcies micobacterianas. O HPLC, iniciais em ingls de cromatografia lquida de alta
performance, foi incorporada na rotina de testes de identificao do CDC (Centers for Disease Control
I - FOTOCROMOGNICAS
II - ESCOTOCROMOGNICAS
III - NO CROMOGNICAS
IV - CRESCIMENTO RPIDO
Crescimento lento. Colnias no pigmentadas
que adquirem cor que pode variar do amarelo
ao laranja quando expostas luz.
Crescimento lento. Colnias adquirem cor que
pode variar do amarelo ao laranja quando culti-
vadas na ausncia ou na presena da luz.
Crescimento lento. Colnias geralmente no
pigmentadas (cor creme).
Desenvolvem colnias nos meios de cultura
em 7 dias ou menos.
Podem ser pigmentadas ou no.
GRUPO DESCRIO
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and Prevention) dos Estados Unidos, em 1989, e em 1990 foi colocada como teste padro para
identificao naquele Centro. Entre os testes genticos ou moleculares, existem testes comerciais ou
no. Os comerciais mais utilizados so o GEN-PROBE, que tem como molcula alvo o RNA ribossomal
e o INNO-LIPA. So tcnicas com o resultado final rpido, relativamente simples, mas que identi-
ficam um nmero limitado de espcies. Entre os mtodos no comerciais, o que mais tem chamado
a ateno dos micobacteriologistas nos ltimos anos o PRA, que foi descrito em 1993, e se baseia no
PCR (iniciais em ingls de reao da polimerase em cadeia) do gen que codifica a protena 65-KDa,
e anlise de enzimas de restrio do produto gerado pelo PCR, atravs de eletroforese. Essa tcnica
tem se mostrado importante com o mtodo de apoio na identificao de micobactrias, e na
caracterizao de novas espcies.
Outra metodologia que utilizada tanto na identificao de espcies quanto em estudos filogenticos
o seqenciamento gentico. Este mtodo consiste na amplificao, atravs de PCR, do gen que
codifica a subunidade 16S do RNA ribossomal, seguido de seqenciamento do mesmo. A identificao
acontece pela comparao com seqncias de referncia. Esta metodologia considerada padro-ouro
nos pases desenvolvidos.
importante salientar que nenhuma dessas tcnicas, isoladamente, capaz de identificar todas as
espcies de micobactrias descritas na literatura. Existem ocasies em que a conjugao de duas ou
mais dessas tcnicas se faz necessria para identificao definitiva de uma determinada espcie.
5.5- TEMPO DE CRESCIMENTO E PRODUO DE PIGMENTO (3,9)
5.5.1- PRINCPIO
As micobactrias podem ser grupadas segundo o tempo de crescimento e a presena de
pigmentao ou no, o que motivou Runyon a separ-las em grupos, de acordo com essas
propriedades. O tempo de crescimento no deve ser observado de cultivo primrio, uma vez que
no processo de descontaminao algumas micobactrias de crescimento rpido podem levar
mais que uma semana para desenvolver colnias no meio de cultura.
5.5.2- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, semear 0,1 ml da suspenso bacteriana
na diluio 10
-5
segundo padronizao para teste de sensibilidade indireto (ver Captulo 6 TESTE
DE SENSIBILIDADE DE M. tuberculosis AOS ANTIBITICOS E QUIMIOTERPICOS) em 2 tubos de LJ cobertos
com papel alumnio. Incubar em estufa a 36C 1
0
C.
5.5.3- LEITURA E INTERPRETAO
Verificar crescimento visvel, diariamente durante 7 dias e depois at completar 4-6 semanas.
Quando for observado crescimento registrar a pigmentao desenvolvida e expor um dos tubos
coberto com papel alumnio, iluminao de lmpada fluorescente (30 a 60 W), durante 4
horas, numa distncia de aproximadamente 30 cm. Afrouxar as tampas dos tubos, pois o oxignio
indispensvel sntese de pigmentos carotenides. Reincubar overnight e observar a
pigmentao desenvolvida aps esse perodo comparando com o tubo que no foi exposto luz.
Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
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5.5.4- RESULTADO
5.6- CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES INIBIDORES (7, 9, 24)
5.6.1- INDICAO
Estes testes so utilizados na identificao das espcies micobacterianas:
o cido p-nitrobenzico (PNB-500 g/ml) separa os membros do Complexo M.tuberculosis,
que so sensveis, das demais micobactrias, que so resistentes, excetuando algumas estirpes
de M.kansasii, M.gastri, M. gordon e M.marinum;
a hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico (TCH -2 g/ml) separa M. tuberculosis, que resistente
ao contrrio dos demais membros do Complexo M.tuberculosis, que so sensveis.
NOTA: Esses dois agentes identificam M. tuberculosis em 20 dias, quando se semeia diretamente
escarro positivo a baciloscopia, em meio de cultura contendo esses inibidores.
a cicloserina (CS -30 g/ml) separa M.bovis (BCG), que resistente, dos demais membros do
Complexo M. tuberculosis. Alm de ser til na separao de M.szulgai, que resistente, das
demais escotocromognicas;
o ofloxacin (OFLO-2 g/ml) utilizado para separar Complexo M. fortuitum, que sensvel,
do Complexo M.chelon, que resistente;
o etambutol (EMB - 2 g/ml) separa o Complexo M.avium-intracellulare, que resistente,
das demais espcies no cromognicas de crescimento lento;
a pirazinamida (PZA-100 g/ml) separa M. bovis e M. bovis (BCG), que so resistentes, de
M.tuberculosis, que sensvel;
a hidroxilamina (HX-500 g/ml) separa Complexo M. fortuitum e M.chelon, que so
resistentes, do restante das micobactrias de crescimento rpido.
5.6.2- PREPARAO E TCNICA
Semear 0,1 ml de suspenso bacteriana na diluio 10
3
da escala de MacFarland em tubos
com meio LJ (controle) LJ contendo PNB, TCH, EMB, CS, OFLO e PZA, e HX, como descrito
no Captulo 6. Anotar a preparao das drogas na ficha 2 Controle dos reagentes para crescimento
em presena de agentes inibidores.
TUBO COBERTO
TUBO EXPOSTO
LUZ
CROMOGENICIDADE
POSITIVO NEGATIVO
sem pigmento sem pigmento
no cromognica
grupo III
M. terr
M. gordon
com pigmento com pigmento
escotocromognica
grupo II
M.gordon
M. terr
sem pigmento com pigmento
fotocromognica
grupo I
M. kansasii M. terr
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A leitura deve ser efetuada como no teste de sensibilidade considerando-se 1% a proporo
crtica para todas as drogas, excetuando-se a pirazinamida que de 10%. Anotar os resultados na
ficha 3 Resultado de Leitura de Crescimento em Presena de Agentes Inibidores (anexa).
5.6.4- CONTROLE DE QUALIDADE
Para o controle de qualidade so utilizadas todas as cepas descritas no item 5.6.1.
5.7- CRESCIMENTO EM GELOSE NUTRITIVA (7,9)
5.7.1- INDICAO
Esta prova utilizada para separar as espcies de crescimento lento daquelas de crescimento
rpido.
5.7.2- PREPARAO
5.7.2.1- Meio de Cultura
Preparar Agar nutriente segundo recomendao do fabricante.
Distribuir volumes de 5ml em tubos de rosca 20 x 150 mm. Autoclavar a 121C por 15
minutos e inclinar. Anotar a preparaao na ficha 4 Controle de Produo de Meio de
Gelose Nutritiva.
5.7.3- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, fazer uma suspenso padronizada como
para teste de sensibilidade (ver Captulo 6) e semear 0,1ml da diluio 10
-3
, nos tubos contendo
o meio de gelose. Incubar em estufa a 36C 1
0
C. Fazer leituras dirias at o stimo dia e depois
semanalmente at completar 4 semanas. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da
Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
5.7.4- LEITURA
Positiva: Crescimento de colnias (+ a +++), conforme descrito no Captulo 4 Cultura.
Positivo: M. fortuitum
Negativo: M. tuberculosis
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5.8- CRESCIMENTO EM AGAR MacCONKEY (3,14)
5.8.1- INDICAO
Este meio base de sais biliares, que so agentes inibidores, e funciona como meio seletivo
para micobactrias, pois a maioria das espcies no cresce, excetuando-se os Complexos M.
fortuitum e M. chelon.
5.8.2- PREPARAO
5.8.2.1- Meio de Cultura
Dissolver o meio desidratado em gua (agar MacConkey sem cristal violeta), segundo a
recomendao do fabricante. Aquecer at a completa dissoluo do agar. Distribuir em
volumes de 5 ml em tubos de rosca 20 x 150 mm. Esterilizar em autoclave a 121C por 15
minutos. Inclinar os tubos e deixar esfriar. Anotar na ficha 5 Controle de Produo de
Meio MacConkey Sem Cristal Violeta.
5.8.3- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, fazer uma suspenso padronizada como
para teste de sensibilidade (ver captulo) e semear 0,1ml da diluio 10
-3
no tubo com o meio
teste. Incubar em estufa a 28C, 1
0
C, por 11 dias.
Fazer a leitura com 5 e 11 dias de incubao. O teste positivo quando ocorre crescimento
em toda extenso da rea semeada, com alterao ou no da colorao do meio de cultura. O
teste negativo quando h ausncia de crescimento, e no se considera positivo a ocorrncia de
colnias na parte inferior do meio da cultura, onde o inculo mais denso. Anotar estes resultados
na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positivo: M. fortuitum ou M. chelon
Negativo: M.phlei
5.9- CRESCIMENTO EM MEIO COM CLORETO DE SDIO A 5% (5,9)
5.9.1- PRINCPIO
A maioria das micobactrias de crescimento rpido cresce em meio contendo o cloreto de
sdio. A incapacidade de M. chelon crescer neste meio facilita sua distino do Complexo M.
fortuitum.
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5.9.2- PREPARAO
Adicionar o cloreto de sdio base de Lowenstein Jensen de modo que este meio fique na
concentrao final de 5% (10 g em 200 ml da base do meio total). Distribuir o meio em
volumes de 5 ml, em tubos de rosca 20 x 150 mm. Coagular a 80C, por 40 a 45 minutos.
Anotar na ficha 6 Controle da Preparao do Meio de Lowenstein Jensen com NaCl.
5.9.3- TCNICA
Fazer uma suspenso bacteriana que corresponda ao tubo n 1 da escala MacFarland (ver
Captulo 6). Semear 0,1ml em um tubo de Lowestein-Jensen com NaCl e um de Lowestein
Jensen sem NaCl (controle). Incubar a 36C 1C. Fazer a leitura com 7e 14 dias ate 4 semanas
(leitura final). Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em
modelo anexo.
Em caso de micobactrias de crescimento lento, semear 0,1 ml da diluio 10
-3
da escala
MacFarland (ver Captulo 6).
Positiva: Crescimento no tubo controle e no tubo com NaCl. Se mais de 50 colnias se
desenvolverem no meio com NaCl em at 4 semanas, o teste positivo. O inculo no tubo
controle deve fornecer numerosas colnias no mesmo perodo de tempo.
Negativa: Crescimento somente no tubo controle.
Negativo: M.chelon
5.10- PRODUO DE NIACINA (3,12)
5.10.1- PRINCPIO E INDICAO
A niacina desempenha um papel vital nas reaes de oxidao-reduo que ocorrem durante
as snteses metablicas em todas as micobactrias. Ela funciona com um precursor na biossntese
de coenzimas. Embora todas as micobactrias produzam cido nicotnico, estudos comparativos
tm mostrado que, devido a um bloqueio de uma via metablica, M. tuberculosis acumula uma
quantidade maior e a deteco dessa niacina acumulada til no diagnstico deste microrganismo.
O teste de niacina pode ser utilizado isoladamente para identificar M. tuberculosis, embora algumas
estirpes de M.simi, M. africanum e M.chelon possam dar resultado positivo.
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5.10.2- PREPARAO
Utilizam-se fitas impregnadas com reativos, disponveis comercialmente.
5.10.2.1- Soluo Salina a 0,85%
Dissolver 0,85 g de cloreto de sdio em 100 ml de gua destilada. Esterilizar em autoclave
a 121C por 15 minutos
5.10.3- TCNICA
antes da realizao do teste, verificar se as culturas tm pelo menos 4 semanas de crescimento
em meio base de ovo e no mnimo 50 colnias. Uma vez que o microrganismo excreta niacina
no meio de cultura, cortar levemente a superfcie do meio com uma ala bacteriolgica para
assegurar que o lquido entre em contato com o meio de cultura e extraia a niacina a presente;
adicionar 1,5 ml de gua destilada estril ou soluo salina sobre a cultura a ser testada;
colocar os tubos horizontalmente de modo que o lquido cubra toda a superfcie do meio;
deixar no mnimo 15 minutos para haver a extrao da niacina. Esse tempo pode ser maior
quando a cultura tem poucas colnias ou quando o microrganismo testado conhecidamente
um fraco produtor de niacina. Os tubos podem ser colocados em estufa a 36C para acelerar a
extrao;
OBS: As culturas crescidas em meio base de ovo fornecem resultados mais satisfatrios. Se for
necessrio usar culturas, crescidas em meio de 7H-10 ou 7H-11, usar o meio suplemen-
tado com aspartato de potssio a 0,1% ou aumentar o tempo de extrao (2 horas em estufa a
36C 1
0
C);
remover 0,6 ml do lquido extrator para um tubo com tampa de rosca de 13x100mm.
colocar a fita num tubo com gua. Observar o aparecimento de cor amarela at um mximo de
30minutos. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em
modelo anexo;
Positiva: Desenvolvimento de cor amarela.
Negativa: No h mudana de cor.
5.10. 5- CONTROLE DE QUALIDADE
Positivo: M. tuberculosis
Negativo: M.avium
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5.11- REDUO DO NITRATO (25)
5.11.1- INDICAO
Separar M. tuberculosis (positivo) das outras espcies do Complexo M. tuberculosis. Alm
disso separar o Complexo M.fortuitum (positivo) do Complexo M.chelon (negativo). til
na identificao de M.kansasii.
5.11.2- SOLUES
5.11.2.1- Soluo Substrato
(soluo de nitrato de sdio 0,01 M em tampo fosfato 0,022 M, pH 7,0)
Nitrato de sdio ................................................................................................0,085g
KH
2
PO
4
............................................................................................................0,117g
Na
2
HPO
4
.12 H
2
O ............................................................................................0,485g
gua destilada ...................................................................................................100ml
Dissolver os sais em 100 ml de gua destilada. Esterilizar em autoclave a 121C durante
15 minutos. Anotar toda a preparao na ficha 7 Controle de Preparao da Soluo
Substrato Para a Prova da Reduo do Nitrato (ver anexo).
5.11.2.2- Reativos
reativo n1 - Adicionar cuidadosamente 50ml de HCL concentrado em 50ml de gua
destilada. ADICIONAR O CIDO SOBRE A GUA;
reativo n2 - Dissolver 0,2 g de sulfanilamida em 100 ml de gua destilada;
reativo n3 - Dissolver 0,1g de hidrocloridrato de N-naftiletilenodiamina em100 ml de
gua destilada. Guardar em refrigerador o substrato e os reativos em frasco escuro. Desprezar
os reativos se houver mudana de cor ou formao de precipitado;
Anotar toda a preparao na ficha 8 Controle de Preparao dos Reagentes Reveladores da
Prova da Reduo do Nitrato.
5.11.2.3- Escala Padro Para Leitura
Preparar as seguintes solues estoques (ver esquema 1, anexo):
n1 - Na
2
HPO
4
M/15 (1,1864g em 100 ml de gua destilada q.s.p.);
n2 - KH
2
HPO
4
M/15 (0,90726g em 100 ml de gua destilada q.s.p.);
n3 - Na
3
HPO
4
.12 H
2
O M/15 (3,047 em 100 ml de gua destilada q.s.p.);
n4 - fenolftalena a 1% (1g em 100 ml de lcool etlico comercial a 95);
n5 - azul de bromotimol a 1% (1g em100 ml de lcool etlico comercial a 95); Anotar
na ficha 9 Controle da Preparao do Azul de Bromotimol a 1%
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n6 - azul de bromotimol a 0,01% (misturar 1,0ml da soluo estoque n5 com 100ml
de gua destilada).
preparar um tampo pela mistura de: 35ml da soluo estoque n1, 5ml da soluo
estoque n2 e 100ml da soluo estoque n3. Colocar numa estante 8 tubos de rosca
13 x 100mm, numerados de 1 a 8. Distribuir 2ml do tampo nos 7 primeiros tubos;
preparar uma mistura composta por 10ml do tampo, 0,1ml da soluo estoque n4,
0,2ml da soluo estoque n6 e transferir 2ml dessa soluo ao tubo n8, que corresponder
ao tubo 5+ na escala padro; e 2ml ao tubo n1; homogeneizar e transferir 2ml para o
tubo n2, e assim sucessivamente at o tubo n7, desprezando os 2ml excedentes deste
tubo. A escala padro de leitura para o teste da reduo do nitrato corresponder a:
tubo n7 (+/-)
tubo n5 (1 +)
tubo n4 (2 +)
tubo n2 (3 +)
tubo n1 (4 +)
tubo n8 (5 +)
Esta escala dever apresentar uma faixa de colorao variando do rseo-claro at o vinho.
Esterilizar em autoclave a 121C por 15 minutos, lacrar e estocar em geladeira a 4C,
aproximadamente. Anotar na ficha 10 Controle da Preparao dos Reagentes Para Leitura
da Prova da Reduo do Nitrato.
5.11.3- TCNICA
adicionar 0,2ml de gua destilada estril em tubos 13x100mm;
a partir de um cultivo recente em meio solidificado emulsionar duas alas de crescimento em
gua destilada;
adicionar 2,0ml de NaNO
3
(substrato) aos tubos;
agitar manualmente e incubar por 2 horas em banho-maria ou estufa a 36C 1C;
retirar o tubo do banho-maria;
adicionar 1 (uma) gota de reativo n 1;
adicionar 2 (duas) gotas de reativo n 2;
adicionar 2 (duas) gotas de reativo n 3;
observar imediatamente a formao de cor rosa ao vermelho.
Positiva: Pode variar do rosa plido (+/-) ao vermelho intenso (5+) quando comparado com a cor
dos padres. Considerar positivo o tubo com cor a partir de 3+.
Negativa: Nenhuma cor. Se no h aparecimento de cor, o teste pode ser negativo ou a reduo
se processou alm do nitrito formando N
2
. Adicionar uma pequena quantidade de zinco em p
a todos os testes negativos.
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Se o nitrato ainda estiver presente, ele ser reduzido cataliticamente pelo zinco, e se desenvolver
cor vermelha, indicando que o teste verdadeiramente negativo.
Se no h desenvolvimento de cor quando adicionado, significa que a reao original era
positiva, ou seja, o nitrato foi reduzido a nitrito e este ltimo foi tambm reduzido a N
2
. Como
o teste verifica a presena do nitrito, no h desenvolvimento de cor, embora a reduo do nitrato
tenha ocorrido. Nesse caso, o teste considerado como positivo e aconselhvel que se repita o
teste para confirmar a observao. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao
Bioqumica, em modelo anexo.
Positivo: M.tuberculosis (3+ a 5+)
Negativo: M.bovis ou tubo no inoculado
5.12- CATALASE A 68C (13)
5.12.1- INDICAO
A catalase uma enzima intracelular e solvel, capaz de clivar o perxido de hidrognio em
gua e oxignio. Virtualmente, todas as micobactrias possuem esta enzima, exceto certas estirpes
mutantes de M. tuberculosis resistentes a isoniazida e M. bovis. Vrios estudos tm demonstrado
que as micobactrias possuem tipos de catalase que variam em relao estabilidade ao calor. O
Complexo M. tuberculosis pode ser separado das demais micobactrias, por apresentar catalase
que se inativa pelo calor.
5.12.2- SOLUES
5.12.2.1- Soluo de Tampo Fosfato M/15, pH 7,0 segundo Soerensen
Ver preparao no Captulo 10 SOLUES E REAGENTES. MATERIAL DO LABORATRIO.
Esterilizar em autoclave a 121C durante 15 minutos. Distribuir volumes de 0,5 ml em
tubos 13 x 100 mm, quando for realizar a prova.
5.12.2.2- Perxido de Hidrognio a 30% ou 110 volumes (Superoxol, Perhidrol)
5.12.2.3- Soluo de TWEEN 80 a 10%
Dissolver 10ml de TWEEN 80 em 90 ml de gua destilada. Esterilizar em autoclave a
121C durante 10 minutos. Anotar na ficha 11 Controle da Preparao do TWEEN 80
Para a Prova da Catalase.
5.12.2.4- Soluo Reveladora
Imediatamente antes do uso, misturar partes iguais de TWEEN 80 a 10% e perxido de
hidrognio.
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Anotar todas estas etapas na ficha 12 Controle da Preparao dos Reagentes Para a Prova
da Catalase (ver anexo).
5.12.3- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, emulsionar uma ala cheia de crescimento
em 2 tubos contendo 0,5 ml de tampo fosfato. Colocar um dos tubos em banho-maria a 68C
por 20 minutos e o outro em temperatura ambiente (tubo controle). Retirar o tubo do banho-
maria e deixar esfriar. Adicionar 0,5 ml da soluo reveladora nos 2 tubos. Observar a formao
de bolhas e considerar o tempo de leitura at 20 minutos. Anotar estes resultados na ficha 1
Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positiva: Formao de bolhas nos 2 tubos (catalase termoestvel)
Negativa: Formao de bolhas apenas no tubo controle (catalase termolbil)
IMPORTANTE: No agitar os tubos para fazer a leitura, pois o TWEEN 80 forma bolhas.
Negativo: M.tuberculosis
Positivo: M.kansasii
5.13- BETA-GLICOSIDASE (16)
5.13.1- INDICAO
Esta prova utilizada para separar o Complexo M.chelon (negativo) do Complexo M.
fortuitum (positivo) que hidroliza enzimaticamente o substrato, liberando p-nitrofenol.
5.13.2- SOLUES
Pesar em balana de preciso 300 mg de p-nitrofenil--D-glicopiranosdio e dissolv-lo
em 100ml de tampo TRIS (hidroximetilaminometano) 0,05 M, pH 7,0. A soluo obtida
incolor e pode ser conservada por duas semanas em geladeira a 4C, aproximadamente.
Anotar a preparao na ficha 13 Controle da Preparao dos Reagentes Para a Prova da
Beta-glicosidase.
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5.13.2.2- Soluo de Tampo TRIS a 0,05 M
Pesar em balana de preciso 0,6057g de tampo TRIS e dissolv-lo em 100ml de gua
destilada. Esterilizar em autoclave a 121C durante 15 minutos. Anotar a preparao na
ficha 14 Controle da Preparao do Tampo Para a Prova Beta-glicosidase.
Ver esquema 2 Preparao dos Reativos da -glicosidase anexo.
5.13.3- TCNICA
Distribuir 0,5 ml do substrato em tubos de ensaio com rosca 13 x 100mm. A partir de um
cultivo recente em meio solidificado, emulsionar uma ala do crescimento na soluo substrato.
Incubar em estufa a 36C 1C. durante 3 horas. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados
da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positiva: aparecimento de cor amarela
Negativa: no h alterao de cor
Negativo: M.chelon
5.14- HIDRLISE DO TWEEN 80 (11, 26)
5.14.1- INDICAO
A hidrlise enzimtica do TWEEN 80 (com poucas excees) utilizada para separar as
espcies potencialmente patognicas (negativas) das comumente saprfitas (positivas) entre as
escotocromognicas e no cromognicas de crescimento lento.
5.14.2- PRINCPIO
A colorao mbar que o meio adquire devida presena do TWEEN 80, que alcaliniza o
meio. Se a micobactria, atravs de uma esterase, utilizar o TWEEN 80, ocorrer a acidificao
do meio, neutralizando-o, revertendo a cor do vermelho neutro em pH 7,0 (rosa ou vermelho) e
o resultado positivo.
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5.14.3- SOLUES
Tampo fosfato M/15, pH 7,0 segundo Soerensen*..............................................100ml
TWEEN 80 ......................................................................................................0,5ml
Soluo aquosa de vermelho neutro a 0,1% .........................................................2,0ml
* Ver preparao detalhada no Captulo 10 SOLUES E REAGENTES. MATERIAL UTLILIZADO NO
LABORATRIO. Anotar a preparao do vermelho neutro a 0,1% na ficha 15 Controle da
Preparao da Soluo do Vermelho Neutro a 0,1%.
Diluir o TWEEN 80 no tampo fosfato e somente depois juntar a soluo de vermelho
neutro. Distribuir volumes de 2,0ml em tubos de rosca 13 x 100mm. Esterilizar em autoclave
a 121C por 10 minutos. Aps autoclavao a soluo apresentar colorao mbar. Conservar
em geladeira a 4C, aproximadamente ao abrigo da luz at no mximo duas semanas.
Anotar na ficha 16 Controle da Preparao do Substrato Para a Prova da Hidrlise do
TWEEN 80.
5.14.4- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, emulsionar uma ala de crescimento na
soluo substrato. Incubar em estufa a 36C at 10 dias.
5.14.5- LEITURA
A leitura feita aps 1, 5 e 10 dias de incubao. NO AGITAR OS TUBOS DURANTE A
LEITURA. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em
modelo anexo.
Positiva: Observar a mudana de cor da soluo de mbar para rosa ou vermelho. NO
CONSIDERAR COMO POSITIVO A COLORAO RSEA DA MASSA BACTERIANA
DEPOSITADA NO FUNDO DO TUBO.
Negativo: M. bovis (BCG) ou M.avium ou tubo no semeado.
Positivo: M. kansasii
5.15- CAPTAO DO FERRO (9, 22)
5.15.1- INDICAO
indicado para separar M.chelon (negativo) de M. fortuitum (positivo). Esta espcie acumula
xido de ferro tornando as colnias amarronzadas.
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5.15.2- PREPARAO
Adicionar o citrato frrico amoniacal na base autoclavada do LJ, de modo que fique na
concentrao final de 2,5 % (5 g para 200ml de meio total). Distribuir em tubo de rosca 20 x
150mm., em volume de 5ml. Coagular a 80C durante 45 minutos. Anotar na ficha 17 Controle
da Preparao do Meio Lowenstein Jensen com Citrato Ferrico Amoniacal.
5.15.3- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, preparar uma suspenso bacteriana e
semear 0,1ml da diluio 10
-3
, segundo a padronizao para teste de sensibilidade indireto (ver
Captulo 6). Incubar em estufa a 28C 1C, com tampa afrouxada durante 4 semanas.
Positiva: colnias marrons
Negativa: sem crescimento ou crescimento de colnias sem colorao amarronzada. Anotar estes
resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Negativo: M.chelon
5.16- UREASE (9, 23)
5.16.1- INDICAO E PRINCPIO
A capacidade das micobactrias em hidrolisar uria e liberar amnia, alcalizando o meio,
til na identificao das espcies escotocromognicas e no cromognicas e na identificao de
M.bovis (BCG) que apresenta reao fortemente positiva.
5.16.2- PREPARAO
Utiliza-se disco uria disponvel comercialmente.
5.16.3- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, emulsionar uma ala de crescimento em
0,5 ml de H2O destilada em tubos de rosca de 13 x 100mm. Introduzir o disco uria. Incubar
em estufa a 36C, mais ou menos1
0
C. Ler com 2 e 24 horas. Quando a leitura feita com 2 a 3
dias dificulta a identificao final. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao
Bioqumica, em modelo anexo.
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Positiva: Aparecimento de cor rosa escuro.
Negativa: Nenhuma mudana de cor ou rosa plido, ou um leve tom alaranjado.
Positivo: M.scrofulaceum, M. bovis (BCG)
Negativo: Tubo no inoculado ou M.terr.
5.17- UTILIZAO DE ACARES
(INOSITOL- MANITOL- CITRATO DE SDIO) (20, 24)
5.17.1- INDICAO
A capacidade das micobactrias em utilizar acares como nica fonte de carbono til na
diferenciao entre M. fortuitum, M.peregrinum, M.chelon e M.abscessus.
5.17.2- PREPARAO
5.17.2.1- Meio Base
Sulfato de amnio ...............................................................................................1,05g
MgSO
4
. 7H
2
O ...................................................................................................0,20g
KH
2
PO
4
.............................................................................................................0,20g
Agar .....................................................................................................................8,0g
gua destilada ................................................................................................400,0ml
Preparar a soluo de sais em gua destilada (sem o agar) e ajustar o pH para 7,0 com
KOH ou HCl a 10%. Adicionar o agar. Aquecer o meio base at a completa dissoluo do
agar. Distribuir volumes de 4ml em 25 tubos de rosca 16 x 150mm (meio controle).
Autoclavar a 121C por 15 minutos. Inclinar os tubos e deixar esfriar.
Dividir o restante do meio em 3 alquotas de 100ml cada. Esterilizar em autoclave a
121C por 15 minutos. Deixar esfriar at atingir 45C. A cada alquota do meio, adicionar
5ml da soluo de acar previamente preparada e esterilizada por filtrao em membrana
filtrante. Distribuir assepticamente volumes de 5 ml em tubos de rosca 20 x 150mm estreis.
Inclinar os tubos. Anotar na ficha 18 Controle da Preparao do Meio de Cultura Para a
Prova da Utilizao de Acares.
Ver esquema 3 Preparao do Meio Para Utilizao dos Acares anexo.
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5.17.2.2- Soluo de Acares
5.17.2.2.1- Soluo de Inositol ou Manitol
Inositol ou manitol ........................................................................................1,5g
gua destilada ...............................................................................................15ml
Dissolver o acar na gua. Filtrar em membrana filtrante esterilizante. A
concentrao final de inositol/manitol no meio de 0,5%.
5.17.2.2.2- Soluo de Citrato de Sdio
citrato de sdio ...............................................................................................1,8g
gua destilada ...............................................................................................15ml
Dissolver o acar na gua. Filtrar em membrana filtrante esterilizante. A
concentrao final do citrato no meio de 0,6%.
Anotar na ficha 19 Controle da Preparao da Soluo dos Acares.
5.17.3- TCNICA
A partir de um cultivo em meio lquido de 7H9 incubado em estufa de 36C 1
0
C por uma
semana, fazer uma diluio de 10
-1
e semear 0,1ml no tubo com acar e no tubo controle (sem
acar). Incubar a 28
0
C 1
0
C. Ler com 7 at 14 dias.
Positiva: crescimento somente no tubo com acar. Anotar estes resultados na ficha 1 Resultados
da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positivo: M.peregrinum - manitol
M.chelon - citrato de sdio
M.porcinum - inositol
Negativo: M. fortuitum
5.18- REDUO DO TELURITO DE POTSSIO (10)
5.18.1- PRINCPIO DO TESTE
Durante o pico de crescimento do cultivo em meio lquido, as micobactrias reduzem telurito
de potssio em propores variadas. O telurito atua como aceptor artificial de eltrons e reduzido
a telrio metlico (preto) nos stios de atividade de oxi-reduo nas clulas bacterianas.
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5.18.2- INDICAO
Separar o Complexo M.avium-intracellulare (positivo) da maioria das outras espcies no
cromognicas (negativas). O Complexo M.avium-intracellulare e a maioria das micobactrias
de crescimento rpido reduzem telurito em 3 dias.
5.18.3- PREPARAO
5.18.3.1- Meio Lquido de 7H-9 de Middlebrook.
Preparar de acordo com as instrues do fabricante, 900ml de meio lquido 7H-9 de
Middlebrook e suplementar com 0,5ml de TWEEN 80. No usar glicerol. Esterilizar em
autoclave a 121C durante 15 minutos, esfriar at 45C e assepticamente adicionar 100ml
do enriquecimento ADC. Anotar na ficha 20 Controle de Produo de Meio de Cultura
Middlebrook 7H9.
Distribuir assepticamente 2ml do meio em tubos de rosca 13x100 mm estreis.
5.18.3.2- Soluo de Telurito de Potssio a 0,2%
telurito de potssio ...............................................................................................0,1g
gua destilada ......................................................................................................50ml
Dissolver 0,1 g de telurito de potssio em 50ml de gua destilada. Distribuir volumes
de 2ml em tubos de ensaio de rosca 13x100mm e esterilizar em autoclave a 121C durante
10 minutos. Guardar em geladeira a 4C, aproximadamente. Anotar na ficha 21 Controle
da Preparao do Reagente Para a Prova da Reduo do Telurito de Potssio.
5.18.4- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, semear uma ala do crescimento no
meio 7H-9. Incubar em estufa a 36C 1
0
C por somente 7 dias. Se o crescimento no for
intenso aos 7 dias, reinocular para meio lquido com uma ala bem cheia de crescimento para
um reteste na semana seguinte. O cultivo com crescimento escasso pode ser testado aos 7 dias,
mas no reincube por tempo adicional na tentativa de obter um crescimento mais abundante.
Todos os tubos inoculados devem ser agitados diariamente para propiciar o crescimento intenso
em 7 dias. Adicionar 1 gota de soluo de telurito de potssio, assepticamente, a cada cultura-
teste e nos controles. Agitar os tubos. Reincubar todas as culturas em estufa a 36C 1C
durante 3 dias. No agitar os tubos durante este perodo. No terceiro dia de incubao, observar
os grumos sedimentados em cada tubo-teste, tomando cuidado de no agitar os tubos. Anotar
estes resultados na ficha 1 Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positiva: Formao de precipitado preto de telrio metlico.
Negativa: Clulas sem precipitado preto. Algumas espcies produzem um precipitado marrom
claro ou cinza, que deve ser considerado como negativo.
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Positivo: M. avium
Negativo: M. terrae
5.19- ARILSULFATASE (9)
5.19.1- INDICAO
Esta prova auxilia a identificao do Complexo M. fortuitum, Complexo M.chelon e do
M. xenopi que so positivos.
5.19.2- SOLUES
5.19.2.1- MEIO LQUIDO DE 7H-9 DE MIDDLEBROOK
Preparar de acordo com as instrues do fabricante, 900ml de meio lquido 7H-9 de
Middlebrook e suplementar com 0,5ml de TWEEN 80. No usar glicerol. Esterilizar em
autoclave a 121C durante 15 minutos, esfriar at 45C e assepticamente adicionar 100ml
do enriquecimento ADC. Anotar na ficha 20 Controle de Produo de Meio de Cultura
Middlebrook 7H9 (ver anexo).
Distribuir assepticamente 2ml do meio em tubos de rosca 13x100mm estreis.
5.19.2.2- SOLUO SUBSTRATO
Dissolver 2,6g de dissulfato de fenolftalena, sal tripotssio, em 50ml de gua destilada.
Esterilizar com membrana filtrante esterilizante. Estocar a 4C. Anotar na ficha 22
Controle da Preparao do Substrato Para a Prova da Arilsulfatase.
5.19.2.3- SOLUO REVELADORA (Carbonato de sdio 2N)
Dissolver 5,3g de carbonato de sdio anidro em 50ml de gua destilada. No necessrio
esterilizar. Anotar na ficha 23 Controle da Preparao do Carbonato de Sdio Para a Prova
da Arilsulfatase.
5.19.3- PREPARAO
Adicionar assepticamente 1,2ml de soluo substrato a 100ml de meio 7H9. Distribuir
assepticamente 2ml desta soluo em tubos de rosca de 13x100mm. Conservar em geladeira a
4C, aproximadamente. Anotar na ficha 24 Controle da Preparao do Meio de Cultura Com
Substrato da Arilsulfatase.
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5.19.4- TCNICA
A partir de um cultivo recente em meio solidificado, emulsionar uma ala do crescimento na
soluo contendo o substrato. Incubar a 36C 1
0
C. Aps 3 dias da incubao adicionar 6 gotas
da soluo reveladora
Positivo: Aparecimento de cor que varia do rosa ao vermelho.
Negativo: No h mudana de cor ou somente um leve tom rosado.
OBS: Considerar como positivo a partir do tubo 3 + da escala do Nitrato. Anotar estes resultados
na ficha 1"Resultados da Identificao Bioqumica, em modelo anexo.
Positivo: M.fortuitum
Negativo: M.avium
5.20- ILUSTRAES
CULTURA DE M.TUBERCULOSIS CULTURA DE MICOBACTRIAS
PIGMENTADAS
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NIACINA CRESCIMENTO EM MEIO MacCONKEY
BETA-GLICOSIDADE
ESCALA DO NITRATO
PRODUO DE CATALASE
+
-
2+ 3+ 4+ 5+ 1+
+ + - -
+
-
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REDUO DO TELURITO
PROVA DO TWEEN 80
UREASE
CAPTAO DE FERRO
-
+ +
+ -
+
-
+
-
-
+
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5.21- BIBLIOGRAFIA
1- BARRETO, AMW; CAMPOS, CED. Micobactrias no tuberculosas no Brasil. Bol Pneumol Sanit, 2000; 8 (1): 23 - 32.
2- BARRETO, AMW; MARTINS, FM; CAMPOS, CED. Freqncia de doena pulmonar crnica nos casos de micobacterioses
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3- BRASIL/MS/FUNASA/CENEPI/CRPHF - Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 1994. 2 ed. revisada e
ampliada.
4- CHEMLAL, K; PORTAELS, F. Molecular diagnosis of nontuberculous mycobacteria. Curr Opin Infect Dis, 2003; 16: 77-83.
5- CONVILLE, PS; WITEBSKY, FG. Variables affecting results of sodium chloride tolerance test for identification of rapidly growing,
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6- DAVID, HL. Bacteriology of Mycobacterioses. Centers for Disease Control, Atlanta,1976, 166 p.
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8- FERREIRA, RMC; SAAD, MHF; SILVA, MG; FONSECA, LS. Non-tuberculous mycobacteria 1: One year clinical isolates
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Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 2002; 97: 725-729.
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10- KILBURN, JO; SILCOX, VA; KUBICA, GP. Differential identification of mycobacteria. V. The tellurite reduction test. Amer
Rev Respir Dis, 1969; 99: 4
11- KILBURN, JO; ODONNEL, KF; SILCOX, VA & DAVID, H L. Preparation of a stable mycobacterial TWEEN hidrolysis test
substrate. Appl Microbiol, 1973; 26: 826.
12- KONNO, K. New chemical method to differentiate human tubercle bacilli from other mycobacteria. Science, 1956; 24: 985.
13- KUBICA, GP. & POOL, LG. Studies on the catalase activity of acid-fast bacilli. I. An attempt to subgroup these organisms on the
basis of their catalase activity at different temperatures and pH. Amer Rev Respir Dis, 1960; 81: 387.
14- KUBICA, GP. & VITVITSKY, J. Comparison of two commercial formulations on the MacConkey agar test for mycobacteria. Appl
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15- KUSONOKI S & TAKAYUKI E. - Proposal of Mycobacterium peregrinum sp. nov.rev., and elevation of Mycobacterium
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ARIL SULFATASE
-
+
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35ml da sol. N 1
5ml da sol. N 2
100ml da sol. N 3
0,2ml da sol. N 6
0,1ml da sol. N 4
10ml da sol. Tampo
1 ETAPA
2 ETAPA
3 ETAPA
2ml nos tubos 1 ao 7
2ml nos tubos 1 e 8
1 2 3 4 5 6 7 8
2ml
(Desprezar)
ESQUEMA 1- PREPARAO DA ESCALA PADRO PARA A LEITURA DO NITRATO
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107
ESQUEMA 2- PREPARAO DOS REATIVOS DA -GLICOSIDADE
ESQUEMA 3- PREPARAO DO MEIO PARA UTILIZAO DOS AUCARES

Ajustar pH.
Adicionar e
dissolver o gar.
Sais+gua
(400ml de Base)
100ml 100ml 100ml 100ml
4ml 4ml
Autoclavar e
resfriar a 50C
4ml 4ml
5ml 5ml 5ml
Controle Inisitol
Inisitol
Manitol
Manitol
Citrato de Sdio
Citrato de Sdio
Distribuir assepticamente
e inclinar

HCL 2 N
50ml de Tampo Tris ajustado
para pH 7.0 e Autoclavar
Distribuir em volume
de 10ml e guardar o
restante na geladeira
0,5ml em cada tubo 13x100
e guardar na geladeira.
Usar em 2 semanas
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RESPONSVEL
DATA
/ /
TESTES
NIACINA
NITRATO
CATALASE
AMBIENTE
CATALASE 68C
TWEEN
BETA
GLICOSIDASE
URIA 1
URIA 2
GELOSE
MacCONKEY
C F A
TEMPO DE
CRESCIMENTO
FOTOCROMO
GENICIDADE
COR
TELURITO DE K
ARIL SULFATASE
LJ CONTROLE
LJ NaCl 5%
INOSITOL
MANITOL
CITRATO DE Na
CULTURAS
NMERO
FICHA 1- RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA
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SUBSTNCIA PROCEDNCIA POTNCIA N DO LOTE VALIDADE
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Propileno glicol
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RESPONSVEL
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DILUIO VOLUME
PARTIDA
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FICHA 2- CONTROLE DOS REAGENTES PARA
CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES INIBIDORES
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DE CRESCIMENTO EM AGENTES INIBIDORES
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FICHA 4- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE GELOSE NUTRITIVA
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FICHA 5- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO
DE GAR MacCONKEY SEM CRISTAL VIOLETA
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114
PESAGEM / VOLUME
NaCl
NaCl
SUBSTNCIA
QUANTIDADE OBS
Meio Base LJ
RESPONSVEL
OBSERVAES
FICHA 6- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO LOWENSTEIN JENSEN COM NaCl
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Nitrato de sdio
KH PO
2 4
Na HPO .12 H O
2 4 2
Nitrato de sdio
KH PO
2 4
Na HPO .12 H O
2 4 2
H O destilada
2
FICHA 7- CONTROLE DE PREPARAO DA SOLUO
SUBSTRATO PARA A PROVA DA REDUO DO NITRATO
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
HCl
Sulfanilamida
Hidrocloridrato de
N- naftilenodiamina
SUBSTNCIA PESAGEM REATIVO
QUANTIDADE DE
GUA DESTILADA
HCl
Sulfanilamida
Hidrocloridrato de
N- naftilenodiamina
1
2
3
FICHA 8- CONTROLE DE PREPARAO DOS REAGENTES
REVELADORES DA PROVA DA REDUO DO NITRATO
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Azul de bromotimol
Azul de bromotimol
SUBSTNCIA QUANTIDADE/VOLUME
FICHA 9- CONTROLE DA PREPARAO DO AZUL DE BROMOTIMOL A 1%
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
SUBSTNCIA
PROCEDNCIA N DO LOTE VALIDADE
Fosfato dissdico (Na HPO
2 4
)
Fosfato monopotssico (K HPO )
2 4
Fosfato trissdico ( Na PO )
3 4
lcool etlico comercial a 95
Fenolftalena
Azul de bromotimol
H O destilada
2
SUBSTNCIA
REAGENTE N VALIDADE DILUIR*
Fosfato dissdico (Na HPO ) M/15
2 4
Fosfato monopotssico (K HPO ) M/15
2 4
Fosfato trissdico ( Na PO ) M/15
3 4
Fenolftalena a 1%
Azul de bromotimol a 1%
Azul de bromotimol a 0,1%
PESAR*
1
2
3
4
5
6
0,954 g
0,92 g
1,1 g
1g
H O qsp
2
H O qsp
2
H O qsp
2
H O qsp
2
lcool etlico
Ver preparao na ficha 9
1 ml do
reagente
* PARA PREPARAR 100 ml
FICHA 1O- CONTROLE DE PREPARAO DOS REAGENTES
PARA LEITURA DA PROVA DA REDUO DO NITRATO
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
H O destilada
2
TWEEN 80
TWEEN 80
FICHA 11- CONTROLE DA PREPARAO
DO TWEEN 80 PARA A PROVA DA CATALASE
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120
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
H O destilada
2
TWEEN 80
TWEEN 80
FICHA 12- CONTROLE DA PREPARAO DOS
REAGENTES PARA A PROVA DA CATALASE
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
SUBSTNCIA
p-nitrofenil--D-glicopiranosdio
TRIS(Hidroximetilaminometano)
SUBSTNCIA
QUANTIDADE
H O destilada
2
p-nitrofenil--D-glicopiranosdio
FICHA 13- CONTROLE DA PREPARAO DOS
REAGENTES PARA A PROVA DA BETA-GLICOSIDASE
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
SUBSTNCIA
SUBSTNCIA
QUANTIDADE
H O destilada
2
TRIS(Hidroximetilaminometano) 0,6057 g
100 ml
pH do tampo TRIS
FICHA 14- CONTROLE DA PREPARAO DO
TAMPO PARA A PROVA DA BETA-GLICOSIDASE
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Vermelho neutro
H O destilada
2
Vermelho neutro
FICHA 15- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DO VERMELHO NEUTRO A 0,1%
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
TWEEN 80
TWEEN 80
Soluo de vermelho neutro a 1%
tampo fosfato
FICHA 16- CONTROLE DA PREPARAO DO SUBSTRATO
PARA A PROVA DA HIDRLISE DO TWEEN 80
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Citrato frrico amoniacal
SUBSTNCIA QUANTIDADE OBS
Citrato frrico amoniacal
Meio base LJ
FICHA 17- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO
LOWENSTEIN JENSEN COM CITRATO FRRICO AMONIACAL
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Sulfato de Amnio
MgSO .7H O
4 2
KH PO
2 4
Agar
Sulfato de Amnio
MgSO .7H O
4 2
KH PO
2 4
Agar
H O destilada
2
FICHA 18- CONTROLE PREPARAO DO MEIO DE
CULTURA PARA A PROVA DA UTILIZAO DE AUCARES
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Inositol
Manitol
Citrato de Sdio
Inositol
Manitol
Citrato de Sdio
GUA DESTILADA
FICHA 19- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DOS ACARES
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Telurito de Potssio
Telurito de Potssio
gua destilada
FICHA 21- CONTROLE DA PREPARAO DO REAGENTE
PARA A PROVA DA REDUO DO TELURITO DE POTSSIO
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Dissulfato de Fenolftalena
sal Tripotssico
SUBSTNCIA
Dissulfato de Fenolftalena
sal Tripotssico
gua
SUBSTNCIA
QUANTIDADE
FICHA 22- CONTROLE DA PREPARAO DO
SUBSTRATO PARA A PROVA ARILSULFATASE
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Carbonato de sdio
Carbonato de sdio
gua destilada
FICHA 23- CONTROLE DA PREPARAO DO CARBONATO
DE SDIO PARA A PROVA DA ARIL SULFATASE
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
SUBSTNCIA N DE PARTIDA VALIDADE
QUANTIDADE
INCORPORADA
Dissulfato Tripotssico
de Fenolftalena (soluo)
Meio 7H9
FICHA 24- CONTROLE DA PREPARAO DO MEIO DE
CULTURA COM SUBSTRATO DA PROVA ARILSULFATASE
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Captulo 6
TESTE DE SENSIBILIDADE DE M.TUBERCULOSIS
AOS ANTIBITICOS E QUIMIOTERPICOS
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6.1- INTRODUO
A resistncia a drogas em M. tuberculosis surge por mutao espontnea, pois ocorre
independentemente do contato prvio do bacilo com as drogas. Em toda populao de clulas sensveis
existe uma pequena proporo de mutantes resistentes, de cerca de 1 por 10
8
clulas, por gerao.
Quando uma nica droga utilizada no tratamento da tuberculose, a maioria dos bacilos inibida
ou morta. Mas, como o tratamento longo, pois a populao bacteriana elevada, as clulas mutantes
resistentes vo-se multiplicando at se tornarem a maioria.
Portanto, a resistncia a drogas em tuberculose o resultado da inter-relao do fenmeno da
mutao espontnea e da seleo de populao predominantemente resistente como conseqncia de
tratamento irregular e/ou inadequado. Este processo seletivo conhecido como resistncia adquirida.
Para fins epidemiolgicos, quando o paciente que desenvolve resistncia infecta um uma outra pessoa,
e esta adoece, diz-se que o novo caso apresenta resistncia primria.
O conhecimento das taxas de resistncia permite avaliar a qualidade dos programas de controle da
tuberculose de um pas e possibilita a modificao de esquemas teraputicos vigentes.
6.2- INDICAO
A realizao do teste de sensibilidade est indicada nos casos de:
pacientes com suspeita de resistncia, por abandono, por falncia de tratamento, por recidiva ou
por ser contato de um caso de tuberculose resistente;
na vigilncia epidemiolgica da resistncia.
6.3- METODOLOGIA
A sensibilidade de M. tuberculosis s drogas pode ser avaliada pelo mtodo das concentraes
absolutas, mtodo da relao de resistncia e pelo mtodo das propores. Esses so os mtodos
bacteriolgicos mais empregados e aceitos pela Organizao Mundial de Sade.
6.4- MTODO DAS PROPORES
6.4.1- PRINCPIO
Este mtodo foi descrito por Canetti, Rist & Grosset em 1963 e consiste em detectar a
proporo de bacilos resistentes presentes em uma amostra de M. tuberculosis, frente a uma
concentrao da droga que capaz de inibir o desenvolvimento das clulas sensveis mas no o
das clulas resistentes - concentrao crtica. Para cada droga foi definida uma proporo de
mutantes resistentes em um populao bacilar, igual ou acima da qual a amostra considerada
resistente - proporo crtica.
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6.4.2- PREPARAO DO MEIO COM DROGAS
O meio mais utilizado o de Lowenstein Jensen, sendo as drogas incorporadas ao mesmo,
antes da coagulao. Anotar na ficha 1 Controle de Produo de Meio de Cultura Para Teste de
Sensibilidade s Drogas a preparaao de cada partida (ver anexo). As concentraes empre-
gadas, com suas respectivas propores crticas, assim como a preparao das solues para
incorporao no meio de LJ esto, respectivamente, apresentadas nas tabelas 1 e 2. Cada vez que
pesar as drogas anotar na ficha 2 Controle da Pesagem dos Reagentes Para Teste de Sensibilidade
s Drogas. Ver anexo esquema 1 Preparao do Meio com Drogas.
6.4.2.1- Meio com Pirazinamida
Esta droga testada em meio previamente acidificado entre pH 5,0 e 5,2, utilizando-se
HCl 2 N (Ver preparao no Captulo 10 SOLUES E REAGENTES. MATERIAL DO LABORATRIO).
A partir da base do meio LJ, tomar uma alquota conhecida, do meio de cultura (cerca de
30ml), adicionar o cido at obter o pH desejado, anotando o volume utilizado para a
acidificao. Fazer o clculo para incorporao no volume restante do meio. Aps este ajuste,
retirar uma outra alquota em um becher, medir o pH e submeter a coagulao juntamente
com os tubos. Depois de coagulado, o pH do meio no deve ultrapassar 5,4.
Tabela 1- Concentrao crtica das drogas empregadas no teste de sensibilidade de
M.tuberculosis e na identificao de micobactrias e a proporo crtica de mutantes
resistentes
*Drogas utilizadas na identificao de micobactrias
DROGAS
CONCENTRAES
(g/ml)
PROPORES
(%)
Isoniazida (INH) 0,2 1,0
Rifampicina (RMP) 40,0 1,0
Pirazinamida (PZA) 100,0 10,0
Estreptomicina (SM) 4,0 10,0
Etambutol (EMB) 2,0 1,0
Etionamida (ETH) 20,0 10,0
cido p-nitrobenzico (PNB)* 500,0 1,0
Hidrazida do cido
tiofeno-2-carboxlico (TCH)*
Cicloserina (CS)*
Ofloxacin (OFLO2)*
Hidroxilamina (HX)*
2,0
30,0
2,0
500,0 1,0
1,0
1,0
1,0
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Tabela 2- Preparao das solues e as diluies das drogas para incorporao no meio de
Lowenstein Jensen
*A pesagem dessas drogas deve ser recalculada se a potncia referida pelo fabricante for
diferente da apresentada na tabela acima.
6.4.3- TCNICA
O teste de sensibilidade pode ser realizado a partir de escarro positivo a baciloscopia (teste
direto) ou a partir da cultura (teste indireto).
6.4.3.1- Preparao da Suspenso Bacilar, Diluio e Semeadura
6.4.3.1.1- Teste Indireto
A partir de um crescimento em meio slido, isento de droga, fazer uma suspenso,
utilizando o maior nmero de colnias possvel, em um tubo 20 x 150mm contendo
cerca 10 prolas de vidro e aproximadamente 0,5ml de gua destilada estril. Agitar em
vrtex por 20 a 30 segundos para homogeneizar a suspenso. Adicionar 0,5ml de gua
destilada estril, agitar o tubo e manter em repouso por 5 minutos. Gotejar lentamente
a suspenso em tubo contendo 3ml de gua destilada estril at obter a turvao
correspondente ao tubo n 1 da escala de MacFarland (Ver preparao no Captulo 10)
ou de uma suspenso padro de BCG de 1mg/ml. A partir dessa suspenso padronizada,
efetuar diluies decimais at 10
-6
e semear 0,1 ml das diluies 10
-3,
10
-5,
10
-6
nos
tubos controle (sem droga). Nos tubos com as drogas somente as diluies10
-3

e
10
-5
.
Tubos contendo meio LJ adicionado de PNB e de TCH so utilizados se como agentes
inibidores de crescimento, concomitantemente, para auxiliar no diagnstico da espcie
que est sendo testada. Ver anexo esquema 2 Preparao de Inculo e Semeadura do
Teste Indireto.
POTNCIA
(%)
PESAGEM
(g)
DILUENTE
(10ml)
DILUIES
PARA
200ml de L-J
INH 100 0,1 gua destilada
1/100 0,4
RMP 100
100
100
100
100
100
100
100
100
50
0,1
0,1
0,1
0,2
0,2
0,2
0,16
0,1
0,1
0,1
etileno glicol -
-
-
-
-
-
-
0,8
PZA
gua destilada 2,0
SM ( * ) gua destilada
1/10 0,8
EMB
gua destilada
1/10
1/10
0,4
ETH ( * ) etileno glicol 0,4
0,4
PNB
propileno glicol 5,0
5,0
TCH
CS
OFLO
HX
gua destilada
gua destilada
gua destilada
gua destilada
0,6
0,4
DROGA
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138
RESULTADO DA BACILOSCOPIA DILUIES SEMEADAS
+ sem diluio, 10
-2
++ 10 10
-1 -3
,
+++ 10 10
-2 -4
,
6.4.3.1.2- Teste Direto
O teste direto aquele realizado a partir do escarro, que seja positivo a baciloscopia,
para abreviar o tempo do diagnstico do teste de sensibilidade. Para preparao do
inculo deve-se proceder descontaminao rotineira, como descrita no Captulo 4
CULTURA, por qualquer um dos mtodos, levando em considerao que necessrio um
certo volume de escarro, pelo menos 10ml, para haver material suficiente para semear
os diversos tubos com drogas. Aps a concentrao do material, fazer diluies decimais
seriadas at 10
-4
e semear 0,1ml desta suspenso nos tubos controle e nos tubos com
drogas, conforme o nmero de cruzes encontradas previamente na baciloscopia deste
material.
Ver anexo esquemas 3, 4 e 5 Preparao de Inculo e Semeadura do Teste Direto
+,++ e +++.
6.4.3.2- Incubao
Aps a semeadura, colocar os tubos inclinados horizontalmente em uma bandeja de
forma que o inculo se distribua sobre toda a superfcie do meio, mantendo-os com a tampa
frouxa por 24-48 horas para secar o inculo. Aps este perodo os tubos podem ser incubados
na posio vertical em estufa 36C 1C por 20 dias. Anotar os resultados do teste se
houver crescimento eugnico nos tubos-controle. Caso no haja crescimento ainda nos tubos-
controle de PZA, reincub-los e fazer nova leitura com 28 dias para finalizar o teste com esta
droga.
6.4.3.3- Leitura e Interpretao
Aps a leitura do teste, realizar o clculo da porcentagem de bacilos resistentes da seguinte
maneira:
Quando esta porcentagem for superior ou igual proporo crtica estabelecida para
cada droga, a amostra considerada resistente.
A seguir sero mostrados dois exemplos para melhor ilustrar a interpretao dos resultados.
= % de Bacilos Resistentes
Nmero de Colnias no Tubo com Drogas x 100
Nmero de Colnias no Tubo Controle
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139
Exemplo 1:
Clculo:
Neste caso, a amostra resistente INH e sensvel SM, pois a proporo de bacilos
resistentes respectivamente maior e menor do que a proporo crtica dessas drogas (1 e10%).
Exemplo 2:
Como o tubo-controle semeado com a diluio 10
-3
forneceu nmero incontvel de
colnias, contam-se as colnias que cresceram no tubo-controle com maior diluio (10
-5
) e
multiplica-se por 100 para se obter o nmero de colnias no controle correspondente
diluio 10
-3
(100 colnias no tubo-controle 10
-5
igual a 10.000 colnias no 10
-3
).
Clculo:
Neste caso a amostra sensvel ao EMB e RMP, pois a proporo de bacilos resistentes
observada inferior proporo crtica estabelecida para as mesmas (1%).
6.4.3.4- Controle de Qualidade
Cada partida de meio com droga preparada dever ser sempre avaliada semeando-se
M.tuberculosis (H
37
Rv ou H
37
Ra) em todos os tubos, ou seja, o mesmo procedimento do
teste. Estas estirpes mostram-se sensveis s drogas utilizadas nos esquemas de tratamento.
CONTROLE INH SM
10
-5
200 colnias 4 colnias 10 colnias
EMB
10
-3
crescimento
confluente
20 colnias 5 colnias
10
-5
100 colnias
- -
CONTROLE RMP
INH > 4x100/200
= 2 % de Bacilos Resistentes INH
= 5 % de Bacilos Resistentes SM
SM > 10 x 100
200
EMB > 20 x 100 /10.000 = % de Bacilos Resistentes 0,2 ao EMB
RMP > 5 x 100/10.000 = de Bacilos Resistentes 0,05 % RMP
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Nesse caso haver o crescimento nos tubos-controle (sem droga) de colnias na ordem de
incontveis (crescimento confluente) no tubo 10
-3
; e o crescimento de colnias contveis
entre 50 a 150 no tubo 10
-5.
Nos demais tubos com drogas, ausncia de crescimento.
Adicionalmente, outras amostras-tipo podem ser utilizadas, para avaliar determinadas drogas,
como o caso de M.fortuitum, que sensvel etionamida e resistente s demais e M.bovis
BCG, que resistente pirazinamida. Anotar na ficha 3 Controle dos Resultados de Leitura
do Teste de Sensibilidade.
A leitura do teste de sensibilidade no deve ultrapassar a 20 dias, pois falsa resistncia a
estas drogas pode ser observada (etionamida, estreptomicina, etambutol), e porque se
degradam pelo calor da incubao prolongada.
Todas as etapas da preparao do meio com droga, como: pesagem, diluio, volume de
incorporao da droga no meio, data da preparao, devem ser anotadas em fichas prprias
j referidas anteriormente.
O meio com drogas, aps a coagulao e controle de esterilidade, deve ser guardado em
geladeira a 4C aproximadamente, por no mximo 1 ms.
6.5- BIOSSEGURANA
Todos os procedimentos asspticos devero ser efetuados em uma rea de biossegurana nvel 3
em cabines de segurana biolgica classe II B2/B3, usando luvas, avental, culos e respirador.
Na preparao do meio de cultura usar a cabine de fluxo laminar horizontal.
Quando for pesar drogas e preparar os reagentes, utilizar EPIs adequados a cada um. Consultar o
Captulo BIOSSEGURANA ao planejar e executar o trabalho. Os rejeitos lquidos produzidos podem ser
colocados na pia sob fluxo de gua corrente ou de acordo com o plano de rejeitos do LACEN.
6.6- MATERIAL UTILIZADO
amostras-tipo H37Ra, H37Rv, M. fortuitum, M. bovis;
autoclave;
cido clordrico;
cido p-nitrobenzico;
agitador de tubos (vrtex);
gua destilada;
avental;
balana;
balo;
batedeira;
becher;
cabine de fluxo laminar horizontal;
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cabine de segurana biolgica classe II B2 ou B3;
calculadora;
caneta hidrogrfica;
carrinho de ao;
cicloserina;
coagulador;
destilador;
erlenmeyer;
estantes de madeira;
estreptomicina;
estufa bacteriollgica;
etambutol;
etileno glicol;
etionamida;
frasco de reagentes;
funil de ao;
gaze;
geladeira;
glicerol;
hidrazida do cido tiofenocarboxlico;
hidroxilamina;
isoniazida;
luva;
mscara;
meio de Lowenstein Jensen em p;
ofloxacin;
ovos;
pipetas de vidro;
pirazinamida;
potencimetro;
propileno glicol;
proveta;
rifampicina;
tubo n1 da escala de McFarland;
tubos 13x100mm;
tubos 20x150mm.
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142
6.7- BIBLIOGRAFIA
1- BARRETO, AMW & MARTINS, FM. Estudo da resistncia primria no Brasil no perodo de 1986 a 1988. Bol. CNCT
1988:2.
2- BRASIL/MS/FUNASA/CENEPI/CRPHF. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 1994. 2 ed. revisada e
ampliada.
3- CANETTI, G; FOX, W; KHOMENKO, A [ET ALII]. Advances in techniques of testing mycobacterial drugs sensitivity and the
use osf sensitivity tests in tuberculosis control programmes. Bull World Health Organ, 1969; 41: 31- 43.
4- DAVID, HL. Fundamentals of drug susceptibility testing in Tuberculosis. Atlanta: Centers for Disease Control, 1971.
Pasteur; 1989.
Control, 1985.
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ESQUEMA 1- PREPARAO DO MEIO COM DROGAS
1) ESTREPTOMICINA
2) ISONIAZIDA
3) ETAMBUTOL
4) TCH
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144
5) RIFAMPICINA
6) ETIONAMIDA
7) PNB
8) PIRAZINAMIDA
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ESQUEMA 2- PREPARAO DE INCULO E SEMEADURA DO TESTE INDIRETO
1) Distribuo de 9ml de
gua destilada estril
3) Pescar o maior
nmero de colnias
possvel
4) Colocar no tubo
com prolas
5) Agitar em Vrtex e
repousar por 5 minutos
6) Gotejar a suspenso em um tubo contendo 3ml de gua destilada estril at
obter uma turvao correspondente ao tubo n 1 da escala de Mac Farland
7) Efetuar dilues sucessivas at 10 e semear 0,1 ml nos tubos.
-6
2) Prola com
0,5ml de gua
destilada estril
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146
ESQUEMA 3- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE DIRETO
ESQUEMA 4- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE
ESCARRO (+)
ESCARRO (++)
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ESQUEMA 5- PREPARAO PARA TESTE DE SENSIBILIDADE DIRETO
ESCARRO (+++)
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FICHA 1- CONTROLE DE PRODUO DE MEIO DE
CULTURA PARA TESTE DE SENSIBILIDADE AS DROGAS
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Etileno Glicol
Propileno glicol
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
DROGAS QUANT.
DILUIO VOLUME
PARTIDA
PREPARO VALIDADE
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DESTIL.
2
INCORPORAO DATA
INH
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PZA
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OFLO
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1/100
1/10
1/10
1/10
1/10
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FICHA 2- CONTROLE DOS REAGENTES PARA
CRESCIMENTO EM PRESENA DE AGENTES
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FICHA 3- CONTROLE DOS RESULTADOS DE LEITURA
DO TESTE DE SENSIBILIDADE/AGENTES INIBIDORES
MTODO AUTOMATIZADO (MB/BacT) PARA O
TESTE DE SENSIBILIDADE
Captulo 7
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7.1- INTRODUO
O laboratrio de tuberculose foi um dos ltimos a incorporar tcnicas automatizadas na sua
rotina. Somente no final dos anos 70 os trabalhos de Cummings et al, Middlebrook et al. e Kertcher
et al. culminaram com a introduo de um sistema rpido e semi-automatizado para o diagnstico da
tuberculose. Este sistema, desenvolvido pela Becton Dickinson, baseado na deteco de
14
C - cido
palmtico comeou a ser utilizado a partir dos anos 80, para o isolamento de micobactrias de material
humano, mostrando grande acurcia quando comparado a mtodos tradicionais. O desenvolvimento
de sistemas de lise de clulas sanguneas consagrou este sistema no isolamento de micobactrias de
pacientes HIV positivos. Alm do isolamento, este sistema permitiu separar o Complexo M.
tuberculosis das demais espcies, alm de se tornar padro-ouro em antibiograma nos pases
desenvolvidos, nestes ltimos 20 anos.
Atualmente o BACTEC est sendo substitudo pelo MGIT, na sua verso totalmente automatizada,
pois alm disso oferece a vantagem de no produzir resduo radioativo.
Todos esses sistemas permitem a introduo de outros antibiticos/substncias inibidoras, para
identificao, sondas genticas, cromatografia lquida e outros mtodos para o diagnstico final.
Todas os sistemas desenvolvidos at o presente utilizam o meio 7H9 de Middlebrook como meio
de cultura principal, variando no modo de deteco e nos suplementos para prevenir a contaminao.
Mas o primeiro sistema totalmente automatizado foi o desenvolvido pela Organon Teknika e foi o
que escolhemos para trabalhar atualmente no nosso laboratrio. Para isso estudamos sua utilizao no
antibiograma direto e indireto comparando com o BACTEC e LJ, com resultados bem acurados.
7.2- PRNCIPIO E INDICAO
O MB/BacT utiliza como princpio um sensor colorimtrico e luz refletida para monitorar a
presena e produo de dixido de carbono (CO
2
) que est dissolvido no meio de cultura. Se houver
microorganismos na amostra testada, ser produzido CO
2
como resultado do metabolismo dos
substratos do meio de cultura. A cor do sensor gs-permevel localizado no fundo de cada frasco ser
alterada pela presena de CO
2
, passando de verde escuro para verde claro ou amarelo. A colorao
mais clara resulta em um aumento de unidades de reflectncia monitoradas e registradas pelo
equipamento a cada 10 minutos. A reflectncia do frasco , no momento da deteco, comparado a
10
6
a 10
7
unidades formadoras de colnia (UFC) por ml. Este sistema, alm de fornecer resultados
mais rpidos de crescimento, com grande acurcia para M.tuberculosis, permite tambm a utilizao
de frascos para deteco no sangue (MB BLOOD BOTTLE), sendo indicado principalmente para
instituies que recebem material clnico de pacientes com AIDS.
7.3- TESTE DIRETO
O teste direto feito a partir de escarro positivo a baciloscopia, para abreviar o diagnstico final da
sensibilidade s drogas utilizadas no tratamento da tuberculose. Na nossa experincia, em 20 dias,
conseguimos diagnosticar 80% dos testes. A quantidade de material e o mtodo de descontaminao
podem ser fatores crticos para a no realizao do teste.
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7.3.1- TCNICA
fixar na planilha (que correlaciona o cdigo de barras do frasco a ser utilizado, a droga ou os
controles a serem testados, e o resultado e tempo de determinao de positividade a ser
registrado), a etiqueta de cdigo de barras descartvel que acompanha o frasco de processamento.
Ver ficha 3 Resultados do Teste no MB/BacT;
ressuspender o sedimento do material tratado (utilizando o mtodo de Corper & Stoner
modificado, conforme Captulo 4 CULTURA em 1,0 ml de gua destilada estril);
adicionar 0,5ml do suplemento de antibitico (conforme recomendao do fabricante) em dez
(10) frascos de processamento MB/BacT;
as drogas a serem testadas devem ser preparadas, conforme a seqncia descrita no esquema 1
Preparao do Inculo e Semeadura do Teste Direto anexo, e adicionadas no volume de
0,1ml em seus respectivos frascos previamente identificados, exceto nos frascos Controle.
Controle 1/100 e Controle PZA. Anotadar na ficha1 Controle da Preparao de Reagentes
Para Teste de Sensibilidade;
nos frascos que contm a droga PZA e o Controle PZA adicionar 0,5ml da soluo de cido
clordrico 0,2 N, de modo a obter um pH final de 5,7. Anotar na ficha 2 Controle da
Preparao da Soluo Acidificadora Para Teste do PZA no MB/BacT;
inocular 0,5ml do material nos frascos Controle e nos frascos contendo as respectivas drogas
a serem testadas, exceto no frasco Controle 1/100;
no frasco Controle 1/100 inocular 0,5ml da diluio em gua, na proporo 1/100 do
material;
colocar todos os frascos no equipamento, seguindo as recomendaes contidas no Manual de
Operaes do Equipamento.
7.4- TESTE INDIRETO
7.4.1- TCNICA
fixar em uma planilha (que correlacione o cdigo de barras do frasco a ser utilizado, droga ou
os controles a serem testados, e o resultado e tempo de determinao de positividade a ser
registrado), a etiqueta de cdigo de barras descartvel que acompanha o frasco de processamento.
Ver ficha 3 Resultados do Teste no MB/BacT;
colocar em um tubo de 13x100mm contendo cerca de 10 prolas de vidro uma alada de
colnias obtidas a partir de um crescimento em meio slido (cultura);
agitar em vrtex por 20 a 30 segundos e manter em repouso por 5 minutos;
adicionar 0,5ml de gua estril, agitar em vrtex para homogeneizar e manter em repouso por
5 minutos;
gotejar lentamente a suspenso obtida, em um tubo contendo cerca de 2ml de gua estril at
obter turvao correspondente ao tubo n 1 da escala de McFarland. Ver captulo 10 MATERIAL
DO LABORATRIO. SOLUES E REAGENTES;
a partir da suspenso padronizada, efetuar uma diluo de 1/10 e 1/100 em gua destilada
estril;
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adicionar 0,5ml do suplemento de antibitico (conforme recomendao do fabricante) em dez
(10) frascos de processamento MB/BacT;
as drogas a serem testadas devem ser preparadas, conforme a seqncia descrita no esquema 2
Preparao do Inculo e Semeadura do Teste Indireto anexo, e adicionadas no volume de
0,1ml em seus respectivos frascos previamente identificados, exceto nos frascos, Controle
1/100 e Controle PZA Anotar na ficha1 Controle da Preparao de Reagentes Para Teste
de Sensibilidade s Drogas;
nos frascos que contm a droga PZA e o Controle PZA adicionar 0,5ml da soluo de cido
clordrico 0,2 N, de modo a obter um pH final de 5,7. Anotar na ficha 2 Controle da
Preparao da Soluo Acidificadora Para Teste do PZA (MB/BacT);
inocular 0,1ml do material nos frascos contendo as respectivas drogas a serem testadas, exceto
no frasco Controle 1/100;
no frasco Controle 1/100 inocular 0,5 ml da diluio em gua, na proporo 1/100 do
material ressuspenso;
colocar todos os frascos no equipamento, seguindo as recomendaes contidas no Manual de
Operaes do Equipamento.
7.5- CONCENTRAO DAS DROGAS ( 3 )
No laboratrio de referncia, trabalhamos rotineiramente com PNB incorporado ao meio de cultura
do MB/Bact para confirmar a identificao de M.tuberculosis, juntamente com os testes de sensibilidade
na concentrao de 500 g/ml. Mas esta concentrao est indicada para incorporao em meio a
base de ovo e no MB/BacT. Experincias preliminares realizadas por ns apontam para uma
concentrao inibitria mnima entre 250 e 125 g/ml, ainda sob investigao.
A preparao das drogas est nos esquemas 3 e 4 anexos e as concentraes empregadas nos testes,
tanto o direto quanto o indireto, esto apresentadas nas tabelas abaixo:
Tabela 1- Concentrao crtica das drogas empregadas no teste de sensibilidade
*droga utilizada na identificao do Complexo M. tuberculosis
DROGAS
CONCENTRAES
(g/ml)
Isoniazida (INH) 0,1
Rifampicina (RMP) 2,0
Pirazinamida (PZA) 100
Estreptomicina (SM) 2,0
Etambutol (EMB) 2,5
Etionamida (ETH) 1,25
cido p-nitrobenzico (PNB)* 500,0
Levofloxacin (Lev)Ofloxacin (OFLO)*
Amicacina (AMI)
2,0
2,0
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Tabela 2- Preparao das Solues e as Diluies das Drogas
*A pesagem dessas drogas deve ser recalculada se a potncia referida pelo fabricante for diferente da
apresentada na tabela acima.
7.6- LEITURA E INTERPRETAO
a leitura feita pelo sistema do equipamento que sinaliza a deteco de positividade. Neste caso,
devero ser verificadas atravs de varredura pelo leitor de cdigo de barras todos os cdigos
correspondentes aos Controles 1/100 e, se positivos, anotar o resultado como tal na planilha e o
tempo de determinao, procedendo de maneira idntica para os demais frascos do teste;
o final do teste indicado quando o frasco Controle 1/100 indica positividade;
se o tempo de positividade do frasco contendo a droga for menor que o tempo de positividade do
frasco Controle 1/100, deve ser considerado como resistente. Se o frasco da droga estiver negativo
no final do teste, a bactria considerada como sensvel droga;
os resultados devem ser reportados como Resistente ou Sensvel.
7.7- CONTROLE DE QUALIDADE
O controle de qualidade feito a cada partida de nova soluo da droga. Ser utilizada a cepa
padro de sensibilidade M. tuberculosis H
37
Ra.
7.8- BIOSSEGURANA
Estes testes devero ser executados segundo a tcnica assptica, em cabine de segurana biolgica
classe II B2 ou B3. O tcnico dever utilizar equipamentos de proteo individual, como luva,
respirador N 95, avental descartvel, pipetador automtico, seringas com trava de agulha ou seringa
de insulina com agulha fixa.
POTNCIA
(%)
PESAGEM
(g)
DILUENTE
(10ml)
DILUIES
PARA
10ml DE MEIO
DO M/Bac
INH 99 0,1010 gua destilada 0,1
RMP 95
100
100
100
100
100
100
75
0,1053
0,1
0,1
0,1
0,15
0,1
0,1
0,2
etileno glicol
-
-
0,1
PZA
gua destilada 0,1 0,1
SM ( * ) gua destilada
EMB
gua destilada
ETH ( * ) etileno glicol
PNB
propileno glicol
LEV/OFLO
AMI
gua destilada
gua destilada
DROGA
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,5
1/1000
1/10 e 2/8
1/10 e 2/8
1/10 e 2,5/7,5
1/10 e 2,2/17,5
1/100
1/10 e 2/8
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Durante o teste, as seringas utilizadas devero ser colocadas em frasco de vidro com tampa, contendo
soluo de hipoclorito de sdio a 2%, de modo que a agulha fique apontada para o fundo. O frasco
dever ser tampado antes de ser retirado da cabine.
Aps a execuo do teste, o frasco tampado contendo as agulhas e todo o material utilizado dever
ser colocado em recipiente de ao com tampa, para ser esterilizado em autoclave a 121
o
C durante 15
minutos. Aps esterilizao descartar pelo servio de coleta hospitalar, privado ou pblico. O contedo
dos lquidos nos frascos de ensaio, descartar no esgoto da pia sob fluxo de gua corrente. Roupas,
luvas, respiradores, aventais devem ser descartados em lixo comum, depois de serem autoclavadas.
7.9- MATERIAL
amicacina;
amostras-tipo H
37
Ra;
aparelho automatizado de incubao e leitura do MB/BacT;
autoclave;
cido clordrico;
cido p-nitrobenzico;
agitador de tubos (vrtex);
gua destilada;
avental;
balana;
bcher;
cabine de fluxo laminar horizontal;
calculadora;
caneta hidrogrfica;
carrinho de ao;
destilador;
erlenmeyer;
estreptomicina;
estufa bacteriollgica;
etambutol;
etileno glicol;
etionamida;
frasco de reagentes ;
frasco de meio do sistema MB/BacT;
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geladeira;
hidrazida do cido tiofenocarboxlico;
isoniazida;
. levofloxacin
luva;
mscara;
ofloxacina;
pipetas de vidro;
pirazinamida;
potencimetro;
propileno glicol;
proveta;
rifampicina;
seringa descartvel de 1e de 3ml;
suplemento antibitico do MB/BacT;
tubo n1 da escala de McFarland;
tubos 13 x 100mm.
7.10- ILUSTRAES
7.11- BIBLIOGRAFIA
1- BADAK, FZ; KISKA, DL; SETTERQUIST, S [ET ALII]. Comparison of mycobacteria growth indicator tube with BACTEC
460 for detection and recovery of mycobacteria from clinical specimens. J Clin Microbiol, 1996; 34 (9): 2236-9.
2- BARRETO, AMW; ARAJO, JBM; MEDEIROS, RFM; CALDAS, PCS. Direct sensitivity test of the MB/BacT System.
Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 2002; 97: 263-264.
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159
3- BARRETO, AMW; ARAJO, JBM; MEDEIROS, RFM; CALDAS, PCS. Evaluation of indirect susceptibility testing of
mycobacterium tuberculosis to the first and second line, and alternative drugs by the newer MB/BacT System. Memrias do
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5- BEER, J; KUCHLER, R; RODLOFF, AC. Investigations about the possibility for testing the susceptibility of mycobacteria with the
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6- BERGMANN, JS; WOODS, GL; Mycobacterial growth indicator tube for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to
isoniazid and rifampin. Diagn Microbiol Infect Dis,1997; 28 (3): 153-
7- BRUNELLO, F; FONTANA, R. Reliability of the MB/BacT system for testing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis
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8- CUMMINGS, DM; RISTROPH D; CAMARGO, EE [ET ALII]. Radiometric detection of the metabolic activity of Mycobac-
terium tuberculosis. J Nucl Med, 1975;16 (12):1189-91.
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MB/BacT Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol, 2000; 38:
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clinical specimens by using the automated BACTEC 9000 MB system and comparison with radiometric and solid-culture systems. J
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160
1) Preparar uma lmina e
corar pelo Ziehl Neelsen
e observar se h bacilos
2) Colocar todo o material
em tubo de centrifuga
de plstico de 50 ml

3) Adicionar a Soluo A
em volume igual ao do
material a ser tratado
4) Agitar em Vrtex e
Manter em estufa a
37 C por 24 horas
6) Centrifugar a 3.000g por 30 minutos

7) Desprezar o sobrenadante
8) Inocular 0,5 ml do Suplemento e
0,1 ml das Drogas a serem testadas

10) Inocular o material tratado nos frascos controle e com as Drogas.Colocar no equipamento
e aguardar at que o controle esteja positivo,para a analise dos resultados
9) Resuspender o sedimento com
1,0ml de gua Destilada Estril

5)Neutralizar com a Soluo B
em igual volume da Soluo A
ESQUEMA 1- PREPARAO DO INCULO E SEMEADURA NO TESTE DIRETO
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161
1) Pescar o maior nmero
de colnias possvel
2) Colocar no tubo com prolas 3) Agitar em Vrtex e repousar por 5 minutos
4) Adicionar 0,5 ml de gua destilada estril,
agitar em Vrtex e repousar por 5 minutos.
5) Gotejar a suspenso em um tubo contendo 3ml de gua destilada
estril at obter uma turvao correspondente ao tubo n 1 da
escala de Mac Farland
6) Inocular 0,5 ml do Suplemento e 0,1 ml das
Drogas a serem testadas
7) Inocular o material tratado nos frascos controle e com
as Drogas. Colocar no equipamento e aguardar at que
o controle esteja positivo, para a analise dos resultados
ESQUEMA 2- PREPARAO DO INCULO E SEMEADURA NO TESTE INDIRETO
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162
ESQUEMA 3- DROGAS USADAS NO MB/BACT
1) ESTREPTOMICINA (2g/ml) 2) ISONIAZIDA(0,2g/ml)
6) PZA (100g/ml)
7) PNB (500g/ml)
3) RIFAMPICINA (2g/ml) 4) ETAMBUTOL ( 2,5g/ml)
5) ETIONAMIDA (1,25g/ml)
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163
1) OFLOXACINA (2,0g/ml)
2) AMICACINA (2,0g/ml)
ESQUEMA 4- DROGAS ESPECIAIS PARA USO NO MB/BACT
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
Isoniazida
Rifampicina
Pirazinamida
Estreptomicina
Etambutol
Etionamida
PNB
Lev/Oflo
Amicacina
Propileno glicol
Etileno Glicol
DROGAS QUANT.
DILUIO VOLUME
PARTIDA
PREPARO VALIDADE
INCORPORAO DATA
Isoniazida
Rifampicina
Pirazinamida
Estreptomicina
Etambutol
Etionamida
PNB
Lev/Oflo
Amicacina
Propileno glicol
Etileno Glicol
1/1000
1/10 e 2/8
1/10 e 2/8
1/10 e 2,5 /7,5
1/10 e 2,2/17,5
1/100
1/10 e 2/8
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DE REAGENTES
PARA TESTE DE SENSIBILIDADE S DROGAS
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
SOLUO APROVADA
HCl 2N
SUBSTNCIA
HCl 0,2N
QUANTIDADE VOLUME FINAL INCORPORAO DO MEIO
FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO
ACIDIFICADORA PARA TESTE DO PZA (MB/BacT)
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FICHA 3- LEITURA DO TESTE NO MB/BACT
NMERO DA AMOSTRA DATA DE ENTRADA
CDIGO
DROGAS
RESULTADO TEMPO
RESULTADO
FINAL
LOTE:__________
CONTROLE
SM
INH
RMP
EMB
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C:1/100
PNB
PZA
C/PZA
LEITURA POR: REALIZADO POR:
ANALISADO POR: LIBERADO:
Captulo 8
CONTROLE DE QUALIDADE NO LABORATRIO DE
MICOBACTERIOLOGIA
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8.1- INTRODUO
O controle da qualidade dos exames laboratoriais uma atividade de importante relevncia para a
produo de resultados confiveis e reprodutveis. Este pode ser considerado uma atividade operacional
preventiva medida que fornece em tempo real, a informao sobre o desempenho do processo
investigativo.
O controle da qualidade compreende o monitoramento da competncia do pessoal tcnico, o
gerenciamento do comportamento dos instrumentos e equipamentos crticos, o monitoramento e
controle das condies ambientais e de biossegurana, a atualizao das metodologias e procedimentos
utilizados, o monitoramento da qualidade dos materiais e reagentes utilizados, e o monitoramento
do processo global de exame atravs da utilizao de amostras, tipo de fornecedor confivel, padres
rastreveis ao Sistema Internacional de Unidades (SI) e amostras de controle.
Alm das tcnicas citadas acima, de primordial importncia a participao do laboratrio em
ensaios de proficincia, com o objetivo de fornecer informaes sobre o comportamento do laboratrio
em relao aos demais que realizam os mesmos exames, e sobre a competncia tcnica do pessoal.
Tanto quanto possvel todos os dados de controle da qualidade devem estar baseados em tcnicas
estatsticas. O controle deve ficar a cargo dos membros do Comit da Qualidade. No entanto, a
responsabilidade dividida com toda a equipe do laboratrio.
8.2- RECOMENDAES GERAIS
todos os dados referentes ao controle de qualidade devem ser registrados em fichas adequadas para
cada procedimento, e monitorado diariamente pelo supervisor dos exames, a fim de corrigir os
problemas a tempo de no invalid-los, e analisados criticamente pelo Comit da Qualidade em
sua reunio peridica;
toda a metodologia realizada no laboratrio deve estar detalhadamente descrita e atualizada em um
manual de procedimentos, de modo a facilitar a execuo dos exames pelo pessoal habilitado. Os
mtodos usados rotineiramente devem ser aqueles publicados em normas internacionais, regionais
e nacionais, ou aqueles que tenham sido publicados em livros clssicos de microbiologia, manuais
ou publicaes especficas. Procedimentos no descritos em publicaes podem ser utilizados desde
que tenham sido desenvolvidos sob controle experimental confivel, validados, e que estejam aceitos
para publicao;
o prazo de validade de todo o material (meios de cultura, corantes, reagentes, antibiticos e outros)
deve ser observado no momento da aquisio, assim como o certificado de anlise do produto, a sua
armazenagem correta no laboratrio (geladeira, freezer, dessecador, ao abrigo da luz, etc). As
substncias txicas, inflamveis e explosivas etc. devem ser respectivamente rotuladas como tal e
armazenadas segundo as normas de segurana qumica (ver Captulo BIOSSEGURANA);
os meios de cultura, corantes e reagentes preparados no laboratrio devem ser rotulados com o
nome, concentrao e a data da preparao, prazo de validade, assinatura do responsvel pela
preparao e lote de origem. Esses devem ser periodicamente observados quanto presena de
contaminantes, alterao de cor, formao de precipitado etc. A marca e o nmero do lote do
produto utilizado devem ser sempre registrados numa ficha quando houver mudana de frasco;
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a gua utilizada para as anlises do laboratrio deve ser filtrada em filtro de areia e de carvo
ativado, para reteno de materiais particulados, absoro de contaminantes orgnicos e cloro,
facilitando com isso o trabalho das colunas deionizadoras, e depois deionizada. Aps a deionizao
a gua pode ser sanitizada atravs do processo de autoclavao ou esterilizao por luz ultravioleta.
O pH deve ser medido logo aps cada deionizao e deve estar entre 5,0 e 7,0. Assim a gua
apresentar qualidade para o preparo dos reagentes utilizados nos exames. Anotar os resultados de
cada deionizao na ficha 1 Controle de Qualidade da gua Deionizada (ver anexo).
8.3- EQUIPAMENTOS DO LABORATRIO
Os equipamentos devem ser utilizados seguindo as recomendaes do fabricante, para permitir
maior vida til, e regularmente monitorados pelo usurio para assegurar a preciso e exatido necessrias.
Caso apresentem comportamento suspeito e indcios de defeito, deve-se tomar o cuidado de
segreg-los e fixar uma etiqueta ou aviso para evitar o uso inadvertido por outra pessoa. Aps a
manuteno ou calibrao e antes do uso, o equipamento deve ser testado para a evidenciar a sua
adequao. As manutenes, controle de rotina e calibrao devem ser registrados.
Observao: Nos locais com grande variao de tenso, recomendvel o uso de reguladores de
voltagem, especialmente nos aparelhos que apresentam maior sensibilidade a essas variaes, como:
balana, medidor de pH, microscpio, aparelhos gerenciados por computador etc. Nas salas midas
e em equipamentos mais sensveis umidade, como o caso dos microscpios, recomendvel o uso
de desumidificador ou ambientes aquecidos a seco.
Alguns equipamentos no descritos neste captulo podem ser controlados atravs da anotao no
Livro de Registro de Ocorrncias do Laboratrio, como o caso das centrfugas, potencimetros,
balanas, deionizadores, microscpios etc. Caso apresentem defeitos, estes sero comunicados pelo
usurio a um membro do Comit da Qualidade que far o registro no livro e que comunicar o
ocorrido ao chefe do laboratrio para providncias cabveis.
8.3.1- AUTOCLAVE
A cada autoclavao a temperatura dever ser registrada na Ficha 2 Controle de Esterilizao
por Autoclave (ver anexo), assim como a eficincia da esterilizao dever ser verificada atravs
do uso da fita adesiva indicadora apropriada, termosensvel, usada no acondicionamento de todo
o material ou atravs de controle biolgico. Para um processo eficiente de esterilizao deve-se
assegurar que o vapor penetre facilmente atravs de todo material contido na autoclave. Por essa
razo no se deve colocar material em excesso . fundamental a eliminao de todo o ar residual,
antes de comear a contar o tempo do processo, de modo a utilizar apenas o vapor dgua
superaquecido. A esterilizao em autoclave feita a 121C durante 15 a 20 minutos.
Periodicamente, deve-se verificar se h perda de vapor nas juntas e na tampa; se a borracha de
vedao est danificada ou ressecada; se h formao de incrustaes na caldeira e, dependendo
da utilizao do equipamento, o mesmo dever ser submetido prova hidrulica da cmara,
conforme NR 13 do Ministrio do Trabalho, para detectar possveis fugas e verificar soldaduras.
O interior deve ser lavado mensalmente ou at semanalmente se muitos resduos acumularem-se
no fundo. A calibrao do manmetro e do termmetro, bem como o controle da vlvula de
segurana, devem ser feitos anualmente.
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8.3.2- CABINE DE SEGURANA BIOLGICA (CSB)
O componente mais delicado da cabine de segurana biolgica o filtro HEPA (high efficiency
particulate air). Ento toda manipulao nas CSB deve zelar pela integridade dos filtros e pela
garantia de no contaminao do operador e dos materiais que esto sendo manipulados A
cabine deve ser munida de manmetro para permitir o controle peridico do fluxo do ar. A
manuteno deste equipamento feita por tcnico especializado, a cada ano, de preferncia
indicado pelo prprio fabricante. A reviso inclui tambm a inspeo e troca da lmpada germicida.
A troca de filtros geralmente recomendada aps 2 anos de utilizao, mas dependendo do
manuseio da cabine, da qualidade do ar do laboratrio e do prprio equipamento, esse prazo
pode ser maior. A utilizao diria da CSB requer cuidados:
ligar a cabine 30 minutos antes de comear o trabalho, inclusive a lmpada UV;
desligar e passar um pano limpo embebido com lcool a 70% no interior da CSB, incluindo a
lmpada germicida, colocando apenas o antebrao e as mos no seu interior (nunca a cabea);
planejar a realizao do trabalho com antecedncia e arrumar todo o material necessrio de
forma a que as manipulaes no provoquem gestos bruscos que possam alterar o fluxo de ar;
ao terminar o trabalho, retirar todo o material, passar um pano limpo embebido com lcool a
70% no interior e ligar a lmpada UV durante 30 minutos antes de encerrar o trabalho;
anotar na ficha 3 Manipulao na CSB toda vez que for manipular.
8.3.2.1- Descontaminao da CSB
Para evitar a contaminao do tcnico, antes de fazer a visita para a manuteno ou
conserto da cabine a descontaminao do aparelho obrigatria. A descontaminao feita
com formaldedo gasoso, produzido pela despolimerizao trmica do paraformaldedo. Para
calcular seu peso em gramas necessrio multiplicar o volume total da rea de trabalho
(altura x largura x comprimento) por 0,25. Pesar o paraformaldedo num bcher e coloc-lo
sobre uma placa aquecedora no centro da bancada da cabine. Em outra placa, colocar um
bcher com gua para elevar a umidade relativa do ar, que deve ser de no mnimo 60%,
durante o processo de descontaminao. Aps fechar hermeticamente todas as aberturas da
cabine, ligar as placas aquecedoras acionadas remotamente e s deslig-las uma hora depois
ou quando o p tiver sublimado. Deixar o equipamento tampado e desligado por toda a
noite . Pela manh ligar a cabine e deixar operando por uma hora para retirar todo o resduo
do gs. Anotar na ficha 4 Controle da Descontaminao da CSB.
ATENO: O formaldedo um gs custico para a pele e irritante para pele e mucosas
(olhos, trato respiratrio). Esta operao s deve ser feita por pessoal usando mscara semifacial
em silicone, luvas de borracha natural ou PVC, culos e avental de tyvek. Consultar o
Captulo BIOSSEGURANA.
8.3.3- CENTRFUGA
Estes aparelhos devem ser equipados de tacmetro para controlar a fora centrfuga. Para a
sedimentao de micobactrias a fora centrfuga ideal acima de 3.000 x g. O uso do rotor do
tipo angular (45) o mais adequado, pois minimiza a resistncia do ar e a elevao da temperatura
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durante a centrifugao. Alm disso elas devem ser refrigeradas e os rotores devem ter tampa de
vedao (aerossol free) e s devem ser abertos dentro das cabines de segurana para a retirada
dos tubos. Este aparelho deve ser calibrado anualmente. Quando necessrio, aps cada uso, deve
ser realizada a desinfeco do rotor. A operao destes aparelhos descrita de modo geral:
ligar;
ajustar a temperatura para 13C, com um toque no boto indicado no painel frontal;
ajustar a fora centrfuga para 3000 x g com um toque no boto indicado no painel;
ajustar o tempo de centrifugao para 30 minutos com um toque no boto indicado no painel;
arrumar os tubos dentro do porta-tubos de modo que os tubos diametralmente opostos tenham
o mesmo peso;
fechar a tampa do rotor, rosqueando o parafuso;
tampar a centrfuga;
ligar e deixar completar o programa;
destampar a centrfuga e retirar o rotor com os tubos;
S abrir a tampa do rotor dentro da cabine de segurana.
8.3.4- CABINE DE EXAUSTO QUMICA (CEQ)
Esse aparelho um grande auxiliar que garante a segurana nas manipulaes qumicas e para
que isso ocorra a utilizao desse equipamento deve ser rigorosamente observada. Anotar as
observaes de cada tarefa na ficha 5 Manipulao na CEQ.
arrumar todo o material na capela qumica (reagentes, vidraria, porta-pipetas, pipetador
automtico). A cabine s deve conter materiais e frascos de reagentes que vo ser utilizados
naquela manipulao;
ligar;
verificar se a fita est acenando para dentro da cabine (fita indicativa de presso negativa);
limitar os movimentos dos braos, mov-los retilineamente para dentro e para fora, devagar;
manter a vidraa no ponto de segurana mais baixo;
assegurar-se de que as aberturas na parte de trs da cabine no estejam obstrudas;
no desligar a cabine at que os produtos qumicos sejam retirados.
8.3.5- ESTUFA BACTERIOLGICA (36 1 C)
A temperatura deve ser observada diariamente em vrios locais dentro da estufa, anotada na
ficha 6 Controle de Temperatura da Estufa Bacteriolgica (anexa) usando termmetros de
mnima e mxima controlados externamente com certificado de calibrao . O uso de qualquer
luz no interior da estufa deve ser restrito. A intervalos pr-determinados deve ser feita uma
verificao da uniformidade da temperatura.
Como existe a possibilidade de haver quebra ou mesmo a abertura involuntria de tampa de
tubos no interior da estufa, recomendamos que seja instalado um sistema de desinfeco de ar
atravs de radiao ultravioleta para o controle interno dessas possveis contaminaes. Ver descrio
do aparelho no Captulo 10 SOLUES E REAGENTES. MATERIAL UTILIZADO NO LABORATRIO.
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8.3.6- MICROSCPIO
Aps exame dirio de lminas, a objetiva de imerso deve ser limpa com gaze embebida
levemente com xilol (usar luva de borracha nitrlica), para que o excesso no descole as lentes. O
microscpio deve ficar protegido da poeira e da umidade com uma capa de pano de algodo, que
possa ser lavada periodicamente. Efetuar limpeza geral, revisar o circuito eltrico de iluminao,
os sistemas tico e mecnico anualmente.
8.3.7- COAGULADOR
O coagulador deve manter em seu interior uma temperatura constante de 80 a 85C. Em
alguns casos, os coaguladores apresentam temperaturas mais altas prximo s paredes e da resistncia
e os tubos colocados nas extremidades podem sofrer superaquecimento. O tempo mximo de
coagulao de 50 minutos. Anotar a temperatura de cada processo na ficha 7 Controle de
Temperatura do Sorocoagulador. A exemplo das estufas bacteriolgicas, deve ser verificada a
distribuio de calor no seu interior.
8.3.8- GELADEIRA (2-8C)
Verificar a temperatura diariamente com termmetro digital externo e calibrado, cujo sensor
esteja localizado internamente ou com o de mnima e mxima calibrado colocado no interior.
Anotar na ficha 8 Controle de Temperatura da Geladeira. Descongelar e limpar mensalmente
. Passar pano de limpeza com lcool a 70% se a geladeira armazenar material contaminado e s
depois lavar com um pano com gua e detergente.
Como existe a possibilidade de haver quebra ou mesmo abertura involuntria de tampa de
tubos ou potes de escarro e outros materiais no interior da geladeira, recomendamos que seja
instalado um sistema de desinfeco de ar atravs de radiao ultravioleta para o controle interno
dessas possveis contaminaes. Ver descrio do aparelho no Captulo 10.
8.3.9- FREEZER (0 A -70C)
A exemplo da geladeira, verificar a temperatura diariamente e anotar na ficha 9 Controle de
Temperatura do Freezer. Descongelar e limpar a cada ano, com os procedimentos utilizados
para a geladeira.
8.3.10- BALANA ANALTICA DE PRECISO
Cuidados especiais devem ser tomados para a operao adequada das balanas analticas.
Estas devem estar situadas sobre uma mesa ou bancada isenta de trepidaes, caso contrrio seu
mecanismo interno se desgastar, danificando-as. Deve ser observado o seu nvel, o que evitar o
empeno do mecanismo de sustentao dos pratos. Sob hiptese alguma seu mecanismo interno
poder ser mexido.
Aps o uso dever ser removido todo o resduo do material que foi pesado. Sua calibrao
anual deve ser feita por laboratrio que possa fornecer rastreabilidade do SI.
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Entre as calibraes devem ser feitas verificaes da validade das mesmas pela utilizao de
massas calibradas na faixa de uso das balanas.
Outros cuidados na instalao das balanas:
no instalar em frente ou ao lado de janelas, para evitar o aquecimento por radiao solar;
no instalar aquecedores nas proximidades, pois alm da radiao trmica, produzem correntes
de ar relativamente fortes;
instalar em local protegido de correntes de ar;
ambiente onde so realizadas as pesagens deve ter umidade controlada (55% 5%);
as mesas de instalao das balanas devem ser com tampos de mrmores ou concreto macio,
com o fundo apoiado sobre neoprene ou material similar, a fim de minimizar as vibraes. As
balanas podem tambm ser instaladas sobre suportes, porm devem ser evitadas as colocaes
combinadas de suportes no solo e na parede, evitando uma conjugao de trepidaes;
a mesa deve ter um tamanho que evite que o operador apie-se sobre o tampo.
OBS: Nos locais com grande variao de tenso, recomendvel o uso de reguladores de voltagem,
especialmente nos aparelhos que apresentam maior sensibilidade a essas variaes, como: balana,
medidor de pH, microscpio, geladeira, estufas etc. Nas salas midas e em equipamentos mais
sensveis umidade, como o caso dos microscpios, recomendvel o uso de desumidificador
ou ambientes aquecidos a seco.
8.3.11- MB/BACT
Os cuidados tomados para a operao deste aparelho esto diretamente ligados manuteno
da gravao dos dados produzidos diariamente pelo sistema e do controle das clulas leitoras do
fundo dos tubos. A manuteno do aparelho oferecida pela firma em tempo integral, de forma
corretiva.
8.4- VIDRARIA
Antes de colocar o meio nos tubos necessrio que eles estejam bem limpos. No suficiente que
tenham sido esterilizados, pois os resduos alteram a qualidade do meio de cultura. A alcalinidade
dos tubos influi desfavoravelmente na composio do meio, por isso deve-se adquirir vidro neutro.
Tambm freqente observar tubos alcalinizados (o meio adquire cor esbranquiada na parte que
est em contato com o tubo) quando so lavados com solues detergentes com alta concentrao de
soda. Para evitar isso, necessrio enxaguar exaustivamente com gua destilada.
8.5- MANUTENO DE AMOSTRAS-TIPO DE MICOBACTRIAS
Preparar suspenses em 2ml de salina fisiolgica ou gua destilada estril ou em meio lquido de
7H-9 e estocar no freezer. Alternativamente, culturas podem ser semeadas no meio lquido de 7H-9
e quando apresentarem crescimento, estocar no freezer. A maioria das espcies, inclusive M.tuberculosis,
perdem a validade quando armazenadas por mais de 1 ano a -20C, mas se mantm vlidas e com as
caractersticas inalteradas a -70C por mais de 2 anos.
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8.6- TCNICAS LABORATORIAIS
8.6.1- BACILOSCOPIA
Antes da preparao dos corantes deve-se verificar a potncia dos mesmos e corrigir a massa a
ser pesada para que se trabalhe sempre com 100% do corante ativo. O controle de qualidade
deve ser feito cada vez que so preparados, utilizando-se lminas sabidamente positivas para
testar a colorao. Sempre que apresentarem precipitados ou, mudana na colorao, devem ser
descartados. Anotar na ficha 10 Controle da Soluo de Fenol Lquido Para o Mtodo de Colorao
de Ziehl Neelsen e na ficha 11 Controle da Preparao dos Corantes Para o Mtodo de Colorao
de Ziehl Neelsen.
8.6.2- MEIO DE CULTURA
Cada partida de meio de cultura preparada no laboratrio ou adquirida comercialmente deve
ser avaliada quanto esterilidade e sensibilidade no isolamento de micobactrias. Esta ltima
deve ser realizada utilizando uma suspenso padronizada de M.tuberculosis (H
37
Rv ou H37Ra)
com contagem de viveis previamente conhecida. Geralmente a diluio 10
-5
desta suspenso
(conforme preparada para teste de sensibilidade, ver o captulo), contm de 50 a 150 unidades
formadoras de colnias em 0,1ml. Estes resultados devem ser anotados em ficha prpria Meios
de qualidade inferior geralmente no propiciam crescimento de colnias nesta diluio. Anotar
na ficha 12 Controle de Produo de Meio de Cultura Lowenstein Jensen.
Na preparao do meio de Lowenstein-Jensen observar que:
a temperatura e o tempo de coagulao devem ser controlados e registrados;
aps a coagulao, os tubos de meio devero ficar 24 horas a temperatura ambiente com as
tampas afrouxadas, para controlar a esterilidade e eliminar a gua de condensao. Aps esse
perodo os tubos devem ser bem fechados e guardados em geladeira a 4C por no mximo 2
meses;
os ovos utilizados no preparo do meio devem ser frescos e preferencialmente provenientes de
galinhas de granja, cuja alimentao seja isenta de antibiticos (ovos para fins biolgicos).
O meio de 7H-9 de Middlebrook preparado de acordo com o fabricante e o controle de
esterilidade feito deixando-se os tubos 24horas em temperatura ambiente aps serem
distribudos. O controle de qualidade da partida feito com uma amostra de M. avium durante
a prova do telurito de potssio. Os resultados sero anotados na ficha 13 Controle de Produo
de Meio de Cultura 7H9 de Middlebrook.
8.6.3- DESCONTAMINAO DE ESPCIMES
O controle deste procedimento deve ser feito mensalmente para avaliar o percentual de culturas
contaminadas, por metodologia utilizada, atravs da marcao na agenda de anotao das
semeaduras e leituras dirias do trabalho, das amostras processadas que foram contaminadas (ver
ficha 14 ndice de Contaminao).
Obs: Cuidado ao semear ou repicar as culturas na cabine de segurana de modo a evitar que os
aerossis produzidos pela manipulao provoquem miniepidemias em outras culturas, ou seja,
isolamentos repetidos de micobactrias saprfitas e de cultura mista de micobactrias. Aguarde
alguns minutos entre uma semeadura e outra.
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8.6.4- TESTE DE SENSIBILIDADE
Cada partida de meio com drogas preparadas deve ser sempre avaliada semeando-se uma
amostra padro de M.tuberculosis (H
37
Rv ou H
37
Ra) que mostram-se sensveis s drogas utilizadas
nos esquemas de tratamento (Rifampicina, Isoniazida, Pirazinamida, Etambutol, Etionamida e
Estreptomicina). Adicionalmente, outras amostras-tipo podem ser utilizadas, para avaliar
determinadas drogas, como o caso de M. fortuitum, que sensvel a Etionamida e M. bovis
BCG, que resistente a Pirazinamida. Outras drogas incorporadas ao Lowenstein Jensen, tais
como Cicloserina, Ofloxacina, Amicacina, cido p-nitrobenzico e Hidrazida do cido tiofeno-
carboxlico tm a qualidade controlada quando semeadas com a cepa padro H
37
Ra. Todas as
etapas da preparao do meio com droga como: clculo da potncia da drogas, pesagem, diluio,
volume de incorporao da droga no meio, data da preparao devem ser anotadas em fichas
prprias (Ficha 15 Controle dos Reagentes Para Teste de Sensibilidade s Drogas), assim como
os resultados dos testes com as amostras-pado. A leitura do teste de sensibilidade no deve
ultrapassar a 20 dias, pois falsa resistncia a drogas pode ser observada, principalmente a
etionamida, estreptomicina e etambutol, que se degradam pelo calor da incubao prolongada.
Anotar na ficha 16 Leitura de Resultados de Teste de Sensibilidade. O meio com drogas, aps
a coagulao e controle de esterilidade (que o mesmo da preparao do meio de cultura) deve
ser guardado em geladeira a 4C por no mximo 1 ms.
8.6.5- IDENTIFICAO
O laboratrio que realiza identificao de micobactrias deve ter amostras-tipo provenientes
de colees internacionalmente reconhecidas e certificadas, para controlar a qualidade dos testes
bioqumicos. O controle de qualidade de cada uma das tcnicas est descrito no Captulo 5
IDENTIFICAO DE MICOBACTRIAS, assim com as fichas para anotao de cada procedimento.
8.7- BIBLIOGRAFIA
1- BARTLETT, RC. Quality control in clinical microbiology. In: LENETTE, EH; BALLOWS, A; HAUSLER Jr, WJ;
SHADOMY, HJ. Manual of Clinical Microbiology. Washington : American Society for Microbiology, 1985, 4
th
ed., p 14.
2- BRASIL/MS/FUNASA/CENEPI/CRPHF. Manual de Bacteriologia da Tuberculose. Rio de Janeiro, 1994. 2 ed. revisada e
ampliada.
3- STRONG, B. E. & KUBICA, G.P. Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis. A Guide for the Level II Labora-
tory. Atlanta: Centers for Disease Control, 1991.
4- INMETRO. Guia para laboratrios qumicos; um auxlio Organizao e ao Credenciamento. Intercincia, 2000.
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IDENTIFICAO DO POTENCIMETRO
IDENTIFICAO DO DEIONIZADOR
MODELO REGISTRO FNS COLUNA MARCA
MODELO REGISTRO FNS MARCA
OBSERVAES pH DATA
FICHA 1- CONTROLE DE QUALIDADE DA GUA DEIONIZADA
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F i m ( h o r a )
T e m p e r a t u r a
P r e s s o
T e m p e r a t u r a
M x i m a
N v e l d e H O
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F i t a A d e s i v a
I n d i c a d o r
B i o l g i c o
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FICHA 2- CONTROLE DE ESTERILIZAO POR AUTOCLAVE
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179
Verificao
de material
contaminado
Desinfeco
da cabine
Verificao
das
lmpadas
Verificao
dos filtros/
manmetros
Ligar 30
minutos
antes uso
2
Desinfeco
da cabine
30 min de
luz UV aps
trabalho
Verificao
do total
desligamento
DIA
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PROCEDIMENTOS
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ANO MS
MARCA PATRIMNIO SALA
FICHA 3- MANIPULAO NA CSB
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180
DATA
USO DE EPIs
Formaldedo
RESPONSVEL
OBSERVAES
FORMALDEDO (g) TEMPO DE DESCONTAMINAO
PATRIMNIO
EQUIPAMENTO MODELO SALA
( ) MSCARA
( ) LUVAS
( ) CULOS
( ) AVENTAL
/ /
FICHA 4- CONTROLE DA DESCONTAMINAO DA CSB
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ANO MS
MARCA PATRIMNIO SALA
DIA
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PROCEDIMENTOS
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Verificao
de reagentes
deixados
Arrumao
da cabine
Verificao
do fluxo
de ar
Verificao
do total
desligamento
Observaes
(relatrios)
CONTROLE ANUAL REALIZADO EM
/ /
FICHA 5- MANIPULAO NA CEQ
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OBSERVAES
TEMPERATURA C
Mnima mxima atual
HORA
RESPONSVEL
IDENTIFICAO DO TERMMETRO
PATRIMNIO
TEMPERATURA DE TRABALHO DO APARELHO PATRIMNIO MARCA
FICHA 6- CONTROLE DE TEMPERATURA DA ESTUFA BACTERIOLGICA
C
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OBSERVAES
TEMPERATURA C
Mnima mxima atual
HORA
RESPONSVEL
PATRIMNIO
TEMPERATURA DE TRABALHO DO APARELHO PATRIMNIO MARCA
FICHA 7- CONTROLE DE TEMPERATURA DO SOROCOAGULADOR
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OBSERVAES
TEMPERATURA C
Mnima mxima atual
HORA
RESPONSVEL
PATRIMNIO
TEMPERATURA DE TRABALHO DO APARELHO PATRIMNIO SALA MARCA
FICHA 8- CONTROLE DE TEMPERATURA DA GELADEIRA
C
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OBSERVAES
TEMPERATURA C
Mnima mxima atual
HORA
RESPONSVEL
PATRIMNIO
TEMPERATURA DE TRABALHO DO APARELHO PATRIMNIO SALA MARCA
FICHA 9 -CONTROLE DE TEMPERATURA DO FREEZER
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186
SUBSTNCIA PROCEDNCIA
N DO LOTE VALIDADE
Fenol Cristalizado
SUBSTNCIA
QUANTIDADE
Fenol Cristalizado
H 0 destilada
2
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
FICHA 10- CONTROLE DA SOLUO DE FENOL LQUIDO
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187
PESAGEM / VOLUME
Fucsina Bsica
lcool etlico 95% PA
Azul de Metileno
Hcl
Fenol Cristalizado
Fucsina Bsica
Azul de Metileno
Hcl
SUBSTNCIA CORANTES FENOL LQUIDO H 0 DESTILADA
2
RESPONSVEL
OBSERVAES
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FICHA 12- CONTROLE DE PRODUO DE
MEIO DE CULTURA LOWENSTEIN JENSEN
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190
MTODO
N DE TUBOS
MS
PERCENTUAL
RESPONSVEL
TOTAL CONTAMINADOS
Janeiro
Fevereiro
Maro
Abril
Maio
Junho
Julho
Agosto
Setembro
Outubro
Novembro
Dezembro
TOTAL GERAL
OBSERVAES
FICHA 14- NDICE DE CONTAMINAO
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CS
HX
Etileno Glicol
Propileno glicol
PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
DROGAS QUANT.
DILUIO VOLUME
PARTIDA
PREPARO VALIDADE
H O
DESTIL.
2
INCORPORAO DATA
INH
RMP
PZA
SM
EMB
ETH
PNB
TCH
OFLO
CS
HX
1/100
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1/10
1/10
1/10
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*
**
FICHA 15- CONTROLE DOS REAGENTES
PARA TESTE DE SENSIBILIDADE S DROGAS
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FICHA 16- LEITURA DE RESULTADO DO TESTE DE SENSIBILIDADE
Captulo 9
REGISTRO DE EXAMES FLUXO E
RASTREABILIDADE
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195
9.1- REGISTRO DE INFORMAO
Os laboratrios integrantes ou vinculados Rede Nacional de Laboratrios de Sade Pblica
devem dispor de um sistema de registro interno que possibilite fornecer, alm do resultado do exame
ao solicitante, informaes indispensveis para a Vigilncia Epidemiolgica da Tuberculose e para a
Coordenao Nacional de Laboratrios de Sade Pblica. Visando padronizar estas informaes, o
Centro de Referncia Professor Hlio Fraga elaborou o Livro de Registro de Baciloscopia e de Cultura
para o Diagnstico e Controle da Tuberculose (livro branco) . Este livro vem sendo amplamente
utilizado em todas as unidades laboratoriais e Laboratrio Central (LACENs) das capitais, sendo
fornecido gratuitamente pelo CRPHF. O modelo da folha de preenchimento do livro apresentado
em anexo.
Com o objetivo de disponibilizar os dados laboratoriais contidos no livro branco de forma mais
ampla e gil, foi desenvolvido tambm pelo CRPHF um sistema de informao laboratorial
informatizado SILTB Sistema de Informao Laboratorial da Tuberculose. Esse sistema apresenta
uma verso para ser utilizada em unidades laboratoriais (SILTB-UL) e uma verso para os laboratrios
estaduais e regionais (SILTB-LACEN).
O SILTB-LACEN permite, alm do armazenamento de dados laboratoriais, a avaliao da qualidade
das baciloscopias realizadas nas unidades laboratoriais e a emisso de relatrios consolidando
informaes da rede de laboratrios, por municpio. O controle de qualidade feito a partir de um
banco de replicao gerado aleatoriamente, que inclui todas as lminas positivas mais 10% das negativas
recebidas de um determinada unidade laboratorial em um determinado perodo. Aps a reviso
destas lminas pelo LACEN ser realizada a anlise de concordncia. O sistema disponibiliza
informaes como a positividade da baciloscopia e da cultura, nmero de sintomticos respiratrios
examinados, pacientes novos diagnosticados, total de exames realizados entre outras. Estas informaes
podem ser obtidas para um determinado laboratrio ou municpio e podem ser impressas na forma
de relatrios incluindo o resultado dos exames por paciente diagnosticado.
Alm do sistema SILTB, os LACENs devero dispor de outro sistema informatizado para atender
as necessidades da rotina dos exames de maior complexidade realizados em seus servios.
9.2- FLUXO E RASTREABILIDADE DOS EXAMES REALIZADOS
Uma vez registrado no programa SILTB, o material recebido ter um fluxo no laboratrio dependente
do tipo de exame solicitado. Para sinalizar e instruir os tcnicos do laboratrio que procedimentos
devero ser executados, fichas internas de trabalho precisam ser padronizadas. Alm das agendas, que
orientam os tcnicos na programao dos testes e preparao de material a ser utilizado no laboratrio,
as fichas permitem o rastreamento dos exames realizados de forma a garantir a confiabilidade de seus
resultados. A seguir sero detalhadas as fichas empregadas de acordo com o tipo de exame solicitado,
tomando como base aquelas que so utilizadas na nossa rotina. (fichas em anexo)
9.2.1- FICHA 1 ESPCIME CLNICO PARA CULTURA, IDENTIFICAO E/OU
Se o exame solicitado for cultura ou teste de sensibilidade direto, a ficha Espcime Para
Cultura, Identificao e/ou Teste de Sensibilidade dever ser preenchida inicialmente. Os campos
desta ficha so preenchidos a partir da ficha de entrada gerada no sistema de registro geral do
laboratrio.
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9.2.2- FICHA 2 CULTURAS ENCAMINHADAS PARA TESTE DE SENSIBILIDADE
E/OU IDENTIFICAO
Todas as culturas encaminhadas por outras instituies devem ser listadas nesta ficha.
9.2.3- FICHA 3 CULTURAS PARA REALIZAO DO TESTE DE SENSIBILIDADE
Os isolamentos obtidos no laboratrio com solicitao de teste de sensibilidade (antibiograma)
e as culturas recebidas para este exame devero ser relacionados nesta ficha para a consumao do
teste solicitado. No antibiograma, dever ser assinalado o tipo de teste a ser executado: se teste
para 6 drogas, que compreende isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol, estreptomicina,
etionamida e/ou um teste com drogas especiais, como por exemplo, ofloxacin e amicacina.
9.2.4- FICHA 4 LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS DE CULTURA
Os resultados dos exames so anotados em fichas de leitura especificas para cada tipo exame.
Nesta ficha anotamos os resultados do exame de cultura anotando o nmero da amostra e o
resultado observado. A partir delas, os resultados so transferidos para o SILTB ou outro sistema
que informe o resultado ao paciente.
9.2.5- FICHA 5 LEITURA E REGISTRO DE RESULTADO DE TESTE DE
SENSIBILIDADE
Nesta ficha sero feitas todas as leituras dos crescimentos obtidos nos tubos com drogas
semeados e a interpretao destes crescimentos, ou seja, se a amostra resistente ou sensvel a
determinada droga.
9.2.6- FICHA 6 RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA
Nesta ficha so anotados as culturas e os resultados dos testes bioqumicos obtidos no
laboratrio.
9.2.7- FICHA 7 RESULTADO DE LEITURA DO TESTE DE CRESCIMENTO EM
AGENTES INIBIDORES
Nesta ficha sero transcritos os resultados dos testes de crescimento na presena de inibidores
utilizados para identificao da espcies micobacterianas.
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9.2.8- FICHA 8 RESULTADO DOS EXAMES DO LABORATRIO
Estas fichas sero utilizadas para registrar um exame ou liberar resultado, manualmente,
sempre que no for possvel utilizar o sistema do laboratrio. Podero ainda ser utilizadas para
liberao de resultados parciais de exames, ou seja, exame ainda no totalmente concludos.
9.2.9- FICHAS PARA PEDIDO DE EXAMES
A requisio mdica padronizada pelo LACEN. Para solicitar exame de baciloscopia e de
cultura utilizada a ficha 9 Solicitao de Baciloscopia e de Cultura e para identificao ou
teste de sensibilidade o requisitante dever preencher a ficha 10 Solicitao de Identificao e/
ou Teste de Sensibilidade.
9.3- BIBLIOGRAFIA
1- MINISTRIO DA SADE; Fundao Nacional de Sade; Coordenao Nacional de Pneumologia Sanitria; Centro de
Referncia Professor Hlio Fraga. Livro de Registro de Baciloscopia e de Cultura para o Diagnostico e controle da tuberculose. Rio
de Janeiro, 2002.
2- MINISTRIO DA SADE; Fundao Nacional de Sade; Centro Nacional de Epidemiologia; Centro de Referencia
Professor Hlio Fraga. Manual de Instrues - SILTB Sistema de Informao Laboratorial da Tuberculose. Unidade Laborato-
rial. Rio de Janeiro, 2000. Verso 3.0.
3- MINISTRIO DA SADE; Fundao Nacional de Sade; Centro Nacional de Epidemiologia; Centro de Referencia
Professor Hlio Fraga. Manual de Instrues - SILTB Sistema de Informao Laboratorial da Tuberculose. Rio de Janeiro, 2000.
Verso 3.0. LACEN.
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FICHA 1- ESPCIME CLNICO PARA CULTURA,
IDENTIFICAO E /OU TESTE DE SENSIBILIDADE
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FICHA 2- CULTURAS ENCAMINHADAS PARA:
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FICHA 3- CULTURAS PARA REALIZAO DO TESTE DE SENSIBILIDADE
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FICHA 4- LEITURA E REGISTRO DOS RESULTADOS DE CULTURA
SUPERVISOR
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LEITURA DE DIAS
N DA CULTURA RESULTADO OBSERVAES
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FICHA 5- LEITURA E REGISTRO DE RESULTADO DO TESTE DE SENSIBILIDADE
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RESPONSVEL
DATA
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TESTES
NIACINA
NITRATO
CATALASE
AMBIENTE
CATALASE 68C
TWEEN
BETA
GLICOSIDASE
URIA 1
URIA 2
GELOSE
MacCONKEY
C F A
TEMPO DE
CRESCIMENTO
FOTOCROMO
GENICIDADE
COR
TELURITO DE K
ARIL SULFATASE
LJ CONTROLE
LJ NaCl 5%
INOSITOL
MANITOL
CITRATO DE Na
CULTURAS TESTES CULTURAS
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FICHA 6- RESULTADOS DA IDENTIFICAO BIOQUMICA
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FICHA 7- RESULTADOS DE LEITURA DO TESTE
DE SENSIBILIDADE AOS AGENTES INIBIDORES
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205
Nome:_______________________________________________________ N______________
Pronturio:_________________ Encaminhado por:____________________________________
Material:____________________________________ Data do registro:_______/______/______
Mdico responsvel:_____________________________________________________________
RESPONSVEL
OBSERVAES
DATA
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BACILOSCOPIA
Negativa ( ) Positiva ( ) Contaminada ( ) Aguardar ( ) No realizada ( )
CULTURA
Negativa ( ) Positiva ( ) Contaminada ( ) Aguardar ( ) No realizada ( )
IDENTIFICAO
M.tuberculosis ( ) M. sp. aguardar ( ) Aguardar ( ) No realizada ( )
Direto ( ) Indireto ( ) Aguardar ( ) No realizado ( )
Isoniazida
Pirazinamida
Etionamida
Ofloxacin
Rifabutina 1.0
( )
( )
( )
( )
( )
Rifampicina
Etambutol
Estreptomicina
Amicacina
Clofazimine
( )
( )
( )
( )
( )
FICHA 8- RESULTADO DOS EXAMES DO LABORATRIO
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FICHA 9- SOLICITAO DE BACILOSCOPIA E DE CULTURA
US:___________________________Municpio:________________________UF:____________
Nome do Paciente:______________________________________ N Registro:______________
Endereo:_____________________________________________
Sexo: Masculino ( ) Feminino ( ) Material Clnico: Escarro ( ) Outros:______________
Data Nasc.:____/_____/____
OBSERVAES
BACILOSCOPIA
CULTURA
SOLICITAO DE EXAME
( ) DIAGNSTICO
( ) 1 AMOSTRA
( ) 2 AMOSTRA
( ) CONTROLE
MS
DATA
RESPONSVEL
RESULTADOS
( ) NEGATIVO
( ) +
( ) ++
( ) +++
( ) NO REALIZADO
MS
DATA
RESPONSVEL
SOLICITAO DE EXAME
( ) DIAGNSTICO
( ) 1 AMOSTRA
( ) 2 AMOSTRA
( ) CONTROLE
MS
DATA
RESPONSVEL
RESULTADOS
( ) CONTAMINADO
( ) NEGATIVO
( ) +
( ) ++
( ) +++
( ) NO REALIZADO
MS
DATA
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207
FICHA 10- SOLICITAO DE IDENTIFICAO E/OU TESTE DE SENSIBILIDADE
IV - DADOS CLNICOS
III - EXAME SOLICITADO
II - MATERIAL ENVIADO
Instituio:
Profisso:_______________
_____________________________________________________ UF:____________
Nome do Paciente:______________________________________________________________
Sexo:Masculino ( ) Feminino ( ) Data Nasc.:____/_____/____
I - PROCEDNCIA DA AMOSTRA
ESPCIME ( ) QUAL ? ________________
CULTURA ( ) cruzes
( ) Identificao ( ) Teste de Sensibilidade
( ) 6 drogas
( ) EMB, SM, INH, RMP
( ) OFLO, AMI
( ) RMP, INH, PZA
outras: ______________
1. J teve tuberculose antes: ( ) sim ( ) no ( ) no sabe
Esquema ano cura
abandono falncia recidiva
( ) ( ) ( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( ) ( ) ( )
2. Outros fatores pr-disponentes para micobacterioses
Doena pulmonar obstrutiva e/ou destrutiva:
( ) micose curada
( ) pneumoconiose
( ) doena maligna
( ) bronquite crnica
( ) tuberculose curada
( ) bronquiectasia
( ) silicose
Estados de imunosupresso
HIV/AIDS: ( ) positivo ( ) negativo ( ) sem informao
( ) doena maligna
( ) diabetes
( ) uso de drogas imunosupressoras
( ) outros. Especificar
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VI - DADOS LABORATORIAIS
Nmero de colnias nos isolamentos
1 isolamento
( ) + ( ) ++ ( ) +++ ( ) nmero de colnias ___________
2 isolamento ( ) +
( ) ++
( ) +++ ( ) nmero de colnias ___________
3 isolamento ( ) +
( ) +++ ( ) +++
( ) nmero de colnias ___________
Cultura positiva com quantos dias? __________________________________________
Nmero de culturas realizadas
Nmero de culturas positivas
V - RESUMO DA DOENA
VII - OBSERVAO
Doena esofageana com regurgitao
( ) sim ( ) no
Utilizao de procedimentos invasivos:
( ) prtese/implante
( ) dilise
( ) transplante
( ) injees e/ou punes repetidas
Data: ___ /___ /___ Responsvel pelo envio _________________________________
SOLUES E REAGENTES.
MATERIAL DO LABORATRIO
Captulo 10
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10.1- INTRODUO
Neste captulo sero descritas as formulaes dos reagentes de uso comum no laboratrio, que
podem entrar na composio de outros reagentes descritos em captulos anteriores. Assim como as
solues desinfetantes e anti-spticas que podem ser utilizadas, caso o laboratrio no faa uso daquelas
preparaes prontas fornecidas pelo comrcio. Para orientar o controle de material, listamos todos os
insumos utilizados pelo Laboratrio.
10.2- SEGURANA QUMICA
Os reagentes descritos neste captulo devem ser preparados em cabine de exausto qumica com
luvas, mscara, culos e avental apropriado para cada um deles (ver Captulo 1 BIOSSEGURANA). De
modo geral, havendo contato com pele e mucosas, lavar imediatamente com gua abundante. Anotar
o reagente preparado nas fichas prprias e etiquetar os passos de armazenagem com a etiqueta
padronizada para tal.
10.3- LCOOL ETLICO A 70% (3)
10.3.1- SOLUO
lcool etlico PA ....................................................................................................77ml/70g
H
2
O destilada qsp .......................................................................................................23ml
10.3.1.1- Preparao
70 g de lcool etlico corresponde a 77 ml. Se necessitar preparar outros volumes, considerar
a questo acima;
Esta preparao dever ser distribuda em jorradeiras de 250ml e colocadas para uso na
Cabine de Segurana Biolgica e nas pias;
Anotar na Ficha 1 Controle da Preparao do lcool Etlico a 70%;
As solues de lcool so anti-spticas e podem ser utilizadas na desinfeco do interior
das CSB.
10.4- LCOOL ETLICO A 70% (4)
10.4.1- SOLUO
lcool etlico comercial 95% GL/92,5 INPM ............................................................700ml
H
2
O destilada ..........................................................................................................250ml
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10.4.1.1- Preparao
Adicionar lcool na proveta de 1000ml e completar com H
2
O destilada;
Anotar a preparao na Ficha 1 Controle de Preparao do lcool Etlico a 70%;
Distribuir em jorradeiras de 250 ml, para serem utilizadas na Cabine de Segurana Biolgica
(CSB) e nas pias.
10.5- SOLUO DE HIPOCLORITO DE SDIO A 2% (3)
10.5.1- SOLUO
NaOCl a 5% ..............................................................................................................40ml
H
2
O destilada qsp ....................................................................................................100ml
10.5.1.1- Preparao
esta soluo preparada a partir de uma soluo comercial a 5%;
juntar as duas solues em uma proveta, misturar e distribuir para jorradeiras de 250 ml.
Preparar somente no dia que vai ser utilizada, na CSB, durante as manipulaes, ou em
caso de acidente no laboratrio;
esta a soluo desinfetante mais recomendada para uso em laboratrio de
micobacteriologia;
anotar a preparao na Ficha 2 Controle de Preparao da Soluo de Hipoclorito de
Sdio a 2%.
10.6- SOLUO DE LCOOL IODADO
10.6.1- SOLUO ESTOQUE
Cristal de iodo ..........................................................................................................1,0g
lcool a 70% ..........................................................................................................20ml
10.6.1.1- Preparao
Adicionar o lcool aos poucos, homogeneizando at a dissoluo dos cristais de iodo. Esta
preparao dever produzir uma soluo escura e concentrada. Guardar em frasco escuro
com tampa.
10.6.1.2- Soluo de Uso
adicionar a soluo estoque ao lcool a 70% at alcanar a cor de ch forte. A concentrao
exata desta soluo no importante;
anotar a preparao na Ficha 3 Controle de Preparao do lcool Iodado.
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10.7- SOLUO TAMPO FOSFATO, SEGUNDO SOERENSEN ( 1 )
10.7.1- PREPARO DAS SOLUES
10.7.1.1. Soluo de Fosfato de Sdio M/15
Na
2
HPO
4
.........................................................................................................9,464g
Na
2
HPO
4
. H
2
O ..............................................................................................10,664g
Na
2
HPO
4
. 2H
2
O ............................................................................................11,864g
Na
2
HPO
4
. 4H
2
O ............................................................................................14,264g
Na
2
HPO
4
. 7H
2
O ..............................................................................................17,64g
Na
2
HPO
4
. 12H
2
O .............................................................................................48,5g
H
2
O destilada q.s.p. ........................................................................................1000ml
dissolver o sal na gua;
esterilizar em autoclave a 121 C por 20 minutos.
10.7.1.2- Soluo de Fosfato de Potssio M/15
KH
2
PO
4
.........................................................................................................9,0726g
H
2
O destilada q.s.p. ........................................................................................1000ml
dissolver o sal na gua.
esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos.
anotar a preparao na Ficha 4 Controle da Preparao do Tampo Fosfato.
10.7.2- MONTAGEM DO TAMPO
Tabela 1- Montagem do tampo fosfato segundo o pH desejado.
pH
6,0 12,0 88,0
6,2 18,5 81,5
6,4 26,2 73,8
6,6 36,0 64,0
6,8 50,0 50,0
7,0 61,1 38,9
7,2 72,2 28,0
7,4 80,0 20,0
7,6 87,0 13,0
7,8 91,2 8,8
8,0 95,0 5,0
Na HPO
2 4
KH PO
2 4
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10.8- ESCALA DE McFARLAND
10.8.1- PREPARO DAS SOLUES
10.8.1.1- Soluo de Cloreto de Brio a 1%
Pesar 1,17g de BaCl
2
.2H
2
O e dissolver em gua destilada completando o volume final
para 100ml.
10.8.1.2- Soluo de cido Sulfrico a 1%
Pipetar 1ml de H
2
SO
4
concentrado e adicionar sobre gua destilada completando o
volume final para 100ml. Ver cuidados nesta manipulao no captulo BIOSSEGURANA.
10.8.2- PREPARAO DA ESCALA
Tomar 10 tubos de mesmo tamanho e numerar de 1 a 10.
Adicionar soluo de cloreto de brio a 1% e soluo de cido sulfrico a 1% (V/V) de acordo
com a tabela abaixo.
Fechar os tubos e manter na geladeira. Anotar a preparao na Ficha 5 Controle de Preparao
da Escala McFarland.
Quando o precipitado branco de sulfato de brio bem agitado, cada tubo tem uma densidade
diferente que corresponde aproximadamente s suspenses bacterianas referidas na tabela abaixo.
Tabela 2- Relao entre o grau de turvao indicado pela escala de McFarland e a concentrao bacteriana
NOTA: O tubo 1/2 foi preparado diluindo-se o volume do tubo n 1 metade.
TUBO
BaCl
a 1%
2
H SO
a 1%
2 4
CONCENTRAO BACTERIANA
(em milhes/ml)
1 0,1 9,9 300
2 0,2 9,8 600
3 0,3 9,7 900
4 0,4 9,6 1.200
5 0,5 9,5 1.500
6 0,6 9,4 1.800
7 0,7 9,3 2.100
8 0,8 9,2 2.400
9 0,9 9,1 2.700
10 1,0 9,0 3.000
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10.9- SOLUO DE HCL 2 N
10.9.1- CLCULOS
10.9.2- PREPARAO DA SOLUO DE HCl a 2N (200 ml)
CIDO SOBRE A GUA
Juntar a 166,88ml de H2O destilada 33,12 ml de HCl a 37%.
Anotar a preparao na Ficha 6 Controle da Preparao de HCl a 2N.
PM
=
=
=
36,46
d 1,19
Concentrao
37%
36,46 1 litro soluo Soluo N
Soluo 2N X 1 litro soluo
X = = 72,92 por litro de soluo
36,46 x 2
1
d = m
v
v = m
d
72,92
1,19
v = v = 61,28 ml HCl / 1 litro soluo
61,28 ml Hcl
100%
X 37%
X = 165,62 ml de HCl p/ litro de soluo a 2N
*regra de trs simples e inversa
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10.10- UNIDADES DE MEDIDA ( 1 )
10.11.1- MEDIDAS DE COMPRIMENTO
A unidade padro de comprimento o metro.
1000 metros = 1 quilmetro (1km)
100 metros = 1 hectmetro
10 metros = 1 decmetro
1/10 metro = 1 decmetro
1/100 metro = 1 centmetro (1 cm)
1/1000 metro = 1 milmetro (1 mm)=10
-3

m
Angstron () = 10
10

m
Nanmetro (nm) = 10
9

m
Mcron (m) ou micrmetro = 10
6

m
Polegada (in) = 2,5 cm
10.10.2- MEDIDAS DE PESO
A unidade de peso o grama.
1000 gramas = 1 quilograma (1 kg)
100 gramas = 1 hectograma
10 gramas = 1 decagrama
1/10 grama = 1 decigrama
1/100 grama = 1 centigrama
1/1000 grama = 1 miligrama (1 mg)=10
3

g
dalton = 1,6 x 10
24

g
picograma (pg) = 10
12

g
nanograma (ng) = 10
9

g
micrograma (g) = 10
6

g
gro (gr) = 64,8 mg
ona (oz) = 28,3 g
libra (lb) = 453,6 g
10.10.3- MEDIDAS DE VOLUME
A unidade de capacidade o litro.
1 litro (l) = 1000 mililitro
1 mililitro (ml) = 10
3
1 microlitro (l) = 10
6
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10.11- MATERIAL UTILIZADO NO LABORATRIO
A seguir sero relacionados o material de consumo e os equipamentos necessrios para a realizao
das tcnicas laboratoriais empregadas no laboratrio de micobacteriologia e descritas neste manual.
10.11.1- EQUIPAMENTOS DE PROTEO COLETIVA
autoclave de dupla porta;
autoclave vertical;
cabine de manipulao Bench Top;
centrfuga de rotor angular para tubos de 50ml com suporte fechado com tampa (aerossol
free);
chuveiro de emergncia;
extintores de incndio de gua, CO
2
, p qumico;
lava-olhos;
recipientes de ao inoxidvel com tampa para descarte, transporte e armazenamento temporrio
de material contaminado.
avental de tyvek
;
luva de borracha butlica;
luva de borracha nitrlica;
luva de PVA;
luva de PVC;
luva protegida contra puncturas;
luva de raspa de couro;
luva para manipular objetos em baixas temperaturas;
luva para manipular objetos em altas temperaturas;
luva de vinil;
culos;
respirador semi-facial de silicone;
respirador facial contra poeiras, fumos e nvoas.
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avental de tyvek
;
luva de borracha butlica;
luva de borracha nitrlica;
luva de PVA;
luva de PVC;
luva protegida contra puncturas;
luva de raspa de couro;
luva para manipular objetos em baixas temperaturas;
luva para manipular objetos em altas temperaturas;
luva de vinil;
culos;
respirador semi-facial de silicone;
respirador facial contra poeiras, fumos e nvoas.
10.11.3- OUTROS EQUIPAMENTOS
agitador de tubos, tipo vrtex;
balana analtica;
balana de prato superior;
banho-maria;
bico de Bunsen;
cmara estufa bacteriolgica;
coagulador;
dessecador;
destilador, deionizador;
estufa de secagem;
freezer (-20 e - 70C);
geladeira;
microscpio binocular;
mixer;
placa aquecedora com agitaco magntica;
potencimetro;
termmetros de mxima e de mnima;
termmetro qumico.
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10.11.4- REAGENTES
cido clordrico concentrado PA;
cido ortofosfrico;
cido paranitrobenzico;
cido sulfrico;
gar nutriente;
lcool etlico comercial 95GL/92,5 INPM;
lcool etlico 95% PA;
anilina incolor;
azul de bromotimol;
azul de metileno;
carbonato de sdio;
cicloserina;
citrato de sdio;
citrato frrico amoniacal;
cloreto de sdio;
dextrose;
dihidrocloridrato de N-naftilenodiamina;
dissulfato tripotssico de fenolftalena;
disco de uria;
estreptomicina;
etambutol;
etileno glicol;
etionamida;
fenol em cristais;
fenolftalena;
fita para a prova da niacina;
fosfato dissdico anidro e 12 H
2
O;
fosfato monopotssico anidro;
fosfato monossdico;
fosfato trissdico;
frutose;
fucsina bsica;
glicerol;
hidrazida do cido tiofeno-2-carboxlico;
hidrxido de sdio;
hidroxilamina;
hipoclorito de sdio a 5%;
inositol;
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iodo metalodico cristalizado;
isoniazida;
lauril sulfato de sdio;
manitol;
nitrato de sdio;
ofloxacin;
leo de cedro;
paraformaldedo;
paranitrofenil--D-glicopiranosdeo;
perxido de hidrognio a 30%;
pirazinamida;
piruvato de sdio;
propileno glicol;
rifampicina;
sulfanilamida;
sulfato de amnio;
sulfato de magnsio.7 H
2
O;
tampo TRIS;
telurito de potssio;
tween 80;
vermelho de fenol;
vermelho neutro;
xilol;
zinco em p.
10.11.5- MEIOS DE CULTURA
gar MacConkey sem cristal violeta, em p;
gar nutriente, em p;
caldo 7H-9 de Middlebrook, em p;
enriquecimento ADC;
lowenstein Jensen, em p.
10.11.6- VIDRARIA
balo de fundo chato, de 250 a 2.000ml.
balo volumtrico de 10, 100, 500 e 1000ml.
becker de 50 a 1.000ml.
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erlenmeyer de 250 a 2.000ml;
frasco conta-gotas para corantes de 250ml;
frasco escuro para estocar reagentes de 100 a 1.000ml;
funil de 100 a 500ml;
graal de porcelana com pistilo;
kitasato de 500ml;
lmina de vidro para microscopia;
prolas de vidro;
pipeta sorolgica graduada ao dcimo e ao centsimo de 1,2,5,10ml;
proveta graduada de 100 a 2.000ml;
tubos de ensaio com tampa de rosca 20 x 150mm, 13 x 100mm, 16x150mm.
10.11.7- OUTROS
algodo hidrfobo;
ala de semeadura bacteriolgica (nquel-cromo e descartvel);
aplicador de madeira;
caixa de madeira para guardar lminas;
escova para lavar tubos;
estante de ao para portar tubos 13x100mm, 16x150mm, 20x150mm e tubos de centrfuga
(de 30 e 50ml);
esptula para pesagem de ps;
fita adesiva para controle de autoclavao;
fita para medir pH (faixa de 0 a 7,0);
gaze 8 fios tipo queijo;
membrana filtrante tipo Millipore;
pina anatmica;
potes plsticos para colheita de escarro;
sacos plsticos para autoclavao;
suporte de ao para colocar lminas;
tubo de polipropileno com capacidade para 30 e 50ml, com tampa de rosca autoclavvel.
10.11.8- DESCRIO DETALHADA DOS PRINCIPAIS EQUIPAMENTOS
Para que os equipamentos do laboratrio apresentem a qualidade desejada para o trabalho a
que se destinam necessrio fazer uma descrio completa dos mesmos, alm de certificar-se se:
vm acompanhados dos catlogos descritivos, das garantias, dos certificados da Rede Brasileira
de Calibrao, se os fornecedores instalam. Todos esses critrios devem ser inseridos no seu
pedido de compra antes da aquisio.
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10.11.8.1- Cabine de Segurana Biolgica
Cabine de segurana biolgica classe II B2 fornecida com instalao, com as seguintes
caractersticas:
construda em poliuretano expandido com acabamento em epxi texturizado;
mesa de trabalho tripartida construda em chapa de ao inox 304 de fcil remoo de
limpeza e desinfeco;
motoventilador com motor equipado com proteo trmica;
insuflamento e exausto - filtro HEPA, eficincia 99,99% DOP;
rea de acesso superfcie de trabalho com altura de 200mm, de acordo com a norma
NSF-49;
lmpadas fluorescentes instaladas na parte interna do equipamento;
nvel de rudo abaixo de 67 dB;
exausto externa de 100% de ar filtrado;
janela frontal, tipo basculante, confeccionada em vidro temperado com o mximo de
visibilidade;
sistema de travamento da janela blindex;
plenuns totalmente negativados;
intertravamento entre motoventiladores de insuflamento e exausto.
Painel de controle:
painel eletrnico com acionamento atravs de teclado tipo Push Botton;
alarme visual que se ativar quando o nvel de saturao dos filtros for atingido;
lmpada germicida;
Acessrios opcionais:
tomada auxiliar dupla 110/220, monofsica, 5
A
;
kit para instalao (2 conexes vinlicas, 2 joelhos 90 e 3m de duto PVC);
rea de trabalho 600cm X 1200cm X 600cm aproximadamente
10.11.8.2- Pipetador Automtico
Pipetador automtico, porttil, desenho ergonmico, leve e com as seguintes caractersticas:
funes de enchimento e esvaziamento realizadas atravs de dois botes;
adaptador em silicone para ajuste perfeito de pipetas sorolgicas de 0,1ml at 100ml;
vlvula de reteno combinada ao filtro de membrana para proteo contra penetrao de
lquidos;
com funcionamento livre do cabo e carregador;
autonomia de 8 horas de pipetagem contnua sem recarga;
munido de bateria recarregvel;
com suporte para fixao do pipetador na parede;
com recarregador 110 /220v.
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10.11.8.3- Microscpio Binocular
Microscpio binocular, com inclinao do tubo das oculares a 30, com ajuste de distncia
entre as pupilas de 47-75 mm e rotao de 360, oculares com amplo campo de viso com
aumento de 10x (F. O. V. 20), 15x (F. O. V. 12), de construo em material slido resistente
vibrao, com pintura e tratamento antifungos para uso em ambientes quentes e midos.
Design ergonmico com boto de foco e de movimento do charriot bem prximos em uma
posio baixa, permitindo uso sem torcer os ombros, revlver com 4 objetivas planocromticas
de aumentos - 4x (A.N. 0,10), 10X (A.N. 0,25), 40X (A.N. 0,65), 100 X
(imerso)(A.N.1,25). Sistema de alimentao de 110/220 V, iluminao com lmpada de
halognio de 6V-20W, com sistema de troca de lmpada com remoo da unidade de lente
sem uso de ferramentas de forma fcil e segura, condensador Abbe (A.N. 1,25) com controle
de abertura do diafragma com guia de marcao para cada tipo de objetiva de imerso.
Fornecido com as 2 oculares e as 4 objetivas de imerso.
10.11.8.4- Geladeira Para Laboratrio
Geladeira para laboratrio, medindo: altura-2160 mm x largura-715mm x profundidade-
780 mm. Gabinete externo de ao inoxidvel, gabinete interno de ao inoxidvel, capacidade
500 litros, prateleiras regulveis 05 unidades, iluminao interna fluorescente 15 watts,
temperatura de 2 a 8C. Comando digital microprocessado. Alarme de mxima e mnima.
Alarme de falta de energia. Sistema eltrico de segurana para uso em laboratrio. Porta em
perfil de alumnio anodizado com resistncia interna e vidro com dupla cmara de isolao
trmica. Fechamento autmatico por mola de toro, vedao com borracha magntica.
Degelo automtico, rodzios com freio, 110/220 v.
10.11.8.5- Freezer Para Laboratrio
Freezer para laboratrio, medindo: altura-2160mm x largura-715mm x profundidade-
780 mm. Gabinete externo de ao inoxidvel, gabinete interno de ao inoxidvel, capacidade
500 litros, prateleiras regulveis 05 unidades, iluminao interna fluorescente 15 watts,
temperatura -30 C. Comando digital microprocessado. Alarme de mxima e mnima. Alarme
de falta de energia. Sistema eltrico de segurana para uso em laboratrio. Porta em perfil de
alumnio anodizado com resistncia interna e vidro com dupla cmara de isolao trmica.
Fechamento autmatico por mola de toro, vedao com borracha magntica. Degelo
automtico, rodzios com freio, 110/220v.
10.11.8.6- Centrfuga de Bancada
Centrfuga de bancada, refrigerada com as seguintes caractersticas:
velocidade mxima 5600 rpm;
fora centrfuga de 5060 x g;
temperatura ajustvel entre -5C a temperatura ambiente;
rotor angular com capacidade para 8 tubos de 50ml;
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8 caapas aerossol free;
programa de memria para armazenar at 35 programas;
processo de centrifugao microprocessado;
fornecimento com instalao;
120 /220 v, 60 Hz;
tempo de centrifugao ajustvel entre 1 segundo a 360 minutos.
10.11.8.7- Agitador de Tubos
Agitador de tubos, tipo vrtex, design compacto, com ajuste de velocidade entre 100 e
3000rpm, base em metal resistente, opo de funcionamento contnuo e intermitente;
munido de dois adaptadores de borracha reforada sendo um para agitao de um nico
tubo de ensaio de 20mm de dimetro e outro adaptador para frascos com 10 cm de dimetro,
medindo aproximadamente 15cm de comprimento por 12cm de largura, com mnimo de
rudo e trepidao para trabalhar no interior de capela de segurana biolgica, 120/220v.
10.11.8.8- Autoclave Dupla Porta
Autoclave dupla porta, fornecido com instalao, para esterilizao em geral.
Funcionamento eltrico, a vapor ou duplo funcionamento atravs de:
gerador de vapor eltrico acoplado;
cmara interna em ao inoxidvel AISI 316;
cmara externa, porta ou portas (tipo barreira), flange(s) e gerador de vapor em ao
inoxidvel AISI 304;
totalmente automtico, painel com manmetro, manovacumetro, com opes de
operacionalizao atravs de:
boteiros de fcil manuseio com lmpadas indicativas dos processos;
microprocessado com ou sem impressora, necessitando apenas a programao dos
parmetros dos ciclos desejados;
controle de temperatura digital, conjugado com impressora serial para registro de tempo
e temperatura de esterilizao;
sistema hidrulico em material anti-corrosivo no segmento de alimentao, acoplado com
uma bomba de alto vcuo e uma bomba de gua;
sistemas de segurana acoplados como:
trava de segurana mecnica no eixo central da porta;
pressostato;
carro interno em ao inoxidvel AISI 316 e carro externo facilitando o transporte dos
materiais esterelizados.
dimenses internas (mm): altura 500 x largura 500 x profundidade 1200;
dimenses externas (mm) : altura 1880 x largura 700 x profundidade 1500;
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capacidade: 300 litros;
potncia: 21000w, 220v;
com certificado de calibrao RBC.
10.11.8.9- Bico Bunsen
Bico Bunsen eltrico, em ao inoxidvel, 400W, 115V, temperatura entre 800C a
1000C, com chama piloto, com intensidade e altura da chama regulvel para trabalho no
interior de cabine de segurana biolgica.
10.11.8.10- Estufa de Bancada
Estufa de bancada para incubao de 5 a 50C, com trs termostatos hidrulicos
independentes para controle de segurana com painel de controle digital externo do aparelho
controlado por microprocessador. Equipado com timer para alternar temperatura, 220v.
Medindo aproximadamente: 66cm largura x 83cm de altura x 58 cm de profundidade.
10.11.8.11- Cmara Para Sorocoagulao
Cmara para sorocoagulao (calor mido) - construda em gabinete especial, externamente
com pintura eletrosttica e seu interior totalmente revestido em ao inox AISI 304, com
acabamento escovado. As prateleiras so tambm construdas em ao inox, com inclinao
ajustvel. Suportes independentes para tubos. Temperatura no interior da cmara at 85C,
gerador de umidade com nvel constante. Controladores de temperatura digitais
microprocessados, com sistema PID, independentes da cmara e gerador de vapor, garantindo
temperatura homognea, 220v, 700 w, 50/60 Hertz.
painel frontal superior em policarbonato;
controladores de temperatura digitais microprocessados independentes;
gabinete com interior todo revestido em ao inoxidvel;
prateleiras em inox inclinveis;
suporte independente para tubos;
circulao interna de ar por ventoinha;
gerador de umidade por evaporao direta;
nvel para manter o volume de gua.
10.11.8.12- Sistema de Esterilizao de Ar
Sistema especfico de esterilizao de ar para cmaras de conservao de vacinas, cmaras
frias e estufas, com voltagem de127 e 220V, estrutura interna com espelhos refletores em
ao inoxidvel AISI 304, sanitrio, eletropolido para eliminao segura e imediata de
microorganismos e odores, atravs de energia ultravioleta com faixa de comprimento de
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ondas banda C (253,7nm), lmpada com estrutura fsica em quartzo UV3s, germicida para
desinfeco do ar ambiente (in door), sistema de suco/exausto que direciona o ar esterelizado
em movimento de 360, com controle preciso dos feixes de luz UVC, atravs de
monitoramento microprocessado por radimetro, fabricado de acordo com as normas da
NIOSH (National Institute of Occupational Safeth and Health), para ser instalado em
estufas e geladeiras.
10.12- PREVISO DE MATERIAL PARA COLORAO DE 1.000 LMINAS
UTILIZANDO O MTODO DE ZIEHL-NEELSEN
10.12.1- SUBSTNCIAS
Fucsina bsica .............................................................................................................10g
lcool etlico a 95 ......................................................................................................10l
Azul de metileno .........................................................................................................10g
Fenol aquoso ............................................................................................................110ml
cido clordrico .......................................................................................................300ml
leo de cedro ..........................................................................................................100ml
Xilol ........................................................................................................................200ml
10.12.2- SOLUES
Fucsina bsica .................................................................................................................2l
lcool-cido ..................................................................................................................10l
Azul de metileno ...........................................................................................................2l
10.13- BIBLIOGRAFIA
1- BIER, O. Bacteriologia e Imunologia. So Paulo: Ed. Melhoramentos; 1981.
2- BRASIL/MS/FNS/CENEP/CNPS/CRPHF. Manual de Bacteriologia da Tuberculose.Rio de Janeiro, 1994. 2 ed.
3- BRASIL/SPS/Coordenao Nacional de DST e AIDS/ Coordenao Geral de Sangue e Hemoderivados. Biossegurana em
Unidades hemoterpicas e laboratoriais de Sade Pblica, Braslia.
4- SOMMERS, HM; GOOD, RC. Mycobacterium. In: LENETTE, EH; BALLOWS, A; HANSLER Jr, WR; SHADOMY,
HJ. Manual of Clinical Microbiology. Washington: American Society for Microbiology ;1985, p.216.
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lcool Etlico PA
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RESPONSVEL
OBSERVAES
lcool Etlico PA
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2
FICHA 1- CONTROLE DA PREPARAO DO LCOOL ETLICO A 70%
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PESAGEM / VOLUME
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Hipoclorito de sdio a 5%
Hipoclorito de sdio a 5%
H O destilada
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FICHA 2- CONTROLE DA PREPARAO DA
SOLUO DE HIPOCLORITO DE SDIO A 2%
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
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lcool etlico comercial 95
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H O destilada
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lcool etlico comercial 95
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FICHA 3- CONTROLE DA PREPARAO DO LCOOL IODADO
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
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NA HPO4. 12 H 0
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SUBSTNCIA
KH PO
2 4
NA HPO4. 12 H 0
2 2
SOLUO FINAL
QUANTIDADE H O DESTILADA
2
VOLUME DAS SOLUES pH
FICHA 4- CONTROLE DA PREPARAO DO TAMPO FOSFATO
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PESAGEM / VOLUME
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Cloreto de brio
H SO concentrado
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SUBSTNCIA
Cloreto de brio
H SO concentrado
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Escala 1
QUANTIDADE H O DESTILADA
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VOLUME DAS SOLUES
FICHA 5- CONTROLE DA PREPARAO DA ESCALA DE MacFARLAND
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PESAGEM / VOLUME
RESPONSVEL
OBSERVAES
HCl concentrado
SUBSTNCIA QUANTIDADE VOLUME
HCl concentrado
H O destilada
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FICHA 6- CONTROLE DA PREPARAO DA SOLUO DE HCl A 2N
Captulo 11
REDE NACIONAL DE LABORATRIOS DE SADE
PBLICA PARA VIGILNCIA DA TUBERCULOSE
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11.1-INTRODUO
O Sistema Nacional de Laboratrios de Sade Pblica (SNLSP) foi instituido atravs da Portaria
Ministerial n 280 de 21/07/77 e foi ratificado pela lei Orgnica da Sade n 8.080 de 19/09/90,
artigo 16, que instituiu o Sistema nico de Sade - SUS. Recentemente este sistema foi reestruturado
e constitudo o SISLAB, um conjunto de redes nacionais de laboratrios, organizados em sub-redes
por agravos ou programas, de forma hierarquizada por grau de complexidade das atividades relacionadas
vigilncia epidemiolgica, vigilncia ambiental em sade, vigilncia sanitria e assistncia mdica,
criada pela Portaria n 15 de 3 de janeiro de 2002 e ratificada pela Portaria 2031 de 23 de setembro
2004. Logo a seguir, pelas Portarias n 409 e 410 de 12 de setembro de 2002 o Centro de Referncia
Professor Hlio Fraga foi constitudo laboratrio de referncia nacional para a tuberculose ratificada
pela portaria n 70 de 24 de fevereiro de 2005. A rede da tuberculose ainda ter que definir os
laboratrios de referncia regionais e os centros colaboradores.
11.2 - COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA NACIONAL
Os laboratrios de Referncias Nacional so unidade laboratoriais de excelncia tcnica altamente
especializadas, com as seguintes competncias:
a) assessorar o gestor nacional no acompanhamento, normalizao, padronizao de tcnicas e avaliao
das atividades laboratoriais;
b) coordenar tecnicamente a rede de vigilncia laboratorial sob sua responsabilidade;
c) realizar procedimentos laboratoriais de alta complexidade, para complementao diagnstica e
controle de qualidade analtica de toda a rede;
d) desenvolver estudos, diagnsticos e pesquisas, de forma articulada com as sociedades tcnico-
cientficas sem fins lucrativos e com centros de pesquisa e desenvolvimento, que reunam competncias
e capacitaes tcnicas em reas crticas de interesse;
e) promover capacitao de recursos humanos em reas de interesse ao desenvolvimento da credibilidade
e confiabilidade laboratorial, estimulando parcerias com os laboratrio integrantes do sistemas e com
centros formadores de recursos humanos com competncias especficas de interesse, visando melhoria
da qualidade do diagnstico laboratorial;
f ) disponibilizar, periodicamente, relatrios tcnicos e de gesto, aos gestores nacionais com informaes
relativas s atividades laboratoriais realizadas para os diferentes agravos, obedecendo cronograma
definido;
g) participar de intercmbio e acordos nacionais e internacionais, visando, juntamente com o gestor
nacional, promover a melhoria do Sistema;
11.3 - COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA REGIONAL
Os laboratrios de referncia regionais so unidades laboratoriais capacitadas para desenvolver
atividades mais complexas, organizadas por agravos ou programas que prestam apoio tcnico-operacional
quelas unidades definidas para sua abrangncia, com a competncia de:
a) assessorar, acompanhar as atividades laboratoriais executadas nas unidades;
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b) desenvolver e realizar tcnicas de maior complexidade necessrias ao diagnstico laboratorial de
doenas e outros agravos sade, bem como dar o suporte tcnico aos Laboratrios de Referncia
Estadual, promovendo as condies tcnicas e operacionais na execuo das aes;
c) apoiar as unidades laboratoriais, realizando anlises de maior complexidade, complementao de
diagnstico, controle de qualidade, capacitao de recursos humanos, bem como a superviso e
assessoria tcnicas;
d) avaliar, periodicamente, em conjunto com o Laboratrio de Referncia Nacional o desempenho
dos laboratrios estaduais;
e) implantar e promover os mecanismos para o controle de qualidade inter e intralaboratorial;
f ) encaminhar ao Laboratrio de Referncia Nacional as amostras inconclusivas, bem como aquelas
para a complementao do diagnstico e as outras destinadas ao controle de qualidade analtica;
g) disponibilizar as informaes relativas s atividades laboratoriais, por meio de relatrios peridicos,
obedecendo cronograma definido.
11.4- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA ESTADUAL
Os laboratrios de Referncia Estadual so os Laboratrios Centrais de Sade Pblica - LACEN,
vinculados s Secretarias Estaduais de Sade, com rea geogrfica de abrangncia estadual, e com as
seguintes competncias:
a) coordenar a rede de laboratrios pblicos e privados que realizam anlises de interesse em sade
pblica;
b) encaminhar ao Laboratrio de Referncia Regional amostras inconclusivas para a complementao
de diagnstico e aquelas destinadas ao controle de qualidade analtica;
c) realizar controle de qualidade analtica da rede estadual;
d) realizar procedimentos laboratoriais de maior complexidade para complementao de diagnstico;
e) habilitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos Gestores Nacionais das Redes, os
laboratrios que esto integrados rede estadual, informando ao gestor nacional respectivo;
f ) promover a capacitao de recursos humanos da rede de laboratrios;
g) disponibilizar aos gestores nacionais as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas
por intermdio do encaminhamento de relatrios peridicos, obedecendo cronograma definido.
11.5- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE REFERNCIA MUNICIPAL
So unidades laboratoriais vinculadas s Secretarias Municipais de Sade, com rea geogrfica de
abrangncia municipal e as seguintes competncias:
a) definir, organizar e coordenar a rede municipal de laboratrios;
b) supervisionar e assessorar a rede de laboratrios;
c) promover a capacitao de recursos humanos na rede de laboratrios;
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d) habitar, observada a legislao especfica a ser definida pelos Gestores Nacionais das Redes, os
laboratrios que sero integrados rede municipal, informando ao gestor estadual.
11.6- COMPETNCIAS DO LABORATRIO LOCAL
So unidades laboratoriais que integram a rede estadual ou municipal de laboratrios de sade
pblica, que executam, dentre outras, as seguintes atividades:
a) realizar anlises bsicos e/ou essenciais;
b) encaminhar ao respectivo Laboratrio de Referncia Municipal ou Estadual as amostras
inconclusivas, para complementao de diagnstico e aquelas destinadas ao controle de qualidade
analtica;
c) disponibilizar as informaes relativas s atividades laboratoriais realizadas ao Laboratrio de
Referncia Municipal ou Estadual, por meio do encaminhamento de relatrios peridicos, obedecendo
o cronograma definido.
11.7- COMPETNCIAS DOS CENTROS COLABORADORES
So unidades laboratoriais especializadas e capacitadas em reas especficas que apresentam requisitos
necessrios para desenvolver atividades de maior complexidade, ensino e pesquisa, e tm as seguintes
competncias:
a) assessorar o Gestor Nacional no acompanhamento, normatizao, padronizao de tcnicas e avaliao
das atividades laboratoriais;
b) promover o desenvolvimento cientfico e tecnolgico da rede, bem como a capacitao de recursos
humanos;
c) realizar procedimentos laboratoriais de alta complexidade, com vistas complementao diagnstica
e realizao de controle de qualidade analtico;
d) desenvolver estudos e pesquisas de interesse do Gestor Nacional;
e) disponibilizar ao Gestor Nacional informaes referentes s atividades laboratoriais atravs do
encaminhamento de relatrios peridicos.
11.8- COMPETNCIAS DO LABORATRIO DE FRONTEIRA
So unidades laboratoriais localizadas em regies de fronteiras para viabilizao do diagnstico
laboratorial de agentes etiolgicos, vetores de doenas trasmissveis e outros agravos sade pblica,
bem como a promoo do controle analtico de qualidade sanitria dos servios prestados e de produtos,
e tm como competncia:
a) fortalecer as aes de vigilncias epidemolgica, ambiental em sade e sanitria no que se refere as
aes laboratoriais em reas de fronteiras;
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b) auxiliar nas atividades desenvolvidas pelos Laboratrios de Referncia Estadual;
c) colaborar no cumprimento dos acordos internacionais, nas reas de preveno e controle de doenas,
produtos e servios.
Pargrafo nico. O laboratrio de Fronteira, por se constituir em unidade estratgica para o pas, deve
reportar-se, alm do gestor estadual, diretamente ao gestor nacional da rede especfica.
Na definio dos Laboratrios de Fronteiras, foram considerados os seguintes aspectos:
as estruturas laboratoriais disponveis na regio;
os centros populacionais de maior densidade demogrfica;
reas onde ocorrem os principais deslocamentos de pessoas e trnsito de cargas nacionais e
internacionais.
11.9- REQUISITOS DE ELEGIBILIDADE PARA LABORATRIOS NOS
DIVERSOS NVEIS
O crescente aumento da demanda analtica, em decorrncia da evoluo do processo de
desenvolvimento global da economia, tem exigido respostas rpidas, maior efetividade no controle de
qualidade e implantao de mecanismos que possam promover a modernizao das estruturas
laboratoriais. Os avanos tecnolgicos ocorrem de maneira rpida e, cada vez mais colocam em
disponibilidade o uso de equipamentos de automoo e mtodos rpidos de identificao de agentes
etiolgicos importantes, tornando-se imprescindvel a reformulao de critrios e procedimentos,
visando a melhoria do modelo existente.
Para o acompanhamento do processo de modernizao e reestruturao do setor sade fundamental
a implantao ou implementao dos sistemas de garantia da qualidade analtica nos laboratrios de
sade pblica, com vistas melhoria na prestao de servios e eficincia no desempenho das aes
relativas vigilncia em sade. Para tanto devero ser considerados os seguintes aspectos:
instalaes fsicas;
equipamentos e instrumentos;
recursos humanos capacitados;
sistemas de garantia de qualidade;
materiais e reagentes;
coleta, controle e transporte de amostras;
metodologias utilizadas;
boas prticas de laboratrio;
biossegurana;
informatizao;
emisso de laudos;
rotinas e fluxos.
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11.10- BIBLIOGRAFIA
1- BRASIL. Portaria n 15, de 3 de janeiro de 2002. Dispe sobre a organizao do Sistema Nacional de Laboratrios de Sade
Publica. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 8 de janeiro de 2002, seo 1, p. 59.
2- BRASIL. Portaria n 409, de 12 de setembro de 2002. Organiza as sub-redes de diagnstico e vigilncia laboratorial no Pas
integrantes da Rede Nacional de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 16 de
setembro de 2002, seo 1, p. 38.
3- BRASIL. Portaria n 410, de 12 de setembro de 2002. Divulga relao de rgos/entidades que possuem laboratrios pr-
selecionados para integrar a Rede Nacional de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica. Dirio Oficial da Unio, Braslia,
16 de setembro de 2002, seo 1, p. 39.
4. BRASIL. Portaria n 2031, de 23 de setembro de 2004. Dispe sobre a organizao do Sistema Nacional de Laboratrios
de sade Pblica. Dirio Oficial da Unio, Braslia 24 de setembro de 2004, Seo 1 p. 79.
5. BRASIL. Portaria n 70, de 24 de fevereiro de 2005. Estabelece os critrios e a sistemtica para habilitao de laboratrios
de Referncia Nacional e Regional para as Redes Nacionais de Laboratrios de Vigilncia Epidemiolgica e Ambiental em
Sade. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 24 de fevereiro de 2005. Seo 1, p. 54.

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