Clonagem de DNA

CLONAGEM DE DNA
CLONAGEM: multiplicar assexuadamente.
Na Biologia Molecular, significa mais especificamente crescer uma
colnia de bactrias a partir de uma clula nica.

Clonagem de genes essencialmente o processo de amplificar
seletivamente um gene particular, incorporando-o numa bactria
e clonando a bactria.

Primeiros experimentos bem sucedidos de clonagem foram
mostrados no incio da dcada de 1970.
Avanos conceituais e tecnolgicos que contriburam para a tcnica de
clonagem:

Na dcada de 60: identificao de pequenas molculas de DNA circular
denominadas plasmdeos, que carregam genes de resistncia bacteriana a
antibiticos.
No final da dcada de 60: descoberta e caracterizao de endonucleases
de restrio (Werner Arber, Hamilton Smith, Daniel Nathans; H. Smith e T.
Kelly)
1967: Gellert - purificao da enzima DNA ligase
1972: Janet Mertz e Ronald Davis usaram DNA ligase para juntar
fragmentos digeridos com Eco RI.
1972: o grupo de Paul Berg conseguiu inserir genes do bacteriofago l e
genes de E. coli no genoma do virus SV40, construindo molculas
recombinantes
Por que clonar?
Sequenciamento de DNA
Separar fragmentos de DNA em clones independentes
Estudar a transcrio e a traduo do gene
Fazer estudos de expresso funcional
Sintetizar protenas para produo de anticorpos
Sintetizar protenas para uso teraputico
etc, etc
Para clonar necessrio um VETOR
Um vetor de clonagem uma molcula de DNA que tem 3 caractersticas
fundamentais:

capaz de replicar independentemente do cromossomo da clula hospedeira.
Organismos contendo o vetor devem poder se desenvolver preferencialmente
em um dado meio, porque o vetor confere ao organismo alguma propriedade
fsica ou qumica, ou ambas, que lhe permite este crescimento preferencial.
O vetor aceita a insero de DNA adicional em sua molcula de DNA.
Enzimas de restrio foram primeiramente identificadas pela sua
capacidade de restringir o crescimento de certas viroses em
algumas linhagens de E. Coli. Por isso, foram denominadas
enzimas de restrio.

Essas enzimas fazem parte do mecanismo natural de defesa das
bactrias contra a invaso de DNA estranho.


Enzimas de restrio
Stios de reconhecimento para enzimas de restrio so curtas sequncias
reconhecidas e clivadas por vrias endonucleases
Bactrias com endonucleases de restrio tambm tm as enzimas
correspondentes que metilam as bases especficas no stio de
reconhecimento, assim o seu prprio DNA fica protegido de autodigesto.
OH
P
OH
P
As enzimas de restrio catalizam a quebra da ligao fosfoster
(hidrlise) entre o oxignio na posio 3 de uma base, e o fosfato
ligado ao oxignio na posio 5 da base seguinte.
Enzimas de restrio
Corte com extremidades rombas
blunt ends
Corte com extremidades coesivas stick ends
5 pendente
ou
3 pendente
A enzima se movimenta ao longo da major groove (difuso linear).
Quando a seqncia especfica encontrada, h um notvel rearranjo estrutural, tanto da
enzima quanto do DNA. O DNA sofre uma dobra de cerca de 50
o
no centro do stio de
reconhecimento.
Mg
2+
essencial para a hidrlise e entra no stio cataltico apenas quando a seqncia alvo
encontrada.
Eco RV endonuclease :
5 G - A - T - A - T - C 3
3 C - T - A - T - A - G 5
Fragmentos produzidos pela clivagem dos ~36 kb do DNA genmico de
adenovirus 2 com Eco RI e Hind III
Exemplo de clivagem com enzima de restrio
GAATTC
CTTAAG
AAGCTT
TTCGAA
Algumas endonucleases de restrio e seus stios de reconhecimento
As enzimas so nomeadas com as abreviaes das linhagens de bactrias
das quais foram isoladas
As duas enzimas da tcnica de clonagem de DNA:

- Enzimas de restrio
1962 - Arber - ENZIMAS DE RESTRIO

- DNA ligases
1967 Gellert - DNA LIGASE

Extremidades pendentes menores que 15 nucleotdeos no fornecem
pareamentos estveis na temperatura de 37
o
C. Para que os diferentes
segmentos de DNA permaneam juntos (o plasmdeo e o DNA que se quer
clonar) preciso restabelecer a ligao fosfoester com a LIGASE.
Tipos de vetores usados para clonagem
Os vetores de clonagem pertencem a duas classes gerais:

- Plasmdeos

- Fagos

Clonagem de DNA usando plasmdeos
como vetores
Plasmdeos
Pequenas molculas circulares de DNA dupla fita, no
incorporadas ao genoma das bactria
So formas autoreplicativas de DNA

Todas as enzimas necessrias para a replicao de um
Plasmdeo so produzidas pela bactria hospedeira,
embora protenas codificadas pelo plasmdeo auxiliem na
regulao de sua replicao.
Plasmdeos utilizados para clonagem foram construdos a partir
de fragmentos do plasmdeo pBR-322 de E. coli.
Todos os plasmdeos usados como vetor devem ter:
REPLICATOR ou origem de replicao
Marcador de seletividade
Stio de clonagem
Origem de replicao (replicator, replicon): uma sequncia especfica do plasmdeo, com
cerca de 1.000 pb, na qual tem incio a replicao do DNA. Neste local h um conjunto de
elementos regulatrios envolvidos no controle do nmero de cpias do plasmdeo que sero
feitas numa nica bactria.

No pBR322: replicon pMB1 - h produo de 15 a 20 cpias/clula
No pBlue Script: forma mutada do mesmo replicon h produo de 500 a 700 cpias/clula
MARCADOR DE SELETIVIDADE
O marcador de
seletividade permite a
identificao da
bactria que recebeu o
plasmdeo. No vetor ao
lado, so genes que
codificam protenas que
degradam antibiticos.

Amp: betalactamase
que degrada ampicilina
Seqncia polylinker ou multiple-cloning-site (MCS) que inclui uma cpia
do stio de reconhecimento para cada uma das 10 enzimas indicadas
Plasmdeo UC19
O stio de clonagem consiste de uma seqncia de nucleotdeos que
corresponde a stios de interao com enzimas de restrio, e que
adicionada ao vetor por engenharia gentica.
Para clonar, escolhemos uma enzima que corte em um ou dois destes locais.
STIO DE CLONAGEM
Ligao de fragmentos de restrio com
extremidades coesivas
As ligases usadas no laboratrio:

T4 DNA ligase:
produzida pelo bacteriofago T4
liga tanto extremidades coesivas,
como extremidades cegas.

DNA ligase de E. Coli:
liga apenas extremidades coesivas

Se a ligao no vetor feita aps a digesto com enzimas de restrio que
produzem extremidades cegas (blunt ends), ou se o vetor foi linearizado com
apenas uma endonuclease de restrio, necessrio desfosforilar a
extremidade 5-P do vetor, para evitar auto-ligao.


Enzima: Fosfatases

Removem grupos fosfato da extremidade 5 das moleculas de DNA,
substituindo-os por -OH.
Digesto do vetor para clonagem
Vetor cortado com uma nica enzima que corta no ponto a:
O vetor ficar com as extremidades (a) e (a) que so compatveis. Ao ser adicionada a
ligase, o vetor ser novamente fechado, sem inserto.
Para que isso no ocorra, preciso usar fosfatase, que remove o P da extremidade 5
a b
a b Se duas enzimas distintas forem usadas para
abrir o vetor, as extremidades se tornam
incompatveis. Ele no fechado pela ligase.
O DNA a ser inserido deve ser cortado com as mesmas duas
enzimas, para ter extremidades compatveis com o vetor.
Que tipo de fragmento de DNA podemos inserir em um vetor:

O DNA a ser inserido tem que ser dupla-fita.
Enzimas de restrio s cortam DNA dupla-fita.

O fragmento de DNA pode ser :
cDNAs sintetizados as partir de mRNAs
Produto de digesto de DNA genmico com endonucleases de restrio
Produto de PCR
DNA dupla fita de qualquer origem

Os fragmentos de DNA a
serem clonados so
cortados com as
mesmas enzimas
utilizadas para linearizar
(abrir) o vetor
Aps a obteno do plasmdeo recombinante contendo a sequncia de
interesse, o prximo passo coloc-lo na bactria.
Esse processo denominado transformao.

A transformao um processo ineficiente, porm eficiente o bastante para
nossos propsitos.

Tipicamente, de 10
9
clulas em contato com 1 ug de plasmdeo (~ 10
11

molculas), apenas aprox. 10
5
recebero o plasmdeo (1: 10
6
)

Como a probabilidade de uma clula captar um plasmdeo baixa, a
probabilidade de uma clula captar dois ou mais extremamente baixa.
Insero do plasmdeo em bactrias:

Choque trmico (bactrias tornadas competentes)

Eletroporao (bactrias normais, em meio de baixa fora inica)

Seleo das bactrias transformantes
(marcador de seletividade)
resistncia a antibitico

Seleo das bactrias transformadas com plasmdeos
recombinantes:
alfa complementao do gene da betagalactosidase
(colnias azuis ou brancas)
Transformao das bactrias
Ao transformar as bactrias, cada uma receber um nico plasmdeo.

Cada clone de bactrias ter um nico plasmdeo.
Assim os fragmentos que antes estavam misturados, agora esto individualizados
O fragmento a da betagalactosidase (LacZ)
codificada pelo plasmdeo.

A insero do DNA a ser clonado interrompe
a sequncia do LacZ.
pUC plasmid- genrico
Lac repressor
Represso removida
por IPTG
Fragmento da
betalactamase produzido
pela bactria

-complementao

lacZ inteiro () + :
Betagalactosidase ativa
Cliva X-gal
Colnias azuis

Laz segmentado
Betagalactosidase inativa
Colnias brancas
Genomic
Relaxed
Supercoiled
Purificao do plasmdeo
Quando usar plasmdeos:
So utilizados para clonagem de fragmentos relativamente pequenos (no mximo 20 kb)
So de fcil manuseio
Existem vrios tipos de plasmdeos comercialmente disponveis, cada um com vantagens
e aplicaes especficas:
vetores para sntese de RNA e protenas (vetores de expresso)
vetores com genes reprteres
plasmdeos para produo de protenas de fuso
etc
Vetores plasmdeos para transfeco de clulas eucariotos:

So vetores usados para expressar genes clonados em clulas animais ou vegetais.
Estes vetores possibilitam a expresso de genes tanto em bactrias como em
eucariotos.

- Para replicao em bactrias, carregam um replicon (origem de replicao)
bacteriano e um gene de resistncia a antibitico.

- Para propagao em eucariota, carregam um promotor viral e um enhancer
localizados 5 da regio codificante do gene a ser clonado e um stio de
poliadenilao 3 do gene. Alguns tambm incluem um intron, antes ou depois da
regio codificante.

No primeiro vetor eucariota utilizado, estes elementos foram provenientes do virus
SV40.

Uma vez inserido na clula, a protena codificada no plasmdeo passa a ser expressa aps
algumas horas. Neste estgio, a maioria do DNA do plasmdeo inserido na clula
extracromossomal. Aps vrios dias, algumas molculas de plasmdeo se integram no
genoma de raras clulas.
Vetores de expresso
Vetores de expresso tpicos tm:

Promotores que dirigem a sntese de grande quantidade de mRNA do gene
que se quer expressar
Sequncias que permitam a replicao autnoma em bactria (origem de
replicao)
Seqncias que codificam traos genticos que possibilitam reconhecer as
clulas que contm o vetor
Seqncias que aumentam a eficincia da traduo do RNA

Expresso de protenas recombinantes:

Expresso em E. coli
Vantagem: simplicidade e baixo custo

Expresso em clulas eucariotas
Vantagens: quase sempre as protenas so expressas no
compartimento subcelular correto e corretamente processadas.
Desvantagem: difcil produzir em larga escala (clulas de mamferos, por ex.)
Produo em levedura eficiente
Expresso da protena recombinante em procariotas:

Clonar o cDNA a partir de mRNA processado, pois preciso lembrar que bactrias no
removem introns. Retirar tambm as regies 5UTR e 3UTR.

Adicionar a seqncia Shine Dalgarno (AGGAGG, 5 a 12 bases antes do ATG), para
expresso em procariota. Esta seqncia contribui para localizao da metionina
inicial.

ATG inicial que codifica uma formil-metionina em bactrias, pode eventualmente ser
removida, apenas se o segundo amino cido for um amino cido com cadeia lateral
pequena. Leucina deve ser evitada nesta posio.

STOP codon

A seqncia de Shine-Dalgarno favorece a atividade tima dos ribossomos
Expresso em procariota (E. coli)
Codon usage:

A diferena entre o uso do cdigo (codon usage) pode ser um motivo
para expresso ineficiente em procariotas. Codons que so muito
raramente usados em E. coli correspondem a poucas molculas do tRNA
especfico. Isso torna a sntese de uma protena eucariota muito
ineficiente em E.coli.

Soluo:
Fazer co-expresso dos tRNAs raros
Modificar o codon, para um codon mais comum em E.coli, preservando o
amino cido.
Promotor:
A transcrio do gene alvo em procariotas controlada por dois sistemas bsicos:

tac promoter, reconhecido pela RNA polimerase de E. coli

T7 promoter de bacteriofago, reconhecido pela T7 RNA polimerase (este tem a
vantagem de propiciar uma expresso muito baixa na ausncia de induo).

Inicialmente, o vetor com o cDNA a ser expresso propagado numa bactria que no tem o
gene da T7 RNA polimerase.
O plasmdeo recombinante em seguida purificado e sequenciado.

Em seguida, o plasmdeo j estabelecido transferido para uma linhagem bacteriana que
expresse o gene da T7 RNA polimerase.
Os sistemas indutveis so os mais adequados para expresso em E. coli
porque altos nveis de protena heterloga podem ser letais para a
bactria.

Os vetores ideais para expresso em E. coli devem ter:
- Um promotor indutvel
- O sinal de trmino de transcrio
- Um enhancer opcional
- Um stop codon
- Gene de resistncia a antibitico
- Origem de replicao que determina o nmero de cpias do plasmdeo
na clula.

Sistema de induo em E. coli:

Lac repressor / Anlogo da lactose (IPTG)
Protenas expressas em E. coli frequentemente formam agregados proticos,
denominados corpos de incluso.

Isso no costuma ser problema se o objetivo final produzir protenas para
produo de anticorpos. No entanto, problema se o que se deseja uma anlise
funcional da protena.

Uma possvel soluo expressar a protena como protena de fuso. Protenas de
fuso costumam ser mais estveis que as protenas nativas em E. coli. Alm disso,
mais fcil purificar uma protena de fuso.

As fuses mais comuns so com:
- GST (glutationa S transferase) e
- segmento polihistidnico (tag de histidina)
Vetores para expresso de protenas de fuso
Fuso com Glutationa S-transferase
GST
GST sua protena
Clivagem com trombina
ou fator Xa
Controle do
P
tac

26kd
A protena de
fuso purificada
em coluna
contendo
glutationa.
A protena de fuso, sua protena de
interesse + GST, pode ser facilmente
purificada em coluna contendo
glutationa, o substrato da enzima GST.

GST pode ser separada de sua protena
de interesse por digesto enzimtica. Na
regio entre uma protena e outra h
stio de clivagem para a trombina ou
outra protease.

O sistema muito til para isolar
protenas da clula que interagem com
sua protena de interesse.


Expresso da protena nativa em eucariotos:

Para expresso de protenas em eucariotos, necessrio adicionar
imediatamente antes da regio codificante da protenas:

Seqncia Kozac (-- GCCACC ATG G -), para expresso em eucariota

Alm disso, deve ser adicionado:

ATG inicial

STOP codon

Seqncia de Kozac: a introduo da sequncia de Kozac facilita a
identificao do ATG inicial pelos ribossomas em eucariotas
Expresso em eucariotas
Os vetores para expresso em eucariotos, possuem uma origem de replicao
bacteriana e um gene de resistncia a antibitico para propagao inicial em
bactrias.

Para propagao em eucarioto, carregam um promotor e um enhancer
localizados 5 da regio codificante do gene a ser clonado e um stio de
poliadenilao 3 do gene. Alguns tambm incluem um intron, antes ou depois
da regio codificante.

Os primeiros vetores para expresso em eucarioto tinham um promotor e um
enhancer do virus SV40

Muitos vetores tm um promotor do CMV.
Um plasmdeo para expresso de protena recombinante em
eucarioto:

P
CMV
: enhancer-promoter do Cytomegalovirus, que induz
uma transcrio constitutiva e abundante do gene clonado
sob seu controle em eucariotos.

BGH
pA
: Sinal de poliadenilao do gene Bovine Growth
Hormone (BGH)

f1 ori: Origem de replicao para obter fitas nicas, sense.

SV40 ori: Origem para replicao epissomal em clula
eucariota.

pUC ori: Origem para replicao em bactria

Resistncia a Neomycin ou Zeocin: para seleo de clulas
eucariotas.

Resistncia a Ampicilina: para seleo de bactrias (E. coli)
Transfeco de clulas eucariotas

Mtodos de Transfeco:

Transfeco por mtodos bioqumicos
Precipitao de fosfato de clcio
Lipdeos catinicos

Transfeco por mtodos fsicos
Microinjeo com partculas de ouro ou tungstnio
Eletroporao

Transfeco mediada por infeco viral

Eletroporao
Lipofeco
Microinjeo

Indicado para
clulas vegetais
Transfeco transiente e estvel:
Transiente:
O DNA recombinante introduzido na linhagem celular receptora com o objetivo de
obter uma expresso temporria porm elevada do gene de interesse.
A protena codificada pelo cDNA transfectado detectada na clula aps algumas
horas. Neste estgio, a maioria dos plasmdeos recombinantes extracromossomal,
mas aps vrios dias algumas molculas do vetor se integram no genoma da clula.

Estvel:
Usada para estabelecer linhagens celulares nas quais o gene transfectado est
inserido no DNA cromossomal, onde ele comanda a sntese de quantidades
moderadas da protena alvo.
O isolamento dos raros transformantes estveis de um background de clulas no
infectadas facilitado pelo uso de marcadores genticos para seleo.
(Resistncia a Neomycin, Zeocin, Hygromycin)
Retrovirus: o genoma um RNA fita nica.
convertido em DNA dupla fita dentro da clula infectada.
O DNA dupla fita se integra no cromossomo da clula hospedeira como genoma proviral.
O provirus continua a transcrever seu genoma inteiro, o qual codifica todas as protenas
necessrias para fazer novos virions.

LTR LTR genes virais
gag pol env
LTR tandem long terminal repeats, importantes para mediar a integrao do provirus e
para regular a transcrio.

O retrovirus para expresso de protenas clonadas no tem seus prprios genes preservados
As clulas infectadas no produzem partculas virais
Clulas de empacotamento produzem partculas
virais com RNA viral contendo o gene de interesse
Tcnica de clonagem para estudo de promotores
+1
Vrios segmentos do promotor so inseridos em
vetor com gene reprter
A transcrio do gene reprter ser comandada pelos
diferentes segmentos do promotor em anlise
A protena produzida a partir do mRNA quantificada:
quanto mais eficiente for o segmento do promotor, maior
a quantidade de protena produzida
So removidos promotor/enhancer que
controlam a transcrio do gene da Luciferase.
Obtem-se o vetor abaixo para estudo de
promotores:
No stio de clonagem introduzido o fragmento de
DNA correspondente ao promotor do gene que se
quer estudar.

O vetor recombinante transfectado para clulas
eucariotas que normalmente expressam a protena
de interesse.
Gene que codifica
Luciferase, que a protena
reprter
Medida da atividade de luciferase
Tcnica de clonagem para identificao de protenas que
interagem umas com as outras no interior da clula:

Two-hybrid system
Estes experimentos so realizados em leveduras.
A linhagem de levedura transformada com o plasmdeo recombinante que produz a protena-
isca fusionada com o mdulo protico que interage com o DNA na regio do promotor.
construda uma biblioteca do
tecido no qual se quer procurar
protenas (presa) que interagem
com a protena-isca .

Esta biblioteca construda de
modo que todos os genes so
expressos na forma de protena
de fuso com o mdulo de
transativao do fator de
transcrio, cujo mdulo de
interao com o DNA est ligado
protena isca.

Quando isca e presa interagem o
gene reprter ativado.
Um grande nmero de ORFs
(open reading frames) tm sido
interrompidas com a finalidade de
obter informaes sobre a funo
das protenas que codificam.
Knockout de genes de levedura
Knockout
Camundongo knockout
ZFN mRNA targeted
Deteco das clulas mutadas
Camundongo transgnico