Extrao de Lipdios de Lipomyces starkeyi

rika Reis 1, Eullia Vargas 1, Andria Anschau1, Telma Franco 1

1

Faculdade de Engenharia Qumica Universidade Estadual de Campinas UNICAMP.

Cidade Universitria "Zeferino Vaz" Av. Albert Einstein, 500 - CEP 13083-852. Lab.
Engenharia Bioqumica, Biorrefino e Produtos de Origem Renovvel LEBBPOR. Tel: (55)
19-3521-2053 Campinas - SP Brasil. e mail: erika.mrk0@gmail.com

Resumo: As principais matrias-primas do biodiesel so espcies vegetais

oleaginosas com diferentes nveis de produtividade e adaptao a cada regio do
Brasil. Alm das plantas oleaginosas, leveduras, fungos e microalgas so capazes
de acumular lipdios, desempenhando papel fundamental na substituio de
biodiesel vegetal. Por razes ambientais e econmicas, a obteno de
biocombustveis a partir de biomassa microbiana considerada uma possibilidade
de integrao dessas tecnologias nas plantas industriais atuais. Os leos
microbianos constituem uma alternativa promissora para a produo de biodiesel,
podendo alcanar altos nveis de lipdios no necessitando de terra arvel. Alm
disso, a produo destes microrganismos no necessariamente compete com a
produo de alimentos, visto que resduos de biomassa podem ser utilizados como
fontes de carbono. No presente estudo a concentrao mssica de lipdios de L.
starkeyi pelo mtodo Bligh & Dyer (51,15% 1,48) e o efeito do solvente sobre a
extrao lipdica por Soxhlet de L. starkeyi (hexano 2,36%, clorofrmio: metanol
(44,75%) e etanol (32,76%) e Butt (hexano 26,18%, clorofrmio: metanol (40,81%) e
etanol (30,19%) foram estudados. A eficincia da extrao est relacionada
diretamente com a polaridade do solvente. A composio do leo foi determinada
pela esterificao a steres metlicos e analisados por cromatografia gasosa. O leo
de L. Starkeyi composto basicamente por seis cidos graxos entre 14 e 18
carbonos, com baixo grau de insaturao, caracterstica desejvel para a produo
de biodiesel. A caracterizao do leo foi determinada por mtodos tericos e
experimentais. A determinao de acilgliceris por cromatografia lquida de alta
perfomance por excluso de tamanho do leo observou-se que o hexano e
clorofrmio: metanol obtiveram maior concentrao de triacilglicerdios que o etanol.
As transesterificaoes in situ alcalinas foi analisada por cromatografia gasosa
acoplada a espectrmetro de massas obtendo um rendimento reacional de 88%.
Palavras chave: lipdios, levedura, extrao
Agradecimentos: CNPq, Capes e Shell.
1. INTRODUO
A diminuio na oferta mundial de petrleo e a instabilidade das grandes regies
exportadoras provocaram o aumento do preo dos combustveis fsseis e seus
derivados. Alm disso, grandes quantidades de CO2 so emitidas pela combusto
dos mesmos. Por razes ambientais e econmicas, a obteno de biocombustveis
a partir de biomassa considerada uma possibilidade de integrar essas tecnologias
nas plantas industriais existentes (Stamenkovi, Velikovi et al., 2011).
Os leos de microrganismos constituem uma alternativa promissora para a
produo de biodiesel, pois dependendo da cepa microbiana, altos nveis de lipdios
podem ser alcanados os quais no necessitam de terra arvel. Alm disso, a
produo destes microrganismos no necessariamente compete com a produo de
1

alimentos, visto que resduos de biomassa podem ser utilizados como fontes de
carbono (Vicente, Bautista et al., 2009).
Em microrganismos, o acmulo e a composio de lipdios so influenciados pela
constituio gentica e por fatores como condies de cultura (temperatura, pH,
tempo, etc) e composio do meio. (Meng, Yang et al., 2009). leos microbianos
podem ter grande potencial na produo de biodiesel devido composio de
cidos graxos. Bactrias, leveduras, fungos e algas capazes de acumular mais de
20% de lipdios (peso seco) so classificados como oleaginosos (Karatay e Dnmez,
2011). Os lipdios so um grupo de substncias biolgicas, compostos
principalmente de substncias no polares (triglicerdeos, diglicerdeos,
monoglicerdeos e esteris) e compostos mais polares (cidos graxos livres,
fosfolipdios e esfingolipdios) que se ligam covalentemente aos carboidratos e
protenas para formar glicolipdios e lipoprotenas, respectivamente (Manirakiza,
Covaci et al., 2001)(Halim, Danquah et al., 2012). A anlise da composio de cidos
graxos por mtodos cromatogrficos constitui o primeiro passo para a avaliao da
qualidade do leo bruto e/ou seus produtos de transformao. (Costa Neto, Rossi et al.,
2000).
O biodiesel obtido pelo processo qumico chamado transesterificao, onde os
leos so combinados com lcool e quimicamente alterados para formar steres de
cidos graxos, como ster metlico. Quimicamente, so constitudos por steres
alquilas e no por alcanos e hidrocarbonetos aromticos como os derivados de
diesel (Singh e Singh, 2010). Os catalisadores so normalmente usados para
melhorar a taxa de reao e rendimento. Excesso de lcool usado para deslocar o
equilbrio para o produto devido natureza reversvel da reao (Ma e Hanna,
1999). Para esta finalidade so usados alcois primrios e secundrios alifticos
tendo 1-8 tomos de carbono (Singh e Singh, 2010).
A transesterificao in situ de leos foi investigada por Harrington e Catherine
1985 (1985) que compara o processo convencional e o in situ por catlise cida para
o leo de semente de girassol foram maceradas obtendo-se resultados superiores a
40% na transesterificao in situ e 30% na transesterificao convencional. SilerMarinkovic e Tomasevic, 1998 (1998) estudaram diversas condies de reao in
situ de sementes de girassol como razo molar de lcool e leo, catalisador, tempo,
temperatura e rendimento. A composio dos steres da reao in situ foi mesma
da transesterificao convencional mostrando que os produtos so adequados como
substitutos ao diesel. A transesterificao in situ difere da reao convencional, pois
a extrao do lipdeo e a transesterificao ocorrem simultaneamente. O lcool age
como solvente de extrao e como reagente de esterificao. Esta rota elimina
custos associados extrao simplificando os passos na produo de steres
(Hincapi, Mondragn et al., 2011). O objetivo geral do presente trabalho a
extrao de lipdios de Lipomyces starkeyi caracterizando o leo por mtodos
tericos e experimentais e a transesterificao in situ.
2. MATERIAIS E MTODOS
Neste trabalho, foi utilizada a biomassa da levedura Lipomyces starkeyi DSM
70296 obtida aps 143 h de fermentao. Aps a lavagem com gua destilada, a
biomassa foi centrifugada e congelada a -80C e seca por liofilizao Os lipdios da
biomassa liofilizada foram extrados por Bligh & Dyer (1959), seguidos se anlise da
2

composio do leo, extrao dos mesmos (soxhlet e butt) e transesterificao in

situ. A qualidade desses steres obtidos foi caracterizada por cromatografia gasosa.
2.2 Extraes de Lipdios
2.2.1 Extrator Soxhlet
Amostras de aproximadamente 11 g de biomassa liofilizada foram adicionadas ao
cartucho de celulose. A extrao foi feita por 8 horas, em aparelho Soxhlet com 200
mL de solvente (clorofrmio: metanol (2:1), etanol e hexano). Aps a extrao, o
solvente foi evaporado sob presso reduzida e a frao lipdica foi seca a peso
constante em estufa. Essa metodologia baseada em Doca, Vigas et al., (2011).
Os procedimentos desse mtodo foram feitos em duplicata. A polaridade dos
solventes foram definidas por Snyder et al., 1997.
2.2.2 Extrator Butt
A extrao foi feita por 6 horas, em extrator Butt com 200 mL de solvente usando
14g biomassa liofilizada conforme procedimento anterior para extrao Soxhlet.
2.3 Composio Qumica do leo
O protocolo de transesterificao foi adaptado de Lewis, Nichols et al., (2000). As
amostras de biomassa liofilizada foram transesterificadas adicionando-se 6 mL da
mistura metanol/cido clordrico/clorofrmio (10:1:1, v/v) e levando a banho
termostatizado a 90C por uma hora. A amostra foi mantida a -20C at injeo no
cromatgrafo. A identificao dos steres metlicos foi feita mediante comparao do
tempo de reteno com padres previamente injetados (Supelco 37 FAME mix).
A anlise de cidos graxos foi feita utilizando-se cromatgrafo a gs GC2014 com detector de FID (Shimatzu), coluna capilar, Stabilwax, 30m, ID 0,25
milmetros, 0,25m, utilizando-se hlio (15 psi, split 1/100), como fase mvel, com
temperaturas no injetor e detector 250 C e 300 C. A programao da rampa de
temperatura a seguinte; temperatura inicial de 50 C por 2 min, gradiente de 10 C/
min a 180 C com tempo de espera de 5 min, gradiente de 5C/min at temperatura
final de 240 C.
2.4 Clculo da massa molar do leo
A massa molar mdia dos cidos graxos constituintes do leo de levedura
(MMMLv) foi calculada pela composio fornecida por cromatografia gasosa (CG)
comparando-se sua constituio com dados obtidos da literatura. As massas
molares dos cidos graxos utilizados no clculo de MMMLv foram obtidas do NIST
Webbook (NIST, 2011). Halvorsen et al., (1993) estimaram a densidade de lquidos
e misturas de triacilgliceris de leo (Equao 1). A massa molar de leo vegetal ou
triacilglicerol pode ser estimada e estendida para outras propriedades (Halvorsen,
Mammel et al., 1993; Rodenbush, Hsieh et al., 1999; Morad, Kamal et al., 2000)
MMo= 3 xi MMi + 38

(1)

Onde: MMo a massa molar do leo ou triacilglicerol;

xi a frao molar do componente i do cido graxo constituinte no perfil
cromatogrfico;
MMi a massa molar do componente i do cido graxo constituinte no perfil
cromatogrfico.
3

A composio do leo analisado por CG permitiu a contribuio de cada grupo de

cido graxo da estrutura do leo atravs dos teores encontrados nos steres. Essa
determinao importante para analisar as relaes estequiomtricas dos
componentes envolvidos na reao.
2.5 Transesterificao in situ
As reaes de transesterificao de leo in situ por catlise bsica foram feitas
usando razo molar etanol e leo 600:1 e 2% de catalisador bsico (NaOH) diludo
em lcool a uma temperatura de 70C em aparato composto de um tanque
cilndrico com fundo plano em ao inox 316 com e jaqueta trmica para controle de
temperatura. (Georgogianni, Kontominas et al., 2008; Velasquez-Orta, Lee et al.,
2012) O sistema de agitao consistiu em um agitador mecnico Q-251D da marca
IKA Labortechnik (Alemanha). Aps o trmino da reao de transesterificao a
mistura reacional foi centrifugada a 2000 rpm para separao da biomassa e
posteriormente deixada em repouso (em funil de separao) para separao das
fases. A mistura de steres foi purificada posteriormente por adio de hexano e a
neutralizao do catalisador e feita com 0,1 mL de cido actico e posteriormente
lavada com gua destilada ajustando o pH a 7,0. A frao enriquecida de steres foi
seca com sulfato de sdio anidro e analisada qualitativamente por cromatografia em
camada delgada (CCD) e quantitativamente por cromatgrafo a gs GC- QP2010
PLUS com detector de Massas (Shimatzu).
2.6 Anlises e caracterizaes
As caracterizaes dos mtodos analticos de lipdios microbianos foram feitas
seguindo mtodos padres, quando possvel. No entanto, devido quantidade
limitada de biomassa microbiana, alguns procedimentos de anlise foram
adaptados. A quantidade de triacilglicerdios, diacilglicerdios e monoacilglicerdios
foram quantificadas para cada solvente de extrao. O processo preparativo foi
validado pelo uso da cromatografia lquida de alta performance por excluso de
tamanho (HPSEC) em cromatgrafo lquido Perkin Elmer Series 200 com detector
de ndice de refrao Waters 2414 colunas: 1- Jorgi gel DVB 300x 7,8 mm, 500 ;
2- Jorgi Gel DVB 300x 7,8, 100 . A fasel mvel utilizada foi tetrahidrofurano (THF),
Fluxo de 1mL/min e volume injetado de 20 L. A amostra preparada em 1,0% em
tetrahidrofurano.
2.6.1 Umidade
O contedo de gua existente nos leos foi determinada baseando-se no mtodo
de Karl Fischer (Titulador Potenciomtrico Metrohm 831). A determinao foi feita
em duplicata. Essa metodologia baseada na AOCS Ca 2e-84 conforme Silva,
(2005).
2.6.2 ndice de Acidez
ndice de acidez definido como a quantidade de hidrxido de potssio (KOH),
em mg, necessria para neutralizar os cidos livres de 1 grama da amostra de leo.
Essa metodologia adaptada da AOCS Cd 3d-63 e Silva, (2005) esse procedimento
foi feito em triplicata.
2.6.3 ndice de Iodo
O ndice de iodo foi calculado com base na composio do leo obtido por CG
segundo o mtodo oficial da AOCS Cd 1c-85.
4

2.6.4 ndice de Saponificao Calculado

O ndice de saponificao foi calculado a partir da composio em cidos graxos,
em funo da definio, que corresponde massa de KOH necessria para
saponificar um grama de leo ou gordura. O ndice de saponificao calculado
atravs da AOCS, 1998, mtodo Cd 3a-94.
2.6.5 ndice de Saponificao Experimental
O ndice de saponificao definido como a massa (mg) de KOH requerida para
saponificar um grama de leo ou gordura. Essa metodologia adaptada da AOCS
Cd 3d-25 e Moretto &Fett, (1989) esse procedimento foi feito em duplicata.
3. RESULTADOS E DISCUSSO
3.1 Obteno da Biomassa e Determinao de Lipdios
O total de biomassa obtida da fermentao de Lipomyces starkeyi DSM 70296
foi de 335,46 gramas com a concentrao mssica de lipdios determinada por
Bligh & Dyer de 51, 15 1,48.
3.2 Extrao de Lipdios
3.2. 1 Extrao Soxhlet e Butt
A extrao lipdica foi feita em duplicata para a fermentao testando-se
principalmente o solvente de extrao (Tabela 1).
Tabela 1. Efeito do solvente sobre a extrao lipdica por Soxhlet de L. starkeyi
Solventes
Polaridade
Soxhlet
Butt
(Snyder et
Lipdios
Lipdios
al., 1997)
(%)
(%)
Hexano
0,1
2,36
26,18
Clorofrmio: Metanol (2:1)
4,43
44,75
40,81
Etanol
4,3
32,76
30,19
Os solventes empregados na extrao apresentaram diferena na eficincia de
extrao seguindo a ordem decrescente de polaridade: clorofrmio:metanol > etanol
> hexano. Estudos de extrao por Soxhlet para trs espcies de microalgas
demonstraram o efeito da polaridade do solvente sobre o rendimento de lipdios. Os
solventes polares (clorofrmio:metanol (2:1), etanol e acetona) extraram maior teor
de lipdios em relao aos solventes no polares (hexano). Solventes polares como
etanol e clorofrmio:metanol (2:1) apresentaram maior variabilidade em relao teor
de lipdios em relao outras matrizes de solventes (Mcnichol, Macdougall et al.,
2012).
No mtodo Soxhlet, a amostra esteve sempre em contato com o solvente,
havendo constante renovao do mesmo. A temperatura do sistema manteve-se
relativamente alta, possibilitando a extrao de maior quantidade de leo em relao
a outros mtodos, sem a necessidade de filtrao da micela aps o trmino da
extrao, uma vez que a amostra esteve envolta em cartucho durante todo o
procedimento (De Castro e Garcia-Ayuso, 1998). O mtodo de Bligh & Dyer (1959),
na verso simplificada de extrao usando clorofrmio:metanol proposto por Folch,
et al., (1957), um mtodo rpido para extrao e purificao dos lipdios totais. A
vantagem apresentada pelos mtodos baseados na mistura clorofrmio:metanol a
capacidade de extrao de lipdios neutros e lipdios polares.
Os mtodos de extrao influenciam significantemente no resultado final de
extrao dos lipdios. Como os lipdios apresentam grande faixa de hidrofobicidade,
praticamente invivel a utilizao de um nico solvente na extrao dos mesmos.
5

Os lipdios neutros esto ligados covalentemente e podem ser extrados dos tecidos
por solventes apolares. Lipdios polares, os quais esto ligados por foras
eletrostticas e pontes de hidrognio, requerem solventes polares capazes de
quebrar tais ligaes e liber-los (Brum, De Arruda et al., 2009). A diferena entre os
mtodos de extrao Soxhlet e Butt e apenas na percolao do solvente, o extrator
Butt, o solvente aquecido e evaporado diretamente pela cmara de extrao,
condensando, gotejando-se sobre a parte superior do cartucho de celulose assim
lixiviando a frao lipdica dissolvida no balo (Brum, 2004). A vantagem desse
mtodo a fcil recuperao dos lipdios (Mehlenbacher, 1958).
Na extrao por Butt possvel observar uma melhor eficincia de extrao
quando o solvente de menor polaridade (hexano) empregado. O efeito de
solvatao foi aumentado eficientemente para esse solvente com a mudana no
mecanismo de extrao (cmara de extrao). Para os outros solventes, o resultado
no foi to significativo, pois no houve uma grande variao da porcentagem de
lipdios em relao extrao por Soxhlet.
3.3. Caracterizao do leo de L. starkeyi DSM 70296
3.3.1 Composio do leo
Para a determinao da composio do leo, os cidos graxos foram
esterificados a steres metlicos e analisados por CG. O perfil lipdico do leo de L.
starkeyi e outros microorganismos foram relatados por diversas pesquisas (Liu e
Zhao, 2007; Angerbauer, Siebenhofer et al., 2008; Meng, Yang et al., 2009; Wild,
Patil et al., 2010). O perfil cromatogrfico apresentou similariadade com leo de
palma (Tabela 2).
Tabela 2. Composio percentual dos cidos graxos da L. starkeyi.
C14:0
C16:0
C16:1
C18:0
C18:1
C18:2
Nesse estudo
0,390,02 35,090,2 2,820,095 9,800,15 48,140,5 3,700,3
(Garzn, 2009)
Literatura

0,83

20,38

n.d.

10,77

56,06

11,96

Perfil dos lipdeos do leo de palma (%, massa)

C14:0
C16:0
C16:1
C18:0
C18:1

C18:2

(Crabbe, NolascoHipolito et al.,

2001)

1,2

47,9

n.d.

4,8

37,0

9,1

(Liu e Zhao, 2007)

0,4

33,0

0,1

4,7

55,1

1,6

*n.d. no detectado

Os seis cidos graxos indentificados no leo de L. starkeyi DSM 70296 so

composto basicamente por 14 e 18 carbonos, com baixo grau de insaturao,
caracterstica desejvel para a produo de biodiesel.
3.3.2 Determinao de Triacilglicerdios, Diacilglicerdios e Monoacilglicerdios
no leo de levedura por Cromatografia Lquida de Alta Perfomance por
excluso de tamanho
Os triacilglicerdeos so a fonte de armazenamento principal de energia em
clulas eucariticas. Os lipdios neutros so armazenados em gotas lipdicas, que
so cobertas por uma camada de fosfolipdio com algumas protenas incorporadas.
As leveduras apresentam vrias desvantagens para a extrao de lipdios, incluindo
6

a espessura da parede celular que resiste a muitos solventes e a possvel presena

de lipases em extratos celulares. A maioria dos lipdios neutros intracelularmente
armazenada em gotas lipdicas, que tambm contm outros compostos, em
particular compostos aromticos, que so difceis de remover durante a purificao
de lipdios. Devido a estas e outras dificuldades, a extrao do lipdio apresentou
baixo rendimento (Ageitos, Vallejo et al., 2011). A Tabela 3 apresenta a composio
de acilgliceris da L. starkeyi.
Tabela 3. Composio percentual dos acilgliceris da L. starkeyi.
Solventes
Triacilglicerdios Diacilglicerdios Monoacilglicerdios
(%)
(%)
(%)
Hexano
64,14
20,64
15,20
Clorofrmio:
60,71
20,14
19,13
Metanol
(2:1)
Etanol
35,93
18,66
45,39
Como relatado anteriormente por Brum, De Arruda et al., (2009) e Manirakiza,
Covaci et al., (2001) os lipdios neutros esto ligados covalentemente e podem ser
extrados dos tecidos por solventes apolares (triglicerdeos, diglicerdeos,
monoglicerdeos e esteris) os lipdios polares (cidos graxos livres, fosfolipdios e
esfingolipdios), os quais esto ligados por foras eletrostticas e pontes de
hidrognio, requerem solventes polares capazes de quebrar tais ligaes e liberlos. Baseado nessas condies, observou-se que a capacidade de extrao dos
solventes hexano e clorofrmio:metanol (2:1) obtiveram maiores percentagens de
triacilglicerdios em relao ao etanol.
Os acilgliceris so desejveis para produo do biodiesel principalmente para
transesterificaes alcalinas (Chisti, 2007). Os acilgliceris geralmente apresentam
menor grau de insaturao do que outras fraes lipdicas (lipdios polares),
produzindo steres com maior estabilidade de oxidao (Halim, Danquah et al.,
2012).
3.3.3 Anlises de caracterizao do leo de L. starkeyi
O leo foi caracterizado por mtodos tericos e experimentais (Tabela 4). Os
mtodos calculados foram determinados a partir da composio do leo como ndice
de iodo, ndice de saponificao e massa molar, enquanto que os mtodos
experimentais usados foram ndice de acidez, umidade e saponificao.
O ndice de iodo calculado pela composio mdia dos cidos graxos do leo L.
starkeyi DSM 70296 indica o grau de insaturao do leo. Pela norma EN 14214, o
nmero mximo permitido de 120 g I2/100 g (Ramos, Fernandez et al., 2009), ao
passo que a norma brasileira no especifica a quantidade permitida. O leo de L.
Starkeyi, por possuir ndice de iodo baixo, satisfaz uma importante caracterstica
requerida para ser usado como biocombustvel. O nmero de insaturaes no tem
efeito apenas nos valores de densidade e viscosidade do biodiesel, mas tambm na
estabilidade oxidativa (Lobo, Costa Ferreira et al., 2009). A autooxidao ocorre
devido presena de ligaes duplas nas cadeias de muitos compostos graxos. A
oxidao de compostos graxos insaturados prossegue com taxas diferentes,
dependendo do nmero e posio das ligaes duplas. As posies allicas das
ligaes duplas so especialmente suscetveis oxidao. Isto essencial porque a
maioria dos combustveis de biodiesel apresentam quantidades significativas de
steres de cidos oleico, linoleico ou linolnico, influenciando na estabilidade
7

oxidativa dos combustveis (Knothe, 2005). As espcies formadas durante o

processo de oxidao faz com que o combustvel possa eventualmente deteriorar-se
(Knothe, 2009).
Tabela 4. Caracterizao do leo L. Starkeyi.
Mtodos Experimentais
leo Solvente de
ndice de
cidez
ndice de
Extrao
Acidez
em % olico
Saponificao
Hexano
0,1208 0,0360
0,060769 0,0181
170,84
CHCl3: Metanol
2,3436 0,5176
1,178846 0,2603
171,11
(2:1)
Etanol
3,5639 1,3979
1,792646 0,7031
163,14
*Refinado mximo de 0,3 g de cido olico/100g *Bruto mximo de 5 ,0 g de cido olico/100g

ndide de Iodo

Mtodos Calculados
leo de Palma
57 g I2/100 g (Ramos,
Fernandez et al., 2009)

L. starkeyi
51, 58 g I2/100 g

ndice de Saponificao

*190 209

196,39

Massa Molar

847,3 g/mol (Crabbe, NolascoHipolito et al., 2001)

855,13 g/ mol

*Valores de Referncia: RDC N 482, de 23/09/1999, da Agncia Nacional da Vigilncia Sanitria

ANVISA.

Para o clculo da massa molar do leo residual (triacilgliceris) apresentada na

Tabela 6. Em termos gerais, o primeiro termo da Equao 1 corresponde mdia
ponderada do peso molecular de todos os componentes dos cidos graxos com
base no seus pesos moleculares e nas fraes molares individuais e multiplica-se
por 3 para representar as trs cadeias de cidos graxos idnticos. Adicionalmente,
tambm necessrio considerar o glicerol, que composto por trs tomos de
carbono e cinco tomos de hidrognio (CH2-CH-CH2), bem como a diferena de trs
tomos de hidrognio entre os cidos graxos e as cadeias de cidos graxos (Su, Liu
et al., 2011).
O ndice de saponificao calculado necessita-se da frao molar de cada
componente do leo de L. Starkeyi. A umidade presente nesses leos foi inferior a
1%. Isso j era esperado, pois a biomassa passou pelo processo de liofilizao
retirando-se todo o resduo de gua presente na amostra. Um requisito para
eficincia da reao de transesterificao por catlise bsica que os materiais e
reagentes estejam secos, uma vez que a presena de gua no meio causa a
formao de sabo com a consequente perda da alcalinidade do catalisador. Alm
disso, alto teor de umidade resulta em menor solubilidade do leo na fase alcolica,
com consequente queda no rendimento dos steres etlicos (Silva, 2005). O ndice
de acidez adequado para realizar as transesterificaes bsicas de 3mg KOH/gleo.
Elevado ndice de acidez pode neutralizar o catalisador bsico e gerar produtos
indesejveis como os sabes (Ei-Mashad, Zhang et al., 2008) Os resultados obtidos
do ndice de acidez so satisfatrios podendo-se fazer a reao de
transesterificao.

3.4 Transesterificaao in situ

A composio qualitativa da transesterificao in situ via catlise bsica foi
determinada por CG/MS (Figura 1).

Padro

A.1

A. 2

(a)
(b)
Figura 1. (a) Cromatograma das amostras (A.1 e A.2) (b) Placa CCD revelada com
vapores de iodo.
Os cidos graxos de maior concentrao determinados na composio do leo
foram identificados nos cromatogramas de steres etlicos com os picos majoritrios
(hexadecanoato de etila, 9- hexadecanoato de etila, octadecanoato de etila, oleato
de etila) comprovando a similaridade dos resultados. A reao de transesterificao
in situ obteve um rendimento de 88%. Pela anlise em CCD possvel observar
uma separao bem evidenciada com o clculo do fator de reteno (Rf) de 0,57
para o padro (heptadecanoato de metila). As amostras (A.1 e A.2) observado um
perfil bem prximo ao padro aplicado na placa cromatogrfica comprovando o
andamento da reao para a produo de steres etlicos.
4. CONCLUSO
A concentrao mssica de lipdios de L. starkeyi depende do efeito do solvente
sobre a extrao lipdica (Soxhlet e Butt) determinando que a eficincia da extrao
est relacionada diretamente com a polaridade do solvente como determinado pela
composio de acilgliceris. A eficincia do hexano foi aumentada para extrao
Butt, pois obteve maior efeito de solvatao. O leo de L. Starkeyi composto
basicamente por seis cidos graxos entre 14 e 18 carbonos, com baixo grau de
insaturao, caracterstica desejvel para a produo de biodiesel. As
transesterificaes in situ alcalinas necessitam de maior otimizao mas mostram-se
vivel a transesterificaes in situ para a levedura em estudo.
5. REFERNCIAS
AGEITOS, J. M. et al. Oily yeasts as oleaginous cell factories.
Applied Microbiology and Biotechnology, v. 90, n. 4, p. 12191227, May 2011. ISSN 0175-7598.
AOCS AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY) Official Methods
and
Recommended
Practices
of
the
American
Oil
Chemists`Society [recurso eletrnico CD ROM]. Methods for
biodiesel feedstock quality, Urbana, IL:AOCS Press, c 2007

AOCS (AMERICAN OIL CHEMISTS SOCIETY). Official methods

and recommended Practices of the AOCS. 5 . ed. Champaign,
1998.
ANVISA (Agncia Nacional da Vigilncia Sanitria). RDC N 482,
de
23/09/1999.
Disponvel
em:
<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/482_99.htm>. Acessado em:
16/03/2012.

ANGERBAUER, C. et al. Conversion of sewage sludge into lipids

by Lipomyces starkeyi for biodiesel production. Bioresource
Technology, v. 99, n. 8, p. 3051-3056, 2008. ISSN 0960-8524.
BLIGH, E. G.; DYER, W. J. A rapid method of total lipid extraction
and purification. Canadian Journal of Biochemistry and
Physiology, v. 37, n. 8, p. 911-917, 1959. ISSN 0576-5544.
BRUM, A. A. S.; DE ARRUDA, L. F.; REGITANO-D'ARCE, M. A. B.
Extraction methods and quality of the lipid fraction of vegetable and
animal samples. Mtodos de extrao e qualidade da frao
lipdica de matrias-primas de origem vegetal e animal, v. 32,
n. 4, p. 849-854, 2009. ISSN 01004042 (ISSN).
BRUM, A. A. S.; Mtodos de Extrao e Qualidade da frao
Lipdica. Dissertao (Mestrado em Cincias). Escolar Superior de
Agricultura Luiz de Queiroz-ESALQ. Universidade de So Paulo.
Piracicaba, 2004.
CHISTI, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances,
v. 25, n. 3, p. 294-306, 2007. ISSN 0734-9750.
COSTA NETO, P. R. et al. The utilization of used frying oil for the
production of biodiesel. Produo de biocombustvel alternativo
ao leo diesel atravs da transesterificao de leo de soja
usado em frituras, v. 23, n. 4, p. 531-537, 2000. ISSN 01004042
(ISSN).
CRABBE, E. et al. Biodiesel production from crude palm oil and
evaluation of butanol extraction and fuel properties. Process
Biochemistry, v. 37, n. 1, p. 65-71, 2001. ISSN 0032-9592.
DOCA, M. G. M. et al. Production of FAMEs from several
microalgal lipidic extracts and direct transesterification of the
Chlorella pyrenoidosa. Biomass and Bioenergy, v. 35, n. 4, p.
1533-1538, 2011. ISSN 09619534.
DE CASTRO, M. D. L.; GARCIA-AYUSO, L. E. Soxhlet extraction
of solid materials: an outdated technique with a promising
innovative future. Analytica Chimica Acta, v. 369, n. 1-2, p. 1-10,
Aug 10 1998. ISSN 0003-2670.
EI-MASHAD, H. M.; ZHANG, R.; AVENA-BUSTILLOS, R. J. A twostep process for biodiesel production from salmon oil. Biosystems
Engineering, v. 99, n. 2, p. 220-227, Feb 2008. ISSN 1537-5110.
FOLCH, J.; LEES, M.; STANLEY, G. H. S. A Simple Method for the
Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues.
Journal of Biological Chemistry, v. 226, n. 1, p. 497-509, 1957.
ISSN 0021-9258.
GARZN, C. S. L. Produo microbiana de lipdeos. 2009.
(Master). Department of Chemical Processes, State University of
Campinas, Campinas.
GEORGOGIANNI, K. G.
et al. Conventional and in situ
transesterification of sunflower seed oil for the production of
biodiesel. Fuel Processing Technology, v. 89, n. 5, p. 503-509,
2008. ISSN 03783820.
HALIM, R.; DANQUAH, M. K.; WEBLEY, P. A. Extraction of oil
from microalgae for biodiesel production: A review. Biotechnol
Adv, Jan 11 2012. ISSN 1873-1899 (Electronic)
0734-9750 (Linking).
HALVORSEN, J. D.; MAMMEL, W. C.; CLEMENTS, L. D. DensityEstimation for Fatty-Acids and Vegetable-Oils Based on Their
Fatty-Acid Composition. Journal of the American Oil Chemists
Society, v. 70, n. 9, p. 875-880, Sep 1993. ISSN 0003-021X.
HARRINGTON, K. J.; D'ARCY-EVANS, C. A comparison of
conventional and in situ methods of transesterification of seed oil
from a series of sunflower cultivars. Journal of the American Oil
Chemists Society, v. 62, n. 6, p. 1009-1013, 1985. ISSN
0003021X (ISSN).
HINCAPI, G.; MONDRAGN, F.; LPEZ, D. Conventional and in
situ transesterification of castor seed oil for biodiesel production.
Fuel, v. 90, n. 4, p. 1618-1623, 2011. ISSN 00162361.
KARATAY, S. E.; DNMEZ, G. Microbial oil production from
thermophile cyanobacteria for biodiesel production. Applied
Energy, v. 88, n. 11, p. 3632-3635, 2011. ISSN 03062619.
KNOTHE, G. Dependence of biodiesel fuel properties on the
structure of fatty acid alkyl esters. Fuel Processing Technology,
v. 86, n. 10, p. 1059-1070, Jun 25 2005. ISSN 0378-3820.
______. Improving biodiesel fuel properties by modifying fatty ester
composition. Energy & Environmental Science, v. 2, n. 7, p. 759766, 2009. ISSN 1754-5692.
LEUNG, D. Y. C.; WU, X.; LEUNG, M. K. H. A review on biodiesel
production using catalyzed transesterification. Applied Energy, v.
87, n. 4, p. 1083-1095, 2010. ISSN 0306-2619.
LEWIS, T.; NICHOLS, P. D.; MCMEEKIN, T. A. Evaluation of
extraction methods for recovery of fatty acids from lipid producing

microheterotrophs. Journal of Microbiological Methods, v. 43, n.

2, p. 107-116, Dec 2000. ISSN 0167-7012.
LIU, B.; ZHAO, Z. Biodiesel production by direct methanolysis of
oleaginous microbial biomass. Journal of Chemical Technology
and Biotechnology, v. 82, n. 8, p. 775-780, Aug 2007. ISSN 02682575.
LOBO, I. P.; COSTA FERREIRA, S. L.; DA CRUZ, R. S. Biodiesel:
quality parameters and analytical methods. Quimica Nova, v. 32,
n. 6, p. 1596-1608, 2009 2009. ISSN 0100-4042.
MA, F. R.; HANNA, M. A. Biodiesel production: a review.
Bioresource Technology, v. 70, n. 1, p. 1-15, 1999. ISSN 09608524.
MANIRAKIZA, P.; COVACI, A.; SCHEPENS, P. Comparative study
on total lipid determination using Soxhlet, Roese-Gottlieb, Bligh &
Dyer, and modified Bligh & Dyer extraction methods. Journal of
Food Composition and Analysis, v. 14, n. 1, p. 93-100, 2001.
ISSN 0889-1575.
MCNICHOL, J. et al. Suitability of Soxhlet Extraction to Quantify
Microalgal Fatty Acids as Determined by Comparison with In Situ
Transesterification. Lipids, v. 47, n. 2, p. 195-207, Feb 2012. ISSN
0024-4201.
MEHLENBACHER, V. C. Standard methods in the fat and oil
industry. Progress in the Chemistry of Fats and other Lipids, v.
5, n. 0, p. 1-29, 1958. ISSN 0079-6832.
MENG, X.
et al. Biodiesel production from oleaginous
microorganisms. Renewable Energy, v. 34, n. 1, p. 1-5, 2009.
ISSN 09601481.
MORETTO, E.; FETT, R. leos e gorduras vegetais.
Processamento e anlises. 2 ed. Florianpolis: Editora da UFSC,
1989
MORAD, N. A. et al. Liquid specific heat capacity estimation for
fatty acids, triacylglycerols, and vegetable oils based on their fatty
acid composition. Journal of the American Oil Chemists
Society, v. 77, n. 9, p. 1001-1005, Sep 2000. ISSN 0003-021X.
NIST, National Institute of Standards and Technology. NIST
Webbook,
2008.
Disponvel
em:
<http://webbook.nist.gov/chemistry/>. Acessado em: 17/10/2011.
RAMOS, M. J. et al. Influence of fatty acid composition of raw
materials on biodiesel properties. Bioresour Technol, v. 100, n. 1,
p. 261-8, Jan 2009. ISSN 1873-2976 (Electronic)
0960-8524 (Linking).
RODENBUSH, C. M.; HSIEH, F. H.; VISWANATH, D. S. Density
and viscosity of vegetable oils. Journal of the American Oil
Chemists Society, v. 76, n. 12, p. 1415-1419, Dec 1999. ISSN
0003-021X.
SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. 1997. Pratical
HPLC Method Development. 2 ed. John Wiley & Sons;, 722-723.
SILER-MARINKOVIC, S.; TOMASEVIC, A. Transesterification of
sunflower oil in situ. Fuel, v. 77, n. 12, p. 1389-1391, Oct 1998.
ISSN 0016-2361.
SINGH, S. P.; SINGH, D. Biodiesel production through the use of
different sources and characterization of oils and their esters as the
substitute of diesel: A review. Renewable and Sustainable
Energy Reviews, v. 14, n. 1, p. 200-216, 2010. ISSN 13640321.
SILVA, C. L M da. Obteno de steres etlicos a partir da
trasesterificao do leo de andiroba com etanol. Dissertao
(Mestrado em Qumica Inorgnica) Departamento de Qumica
Inorgnica, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2005
STAMENKOVI, O. S.; VELIKOVI, A. V.; VELJKOVI, V. B.
The production of biodiesel from vegetable oils by ethanolysis:
Current state and perspectives. Fuel, v. 90, n. 11, p. 3141-3155,
2011. ISSN 00162361.
SU, Y.-C.
et al. Selection of Prediction Methods for
Thermophysical Properties for Process Modeling and Product
Design of Biodiesel Manufacturing. Industrial & Engineering
Chemistry Research, v. 50, n. 11, p. 6809-6836, 2011. ISSN
0888-5885
1520-5045.
VELASQUEZ-ORTA, S. B.; LEE, J. G. M.; HARVEY, A. Alkaline in
situ transesterification of Chlorella vulgaris. Fuel, v. 94, n. 1, p.
544-550, Apr 2012. ISSN 0016-2361.
VICENTE, G. et al. Biodiesel production from biomass of an
oleaginous fungus. Biochemical Engineering Journal, v. 48, n. 1,
p. 22-27, 2009. ISSN 1369-703X.
WILD, R. et al. Lipids from Lipomyces starkeyi. Food Technology
and Biotechnology, v. 48, n. 3, p. 329-335, 2010. ISSN 13309862.

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Dados dos autores

rika Marques Reis- Possui graduao em Qumica pela Universidade Federal do Amazonas (2009).
Estudante de mestrado em Engenharia Qumica na Universidade Estadual de Campinas. Atualmente
trabalha no laboratrio de Engenharia bioqumica, biorrefino e produtos de origem renovvelLEBBPOR com a orientao da professora Telma Teixeira Franco, onde desenvolve seu projeto de
mestrado TRANSESTERIFICAO IN SITU VIA ETANLISE DO LEO DE LEVEDURA PARA
PRODUO DE BIODIESEL.
Eulalia Vargas Tapia - Possui graduao em Engenharia de alimentos pela Universidad Peruana
Union (2007). Mestranda em Engenharia Qumica pela Universidade Estadual de Campinas. (20102012). Tem experincia na rea de Biotecnologia, Cincia e Tecnologia de Alimentos, atuando
principalmente nos seguintes temas: Melhora gentica de microrganismos para produo de leos
microbianos
.Andria Anschau Possui graduao em Engenharia de Alimentos pela Universidade Federal do
Rio Grande (2008), mestrado em Engenharia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas
(2010). Atualmente doutoranda em Engenharia Qumica pela Universidade Estadual de Campinas.
Possui experincia nos seguintes temas: purificao de bioprodutos, sntese enzimtica, processos
fermentativos, produo microbiana de lipdeos.
Telma Teixeira Franco- Possui graduao em Farmcia Bioqumica pela Universidade de So Paulo
(1980), mestrado em Cincia de Alimentos pela Faculdade de Cincias Farmacuticas da USP,
(1987) e doutorado em Engenharia Bioqumica - University of Reading, Inglaterra (1992).
Responsvel pelo Laboratrio de Engenharia bioqumica, biorrefinaria e produtos de origem
renovvel (LEBBPOR) da Faculdade de Engenharia Qumica da Universidade Estadual de Campinas,
UNICAMP, aonde professora Titular, MS6. Tem experincia na rea Bioprocessos, atuando
principalmente nos seguintes temas: Biorrefinaria, utilizao de biomassa para obteno de
molculas com aplicao industrial, caracterizao e aplicao de quitosana e outros biopolmeros,
tecnologia enzimtica, processos fermentativos e biocatlise, fotobiorreatores, filmes inteligentes
entre outros. Colabora com indstrias qumicas e de energia na rea de utilizao de recursos
renovveis. Presidente da Sociedade Iberoamericana de Quitina. Atualmente revisora de diferentes
peridicos indexados tai como: Biopr. Engin.; Microb. Biotechnol.; Biores. Techn, Biochem.
Eng.J. .Chromat.; .Chem.Techn.Biotech.; Qumica Nova.

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