Gotardo Ma DR Araiq

UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
INSTITUTO DE QUMICA
CAMPUS DE ARARAQUARA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
Desenvolvimento de mtodos para anlise de

medicamentos utilizando reflectncia difusa e
espectrofotometria
MARA ANDRIA GOTARDO
Tese de Doutorado
2006
MARA ANDRIA GOTARDO
Desenvolvimento de mtodos para anlise de

medicamentos utilizando reflectncia difusa e
espectrofotometria
Tese apresentada ao Instituto de Qumica,

Universidade Estadual Paulista, como parte
dos requisitos para obteno do ttulo de
Doutor em Qumica.
Orientadora: Prof Dr Helena Redigolo Pezza
ARARAQUARA
2006
DADOS CURRICULARES
1. Formao Acadmica
1.1. Graduao
Farmcia - Bioqumica
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto - USP
Perodo: 1995 a 1999
1.2. Ps-Graduao
Mestrado em Cincias Farmacuticas
Faculdade de Cincias Farmacuticas - UNESP - Araraquara
Perodo: 2000 a 2002
Doutorado em Qumica
Instituto de Qumica - UNESP - Araraquara
Perodo: 2003 a 2006
2. Artigos Publicados
2.1. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Migration of diethylhexyl phthalate from PVC
bags into intravenous cyclosporine solutions. J. Pharm. Biomed. Anal., v. 38, n. 4, p.
709-713, July 2005.
2.2. GOTARDO, M. A.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of

hydrochlorothiazide in pharmaceutical formulations by diffuse reflectance
spectroscopy, Eclet. Qum., v. 30, n. 2, p. 17-24, 2005.
2.3. CIAPINA, E. G.; SANTINI, A. O.; LOS WEINERT, P.; GOTARDO, M. A.; PEZZA,
H. R.; PEZZA, L. Spectrophotometric determination of diclofenac in pharmaceutical
preparations assisted by microwave oven, Eclet. Qum., v. 30, n. 1, p. 29-36, 2005.
2.4. GOTARDO, M. A.; GIGANTE, A. C.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of

furosemide in pharmaceutical formulations by diffuse reflectance spectroscopy.
Talanta, v. 64, n. 2, p. 361-365, Oct. 2004.
2.5. GIGANTE, A. C.; GOTARDO, M. A.; TOGNOLLI, J. O.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R.
Spectrophotometric determination of formaldehyde with chromotropic acid in
phosphoric acid medium assisted by microwave oven. Microchem. J., v. 77, n. 1, p.
47-51, May 2004.
2.6. QUEIROZ, R. H. C.; PEREIRA, R. C.; GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.;

MELCHIOR. E. Determination of clofazimine in leprosy patients by high-performance
liquid chromatography. J. Anal. Toxicol., v. 27, n. 6, p. 377-380, Sept. 2003.
2.7. GOTARDO, M. A.; TOGNOLLI, J. O.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Determination of

propranolol in pharmaceutical formulations by combined spot test-diffuse reflectance
spectroscopy, 2006 (submetido).
3. Trabalhos apresentados em Congresso

3.1. GOTARDO, M. A.; DORETTO, K. M.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Determinao
de metoclopramida em medicamentos utilizando a combinao espectroscopia de
reflectncia difusa spot test. In: REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA
DE QUMICA, 29., 2006, guas de Lindia. p. 101.
3.2. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Migration of DEHP from PVC bags

containing large parenteral solutions with cyclosporine. In: COLACRO:
CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE CROMATOGRAFIA E TCNICAS AFINS,
10., 2004, Campos do Jordo., v. 1, p. 140.
3.3. GOTARDO, M. A.; L. PEZZA; H.; R. PEZZA. Spot test quantitativo para a
determinao de furosemida em formulaes farmacuticas. In: REUNIO ANUAL
DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUMICA, 27.; CONGRESSO LATINO
AMERICANO DE QUMICA, 26., 2004, Salvador, p. QA239.
3.4. RIBEIRO, P. R. S.; GOTARDO, M. A.; L. PEZZA; H.R. PEZZA. Spot test
quantitativo para a determinao de metildopa em formulaes farmacuticas por
espectroscopia de reflectncia difusa. In: REUNIO ANUAL DA SOCIEDADE
BRASILEIRA DE QUMICA, 27.; CONGRESSO LATINO AMERICANO DE
QUMICA, 26., 2004, Salvador, p. QA238.
3.5. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. PVC bags containing large parenteral

solutions with cyclosporine: should DEHP migrate? In: CONGRESS OF
PHARMACEUTICAL SCIENCES, 4., 2003, Ribeiro Preto. Revista Brasileira de
Cincias Farmacuticas, v. 39, p. 123, 2003.
3.6. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Uso da cromatografia gasosa de alta

resoluo na determinao de DEHP. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE QUMICA,
42., 2002, Rio de Janeiro. p. 171.
3.7 GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Plasticizers identification in plastic bag used
to large-volume parenteral solution (LVPS) by high-resolution gas chromatography.
In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 3rd, 2001, guas de Lindia.
European Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 13, p. S49, 2001.
3.8. GOTARDO, M. A.; SANTIAGO-SILVA, M.; MONTEIRO, M. PVC plastic bag for
large-volume parenteral solution (LPVS): is DEHP present? In: PHARMATECH, 6th.,
ANNUAL MEETING OF THE SBTF, 3rd, 2001, Recife. Proceedings. Recife: [s.n.],
2001, p.221-222.
3.9. GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.; DREOSSI, S. A. C.; QUEIROZ, R. H. C.

A rapid, specific and sensitive HPLC analysis of clofazimine in human plasma
samples. In: CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE CROMATOGRAFIA E
TCNICAS AFINS, 7., 1998, guas de So Pedro. Livro de Resumos. So Carlos:
Acta Eventos, 1998. p.175-175.
3.10. GOTARDO, M. A.; QUEIROZ, R. H. C. HPLC analysis of clofazimine in plasma.

In: CONGRESS OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 1st, 1997, Ribeiro Preto.
Bolletino Chimico Farmaceutico Rivista di Scienze Farmaceutiche e Biologiche.
Milano: Societ Editoriale Farmaceutica, v. 136, n. 2, p. 50, 1997.
DEDICATRIA
Aos meus pais Joo e Dirce,

por todo amor e essencial apoio para a minha vida.
Aos meus irmos Miriam e Joo Roberto,

por quem tenho muito carinho e admirao.
Ao Henrique,
que surgiu na minha vida para torn-la mais alegre
e iluminada, pelo apoio, carinho e amor.
AGRADECIMENTOS
A CAPES pela bolsa de Doutorado.
Prof Helena Redigolo Pezza pela orientao, confiana e preocupao em ajudar,

sempre com muita energia e perseverana.
Ao Prof. Leonardo Pezza pela confiana, apoio e amizade.
Ao Prof. Joo Olmpio Tognolli pela colaborao na parte estatstica deste trabalho.
Prof Dr Adriana Vitorino Rossi (Unicamp Campinas) pela ateno e auxlio na

parte de montagem e uso do sistema porttil.
Aos membros da banca examinadora pela ateno e importante colaborao na

apreciao crtica deste trabalho.
Ao Prof. Massao Ionashiro pelos valiosos ensinamentos, incentivo e sincera

amizade.
Aos amigos do Grupo Fritz Feigl: Alberto (Fritz), Paulo, Elaine, Luciana, Keity,
Liliane, Patrcia, Z Luiz, Fernanda, Sahra, Suelen, Joel, Marco, Fabrcia, Tuane e
Thiago.
Aos amigos do Grupo Latig: Adriano, Cludio, Elias, Emanuel, Gilbert e Marcelo.
Aos funcionrios da biblioteca, seo de ps-graduao e do Departamento de

Qumica Analtica pela ateno e gentileza com que sempre me atenderam.
RESUMO
Este trabalho prope mtodos por espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot
test para determinao de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em
formulaes farmacuticas e tambm um mtodo espectrofotomtrico no visvel para
determinao de metildopa em formulaes farmacuticas. Os mtodos reflectomtricos
foram baseados em reaes em papel de filtro, utilizando p-dimetilaminocinamaldedo
(PDAC)
como
reagente
cromognico
para
furosemida
hidroclorotiazida;
2,6-
dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) para propranolol e p-cloranil para atenolol. Estas reaes

produziram compostos coloridos com mximo de AR (log 1/R) em 585 nm para furosemida e
hidroclorotiazida; 500 nm para propranolol e 550 nm para atenolol. Planejamentos
experimentais foram empregados no desenvolvimento de todos os mtodos e, as condies
otimizadas para as respectivas reaes de spot test foram: 10 L de soluo de furosemida
em acetona, 20 L de HCl 6,3% (m/v) em metanol e 20 L de PDAC 0,4% (m/v)
em metanol, nesta ordem, com aquecimento a 80C por 5 minutos; 20 L de soluo de
hidroclorotiazida em acetona, 20 L de HCl 10% (m/v) em metanol e; 20 L de PDAC 0,4%
(m/v) em metanol, nesta ordem, com aquecimento a 80C por 8 minutos; 30 L de soluo de
propranolol em etanol 35% (v/v) e 30 L de soluo de DCQ 70 mg/mL em acetona e; 20 L
de soluo de atenolol em metanol e 20 L de p-cloranil 8,00 10-2 mol L-1 em dioxano. As
curvas analticas foram lineares nas faixas de concentrao de 7,56 10-3 6,05 10-2 mol L-1
(r=0,9987) para furosemida, 3,36 10-2 1,01 10-1 mol L-1 (r=0,9979) para
hidroclorotiazida, 1,35 10-2 8,45 10-2 mol L-1 (r=0.9991) para propranolol e 1,13 10-2
7,88 10-2 mol L-1 (r=0,9992) para atenolol. O mtodo espectrofotomtrico para a
determinao de metildopa em formulaes farmacuticas utilizou p-cloranil como reagente
cromognico e H2O2 como acelerador da reao. Planejamentos experimentais foram
realizados e a condio tima para a reao foi obtida com a adio de 770 L de p-cloranil e
85 L de H2O2 4,55 mol L-1 para um volume final de 5,00 mL, em meio de metanol. A lei de
Beer foi obedecida na faixa de concentrao de 4,20 10-4 a 2,48 10-3 mol L-1, com r =
0.9993. Tal mtodo foi adaptado, com sucesso, a um dispositivo porttil baseado em medidas
fotomtricas. Todos os mtodos desenvolvidos neste trabalho foram aplicados na anlise de
diversas marcas comerciais de formulaes farmacuticas e, comparados estatisticamente com
mtodos descritos nas farmacopias. Os resultados, para todos os mtodos, foram
concordantes com relao preciso e exatido, demonstrando a possibilidade de se utilizar
mtodos alternativos, vantajosos e confiveis para a determinao de furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulaes farmacuticas.
Palavras-chave: espectroscopia de reflectncia difusa; spot test; espectrofotometria;

furosemida; hidroclorotiazida; propranolol; atenolol; metildopa.
10
ABSTRACT
This work proposes methods by diffuse reflectance spectroscopy using spot tests for
the determination of furosemide, hydrochlorothiazide, propranolol and atenolol in
pharmaceutical formulations and also a visible spectrophotometric method for the
determination of methyldopa in pharmaceutical formulations. The reflectometric methods
were based on spot test reactions on filter paper, using p-dimetylaminocinnamaldehyde (pDAC) as chromogenic reagent for furosemide and hydrochlorothiazide, 2,6-dichloroquinone4-chloroimide (DCQ) for propranolol and, p-chloranil for atenolol. These reactions produced
colored compounds with maximum AR (log 1/R) at 585 nm for furosemida and
hydrochlorothiazide; 500 nm for propranolol and 550 nm for atenolol. Experimental designs
were employed in the development of all methods and, the conditions optimized for the
respective spot test reactions were: 10 L of furosemide solution in acetone, 20 L of HCl
6.3% (w/v) in methanol and 20 L of PDAC 0.4% (w/v) in methanol, in this order,
with heating at 80C for 5 minutes; 20 L of hydrochlorotiazide solution in acetone, 20 L of
HCl 10% (w/v) in methanol and 20 L of p-DAC 0.4% (w/v) in methanol, in this order, with
heating at 80C for 8 minutes; 30 L of propranolol solution in ethanol 35% (v/v) and 30 L
of DCQ solution at 70 mg/mL in acetone and, 20 L of atenolol solution in methanol and 20
L of p-cloranil at 8.00 10-2 mol L-1 in dioxane. The analytical curves were linear in the
concentration ranges of 7.56 10-3 6.05 10-2 mol L-1 (r=0.9987) for furosemide, 3.36 10-2
1.01 10-1 mol L-1 (r=0.9979) for hydrochlorothiazide, 1.35 10-2 8.45 10-2 mol L-1
(r=0.9991) for propranolol and (r=0.9992) for atenolol. The spectrophotometric method for
the determination of methyldopa in pharmaceutical formulations used p-chloranil as
chromogenic reagent and H2O2 as accelerator of the reaction. Experimental designs were
carried out and the optimal condition for the reaction was obtained with the addition of 770
11
L of p-chloranil and 85 L of H2O2 at 4.55 mol L-1 for a final volume of 5.00 mL, in
methanol medium. Beers law was obeyed in a concentration range from 4.20 10-4 to 2.48
10-3 mol L-1, with r = 0.9993. Such method was successfully adapted to a portable device
based on photometric measurements. All methods developed in this work were applied for
analysis of some commercial brands of pharmaceuticals and statistically compared with
methods described in the pharmacopeias. The results for all methods were in agreement in
relation to precision and accuracy, demonstrating the possibility of using alternative,
advantageous and reliable methods for the determination of furosemida, hydrochlorothiazide,
propranolol, atenolol and methyldopa in pharmaceutical formulations.
Keywords:
diffuse
reflectance
spectroscopy;
spot
test;
furosemida; hydrochlorothiazide; propranolol; atenolol; methyldopa.
spectrophotometry;
12
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1. Estrutura qumica da furosemida
24
Figura 2. Estrutura qumica da hidroclorotiazida
25
Figura 3. Estrutura qumica do propranolol
27
Figura 4. Estrutura qumica do atenolol
28
Figura 5. Estrutura qumica da metildopa
29
Figura 6. Vista superior do acessrio de reflectncia Labsphere modelo RSAHP-53
67
Figura 7. Espectros de reflectncia obtidos a partir do produto da reao de

spot test entre butenamida e p-dimetilaminocinamaldedo, em meio
cido. As anlises foram realizadas utilizando um acessrio de
reflectncia Labsphere, modelo DRA-CA-3300. Concentrao de
butemanida = 1,37 10-3 mol L-1. Figura 7a. Espectro de
reflectncia obtido a partir dos valores de %R. Figura 7b. Espectro
de reflectncia obtido a partir dos valores de log(1 / R ) . Figura 7c.
Espectro de reflectncia obtido a partir dos valores de f (R )
69
Figura 8. Distribuio das publicaes de mtodos por espectroscopia de

reflectncia difusa na regio do visvel para anlises quantitativas.
Perodo: 1960-2006
71
Figura 9. Suporte utilizado na realizao dos spot tests (Baseado em:

TUBINO et al., 1997)
78
Figura 10. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

furosemida e PDAC, em meio cido, aps aquecimento a 80C
por 5 min. O comprimento de onda mximo foi 585 nm. Soluo
padro de furosemida: 3,78 10-2 mol L-1
83
Figura 11. Grficos tridimensionais obtidos para estabelecer condies timas

de tempo e temperatura de aquecimento (A) e de volumes de
PDAC e de cido adicionados (B)
88

furosemida e PDAC, em meio cido, aps aquecimento a 80C
por 5 min. O comprimento de onda mximo foi 585 nm. Soluo
padro de furosemida: 3,78 10-2 mol L-1
89
Figura 13. Curva analtica para a determinao de furosemida. Coeficiente de

correlao linear (r) = 0,9987. Valores de AR foram obtidos em
585 nm. Faixa de concentrao das solues padro de furosemida:
7,56 10-3 a 6,05 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios
padro para 3 repeties
90
13

hidroclorotiazida e PDAC, em meio cido, aps aquecimento a
80C por 8 min. O comprimento de onda mximo foi 585 nm.
Soluo padro de hidroclorotiazida: 4,20 102 mol L-1
94
Figura 15. Grfico de Pareto do planejamento fatorial fracionrio para a

reao entre hidroclorotiazida e PDAC, sobre papel de filtro
97
Figura 16. Grfico tridimensional obtido no estabelecimento das melhores

condies de tempo e temperatura de aquecimento para a reao
entre hidroclorotiazida e PDAC sobre papel de filtro
99
Figura 17. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre

hidroclorotiazida e PDAC, em meio cido, sobre papel de filtro.
As anlises dos spot tests foram realizadas a cada 5 minutos at
40 minutos. Soluo padro de hidroclorotiazida: 1,01 10-1
mol L-1
100
Figura 18. Curva analtica para a determinao de hidroclorotiazida.

Coeficiente de correlao linear (r) = 0,9979. Valores de AR
foram obtidos em 585 nm. Concentraes das solues padro
de hidroclorotiazida: 3,36 10-2 a 1,01 10-1 mol L-1. As barras
representam os desvios padro para 3 repeties
101

propranolol e DCQ. Os spot tests foram analisados 10 min. aps
a adio das solues sobre o papel de filtro. O comprimento de
onda mximo foi em 500 nm. Soluo padro de propranolol:
8,45 102 mol L-1
106
Figura 20. Grfico de Pareto do planejamento fatorial completo para a reao

entre propranolol e DCQ, sobre papel de filtro
119
Figura 21. Superfcie de resposta obtida no planejamento composto central

para valores de AR em funo da concentrao de DCQ e mistura
etanol-gua (%, v/v) como solvente para propranolol
112
Figura 22. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre

propranolol e DCQ. As anlises dos spot tests foram realizadas a
cada 2 minutos at 60 minutos. Soluo padro de propranolol:
8,45 10-2 mol L-1
113
Figura 23. Curva analtica para determinao de propranolol. Coeficiente de

500 nm. Concentraes das solues padro de propranolol: 1,35
10-2 a 8,45 10-2 mol L-1. As barras representam o desvio padro
para 3 repeties
114

atenolol e p-cloranil. O comprimento de onda mximo foi em 550
nm. Soluo padro de atenolol: 7,88 102 mol L-1
120
14
Figura 25. Efeito da concentrao de p-cloranil na resposta (AR). As barras

representam os desvios padro para 3 repeties
121
Figura 26. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre atenolol e

p-cloranil. As anlises dos spot tests foram realizadas no tempo
zero, aps 1 minuto e a cada 2 min. at 40 min. Soluo padro de
atenolol: 7,88 10-2 mol L-1
122
Figura 27. Curva analtica para a determinao de atenolol. Coeficiente de

550 nm. Concentraes das solues padro de atenolol: 1,13
10-2 a 7,88 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios
123
Figura 28. Espectro de absoro do produto da reao entre metildopa e pcloranil. O comprimento de onda analtico foi 535 nm.
Concentrao final de metildopa = 1,07 103 mol L-1; caminho
ptico: 1,0 cm
135
Figura 29. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre metildopa

e p-cloranil. As medidas de absorbncia foram realizadas a cada 2
minutos at 60 minutos. Concentrao final de metildopa: 7,14
104 mol L-1
135
Figura 30. Superfcie de resposta obtida a partir dos valores de absorbncia

em funo do volume adicionado de p-cloranil e volume de H2O2
138
Figura 31. Curva analtica para a determinao espectrofotomtrica de

metildopa. Valores de absorbncia foram obtidos em 535 nm.
Coeficiente de correlao linear (r) = 0,9993. As barras
representam o desvio padro para 3 repeties
139
Figura 32. Dispositivo porttil de medidas fotomtricas: (a) Montagem do

sistema para medidas fotomtricas. (b) Esquema da cela de
Teflon (Fonte: CRIVELENTE, 2003)
143
Figura 33. Curva analtica para a determinao de metildopa por medidas

fotomtricas utilizando dispositivo porttil. Coeficiente de
correlao linear (r) = 0,9986. As barras representam o desvio
144
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Mtodos por espectrofotometria no visvel descritos na literatura para a
determinao de furosemida emedicamentos
33
Tabela 2. Mtodos analticos por CLAE descritos na literatura para a determinao
de furosemida associada ou no a outros frmacos em comprimidos
36
Tabela 3. Mtodos por espectrofotometria UV derivativa descritos na literatura para a
determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas
combinadas
40
Tabela 4. Mtodos analticos por CLAE descritos na literatura para a determinao
de hidroclorotiazida associada ou no a outros frmacos em comprimidos
42
Tabela 5. Comparao entre alguns mtodos espectrofotomtricos e seus reagentes
cromognicos descritos na literatura para a determinao de propranolol
em formulaes farmacuticas
46
Tabela 6. Mtodos espectrofotomtricos no visvel descritos na literatura para a
determinao de metildopa em formulaes farmacuticas
54
Tabela 7. Nmero de marcas comerciais de formulaes farmacuticas analisadas em
cada mtodo desenvolvido e contedo declarado de frmaco por
comprimido
77
Tabela 8. Quantidades adicionadas de frmaco padro dadas em mg e em
concentrao (mol L-1)
81
Tabela 9. Combinaes das variveis estudadas e resultados dos planejamentos 22
com ponto central
87
Tabela 10. Resultados de recuperao de furosemida padro adicionada em amostras
de trs formulaes farmacuticas comerciais diferentes
91
Tabela 11. Determinao de furosemida em formulaes farmacuticas comerciais
92
Tabela 12. Matriz do planejamento fatorial fracionrio
96
Tabela 13. Matriz do planejamento fatorial completo com ponto central
98
Tabela 14. Resultados de recuperao de hidroclorotiazida padro adicionada em trs

formulaes farmacuticas comerciais diferentes
102
Tabela 15. Determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas
comerciais
103
Tabela 16. Matriz e resultados do planejamento fatorial completo
108
Tabela 17. Matriz e resultados obtidos no planejamento composto central
111
16
Tabela 18. Resultados de recuperao de propranolol adicionado em formulaes

farmacuticas
116
Tabela 19. Determinao de propranolol em formulaes farmacuticas comerciais
117
Tabela 20. Resultados de recuperao de atenolol padro adicionado em trs

formulaes farmacuticas comerciais diferentes
125
Tabela 21. Determinao de atenolol em formulaes farmacuticas comerciais
126
Tabela 22. Matriz do planejamento composto central e valores de absorbncia

referentes a cada experimento
137
Tabela 23. Resultados de recuperao de metildopa adicionada em formulaes
farmacuticas
141
Tabela 24. Determinao de metildopa em formulaes farmacuticas comerciais
142
Tabela 25. Determinao de metildopa em formulaes farmacuticas comerciais
146
17
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AAS espectrometria de absoro atmica
CCD cromatografia em camada delgada
CCDAE cromatografia em camada delgada de alta eficincia
CLAE cromatografia lquida de alta eficincia
CLS mnimos quadrados clssicos
DCQ 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida
DDQ 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona
DNA cido desoxirribonuclico
FIA anlise por injeo em fluxo
ILS mnimos quadrados inverso
LDR light dependent resistor (resistor dependente de luz)
LED light emitting diode (diodo emissor de luz)
ND no descrito
PCR regresso de componentes principais
PDAC p-dimetilaminocinamaldedo
PLS mnimos quadrados parciais
PTFE politetrafluoretileno
PVC cloreto de polivinila
RDC resoluo da diretoria colegiada
RMN ressonncia magntica nuclear
SDS dodecil sulfato de sdio
TCNE tetracianoetileno
TCNQ 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano
UV Ultravioleta
18
LISTA DE SMBOLOS
A absorbncia
AR densidade ptica para medida de reflectncia

b caminho ptico
C concentrao
I intensidade da radiao refletida
I 0 intensidade da radiao incidente

r coeficiente de correlao linear
R reflectncia ou poder de reflexo
s coeficiente de disperso
absortividade molar
k coeficiente de absoro molar

mx. comprimento de onda de mxima absoro
19
Sumrio
CAPTULO I - INTRODUO .............................................................................22
I. 1. CONSIDERAES GERAIS .............................................................................. 23
I.
I.
I.
I.
I.
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
Furosemida ..................................................................................................................................... 23
Hidroclorotiazida........................................................................................................................... 24
Propranolol...................................................................................................................................... 26
Atenolol ............................................................................................................................................ 27
Metildopa ......................................................................................................................................... 28
CAPTULO II. REVISO BIBLIOGRFICA - MTODOS ANALTICOS

PARA QUANTIFICAO DOS FRMACOS EM ESTUDO................................29
II. 1. FUROSEMIDA ....................................................................................................... 30
II.
II.
II.
II.
II.
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
Espectrofotometria na Regio do Visvel ........................................................................... 30

Espectrofotometria na regio do UV ................................................................................... 32
Cromatografia .............................................................................................................................. 33
Titulometria .................................................................................................................................. 36
Outras Tcnicas Analticas ...................................................................................................... 36
II. 2. HIDROCLOROTIAZIDA ................................................................................... 37

II. 2.1. Espectrofotometria na regio do UV ................................................................................... 37
II. 2.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)............................................................ 40
II. 2.3. Outras Tcnicas Analticas ...................................................................................................... 43
II. 3. PROPRANOLOL ................................................................................................... 44

II.
II.
II.
II.
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
Espectrofotometria na Regio do Visvel ........................................................................... 44

Espectrofluorimetria .................................................................................................................. 47
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia ........................................................................... 48
Outras Tcnicas........................................................................................................................... 48
II. 4. Atenolol................................................................................................................... 49
II. 4.1. Espectrofotometria na Regio do Visvel ........................................................................... 49
II. 4.2. Outras Tcnicas........................................................................................................................... 50
II. 5. Metildopa ............................................................................................................... 52

II. 5.1. Espectrofotometria na Regio do Visvel ........................................................................... 52
II. 5.2. CLAE ................................................................................................................................................ 55
II. 5.3. Outras Tcnicas........................................................................................................................... 55
CAPTULO III. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS............................................57

CAPTULO IV - ESPECTROSCOPIA DE REFLECTNCIA DIFUSA EM
COMBINAO COM SPOT TEST PARA ANLISES QUANTITATIVAS ......61
IV. 1. SPOT TEST ............................................................................................................ 62
20
IV. 2. ASPECTOS TERICOS DA ESPECTROSCOPIA DE

REFLECTNCIA DIFUSA ............................................................................................. 64
IV. 2.1. Fundamentos............................................................................................................................... 65
IV. 2.2. Teoria de Kubelka-Munk ......................................................................................................... 66
III. 2.3. Instrumentos .............................................................................................................................. 67
IV. 2.4. Representao do espectro de reflectncia..................................................................... 68
III. 2.5. Aplicaes da espectroscopia de reflectncia difusa para anlises quantitativas
.......................................................................................................................................................................... 70
CAPTULO V. DESENVOLVIMENTO DE MTODOS ANALTICOS POR

ESPECTROSCOPIA DE REFLECTNCIA DIFUSA UTILIZANDO SPOT TEST
PARA A DETERMINAO DE FUROSEMIDA, HIDROCLOROTIAZIDA,
PROPRANOLOL E ATENOLOL EM FORMULAES FARMACUTICAS. ........74
V. 1. PARTE EXPERIMENTAL.................................................................................... 75
V.
V.
V.
V.
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
Equipamentos............................................................................................................................... 75
Material e Solventes................................................................................................................... 75
Reagentes e Solues ............................................................................................................... 76
Amostras ........................................................................................................................................ 77
V. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.............................................................. 78
V.
V.
V.
V.
V.
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
Spot test ......................................................................................................................................... 78

Preparao das Amostras ........................................................................................................ 79
Estudo de Interferncias .......................................................................................................... 80
Estudo de Adio e Recuperao .......................................................................................... 81
Determinao de perxido de hidrognio em dioxano: mtodo modificado........ 82
V. 3. RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................... 83
V. 3.1. Determinao de furosemida em formulaes farmacuticas ................................... 83
V. 3.2. Determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas ........................ 94
V. 3.2.2.1. Planejamento Fatorial Fracionrio: triagem de fatores............................... 96
V. 3.2.2.2. Efeitos do tempo e temperatura de aquecimento......................................... 98
V. 3. 3. Determinao de propranolol em formulaes farmacuticas ............................... 105
Esquema 3 ............................................................................................................................................. 105
V. 3. 4. Determinao de atenolol em formulaes farmacuticas ...................................... 119
CAPTULO VI. DESENVOLVIMENTO DE MTODO ANALTICO POR

ESPECTROFOTOMETRIA NA REGIO DO VISVEL PARA A
DETERMINAO DE METILDOPA EM FORMULAES FARMACUTICAS128
VI. 1. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................... 129
VI. 1.1. Equipamentos ........................................................................................................................... 129
VI. 1.2. Reagentes e Solues............................................................................................................ 129
VI. 1.4. Amostras..................................................................................................................................... 129
VI. 2. PROCEDIMENTO.............................................................................................. 130

VI. 2. 1. Curva analtica ........................................................................................................................ 130
VI. 2. 2. Estudo de interferncias...................................................................................................... 130
VI. 2.3. Preparao da amostra ......................................................................................................... 131
V. 2.4. Estudo de Adio e Recuperao ........................................................................................ 131
VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSO .................................................................... 132
21
VI.
VI.
VI.
VI.
VI.
VI.
VI.
VI.
VI.
3.1. Planejamento Fatorial de Experimentos ......................................................................... 136

3.3. Curva Analtica ......................................................................................................................... 139
3.4. Estudo de interferncias ....................................................................................................... 140
3.5. Estudo de Adio e Recuperao....................................................................................... 140
3.6. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia.... 141
3.7. Medidas em dispositivo porttil.......................................................................................... 142
3.7.1. Curva Analtica ..................................................................................................................... 144
3.7.2. Anlise das amostras de comprimidos ........................................................................ 145
3.8. Concluses ................................................................................................................................. 146
CAPTULO VII. CONCLUSES GERAIS ..........................................................148

CAPTULO VIII. PERSPECTIVAS FUTURAS...................................................151
CAPTULO IX. REFERNCIAS...........................................................................153
22
Captulo I - Introduo
23
I. 1. CONSIDERAES GERAIS
Este trabalho apresenta o desenvolvimento de mtodos analticos para a determinao
de diferentes frmacos em formulaes farmacuticas. Os frmacos em estudo foram:
furosemida, hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa. Consideraes gerais sobre
cada um dos frmacos so dadas a seguir:
I. 1.1. Furosemida
A furosemida, cido 5-(aminossulfonil)-4-cloro-2-[(2-furanilmetil) amino] benzico,
(Figura 1) apresenta ponto de fuso de 206C, solvel em acetona, metanol,
dimetilformamida e solues aquosas com pH maior que 8,0. levemente solvel em gua,
clorofrmio e ter; e pouco solvel em etanol (THE MERCK..., 2001). A furosemida um
derivado do cido antranlico ou o-aminobenzico, pertencente classe dos diurticos de ala
(JACKSON, 2003; RANKIN, 2002). Os substituintes cloreto e sulfonamida presentes na
molcula de furosemida so caractersticos em algumas outras classes de diurticos e
essenciais para a atividade diurtica (RANKIN, 2002). Estes frmacos atuam primariamente
sobre o ramo ascendente da ala de Henle, inibindo o sistema de transporte Na+/K+/2Cl-, com
conseqente diminuio do volume sangneo e do dbito cardaco (JACKSON, 2003).
Cl
H2NO 2S
NH CH2
COOH
Figura 1. Estrutura qumica da furosemida
24
Os diurticos de ala so os diurticos mais potentes e, por isso, devem ser utilizados
com cautela. A furosemida indicada no tratamento de edemas relacionados com os sistemas
cardaco, renal e heptico e usada na hipertenso arterial em situaes especiais como
estados edematosos ou em emergncias hipertensivas (JACKSON, 2003). A furosemida
apresenta um efeito salurtico (excreo de ons sdio e cloreto) de 8 a 10 vezes maior que os
diurticos tiazdicos e uma durao da ao mais curta, cerca de 6-8 horas. Ela excretada,
em cerca de 80%, na sua forma inalterada, e uma pequena parte (cerca de 20%)
metabolizada. A furosemida causa excreo de ons sdio, cloreto, potssio, clcio, magnsio
e bicarbonato, podendo levar a desequilbrios eletrolticos. A furosemida tambm pode causar
como efeitos adversos ototoxicidade e distrbios gastrintestinais. Este frmaco efetivo por
via oral, mas pode ser usado parenteralmente em casos emergenciais. A dose de furosemida,
20 a 80 mg por dia, deve ser administrada em doses divididas devido a sua curta durao da
ao e cuidadosamente aumentadas at o mximo de 600 mg por dia (RANKIN, 2002).
I. 1.2. Hidroclorotiazida
A
hidroclorotiazida
(1,1-dixido-6-cloro-3,4-diidro-2H-1,2,4-benzotiadiazino-7-
sulfonamida) (Figura 2) apresenta ponto de fuso de 273-275C, solvel em acetona, amnia

diluda, metanol e etanol e praticamente insolvel em gua (THE MERCK..., 2001).
Cl
H
N
H2NO2S
S
O
NH
O
Figura 2. Estrutura qumica da hidroclorotiazida
25
A hidroclorotiazida pertence classe dos farmcos tiazdicos, os quais possuem um

ncleo benzotiadiazina 1,1-dixido (RANKIN, 2002). Tais frmacos constituem uma
importante classe de agentes diurticos que atuam no tbulo distal, diminuindo a reabsoro
ativa dos ons sdio e cloreto. Entretanto, estes frmacos apresentam ao diurtica moderada
quando comparados aos diurticos de ala. Os diurticos tiazdicos levam a uma perda
significativa de potssio, causando hipocalemia (diminuio nos nveis plasmticos de
potssio) que pode ser evitada atravs da administrao concomitante de diurticos
poupadores de potssio (triantereno, amilorida, por exemplo) ou suplementos de potssio.
Assim, algumas formulaes farmacuticas contendo hidroclorotiazida em associao com
diurticos poupadores de potssio so comercialmente disponveis. A hidroclorotiazida
efetiva por via oral e excretada na urina em sua forma inalterada, a durao da ao de 812 horas (RANKIN, 2002). Os principais efeitos adversos da hidroclorotiazida resultam de
algumas aes renais, sendo a depleo de potssio a mais importante. Outros efeitos incluem
alcalose metablica e aumento dos nveis sricos de cido rico. A hidroclorotiazida
indicada no tratamento de edemas associados a cardiopatias (insuficincia cardaca
congestiva), hepatopatias (cirrose heptica) e doenas renais (sndrome nefrtica,
insuficincia renal crnica, glomerulonefrite aguda). Este frmaco tambm muito usado no
controle da hipertenso (JACKSON, 2003). A diminuio da presso arterial pode ser
atribuda reduo no volume sanguneo e ao relaxamento direto do msculo liso vascular
(RANKIN, 2002). Os diurticos tiazdicos podem ser administrados uma vez ao dia e so bem
tolerados (JACKSON, 2003).
26
I. 1.3. Propranolol
O propranolol, 1-(isopropilamino)-3-(1-naftiloxi)-2-propanol, (Figura 3) apresenta
ponto de fuso de 163-164C, solvel em gua e praticamente insolvel em ter, benzeno e
acetato de etila (THE MERCK..., 2001).
O
OH
N
H
Figura 3. Estrutura qumica do propranolol
O propranolol pertence classe dos -bloqueadores muito utilizados no tratamento da

hipertenso associada doena arterial coronria ou a arritmias cardacas. Os -bloqueadores
exercem seus efeitos farmacolgicos bloqueando os receptores -adrenrgicos, levando
reduo na contratilidade miocrdica e na freqncia cardaca. O propranolol um bloqueador no seletivo, uma vez que interage com os receptores 1 e 2 com igual afinidade.
Este frmaco tambm apresenta eficcia para reduzir a gravidade e a freqncia dos ataques
de angina de esforo e para melhorar a sobrevida de pacientes que sofreram infarto do
miocrdio (HOFFMAN, 2003).
27
I. 1.4. Atenolol
O atenolol, 4-(2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino] propoxi) benzenoacetamida, (Figura 4)
apresenta ponto de fuso de 146-148C, solvel em metanol, acetona e dimetilsulfxido;
levemente solvel em etanol 96%; pouco solvel em gua, isopropanol; muito pouco solvel
em acetona, dioxano e praticamente insolvel em acetonitrila, acetato de etila e clorofrmio
(THE MERCK..., 2001).
NH2
CH 3
O
H 3C
N
H
O
OH
Figura 4. Estrutura qumica do atenolol
O atenolol um agente -bloqueador seletivo, isto , exibe afinidade ligeiramente

maior pelos receptores 1 do que pelos receptores 2. Os -bloqueadores, entre eles, o
atenolol, exercem seu efeito farmacolgico bloqueando os receptores -adrenrgicos, levando
reduo na contratilidade miocrdica e na freqncia cardaca. Da mesma forma que o
propranolol, o atenolol muito utilizado em todos os graus de hipertenso e tambm no
tratamento da angina e arritmias cardacas (HOFFMAN, 2003).
28
I. 1.5. Metildopa
A metildopa, -metil-3,4-diidroxifenilalanina, (Figura 5) solvel em gua a 25C
(~10 mg/ml), em cidos minerais diludos e praticamente insolvel nos solventes orgnicos
mais comuns (THE MERCK..., 2001). A metildopa quimicamente relacionada s
catecolaminas e possui atividade anti-hipertensiva. Tal atividade atribuda ao seu
metabolismo no sistema nervoso central -metilnorepinefrina, a qual ativa os receptores 2
adrenrgicos centrais, reduzindo o tnus simptico e conseqentemente a presso arterial.
Efeitos adversos da metildopa incluem sonolncia, hipotenso postural, reteno de fluidos
com edemas e distrbios gastrintestinais. A dose inicial habitual de metildopa de 250 mg, 2
vezes ao dia (HOFFMAN, 2003).
HO
COOH
H2N
CH3
HO
Figura 5. Estrutura qumica da metildopa
29
Captulo II. Reviso Bibliogrfica - Mtodos analticos

para quantificao dos frmacos em estudo
30
Levantamento bibliogrfico foi realizado nas principais bases de dados sobre os

mtodos analticos publicados nas revistas cientficas de maior circulao para a determinao
de furosemida, hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulaes
farmacuticas. Para melhor compreenso, este levantamento foi descrito em tpicos
subdivididos, como segue:
II. 1. FUROSEMIDA
II. 1.1. Espectrofotometria na Regio do Visvel
A espectrofotometria na regio do visvel tem sido amplamente descrita na literatura
como tcnica analtica utilizada na determinao de furosemida em preparaes farmacuticas
(AGATONOVIC et al., 1990; CASASSAS; FABREGAS, 1979; GARCA et al., 1997;
MOHAMED, 1989; SASTRY et al., 1988; SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI,
1989;
SEVILLANO-CABEZA;
CAMPNS-FALC;
SERRADOR-GARCA,
1997;
ZIVANOVIC; AGATONOVIC; RADULOVIC, 1990). O mtodo descrito por Agatonovic et

al. (1990) foi baseado na reao entre furosemida e cloreto de paldio (II). A mesma reao
foi utilizada por Garca et al. (1997) para a determinao espectrofotomtrica de furosemida
em preparaes farmacuticas utilizando anlise por injeo em fluxo (FIA) (GARCIA, et al.,
1997). O mtodo desenvolvido por Zivanovic, Agatonovic e Radulovic (1990) envolveu a
formao de um complexo colorido a partir da reao entre furosemida e cloreto frrico, em
pH 5,2-6,2. Sastry et al. (1988) descreveram o uso de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona
(MBTH) na determinao espectrofotomtrica de diversos frmacos diurticos, entre eles a
furosemida, em amostras de comprimidos. A reao entre furosemida e MBTH ocorreu na
presena de um agente oxidante - cloreto frrico - com aquecimento a 85C por 5 minutos. A
furosemida tambm foi determinada espectrofotometricamente a partir da reao com
cloramina T, sob aquecimento em banho-maria a 70C por 10 minutos, seguida da adio de
31
N,N-dimetilfenilenodiamina (SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1989). O

mtodo descrito por Sevillano-Cabeza, Campns-Falc e Serrador-Garca (1997) foi baseado
na reao entre furosemida e 1,2-naftoquinona-4-sulfonato com aquecimento a 70C por 30
minutos e envolveu um procedimento de extrao do produto colorido utilizando lcool
isoamlico como solvente extrator. Outros reagentes cromognicos citados na literatura para a
determinao espectrofotomtrica no visvel de furosemida em medicamentos foram 7,7,8,8tetracianoquinodimetano
(MOHAMED,
1989)
1,3,5-benzenotriol
(floroglucinol)
(CASASSAS; FABREGAS, 1979). A Tabela 1 sumariza as condies analticas dos mtodos

espectrofotomtricos acima mencionados. A maioria dos mtodos espectrofotomtricos
relatados apresenta algumas desvantagens como, por exemplo, necessidade de tempos de
espera para o aparecimento da cor, etapas de aquecimento ou de extrao por solvente.
32
Tabela 1. Mtodos por espectrofotometria no visvel descritos na literatura para a determinao de

furosemida em medicamentos.
Reagente Cromognico
mx.
Condies para a reao
Referncia
(nm)
Pd (II)
527
Pd (II)
527
pH 10,0
AGATONOVIC et al.,
1990
pH 5,0 - aquecimento a 55C GARCA et al., 1997

Anlise por injeo em fluxo
FeCl3
513
pH 5,2-6,2
ZIVANOVIC;
AGATONOVIC;
RADULOVIC, 1990
FeCl3 e 3-metil-2benzotiazolinona hidrazona
630
Aquecimento a 85C por 5

min.
SASTRY et al., 1988
Cloramina T e Dicloridrato de
N-N-dimetilfenilenodiamina
540

min.
SASTRY;
SURYANARAYANA;
TIPIRNENI, 1989
1,2 - naftoquinona-4-sulfonato
de sdio
498

min.
SEVILLANOCABEZA; CAMPNSFALC; SERRADORGARCA, 1997
Extrao com lcool

isoamlico
7,7,8,8tetracianoquinodimetano
578
pH 9,0-9,5
Floroglucinol
558
Tempo de espera de 20 min.
MOHAMED, 1989
CASASSAS;
Produto colorido estvel por FABREGAS, 1979
20 min.
II. 1.2. Espectrofotometria na regio do UV

O mtodo descrito na Farmacopia Britnica para a determinao de furosemida em
comprimidos emprega a espectrofotometria na regio do UV (271 nm). O procedimento
recomendado requer diversas etapas de diluio e filtrao lenta em papel de filtro
(BRITISH, 2001). A espectrofotometria no UV tambm foi empregada no mtodo
desenvolvido por Moustafa e Abdel-Moety (1987) para a determinao de formulaes
farmacuticas contendo somente furosemida. Os mtodos espectrofotomtricos na regio do
33
UV, entretanto, apresentam pouca seletividade uma vez que compostos insaturados
apresentam uma ou mais bandas nesta regio do espectro.
A espectrofotometria derivativa tem sido amplamente descrita para a anlise de
formulaes farmacuticas contendo furosemida em associao com outros frmacos. Alguns
mtodos utilizando esta tcnica so descritos na literatura para a determinao simultnea de
furosemida e amilorida (TORAL et al., 2002; FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN,
2001) e tambm de furosemida e espironolactona em formulaes farmacuticas combinadas
(MILLERSHIP; PARKER; DONNELLY, 2005). Dias, Martins e de Oliveira Neto (2005)
propuseram um mtodo por espectrofotometria derivativa na regio do UV para a
determinao de furosemida em medicamentos na presena de seus produtos de
fotodegradao.
II. 1.3. Cromatografia

Devido a sua seletividade e sensibilidade, a cromatografia lquida de alta eficincia
(CLAE) tem sido empregada para a quantificao de furosemida em formulaes
farmacuticas contendo somente furosemida ou em associao com outros frmacos e
tambm em estudos de estabilidade (ANAPURE; KHANNA; DIGHE, 1989; BARROSO et
al., 1996; BARROSO; ALONSO; JIMENEZ, 1996; BROCH; ROMERO; COQUE, 2000;
RAPAKA; ROTH; PRASAD, 1982; SEMAAN et al., 2005).
A CLAE em fase reversa utilizando detector UV (254 nm) foi empregada por
Anapure, Khanna e Dighe (1989) para quantificar furosemida e espironolactona em
medicamentos que combinam estes dois frmacos. Rapaka, Roth e Prasad (1982) descreveram
um mtodo por CLAE com detector UV (280 nm) utilizando extrao com hidrxido de sdio
para quantificar cido 4-cloro-5-sulfamoilantranlico - produto de degradao da furosemida e furosemida em matrias-primas e em formulaes farmacuticas. Outro mtodo por CLAE
com detector UV (237 nm) para a determinao de furosemida em comprimidos empregou
34
uma coluna C18 homemade (SEMAAN et al., 2005). A CLAE empregando fases mveis
micelares tambm tem sido descrita para a determinao de furosemida. Broch, Romero e
Coque (2000) utilizaram a CLAE com detector UV (274 nm), coluna C18 e fase mvel
constituda por dodecil sulfato de sdio (SDS) 0,06 mol L-1 e propanol 8% para a
determinao de furosemida em medicamentos. Este mtodo tambm foi empregado para o
estudo da estabilidade da furosemida. Neste caso, a separao de furosemida e dos seus
produtos de fotodegradao foi conseguida utilizando-se uma fase mvel com fora de
eluio menor (SDS 0,04 mol L-1 e propanol 2%) (BROCH; ROMERO; COQUE, 2000).
A CLAE com detector amperomtrico tem sido empregada para a determinao de
furosemida, principalmente, quando se requer grande sensibilidade. Barroso et al. (1996)
utilizaram CLAE com detector amperomtrico para quantificar furosemida e piretanida em
formulaes farmacuticas e em amostras de urina. Outro mtodo utilizando CLAE com
detector amperomtrico foi aplicado determinao simultnea de furosemida e triantereno
em amostras de comprimido contendo os dois frmacos e tambm em amostras de urina
(BARROSO; ALONSO; JIMENEZ, 1996). Os mtodos por CLAE, entretanto, apresentam
algumas desvantagens, tais como o alto custo dos cromatgrafos e colunas cromatogrficas e
a necessidade de grandes volumes de solventes orgnicos, levando gerao de resduos
txicos.
A cromatografia em camada delgada (CCD) foi descrita para a determinao
simultnea de amilorida, bumetanida, politiazida e furosemida em formulaes farmacuticas
(ZIVANOVIC; AGATONOVIC; RADULOVIC, 1989). Tal mtodo empregou placas de
slica gel, NH3 25% : propanol (3:7) ou clorofrmio : isopropanol : metanol : cido actico
(5:3:1:1) como fases mveis e a deteco foi em 254 nm.
Algumas informaes sobre os mtodos por CLAE descritos acima esto apresentadas
na Tabela 2.
Fosfato 5,0 mmol L-1 pH 5,5
Acetonitrila:gua (30:70, v/v) Tampo
Fosfato 5,0 mmol L pH 5,5
-1
Acetonitrila:gua (40:60, v/v) Tampo
SDS 0,06 mol L-1 : propanol 8%
SDS 0,04 mol L-1 : propanol 2%
pH 5,5) (30:70, v/v)
Eletroqumica
Eletroqumica
UV (230, 268 e 330 nm)
Triantereno
Piretanida
JIMENEZ, 1996
BARROSO; ALONSO;
BARROSO et al., 1996
COQUE, 2000
BROCH; ROMERO;
SEMAAN et al., 2005
Metanol:Tampo Fosfato (10 mmol L-1,

UV (237 nm)
PRASAD, 1982
(10:90, v/v)
ANAPURE; KHANNA;
RAPAKA; ROTH;
UV (280 nm)
Espironolactona
Acetonitrila:cido Fosfrico 0,08 mol L-1
SDS: dodecil sulfato de sdio
C18
C18
C18
C18
C18
UV (254 nm)
Frmaco Associado Referncia
DIGHE, 1989
Acetonitrila:hidrogenofosfato diamnio
C18
Deteco
0,02 mol L-1 (55:45, v/v), pH 4,0
Fase Mvel
Coluna
Tabela 2. Mtodos analticos por CLAE descritos na literatura para a determinao de furosemida associada ou no a outros frmacos em comprimidos.
35
36
II. 1.4. Titulometria

A titulometria tem sido empregada em alguns estudos envolvendo a determinao de
furosemida em sua forma pura ou em medicamentos (KULICHENKO; FESENKO, 2002;
OSSMAN et al., 1988).
Ossman et al. (1988) propuseram mtodos titulomtricos indiretos para a determinao
de furosemida em sua forma pura. O mtodo foi baseado na reao entre furosemida e Nbromosuccinimida ou N-clorosuccinimida. soluo contendo excesso de reagente foi
adicionado iodeto de potssio. Esta soluo foi, ento, titulada com tiossulfato de sdio,
utilizando amido como indicador. O tempo timo para a reao se completar foi de 20
minutos para N-bromosuccinimida e de 30 minutos para N-clorosuccinimida. Kulichenko e
Fesenko (2002) estudaram a solubilidade e as propriedades cido-base da furosemida e
propuseram um mtodo titulomtrico utilizando tensoativos catinicos com determinao
potenciomtrica ou utilizando azul de bromotimol como indicador.
II. 1.5. Outras Tcnicas Analticas

A cromatografia eletrocintica capilar micelar - tcnica eletrofortica na qual h a
introduo de micelas na soluo tampo - foi utilizada para separar e quantificar furosemida,
hidroclorotiazida, clortalidona e triantereno em comprimidos (LUIS et al., 2002). Um mtodo
por espectroscopia de fluorescncia associada calibrao multivariada (mtodo dos mnimos
quadrados parciais) foi descrito para a determinao simultnea de furosemida e triantereno
em amostras de urina e em formulaes farmacuticas (LUIS et al., 2004). Medicamentos
contendo furosemida foram analisados por espectroscopia de ressonncia magntica nuclear
(RMN) (ABOUL-ENEIN; AL-BADR; RASHED, 1979). Barroso, Alonso e Jimenez (1995)
desenvolveram mtodos por voltametria de pulso diferencial e voltametria de onda quadrada
para determinar furosemida em amostras de urina e em formulaes farmacuticas. Um
37
eletrodo de membrana de PVC incorporado com o par inico furosemida-cloreto de

tricaprilmetilamnio foi desenvolvido por Dias et al., 2004 para quantificar furosemida em
medicamentos.
II. 2. HIDROCLOROTIAZIDA
II. 2.1. Espectrofotometria na regio do UV
A maioria dos mtodos analticos para a determinao de hidroclorotiazida em
medicamentos emprega a espectrofotometria no UV (ALBERO et al., 2002; CARLUCCI; DI
GIUSEPPE; MAZZEO, 1993; DINC; USTUNDAG, 2003; DINC, 2002; EL-WALILY et al.,
1995; ERK; ONUR, 1996; ERK, 1999, 2002; FERRARO; CASTELLANO; KAUFMAN,
2002, 2004; JOSEPH-CHARLES et al., 2003; KARGOSHA; SARRAFI, 2001; MAHADIK,
2000; MARTIN et al. 1995, 1998; PANDERI, 1999; PANZADE; SALAMA et al., 2000;
SASTRY et al., 1988; URBNYI; OCONNELL, 1972). A Farmacopia Britnica descreve
um mtodo por espectrofotometria no UV em 273 nm para a determinao de
hidroclorotiazida em comprimidos (BRITISH, 2001). Os mtodos por espectrofotometria
no UV descritos na literatura so, principalmente, para a determinao de hidroclorotiazida
em associao com um ou mais frmacos. Entretanto, medidas diretas na regio do UV esto
sujeitas s interferncias provenientes de frmacos e/ou de excipientes presentes na
formulao farmacutica, resultando em baixa seletividade, uma vez que todos os compostos
insaturados apresentam uma ou mais bandas na regio UV do espectro eletromagntico. Desta
forma, os mtodos por espectrofotometria no UV para a determinao de hidroclorotiazida
associada a outros frmacos presentes em formulaes farmacuticas so baseados em
medidas derivativas a fim de se obter mtodos com maior seletividade do que os mtodos
espectrofotomtricos convencionais. Alm disso, muitos destes mtodos aplicam ferramentas
quimiomtricas, tais como: mnimos quadrados clssicos (CLS), mnimos quadrados inverso
38
(ILS), regresso de componentes principais (PCR) e mnimos quadrados parciais (PLS) sobre
os dados dos espectros UV e sobre suas derivadas de primeira ou segunda ordem. Algumas
informaes sobre as determinaes de hidroclorotiazida associada a outros frmacos por
espectrofotometria derivativa com ou sem aplicao de mtodos quimiomtricos esto
apresentadas na Tabela 3.
39
Tabela 3. Mtodos por espectrofotometria UV derivativa descritos na literatura para a determinao

de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas combinadas.
Frmaco(s) associado(s)
Mtodo(s) quimiomtrico(s)
Referncia
empregado(s)
Amilorida, atenolol e timolol
CLS, PCR, PLS
FERRARO;
CASTELLANO;
KAUFMAN, 2004
Amilorida
PLS
FERRARO;
CASTELLANO;
KAUFMAN, 2002
Amilorida
Regresso linear mltipla
MARTIN et al., 1995
Benazepril, triantereno, cilazapril
Mtodo de Vierordt
ERK, 1999
Benazepril
Derivada 2 ordem
PANDERI, 1999
Benazepril
CLS, ILS, PCR
Captopril
DINC, 2002
PANZADE; MAHADIK,
2000
Captopril, enalapril, fosinopril
Derivada 2 ordem
SALAMA et al., 2000
Cilazapril
Derivada 1 ordem
ERK; ONUR, 1996
Enalapril
Derivada 1 ordem
EL-WALILY et al., 1995
Enalapril
Derivada 2 ordem
CARLUCCI; DI
GIUSEPPE; MAZZEO,
1993
Espironolactona
Espironolactona, canrenona
CLS, ILS, PCR, PLS
DINC; USTUNDAG,
2003
PLS
MARTIN et al., 1998
Fosinopril
Derivada 1 ordem
ERK, 2002
Irbesartan
Derivada 1 ordem
JOSEPH-CHARLES et
al., 2003
Irbesartan
Derivada 1 ordem
ALBERO et al., 2002
Losartan
Derivada 1 ordem
ERK, 2001
Triantereno
Valsartan
PLS e PCR
Derivada 1 ordem
KARGOSHA;
SARRAFI, 2001
SATANA et al., 2001
CLS: mnimos quadrados clssicos; ILS: mnimos quadrados inverso; PCR: regresso de componentes
principais; PLS: mnimos quadrados parciais.
40
II. 2.2. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Dentre os mtodos cromatogrficos, a CLAE, em fase reversa, com detector UV tem
sido a mais descrita para a determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas
(ATAY; TAMER; ARIKAN, 2001; CETIN; SUNGUR, 2005; ERK; KARTAL, 1999; ERK,
1999, 2001; KARTAL; ERK, 1999; OZKAN, 2001; PANDERI; PARISSI-POULOU, 1999).
Com o objetivo de reduzir o consumo de solventes e tornar os mtodos por CLAE mais
seletivos, colunas micro-bore (com dimetro interno entre 1,0 a 4,6 mm) tm sido utilizadas
(PANDERI; PARISSI-POULOU, 1999). CLAE com deteco por quimiluminescncia
tambm tem sido empregada para a determinao de hidroclorotiazida em formulaes de
comprimidos (OUYANG et al., 1999). Neste caso, a deteco foi baseada na reao entre
hidroclorotiazida e crio (IV) em meio de cido sulfrico, sensibilizada pelo corante
fluorescente rodamina 6G (OUYANG et al., 1999). Os dados sobre as determinaes por
CLAE esto apresentados na Tabela 4.
254
232
250
213
278
265
CL
Tampo fosfato 0,01 mol L-1 : Metanol (53:47, v/v) por 5

min. e (36:64, v/v) por 15 min.
KH2PO4 0,01 mol L-1 : acetonitrila (65:35, v/v) pH 3,1

ajustado com H3PO4
Tampo Fosfato 0,025 mol L-1 pH 4,8 : acetonitrila

(55:45, v/v)
acetonitrila : H2O (20:80, v/v) - pH 3,8
cido o-fosfrico 0,025 mol L-1 pH 3,0 ajustado com

trietilamina : acetonitrila (84:16, v/v)
NaH2PO4 0,01 mol L-1 : Metanol : Acetonitrila (8:2:1,

v/v/v) pH 5,5 ajustado com H3PO4
Metanol 10% -Tampo acetato de sdio 50 mmol L-1 pH

3,5 contendo octanosulfonato de sdio 25mmol L-1
C18
C18
C18
microbore
C18
C18
C18
C18
CL: Quimiluminescncia
209
Metanol:Tampo Fosfato pH 4,0 (70:30, v/v)
C18
Deteco
(nm)
Fase Mvel
Coluna
tiopronina
naproxeno
furosemida
trimetropina
fenobarbital
Captopril
Losartan
Amilorida
Lisinopril
Benazepril
Losartan
Cilazapril
Cilazapril
Padro Interno Frmaco(s) Associado(s)
OUYANG et al.,
1999
ERK, 2001
KARTAL; ERK,
1999
ERK; KARTAL,
1999
PANDERI;
PARISSIPOULOU, 1999
OZKAN, 2001
ATAY; TAMER;
ARIKAN, 2001
CETIN; SUNGUR,
2005
Referncia
Tabela 4. Mtodos analticos por CLAE descritos na literatura para a determinao de hidroclorotiazida associada ou no a outros frmacos em comprimidos.
41
43
II. 2.3. Outras Tcnicas Analticas

A Farmacopia Brasileira descreve um mtodo para quantificar hidroclorotiazida em
comprimidos utilizando titulao em meio no-aquoso (FARMACOPIA..., 1988).
Um mtodo por FIA baseado na reao de quimiluminescncia entre hidroclorotiazida
e crio (IV) foi desenvolvido por Ouyang et al. (1998). A mesma reao foi utilizada em outro
mtodo utilizando quimiluminescncia para a determinao de hidroclorotiazida em
formulaes farmacuticas (PULGARIN; MOLINA; OLIVARES NIETO, 2004).
A cromatografia eletrocintica capilar micelar foi utilizada por Luis et al. (2002) para
a separao e quantificao de clortalidona, furosemida, triantereno e hidroclorotiazida e
tambm no mtodo desenvolvido por Quaglia et al. (2002) para a determinao de losartan e
hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas.
Poucos mtodos por espectrofotometria na regio do visvel so citados na literatura
para a determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas (SASTRY et al.,
1989; SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1988). Os mtodos mencionados
envolveram reaes qumicas com dicloridrato de N,N-dimetilfenilenodiamina e cloramina T
(SASTRY et al., 1989) e 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona aps hidrlise alcalina
(SASTRY; SURYANARAYANA; TIPIRNENI, 1988).
44
II. 3. PROPRANOLOL
A maioria dos mtodos analticos descritos na literatura para a determinao de
propranolol em formulaes farmacuticas emprega a espectrofotometria na regio do visvel.
Estes mtodos so baseados em reaes entre propranolol e diferentes reagentes
cromognicos. Salem (2002) desenvolveu mtodos baseados na reao do propranolol
(doador de eltrons) e reagentes aceptores de eltrons, tais como: iodo, p-cloranil, bromanil,
2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona (DDQ), tetracianoetileno (TCNE) e 7,7,8,8tetracianoquinodimetano (TCNQ), produzindo complexos de transferncia de carga coloridos
(SALEM, 2002). Glc, Ycesoy e Serin (2004) descreveram dois mtodos por
espectrofotometria no visvel para determinar propranolol em formulaes farmacuticas.
Tais mtodos foram baseados em reaes de complexao do frmaco com Cu (II) e Co (II).
Um mtodo indireto utilizando a espectrofotometria no visvel foi descrito para a
determinao de propranolol e piroxicam em formulaes farmacuticas e em matriasprimas (GOWDA; SEETHARAMAPPA; MELWANKI, 2002). Este mtodo foi baseado na
oxidao de propranolol por um excesso de N-bromosuccinimida, em meio cido, seguida
pela reao do excesso de oxidante com cloridrato de prometazina e cloridrato de
metidilazina, resultando em um produto colorido. Outro mtodo indireto foi proposto por
Sastry, Srinivas e Prasad (1996). Tal mtodo foi baseado na reao do propranolol com Nbromosuccinimida, a qual foi adicionada em concentrao conhecida e em excesso. A
concentrao de N-bromosuccinimida que no reagiu foi determinada pela diminuio na
absorbncia do corante celestine blue. O mtodo proposto por El-Eman et al. (2003) foi
baseado na reao de acoplamento oxidativo entre propranolol e 3-metil-2-benzotiazolinona
hidrazona (MBTH), na presena de Ce (IV). Outros mtodos espectrofotomtricos para a
determinao de propranolol em formulaes farmacuticas envolveram reaes com azul de
45
bromotimol (RADULOVIC; JOVANOVIC; ZIVANOVIC, 1986) e cido 4-amino-3,5dinitrobenzico diazotizado (IDOWU; ADEGOKE; OLANIYI, 2004). O mtodo descrito por
Zivanovic, Radulovic e Jovanovic (1988) envolveu a reao entre propranolol e cloreto
frrico, em meio cido, na presena de tiocianato de amnio. O complexo colorido formado
foi extrado com clorofrmio.
A Tabela 5 apresenta as condies analticas dos mtodos espectrofotomtricos acima
mencionados, bem como os reagentes cromognicos envolvidos nas reaes qumicas para
determinao de propranolol em formulaes farmacuticas. A maioria dos mtodos
espectrofotomtricos descritos apresenta algumas desvantagens, tais como tempo de espera
para o aparecimento da cor, etapas de derivatizao ou extrao com clorofrmio e alguns so
indiretos.
365
440
450
470
420
840
548
614
515
540
496
414
470
477
Iodo
p-Cloranil
Bromanil
DDQ
TCNE
TCNQ
Cu (II)
Co (II)
N-bromosuccinimida
N-bromosuccinimida e celestine blue
3-metilbenzotiazolina-2-ona hidrazona
Azul de bromotimol
cido 4-amino-3,5-dinitrobenzico
FeCl3 e NH4CNS
Extrao com clorofrmio
Requer etapa de derivatizao
Extrao com clorofrmio
Requer tratamento com sulfato crico amoniacal
Mtodo indireto
Mtodo indireto
Desenvolvimento da cor aps 30 min.
Desenvolvimento da cor aps 5, 5, 15, 20, 20 e 40

min., respectivamente.
Comentrios
DDQ: 2,3-dicloro-5,6-diciano-1,4-benzoquinona; TCNE: tetracianoetileno; TCNQ: 7,7,8,8-tetracianoquinodimetano.
Deteco (nm)
Reagente
em formulaes farmacuticas.
ZIVANOVIC; RADULOVIC;
JOVANOVIC, 1988
IDOWU; ADEGOKE;
OLANIYI, 2004
RADULOVIC; JOVANOVIC;
ZIVANOVIC, 1986
EL-EMAM et al., 2003
SASTRY; SRINIVAS;
PRASAD, 1996
GOWDA; SEETHARAMAPPA;
MELWANKI, 2002
GLC; YCESOY; SERIN,

2004
SALEM, 2002
Referncia
Tabela 5. Comparao entre alguns mtodos espectrofotomtricos e seus reagentes cromognicos descritos na literatura para a determinao de propranolol
46
47
II. 3.2. Espectrofluorimetria

Alguns mtodos fluorimtricos tm sido desenvolvidos para a determinao de
propranolol em formulaes farmacuticas. Tais mtodos foram baseados na fluorescncia
natural da molcula de propranolol (FERNNDEZ-SNCHEZ et al., 2003; LA PEA;
SALINAS; DURN, 1991; RUIZ et al., 1998) ou em reaes de derivatizao (RAMESH et
al., 2003). Um mtodo por espectrofluorimetria foi descrito para a determinao simultnea
de propranolol e hidralazina em formulaes farmacuticas. Os espectros foram registrados
aps aquecimento da amostra em meio aquoso a 70C por 15 minutos e resfriamento a 20C e
suas derivadas (1 ordem) foram utilizadas (LA PEA; SALINAS; DURN, 1991). Outro
mtodo empregando espectrofluorimetria derivativa foi descrito por Ruiz et al. (1998) para a
determinao simultnea de propranolol e pindolol em formulaes farmacuticas. Neste
mtodo, os espectros foram registrados a 25C e suas derivadas (1 ordem) foram utilizadas.
Um sensor ptico sensvel fluorescncia foi desenvolvido por Fernndez-Snchez et al.
(2003) para determinar propranolol e pindolol em formulaes farmacuticas e em amostras
de urina. Ramesh et al. (2003) propuseram um mtodo por espectrofluorimetria para a
determinao simultnea de piroxican e propranolol em formulaes farmacuticas. O mtodo
foi baseado na reao de oxidao entre o frmaco e excesso de N-bromosuccinimida, seguida
pela reao do excesso de N-bromosuccinimida com cloridrato de metdilazina, resultando em
espcies fluorescentes (RAMESH et al., 2003).
48
II. 3.3. Cromatografia Lquida de Alta Eficincia

A CLAE com detector UV (270 nm) foi utilizada por DasGupta (1985) para a
quantificao de propranolol em formulaes farmacuticas. O mtodo empregou uma coluna
C18 e verapamil como padro interno. Outro mtodo por CLAE no UV (290 nm) foi proposto
por Hitscherich et al. (1987). Este mtodo empregou coluna de cianopropilsilano para separar
e quantificar propranolol e hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas. Martinez, Coque
e Camanas (1997) desenvolveram um mtodo por CLAE com detector UV (225 nm) com o
propsito de separar e quantificar diversos -bloqueadores, entre eles o propranolol, em
formulaes farmacuticas. O mtodo empregou fases mveis micelares em diferentes valores
de pH.
II. 3.4. Outras Tcnicas

A Farmacopia Britnica descreve um mtodo por espectrofotometria na regio do UV
(290 nm) para a determinao de propranolol em comprimidos (BRITISH, 2001). Um
mtodo por quimiluminescncia e anlise por injeo em fluxo foi desenvolvido por Tsogas et
al. (2005) para a determinao de propranolol em formulaes farmacuticas. Tal mtodo foi
baseado na reao com pirogalol oxidado por periodato. Trata-se de um mtodo indireto, uma
vez que o propranolol oxidado por periodato que adicionado em excesso e a deteco
feita pela medida de quimiluminescncia gerada pela oxidao de pirogalol com o excesso de
periodato. Outro mtodo por quimiluminescncia e FIA foi baseado na quimiluminescncia
produzida pela reao entre propranolol e permanganato de potssio em meio de cido
sulfrico (TOWNSHEND; PULGARIN; PARDO, 2005).
Outras tcnicas citadas para a determinao de propranolol em formulaes
farmacuticas tm sido a polarografia de pulso diferencial (EL-RIES; ABOU-SEKKINA;
WASSEL, 2002), a fosforescncia temperatura ambiente (DIAZ et al., 2002; MARTINEZ;
CAMANAS; COQUE, 1994) e a espectrometria de absoro atmica (AAS) (EL-RIES;
49
ATTIA; IBRAHIM, 2000; KHALIL; BORHAM, 2000; KHALIL; EL-RABIEHI, 2000). Um

mtodo titulomtrico direto utilizando N-bromosuccinimida como titulante tambm foi
descrito para determinar propranolol em formulaes farmacuticas (PATHAKA; SHUKLA;
SHUKLA, 1982). Briguenti e Bonato (2005) empregaram a eletroforese capilar para a anlise
dos -bloqueadores: atenolol, metoprolol, pindolol e propranolol em preparaes
farmacuticas. Mtodos potenciomtricos utilizando eletrodos on-seletivos tambm tm sido
descritos na literatura para a determinao de propranolol em formulaes farmacuticas
(ABOUL-ENEIN; SUN, 2000; HASSAN et al., 2003; KARTAMYSHEV; RYASENSKII;
GORELOV, 2002).
II. 4. Atenolol
Diversos mtodos espectrofotomtricos na regio do visvel tm sido descritos para
quantificar atenolol em formulaes farmacuticas (AGRAWAL et al., 1992; ALGHANNAM; BELAL, 2002; AL-GHANNAM, 2006; AMIN; RAGAB; SALEH, 2002;
GLC; YCESOY; SERIN, 2004; SALEM, 2002). Um mtodo espectrofotomtrico
indireto foi desenvolvido por Agrawal et al. (1992). O mtodo foi baseado na reao de
atenolol com cloridrato de hidroxilamina, produzindo um derivado do cido hidroxmico, o
qual formou um complexo colorido com Fe (III) que foi determinado em 510 nm. Mtodos
para a determinao de diversos agentes -bloqueadores, entre eles o atenolol, baseados em
reaes que formam complexos de transferncia de carga foram descritos por Salem (2002) e
empregaram iodo, p-cloranil, bromanil, TCNE e TCNQ como reagentes cromognicos.
Golc, Ycesoy e Serin (2004) descreveram dois mtodos por espectrofotometria no visvel
para determinar acebutolol, propranolol e atenolol em formulaes farmacuticas. Tais
mtodos foram baseados em reaes de complexao dos frmacos com Cu (II) e Co (II). Um
mtodo espectrofotomtrico cintico para a determinao de atenolol em formulaes
50
farmacuticas foi proposto por Al-Ghannam e Belal (2002). O mtodo foi baseado na reao
entre atenolol e 4-cloro-7-nitrobenzeno-2-oxa-1,3-diazol em pH 8,0 e com aquecimento por
30 minutos, produzindo um composto colorido (460 nm). O mtodo descrito por Al-Ghannam
(2006) para a determinao de atenolol envolveu o uso de corantes cidos, tais como: azul de
bromofenol, azul de bromotimol e vermelho de bromocresol. O complexo colorido formado
foi analisado por espectrofotometria em 415 nm.

Martinez, Coque e Camanas (1997) desenvolveram um mtodo por CLAE com
detector UV (225 nm) com o propsito de separar e quantificar diversos -bloqueadores, entre
eles o atenolol, em formulaes farmacuticas. O mtodo empregou fases mveis micelares
em diferentes valores de pH.
A cromatografia em camada delgada de alta eficincia (CCDAE) foi empregada para a
determinao de atenolol e nitrendipina em formulaes farmacuticas (ARGEKAR;
SAWANT, 1999). Tal mtodo empregou placas de slica gel sobre folhas de alumnio como
fase estacionria e clorofrmio: metanol : tolueno : amnia 25% (2:2:5,5:0,1, v/v) como fase
mvel. A deteco foi realizada em 233 nm (ARGEKAR; SAWANT, 1999). Um mtodo
semelhante utilizando CCDAE foi aplicado determinao de atenolol e amlodipina em
amostras de comprimidos (ARGEKAR; POWAR, 2000). Tal mtodo empregou placas de
slica gel como fase estacionria e cloreto de metileno : metanol : amnia 25% (8,8:1,3:0,1,
v/v) como fase mvel. A deteco foi realizada em 230 nm.
A Farmacopia dos Estados Unidos descreve um mtodo por CLAE com detector UV
(226 nm) para a quantificao de atenolol em comprimidos (UNITED..., 2003). O mtodo
recomendado pela Farmacopia Britnica envolve a espectrofotometria no UV em 275 nm
(BRITISH, 2001).
51
A espetrofotometria derivativa no UV utilizando mtodos quimiomtricos foi descrita

por Ferraro, Castellano e Kaufman (2004) para a determinao simultnea de amilorida,
atenolol, hidroclorotiazida e timolol em formulaes farmacuticas e em misturas sintticas.
A espectrofotometria UV derivativa tambm foi empregada nos mtodos desenvolvidos por
Bonazzi et al. (1996) para a anlise de formulaes farmacuticas contendo atenolol,
metoprolol e suas associaes, tais como: atenolol-clortalidona, metoprolol-clortalidona e
metoprolol-hidroclorotiazida.
Entre os mtodos potenciomtricos para a determinao de atenolol est o uso de um
biossensor contendo membrana de bicamada lipdica com superfcie estabilizada com DNA
desenvolvido para triagem rpida de atenolol em preparaes farmacuticas (NIKOLELIS;
PETROPOULOU; MITROKOTSA, 2002). Outro mtodo potenciomtrico descrito para a
determinao de atenolol em formulaes farmacuticas empregou sensores de membrana de
matriz polimrica de PVC incorporada com o par inico atenolol-tungstofosfato (HASSAN et
al., 2003). Um mtodo potenciomtrico utilizando eletrodo on-seletivo de membrana de PVC
foi descrito na literatura para a determinao de atenolol em formulaes farmacuticas. O
eletrodo foi construdo pela incorporao na matriz de PVC com o par inico atenolol-tetrakis
(p-clorofenil) borato (SHAMSIPUR; JALALI, 2005).
Briguenti e Bonato (2005) empregaram a eletroforese capilar para a anlise dos bloqueadores atenolol, metoprolol, pindolol e propranolol em preparaes farmacuticas.
Outros mtodos por eletroforese capilar foram descritos por Shafaati e Clark (1996) para a
determinao de atenolol, na presena de substncias relacionadas, em formulaes
farmacuticas e por Maguregui, Jimenez e Alonso (1998) para a determinao simultnea de
atenolol e de outros agentes anti-hipertensivos em formulaes farmacuticas e em amostras
de urina.
52
II. 5. Metildopa
O mtodo recomendado pela Farmacopia Brasileira para a anlise de comprimidos
contendo metildopa emprega a espectrofotometria na regio do visvel. O mtodo baseado
na reao entre metildopa e tartarato ferroso em pH 8,5 (FARMACOPIA..., 1988). Outros
mtodos espectrofotomtricos, na regio do visvel, descritos para a determinao de
metildopa so baseados em diferentes tipos de reaes qumicas. O mtodo desenvolvido por
Nagaraja et al. (1998) envolveu uma reao de oxidao da metildopa por Nbromosuccinimida, seguida pelo acoplamento oxidativo com isoniazida. A metildopa tambm
foi determinada pela reao com sulfanilamida diazotizada, na presena de ons molibdato,
em meio cido (NAGARAJA; VASANTHA; SUNITHA, 2001). O mtodo desenvolvido por
Aman et al. (1998) empregou a reao entre metildopa e cido barbitrico, em meio alcalino.
Outros reagentes citados tm sido: periodato (AFKHAMI; KHATAMI, 2003), pdimetilaminocinamaldedo (WALASH; ABOU-OUF; SALEM, 1985), vanilina (SALEM,
1985), nitrato de crio (IV) (HELALEH; RAHMAN; ABU-NAMEH, 1997) e cloreto frrico
(ZIVANOVIC; VASILJEVIC; RADULOVIC, 1991). Alguns mtodos espectrofotomtricos
utilizando FIA tambm tm sido descritos na literatura (NEVADO; GALLEGO; LAGUNA,
1995; TUBINO; RODRIGUES-JR; VILA, 2004; ABDULRAHMAN; AL-ABACHI; ALQAISSY, 2005; RIBEIRO et al., 2005). Tais mtodos envolveram reaes entre metildopa e
metaperiodato (NEVADO; GALLEGO; LAGUNA, 1995), p-aminofenol em meio alcalino
(TUBINO;
RODRIGUES-JR;
VILA,
2004),
p-toluidina
periodato
de
sdio
(ABDULRAHMAN; AL-ABACHI; AL-QAISSY, 2005) e molibdato de amnio (RIBEIRO

et al., 2005). Ainda, um mtodo espectrofotomtrico para a determinao de metildopa em
formulaes farmacuticas empregou extrato bruto de raiz de batata doce (Ipomoea batatas
(L.) Lam.) como fonte da enzima polifenol oxidase, a qual catalisa a reao de oxidao de
53
catecolaminas levando a formao de compostos coloridos (VIEIRA; FATIBELLO-FILHO,

1998). Dados adicionais sobre os mtodos espectrofotomtricos citados acima esto
apresentados na Tabela 6. A maioria dos mtodos espectrofotomtricos citados apresenta
algumas desvantagens, tais como necessidade de tempo de espera para o aparecimento da cor,
etapa de aquecimento e envolvem procedimentos complexos.
0,10 2,5
0,5 7,0
4,0 60,0
665
500
440
420
550
423
473
608
410
480
Vanilina
Nitrato de Ce (IV)
FeCl3
Metaperiodato
p-Aminofenol
Molibdato de Amnio
Extrato de batata doce
(polifenol oxidase)
ND: No descrito
1,0 250
1,0 50,0
540
480
50 100
47,64 1429,2
47,64 714,6
4,76 47,6
19,0 76,2
125 250
12 144
5,0 16,0
Lei de Beer
(g mL-1)
480
Deteco
(nm)
N-bromosuccinimida
Isoniazida
cido barbitrico
p-Toluidina Periodato de
sdio
Periodato
Sulfanilamida diazotizada ons molibdato
p-Dimetilaminocinamaldedo
Reagente
Comentrios
0,9999 FIA
0,9990 Reao enzimtica
0,9999 FIA
Tempo de espera de 20
min.
ND
Aquecimento a 80C por
20-25 min.
0,998 Tempo de espera de 10
min.
0,9999 FIA - Aquecimento a 45 C
ND
0,9945 Mtodo indireto

0,9895 Tempos de espera de 10
min.
1,0
Tempo de espera de 5 min.
0,9998 Aquecimento por 20 min.

0,9898 FIA
0,9994 Tempo de espera de 5 min.
HELALEH; RAHMAN; ABUNAMEH, 1997

ZIVANOVIC; VASILJEVIC;
RADULOVIC, 1991
NEVADO; GALLEGO; LAGUNA,
1995
TUBINO; RODRIGUES-JR; VILA,
2004
RIBEIRO et al., 2005
VIEIRA; FATIBELLO-FILHO, 1998
AMAN et al., 1998

ABDULRAHMAN; AL-ABACHI; ALQAISSY, 2005
AFKHAMI; KHATAMI, 2003
NAGARAJA; VASANTHA;
SUNITHA, 2001
WALASH; ABOU-OUF; SALEM,
1985
SALEM, 1985
NAGARAJA et al., 1998
Referncia
Tabela 6. Mtodos espectrofotomtricos no visvel descritos na literatura para a determinao de metildopa em formulaes farmacuticas.
54
55
II. 5.2. CLAE

A CLAE tambm tem sido descrita para a anlise de formulaes farmacuticas
contendo metildopa. Um mtodo por CLAE com detector UV (280 nm) foi descrito por Ting
(1983). O mtodo empregou uma coluna C18, uma mistura de cido actico 3% : metanol
(96:4, v/v) como fase mvel e teobromina como padro interno (TING, 1983). A CLAE
utilizando fase mvel micelar foi empregada no mtodo proposto por Camanas et al. (1995)
para a determinao das catecolaminas: L-dopa, metildopa, epinefrina, dopamina e
isoproterenol, bem como de outros compostos freqentemente associados com essas
catecolaminas, em formulaes farmacuticas (CAMANAS et al., 1995). A CLAE com
detector UV (286 nm) foi empregada para a determinao simultnea de metildopa, amilorida
e hidroclorotiazida em comprimidos (ZECEVIC et al., 2001). As condies timas de
separao foram estabelecidas utilizando metodologia de superfcie de resposta. A fase mvel
consistiu de gua : metanol (75:25, v/v) pH 3,60, a coluna foi uma C18 e o padro interno
cafena (ZECEVIC et al., 2001).

Badawy et al. (1996) descreveram um mtodo potenciomtrico para a determinao de
L-dopa,
carbidopa,
metildopa
and
aspartame
utilizando
um
eletrodo
seletivo
trinitrobenzenosulfonato. A polarografia de pulso diferencial tambm foi descrita para a

determinao de metildopa em formulaes farmacuticas (BALLANTINE; WOOLFSON,
1979). Um mtodo por titulometria foi descrito para a determinao de metildopa em
comprimidos. Neste mtodo, N-bromosuccinimida foi utilizada para titular a soluo
contendo amostra, iodo e vermelho de metila (PATHAK; SHUKLA; SHUKLA, 1982). Um
mtodo utilizando espectrofotometria no UV foi descrito por Wahbi et al. (1978). Tal mtodo
empregou a reao com cobaltinitrito de sdio e foi aplicado na determinao de alguns
56
frmacos fenlicos, entre eles a metildopa, em amostras de comprimidos. Outro mtodo

espectrofotomtrico no UV (358 nm) para a determinao de metildopa em formulaes
farmacuticas utilizou reao com p-cloranil (KORANY; WAHBI, 1979). Entretanto, este
mtodo apresenta problemas relacionados necessidade de aquecimento por tempo
prolongado (30 minutos) e possibilidade de interferncias provenientes da matriz, os quais
tambm absorvem na regio do UV (KORANY; WAHBI, 1979).
57
Captulo III. Justificativa e Objetivos
58
A hipertenso arterial a mais comum das doenas cardiovasculares. Em 1998, as

doenas cardiovasculares foram responsveis por 27% dos bitos registrados no pas
(MINISTRIO DA SADE, 2006). O tratamento farmacolgico de pacientes hipertensos
visa reduzir a morbidade e a mortalidade decorrentes de doenas cardiovasculares. A terapia
com
anti-hipertensivos
previne,
consideravelmente,
acidentes
vasculares
cerebrais
hemorrgicos, insuficincia cardaca e insuficincia renal resultantes da hipertenso

(KANNEL, 1996). Dentre os medicamentos indicados para o tratamento da hipertenso
arterial destacam-se a furosemida, a hidroclorotiazida, o propranolol, o atenolol e a metildopa,
os quais so utilizados por grande parte da populao brasileira de hipertensos.
A RDC n 33 da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria/Ministrio da Sade, que
institui o Regulamento Tcnico sobre Boas Prticas de Manipulao de Medicamentos em
Farmcias, em seu Anexo I (Boas Prticas de Manipulao em Farmcias) (AGNCIA
NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA, 2000) estabelece que todos os itens que
comprovem a especificao das matrias primas e que garantam seu teor, pureza e integridade
devem ser re-analisados pelo setor de Controle de Qualidade da Farmcia para certificao do
laudo de anlise do fornecedor (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA,
2000). Um grande problema mundial a falsificao e adulterao de medicamentos
consumidos pela populao. O uso destes medicamentos representa um risco para a sade das
pessoas. No Brasil, este problema foi detectado em 1998, quando uma variedade de
medicamentos, tais como contraceptivos orais, antibiticos, antineoplsicos, e antipirticos
foram falsificados com srias consequncias. Assim, a anlise de formulaes farmacuticas
tem como objetivo no somente o controle de qualidade, mas tambm demonstrar a
idoneidade do produto.
Diversos mtodos tm sido desenvolvidos para a anlise de furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol, atenolol e metildopa em formulaes farmacuticas.
59
Entretanto, a maioria dos mtodos descritos na literatura, de modo geral, envolve mtodos por
CLAE convencional, a qual requer instrumentao complexa e de alto custo, alm de um
excessivo tempo de anlise e necessidade de grandes volumes de solventes orgnicos txicos.
Outra tcnica muito utilizada para a determinao dos frmacos envolvidos neste
estudo a espectrofotometria no UV e no visvel. Todavia, os mtodos espectrofotomtricos
baseados em medidas diretas no UV esto sujeitos a interferncias provenientes da matriz.
Assim, a maioria dos mtodos por espectrofotometria no UV derivativa e envolve,
geralmente, a determinao de diversos frmacos simultaneamente, os quais empregam
anlise multivariada, apresentando o inconveniente de necessitar conhecer todos os
componentes presentes na amostra que poderiam influenciar na resposta de absorbncia. Os
mtodos por espectrofotometria no visvel descritos para a determinao dos frmacos em
estudo apresentam problemas relacionados necessidade de etapas de aquecimento e de
derivatizao, tempo de anlise relativamente longo, instabilidade do composto colorido
formado e alguns so mtodos indiretos.
A partir das consideraes descritas acima, a necessidade de mtodos simples, rpidos,
de baixo custo e com baixo consumo de reagentes e solventes torna-se evidente,
especialmente para anlises de controle de qualidade de furosemida, hidroclorotiazida,
propranolol, atenolol e metildopa.
A combinao da espectroscopia de reflectncia difusa com spot test torna-se muito
atraente no desenvolvimento de mtodos analticos, uma vez que esta combinao fornece
medidas rpidas, simples, com baixo consumo de reagentes e solventes e baixa gerao de
resduos. Alm disso, pouca ateno havia sido dada espectroscopia de reflectncia difusa
como tcnica para anlises quantitativas. Atualmente esta tcnica tem sido empregada,
principalmente, em mtodos para a anlise de metais. No entanto, relatos do uso desta tcnica
para anlises de medicamentos ainda so incipientes.
60
Quando envolve reaes rpidas e medidas diretas, a espectrofotometria de absoro

molecular na regio do visvel consiste de uma tcnica muito til para anlises de frmacos.
Alm disso, existe a possibilidade de se adaptar mtodos espectrofotomtricos para
dispositivo porttil de medidas fotomtricas, tornando-os prticos para serem usados, por
exemplo, em farmcias de manipulao.
Desta forma, os objetivos deste trabalho foram:
Desenvolver
mtodos
analticos
para
determinao
de
furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em formulaes farmacuticas por espectroscopia de

reflectncia difusa utilizando spot test.
Desenvolver mtodo analtico para a determinao de metildopa em formulaes
farmacuticas por espectrofotometria na regio do visvel e adaptao do mtodo para uso em
dispositivo porttil de medidas fotomtricas.
Aplicar os mtodos desenvolvidos na anlise de formulaes farmacuticas
disponveis comercialmente e comparar os resultados obtidos pelos mtodos propostos com
queles obtidos por mtodos oficiais.
61
Captulo IV - Espectroscopia de reflectncia difusa em

combinao com spot test para anlises quantitativas
62
IV. 1. SPOT TEST

H muitas dcadas os spot tests tm sido discutidos e explorados, principalmente, em
anlises clnicas, testes de controle da qualidade do ar, em anlises de gua e alimentos, em
prospeces geoqumicas e em anlises forenses (JUNGREIS, 1997). Os spot tests envolvem,
basicamente, a mistura de algumas gotas de uma soluo contendo a substncia de interesse
com algumas gotas de uma soluo contendo o reagente formando um produto colorido. O
meio para a reao pode ser um suporte de superfcie porosa, por exemplo, papel de filtro ou
slica gel (JUNGREIS, 1997). Historicamente, Friedlieb Ferdinand Runge, qumico alemo,
considerado um dos importantes pioneiros no uso de papel de filtro como suporte para reaes
qumicas (ANFT, 1955). Schnbein e Goppelsroeder (1861) e Schiff (1859) tambm so
citados na literatura como pioneiros, mas a reao mais antiga descrita quela realizada por
Runge em 1822 (ANFT, 1955). Tal reao foi desenvolvida a partir de um estudo para avaliar
o poder de branqueamento de solues alvejantes atravs de um teste para detectar a presena
de cloro em tais solues. O teste ocorreu sobre uma superfcie de papel de filtro impregnado
com amido e iodeto de potssio. Quando gotas da soluo alvejante foram adicionadas sobre o
papel, uma mancha azul apareceu na superfcie devido liberao de iodo e sua reao com o
amido (ANFT, 1955). Esta , provavelmente, a reao de spot test mais antiga utilizando
papel de filtro impregnado e antecede o teste desenvolvido por Schiff, o qual detectou cido
rico utilizando papel impregnado com carbonato de amnio (ANFT, 1955; JUNGREIS,
1997). Posteriormente, Fritz Feigl se destacou como um grande estudioso das anlises por
spot test de substncias orgnicas e inorgnicas, tendo estudado reaes mais sensveis e
seletivas e publicado diversos livros cientficos (FEIGL, 1966, 1958).
Uma vez que os spot tests levam formao de um produto colorido, eles podem ser
usados para anlises qualitativas - quando a deteco da substncia de interesse se d
visualmente pela presena de cor; para anlises semi-quantitativas na quais escalas de cores,
63
feitas com padres analticos de diferentes concentraes, so utilizadas para comparao

com a intensidade de cor do teste e para anlises quantitativas, utilizando, por exemplo,
instrumentos para medir a luz refletida, neste caso, a espectroscopia de reflectncia difusa.
Para anlises semi-quantitativas ou quantitativas, importante que o procedimento para a
realizao do spot test seja bem elaborado, visando obteno de uniformidade na cor da
mancha formada e, conseqentemente, uma boa preciso das medidas. Detalhes importantes
da execuo do spot test envolvem o controle do volume da soluo a ser adicionada
utilizando micropipetas ou microsseringas e da velocidade da adio das solues, bem como
a escolha da ordem de adio que resulte em maior uniformidade da mancha colorida formada
(GHAUCH et al., 2000; TUBINO; ROSSI; MAGALHES, 1997; JUNGREIS, 1997).
O fato dos spot tests serem procedimentos especialmente rpidos, simples e que
apresentam baixo consumo de reagentes e solventes o tornam muito interessantes para o
desenvolvimento de mtodos analticos, principalmente do ponto de vista da Qumica Verde,
a qual tem interesse por mtodos e tcnicas que reduzem ou eliminam o uso e a gerao de
substncias prejudiciais sade humana ou ao meio ambiente (ANASTAS, 1999).
Atualmente, a espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot tests tem sido utilizada
com sucesso em anlises quantitativas (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; DMITRIENKO et
al., 2002; FRITZ et al., 2003; GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a, 2004b; GHAUCH et al.,
1999, 2000; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTNEZ; CAMPNSFALC, 2005; MOLINER-MARTNEZ; HERREZ-HERNANDEZ; CAMPNS-FALC,
2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993; NARAYANASWAMY, 1993;
OLIVEIRA; SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHES, 1997; TUBINO; SOUZA,
2006; ZAPOROZHETS; GAWER; SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS et al., 1999;
ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).
64
IV. 2. ASPECTOS TERICOS DA ESPECTROSCOPIA DE REFLECTNCIA DIFUSA
A percepo ptica dada por uma substncia qumica baseada em sua interao com
a luz. Absoro, emisso e reflexo ou espalhamento so os trs fenmenos mais comumente
empregados para medidas analticas (GHAUCH et al., 2000).
Ao contrrio da espectroscopia de absoro que h muito tempo vm apresentando
amplo uso como tcnica de anlise quantitativa, a espectroscopia de reflectncia difusa tem
sido pouco estudada. Durante muitos anos, o uso da espectroscopia de reflectncia difusa foi
limitado s reas txteis, de papel, cermica, tintas e pigmentos como tcnica analtica de
controle de qualidade para avaliar cor, brancura e brilho das superfcies brancas ou coloridas.
Por exemplo, na indstria txtil, durante a produo de tecidos tingidos, amostras de tecidos
so retiradas para avaliar se a tonalidade est sendo mantida, sempre tendo como referncia o
espectro de reflectncia. Na indstria de papel, alm da cor, a brancura e brilho tambm so
avaliados (WENDLANDT; HECHT, 1966). A espectroscopia de reflectncia difusa foi
considerada uma tcnica invivel para anlises quantitativas, uma vez que no era possvel
alcanar boa preciso das medidas obtidas a partir de spot tests convencionais (KEALEY,
1972). De acordo com Kealey (1972) as medidas de reflectncia obtidas a partir de spot tests
convencionais apresentavam preciso relativa entre 10 e 20% e, portanto, resultados
quantitativos foram considerados inviveis. Entretanto, com os avanos tecnolgicos na rea
de dispositivos pticos, incluindo fibras pticas e esferas de integrao, medidas de
reflectncia puderam ser obtidas com bons resultados de preciso (GHAUCH et al., 2000;
TUBINO; ROSSI; MAGALHES, 1997).
65
IV. 2.1. Fundamentos

Segundo as teorias discutidas por Wendlant e Hecht (1966) a reflexo da radiao
sobre uma superfcie pode ser de dois tipos: especular ou tipo espelho e difusa. Para que se
possa utilizar a reflectncia como tcnica analtica necessrio entender os tipos de reflexo.
A reflexo especular ou tipo espelho ocorre em superfcies lisas ou polidas e pode ser
definida pela lei de reflexo de Fresnel. Neste tipo de processo os ngulos de incidncia e de
reflexo so idnticos e no h transmisso da radiao atravs da superfcie (WENDLANT;
HECHT, 1966).
Ao contrrio da reflexo especular, a reflexo difusa acontece em superfcies foscas ou
opacas e ocorre por reflexes mltiplas a partir das superfcies das partculas que constituem o
meio. A reflexo difusa compreende um processo complexo que ocorre quando a radiao
penetra em um substrato slido. Parte desta radiao retorna superfcie do substrato,
ocorrendo tambm disperso mltipla e absoro parcial da radiao pelas partculas ou fibras
que constituem o substrato slido (WENDLANT; HECHT, 1966).
A reflectncia ou poder de reflexo (R) dada por:
R=
I
,
I0
onde:
(Equao 1)
R o sinal que representa a radiao refletida e que pode ser registrado por detectores, tais
como uma fotomultiplicadora ou arranjo de fotodiodos.
I 0 = intensidade da radiao incidente
I = intensidade da radiao refletida

Os valores de R variam entre 0 e 1 e so normalmente expressos em termos de
reflectncia percentual R (%) , isto :
R=
I
100
I0
(Equao 2)
66
Considera-se R igual a 1 quando o sinal de reflectncia igual ao da radiao

incidente, condio que pode ser conseguida utilizando um padro de reflectncia mxima,
geralmente pastilhas de BaSO4 e MgO (WENDLANT; HECHT, 1966).
IV. 2.2. Teoria de Kubelka-Munk

Diversos modelos foram desenvolvidos para descrever, em termos quantitativos, a
intensidade da radiao refletida difusamente (SKOOG, 2002). A teoria de Kubelka-Munk o
modelo mais aceito que relaciona concentrao da amostra e reflectncia. Esta teoria descreve
a relao entre coeficiente de absoro molar, coeficiente de disperso e poder de reflectncia
em um meio semi-infinito (infinitamente fino) de acordo com a seguinte equao:
(1 R) 2 k
f ( R) =
= ,
2.R
s
onde:
(Equao 3)
k = coeficiente de absoro molar
s = coeficiente de disperso
Para amostras diludas, k est relacionado absortividade molar () e concentrao

(C) pela relao:
k = 2,303 .C
(Equao 4)
Para a aplicao adequada da equao de Kubelka-Munk necessria a determinao

da reflectncia absoluta do material usado como referncia (REINECKE et al., 1988).
Entretanto, a relao linear entre f ( R) e concentrao somente observada na prtica
para substncias que absorvem fracamente e quando o tamanho das partculas que constituem
o meio relativamente pequeno (1 m de dimetro interno) (FREI; MACNEIL, 1973).
Atualmente, diversos grficos tm sido descritos para anlises quantitativas envolvendo
transformaes matemticas da varivel dependente (sinal) e/ou independente (concentrao),
67
tais como: log R versus C 2 R ; R versus [C /(1 C ) 2 ] ; log R versus 1 / C ; e R versus

log C (TUBINO; ROSSI; MAGALHES, 1997).
Vale mencionar que em anlises por espectroscopia de reflectncia difusa, o sinal de
reflectncia pode ser convertido em densidade ptica para medida de reflectncia ( AR ), que
dada por:
AR = log(1 / R)
(Equao 5)
III. 2.3. Instrumentos

Os instrumentos para medida de reflectncia podem ser acessrios acoplados a um
espectrofotmetro ou podem ser equipamentos portteis. Em geral, os instrumentos para
medidas de reflectncia contm os seguintes componentes: fonte de luz, suporte para amostra
e para padro branco usado como referncia, esfera de integrao, espelhos, detector e
registrador. A Figura 6 apresenta um esquema de um acessrio de reflectncia Labsphere,
modelo RSA-HP-53.
Figura 6. Vista superior do acessrio de reflectncia Labsphere modelo RSA-HP-53

Fonte: LABSPHERE. RSA-HP-53 instruction manual. North Sutton, [1999?]. p. 4.
68
A esfera de integrao consiste de uma esfera revestida internamente por uma camada
de material altamente refletor. Antigamente, as esferas de integrao eram fabricadas com
material metlico revestido com tinta branca ou p de MgO ou de BaSO4 prensado. Os
revestimentos utilizados atualmente so materiais brancos de politetrafluoroetileno (PTFE) ou
outros termoplsticos (Spectralon) (STORM; SPRINSTEEN, 2006). As propriedades de
reflectncia de uma amostra envolvem a determinao da distribuio espacial da radiao
refletida, com relao intensidade e ao estado de polarizao. A esfera de integrao tem a
funo de coletar e integrar espacialmente o fluxo de radiao refletida por uma superfcie.
Assim, a intensidade da luz refletida em qualquer ponto da esfera corresponde medida do
fluxo total de radiao refletida pela superfcie. Desta forma possvel obter o fluxo de luz
refletida integrado total, o qual utilizado para as medidas de reflectncia (LABSPHERE,
2006).
Os equipamentos para medidas de reflectncia podem apresentar esferas de integrao
de diferentes tamanhos. Esferas com dimetro interno maior so mais eficazes na integrao
da luz e as medidas so mais exatas do que esferas de menor dimetro interno. Os
equipamentos para medidas de reflectncia tambm podem apresentar diferentes geometrias,
podendo levar a valores de reflectncia diferentes para uma mesma amostra em dois
equipamentos com geometrias distintas. Isto ocorre devido a diferenas nos ngulos de
incidncia e de reflexo, os quais so muito importantes para as medidas da reflectncia
difusa (WENDLANDT; HECHT, 1966).
IV. 2.4. Representao do espectro de reflectncia

Os espectros de reflectncia podem ser apresentados de vrias maneiras. Os grficos
so comumente obtidos a partir de R (%) , f (R) ou AR (log(1 / R) em funo do comprimento
de onda (nm). A Figura 7 apresenta trs espectros obtidos a partir de um mesmo equipamento
69
para medidas de reflectncia (acessrio Labsphere, modelo DRA-CA-3300) e de um mesmo

papel de filtro colorido, sobre o qual ocorreu a reao entre bumetanida e pdimetilaminocinamaldedo, em meio cido (POLLO, 2006), sendo que a Figura 7a representa
o espectro obtido a partir de R (%) , a Figura 7b o espectro de log (1/R) ( AR ) e a Figura 7c o
espectro de f ( R) versus comprimento de onda (nm).
(a)
Comprimento de onda (nm)
(b)
(c)
Figura 7. Espectros de reflectncia obtidos a partir do produto da reao de spot test entre butenamida
e p-dimetilaminocinamaldedo, em meio cido. As anlises foram realizadas utilizando um
acessrio de reflectncia Labsphere, modelo DRA-CA-3300. Concentrao de butemanida
= 1,37 10-3 mol L-1. Figura 7a. Espectro de reflectncia obtido a partir dos valores de %R.
Figura 7b. Espectro de reflectncia obtido a partir dos valores de log(1 / R) . Figura 7c.
Espectro de reflectncia obtido a partir dos valores de f ( R )
70
Para compreender as diferenas entre os espectros apresentados na Figura 7, basta

converter R (%) em f ( R) e em log(1 / R) , de acordo com as Equaes 3 e 5. Desta forma,
pode-se entender porque o espectro de R (Fig. 7a) deve apresentar-se invertido em relao aos
outros espectros (Fig. 7b e 7c).
III. 2.5. Aplicaes da espectroscopia de reflectncia difusa para anlises

quantitativas
Diversos mtodos por espectroscopia de reflectncia difusa, na regio do visvel, para
anlises quantitativas tm sido descritos na literatura (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003;
BEROZA; HILL; NORRIS, 1968; BRADDOCK; MAREC, 1966; DMITRIENKO et al.,
2002; FRITZ et al., 2003; FRODYMA; FREI, 1964, 1965, 1969; GAZDA; FRITZ; PORTER,
2004a, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; KEALEY, 1972, 1974, 1976, 1977; KIRK;
MOSS; VALENTIN, 1968; LIEU et al., 1967; LIEU; ZAYE; FRODYMA, 1969; LIEU;
FRODYMA, 1966; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003, 2004; MOLINER-MARTNEZ;
CAMPNS-FALC,
2005;
MOLINER-MARTNEZ;
HERREZ-HERNANDEZ;
CAMPNS-FALC, 2005; NADZHAFOVA et al., 2005; NAKANO et al., 1993;

NARAYANASWAMY; SEVILLA III; 1986; NARAYANASWAMY, 1993; OLIVEIRA;
SALIBA, 1994; TUBINO; ROSSI; MAGALHES, 1997; TUBINO; SOUZA, 2006;
ZAPOROZHETS;
GAWER;
SUKHAN,
1998;
ZAPOROZHETS
et
al.,
1999;
ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002; ZAYE; FREI; FRODYMA, 1967). O grfico

apresentado na Figura 8 apresenta o resultado de um levantamento realizado, no perodo de
1960 at 2006, nas principais bases de dados, sobre mtodos que empregaram a
espectroscopia de reflectncia difusa, na regio visvel do espectro, para anlises
quantitativas.
71
16
Nmero de publicaes
14
12
10
8
6
4
2
0
60
70
80
90
20002006
Dcadas
Figura 8. Distribuio das publicaes de mtodos por espectroscopia de reflectncia difusa na regio
do visvel para anlises quantitativas. Perodo: 1960-2006.
Podemos observar (Figura 8) que muitos artigos foram publicados na dcada de 60 e,

talvez pela dificuldade em obter resultados com boa preciso naquela poca, o nmero de
publicaes diminuiu e s voltou a aumentar na dcada de 90, provavelmente, devido aos
avanos tecnolgicos e facilidade de se obter medidas mais precisas, alm da preocupao
em se desenvolver mtodos simples, rpidos e com baixo consumo de reagentes e solventes.
Atualmente, o nmero de publicaes envolvendo a espectroscopia de reflectncia difusa na
regio do visvel para anlises quantitativas vem aumentando consideravelmente (Figura 8).
Algumas destas anlises envolvem a determinao de metais sobre superfcie de papel de
filtro (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004b; GHAUCH et al., 1999, 2000; TUBINO; ROSSI;
MAGALHES, 1997).
72
O mtodo descrito por Tubino, Rossi e Magalhes (1997) foi proposto para a
determinao de Fe(III), Cr(VI) e Ni(II). Ghauch et al. (1999) descreveram um mtodo
semelhante para a determinao de Co(II), Cu(II), Fe(III) e Ni(II). Fosfato, amnio e Cu(II)
tambm foram determinados por espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot test em
papel de filtro (GHAUCH et al., 2000).
A espectroscopia de reflectncia difusa associada extrao em fase slida (EFS)
tambm tem sido descrita na literatura. Gazda, Fritz e Porter (2004b) desenvolveram um
mtodo para a determinao de Ni (II) em amostras de gua a bordo da Estao Espacial
Internacional. Outros mtodos utilizando EFS acoplada a espectroscopia de reflectncia difusa
foram propostos para a quantificao de aminas alifticas (MOLINER-MARTNEZ;
CAMPNS-FALC, 2005), iodo (GAZDA; FRITZ; PORTER, 2004a) e iodeto, Ag (I), Cu
(II), Ni (II), Fe (III), Cr (VI) e outros ctions (ARENA; PORTER; FRITZ, 2003; FRITZ et al.,
2003; MOLINER-MARTNEZ; HERREZ-HERNANDEZ; CAMPNS-FALC, 2005) em
amostras de gua. Slica gel impregnada com reagentes analticos tambm tem sido associada
espectroscopia de reflectncia difusa para a determinao de diversos metais
(NADZHAFOVA et al., 2005; ZAPOROZHETS et al., 1999; ZAPOROZHETS; GAWER;
SUKHAN, 1998; ZAPOROZHETS; TSYUKALO, 2002).
Alm disso, a espectroscopia de reflectncia difusa tem oferecido a possibilidade da
construo em laboratrio de dispositivos portteis para anlises quantitativas (MATIAS;
OLIVEIRA; MOSCHIM, 1997; MATIAS; VILA; TUBINO, 2003). Um sensor de fibra ptica
porttil foi desenvolvido por Matias, Oliveira e Moschim (1997) para analisar a fumaa
proveniente de motores de veculos a diesel. O sensor funciona por amostragem da fumaa
sobre a superfcie de uma fita adesiva branca, seguida da medida da luz refletida pela fita
marcada. Um outro dispositivo porttil empregando o fenmeno da reflectncia difusa foi
desenvolvido para a determinao de Ni (II) em catalisadores (MATIAS; VILA; TUBINO,
73
2003). O mtodo foi baseado na clssica reao entre Ni (II) e dimetilglioxima, em meio
alcalino (NH4OH), a deteco foi realizada por um LDR (light dependent resistor) e a medida
da resistncia por um multmetro, a qual foi correlacionada com a reflectncia.
Recentemente, a espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot test sobre papel
de filtro foi empregada para a determinao de alguns frmacos em formulaes
farmacuticas (GOTARDO et al., 2004; GOTARDO; PEZZA; PEZZA, 2005; MATIAS;
VILA; TUBINO, 2004; TUBINO; SOUZA, 2006).
O mtodo descrito por Matias, Vila e Tubino (2004) para a determinao de cido
acetilsaliclico envolveu uma reao de complexao do cido saliclico, obtido a partir da
hidrlise alcalina do frmaco, com ons Fe (III). O complexo colorido foi submetido anlise
em um reflectmetro homemade, composto por um LED (light emitting diode) e um LDR e
medidas de resistncia foram obtidas. Um mtodo utilizando um reflectmetro semelhante foi
descrito por Tubino e Souza (2006) para a determinao de diclofenaco em formulaes
farmacuticas.
Os estudos citados acima revelaram que o uso apropriado da espectroscopia de
reflectncia difusa forneceu resultados quantitativos confiveis, demonstrando o potencial
desta tcnica para anlises quantitativas.
74
Captulo V. Desenvolvimento de mtodos analticos por

espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot
test para a determinao de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em
formulaes farmacuticas.
75
V. 1. PARTE EXPERIMENTAL
V. 1.1. Equipamentos
Acessrio para reflectncia Labsphere RSA-HP-53, contendo esfera de integrao (76
mm de dimetro interno) e lmpada de tungstnio-halognio (5W), acoplado a um
espetrofotmetro de arranjo de diodos HP-8453A.
Os mtodos de referncia foram realizados utilizando espectrofotmetro UV-Visvel
Cary 1E, com cubetas de quartzo de 1,0 cm de caminho ptico.
Estufa com controle de temperatura - Tecnal, Modelo TE-392.
Agitador magntico Corning.
Micropipetas Eppendorf (10 a 100 L) e Brand (100 a 1000 L).
V. 1.2. Material e Solventes

Papel de filtro quantitativo Whatman 41 e 42 foram usados como suporte slido no
mtodo para a determinao de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente. Papel de
filtro qualitativo Whatman 42 foi usado nos mtodos para a determinao de propranolol e
atenolol.
Os excipientes utilizados nos estudos de interferncias foram de grau farmacutico.
Os solventes utilizados nos mtodos para a determinao de furosemida e
hidroclorotiazida foram acetona (grau p.a.) e metanol (grau HPLC) (Mallinckrodt, Xalostoc,
Mxico). No mtodo para a determinao de atenolol foi usado metanol grau HPLC (J.T.
Baker, Phillipsburg, EUA) e dioxano (grau p.a.) (Tedia, Fairfield, EUA). Os solventes usados
no mtodo para a determinao de propranolol foram acetona (grau p.a.), etanol (grau HPLC)
(Mallinckrodt, Xalostoc, Mxico) e gua desionizada.
76
V. 1.3. Reagentes e Solues

Nos mtodos para a determinao de furosemida e hidroclorotiazida, pdimetilaminocinamaldedo (PDAC) (p.a., Riedel-de han, Alemanha) foi usado para preparar
a soluo de PDAC 2,23 10-1 mol L-1 em metanol. Esta soluo foi mantida refrigerada por,
no mximo, uma semana. Solues de cido clordrico 6,3% (m/v) (1,73 mol L-1) e 10% (m/v)
(2,75 mol L-1) foram preparadas por diluio adequada do cido clordrico concentrado (37%)
(p.a., Mallinckrodt, Xalostoc, Mxico) em metanol e empregadas nos mtodos para a
determinao de furosemida e hidroclorotiazida, respectivamente.
No mtodo para a determinao de atenolol foi utilizado p-cloranil (Sigma, St Louis,
EUA) no preparo de uma soluo 8,00 10-2 mol L-1 em dioxano. Esta soluo foi preparada
diariamente.
No mtodo para a determinao de propranolol, 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida
(DCQ) ou reagente de Gibbs (p.a., Sigma, St. Louis, E.U.A.) foi usado para preparar uma
soluo 3,33 10-1 mol L-1 (70 mg/ml) em acetona. Esta soluo foi preparada diariamente.
Soluo estoque de furosemida (Purifarma, So Paulo, Brasil), grau de pureza de
100,1%, foi preparada na concentrao de 1,52 10-1 mol L-1 em acetona. Solues padro
foram obtidas a partir de diluies da soluo estoque de furosemida em acetona e usadas na
construo da curva analtica (7,56 10-3 a 6,05 10-2 mol L-1).
Soluo estoque de hidroclorotiazida (Purifarma, So Paulo, Brasil), grau de pureza de
99,85%, foi preparada na concentrao de 1,68 10-1 mol L-1 em acetona. Solues padro
foram obtidas a partir de diluies da soluo estoque de hidroclorotiazida em acetona e
usadas na construo da curva analtica (3,36 10-2 a 1,01 10-1 mol L-1).
Soluo estoque de propranolol (Purifarma, So Paulo, Brasil), grau de pureza de
99,80%, foi preparada na concentrao de 1,68 10-1 mol L-1 em soluo de etanol 35% (v/v)
em gua. Solues padro foram obtidas a partir de diluies da soluo estoque de
77
propranolol em etanol 35% (v/v) e usadas na construo da curva analtica (1,35 10-2 a 8,45
10-2 mol L-1).
Soluo estoque de atenolol (Purifarma, So Paulo, Brasil), grau de pureza de 99,90%,

foi preparada na concentrao de 2,25 10-1 mol L-1 em metanol. Solues padro foram
obtidas a partir de diluies da soluo estoque de atenolol em metanol e usadas na
construo da curva analtica (1,13 10-2 a 7,88 10-2 mol L-2).
Todas as solues estoque foram preparadas no momento do uso.
V. 1.4. Amostras
As amostras comerciais das formulaes farmacuticas (comprimidos) analisadas
foram obtidas em farmcias locais e analisadas dentro dos seus prazos de validade.
O nmero de marcas comerciais de formulaes farmacuticas analisadas para cada
um dos frmacos estudados e o contedo de frmaco declarado pelo fabricante em cada
comprimido esto apresentados na Tabela 7.
Tabela 7. Nmero de marcas comerciais de formulaes farmacuticas analisadas em cada mtodo

desenvolvido e contedo declarado de frmaco por comprimido.
Furosemida
Hidroclorotiazida
Propranolol
Atenolol
N Marcas Analisadas
Contedo Declarado
40
50
40
25, 50 e 100
(mg/comprimido)
78
V. 2. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
V. 2.1. Spot test
Para a realizao dos spot tests, as solues foram adicionadas sobre a superfcie de
papel de filtro, cortado em quadrados com rea de, aproximadamente, 2 cm2. O papel foi
colocado na parte inferior de um suporte (Figura 9), de acordo com o procedimento descrito
por Tubino, Rossi e Magalhes (1997) com o auxlio de uma pina. As solues foram
adicionadas no centro do papel de filtro utilizando uma micropipeta adaptada ao suporte.
Figura 9. Suporte utilizado na realizao dos spot tests (Baseado em: TUBINO; ROSSI;
MAGALHES, 1997).
A seguir so descritos os procedimentos para a realizao dos spot tests em cada

mtodo desenvolvido:
Furosemida:
Inicialmente, 10 L da soluo contendo o frmaco foram adicionados sobre a

superfcie do papel de filtro, seguidos da adio de 20 L da soluo de HCl (6,3%, m/v) e de
20 L da soluo de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. Em seguida, o papel de filtro foi
aquecido a 80C por 5 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento
foi necessrio para a formao do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de
reflectncia difusa em 585 nm.
79
Hidroclorotiazida:

superfcie do papel de filtro, seguidos da adio de 20 L da soluo de HCl (10%, m/v) e de
20 L da soluo de PDAC (0,4%, m/v), nesta ordem. O papel de filtro foi ento aquecido a
80C por 8 minutos em uma estufa com controle de temperatura. O aquecimento foi
necessrio para a formao do produto colorido, que foi analisado por espectroscopia de
reflectncia difusa em 585 nm.
Propranolol:

superfcie do papel de filtro, seguidos da adio de 30 L da soluo de DCQ (3,33 10-1 mol
L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectncia difusa em 500 nm.
Atenolol:

superfcie do papel de filtro, seguidos da adio de 20 L da soluo de p-cloranil (8,00 10-2
mol L-1). O produto colorido foi analisado por espectroscopia de reflectncia difusa em 550
nm.
V. 2.2. Preparao das Amostras

Em todos os mtodos desenvolvidos, vinte comprimidos (do mesmo lote), de cada
uma das amostras comerciais estudadas, foram pesados em balana analtica e finamente
triturados em gral de gata. O valor da massa de um comprimido foi expresso como a mdia
de 20 determinaes, com variao menor que 2% (FARMACOPIA..., 1988).
80
Quantidades de amostra equivalentes a 100, 150, 80 e 120 mg de furosemida,

hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram pesadas com preciso de
0,0001 g e submetidas agitao com o solvente adequado (acetona para furosemida e
hidroclorotiazida; etanol 35% (v/v) para propranolol e metanol para atenolol) em um agitador
magntico por 10 minutos. Aps a agitao, as solues foram adicionadas em bales
volumtricos de 10,00 mL e o volume foi completado com o solvente adequado. Alquotas
destas solues foram retiradas para a realizao dos spot tests, conforme descrito no item
V.2.1. O branco contendo apenas o solvente e os reagentes foi utilizado como referncia e
analisado nas mesmas condies.
V. 2.3. Estudo de Interferncias

Uma vez que o objetivo deste trabalho foi determinar o frmaco (furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol) em formulaes farmacuticas (comprimidos), o
efeito dos excipientes mais comumente utilizados foi cuidadosamente avaliado.
Em todos os mtodos desenvolvidos, os excipientes estudados foram amido, talco,
lactose, estearato de magnsio, etilcelulose, dixido de silcio e croscarmelose sdica. No
mtodo para a determinao de atenolol foram ainda estudados os excipientes lauril sulfato de
sdio e celulose microcristalina.
O procedimento para o estudo de interferncias, em todos os mtodos desenvolvidos,
descrito a seguir:
Uma determinada quantidade de frmaco (50, 120, 80 ou 120 mg de furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol ou atenolol, respectivamente) e cada um dos excipientes,
separadamente, em quantidade igual e dez vezes maior de frmaco foram submetidos ao
procedimento descrito no item V. 2.2.
81
V. 2.4. Estudo de Adio e Recuperao

Em todos os mtodos desenvolvimentos foi realizado um estudo de adio e
recuperao de frmaco padro, o qual envolveu o seguinte procedimento:
s amostras contendo massa equivalente a 50, 100, 80 e 60 mg de furosemida,
hidroclorotiazida, propranolol e atenolol, respectivamente, foram adicionadas quantidades de
frmaco padro, de forma a se obter solues com concentraes finais que abrangessem a
faixa de linearidade da curva analtica (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). Para todos
os mtodos, as quantidades adicionadas de frmaco padro corresponderam a 50, 100, 150 e
200% da massa de frmaco presente na amostra. Ao bquer contendo amostra e frmaco
padro foi adicionado o solvente adequado, seguindo o procedimento descrito no item V. 2.2.
A Tabela 8 apresenta as quantidades - em massa (mg) e em concentrao final (mol L-1) - de
frmaco padro adicionado nas amostras.
Tabela 8. Quantidades adicionadas de frmaco padro dadas em mg e em concentrao (mol L-1).
Frmaco
Quantidades adicionadas de frmaco padro

(mg)
(mol L-1)
Furosemida
25
50
75
100
7,56 10-3
1,51 10-2
2,27 10-2
3,02 10-2
Hidroclorotiazida
50
100
150
200
1,68 10-2
3,36 10-2
5,04 10-2
6,72 10-2
Propranolol
40
80
120
160
1,35 10-2
2,70 10-2
4,05 10-2
5,40 10-2
Atenolol
30
60
90
120
1,13 10-2
2,25 10-2
3,38 10-2
4,50 10-2
82
V. 2.5. Determinao de perxido de hidrognio em dioxano: mtodo modificado

No desenvolvimento do mtodo reflectomtrico para a determinao de atenolol foi
realizada a quantificao de perxido de hidrognio no dioxano utilizado como solvente para
o p-cloranil. Para tal, foi inicialmente empregado o mtodo espectrofotomtrico descrito por
Benatsky e Tomik (1988) para determinao de perxidos em solventes orgnicos, o qual
baseado na reao de perxido com metavanadato de amnio e cido ntrico concentrado,
formando um composto colorido ( mx. = 450 nm) (BENATSKY; TOMIK, 1988). Entretanto,
durante o emprego do mtodo observou-se que a etapa de extrao descrita no era necessria,
uma vez que o dioxano e a soluo contendo metavanadato de amnio misturaram-se de
forma homognea. Alm disso, a quantidade de perxido na amostra de dioxano no era
conhecida. Desta forma, a quantificao foi realizada pelo mtodo das adies de padro e
com algumas modificaes no mtodo descrito na literatura (BENATSKY; TOMIK, 1988),
como segue:
A soluo reagente foi preparada a partir da dissoluo de 0,6250 g de metavanadato
de amnio em 3,75 mL de cido ntrico concentrado. O volume foi completado com gua
desionizada em balo volumtrico de 25,00 mL. A 5,00 mL de amostra de dioxano foram
adicionados individualmente 0,50, 1,00, 2,00, 3,00 e 4,00 mL de uma soluo padronizada de
perxido de hidrognio (2,37 10-2%, m/m). Em seguida, adicionou-se 10,00 mL da soluo
de reagente e o volume foi completado para 25,00 mL em balo volumtrico. As solues
foram analisadas por espectrofotometria em 450 nm.
83
V. 3. RESULTADOS E DISCUSSO
V. 3.1. Determinao de furosemida em formulaes farmacuticas
V. 3.1.1. Spot test
O mtodo proposto foi baseado em medidas de reflectncia, na regio visvel do

espectro, do composto violeta formado a partir da reao entre furosemida e PDAC, em meio
cido (HCl). A reao ocorreu sobre superfcie de papel de filtro, aps aquecimento a 80C
por 5 minutos. A Figura 10 apresenta o espectro de reflectncia com valor mximo de AR em
585 nm.
0,6
0,5
0,4
AR
0,3
0,2
0,1
0,0
400
500
600
700
800

Figura 10. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre furosemida e PDAC, em meio
cido, aps aquecimento a 80C por 5 min. O comprimento de onda mximo foi 585 nm.
Soluo padro de furosemida: 3,78 10-2 mol L-1.
O PDAC tem apresentado um amplo uso como reagente cromognico em anlises

espectrofotomtricas de diversos compostos, tais como: uria, tiouria e seus N-alquil/aril
derivados (HUSSAIN; SHAUKAT, 2002), aceclofenaco (ZAWILLA et al., 2002),
diclofenaco de sdio (EL-SHERIF et al., 1997), oxifenbutazona (SAEED; HAQUE;
84
QURESHI, 1993), glafenina e metoclopramida (MOUSSA, 2000). O PDAC tambm tem sido
usado para anlises, em micro-placas, de cido p-aminohiprico em amostras de plasma e
urina (AGARWAL, 2002) e para testes rpidos de benzodiazepinas em medicamentos
(LAUDSZUN; KOVAR, 1991). A maioria dos mtodos mencionados acima envolve reao
em meio cido com aquecimento, produzindo compostos coloridos (variando de laranja a
vermelho ou rosa).
O PDAC tambm foi descrito na literatura para a determinao espectrofotomtrica de
furosemida (SHIMDDA; NAGASE, 1977). Uma provvel reao entre aminas secundrias
aromticas e PDAC envolve a condensao do grupo amino secundrio protonado com o
grupo carbonila do reagente, formando um sal imnio ou base de Schiff (EL-SHERIF et al.,
1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000). A reao apresentada no Esquema 1 foi
baseada em reaes entre outras aminas secundrias aromticas e PDAC descritas na
literatura (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al., 2002; MOUSSA, 2000).
85
CH 2
Cl
H 2NO2S
NH
CH 2
O
H+
COOH
CH3
NH 2
Cl
H2NO2S
OCH CH
CH
N
Ch3
COOH
PDAC
Furosemida
Rpido
CH 2
Cl
NH
HO
+
C CH
CH3
CH
N
CH3
H
H 2NO2S
COOH
Rpido
+
CH2
Cl
+
NH
OH O
C CH
CH 3
CH
N
CH 3
H
H 2NO2S
COOH
Rpido
Cl
H 2NO2S
CH2
O
+
NH C CH
CH 2
CH 3
CH
Cl
O
C CH
CH
+
N
CH 3
CH3
H2NO2S
COOH
COOH
Sal Imnio
Esquema 1
Um fato interessante no mtodo para a determinao de furosemida foi que a cor do

spot test obtido a partir da adio da soluo de furosemida, PDAC e HCl, nesta ordem, foi
mais intensa nas bordas do que no centro da mancha formada. Observou-se tambm que
quando a soluo de reagente foi adicionada por ltimo, a cor do spot test foi mais uniforme e
muito mais intensa.
CH 3
86
De acordo com Wendlandt e Hecht (1966) a cor do spot test deve ser uniforme sobre
toda a superfcie slida para se obter melhor preciso das medidas de reflectncia. Neste
sentido, cabe ressaltar que para a elaborao dos spot tests envolvidos em todos os mtodos
desenvolvidos neste trabalho levou-se em considerao alguns detalhes, tais como: ordem e
velocidade de adio das solues, qualidade do papel de filtro utilizado e volume das
solues adicionadas. Todos estes detalhes mostraram ser importantes para a uniformidade da
cor do spot test e, conseqentemente, para a obteno de boa preciso das medidas de
reflectncia.
V. 3.1.2. Planejamento Fatorial de Experimentos
Estudos foram realizados para estabelecer as condies mais favorveis para a reao
entre furosemida e PDAC, em meio cido (HCl), visando alcanar a intensidade mxima da
cor do spot test, sobre papel de filtro, em 585 nm. Uma vez que a necessidade de aquecimento
para o desenvolvimento da cor foi observada, os fatores inicialmente estudados foram tempo e
temperatura de aquecimento. Utilizando um planejamento fatorial de 2 nveis em torno das
condies utilizadas para a reao em testes preliminares (10 L de soluo de furosemida
3,02 10-2 mol L-1, 10 L de soluo de HCl 6,3%, m/v, 10 L de soluo de PDAC 0,4%
m/v e aquecimento aproximadamente 70C por 3 minutos) foi possvel variar os dois fatores
(tempo e temperatura de aquecimento) simultaneamente. A partir dos resultados obtidos neste
planejamento, foi realizado um planejamento de modo similar, no qual os fatores avaliados
foram volumes adicionados de PDAC e de HCl. Desta forma, os valores de AR (respostas)
obtidos com volumes fixos das solues de furosemida, PDAC e de cido adicionados foram
otimizados em funo do tempo e da temperatura de aquecimento. Do mesmo modo, para
tempo e temperatura de aquecimento e volume de furosemida fixos, as respostas (AR) foram
otimizadas em funo dos volumes adicionados de PDAC e de cido. As condies avaliadas
87
e os resultados obtidos esto apresentados na Tabela 9. Cada experimento foi realizado em

trs repeties. Brancos de reagentes correspondentes a cada um dos experimentos foram
realizados.
Tabela 9. Combinaes das variveis estudadas e resultados dos planejamentos 22 com ponto central.
Volume Adicionado (L)
Aquecimento
Tempo
(min.)
Temperatura
(C)
ARa
HClb
PDACc
ARa
60
0,25056
20
10
0,44373
80
0,42155
20
20
0,50385
70
0,32493
15
15
0,46108
60
0,21077
10
10
0,42623
80
0,36943
10
20
0,47133
Mdia de 3 determinaes
HCl 6,3% (m/v) em metanol
PDAC 0,4% (m/v) em metanol
Os resultados obtidos nos planejamentos fatoriais foram representados em grficos

tridimensionais, conforme Figura 11.
88
(A)
(B)
Figura 11. Grficos tridimensionais obtidos para estabelecer condies timas de tempo e temperatura
de aquecimento (A) e de volumes de PDAC e de cido adicionados (B).
Comparaes entre mdias foram realizadas utilizando ANOVA e a significncia

estatstica das diferenas entre as mdias foi estimada utilizando teste de Tukey (p0,05). Os
resultados demonstraram que as maiores medidas de reflectncia sem perda de uniformidade
da cor foram obtidas com aquecimento a 80C por 5 minutos, diferindo significativamente
daquelas obtidas com outros tempos de aquecimento e temperaturas. Cabe mencionar que spot
tests obtidos com aquecimento a 90C apresentaram reverso de cor do papel e no puderam
ser analisados. Por esta razo, o planejamento foi descontinuado. A partir dos resultados do
planejamento para avaliar volumes de PDAC e de HCl adicionados foi constatado que as
medidas de reflectncia obtidas com 20 L de PDAC e 20 L de HCl foram
significativamente maiores do que as outras condies estudadas. Analisando os grficos
tridimensionais possvel observar pontos referentes s condies escolhidas, as quais
mostraram os maiores valores de reflectncia (Figura 11).
89
V. 3.1.3. Estabilidade ptica
Com o objetivo de avaliar a estabilidade ptica do produto da reao entre furosemida

e PDAC, em meio cido, foi realizado um acompanhamento cintico do valor de AR em 585
nm a cada 5 minutos at 40 minutos aps a adio das solues no papel de filtro. Os
resultados obtidos demonstraram que no houve diferena significativa entre os valores de AR
obtidos nos diferentes perodos de tempo estudados. Portanto, a estabilidade ptica do produto
formado foi de, pelo menos 40 minutos, nas condies estudadas (Figura 12).
0,7
0,6
0,5
AR
0,4
0,3
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (minutos)
Figura 12. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre furosemida e PDAC, em meio
cido, aps aquecimento a 80C por 5 min. O comprimento de onda mximo foi 585 nm.
Soluo padro de furosemida: 3,78 10-2 mol L-1.
V. 3.1.4. Curva Analtica
A Figura 13 apresenta a curva analtica construda a partir de solues padro de

furosemida na faixa de concentrao de 7,56 10-3 a 6,05 10-2 mol L-1. Uma relao linear
(r = 0,9987) foi obtida pela representao grfica de AR versus log da concentrao de
furosemida (mo L-1). O fator 103 foi usado para ajustar a curva analtica com valores de log
maiores do que zero. Valores de AR para esta faixa de concentrao foram ajustados pela
90
equao: AR = -0,17768 + 0,41338 C, onde C = log [furosemida] 103 (mol L-1). O limite
3 DPB
de deteco foi 1,05 103 mol L-1
, sendo a = coeficiente angular da curva
a
analtica e DPB = desvio padro do branco para 10 repeties (LONG; WINEFORDNER,

1983).
0.70
0.65
0.60
0.55
AR
0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
-1
1.8
3
log ([furosemida]/mol L x 10 )
Figura 13. Curva analtica para a determinao de furosemida. Coeficiente de correlao linear (r) =
0,9987. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Faixa de concentrao das solues
padro de furosemida: 7,56 10-3 a 6,05 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios
padro para 3 repeties.
V. 3.1.5. Estudo de Interferncias
O estudo de interferncias foi realizado visando avaliar o efeito dos excipientes mais
comumente presentes na amostra. A porcentagem de furosemida encontrada nas solues
contendo o frmaco padro e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 96 a 104%, com
coeficientes de variao menores que 5% para trs repeties. Esses resultados foram
considerados aceitveis e, portanto, nenhuma interferncia foi constatada a partir destes
excipientes, nas condies estudadas.
91
V. 3.1.6. Estudo de Adio e Recuperao
Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulao farmacutica, a qual contm

todos os excipientes juntos) foram realizados testes de adio e recuperao de frmaco
padro utilizando 3 amostras de diferentes marcas comerciais de comprimidos. Os resultados
obtidos esto apresentados na Tabela 10. Para todas as amostras, os valores mdios de
recuperao (n=3) variaram de 96,7 a 104,6%, com desvios padro relativos entre 2,1 a 5,1%.
Essas variaes foram consideradas aceitveis, indicando que os componentes das
formulaes farmacuticas analisadas no influenciaram nas anlises.
Tabela 10. Resultados de recuperao de furosemida padro adicionada em amostras de trs

formulaes farmacuticas comerciais diferentes.
Amostras
Valor Adicionado
(mol L-1)
Valor Encontradoa
(mol L-1)
Recuperaoa
(%)
(1,510,07) 10-2
-3
7,56 10
(7,390,35) 10-3
97,8 4,6
1,51 10-2
(1,460,05) 10-2
96,73,3
2,27 10-2
(2,210,08) 10-2
97,43,5
3,02 10-2
(3,020,14) 10-2
100,04,6
(1,500,04) 10-2
-3
7,56 10
(7,420,24) 10-3
98,13,1
1,51 10-2
(1,580,05) 10-2
104,63,3
2,27 10-2
(2,210,10) 10-2
97,44,4
3,02 10-2
(2,970,06) 10-2
98,32,0
(1,510,05) 10-2
7,56 10-3
(7,510,38) 10-3
99,35,1
-2
1,51 10
(1,480,06) 10-2
98,04,0
2,27 10-2
(2,250,11) 10-2
99,14,9
3,02 10-2
(3,050,13) 10-2
101,04,3
Mdia Desvio padro (DP), n = 3.
92
V. 3.1.7. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia.
O mtodo proposto foi aplicado na determinao de furosemida em algumas

formulaes farmacuticas disponveis comercialmente e comparado com o mtodo para a
determinao de furosemida em comprimidos descrito na Farmacopia Britnica
(BRITISH, 2001), o qual baseado em medidas por espectrofotometria no UV (271 nm) e
envolve sucessivas diluies da amostra com NaOH 0,1 mol L-1. As anlises foram realizadas
em trs repeties e os resultados esto apresentados na Tabela 11.
Tabela 11. Determinao de furosemida em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Proposto
Amostrasa
Valor Encontradob
Mtodo de Referncia
Valor de t Valor de F
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
(2,78)c
(19,00)c
39,40,5
1,72
1,96
39,60,7
39,61,1
0,45
3,31
40,22,0
40,81,5
0,09
1,86
40,91,1
39,31,5
1,17
1,78
41,02,0
39,21,0
0,97
4,00
39,40,5
39,30,8
0,72
2,56
39,20,5
Valor Declarado: 40mg furosemida/comprimido.
Mdia Desvio padro (DP), n=3.
Valores tericos de t e F em nvel de confiana de 95%.
(mg/comprimido)
Os valores mdios de furosemida obtidos pelo mtodo proposto variaram de 39,2 a

40,8 mg/comprimido e os desvios padro de 0,5 a 1,5 mg/comprimido (Tabela 11). Para todas
as formulaes analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo de referncia e pelo mtodo
proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nvel de confiana de 95%. Em
todos os casos, os valores de t e de F calculados no excederam os valores tericos, indicando
que no houve diferena significativa entre os mtodos com relao preciso e exatido
(Tabela 11).
93
V. 3.1.8. Concluses
Este estudo revelou, pela primeira vez, a possibilidade de se empregar a

espectroscopia de reflectncia difusa, na regio do visvel, utilizando spot test na
determinao de furosemida em formulaes farmacuticas. A ordem de adio e os volumes
das solues de PDAC e de HCl influenciaram significativamente a reao. As melhores
condies para a reao foram obtidas a partir de 10 L de soluo de furosemida, 20 L da
soluo de HCl e 20 L da soluo de PDAC, nesta ordem de adio, e aquecimento a 80C
por 5 minutos. Este mtodo foi aplicado com sucesso na anlise de furosemida em amostras
de comprimidos de diferentes marcas comerciais. A espectroscopia de reflectncia difusa
utilizando spot test oferece vantagens sobre outras tcnicas usadas atualmente como
simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes. Assim, o desenvolvimento de mtodos
por espectroscopia de reflectncia difusa para a anlise de medicamentos encorajado neste
estudo.
94
V. 3.2. Determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas

V. 3.2.1. Spot test
O mtodo proposto foi baseado em medidas de reflectncia, na regio do visvel, do

composto rosa formado a partir da reao entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio cido
(HCl). A reao ocorreu sobre superfcie de papel de filtro, com aquecimento a 80C por 8
minutos. A Figura 14 apresenta o espectro de reflectncia com valor mximo de AR em 585
nm.
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
AR
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
400
500
600
700
800
Figura 14. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre hidroclorotiazida e PDAC, em
meio cido, aps aquecimento a 80C por 8 min. O comprimento de onda mximo foi 585
nm. Soluo padro de hidroclorotiazida: 4,20 102 mol L-1.
Este trabalho descreve, pela primeira vez, o uso de PDAC como reagente cromognico
para a determinao de hidroclorotiazida. Uma provvel reao entre hidroclorotiazida e
PDAC apresentada no Esquema 2, tendo como base aquelas descritas na literatura para a
determinao de aminas secundrias aromticas (EL-SHERIF et al., 1997; ZAWILLA et al.,
2002; MOUSSA, 2000), as quais envolvem a condensao do grupo amino secundrio
95
protonado com o grupo carbonila do PDAC, formando um sal imnio ou base de Schiff
(Esquema 2).
H 2NO2S
Cl
O2
S
NH
+
H
O2
S +
NH 2
H2NO2S
NH
Cl
CH 3
OCH CH
CH
N
Ch3
NH
PDAC
Hidroclorotiazida
Rpido
H2NO2S
O2
S
Cl
NH
NH
OH
+
C CH
CH3
CH
Ch3
Rpido
O2
S +
NH
H2NO2S
Cl
NH
CH 3
OH
C CH
CH
N
Ch3
Lento
H 2NO2S
Cl
O2
S +
NH
CH CH
CH
CH 3
H 2NO2S
O2
S
Ch3
Cl
NH
NH
CH CH
CH
CH3
Ch3
Sal Imnio ou Base de Schiff
Esquema 2
Sabendo que a ordem de adio das solues pode influenciar a uniformidade e a

intensidade da cor do spot test, este detalhe foi considerado, estudando-se todas as possveis
combinaes de ordens de adio das solues. Da mesma forma que no mtodo para a
determinao de furosemida, foi observado que o spot test apresentou uma cor mais uniforme
e intensa quando a soluo do analito foi inicialmente adicionada, seguida pela adio da
soluo do cido e, por ltimo, da soluo de reagente.
+
N
96

V. 3.2.2.1. Planejamento Fatorial Fracionrio: triagem de fatores
Presumindo que a reao entre hidroclorotiazida e PDAC, em meio cido (HCl)

poderia ser influenciada por vrios fatores, as condies mais favorveis para a reao sobre
papel de filtro foram investigadas visando alcanar a intensidade mxima da cor em 585 nm.
Planejamento fatorial fracionrio permitiu o estudo simultneo dos efeitos que diversos
fatores poderiam ter sobre a reao de spot test. Os fatores avaliados foram: tempo de
aquecimento, temperatura de aquecimento, volume de cido e volume de reagente. Todos os
experimentos foram realizados com soluo padro de hidroclorotiazida com concentrao de
6,72 10-2 mol L-1. Brancos de reagentes correspondentes a cada um dos experimentos foram
realizados. A Tabela 12 apresenta a matriz de planejamento e os valores de AR obtidos no
planejamento fatorial fracionrio para cada um dos experimentos.
Tabela 12. Matriz do planejamento fatorial fracionrio.
Fatores
Experimentos
Temperatura
(C)
Tempo
(min.)
60
10
Volume de
cido (L)a
20
60
20
20
0,17124
60
10
10
0,17355
90
10
20
0,19092
60
10
10
20
0,18475
90
10
20
20
90
10
10
10
90
20
10
0,19232
Soluo de HCl 10% (m/v)
Soluo de PDAC 0,4% (m/v)
Volume de
AR
b
PDAC (L)
10
0,18859
97
Deve-se mencionar que houve dificuldades para se realizar todos os experimentos,

uma vez que o papel no resistiu a temperaturas relativamente elevadas (prximas a 90C),
ocorrendo reverso de cor do papel e o espectro de reflectncia do produto colorido foi
diferente daquele apresentado pelo composto rosa formado com aquecimento em
temperaturas mais baixas. Por esta razo, os experimentos 6 e 7 (Tabelas 12) no foram
executados.
A partir dos resultados do planejamento fatorial fracionrio, o grfico de Pareto
(Figura 15) foi obtido para visualizao dos efeitos estimados dos fatores principais. Embora
nenhum dos fatores tivesse influncia significativa nenhuma barra (fator) ultrapassou a linha
de significncia pode ser notado que os efeitos estimados dos fatores tempo e temperatura
de aquecimento foram maiores do que os fatores volume de cido e volume de PDAC.
Portanto, tempo e temperatura de aquecimento foram considerados fatores mais importantes
do que volume de cido e de reagente e foram estudados em seguida.
(2)Tempo (min.)
-1,49178
(1)Temperatura (C)
-1,4085
(4)Volume de PDAC (uL)
-0,031754
(3)Volume de cido (uL)
0,0123232
p=.05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Figura 15. Grfico de Pareto do planejamento fatorial fracionrio para a reao entre hidroclorotiazida
e PDAC, sobre papel de filtro.
98
V. 3.2.2.2. Efeitos do tempo e temperatura de aquecimento
Para investigar os fatores tempo e temperatura de aquecimento foi realizado um

planejamento fatorial completo. A Tabela 13 mostra a matriz de planejamento que abrangeu
as mesmas condies utilizadas no planejamento anterior, porm, com um maior nmero de
nveis entre os valores mnimos e mximos e tambm contendo um ponto central (Tabela 13).
Tabela 13. Matriz do planejamento fatorial completo com ponto central.

Experimentos
Temperatura (C)
Tempo (min)
10
11
12
13
14
15
16
80 90
60
60
70
80
70
80
80
70
90
60
90
90
60
70
10
10
10
10
Vale mencionar que o aquecimento do papel de filtro contendo as solues no pde

ser mantido a 90C por mais do que 5 minutos. Por isso, as combinaes referentes
temperatura de 90C por 7, 8 e 10 minutos no foram realizadas.
A Figura 16 apresenta o grfico tridimensional obtido a partir dos resultados do
planejamento com ponto central. Analisando a superfcie obtida, possvel observar os pontos
referentes s condies escolhidas, os quais mostraram valores de AR mais altos e que
forneceram spot tests com maior uniformidade na cor.
99
0,2
0,18
0,16
0,14
0,12
Figura 16. Grfico tridimensional obtido no estabelecimento das melhores condies de tempo e
temperatura de aquecimento para a reao entre hidroclorotiazida e PDAC sobre papel de
filtro.
Como pode ser visto na Figura 16, as respostas de reflectncia mais altas foram
alcanadas com o aquecimento a 80C por 8 minutos. O formato da superfcie analisada
indicou a direo, na qual novos experimentos deveriam ser realizados. Entretanto, devido a
limitaes experimentais (tempos e temperaturas de aquecimento relativamente altas) o
planejamento no pde ser estendido para outras condies experimentais.
100
Com o objetivo de avaliar a estabilidade ptica do produto da reao entre

hidroclorotiazida e PDAC, em meio cido, foi realizado um acompanhamento cintico do
valor de AR em 585 nm a cada 5 minutos at 40 minutos aps a adio das solues no papel
de filtro. Os resultados obtidos demonstraram que no houve diferena significativa entre os
valores de AR obtidos nos diferentes perodos de tempo. Portanto, a estabilidade ptica do
produto formado foi de pelo menos 40 minutos, nas condies estudadas (Figura 17).
0,22
0,20
AR
0,18
0,16
0,14
0,12
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (minutos)
Figura 17. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre hidroclorotiazida e PDAC, em
meio cido, sobre papel de filtro. As anlises dos spot tests foram realizadas a cada 5
minutos at 40 minutos. Soluo padro de hidroclorotiazida: 1,01 10-1 mol L-1.
A Figura 18 apresenta a curva analtica construda a partir das solues padro de

hidroclorotiazida na faixa de concentrao de 3,36 10-2 a 1,01 10-1 mol L-1. Uma relao
linear (r = 0,9979) foi obtida representando-se graficamente AR versus log da concentrao de
hidroclorotiazida (mol L -1 ). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analtica com valores
de log maiores do que zero. Valores de A R para esta faixa de concentrao foram
101
ajustados pela equao: A R = -0,13487 + 0,17488 C, onde C = log [hidroclorotiazida]

3 DP
102 (mol L-1). O limite de deteco foi 1,07 102 mol L-1
, sendo a = coeficiente
a
angular da curva analtica e DPB = desvio padro do branco para 10 repeties (LONG;
WINEFORDNER, 1983).
0.22
0.20
AR
0.18
0.16
0.14
0.12
1.5
1.6
1.7
1.8
1.9
-1
2.0
2
log ([hidroclorotiazida]/mol L x 10 )
Figura 18. Curva analtica para a determinao de hidroclorotiazida. Coeficiente de correlao linear
(r) = 0,9979. Valores de AR foram obtidos em 585 nm. Concentraes das solues padro
de hidroclorotiazida: 3,36 10-2 a 1,01 10-1 mol L-1. As barras representam os desvios
comumente presentes na amostra. A porcentagem de hidroclorotiazida encontrada nas
solues contendo o frmaco padro e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 97 a
103% com coeficientes de variao menores que 5% para trs repeties. Esses resultados
foram considerados aceitveis e, portanto, nenhuma interferncia foi constatada a partir destes
102
Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulao farmacutica) foi realizado

um estudo de adio e recuperao de frmaco padro utilizando 3 amostras de diferentes
marcas comerciais de comprimidos. Os resultados obtidos esto apresentados na Tabela 14.
Para todas as amostras, os valores mdios de recuperao (n=3) variaram de 95,8 a 101,2%,
com desvios padro relativos entre 1,8 a 4,9%. Essas variaes foram consideradas aceitveis,
indicando que os componentes das formulaes farmacuticas analisadas no influenciaram
nas anlises.
Tabela 14. Resultados de recuperao de hidroclorotiazida padro adicionada em trs formulaes

farmacuticas comerciais diferentes.
Amostras
Valor Adicionadoa
(mol L-1)
Valor Encontradoa
(mol L-1)
Recuperaob
(%)
(3,360,12) 10-2
1,68 10
(1,610,08) 10-2
95,8 4,7
3,36 10
(3,300,11) 10-2
98,23,2
5,04 10
(5,060,13) 10
100,42,6
6,72 10
(6,710,28) 10
99,84,2
(3,350,15) 10-2
1,68 10-2
(1,650,06) 10-2
98,23,5
3,36 10-2
(3,330,10) 10-2
99,13,0
5,04 10-2
(5,010,09) 10-2
99,41,8
6,72 10-2
(6,740,19) 10-2
100,32,8
(3,340,14) 10-2
1,68 10-2
(1,700,05) 10-2
101,22,9
3,36 10
(3,340,09) 10-2
99,42,7
5,04 10
(5,000,18) 10-2
99,23,6
6,72 10
(6,750,19) 10-2
100,42,8
-2
-2
-2
-2
-2
-2
-2
-2
-2
103
V. 3.2.7. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia.
O mtodo proposto foi aplicado na determinao de hidroclorotiazida em seis

determinao de hidroclorotiazida em comprimidos descrito na Farmacopia Britnica
(BRITISH, 2001), o qual baseado em medidas por espectrofotometria no UV (273 nm) e
envolve sucessivas diluies da amostra com NaOH 0,1 mol L-1. As anlises foram realizadas
em trs repeties e os resultados esto apresentados na Tabela 15.
Tabela 15. Determinao de hidroclorotiazida em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Proposto
Amostras
Mtodo de Referncia
Valor Encontradob Valor de t

(mg/comprimido)
(2,78)c
Valor de F
(19,00)c
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
49,22,2
0,23
18,66
49,5 0,5
48,51,8
0,11
1,92
48,31,3
49,52,6
0,62
13,80
48,6 0,7
51,52,6
0,53
1,69
50,5 2,0
50,01,0
1,62
6,25
49,10,4
48,81,7
0,38
2,52
48,12,7
Valor Declarado: 50 mg hidroclorotiazida/comprimido.
Os valores mdios de hidroclorotiazida obtidos pelo mtodo proposto variaram de 48,5

a 51,5 mg/comprimido e os desvios padro de 1,0 a 2,6 mg/comprimido (Tabela 15). Para
todas as formulaes analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo de referncia e pelo
mtodo proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nvel de confiana de 95%.
Em todos os casos, os valores de t e de F calculados no excederam os valores tericos,
104
indicando que no houve diferena significativa entre os mtodos com relao preciso e
exatido (Tabela 15).
V. 3.2.8. Concluses
O mtodo proposto demonstrou ser uma interessante alternativa aos outros

procedimentos existentes para a anlise de comprimidos contendo hidroclorotiazida. Os
resultados do planejamento fatorial de experimentos indicaram que tempo e temperatura de
aquecimento foram os fatores mais importantes para a reao de spot test, influenciando
significativamente na resposta de reflectncia. As melhores condies para a reao foram
obtidas a partir de 20 L de soluo de hidroclorotiazida, 20 L de soluo de HCl e 20 L de
soluo de PDAC, nesta ordem de adio, e aquecimento a 80C por 8 minutos. Este mtodo
foi aplicado com sucesso na anlise de hidroclorotiazida em amostras de comprimidos de
diferentes marcas comerciais. Comparando o mtodo proposto com os outros mtodos
descritos para a determinao de hidroclorotiazida em comprimidos, este mtodo oferece
vantagens relacionadas simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes, preenchendo os
requisitos para o controle de qualidade de medicamentos.
105
V. 3. 3. Determinao de propranolol em formulaes farmacuticas

V. 3.3.1. Spot Test
Desde 1927, a 2,6-dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) ou reagente de Gibbs tem sido

comumente utilizada para a determinao de fenis (GIBBS, 1927). O reagente de Gibbs
tambm tem tido aplicao para a deteco de aminas e hidrocarbonetos aromticos por
cromatografia em camada delgada (ROSS, 1968). Recentemente, o uso de DCQ tem sido
descrito para a deteco de produtos oxigenados resultantes da biotransformao de substratos
aromticos (QUINTANA; DIDION; DALTON, 1997) e para a determinao de frmacos, tais
como: ranitidina (EMMANUEL; HALDANKAR, 1989), cefadroxil (SASTRY; RAO;
PRASAD, 1997), mequitazina (EL-RAGEHY; BADAWEY; EL-KHATEEB, 2002),
tolnaftato (SASTRY et al., 1993) e D-penicilamina (AL-MAJED, 1999), que um produto
caractertisco da degradao cida dos antibiticos -lactmicos. Vale ressaltar que este
trabalho descreve, pela primeira vez, o uso de DCQ como reagente cromognico para a
determinao de propranolol.
Considerando que o propranolol possui um grupo naftol substitudo, uma possvel
reao entre propranolol e DCQ, com base na literatura (SASTRY et al., 1993), apresentada
no Esquema 3.
Esquema 3
106
A reao apresentada no Esquema 3 foi baseada na reao entre tolnaftato e DCQ

(SASTRY et al., 1993), a qual envolve um acoplamento oxidativo que ocorre com o ataque
eletroflico do reagente de Gibbs na posio orto do radical naftol substitudo presente no
propranolol, formando um produto colorido.
Neste trabalho, a reao entre propranolol e DCQ produziu um composto colorido na
superfcie do papel de filtro, cujo espectro de reflectncia, com valor mximo de AR em 500
nm, apresentado na Figura 19.
0,8
0,7
0,6
0,5
AR
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
400
500
600
700
800
Figura 19. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre propranolol e DCQ. Os spot
tests foram analisados 10 minutos aps a adio das solues sobre o papel de filtro. O
comprimento de onda mximo foi 500 nm. Soluo padro de propranolol: 8,45 102
mol L-1.
Estudos foram realizados para estabelecer as condies mais favorveis para a reao
entre propranolol e DCQ, sobre papel de filtro, visando alcanar a intensidade mxima da cor
do spot test em 500 nm. Todos os experimentos foram realizados com soluo de propranolol
na concentrao de 8,45 10-2 mol L-1.
107
Inicialmente, um planejamento fatorial completo foi realizado, o qual permitiu estudar

simultaneamente trs fatores que poderiam ter um efeito importante na reao de spot test. Os
fatores de interesse foram: solvente para DCQ, solvente para propranolol e concentrao de
DCQ. O solvente para DCQ foi fixado em 3 nveis: acetona, dioxano e acetonitrila; o solvente
para propranolol tambm foi fixado em 3 nveis: gua, etanol e metanol; e a concentrao de
DCQ em 2 nveis: 20 e 60 mg mL-1. Os experimentos no foram realizados na ordem em que
aparecem na Tabela 16 e sim de forma aleatria dentro do conjunto de experimentos, em 2
repeties. Vale mencionar que, em todo o planejamento, brancos correspondentes a cada um
dos experimentos foram realizados. A Tabela 16 apresenta a matriz de planejamento, bem
como os valores de resposta obtidos no planejamento fatorial completo gerado a partir das
combinaes dos trs fatores estudados, em todos os nveis. Os valores reais correspondentes
aos nveis de cada fator foram codificados com algarismos arbicos (1 a 3) visando remover
as unidades e facilitar a execuo dos experimentos.
108
Tabela 16. Matriz e resultados do planejamento fatorial completo.
Fatores
Resposta
Solvente para
Solvente para
Concentrao de
DCQb
propranololc
DCQd
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Experimentosa
Cada experimento foi realizado de forma randmica e em 2 repeties.

1 para acetona; 2 para dioxano e 3 para acetonitrila.
c
1 para gua; 2 para etanol e 3 para metanol.
d
1 para 20 mg mL-1 e 2 para 60 mg mL-1.
b
AR (500 nm)
0,45827
0,46291
0,52982
0,54688
0,45689
0,46431
0,63241
0,62032
0,33285
0,32345
0,44207
0,42421
0,44081
0,41312
0,50337
0,50874
0,32340
0,41373
0,69243
0,64733
0,26266
0,26624
0,38232
0,41455
0,40156
0,44656
0,51053
0,49586
0,33905
0,32723
0,59637
0,57535
0,31383
0,28374
0,40421
0,39086
109
A partir dos resultados do planejamento fatorial completo, o grfico de Pareto (Figura

20) foi obtido para visualizao dos efeitos estimados dos fatores principais. O grfico de
Pareto fornece uma representao grfica para estes fatores e permite olhar a magnitude e a
importncia de um efeito. Neste grfico, as barras (fatores) que graficamente ultrapassam a
linha de significncia exercem uma influncia estatisticamente significativa sobre o resultado.
Assim, pode ser claramente observado na Figura 20, que todos os fatores exerceram efeito
significativo sobre a resposta. Concentrao de DCQ foi o fator que teve maior influncia,
seguida pelo solvente para propranolol e, em menor extenso, solvente para DCQ.
(3)Concentrao de DCQ
11,09
(2)Solvente para Propranolol
(1)Solvente para DCQ
-8,78132
-2,56093
p=.05
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Figura 20. Grfico de Pareto do planejamento fatorial completo para a reao entre propranolol e
DCQ, sobre papel de filtro.
Concentrao de DCQ foi o fator mais importante entre todos os fatores investigados e
teve um elevado valor positivo. Este fato indicou que as maiores respostas foram obtidas com
soluo de DCQ na concentrao de 60 mg mL-1. Assim, valores de concentrao mais altos
foram investigados no planejamento experimental seguinte, o qual foi do tipo composto
central.
110
Observou-se tambm no grfico de Pareto (Figura 20) que o solvente para propranolol
teve um efeito significativo e negativo, indicando que as maiores respostas foram obtidas com
o uso de gua. Uma interessante observao foi que misturas etanol-gua dissolviam melhor o
propranolol do que estes solventes separadamente. Por esta razo, no planejamento composto
central misturas etanol-gua, em propores variando de 0 a 70% (v/v) foram avaliadas e a
possibilidade de se utilizar metanol como solvente para propranolol foi eliminada.
O grfico de Pareto (Figura 20) tambm demonstrou que o solvente para DCQ teve um
significativo, mas baixo efeito negativo sobre a resposta, indicando que as maiores respostas
foram obtidas com acetona. Considerando estes resultados e lembrando que se tratam de
fatores qualitativos, a acetona foi ento selecionada para ser o solvente para DCQ.
Com base nos resultados obtidos no planejamento fatorial completo, um planejamento
composto central foi ento delineado visando obter as melhores condies para a reao. Os
fatores estudados foram concentrao de DCQ e solvente para propranolol. Os pontos (nveis)
de um planejamento composto central esto a uma distncia de
2 unidade codificada do
ponto central (normalmente codificado como ponto zero); desta forma todos os pontos esto
sobre uma circunferncia com raio
2 . A Tabela 17 apresenta a matriz usada para o
planejamento composto central e os valores de resposta para cada um dos experimentos. O

experimento correspondente ao ponto central foi realizado em quatro repeties.
111
Tabela 17. Matriz e resultados obtidos no planejamento composto central.
Fatores
Concentrao de DCQ
Resposta
(mg mL )
Solvente para
Propranolol
% (v/v) Etanol em gua a
AR (500 nm)
20 (-1)
10% (-1)
0,46570
80 (+1)
10% (-1)
0,53543
20 (-1)
60% (+1)
0,46486
80 (+1)
60% (+1)
0,54286
50 (0)
35% (0)
0,55065
50 (0)
35% (0)
0,56264
50 (0)
35% (0)
0,55828
50 (0)
35% (0)
0,56023
10 (- 2 )b
35% (0)
0,38359
10
90 (+ 2 )b
35% (0)
0,53933
11
50 (0)
0% (gua) (- 2 )b
0,43494
12
50 (0)
70% (+ 2 )b
0,43496
Experimentos
-1 a
Os valores codificados esto entre parnteses.
Os valores experimentais foram aproximados a
2 para facilitar a preparao das solues.
A metodologia de superfcie de resposta uma poderosa ferramenta experimental para

otimizar parmetros mltiplos e inter-relacionados. No desenvolvimento deste mtodo,
experimentos foram conduzidos de forma a alcanar valores de cada um dos fatores estudados
(variveis independentes) que fornecessem maiores valores de AR (varivel dependente). Os
valores da varivel dependente foram medidos para cada uma das condies da varivel
independente (concentrao de DCQ e solvente para propranolol). Em seguida, uma
superfcie de resposta foi obtida.
A Figura 21 apresenta o grfico tridimensional obtido a partir dos dados experimentais
e ajustados a uma superfcie de resposta.
112
Figura 21. Superfcie de resposta obtida no planejamento composto central para valores de AR em
funo da concentrao de DCQ e mistura etanol-gua (%, v/v) como solvente para
propranolol.
O modelo de regresso quadrtico (valor de p < 0,0005), em termos de fatores

escalonados dado por:
Z = 0,291554 + 0,005377 x 0,000039 x 2 + 0,005151y 0,000075 y 2
(Equao 7)
onde, Z o fator de resposta correspondente ao valor de AR. Os fatores x e y so:

concentrao de DCQ e solvente para propranolol, respectivamente.
O coeficiente de regresso calculado (R2) foi 81%, indicando que a equao obtida
explica a relao entre os resultados experimentais e os efeitos dos fatores estudados.
Nota-se pelo formato da superfcie que a regio tima foi encontrada e tambm que as
respostas mximas foram alcanadas com concentrao de DCQ 70 mg mL-1 e etanol 35%
(v/v) como o solvente para propranolol.
113
Cabe mencionar que a ordem de adio das solues para o spot test foi considerada e
que as seguintes combinaes foram estudadas: adio da soluo do frmaco, seguida pela
adio da soluo de reagente e o inverso. Observou-se que o spot test apresentou cor mais
intensa e uniforme quando a soluo de reagente foi adicionada inicialmente e seca ao ar,
seguida pela adio da soluo de frmaco.
Os resultados obtidos no estudo de estabilidade ptica do produto formado na reao

entre propranolol e DCQ demonstraram que no houve diferena significativa entre os valores
de AR obtidos no perodo de 10 a 60 minutos aps a adio das solues no papel de filtro.
Portanto, a estabilidade ptica do produto formado foi de pelo menos 50 minutos, nas
condies estudadas (Figura 22).
0,65
0,60
0,55
0,50
AR
0,45
0,40
0,35
0,30
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (minutos)
Figura 22. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre propranolol e DCQ. As anlises
dos spot tests foram realizadas a cada 2 minutos at 60 minutos. Soluo padro de
propranolol: 8,45 10-2 mol L-1.
114

propranolol na faixa de concentrao de 1,35 10-2 a 8,45 10-2 mol L-1. Uma relao linear
(r = 0,9991) foi obtida representando-se graficamente AR versus log da concentrao de
propranolol (mol L -1 ). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analtica para valores de log
maiores que zero. Valores de A R para a faixa de concentrao estudada foram
ajustados pela equao: A R = 0,114360 + 0,421087 C, onde C = log [propranolol] 102
3 D PB
, sendo a = coeficiente
(mol L-1). O limite de deteco foi 8,16 103 mol L-1
a
angular da curva analtica e DPB = desvio padro do branco para 10 repeties (LONG;
WINEFORDNER, 1983).
0.55
0.50
0.45
AR
0.40
0.35
0.30
0.25
0.20
0.15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
-1
1.0
log ([propranolol]/mol L x 10 )
Figura 23. Curva analtica para determinao de propranolol. Coeficiente de correlao linear (r) =
0,9991. Valores de AR foram obtidos em 500 nm. Concentraes das solues padro de
propranolol: 1,35 10-2 a 8,45 10-2 mol L-1. As barras representam o desvio padro para
3 repeties.
115
comumente presentes na amostra. A porcentagem de propranolol encontrado nas solues
contendo o frmaco padro e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 94 a 103% com

Para todas as amostras os valores mdios de recuperao (n=3) variaram de 95,0 a 104,7%,
nas anlises.
116
Tabela 18. Resultados de recuperao de propranolol adicionado em formulaes farmacuticas.
Amostras
Valor Adicionadoa
Valor Encontradoa
Recuperaoa
(mol L-1)
(mol L-1)
(%)
(2,650,10) 10-2
-2
1,35 10
(1,290,02) 10-2
95,41,5
2,70 10-2
(2,680,06) 10-2
99,32,4
4,05 10-2
(4,240,08) 10-2
104,72,1
5,40 10-2
(5,530,14) 10-2
102,52,5
(2,680,10) 10-2
1,35 10-2
(1,320,03) 10-2
97,52,4
2,70 10-2
(2,560,120 10-2
95,04,6
4,05 10-2
(4,140,14) 10-2
102,33,4
5,40 10
(5,460,01) 10-2
101,20,2
(2,700,10) 10-2
1,35 10-2
(1,360,06) 10-2
100,74,6
-2
2,70 10
(2,660,12) 10-2
98,44,4
4,05 10-2
(3,950,08) 10-2
97,51,9
5,40 10-2
(5,320,15) 10-2
98,62,8
-2
V. 3.3.7. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia
O mtodo proposto foi aplicado na determinao de propranolol em algumas

determinao de propranolol em comprimidos descrito na Farmacopia Britnica
(BRITISH, 2001), o qual baseado na espectrofotometria no UV (290 nm) e envolve
sucessivas diluies da amostra com metanol. As anlises foram realizadas em trs repeties
e os resultados esto apresentados na Tabela 19.
117
Tabela 19. Determinao de propranolol em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Proposto
Mtodo de Referncia
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
Valor de t
(2,78)c
Valor de F
(19,00)c
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
38,90,3
1,06
2,67
38,50,5
41,01,5
0,88
1,86
40,11,1
39,70,4
1,60
6,02
38,61,1
38,01,1
1,10
9,16
38,1 0,4
41,02,4
0,72
1,44
39,72,0
37,40,5
0,47
1,04
38,60,5
Amostrasa
Valor Nominal: 40 mg propranolol/comprimido

Os valores mdios de atenolol obtidos pelo mtodo proposto variaram de 37,4 a 41,0
mg/comprimido, com desvios padro de 0,30 a 2,38 mg/comprimido (Tabela 19). Para todas
as formulaes analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo de referncia e pelo proposto
foram comparados aplicando-se testes t e F, com nvel de confiana de 95%. Em todos os
casos, os valores de F e de t calculados no excederam os valores tericos, indicando que no
houve diferena significativa entre os mtodos com relao preciso e exatido (Tabela 19).
V. 3.3.8. Concluses
Este trabalho demonstrou, pela primeira vez, o uso de DCQ como reagente
cromognico para a determinao de propranolol e tambm da espectroscopia de reflectncia
difusa utilizando spot test como uma interessante alternativa aos outros procedimentos
existentes para a anlise de comprimidos contendo propranolol. Planejamento fatorial foi
empregado a fim de se otimizar as condies para a reao de spot test e as melhores
condies foram obtidas a partir de 30 L de soluo de propranolol em etanol 35% (v/v) e 30
118
L de soluo de DCQ 70 mg/mL em acetona. O mtodo proposto foi aplicado com sucesso
na anlise de propranolol em amostras de comprimidos de diferentes marcas comerciais. Os

resultados obtidos pelo mtodo proposto mostraram boa concordncia quando comparados
com queles obtidos pelo mtodo da Farmacopia Britnica, indicando que no h diferena
significativa entre ambos mtodos com relao preciso e exatido. O mtodo proposto
oferece vantagens relacionadas simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes sobre os
outros mtodos descritos para determinao de propranolol em comprimidos, podendo ser
recomendado para anlises de rotina no controle de qualidade de medicamentos.
119
V. 3. 4. Determinao de atenolol em formulaes farmacuticas

V. 3.4.1. Spot Test
O p-cloranil (2,3,5,6-tetracloro-p-benzoquinona) tem sido usado como reagente

cromognico para a determinao de diversos frmacos, tais como: sulfato de isoprenalina e
metildopa (KORANY; WAHBI, 1979), fluoxetina e sertralina (BEBAWY et al., 1999),
salbutamol (BAKRY et al., 1996), nortriptilina (ATTIA, 2000), antidepressivos (IBRAHIM et
al., 1983) e beta-bloqueadores, entre eles, o atenolol (SALEM, 2002). Estes mtodos so
baseados na interao entre doadores de eltrons (frmacos) e p-cloranil, o qual age como
aceptor de eltrons formando complexos de transferncia de carga intensamente coloridos
(FOSTER, 1968; SALEM, 2002).
Baseando-se na reao entre atenolol e p-cloranil em soluo, previamente descrita na
literatura (SALEM, 2002), realizou-se esta reao em papel de filtro, a qual resultou no
aparecimento imediato de cor, a qual foi utilizada no desenvolvimento de spot tests
quantitativos. A Figura 24 apresenta o espectro de reflectncia com valor mximo de AR em
550 nm.
120
0,6
0,5
0,4
AR
0,3
0,2
0,1
0,0
400
500
600
700
800
Figura 24. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre atenolol e p-cloranil. O
comprimento de onda mximo foi em 550 nm. Soluo padro de atenolol: 7,88 102
mol L-1.
Sabendo que reaes envolvendo p-cloranil podem ser aceleradas com o uso de H2O2
(WEINERT et al., 2004) e que o dioxano um solvente peroxidvel (JACKSON et al., 1970),
a concentrao de perxido presente no dioxano utilizado neste estudo foi determinada. A
quantificao foi realizada com base no mtodo espectrofotomtrico descrito por Benatsky e
Tomik (1988) para a determinao de perxido em solventes orgnicos, o qual envolve reao
com metavanadato de amnio e cido ntrico concentrado, resultando em um composto
colorido (450 nm). Os resultados obtidos revelaram que o dioxano analisado continha 0,0016
g% (m/v) de H2O2, que foi uma quantidade menor que aquela descrita nas especificaes no
rtulo que de 0,005 g% (m/v) (dioxano p.a - Tedia, Fairfield, EUA).
121
V. 3.4.2. Efeito da concentrao de p-cloranil no spot test
O efeito da concentrao de p-cloranil na resposta (AR) foi estudado utilizando

planejamento univariado, tendo sido fixada a concentrao de atenolol em 7,88 10-2 mol L-1.
Os resultados obtidos no planejamento univariado esto apresentados na Figura 25.
0,5
0,4
0,3
AR
0,2
0,1
0,0
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
-1
Concentrao de p-cloranil (mol L )
Figura 25. Efeito da concentrao de p-cloranil na resposta (AR). As barras representam os desvios
Observando o grfico podemos notar que a adio da soluo padro de atenolol sem
p-cloranil (primeiro ponto do grfico) no apresentou resposta de reflectncia, indicando que
no houve reao entre o analito e componentes do papel. Tambm podemos observar que os
valores de AR obtidos aumentaram continuamente conforme o aumento da concentrao de pcloranil at 8,00 10-2 mol L-1. Com a adio de solues de p-cloranil em concentraes
maiores do que 8,00 10-2 mol L-1 a resposta de reflectncia (AR) estabilizou, no tendo
122
ocorrido diferena significativa entre as concentraes de 8,00 10-2, 1,00 10-1 e 1,20 10-1
mol L-1. Porm, com a adio da soluo de p-cloranil a 1,4 10-1 mol L-1 os valores de AR
foram menores e significativamente diferentes de todas as demais (p<0,05). Assim, os
resultados obtidos indicaram que a soluo de p-cloranil na concentrao de 8,00 10-2 mol
L-1 foi suficiente para que a reao de spot test se completasse, sendo, portanto, a
concentrao escolhida.
Os resultados obtidos no estudo de estabilidade ptica do produto formado na reao

de spot test entre atenolol e p-cloranil demonstraram que no houve diferena significativa
entre os valores de AR obtidos nos diferentes perodos de tempo estudados. Portanto, a
estabilidade ptica do produto formado foi de pelo menos 40 minutos, nas condies
estudadas (Figura 26).
0,45
0,40
0,35
AR
0,30
0,25
0,20
0,15
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (minutos)
Figura 26. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre atenolol e p-cloranil. As anlises
dos spot tests foram realizadas no tempo zero, aps 1 minuto e a cada 2 min. at 40 min.
Soluo padro de atenolol: 7,88 10-2 mol L-1.
123

atenolol na faixa de concentrao de 1,01 10-2 a 7,88 10-2 mol L-1. Uma relao linear
(r = 0,9992) foi obtida pela representao grfica de AR versus log da concentrao de
atenolol (mol L-1). O fator 102 foi usado para ajustar a curva analtica com valores de log
maiores do que zero. Valores de AR para esta faixa de concentrao foram ajustados pela
equao: AR = 0,13469 + 0,32613 C, onde C = log [atenolol] 102 (mol L-1). O limite de
3 DPB
deteco foi 2,80 103 mol L-1
, sendo a = coeficiente angular da curva analtica e
a
DPB = desvio padro do branco para 10 repeties (LONG; WINEFORDNER, 1983).
0,45
0,40
0,35
AR
0,30
0,25
0,20
0,15
0,0
0,2
0,4
0,6
2
0,8
1,0
-1
-1 L ) 2
[atenolol] x 10 L
(mol
loglog([atenolol]/mol
10 )
Figura 27. Curva analtica para a determinao de atenolol. Coeficiente de correlao linear (r) =
0,9992. Valores de AR foram obtidos em 550 nm. Concentraes das solues padro de
atenolol: 1,13 10-2 a 7,88 10-2 mol L-1. As barras representam os desvios padro para 3
repeties.
124
comumente presentes na amostra. A porcentagem de atenolol encontrado nas solues
contendo o frmaco padro e cada um dos excipientes, separadamente, foi de 99 a 104%, com

Para todas as amostras os valores mdios de recuperao (n=3) variaram de 95,3 a 104,0%,
nas anlises.
125
Tabela 20. Resultados de recuperao de atenolol padro adicionado em trs formulaes

farmacuticas comerciais diferentes.
Amostras
Valor Adicionadoa
(mol L-1)
Valor Encontrado
(mol L-1)a
Recuperao
(%)a
(2,230,06) 10-2
-2
1,13 10
(1,100,19) 10-2
97,00,2
2,25 10-2
(2,170,08) 10-2
96,73,8
3,38 10-2
(3,250,03) 10-2
96,10,9
4,50 10-2
(4,580,13) 10-2
101,92,9
(2,220,04) 10-2
1,13 10-2
(1,080,01) 10-2
95,80,6
2,25 10-2
(2,340,09) 10-2
104,04,2
3,38 10-2
(3,270,03) 10-2
96,80,9
4,50 10-2
(4,360,08) 10-2
97,01,8
(2,160,08) 10-2
1,13 10-2
(1,080,03) 10-2
95,33,0
2,25 10-2
(2,220,04) 10-2
98,71,8
3,38 10-2
(3,220,07) 10-2
95,42,0
4,50 10-2
(4,410,12) 10-2
98,12,7
V. 3.4.7. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia
O mtodo proposto foi aplicado na determinao de atenolol em algumas formulaes

farmacuticas disponveis comercialmente e comparado com o mtodo para a determinao
de atenolol em comprimidos descrito na Farmacopia Britnica (BRITISH, 2001), o qual
baseado na espectrofotometria no UV em 275 nm e envolve aquecimento a 60C por 15
minutos e diluies com metanol. As anlises foram realizadas em trs repeties e os
resultados esto apresentados na Tabela 21.
126
Tabela 21. Determinao de atenolol em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Proposto
Amostras
Mtodo de Referncia
Valor Encontradob Valor de t

(mg/comprimido)
(2,78)c
Valor de F
(19,00)c
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
98,61,3
1,23
6,76
99,5 0,5
98,41,5
0,21
9,00
98,60,5
47,81,3
0,25
10,56
48,00,4
49,11,6
0,01
3,16
49,1 0,9
24,10,4
0,87
5,06
24,60,9
Valor Declarado: Amostras A e B: 100 mg atenolol/comprimido; Amostras C e D: 50 mg de
atenolol/comprimido; Amostra E: 25 mg de atenolol/comprimido.

b
Para todas as formulaes analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo de referncia

e pelo proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nvel de confiana de 95%.
Em todos os casos, os valores de F e de t calculados no excederam os valores tericos,
exatido (Tabela 21).
V. 3.4.8. Concluses
Este estudo demonstrou o uso da espectroscopia de reflectncia difusa utilizando spot

tests para o controle de qualidade de atenolol em comprimidos. O mtodo envolveu um
procedimento de spot test muito simples, no qual 20 L da soluo contendo o frmaco e 20

L da soluo de reagente (p-cloranil) foram adicionados em papel de filtro. A reflectncia do
produto colorido foi medida a 550 nm. Um planejamento univariado foi realizado, resultando
na escolha da melhor concentrao de p-cloranil que foi de 8,0 102 mol L-1. O mtodo foi
aplicado com sucesso na determinao de atenolol em amostras de comprimidos de diferentes
127
marcas comerciais, apresentando bons resultados de preciso e exatido quando comparados

ao mtodo da Farmacopia Britnica. Desta forma, este trabalho apresenta uma proposta
vivel de mtodo para a anlise de atenolol em comprimidos, oferecendo vantagens
relacionadas simplicidade, rapidez e baixo consumo de reagentes e de solventes.
128
Captulo VI. Desenvolvimento de mtodo analtico por

espectrofotometria na regio do visvel para a
determinao de metildopa em formulaes farmacuticas
129
VI. 1. PARTE EXPERIMENTAL

VI. 1.1. Equipamentos
As medidas de absorbncia, tanto para o mtodo proposto como para o mtodo da
Farmacopia Brasileira, foram realizadas utilizando um espectrofotmetro UV-Visvel Cary
1E, com cubetas de vidro de 1,0 cm de caminho ptico.
Agitador magntico Corning.
Micropipetas Eppendorf (10 a 100 L) e Brand (100 a 1000 L).
VI. 1.2. Reagentes e Solues

Os excipientes usados no estudo de interferentes foram de grau farmacutico. Os
solventes utilizados foram acetona (grau p.a.) e metanol (grau HPLC) (Mallinckrodt,
Xalostoc, Mxico). p-Cloranil (p.a., Sigma, St. Louis, USA) foi usado para preparar
diariamente uma soluo 4,07x10-2 mol L-1 (1,0%, m/v) em acetona. Soluo de perxido de
hidrognio 4,55 mol L-1 foi preparada por diluio adequada de peridrol 30% (Merck,
Darmstadt, Alemanha) e padronizada conforme descrito na literatura (OHLWEILER, 1982).
Soluo estoque de metildopa, grau de pureza de 99,50%, (Henrifarma, So Paulo, Brasil) foi
preparada na concentrao de 1,68 10-2 mol L-1 (4000 ppm) em metanol. Solues padro
foram obtidas a partir de diluies da soluo estoque de metildopa em metanol e usadas na
construo da curva analtica numa faixa de concentrao de 4,20 10-4 a 2,48 10-3 mol L-1
(100 a 590 ppm).
VI. 1.4. Amostras

As amostras comerciais dos medicamentos contendo metildopa foram obtidas em
farmcias locais e foram analisadas dentro dos seus prazos de validade. Quatro formulaes
130
farmacuticas (comprimidos) contendo 250 mg de metildopa por comprimido, conforme

declarado no rtulo, foram analisadas.
VI. 2. PROCEDIMENTO
VI. 2. 1. Curva analtica
Alquotas (125 a 740 L) da soluo estoque de metildopa (1,68 10-2 mol L-1) foram
transferidas para bales volumtricos de 5,00 mL visando a obteno de uma curva analtica
na faixa de concentrao de 4,20 10-4 a 2,48 10-3 mol L-1. Em seguida, 770 L da soluo
de p-cloranil (4,07 10-2 mol L-1) e 85 L de H2O2 (4,55 mol L-1) foram adicionados. O
volume final (5,00 mL) foi completado com metanol. As medidas de absorbncia foram
realizadas em 535 nm (b=1,0 cm). Branco de reagentes preparado de forma similar, porm
omitindo-se o frmaco foi utilizado como referncia em todas as medidas. A curva analtica
foi obtida representando-se graficamente valores de absorbncia versus concentrao de
metildopa (mol L-1).
VI. 2. 2. Estudo de interferncias

O efeito dos excipientes mais comumente empregados nas formulaes farmacuticas
de metildopa foi cuidadosamente estudado visando avaliar a presena de possveis
interferentes. Os excipientes estudados foram: amido, talco, estearato de magnsio, cido
tartrico, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, celulose, hidroxipropilmetilcelulose, lactose,
etilcelulose, dixido de silcio e croscarmelose sdica. Para este estudo, solues contendo
metildopa (4,0 mg/mL) e cada um dos excipientes, separadamente, em concentrao igual e
dez vezes maior concentrao de metildopa foram submetidas agitao com metanol em
um agitador magntico por 10 minutos. O volume foi completado para 10,00 mL e, aps
131
filtrao em papel de filtro Whatman 41, as solues foram analisadas sob as mesmas
condies descritas no item VI. 2.1.
VI. 2.3. Preparao da amostra

Vinte comprimidos (do mesmo lote) de cada amostra das diferentes marcas comerciais
estudadas foram pesados em balana analtica e pulverizados em gral de gata. O valor da
massa de um comprimido foi expresso como a mdia de 20 determinaes, com variao
menor que 2% (FARMACOPIA..., 1988). Uma poro de amostra pulverizada equivalente a
100 mg de metildopa foi pesada com preciso de 0,0001 g e submetida agitao com
metanol em agitador magntico por 10 minutos. Em seguida, foi realizada uma diluio em
balo volumtrico de 25,00 mL, completando-se o volume com metanol. Esta soluo foi
filtrada em papel de filtro Whatman 41 e uma alquota do filtrado foi submetida ao
procedimento descrito no item VI. 2.1.
V. 2.4. Estudo de Adio e Recuperao

Estudo de adio e recuperao de frmaco padro foi realizado com o objetivo de
avaliar efeitos de matriz (formulao farmacutica) nas anlises. Para tanto, quantidades
conhecidas (2,52 10-4; 5,04 10-4; 7,55 10-4 e 1,00 10-3 mol L-1) de metildopa foram
adicionadas nas amostras previamente analisadas contendo o equivalente a 1,00 10-3 mol L-1
de metildopa. As quantidades de metildopa adicionadas corresponderam a 25, 50, 75 e 100%
da quantidade presente na amostra. O procedimento foi, ento, seguido de acordo com o item
VI. 2.3.
132
VI. 3. RESULTADOS E DISCUSSO

Conforme discutido no item V. 3.4.1., o p-cloranil tem sido usado como reagente
cromognico para a determinao de diversos frmacos, tais como: sulfato de isoprenalina e
metildopa (KORANY; WAHBI, 1979), fluoxetina e sertralina (BEBAWY et al., 1999),
salbutamol (BAKRY et al., 1996), nortriptilina (ATTIA, 2000), antidepressivos (IBRAHIM et
al., 1983), beta-bloqueadores (SALEM, 2002), sulfato de isoprenalina e metildopa
(KORANY; WAHBI, 1979). De acordo com a literatura (FOSTER, 1968; SALEM, 2002) o
p-cloranil interage com alguns frmacos por dois possveis mecanismos de reao, um em que
ocorre uma reao de substituio e outro em que o p-cloranil (-aceptor) interage com
doadores de eltrons formando complexos de transferncia de carga como mostra o Esquema
4. No entanto, esses mecanismos no so bem elucidados existindo muita discusso na
literatura a respeito dos produtos formados, considerando-se inclusive que esto envolvidos
equilbrios qumicos complexos e com diversos produtos existindo concomitantemente.
133
Proposta A
Amino-quinona
(produto de substituio)
Proposta B
p-cloranil
Complexo de transferncia
de carga
em acetona
Par inico
Esquema 4
O uso de p-cloranil tambm foi descrito na literatura na deteco de metildopa em

formulaes farmacuticas por cromatografia em camada delgada (ADIKWU et al., 2002).
Como mencionado anteriormente, um mtodo espectrofotomtrico para a determinao de
sulfato de isoprenalina e metildopa utilizando p-cloranil como reagente cromognico foi
publicado por Korany e Wahbi (1979) (KORANY; WAHBI, 1979). Entretanto, este mtodo
apresenta alguns problemas, por exemplo, aquecimento por tempo prolongado (30 minutos) e
a medida da absorbncia para metildopa realizada na regio do UV (358 nm). Alm disso, a
134
preparao da amostra requer o uso de HCl concentrado e soluo tampo, exigindo vrias
etapas de manipulao (KORANY; WAHBI, 1979).
Com o objetivo de desenvolver um procedimento mais simples, o mtodo proposto
utilizou a reao entre metildopa e p-cloranil, a qual foi significativamente acelerada na
presena de H2O2. Esta reao produziu um composto colorido e a medida de absorbncia foi
realizada em 535 nm, sem a necessidade de aquecimento. A implicao mais importante
destes resultados sobre queles j descritos para a anlise de metildopa com p-cloranil
(KORANY; WAHBI, 1979) que o aquecimento por 30 minutos pde ser substitudo pelo
uso de H2O2.
A Figura 28 apresenta o espectro do produto da reao entre metildopa e p-cloranil, na
presena de H2O2. Como pode ser observado, o espectro exibe bandas largas, as quais so
caractersticas de complexos de transferncia de carga. Nota-se tambm na Figura 28 que o
espectro apresenta bandas de absoro mxima em 435 e em 535 nm. Assim, um estudo da
estabilidade ptica do complexo colorido foi realizado por acompanhamento cintico dos
valores de absorbncia em 435 e em 535 nm, no tempo zero e a cada 2 minutos at 60
minutos (Figura 29).
135
0,40
0,35
Absorbncia
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
400
500
600
700
800
Figura 28. Espectro de absoro do produto da reao entre metildopa e p-cloranil. O comprimento de
onda analtico foi 535 nm. Concentrao final de metildopa = 1,07 103 mol L-1; caminho
ptico: 1,0 cm.
ggg
435 nm
0,60
ggg
535 nm
0,55
0,50
Absorbncia
0,45
0,40
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0
10
20
30
40
50
60
Tempo (min)
Figura 29. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre metildopa e p-cloranil. As
medidas de absorbncia foram realizadas a cada 2 minutos at 60 minutos. Concentrao
final de metildopa: 7,14 104 mol L-1.
136
Os resultados obtidos demonstraram que em 435 nm houve um aumento progressivo

da absorbncia em funo do tempo e que em 535 nm houve uma faixa de estabilidade ptica
de 15 a 35 minutos (Figura 29). Portanto, nas condies estudadas (535 nm), a estabilidade
ptica do complexo colorido foi de 20 minutos, o qual foi considerado tempo suficiente para a
execuo das anlises. Deve-se ressaltar que para a obteno do complexo colorido (Figura
28), a presena de H2O2 foi essencial. Na ausncia de H2O2, a reao foi extremamente lenta e
o produto no foi estvel.
Em estudos anteriores realizados em nosso laboratrio, foi desenvolvido um mtodo
espectrofotomtrico para a determinao de sacarina utilizando p-cloranil, o qual tambm
utilizou H2O2 como agente acelerador da reao (WEINERT et al., 2004). Nossos resultados
corroboram com aqueles j descritos para a anlise de sacarina, sugerindo que reaes
envolvendo p-cloranil e doadores de eltrons podem ser aceleradas com o uso de H2O2.
VI. 3.1. Planejamento Fatorial de Experimentos

Visando investigar as melhores condies para a reao entre p-cloranil e metildopa na
presena de H2O2 um planejamento fatorial utilizando planejamento composto central foi
empregado. Neste caso, as melhores condies para a reao significaram as concentraes
mnimas de reagentes que resultaram numa resposta mxima, isto , a maior absorbncia
possvel.
Planejamento composto central permitiu estudar simultaneamente os dois fatores que
poderiam ter um efeito importante na reao. Os fatores de interesse foram concentrao de pcloranil e concentrao de H2O2. Estes fatores foram estudados na forma de volumes
adicionados das solues de p-cloranil e de H2O2 em concentraes fixadas em 4,07 10-2
mol L-1 e 4,55 10-1 mol L-1, respectivamente. A Tabela 22 apresenta a matriz do
planejamento composto central e os resultados de absorbncia. O experimento correspondente
137
ao ponto central foi realizado em 4 repeties. Todos os experimentos foram realizados com
soluo de metildopa 1,59 10-3 mol L-1.
Tabela 22. Matriz do planejamento composto central e valores de absorbncia referentes a cada
experimento.
Fatores
Respostas
Volume de p-cloranil
(L)a
Volume de H2O2
(L)b
A (535 nm)
600
40
0,4397
1100
40
0,5454
600
90
0,5921
1100
90
0,5813
850
65
0,5978
850
65
0,6151
850
65
0,6094
850
65
0,6165
500
65
0,5946
10
1200
65
0,5973
11
850
30
0,5758
1.
850
100
0,6055
Experimentos
Soluo de p-cloranil: 4,07 10 mol L .
Soluo de H2O2: 4,55 mol L-1.
-2
-1
Os valores de absorbncia experimentalmente obtidos no planejamento composto

central foram ajustados a uma superfcie de resposta visando o estabelecimento das melhores
condies para a reao (Figura 30).
138
0,61
0,56
0,51
0,46
0,41
0,36
0,31
Figura 30. Superfcie de resposta obtida a partir dos valores de absorbncia em funo do volume
adicionado de p-cloranil e volume de H2O2.
O modelo de regresso quadrtica (valor de p< 0,0005), em termos de fatores

escalonados dado por:
Z = 0,177376 + 0,000965 x + 0,009891y 0,000037 y 2
(Equao 7)
onde, Z o fator resposta correspondente ao valor de absorbncia. Os fatores x e y so o

volume de p-cloranil e volume de H2O2, respectivamente. O valor do coeficiente do fator x 2 ,
bem como dos coeficientes das interaes dos fatores foram muito pequenos e por esta razo
no foram mostrados.
Pode-se observar pela forma da superfcie (Figura 30) que a regio tima foi
encontrada e que as respostas mximas foram alcanadas com cerca de 770 L da soluo de
p-cloranil e 85 L da soluo de H2O2.
139
VI. 3.3. Curva Analtica

A Figura 31 apresenta a curva analtica obtida a partir dos valores de absorbncia
versus concentrao de metildopa (mol L-1). A lei de Beer obedecida na faixa de
concentrao de 4,20 10-4 a 2,48 10-3 mol L-1, com um coeficiente de correlao linear de
0,9993. Os valores de absorbncia para esta faixa de concentrao foram ajustados pela
equao: A = - 0,04006 + 364,315 C, onde C = concentrao de metildopa (mol L-1) e o
valor do coeficiente angular corresponde numericamente a absortividade molar (), que 3,64
10 L. mol . cm . O limite de deteco foi 1,51 10
2
-1
-1
-5
3 DPB
mol L-1
, sendo a =
a
coeficiente angular da curva analtica e DPB = desvio padro do branco para 10 repeties e o
10 DPB
limite de quantificao 5,03 10-5 mol L-1
(LONG; WINEFORDNER, 1983).
a
0,9
Absorbncia (535 nm)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
-1
Concentrao de metildopa (mol L )
Figura 31. Curva analtica para a determinao espectrofotomtrica de metildopa. Valores de
absorbncia foram obtidos em 535 nm. Coeficiente de correlao linear (r) =

0,9993. As barras representam o desvio padro para 3 repeties.
140
VI. 3.4. Estudo de interferncias

comumente presentes na amostra (THOMPSON; ELLISON; WOOD, 2002). A porcentagem
de metildopa encontrada nas solues contendo o frmaco padro e cada um dos excipientes,
separadamente, foi de 94,0 a 103,0% com coeficientes de variao menores que 5% para trs
repeties. Esses resultados foram considerados aceitveis e, portanto, nenhuma interferncia
foi constatada a partir destes excipientes, nas condies estudadas.
VI. 3.5. Estudo de Adio e Recuperao

Com o objetivo de avaliar efeitos de matriz (formulao farmacutica, a qual contm
todos os excipientes juntos) foi realizado um estudo de adio e recuperao de frmaco
padro utilizando 3 amostras de diferentes marcas comerciais de comprimidos. Os resultados
obtidos esto apresentados na Tabela 23. Para todas as amostras, os valores mdios de
recuperao (n=3) variaram de 96,3 a 105,9%, com desvios padro relativos entre 1,9 e 6,1%.
Essas variaes foram consideradas aceitveis, indicando que os componentes das
formulaes farmacuticas analisadas no influenciaram nas anlises.
141
Tabela 23. Resultados de recuperao de metildopa adicionada em formulaes farmacuticas.
Amostras
Valor Adicionado
Valor Encontrado
Recuperaoa
(mol L-1)a
(mol L-1)a
(%)
(9,830,45) 10-4
2,52 10-4
(2,540,14) 10-4
100,85,6
5,04 10-4
(5,260,10) 10-4
104,20,2
7,56 10-4
(7,420,29) 10-4
98,13,8
1,01 10-3
(1,050,05) 10-3
104,05,0
(1,020,04) 10-3
-4
2,52 10
(2,480,10) 10-4
98,43,9
5,04 10-4
(5,340,30) 10-4
105,95,9
7,56 10-4
(7,460,30) 10-4
98,74,0
1,01 10-3
(1,010,06) 10-3
100,86,0
(1,040,02) 10-3
2,52 10
(2,560,13) 10-4
101,65,2
-4
5,04 10
(5,300,17) 10-4
105,23,3
7,56 10-4
(7,670,47) 10-4
101,56,2
1,01 10-3
(9,730,30) 10-4
96,33,0
-4
VI. 3.6. Aplicao do mtodo proposto e comparao com o mtodo de referncia.

O mtodo proposto foi aplicado determinao de metildopa em algumas formulaes
farmacuticas disponveis comercialmente e comparado com o mtodo para a determinao
de metildopa em comprimidos (FARMACOPIA..., 1988). Tal mtodo baseado em
medidas por espectrofotometria na regio do visvel (520 nm) e envolve a reao entre
metildopa e soluo de tartarato ferroso. As anlises foram realizadas em trs repeties e os
resultados esto apresentados na Tabela 24.
142
Tabela 24. Determinao de metildopa em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Proposto
Amostrasa
Valor
Mtodo de Referncia
Encontradob Valor de t
(mg/comprimido)
Valor de F
(2,78)c
(19,00)c
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
250,33,1
0,67
2,97
249,01,8
248,10,6
2,32
4,00
249,91,2
248,62,3
0,26
1,83
248,91,7
258,53,1
0,02
4,90
258,51,4
Valor Nominal: 250 mg metildopa/comprimido
Os valores mdios encontrados variaram de 248,1 a 258,5 mg/comprimido e os

desvios padro de 0,6 a 3,1 mg/comprimido (Tabela 24). Para todas as formulaes
analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo da Farmacopia Brasileira (FARMACOPIA...,
1988) e pelo proposto foram comparados aplicando-se testes t e F, com nvel de confiana de
95%. Em todos os casos, os valores de F e de t calculados no excederam os valores tericos,
exatido.
VI. 3.7. Medidas em dispositivo porttil

O mtodo desenvolvido para a determinao de metildopa foi adaptado para o uso em
um sistema de medidas porttil descrito por Rossi, He e Tubino (2000). Tal sistema consiste
em um dispositivo para medidas fotomtricas, o qual baseado em uma relao entre a
resistncia de um sensor (LDR) e a intensidade de luz que incide sobre sua superfcie. Assim,
a resistncia varia em funo da intensidade de cor de uma soluo. Este sistema constitudo
por um multmetro digital (ET-1502 Minipa), ao qual acoplada uma cela de PTFE
143
(politetrafluoretileno) (Teflon) preto contendo um compartimento para a insero de um

tubo de vidro de fundo chato (5,0 cm de altura e 5,0 mm de dimetro interno), o qual
preenchido com a soluo a ser analisada. O volume desta soluo deve ser padronizado,
neste trabalho, o volume da soluo a ser analisada foi de 1,2 mL. Utilizou-se uma luminria
(lmpada compacta fluorescente 9 W Startec) como fonte de luz incidindo continuadamente
sobre o sistema, a fim de se evitar variaes da luz ambiente sobre o LDR. A cela de teflon foi
cedida pelos autores do dispositivo para a realizao desta etapa do trabalho.
A Figura 32a apresenta uma foto do sistema montado para realizar as medidas
fotomtricas no dispositivo porttil e a Figura 32b um esquema da cela de Teflon para
medidas fotomtricas, incluindo LDR, tubo de vidro, janela de vidro e contato eltrico.
(a)
(b)
Figura 32. Dispositivo porttil de medidas fotomtricas: (a) Montagem do sistema para medidas
fotomtricas. (b) Esquema da cela de Teflon (Fonte: CRIVELENTE, 2003).
144
As condies experimentais adotadas para as anlises de metildopa no dispositivo

porttil foram quelas estabelecidas no desenvolvimento do mtodo espectrofotomtrico
descrito anteriormente.
VI. 3.7.1. Curva Analtica

A curva analtica foi construda na faixa de concentrao de 7,14 104 a 2,48 103
mol L-1, utilizando o mesmo procedimento descrito no item VI. 2.1. A soluo contendo o
produto colorido foi, ento, transferida para o tubo de vidro (1,2 mL), o qual foi introduzido
na cela de PTFE para a medida da resistncia. As medidas foram realizadas em triplicata. A
Figura 33 apresenta a curva analtica obtida a partir dos valores de resistncia (ohm) versus
concentrao de metildopa (mol L-1). Uma relao linear (r=0,9986) foi obtida a partir da
equao: y = 2,35 104 C + 9,33543.
40
Resistncia (10 ohms)
50
30
20
10
0
0,0008
0,0012
0,0016
0,0020
0,0024
-1
Concentrao metildopa (mol L )
Figura 33. Curva analtica para a determinao de metildopa por medidas fotomtricas utilizando
dispositivo porttil. Coeficiente de correlao linear (r) = 0,9986. As barras representam o
desvio padro para 3 repeties.
145
Comparando-se a curva analtica obtida por espectrofotometria (Figura 31) e a curva

obtida a partir das medidas de resistncia no dispositivo porttil (Figura 33) nota-se uma
diferena na disperso das medidas (barras verticais nos grficos). Embora a mesma reao
tenha sido utilizada no mtodo espectrofotomtrico e no mtodo adaptado ao dispositivo
porttil, as medidas espectrofotomtricas apresentaram valores de desvio padro relativos
(disperso) menores (variando de 1,4 a 3,8%) do que as medidas de resistncia, as quais
apresentaram valores de desvio padro relativo de 2,5 a 7,9%. Entretanto, mesmo com menor
preciso de medidas, o coeficiente de correlao linear obtido (0,9986) foi considerado
adequado, indicando uma boa correlao entre concentrao de metildopa e medidas de
resistncia.
VI. 3.7.2. Anlise das amostras de comprimidos

As amostras analisadas foram preparadas conforme o procedimento descrito no item
VI. 2.3. Os resultados obtidos a partir das medidas de resistncia das solues contendo o
produto colorido da reao entre metildopa e p-cloranil foram estatisticamente comparados
com aqueles obtidos pelo mtodo da Farmacopia Brasileira (FARMACOPIA..., 1988). Para
todas as formulaes analisadas, os resultados obtidos pelo mtodo da Farmacopia e pelo
mtodo adaptado para o dispositivo porttil foram comparados aplicando-se os testes t e F,
com nvel de confiana de 95%. Em todos os casos, o valor de F e de t calculados no
excederam os valores tericos, indicando que no h diferena significativa entre ambos
mtodos com relao preciso e exatido (Tabela 25). Estes resultados evidenciaram a
aplicabilidade do sistema de medidas porttil para a determinao de metildopa em
formulaes farmacuticas.
146
Tabela 25. Determinao de metildopa em formulaes farmacuticas comerciais.
Mtodo Fotomtrico
Amostras
Mtodo de Referncia
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
Valor de t
(2,78)c
Valor de F
(19,00)c
Valor Encontradob
(mg/comprimido)
247,17,7
0,14
2,47
249,01,8
251,93,6
0,92
9,00
249,91,2
250,44,2
0,59
6,10
248,91,7
260,94,1
0,52
8,58
258,5 1,4
Valor Nominal: 250 mg metildopa/comprimido
VI. 3.8. Concluses

Os resultados obtidos neste trabalho indicaram que o mtodo espectrofotomtrico
proposto foi efetivo para a determinao de metildopa em formulaes farmacuticas. Alm
disso, foi possvel obter rapidez na reao entre metildopa e p-cloranil com a adio de H2O2.
O produto colorido formado apresentou absoro mxima na regio visvel do espectro (535
nm) contornando as inconvenincias dos mtodos baseados em medidas na regio do UV, os
quais esto sujeitos a interferncias de substncias comumente presentes nas formulaes
farmacuticas que absorvem nesta regio do espectro. Planejamento fatorial foi empregado
para estabelecer as melhores condies para a reao. Os maiores valores de absorbncia
foram obtidos a partir de 770 L de soluo de p-cloranil e 85 L de H2O2. O mtodo
espectrofotomtrico proposto foi estatisticamente comparado com o mtodo descrito na
Farmacopia Brasileira, demonstrando boa concordncia em relao preciso e exatido.
O mtodo espectrofotomtrico desenvolvido foi, ento, adaptado a um dispositivo porttil
baseado em medidas fotomtricas. As principais vantagens deste dispositivo so:
147
simplicidade, facilidade de se obter e operar o equipamento e baixo custo. O mtodo adaptado

ao dispositivo porttil foi estatisticamente comparado com o mtodo da Farmacopia
Brasileira apresentando bons resultados de preciso e exatido. Portanto, este sistema
representa uma opo para que farmcias de manipulao possam realizar o controle de
qualidade de medicamentos com confiabilidade e baixo custo.
148
Captulo VII. Concluses Gerais
149
Os mtodos analticos desenvolvidos neste trabalho para a determinao de

furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol utilizando a combinao espectroscopia
de reflectncia difusa - spot test foram aplicados com sucesso na anlise de formulaes
farmacuticas comerciais e foram considerados confiveis, podendo ser teis no controle de
qualidade de medicamentos. Alm disso, os mtodos por espectroscopia de reflectncia difusa
demonstraram, de maneira indita, o uso desta tcnica combinada com spot test para a
quantificao de frmacos em formulaes farmacuticas. A combinao espectroscopia de
reflectncia difusa - spot test oferece vantagens relacionadas principalmente simplicidade,
rapidez e baixo consumo de reagentes e solventes, sendo muito interessante do ponto de vista
da Qumica Verde, a qual tem interesse por mtodos e tcnicas que reduzem e eliminam o uso
e a gerao de substncias prejudiciais sade humana e ao meio ambiente.
A falta de interferncias dos excipientes avaliados demonstrou uma boa seletividade
dos mtodos desenvolvidos no presente trabalho. Os mtodos descritos na Farmacopia
Britnica (2001) utilizados para comparao com os mtodos reflectomtricos propostos so
baseados em medidas diretas na regio do UV e esto sujeitos a interferncias provenientes de
excipientes presentes nas formulaes ou possveis falsificaes e/ou adulteraes, resultando
em baixa seletividade, uma vez que todos os compostos insaturados apresentam uma ou mais
bandas na regio UV do espectro eletromagntico.
O mtodo espectrofotomtrico para a determinao de metildopa em formulaes
farmacuticas foi aplicado com sucesso na anlise de formulaes farmacuticas comerciais.
O produto da reao entre metildopa e p-cloranil, na presena de perxido de hidrognio
apresentou absoro mxima na regio do visvel (535 nm), evitando possveis interferncias
de excipientes que absorvem na regio do UV. Os resultados demonstraram que o uso de
perxido de hidrognio foi extremamente til, uma vez que agiu como um acelerador da
reao, evitando a necessidade de aquecimento. Considerando estes resultados, sugere-se que
150
outros mtodos envolvendo reaes entre doadores de eltrons e p-cloranil podem ser
melhorados com o uso de perxido de hidrognio.
O mtodo espectrofotomtrico foi adaptado ao dispositivo porttil de medidas
fotomtricas e os resultados da comparao com o mtodo oficial indicaram que este sistema
representa uma boa opo para que farmcias de manipulao possam realizar controle de
qualidade destes medicamentos com confiabilidade e baixo custo.
151
Captulo VIII. Perspectivas Futuras
152
Diante dos resultados obtidos no presente trabalho, surgem algumas perspectivas de

trabalhos futuros que do continuidade linha de pesquisa envolvendo o desenvolvimento de
mtodos analticos para a determinao de medicamentos. Entre elas, destacam-se:
a) Aplicao dos mtodos analticos desenvolvidos para a quantificao de
furosemida, hidroclorotiazida, propranolol e atenolol em fluidos biolgicos, visando a
monitorizao dos nveis teraputicos destes frmacos e a anlise de doping, uma vez que tais
frmacos esto includos na lista de substncias proibidas pelo Comit Olmpico
Internacional.
b) Aplicao do mtodo espectrofotomtrico para a determinao de metildopa em
amostras de fluidos biolgicos visando a monitorizao teraputica.
c) Automao dos mtodos propostos, tanto por espectroscopia de reflectncia difusa
como por espectrofotometria, utilizando anlise por injeo em fluxo.
d) Estudar mais detalhadamente a reao entre metildopa e p-cloranil, na presena de
perxido de hidrognio, com intuito de elucidar o mecanismo da reao e compreender a
formao do produto colorido.
153
Captulo IX. Referncias
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Gotardo Ma DR Araiq

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UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

Desenvolvimento de mtodos para anlise de

MARA ANDRIA GOTARDO

MARA ANDRIA GOTARDO

Desenvolvimento de mtodos para anlise de

Tese apresentada ao Instituto de Qumica,

Orientadora: Prof Dr Helena Redigolo Pezza

2.2. GOTARDO, M. A.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of

2.4. GOTARDO, M. A.; GIGANTE, A. C.; PEZZA, L.; PEZZA, H. R. Determination of

2.6. QUEIROZ, R. H. C.; PEREIRA, R. C.; GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.;

2.7. GOTARDO, M. A.; TOGNOLLI, J. O.; PEZZA, H. R.; PEZZA, L. Determination of

3. Trabalhos apresentados em Congresso

3.2. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Migration of DEHP from PVC bags

3.5. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. PVC bags containing large parenteral

3.6. GOTARDO, M. A.; MONTEIRO, M. Uso da cromatografia gasosa de alta

3.9. GOTARDO, M. A.; CORDEIRO, D. S.; DREOSSI, S. A. C.; QUEIROZ, R. H. C.

3.10. GOTARDO, M. A.; QUEIROZ, R. H. C. HPLC analysis of clofazimine in plasma.

Aos meus pais Joo e Dirce,

Aos meus irmos Miriam e Joo Roberto,

Prof Helena Redigolo Pezza pela orientao, confiana e preocupao em ajudar,

Ao Prof. Leonardo Pezza pela confiana, apoio e amizade.

Prof Dr Adriana Vitorino Rossi (Unicamp Campinas) pela ateno e auxlio na

Aos membros da banca examinadora pela ateno e importante colaborao na

Ao Prof. Massao Ionashiro pelos valiosos ensinamentos, incentivo e sincera

Aos funcionrios da biblioteca, seo de ps-graduao e do Departamento de

dicloroquinona-4-cloroimida (DCQ) para propranolol e p-cloranil para atenolol. Estas reaes

Palavras-chave: espectroscopia de reflectncia difusa; spot test; espectrofotometria;

furosemida; hydrochlorothiazide; propranolol; atenolol; methyldopa.

Figura 2. Estrutura qumica da hidroclorotiazida

Figura 3. Estrutura qumica do propranolol

Figura 4. Estrutura qumica do atenolol

Figura 5. Estrutura qumica da metildopa

Figura 6. Vista superior do acessrio de reflectncia Labsphere modelo RSAHP-53

Figura 7. Espectros de reflectncia obtidos a partir do produto da reao de

Figura 8. Distribuio das publicaes de mtodos por espectroscopia de

Figura 9. Suporte utilizado na realizao dos spot tests (Baseado em:

Figura 10. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

Figura 11. Grficos tridimensionais obtidos para estabelecer condies timas

Figura 12. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

Figura 13. Curva analtica para a determinao de furosemida. Coeficiente de

Figura 14. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

Figura 15. Grfico de Pareto do planejamento fatorial fracionrio para a

Figura 16. Grfico tridimensional obtido no estabelecimento das melhores

Figura 17. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre

Figura 18. Curva analtica para a determinao de hidroclorotiazida.

Figura 19. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

Figura 20. Grfico de Pareto do planejamento fatorial completo para a reao

Figura 21. Superfcie de resposta obtida no planejamento composto central

Figura 22. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre

Figura 23. Curva analtica para determinao de propranolol. Coeficiente de

Figura 24. Espectro de reflectncia do produto formado na reao entre

Figura 25. Efeito da concentrao de p-cloranil na resposta (AR). As barras

Figura 26. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre atenolol e

Figura 27. Curva analtica para a determinao de atenolol. Coeficiente de

Figura 29. Estudo da estabilidade ptica do produto da reao entre metildopa

Figura 30. Superfcie de resposta obtida a partir dos valores de absorbncia

Figura 31. Curva analtica para a determinao espectrofotomtrica de

Figura 32. Dispositivo porttil de medidas fotomtricas: (a) Montagem do

Figura 33. Curva analtica para a determinao de metildopa por medidas

Tabela 12. Matriz do planejamento fatorial fracionrio

Tabela 13. Matriz do planejamento fatorial completo com ponto central

Tabela 14. Resultados de recuperao de hidroclorotiazida padro adicionada em trs

Tabela 17. Matriz e resultados obtidos no planejamento composto central