ANLISE QUANTITATIVA POR CROMATOGRAFIA

Antnio Luiz Pires Valente (in memoriam), Fabio Augusto e Cssio Ricardo Fares Riedo
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Qumica, CP 6154,
13084-862 Campinas, So Paulo - Brasil

RESUMO
Este um texto de apoio ao aplicativo multimdia Anlise Quantitativa por Cromatografia (disponvel em
Aplicativos e Programas). A sua finalidade a de oferecer ao leitor material similar, na forma impressa, ao do
multimdia. Este texto mais detalhado do que o apresentado no aplicativo, mas tem um nmero muito menor
de figuras. tambm uma forma complementar para a apresentao das informaes e interpretaes, podendo
servir tanto como material de apoio como resumo do material original.
Palavras-chave: Cromatografia, Curva Analtica, Tratamento de Dados, Teste de Huber

Introduo
A anlise quantitativa em cromatografia baseada em
estabelecer o valor da rea da banda cromatogrfica. Na
cromatografia em coluna, isto , gasosa (CG) e em cromatografia
lquida (comumente de alta eficincia, CLAE) a banda registrada
como um pico (Figura 1) que, idealmente deve ter formato
gaussiano.

O parmetro
quantitativo
fundamental em
cromatografia
a rea da banda
cromatrogrfica.
300
250
200
150
100
50
0
0

Figura 1. Esquema de um cromatgrafo gasoso e de um cromatograma

obtido por cromatografia gasosa.

Em cromatografia gasosa de alta resoluo, onde so

usadas colunas capilares, no incomum que os picos tenham perfil
gaussiano, como demonstrado no detalhe da Figura 2, que o pico
destacado em azul da Figura 1.
Na prtica da
cromatografia so
observados picos
gaussianos.

150
100
50
0
3,9

3,95

Figura 2. Detalhe do pico destacado em azul na Figura 1, mostrando

que ele tende ao perfil gaussiano.
Similarmente ao que ocorre na cromatografia em coluna, as
manchas observadas em cromatografia em camada delgada (CCD)
tambm tendem distribuio gaussiana. Isto mostrado na Figura
3, em que as quantidades de analito numa mancha foram obtidas
para seces verticais:

As bandas
cromatogrficas
tendem ao perfil
gaussiano.

2000
1500
1000
500
22

19

16

13

10

Figura 3. Distribuio das quantidades (figura inferior) de analito numa

mancha (figura superior) de CCD.

Portanto, nos casos mostrados nas figuras anteriores, nas

correspondentes bandas cromatogrficas as quantidades dos
analitos tendem ao perfil gaussiano, isto , aumentam das bordas
para o centro da mancha e, simetricamente, diminuem do centro
para a outra borda.
Quando a banda cromatogrfica registrada na forma de
pico, a sua rea pode ser calculada, como mostrado abaixo, como a
rea do tringulo issceles que engloba o pico cromatogrfico
(Figura 4).

Clculo da rea de um
pico cromatogrfico
por triangulao:
A = h Wb

h
Wb
Figura 4. A = hWb. Clculo da rea de um pico cromatogrfico
por triangulao.
Na cromatografia em camada delgada a rea da mancha
estabelecida por densitometria, cujo princpio est representado na
Figura 5.

A densitometria
faz a contagem do
nmero de pontos de
uma imagem.

Figura 5. O princpio da densitometria: o nmero de pontos que define a

mancha (como vista por um densitmetro ou computador) proporcional
rea da mancha.

O procedimento e princpio de obter reas em CCD a partir

de imagens digitalizadas e arquivadas em computador est
representado na Figura 6: as placas no caso com manchas visveis
de corantes so digitalizadas e com o arquivo gerado realiza-se a
contagem dos pontos (pixeis o termo usado na rea de
computao) que compem cada mancha. A contagem pode ser
feita manualmente com muita pacincia ou por meio de um
programa que conte os pixeis. O nmero de pontos proporcional
rea da correspondente mancha e, conseqentemente, proporcional
quantidade de analito nela existente. Esta metodologia representa
o princpio de estabelecimento de reas cromatogrficas.

O nmero de pontos
que compem uma
mancha escaneada
proporcional
sua rea.
1074 pontos
664 pontos
641 pontos
554 pontos
Escanear.

Figura 6. Princpio do estabelecimento de rea de uma mancha de

CCD por meio de escaneamento da placa cromatogrfica.
Apesar do mtodo de determinar reas ser diferente para
CG e CLAE, o princpio o mesmo do usado em CCD.
O uso das reas cromatogrficas a curva analtica
medindo-se as reas cromatogrficas que se estabelecem
as quantidades de analitos em amostras analisadas e a melhor
forma de realizar quantificaes a baseada numa Curva Analtica1.
A Curva Analtica (Figura 7) a relao entre sinais no caso as
reas e quantidades do analito a ser quantificado.

Curva Analtica o nome sugerido pela IUPAC para substituir o termo Curva de Calibrao.

rea

Toda anlise
efetivamente
quantitativa exige o
uso da curva analtica.

Quantidade

A=a+bQ
Figura 7. Esboo de uma Curva Analtica linear (representada pela
equao de uma reta).
Obtendo uma Curva Analtica
O primeiro passo para obter a curva analtica preparar um
conjunto de solues com um padro do analito que se deseja
quantificar em amostras. Portanto, necessrio conhecer a
identidade do analito e dispor dele na forma de padro (puro ou, se
isso no for possvel, com pureza exatamente conhecida e
determinada independentemente).
Cinco a seis solues costumam ser suficientes para este
trabalho. Estas solues so aplicadas lado a lado na placa
cromatogrfica e realizada a corrida cromatogrfica. Como no
incomum que numa anlise tenha-se que quantificar vrios analitos,
as solues podem conter todos eles, do que resultar uma
cromatoplaca como a mostrada nas Figuras 5 e 6. Ento as reas
das manchas so obtidas (Figura 6) e tabeladas, como mostrado na
Tabela 1.
Dispondo de dados como o da Tabela 1 aplica-se a eles uma
Regresso Linear para obter a equao da curva analtica, isto , a
relao funcional entre Sinais e Quantidades. Para o caso dos dados
da Tabela 1, a equao de reta que relaciona as reas com as

Tabela 1. Concentraes
preparadas e reas obtidas para
as correspondentes manchas
cromatogrficas o analito o
corante Vermelho 40 (V40).

C (g/L)

rea

2,8
5,7
8,4
11,2
14,1

117
135
162
194
207

concentraes do V402 :

O V40 um corante artificial usado em alimentos.

A = 91,7 + 8,5 C (Equao 1)

Note-se que a curva analtica definida como a relao
entre sinais e quantidades; no entanto, na Equao 1 as
quantidades so representadas pelas concentraes das solues.
Isto implica que os volumes de amostra aplicados na placa
cromatogrfica foram iguais, pois, C = Q / V (C= concentrao; Q =
quantidade; V =volume).
Usando a curva analtica
Dispondo da equao da curva analtica pode-se calcular as
quantidades do analito em amostras. As amostras so aplicadas em
outra placa (mesmo volume usado das solues-padro), a corrida
realizada sob as mesmas condies usadas para o conjunto de
padres e as reas do analito nas amostras so determinadas.
Suponhamos que para uma amostra esta rea foi estabelecida como
de 184 pixeis. Este valor substituido na equao (1) da curva
analtica e obtm-se a quantidade do analito na amostra (no caso a
sua concentrao):
184 = 91,7 + 8,5 C;
C = (184 91,7) / 8,5;
C = 10,9 g L-1

Numa curva analtica

interpolam-se
resultados.
As extrapolaes no
refletem resultados
efetivamente
quantitativos.

250

r
e
a

200
150
100

A = 91,7 + 8,5 C

50
0
0,0

2,8

5,0

10,0

14,1

15,0

Concentrao (g/L)

Figura 8. Grfico da curva analtica obtida para os dados da Tabela 1.

Nesta Figura 8 esto destacados os valores inferior (2,8 g L-1)

e superior (14,1 g L-1) das concentraes usadas para obter a curva
analtica. O valor acima calculado C = 10,9 g L-1 intermedirio entre
estes extremos. Portanto, ele foi interpolado usando-se a Equao
1. Como somente se conhece o comportamento da curva entre

aqueles extremos, somente interpolaes so vlidas para fins

efetivamente quantitativos. Extrapolaes no so aceitveis. Isto
uma regra geral em Qumica Analtica.
A confiabilidade dos dados (e da Curva Analtica)
A curva analtica obtida com dados experimentais, que
sempre esto sujeitos a erros e desvios. Por isto, os dados
costumam oscilar e pode ser difcil ou impossvel obter uma equao
que os represente com confiabilidade. Um dos motivos a inevitvel
flutuao dos volumes aplicados na placa cromatogrfica. Um
recurso para contornar esta dificuldade alm do cuidado com
operaes experimentais tecnicamente corretas trabalhar com

Tabela 2. reas medidas em

triplicatas para as cinco
concentraes.

dados em replicatas.
Em CCD isto corresponde a, por exemplo, preparar trs
placas cromatogrficas e aplicar em cada uma delas as solues de
concentraes variadas dos padres. A Tabela 2 mostra que, em

C(g/L)

rea

rea2

rea3

Mdia

0,3

462

416

462

447

0,6

929

924

924

926

0,9

1386

1525

1340

1417

comum que aps obter as triplicatas calculem-se as

1,2

1843

1848

1827

1839

mdias das reas correspondentes a cada concentrao, para se

1,5

2310

2079

2305

2231

placa 1

placa 2

placa 3

cada placa aplicam-se amostras com cinco concentraes: 0,3; 0,6;

0,9; 1,2 e 1,5 g L-1. Assim, por concentrao, dispe-se de triplicata
das reas cromatogrficas.

aplicar a regresso linear sobre estas mdias e concentraes. Sem

um critrio adequado isto pode levar a erros.
Tomemos como exemplo a menor concentrao e suas
reas 462, 416 e 462, cuja mdia igual a 447. No entanto, uma
simples inspeo visual da Tabela 2, torna evidente que a rea 416

so cinco reas por placa

no deve ser usada no clculo da mdia; desprezando este valor

obtem-se uma mdia mais representativa, que igual a 462. O valor
416 claramente oriundo de algum erro, possivelmente devido ao
volume aplicado de amostra e, se usado no clculo, descaracteriza o
significado da mdia. Diz-se que ele um valor anmalo, o qual,

A representatividade
de mdias sempre
deve ser verificada.

conseqentemente, no deve ser considerado. Ocorre que na

Tabela 2 existem outros anmalos, e como um conjunto de 15
dados fica difcil identificar todos eles por inspees visuais como a
acima referida. No entanto existe um conjunto de critrios bastante
seguro para identificar e desprezar anmalos, que baseado na
Curva de Linearidade.

A Curva de Linearidade
A Curva de Linearidade origina-se de um princpio bastante
simples: admite-se que os dados ajustam-se a uma equao de reta
do tipo
y = a + b x (Equao 2),
a qual tem um coeficiente angular, b, constante. Experimentalmente
o que isto significa? Significa que idealmente os quocientes entre as
reas medidas e correspondentes concentraes seriam constantes,
como mostrado na Figura 9 (A / Q).

Com a curva de
linearidade pode-se
identificar dados
anmalos.

A/Q

Q1

Q2

Q1

Q2

Qn

Figura 9. A Curva de Linearidade ( direita): razes A/Q (correspondentes)

vs Q resultaria (idealmente) numa reta paralela com o eixo X.

Portanto, usando os dados da Tabela 3 calculam-se os valores A/C,

que so plotados em relao s correspondentes concentraes.
Tabela 3. Valores de
concentrao e quocientes de
rea por Concentrao (A/C).

Disto resulta o grfico da Figura 10.

1386

1537

0,9

(A/C))) 3

1540

1386

1540

0,6

1549

1540

1540

0,9

1540

1694

1489

1,2

1536

1540

1522

1,5

1540

1386

1537

C (g/L)

1540

0,3

A/C
1530
1520
0,0

1,0

2,0

Concentrao

1,2(A/C) 1

(A /C) 2

1550

Figura 10. Curva de linearidade para os dados da Tabela 3. Os valores de

A/C superiores a 1546 e inferiores a 1534 indicados com campo
sombreado na Tabela 3 foram rejeitados.

Nas consideraes da Tabela 3 e da Figura 10 no

indicamos porque os pontos superiores a 1546 e inferiores a 1534
foram rejeitados. Isto pormenorizado a seguir.

A rejeio sistemtica de anmalos

Para rejeitar anmalos com base na curva de linearidade,
usando o procedimento chamado Teste de Huber, necessrio: (1)
estabelecer um valor central (linha preta na Figura 10) e, acima e
abaixo dela, intervalos de confiana (linhas vermelhas) que definem
quais os dados aceitveis isto , os que pertencem ao intervalo de
confiana. necessrio um critrio para estabelecer o valor central
de forma que ele no dependa dos dados anmalos. Isto feito
obtendo-se a mediana dos dados.
Para estabelecer o valor central a mediana (md) prefervel
mdia, porque o valor da mediana no afetado pelos anmalos.
Para obter a md ordenam-se os dados (rea/concentrao) e, no
presente exemplo, como so 15 dados, a md o oitavo deles, isto

Tabela 4. Valores ordenados em

quocientes de rea por
Concentrao (A/C).

1540. Portanto, o valor central deste conjunto de A/C md = 1540,

como realado na Tabela 4. O prximo passo estabelecer os
intervalos de confiana. Antes, porm, uma observao: a mdia
deste conjunto 1525 (marcado em vermelho na Tabela 4), um valor
bastante menor do que o da md, e claramente inadequado para
representar o conjunto.

1525

Estabelecendo os intervalos de confiana

O primeiro passo calcular as diferenas absolutas entre
cada valor de A/C e a md. Por exemplo, para o primeiro valor de
A/C:
| A/C1 md| = |1522 1540| = 18 (Equao 3).
A seguir obtido o chamado desvio absoluto da mediana (mad) dos
quinze valores |A/Ci md| e o intervalo de confiana (IC) calculado
como:

O intervalo de
confiana
representa a faixa
de variao que
voc deve esperar
para o seu
experimento.

IC = k mad (Equao 4)
onde k um fator que pode variar de 2 a 8. Para os dados em
considerao mad = 3,1; usando-se k = 2 os valores do intervalo
superior e do inferior, que so os limites para desprezar resultados
anmalos, so obtidos por:

ICs,i = md k mad = 1540 2 3,1 (Equao 5)

Tabela 5. Reproduo da Tabela 3
indicando os dados rejeitados.

ou seja,
IC s = 1546; IC i = 1534;

C (g/L)

de forma que os dados rejeitados so destacados pelos sombreados

(A/C)1

(A/C)2

0,3

1540

1386

1540

0,6

1549

1540

1540

critrio para rejeies de anmalos - deve ser comentada. Em

0,9

1540

1694

1489

primeiro lugar, o critrio parece ser excessivamente subjetivo pois,

1,2

1536

1540

1522

1,5

1540

1386

1537

mostrados na Tabela 5.
Naturalmente esta definio de intervalos de confiana - e do

afinal, quem decide o valor de k e, portanto, da rigidez com que os

(A/C)3

dados so desprezados o analista. Mas, de fato, com bom senso o

critrio deixa de ser absolutamente subjetivo. Este bom senso
implica, entre outras coisas, em adicionar mais um parmetro na
avaliao do resultado final (que a equao da curva analtica).
Este outro parmetro chama-se resduo, rs.
Quais so os dados rejeitados?

Observe que, no
teste de Huber,
o estabelecimento
do valor do
coeficiente k no
totalmente
arbitrrio.

Antes de discutir os resduos necessrio estabelecer quais

os dados a serem rejeitados. Na Tabela 4 esto os dados A/C
rejeitados, mas no com estes que se constri a curva analtica.
No entanto, aos valores indicados na Tabela 5 correspondem a
reas que esto na Tabela 2, que so, respectivamente,
(considerando colunas-linhas): 416, 929, 1525, 2079, 1340 e 1827.
Portanto, estas so as reas a serem rejeitadas.
O uso dos resduos
Aps eliminar os dados anmalos supe-se que os
remanescentes representem adequadamente a relao existente
entre rea e Concentrao com reas e concentraes que se
constri a curva analtica. Portanto, a regresso linear aplicada s
reas no rejeitadas da Tabela 5, obtendo-se a seguinte equao

Os resduos
representam o
grau de confiabilidade
de interpolao de
dados com a sua
curva analtica.

para a possvel curva analtica:

A = 2,10 + 1537,7 C; r = 1,000 (Equao 6)

10

Nesta equao (6) pode-se substituir os valores das

concentraes (0,3 g L-1 a 1,5 g L-1) para obter valores interpolados
de reas (Aint). Ento so calculadas as diferenas relativas (%)
entre

estes

Aint

as

mdias

das

correspondentes

reas

experimentais (exp). Por exemplo, para a concentrao de 0,3 g L-1

a exp = 462 e a Aint = 463, de forma que:
rs = 100 (Aint - exp)/100 = + 0,3% (Equao 7).
Os valores rs (calculados para todas as concentraes) so
os resduos, isto , as medidas de quanto as reas interpoladas se
afastam das experimentais. Para o exemplo considerado os resduos

Tabela 6. Valores de reas

interpoladas e resduos.

A int

rs ( %)

463,4

+ 0,3

924,7

- 0,1

Os resduos mostrados na Tabela 6 sugerem que o erro

1386,0

0,0

mximo a ser cometido em interpolaes com a equao obtida para

1847,3

- 0,1

a curva analtica estariam em torno de 0,3 %. Para cromatografia em

2308,6

0,0

esto relacionados na Tabela 6.

Agora dispe-se de mais informaes para decidir se a
escolha de k = 2 foi adequada para o critrio de rejeio.

camada delgada pode-se considerar este como um resultado muito

bom. Por outro lado, considerando os sinais dos resduos existe
suficiente compensao entre resduos positivos e negativos.
Ademais, o coeficiente de correlao obtido r = 1,000 indicativo de
tima preciso da curva obtida. Portanto, pelo conjunto de
argumentos acima pode-se concluir que a seleo de k = 2 foi um
critrio adequado para a rejeio de resultados. O contrrio ocorreria
se, por exemplo, dos 15 dados fossem rejeitados 7 ou 8; neste caso
seria necessrio repetir o procedimento com k = 3 e reanalisar os
resultados.

Outra

excessivamente

possibilidade

elevados

seria

dos

apresentarem

resduos
uma

serem

distribuio

claramente no-aleatria entre valores positivos e negativos (caso

onde o modelo linear de calibrao no aplicvel). Estes casos
poderiam sugerir erros experimentais e, inevitavelmente, a repetio
de todo o procedimento cromatogrfico.

11

Um resumo do procedimento
Dispondo das reas cromatogrficas o que se faz (as
etapas de 1 a 6 constituem o chamado Teste de Huber, baseado em
medianas para rejeio de anmalos):
1. Dividir as reas pelas correspondentes concentraes, para
plotar um esboo de curva de linearidade: A/C vs C.
2. Calcular a md das razes A/C.
3. Calcular as diferenas absolutas entre as A/C e md.
4. Obter a mediana mad dessas diferenas absolutas.
5. Calcular os IC = k

mad e estabelecer os limites superior e

inferior ICS,I = md k md.

6. Rejeitar as A/C de valor acima ou abaixo dos ICS,I e,
conseqentemente, as correspondentes reas.
7. Aplicar a regresso linear s mdias das reas no rejeitadas e
concentraes para obter uma equao para a curva analtica.
8. Substituir os valores das concentraes nesta equao para
obter reas interpoladas e calcular os resduos.

Uma generalizao da curva de linearidade e um critrio mais

genrico para a aplicao do teste de Huber
As discusses anteriores foram baseadas no fato de que se
a curva analtica obedece a uma equao do primeiro grau,
A=a+b

C ou, como mostrado na equao 2, y = a + b

x, ela

tem um coeficiente angular, ou a sua primeira derivada, constante.

Isto tambm aplica-se quando o coeficiente angular, b, diferente de
zero, pois: ento,

b=

Aa
(Equao 8).
C

A equao 8 permite generalizar o critrio de quais dados

aplicar o teste de Huber. Consideremos um segundo exemplo de
obteno de curva analtica.

12

Obtendo a Curva Analtica quando o coeficiente linear muito

diferente de zero
Na Tabela 7 est outro conjunto de dados obtidos por
cromatografia em camada delgada. Ao calcular as razes A/C com
estes dados e plota-las na forma de uma curva de linearidade
obtem-se o grfico da Figura 11.

A/C

4000

Linearidade ?

Tabela 7. reas em triplicata obtidas

para as concentraes da coluna 1.
C

rea 1

rea 2

rea

0,3

872

785

872

0,6

1341

1334

1334

0,9

1796

1976

1737

1,2

2252

2258

2232

1,5

2720

2448

2714

2000
0
0,0

0,5

1,0

1,5

2,0
C

Figura 11. Grfico obtido com os dados de rea e concentrao da Tabela

7.

visvel na Figura 11 que inexiste uma curva de

A curva de linearidade
tem um aspecto de
curva de segundo grau
quando o coeficiente
linear da curva analtica
muito diferente de zero.

linearidade. Isto ocorre porque a correspondente curva analtica tem

(como se ver a seguir) um coeficiente linear bastante diferente de
zero.
Em outros termos, todas as reas obtidas experimentalmente tm
embutido o valor correspondente ao coeficiente linear. Isto cada
rea

experimental

tem

um

componente

Ai

proporcional

correspondente concentrao, mais um valor constante a, de forma

que os quocientes A/C so sucessivamente menores,

A i + a A ii + a
A +a
>
> n
C1
C2
Cn
o que faz com que o grfico de A/C vs C tenha o aspecto no linear
e decrescente mostrado na Figura 11.
A generalizao vista na equao 8:

b=

Aa
,
C

auxilia no contorno a esta dificuldade.

13

Se as quinze reas Ai, as concentraes Ci e o coeficiente

linear a so substitudos nesta equao obtm-se quinze valores
para o coeficiente linear a.
No entanto, qual o valor de a para tais clculos, j que ele est
embutido nas reas experimentais?
O fato que este valor pode ser estimado aplicando-se uma
regresso linear sobre os dados da Tabela 6. Esta regresso
exploratria resulta na equao:
A = 434,0 + 1493,4 C; r = 0,9981 (Equao 9)
de forma que o provisrio a = 434,0 pode ser substitudo na
Equao 9 para obterem-se valores bi correspondentes s
concentraes Ci.
Quando isto feito obtm-se os valores bi 1-3 listados na
Tabela 8. Os valores bi da Tabela 8 (que idealmente seriam
constantes), so submetidos ao teste de Huber (com k = 2)
resultando na rejeio de bi = 1169, 1713, 1343 e 1447 e
correspondentes valores de reas (785, 1976, 2448 e 1737) na
Tabela

7.

Ento,

mdias

das

reas

remanescentes

correspondentes concentraes aplica-se a regresso linear,

obtendo-se a equao da curva analtica:

Tabela 8. Valores do coeficientes

angulares (b) obtidos pelas
substituies de A e C (Tabela 7)
na Equao 9.
C
(g/L)

bi 1

bi 2

bi 3

0,3

1460

1169

1460

0,6

1512

1500

1500

0,9

1513

1713

1447

1,2

1515

1520

1498

1,5

1524

1343

1520

A = 416,5 + 1533,8 C; r = 1,0000 (Equao 10).

Os resduos % calculados a partir desta Equao 9 so
(respectivamente da menor para a maior concentrao): + 0,5; 0,0; 0,1; - 0,4 e 0,0, indicando que o critrio de aplicar o teste de Huber
aos valores bi (obtidos com a Equao 9 a partir de um valor
estimado de b conforme a Equao 10) adequado para obter uma
curva analtica com coeficiente linear diferente de zero. Este critrio

O critrio geral
baseado no fato de
que uma reta tem
coeficiente angular
constante.

geral, de forma que tambm se aplica quando este coeficiente

linear pode ser considerado como estatisticamente nulo.

14

O uso do mtodo da padronizao interna

Os dois exemplos anteriores de obteno de curva analtica
foram baseados no Mtodo da Padronizao Externa (MPE), isto
, preparam-se vrias solues com concentraes diferentes do
analito e aplica-se na placa volumes iguais destas solues (Figura
12).

C = Q / V , de onde,
Q = V C

V tem de ser constante

Figura 12. Representao esquemtica do princpio do Mtodo da

Padronizao Externa (MPE).
O Mtodo da Padronizao Externa tem, dentre outras, uma
condio rgida: os volumes aplicados devem ser iguais, o que
dificilmente se consegue na prtica, de forma que as reas
cromatogrficas podem oscilar substancialmente, levando a
resultados como os apresentados na Tabela 9 e Figura 13.
Tabela 9. Conjunto de dados de
reas e Concentraes. Os dados
com sombreado foram rejeitados
aps o teste de Huber. A
correspondente curva analtica
mostrada na Figura 13.

800

400

C
(g/L)

A1

A2

A3

0,3

138

180

135

0,6

277

379

258

Figura 13. Grfico e equao da curva analtica obtida para os dados da

Tabela 9.

0,9

416

457

310

A curva analtica acima s tem aparncia de boa qualidade,

1,2

553

554

548

1,5

693

624

692

0
0

0,5

1,5

A = 0,22 + 461,1 C ; r = 0,9999

pois ela foi obtida depois que oito dos quinze dados originais foram
rejeitados pelo teste de Huber. Isto certamente demasiado, pois
foram rejeitadas mais de 50 % da informao. Este problema, que
ocorreu por excessiva flutuao dos volumes de amostra aplicados,

15

pode ser contornado com o Mtodo da Padronizao Interna

(MPI).
O mtodo da padronizao interna
O MPI consiste em adicionar s solues usadas para obter

O mtodo da
padronizao
interna atenua os
problemas oriundos
da incerteza do
volume de amostra
aplicado.

a curva analtica um composto, de forma que sua concentrao seja

a mesma em todas as solues (Figura 14). Este composto
denominado de padro interno (PI).
C=

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

C = 0,1
Tabela 10. Triplicatas das
Razes de Concentrao
e Razes de rea.

Rz (C)

Rz(A1)

Rz(A2)

Rz(A3)

0,33

0,40

0,32

0,64

0,86

0,59

0,97

1,09

0,96

12

1,31

1,30

1,26

15

1,60

1,46

1,65

Figura 14. MPI: cinco solues do analito com concentraes variadas, s

quais adicionado o PI em concentrao nica.

Depois de preparadas as solues do analito mais o PI elas

so aplicadas na placa, efetua-se a corrida cromatogrfica e medemse as reas. As reas do analito (variveis) so divididas pela rea
do PI (que deveria ser constante), obtendo-se as razes de rea, Rz
(A). As concentraes do analito so divididas pela concentrao

Tabela 11. Rz (C) e Rz (A)

(triplicata) s quais aplicado o
teste de Huber. Os dados
destacados foram rejeitados.

(valor nico) do PI, obtendo-se as razes de concentrao Rz (C).

Para o exemplo em questo estes dados esto na Tabela 10.
Agora a curva analtica do tipo Rz (A) vs Rz (C),
supostamente uma reta. Portanto, o teste de Huber aplicado sobre
os quocientes Rz (A) / Rz (C) que correspondem inclinao da
curva Rz (A) vs Rz (C). Com isto so rejeitados os dados destacados
em sombreado na Tabela 11.
Aos dados no rejeitados aplica-se a regresso linear
obtendo-se a seguinte equao de reta:

Rz
(C)

Rz (A1)
/ Rz(C)

Rz (A2)
/ Rz(C)

Rz (A3)
/ Rz(C)

0,110

0,133

0,107

0,106

0,144

0,098

0,108

0,121

0,107

12

0,109

0,109

0,105

15

0,106

0,097

0,110

Rz (A) = - 0,006 + 0,1083 Rz (C) (Equao 11)

r = 0,9999

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Esta equao permite interpolar razes de reas (a partir

das correspondentes razes de concentrao com os seguintes
resduos: -1,9; +0,6; +0,4; +0,3; -0,4.
Estes resultados so melhores do que os obtidos sem o
recurso do MPI, isto para os dados de reas e concentraes da
Tabela 6, quando oito de quinze dados foram rejeitados. Resta
Compreender o porque da melhora, o que simples: como o PI est
junto com o analito em todas as solues cromatografadas, a
oscilao de volume de uma aplicao para outra afeta, na mesma
proporo, as reas de ambos. Portanto, quando elas so divididas
o efeito da variao do volume aplicado atenuado.
Finalmente, para quantificar o analito na amostra, adicionase a ela o PI na mesma concentrao usada anteriormente e, com a
razo de reas obtidas para a amostra interpola-se a correspondente
razo de concentraes e calcula-se a concentrao desconhecida
do analito.
Concluses
A anlise quantitativa implica na obteno de uma curva
analtica para o analito a ser quantificado. Dificilmente pode-se usar
outro composto para obter a curva, porque a sensibilidade de
resposta do detector (a inclinao da curva analtica) pode, alis
costuma, ser tpica do composto. Com a equao da curva
interpolam-se valores de quantidade (que pode ser concentrao
quando o volume aplicado constante) do analito em amostras
desconhecidas.
Extrapolaes no so vlidas, porque o comportamento
linear (s avaliamos curvas descritas por equaes do primeiro grau,
que so as mais comuns) s foi estabelecido na faixa estudada.
Para determinar a regio de linearidade usa-se o princpio da curva
de linearidade, apoiado num mtodo de identificao e rejeio de
dados anmalos os que desviam-se da linearidade por razes
experimentais. Caso a curva analtica tenha coeficiente linear igual
ou muito prximo de zero, a rejeio com o teste de Huber pode ser
realizada com sucesso diretamente sobre os quocientes de rea por
Concentrao (A/C - de fato, generalizando, Sinal/Quantidade).
Existindo coeficiente linear diferente de zero mais conveniente

17

aplicar o teste sobre valores do coeficiente angular. Para tal

submete-se os pares rea, Concentrao a uma regresso linear
para obter uma equao tentativa, com a qual interpolam-se os
coeficientes angulares a serem inspecionados para rejeio como
este um mtodo geral, o mais conveniente seria tambm
aplic-lo para os casos de coeficiente linear igual ou muito
prximo de zero. A inspeo final da qualidade e confiabilidade da
curva analtica obtida envolve o clculo dos resduos, avaliando-se
seus valores e sinais (pois, por exemplo, excesso de resduos
negativos ou positivos sugere algum erro experimental e,
consequentemente, repetio do experimento); claro que o total de
dados rejeitados tambm um fator importante. Uma faixa de
resduos compatvel com os recursos qumico analticos disponveis
e um coeficiente de correlao prximo da unidade sugerem que o
procedimento para obteno da curva analtica foi adequado.
No processo acima descrito o teste de rejeio de anmalos
fundamental. Propomos o uso do teste de Huber, porque ele
baseado na rejeio em relao a medianas um mtodo robusto,
pois independente dos anmalos. O teste de Huber implica na
definio do valor do fator k pelo analista, o que no deixa de ser
subjetivo. Contudo, a subjetividade baseada em conhecimentos da
metodologia analtica e pode ser avaliada para vrios valores de k,
buscando-se coerncia entre incertezas conseguidas com a curva
analtica e as esperadas para metodologia analtica. Alm deste
procedimento eliminar uma subjetividade absoluta, ele tem como
grande vantagem a interao do analista com seus dados, o que
certamente aumenta a sua viso da metodologia analtica que tem
em mos. Finalmente, curvas analticas tem de ser obtidas com
muitos dados, o que torna impraticvel rejeies por inspees
visuais, assim como torna muito tedioso aplicar o teste de Huber
com clculos manuais, o que sugere o uso de recursos como uma
planilha

eletrnica

que,

quando

adequadamente

estruturada,

recalcula todos os dados quando se altera o valor de k.

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