Disciplina de Controle de Qualidade

Microbiolgico e Biolgico

MICROBIOLOGIA ANALITICA
rea da microbiologia

DOSEAMENTO DE ANTIBITICOS

Os microrganismos so usados como reativos

Avaliao

de

certos

compostos

bioqumicos

( vitaminas, aminocidos e antibiticos)

Prof. Fbio Murakami

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

CARACTERSTICAS BSICAS PARA

MICRORGANISMO IDEAL

Tipos de microrganismos usados

nos ensaios

1. ser sensvel substncia que se vai avaliar

2. ser facilmente cultivvel

3. ter uma funo metablica ou resposta mensurvel

- Bactrias

- Leveduras

4. No ser suscetvel a variaes (caractersticas metablicas

devem permanecer constantes atravs de cultivos prolongados).

- Fungos

Outras caractersticas desejveis:

5. se possvel ter especificidade

6. no ser patognico

Murakami, F. S.

FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO

Murakami, F. S.

FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO

a) Idade e condies do cultivo

a) Idade e condies do cultivo

Usar fase logartmica de crescimento para minimizar a fase de latncia

Evitar o uso de cultivo com mais de 24 horas

b) Tamanho do inoculo

Os cultivos velhos no respondem adequadamente :

Predominncia

c) Temperatura

de

microrganismos

inativos

que

do

resposta

de

mudanas

na

desenvolvimento insuficiente.

Variao

de

fatores

de

crescimento

essenciais

ou

susceptibilidade a substncia antimicrobiana.

d) Meio de cultivo

Falta de capacidade para ser padronizado

o inculo pela variao do

nmero de clulas vivas.

e) Relao de O2

Possibilidade de autlise com o resultado de liberao de substncias que

podem interferir no ensaio.

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO

b) Tamanho do inoculo

FATORES IMPORTANTES EM UM ENSAIO

d) Meio de cultivo
Deve haver controle ntido sobre a composio do meio evitando variaes na
concentrao de certos ingredientes.

c) Temperatura

No

conter

constituintes

que

afetam

substncia

ensaiar

ou

microrganismo de ensaio.
pH no deve interferir nem na atividade da substncia

A temperatura selecionada dever dar os resultados desejados em

relao ao microrganismo de ensaio e a soluo de ensaio dentro do

e) Relao de O2.

tempo estabelecido para o ensaio em particular.

Fator de menor importncia mas que se deve levar em conta especialmente

nos mtodos turbidimtricos.

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

CRESCIMENTO DAS BACTRIAS SEGUNDO

BUCHANAN
Fase inicial 1 Estacionria (2 h)

No h crescimento.

Nmero de microrganismos contados = "inoculum"

CRESCIMENTO DAS BACTRIAS SEGUNDO

BUCHANAN
Fase de crescimento 3 (4 a 24 h)

Cada clula se divide em duas.

Fases em que h velocidade mxima de crescimento.

O nmero de clula aumenta em progresso geomtrica, enquanto que o
tempo cresce em progresso aritmtica.

Lag fase ou Fase de latncia 2 (4h)

A variao logartmica de (n de bactrias x tempo) expressa por uma

linha reta.

Dura poucas horas. Enzimas adaptativas (substrato).

Multiplicao muito lenta - o aumento gradual at o

inicio

da fase 3.

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

CRESCIMENTO DAS BACTRIAS SEGUNDO

BUCHANAN
Fase estacionaria 4 (25 a 35 h)

Contagem de bactrias viveis permanece constante - numero de bactrias
neo-formadas compensado pelas que comeam a morrer.

Fase de declnio ou morte das bactrias 5

DOSEAMENTO

POTNCIA - Antibiticos, vitamina as e aminocidos

Eficcia teraputica - efeito inibitrio sobre microrganismos
 no demonstrvel por mtodo qumico.

Diferentes concentraes de antibiticos  diferentes graus
de inibio

As bactrias viveis diminuem em nmero, deduz-se que h a morte

devido falta de elementos necessrios ao seu crescimento e o meio muda

Diminuio da atividade antimicrobiana teraputica.

de pH devido s transformaes das bactrias produzindo substancias

txicas

Murakami, F. S.

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HISTRICO

HISTRICO

1929 - Penicilina foi descoberta por Fleming;

Cepas microbianas: provenientes da American Type Culture Collection

(ATCC);

1948 - A dosagem microbiolgica para a Penicilina foi descrita na

Perodo de incubao sugerido: 16 a 18 h, sob temperatura de 32 a 35C

Farmacopia Britnica;

para a tcnica de difuso e 4 h de 34,5 a 35,5 C para turbidimetria;

1958 - A Farmacopia Britnica inclui 10 novos antibiticos;

O tipo de delineamento experimental 5 x 1 da USP XXIV apareceu

1955 - constou pela primeira vez na Farmacopia Americana (USP XV) o

inicialmente na sua 16 edio.

ensaio microbiolgico para antibiticos (tcnica de difuso em gel e

A Farmacopia Brasileira 5 edio descreve as metodologias de difuso

turbidimetria)

em gar e de turbidimetria para antibiticos, assim como procedimentos

SQR  produzida pela United States Pharmacopeia (USP);

estatsticos aplicveis aos ensaios biolgicos.

Padro de trabalho: fornecido pelo FDA;

Murakami, F. S.

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METODOS DE DOSEAMENTO DE ANTIBIOTICOS

E FATORES DE CRESCIMENTO

MTODO TURBIDIMTRICO

Mtodo de Difuso em Ensaio em Placas

O crescimento bacteriano em meio lquido

medido por turbidimetria e leitura da
turvao = crescimento)

Mtodo Turbidimtrico

Murakami, F. S.

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MTODO TURBIDIMTRICO

MTODO TURBIDIMTRICO

PARA ANTIBITICOS
PARA VITAMINAS E AMINOCIDOS

Diferentes concentraes de antibiticos produziro diferentes
graus de inibio.

Maior

A representao grfica das leituras de

ABSORBANCIA ou

TRANSMITANCIA nos tubos de diferentes concentraes de

antibitico,

permite

comparar

amostra

com

um

padro

concentrao

crescimento

de

maior

vitamina

maior

turbidez

maior

absorbncia e menor transmitncia.

(antibitico de referncia).

Maior concentrao antibitico  menor turbidez  menor

crescimento  menor absorbncia e maior transmitncia .
Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

MTODO TURBIDIMTRICO
T%

Antibitico

MTODO TURBIDIMTRICO
Vitaminas e aa

DO

DO

T%

Log conc

Log conc

Log conc

Antibitico

Vitamina

Meio Rico

Murakami, F. S.

Log conc

Meio pobre

Murakami, F. S.

MTODO TURBIDIMTRICO
VANTAGENS DO MTODO

Rapidez, pouco espao exigido, trabalho e material simples quando
computado com outros mtodos biolgicos, mtodo especifico e sensvel.

TCNICA MTODO TURBIDIMTRICO

Transferir 1,0 mL de cada soluo, seja do padro ou da amostra, para serie de 3 a 4 tubos
de dimenso padronizada, previamente esterilizados. Deve-se incluir na serie tubos controles
positivos e negativo

Adicionar 9,0 mL do meio de cultura inoculado

DESVANTAGENS

Alta sensibilidade  sofre interferncia de vrios fatores impurezas,

Homogeneizar e incubar sob as condies especificadas

(geralmente 36-37,5 C em banho-maria ou estufa 4 a 5 horas)

solues turvas ou coloridas.

necessrio validar o mtodo e manter sempre as mesmas condies.

Adicionar 0,5 mL de formaldedo diludo em cada tubo e ler a absorbncia ou transmitncia

em espectrofotmetro a 530 ou 580nm

Nota: O equipamento deve ser zerado com caldo no inoculado especificado para o antibitico ou fator de
crescimento teste, incluindo a mesma quantidade da soluo teste e formaldedo como adicionado em
cada tubo teste.
Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

METODO DA DIFUSO EM PLACAS

METODO DA DIFUSO EM PLACAS

Depende da difuso do produto em anlise atravs de um cilindro

O halo de inibio ou de crescimento ter o dimetro, dentro de

apropriado ou discos de papel ou em orifcios feitos na camada de gar

certos limites, proporcional a concentrao do produto.

semeado e solidificado numa placa de Petri.

A leitura feita nas zonas de inibio de crescimento (antibitico), ou nas
zonas de crescimento (vitamina e aminocidos) dos microrganismos.

Cilindros  10 mm H x 8 mm de dimetro externo x 6 mm interno  0,1 mL de soluo.

Discos  8 mm de dimetro. Papel de filtro embebido na soluo da subst.

Tempo de incubao:

16 a 24 horas;

5 a 7 dias B. subtilis

temperatura: 32 a 37C

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

METODO DA DIFUSO EM PLACAS

O valor resultante da zona de inibio depende:

METODO DA DIFUSO EM PLACAS

Ensaio Balanceado ou Fatorial (2 x 2)

Foi descrito por Knudsen e Randall (1945);

So empregados duas doses do padro e duas da amostra, com idntica

a) Da difuso externa do antibitico.

razo entre as doses;

Em que cada placa de petri de 10 cm de dimetro inclui todas as quatro

doses, de forma que o nmero de rplicas igual ao numero de placas
empregado;

b) Crescimento da bactria que tende a cobrir a superfcie nutriente

Murakami, F. S.

METODO DA DIFUSO EM PLACAS

Ensaio Balanceado ou Fatorial (2 x 2)

Ensaio quantitativo

Tambm conhecido como simtrico ou balanceado.

Murakami, F. S.

TCNICA DA DIFUSO EM PLACAS

Ensaio de difuso  emprego do meio de cultura em bicamada
Base busca uniformizao corrigindo interferncias e falhas tcnicas, a superfcie contem
o inculo)

Resultado atravs de clculos matemticos ou graficamente

O inculo a ser empregado deve apresentar a menor concentrao

Leitura:

microbiana, porm suficiente para apresentar crescimento que

Curva padro - amostra.

propicie contraste com a zona de inibio de crescimento, sem se

2 diluies - clculo da potncia;

apresentar como colnias isoladas;

2 dil. padro ( P e p ) ;

2 dil. Desconhecido (D e d ) ou Amostra (A 1 e A 2)

As concentraes usadas na curva de dosagem devem estar em

progresso geomtrica;

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

DELINEAMENTO DO ENSAIO

TEORIA DO MTODO DE DIFUSO

Sempre essencial que se trabalhe com rplicas

Emprega meio de cultura slido inoculado, distribudo em placas, em
sistema de mono ou bicamada, atravs da qual a substncia-teste se
difunde.

A soluo teste aplicada sobre a superfcie deste meio, em uma rea

restrita, e as placas so ento incubadas.

Devem ser considerados no clculo de potncia da amostra: condies

de tratamento prvio, extraes, diluies, teor de umidades

A potncia de amostras desconhecidas pode ser determinada pelo

dimensionamento da resposta de uma diluio ao apropriada, seguido
de leitura em curva padro.

O crescimento do microrganismo ocorre respeitando, porm, reas onde

tenha ocorrido a difuso do antibitico, gerando contraste e resultando a
chamada zona de inibio de crescimento, ou ainda restrito a reas onde
tenha ocorrido a difuso do fator de crescimento.

Murakami, F. S.

importante que a cada dia do ensaio haja a comparao da amostra

com padro de referncia, sob as mesmas condies.

Murakami, F. S.

3x1

Dispositivo para leitura de halos Eli Lilly Antibiotic Zone Reader

Placas de doseamento microbiolgico

de gentamicina pelo delineamento 3 x 1
antes e depois do perodo de incubao

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

ENSAIOS COM INTERPOLAO EM CURVA

PADRO (5 X 1)

ENSAIOS COM INTERPOLAO EM CURVA

PADRO (5 X 1)

Utilizado para determinao de potncia de nmero grande de amostras de

Cada placa inclui duas doses, em posies alternadas, cada uma em triplicata.

mesma natureza;

Em todas as placas uma das concentraes a de referncia, que a

Este delineamento estaria poupando esforos, pois permite anlise de vrias

concentrao central da curva padro; a outra uma das quatro concentraes

amostras e o maior nmero de nveis de concentrao do padro estaria

do padro (1, 2, 4 ou 5), ou a dose da amostra de potncia desconhecida, em

contribuindo para melhor estimativa da inclinao da reta;

nvel de dose nominal equivalente da referncia do padro

Murakami, F. S.

ENSAIOS COM INTERPOLAO EM CURVA

PADRO (5 X 1)

So preparadas 3 rplicas de placas para cada uma das 4 concentraes do
padro e para a concentrao da amostra;

Murakami, F. S.

ENSAIOS COM INTERPOLAO EM CURVA

PADRO (5 X 1)
A potnncia da amostra pode tambm ser obtida pela equao da reta, e
o clculo do coeficiente de correlao possibilita avaliar a
correspondncia de resposta do ensaio.

Grfico e construdo posicionando, em papel monolog, as mdias das leituras

das zonas de inibio corrigidas do padro, no eixo x, em escala aritmtica, e a

Os valores L e H so posicionados e ligados em linha reta, no papel

monolog.

concentrao (dose) do antibitico (escala logaritma), no eixo y;

Outra possibilidade consiste em aplicar equaes que conduzam ao clculo de

Log dose

dois pontos, atravs dos quais ser traada a reta, com maior segurana.

Dimetro dos padres

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

PREPARO DO INCULO

Microrganismos so fornecidos liofilizados

ETAPAS DO PREPARO DO INCULO

Microrganismo teste em tubos 10 mL do meio de cultura indicado na farmacopia

Incubao do tubo na temperatura e tempo indicado pela farmacopia

Recuperao em meio liquido,

3 mL de soluo salina estril  transferir a cultura para maior superfcie de gar 

frasco de Roux contendo 250 mL do meio de cultura indicado para o microrganismo

Incubar o frasco de Roux a 32-35 C/24h

Sub-culturas para retornar a caractersticas fisiolgicas

normais;

Manuteno com repiques em freqncia mensal;

Murakami, F. S.

Lavar a cultura resultante na superfcie do meio com 50 mL de soluo fisiolgica estril

PADRONIZAO DO NMERO DE MICRORGANISMOS por contagem microscpica
direta, contagem de viveis, medida de turbidez ou mtodo espectrofotomtrico

Determinar a quantidade de suspenso a ser adicionada a cada 100mL de agar ou
calda nutriente para produzir zonas de inibio claras e definidas ou relao satisfatria
dose-resposta no mtodo turbidimtrico.

Murakami, F. S.

FATORES DE INFLUNCIA

ETAPAS DO PREPARO DO INCULO

Preparar a camada basal pela transferncia de 21 mL do meio solido esterilizado e
fundido nas placas de Petri. Esperar solidificar

Transferir 4-5 mL do meio de superfcie previamente inoculado, mantido a 48-50 C,
e espalhar, sob rotao, at solidificao

Dispensar quantidades definidas da soluo do antibitico em reservatrios (cilindros
de vidro ou ao inoxidvel, templates de ao, discos de papel de filtro, cavidades
perfuradas no prprio agar nutriente)

Presena de outras substancias inibidoras;

Presena de nutrientes na amostra;

Tamanho do inculo;

Fase de crescimento da populao microbiana;

Natureza do meio;

Tempo e temperatura crticos.

Incubar 32-35 C/16-18h

Tcnica empregada: se em mono ou bicamada. A ltima resulta em zonas

Para algumas situaes pode ser recomendada a permanncia das placas por 30
minutos a 2 horas a temperatura ambiente anteriormente a incubao (pr-difuso)

Natureza inibitria ou estimulante dos componentes da amostra sobre o

Medir o dimetro das zonas de inibio de crescimento com preciso de 0,1 mm

(paqumetro, rgua milimetrada ou projetor ptico)

rea de aplicao da soluo teste;

de inibio mais ntidas, porm envolve maior dispndio de tempo;

microrganismo teste, alem de hidrossolubilidade e difusibilidade no gar;

Calcular a potncia da substncia conforme tipo de ensaio devendo ser determinados

os limites de confiana, empregando metodologia estatstica
Murakami, F. S.

Outros fatores que afetam o tamanho da zona

de inibio no meio todo de difuso:

Tempo de aplicao da soluo teste

Murakami, F. S.

DOSEAMENTO DE ANTIBITICOS
USP NF XXXI 2008
1. antibitico: P = penicilina G potssica 1.000.000 UI

Escolha do microrganismo e sua sensibilidade  deve ser sensvel

ao antibitico que se quer dosear

Fase de crescimento do microrganismo (cultura recente)

Condies exigidas pelo organismo teste para o crescimento 
formulao e condio do meio de cultura, pH do meio

A = penicilina G potssica 5.000.000 UI

2. mtodo: CP = cylinder plate (difuso em placas)  discos de papel
3. diluente: B1 = tampo n 1
4. organismo teste: S.aureus ATCC 297337
5. condies de incubao: 32 35 C, 24 horas (meio I)

densidade do inculo (padronizao)

6. preparo do inculo

Espessura e uniformidade do agar

7. solues para doseamento: P e D = 2,0 UI/mL

Volume de soluo teste aplicada a placa

p e d = 1,0 UI/mL

Temperatura e tempo de incubao

8. relao de doses: 2

Uso correto dos padres e amostras

9. ensaio: Ensaio Paralelo 2x 2

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.

ou considerar:

log M = log R x (D-P) + (d p)

se o desconhecido tivesse 100%  M seria = 1

(D- d) + (P p)
Conc. Terica  1
X  M obtido

concentrao Desconhecido = M x conc. Padro

Murakami, F. S.

Aceita-se 10%

Murakami, F. S.

Exemplo de clculo

Potncia do desconhecido em relao ao padro

M D/P = conc D em U/mL = quantidade de P em vol que produza um certo efeito

conc P em U/mL

quantidade de D em vol que produz o mesmo efeito

Murakami, F. S.

PLACA
1
2
3
4
Mdia

P
25
25
23
24
24,25

p
21
20
19
20
20,00

D
23
25
23
24
23,75

d
20
21
18
20
19,75

Murakami, F. S.

Exemplo de clculo

Exemplo de clculo

log M = log 2 x (23,75 24,25) + (19,75 - 20)

(23,75 19,75) + (24,25 - 20)
Log M = (- 0,50) + (-0,25) x 0,3010 = -0,75 x 0,3010 = - 0,02736
(4,00) + (4,25)
8,25

Assumindo que o frasco desconhecido tenha 5.000.000 U

M = 0,9389 = ~0,94

Aceita-se 5.000.000 U 10% (4.500.000 --- 5.500.000), logo o valor encontrado est
dentro dos limites permitidos.

Murakami, F. S.

5.000.000 U  1
X
 0,94
X = 4.700.000 U

Murakami, F. S.

Fim

Exemplo de clculo
Ou

Fim

concentrao real = concentrao esperada x M

concentrao real = 5.000.000 U x 0,94
concentrao real = 4.700.000 U

Murakami, F. S.

Murakami, F. S.