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2009/2010
Caracterizao Cintica da
Enzima Invertase
Relatrio TP2
Turma D - Grupo 1:
ngelo Dias, n 65087
Mrcia Santos, n 65111
Mariana Branco, n 65112
30 Outubro de 2009
Prof.: Jorge Leito
Resumo
A invertase catalisa a hidrlise da sacarose nos seus monmeros constituintes. Deste modo, na
actividade laboratorial, procedeu-se caracterizao cintica da invertase (beta-fructofuranosidase) a
partir do estudo do efeito da concentrao de sacarose (substrato) na actividade da enzima, em seis
ensaios. Analisados os resultados obtidos e recorrendo equao de Lineweaver-Burk obteve-se
e
.
Introduo terica
Hidratos de Carbono
Os hidratos de carbono so compostos ternrios de carbono, hidrognio e oxignio, com frmula
emprica
(podendo
).
As suas unidades estruturais so os
monossacardeos ou oses, classificados de
acordo com o nmero de carbonos da
molcula (por exemplo, um monossacardeo
de cinco carbonos denomina-se pentose) e
que possuem vrias funes lcool e uma
funo redutora, aldedo ou cetona. Se a
funo carbonlica for um aldedo, como na
glucose, o monossacardeo denomina-se
aldose, se for uma cetona, como na frutose,
designa-se cetose (Fig.1).
Enzimas
As enzimas so protenas de grandes dimenses especializadas na catlise de reaces biolgicas, isto
, aceleram a velocidade de reaco diminuindo a energia de activao. Podem ser totalmente proteicas
ou constitudas por uma parte proteica (apoenzima) e outra parte no proteica, os cofactores. Estes
ltimos podem ser ies metlicos, grupos prostticos ou coenzimas e so responsveis pela
transformao estrutural do substrato.
Apesar de participarem nas reaces, as enzimas no alteram o equilbrio das mesmas e encontram-se
inalteradas no final da reaco.
Estes biocatalisadores so compostos por um centro activo ou sitio activo que constitudo pelos
aminocidos que esto em contacto com as molculas (substrato) que sero catalisadas. Este local dividese em local de fixao onde a enzima se liga ao substrato por ligaes fracas e em centro cataltico no qual
o substrato sofre a reaco qumica.
As enzimas no reconhecem todas as molculas, pelo contrrio, eles reconhecem especfica e
selectivamente os seus substratos entre todas as outras molculas. Esta especificidade controlada por
um encaixe nico entre enzima e substrato.
Existem dois modelos para a interaco enzima-substrato: o modelo chave-fechadura, e o modelo de
encaixe induzido. O primeiro assume que somente um substrato com uma conformao apropriada
consegue encaixar-se no centro activo da enzima. Ao contrrio, no modelo do encaixe induzido a enzima
molda o seu centro activo a fim de conseguir um encaixe com a molcula.
O trabalho enzimtico pode ser regulado atravs de inibidores e/ou activadores- regulao alostricao que pode ser benfico do ponto de vista da poupana energtica dos organismos.
A classificao das enzimas baseia-se no tipo de reaco que catalisam, dividindo-se assim em seis
categorias:
Oxiredutases;
Transferases;
Hidrolases;
Liases;
Isomerases;
Ligases.
Das hidrolases faz parte a enzima invertase ou beta-fructofuranosidase
(EC 3.2.1.2.6), responsvel pela hidrlise da sacarose nos seus monmeros
constituintes, a glucose (acar redutor) e a frutose. Por definio, uma
unidade (U) de invertase hidrolisa 1 mmol de sacarose a glucose e frutose
por minuto a pH=4.6 e a 25C.
Uma grande quantidade de microorganismos produz invertase (Fig.6),
contudo comercialmente biosintetisada atravs da Sacharomices cerevisae
ou da Sacharomices carlsbergensis. Contrariamente maioria das enzimas, a
invertase tem uma elevada actividade no intervalo de pH 3.5-5.5 com um pH
ptimo em 4.5 e um mximo de actividade a aproximadamente 60C. Esta
Fig. 6 Enzima invertase.
enzima utilizada principalmente na indstria alimentar onde a frutose
preferida em relao sacarose, porque mais doce e no cristaliza to
facilmente. Uma outra utilizao da invertase na produo de mel artificial.
Aps uma hidrlise de sacarose para se poder determinar a quantidade de glucose presente numa
soluo utiliza-se reagente DNS e a tcnica de espectofotometria. O cido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) na
presena de um acar redutor, a glucose, reduzido por este a 3-amino-5-nitrosalicilico que apresenta
uma cor laranja/vermelho. Finalmente, com o espectofotometro possvel determinar a absorvncia que
permite calcular a concentrao do acar redutor por intermdio de um grfico de ajuste linear que
relacione estas duas grandezas.
Cintica Enzimtica
A actividade enzimtica pode ser avaliada atravs de vrios modos, por exemplo com base na
actividade molar, ou seja o nmero de moles de substrato transformado por mole de enzima por unidade
de tempo, ou at por unidade enzimtica, que a quantidade de enzima que catalisa a transformao de
um micromole de subtrato num minuto, a 25C, nas condies ptimas de pH e concentrao de
substrato. Assim podem-se obter grficos substrato transformado em funo do tempo, nos quais se
conclui que existe uma dependncia linear entre a velocidade inicial de uma reaco enzimtica e a
concentrao de enzima na reaco.
Foram Leonor Michaelis e Maud Menten, quem primeiro estudou estas relaes, apresentando em
1913 um estudo quantitativo das variaes da velocidade de uma reaco de acordo com o aumento da
concentrao de substrato na mesma (Fig.7). Assim, atravs da equao
, em
que E a enzima, S o substrato e E-S o complexo enzima-substrato. Do estudo desta reaco surge a
constante de Michaelis
complexo E-S, onde [E] a concentrao de enzima livre, [S] a concentrao de substrato e [E-S] a
concentrao de enzima que se ligou ao substrato. Substituindo na expresso de
[E]=[E0]-[E-S], fica
.
Como se tinha observado que velocidade da reaco era
directamente proporcional concentrao de enzima
ligada, significava que
(E0 a
concentrao total de enzima ligada ao substrato, e
velocidade mxima corresponde a do momento em que
todas as enzimas esto ligadas ao substrato) e, portanto,
, que substituindo na expresso de
fica
, ento
igual concentrao de
Menten vem
, designada por
Absorvncia
A absorvncia uma propriedade que mede a capacidade de um material de absorver radiao com
uma frequncia especfica, avaliada atravs de aparelhos designados por espectrofotometros, que se
baseiam na propriedade que muitas espcies tm de absorver radiao ultravioleta e visvel.
Procedimento
Material:
Foi utilizado material comum de laboratrio, tais como pipetas de preciso, copos de vidro, tubos de
ensaio, suportes e espectrofotometro.
Procedimento experimental:
A experincia consiste na caracterizao cintica da
enzima invertase, e como tal estudou-se o
comportamento da enzima em solues com
diferentes concentraes de sacarose: 15, 30, 45, 60,
75 e 100 g/l. Uma vez que para cada concentrao o
procedimento igual, apenas se vai descrever para
uma.
Comeou-se por numerar 9 tubos de ensaio de 0 a 7
e um branco e colocar num suporte para tubos de
ensaio. Colocou-se 500 l de DNS (Fig.12, lado
esquerdo) em todos os tubos de ensaio com uma
pipeta de preciso, adicionando-se no final 500 l de
Tampo de acetato (Fig.12, lado direito),
exclusivamente no tubo de ensaio branco, tapando
com uma tampa solta e agitando no vrtice (Fig.13,
Azul).
Iniciou-se a experincia pela concentrao mais
baixa de sacarose, 15 g/l, em que se colocou 25 ml de
soluo de sacarose no vaso reaccional, com agitador,
em contacto com o thermomix, aparelho encarregue
de termostatizar a soluo temperatura ptima de
45C para a enzima actuar (Fig.13, Amarelo e Verde).
Fig. 18 Medio
espectrofotometro.
das
absorvncias
no
Resultados Experimentais
Apresentam-se as tabelas e os grficos construdos a partir dos valores registados e dos clculos
efectuados. Primeiramente os grficos de acares redutores em funo do tempo decorrido, para cada
uma das seis concentraes estudadas. De seguida construiu-se o grfico do inverso da velocidade em
funo do inverso da concentrao.
Concentrao: 15g/l
Absorvncia
0
1
2
0,016
0,103
0,189
43,167
188,167
331,500
3
4
0,258
0,386
446,500
659,833
5
6
7
0,471
0,555
0,637
801,500
941,500
1078,167
15g/l
[Acares redutores] (mg/l)
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
Tempo
decorrido
(min)
y = 150,42x + 34,833
R = 0,9973
1200
1078,167
941,5
1000
800
801,5
659,833
600
400
331,5
188,167
200
446,5
43,167
0
0
Concentrao: 30g/l
Absorvncia
0
1
0,052
0,205
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
103,167
358,167
0,395
674,833
0,391
668,167
4
5
0,496
0,606
843,167
1026,500
6
7
0,720
0,790
1216,500
1333,167
10
30g/l
[Acares redutores] (mg/l)
Tempo
decorrido
(min)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
y = 168,23x + 189,14
R = 0,9737
1216,500
1026,5
843,167
674,833
358,167
1333,167
668,167
103,167
0
Concentrao: 45g/l
Absorvncia
0
1
0,071
0,185
134,833
324,833
0,304
523,167
3
4
0,443
0,574
754,833
973,167
0,711
1201,500
6
7
0,850
1,062
1433,167
1786,500
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
Tempo
decorrido
(min)
y = 230,44x + 84,972
R = 0,9933
45g/l
2000
1786,5
1500
1433,167
1201,5
973,167
754,833
523,167
324,833
134,833
1000
500
0
0
Concentrao: 60g/l
Absorvncia
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
0
1
2
3
4
5
6
7
0,099
0,224
0,334
0,449
0,559
0,665
0,782
0,901
181,5
389,833
573,167
764,833
948,167
1124,833
1319,833
1518,167
11
60g/l
Tempo
decorrido
(min)
y = 188,63x + 192,33
R = 0,9997
1518,167
1319,833
1124,833
948,167
764,833
573,167
389,833
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
181,5
0
Concentrao: 75g/l
Absorvncia
0
1
0,095
0,243
174,833
421,5
0,358
613,167
3
4
0,461
0,580
784,833
983,167
0,738
1246,5
6
7
0,878
0,949
1479,833
1598,167
y = 206,59x + 189,69
R = 0,996
75g/l
[Acares redutores] (mg/l)
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
Tempo
decorrido
(min)
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
1598,167
1479,833
1246,5
983,167
784,833
613,167
421,5
174,833
0
4
6
Tempo decorrido (min)
Concentrao: 100g/l
Absorvncia
0
1
0,276
0,402
0,531
901,500
3
4
0,631
0,714
1068,167
1206,5
0,882
1486,500
6
7
0,981
1,018
1651,500
1713,167
476,500
686,500
100g/l
[Acares redutores] (mg/l)
Concentrao
de acares
redutores
(mg/l)
Tempo
decorrido
(min)
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
y = 183,04x + 508,17
R = 0,9895
1486,5
901,5
1713,167
1651,5
1206,5
1068,167
686,5
476,5
12
Lineweaver-Burk
[Sacarose]
(g/l)
[Sacarose]
(mg/l)
Velocidade
(mg/(l.min))
((l.min)/mg)
(l/mg)
15
30
45
60
75
100
150,42
168,23
230,44
188,63
206,59
183,04
y = 26,563x + 0,0047
R = 0,5377
Lineweaver-Burk
1/Velocidade ((l.min)/mg glucose)
7,0E-3
6,0E-3
0,00648
0,00594
0,00546 0,00530
5,0E-3
4,0E-3
0,00484
0,00434
3,0E-3
2,0E-3
1,0E-3
0,0E+0
0,0E+0
1,0E-5
2,0E-5
3,0E-5
4,0E-5
5,0E-5
13
6,0E-5
7,0E-5
8,0E-5
Clculos
A partir dos valores de absorvncia medidos no espectofotmetro e da equao de ajuste do grfico
de absorvncia em funo da concentrao de acares redutores:
dado,
retiraram-se as concentraes de acares redutores, substituindo em os valores de absorvncia e
resolvendo em ordem a .
Recorrendo Equao de Lineweaver-Burk,
,
em conta que a massa molar sacarose 342,296 g/mol.
14
tendo
Discusso
Atravs da anlise e comparao dos valores de absorvncia determinados pelo espectofotmetro,
verificou-se, tal como espectvel, que a concentrao glucose resultante da hidrlise da sacarose,
aumentou com o decorrer do tempo. Todavia, a correspondncia do tempo com a concentrao de
glucose no est totalmente correcta, visto que a partir do momento que retirada a soluo do vaso
reaccional at esta ser colocada no tubo em contacto com a soluo tampo de acetato decorrem alguns
segundos, durante os quais a enzima invertase continua a actuar. Assim, as concentraes
correspondentes aos tempos das tabelas sero um pouco mais baixas que aquelas que esto
apresentadas.
A variao da concentrao de produtos em funo do tempo apresenta uma correlao
aproximadamente linear, no entanto teoricamente os valores de concentrao deveriam tender, aps um
intervalo de tempo suficientemente grande, para o valor de concentrao inicial de sacarose. Como os
valores de concentrao de glucose ao final de sete minutos so muito inferiores ao seu valor final, os
grficos acima construdos no permitem chegar a essa concluso.
A partir do grfico de Lineawer-Burk construdo para esta experincia verifica-se que, apesar de alguns
valores estarem relativamente em desacordo com o expectvel (longe da recta de ajuste ou decrescerem
ao invs de crescerem) o seu declive positivo, donde se conclui que, na generalidade, um aumento da
concentrao de substrato corresponde a um aumento na velocidade. Idealmente, medida que a
concentrao de substrato aumenta, a velocidade deveria aumentar. Porm, os resultados obtidos
distanciam-se ligeiramente da cintica enzimtica descrita por Lineweaver-Burk, evidenciando os erros
sistemticos e acidentais presentes na realizao do trabalho laboratorial.
O valor de KM calculado (
M) est dentro do limite terico previsto (10-8 a 10-2M, como
explicitado no Fundamento Terico). Contudo, no existem valores de referncia que permitam comparar
os valores de velocidade mxima da reaco e de KM, pelo que no se pode inferir quanto aos erros
analticos cometidos, nem exactido dos resultados experimentais. Note-se ainda que este valor,
16,5mM, corresponde concentrao para a qual, a velocidade da reaco metade da velocidade
mxima.
Os erros dos resultados obtidos advm de diversos factores. No s das condies ambientais do
laboratrio, como a temperatura e presso, mas tambm as condies do meio de cultura influenciam,
tanto positiva como negativamente, a reaco. Alm disso, a determinao da concentrao das solues
por espectofotometria indirecta (relembre-se que foi feita atravs da equao do grfico dado),
podendo apresentar erros que influenciam directamente a aplicao da equao de Lineweaver-Burk.
15
Bibliografia
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Superior Tcnico, 1 Semestre, 2008/2009, pg. 10 - 12;
CAMPOS, Lus S.; Entender a Bioqumica (5.Ed.) , 2009, Escolar Editora, Lisboa, pg. 153 161,
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G. M. Copper, R. E. Hausman, The Cell, a molecular approach (4 Ed.) , 2007, ASM Press-SinauerAssociates Inc., Washington, D.C., pg. 44 46, 73 - 80;
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16