células-tronco

Existem dois tipos de células-tronco: as embrionárias e as adultas.

Para que uma célula seja considerada “células-tronco”, necessita possuir três
fatores principais: 1 – Auto-renovação; 2 - Uma única célula deve ter a
capacidade de diferenciar-se em diferentes tipos de tecidos; 3 – As células que
a constitui devem reconstituir um determinado tecido in vivo.
Baseado-se na mitologia grega, se recorda da História de Prometeu,
pois, esse foi acorrentado no monte Cáucaso pelo o Pai dos deuses – Zeus -
por ter entregado o fogo a humanidade. Além disso, todos os dias uma águia
comiam o seu fígado, era como se fosse uma alusão a essa futura tecnologia
das células-tronco, porque o fígado dele sempre se regenerava, uma
multiplicação celular.

1.1 Visão Geral

As células-tronco podem ser definidas como células indiferenciadas

capazes de auto-renovação, e de se diferenciar originando progenitores
maduros, compreendendo tanto progenitores que não se renovam quanto
células efetoras - categorias de linfócitos (células do sistema imunológico),
essas células já estão preparadas para atuar na defesa do organismo e as
células de memória ficam de prontidão à espera que haja nova invasão pelo
mesmo antígeno - que são completamente diferenciadas. É importante
restringir esta definição de células únicas que, uma vez desenvolvidas, se auto-
renovam por toda a vida de um organismo, a fim de distinguir as células-tronco
dos muitos tipos de células progenitoras (com auto-renovação limitada). Assim,
funcionalmente, as células-tronco são células multipotentes localizadas no topo
da hierarquia das linhagens.
Até pouco tempo acreditava-se que apenas as células-tronco
embrionárias eram capazes de se diferenciar em células de origem
ectodérmica, endodérmica e mesodérmica. Em 1999, vários estudos

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surpreenderam os cientistas mostrando que as células-tronco de um tecido,
como o encéfalo, poderiam se transformar em outras, como células
sanguíneas. Esses estudos revelam o poder inesperado das células-tronco de
adultos.
A classificação das células-tronco tem sido feita com base no seu
potencial de desenvolvimento. São chamadas de totipotentes as células
capazes de gerar todos os tipos celulares embrionários e extra-embrionários,
pluripotentes as que podem originar todas as células que formam um embrião
(propriamente dito), multipotentes quando originam um subgrupo de linhagens
celulares, oligopotentes são capazes de gerar células mais restritas a uma
linhagem do que as multipotentes e, por final, as unipotentes podem contribuir
originando apenas um único tipo celular maduro (WAGERS AND WEISSMAN,
2004).
As células-tronco, por poderem, teoricamente, ser induzidas a se
diferenciar em qualquer tipo celular do corpo, revelam possibilidades nunca
antes imaginadas, como tecidos originados em laboratório e até substituição de
órgãos e células para tratar uma gama de distúrbios humanos.
Segundo Verfaillie, (SCIENCE, 2000), além das fronteiras resultantes
dos dilemas éticos ao redor de pesquisas usando células-tronco embrionárias e
fetais, as células provenientes de adultos possuem uma vantagem adicional:
elas são mais fáceis de manipular. As células-tronco embrionárias tendem a se
diferenciar espontaneamente em todos os tipos de tecidos. Quando injetadas
sob a pele de um camundongo imunossuprimido, por exemplo, elas podem
crescer dando origem a teratomas. Ao contrário, as células-tronco de adultos
não se diferenciam espontaneamente, mas podem ser induzidas por meio da
administração de fatores de crescimento apropriados ou outros sinais externos.
Os fatores mitogênicos necessários para a indução da proliferação dessas
células ainda não são completamente conhecidos.
No entanto, as células-tronco adultas parecem ter uma desvantagem
no que se refere à perda de sua capacidade de se dividir e se diferenciar após
certo tempo em cultura, o que as torna inadequadas para algumas aplicações
terapêuticas. Já as células-tronco embrionárias parecem ter capacidade infinita
de se dividir e não perdem sua potencialidade.

3
 O grande interesse em estudar as células-tronco vem da sua
capacidade em originar diversos tipos de células que constituem o corpo e
talvez forneçam substituições para tecidos lesados pela idade, por trauma ou
doença. Sendo assim, as células-tronco possuem uma gama de aplicações em
terapias para diversas doenças consideradas até então incuráveis e outras
para as quais não há tratamento farmacológico eficaz. Dentre essas doenças
podem-se destacar as doenças neurodegenerativas como Parkinson,
Alzheimer, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, retinopatias e
muitas outras como diabetes tipo II, acidentes vasculares (incluindo AVC),
cardiopatias e câncer.
Os resultados obtidos até o momento com terapias celulares utilizando
as células-tronco têm sido animadores. Já existem estudos em andamento na
fase clínica que revelam perspectivas nunca antes imaginadas, dando
esperança para os pacientes. Apesar da aparente promessa de serem capazes
de curar todo tipo de doença, o conhecimento científico por trás das aplicações
terapêuticas das células-tronco deve estar bastante sólido antes de ser
utilizado pela comunidade médica.

1.2 Obtenção e cultivo de células-tronco:

As amostras de medula óssea são obtidas a partir de fêmures de ratos

adultos (250 g) da linhagem Wistar. Para cada período de cultivo (cultura nova
e antiga) foi utilizado um rato. Os animais são sacrificados por overdose de
anestésico (tiopental sódico - Cristália; 3,5 mL/animal ) e têm os dois fêmures
dissecados, eliminando os tecidos muscular e conjuntivo associados. Em
seguida são feitos dois cortes na região das epífises, removendo-as,
possibilitando a entrada da agulha na cavidade medular, onde são injetados 10
mL de DMEM (Dulbeco´s Modified Eagle Medium - GibcoBRL) sem soro.
O material obtido é ressuspenso e centrifugado a 1.500 rpm durante
10 minutos. O pellet é ressuspenso em DMEM sem soro, num volume de cerca
de 4 mL e transferido para um outro tubo de 15 mL contendo 4 mL de Ficoll-
Paque (densidade 1.077 g/mL - Amersham Biosciences; diluição Ficoll:meio de
1:1), evitando que as duas fases líquidas se misturem. Centrifuga-se a 2.000

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rpm durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir, coleta-se o anel de
células na interface Ficoll-células e as ressuspende em solução BSS
respeitando a diluição 1:5 (células: BSS). Centrifuga-se novamente a 1.500 rpm
durante 10 minutos à temperatura ambiente, desprezando o sobrenadante.
Esse procedimento deve ser repetido mais duas vezes a fim de retirar o
excesso de Ficoll, que é tóxico para as células.
Após a última lavagem, o pellet é ressuspenso em 1 mL de DMEM
com 20% de soro fetal bovino (SFB – StemCell Technology) e então as células
são contadas, utilizando Trypan Blue (GibcoBRL) para acessar a viabilidade
das células extraídas. Por final as células são plaqueadas em frascos canted
neck com filtro (Corning), de 25 cm2, com 5 mL de meio de cultura composto
por DMEM 20% SFB acrescido de 1% de penicilina e estreptomicina (StemCell
Technology) e de 4% de L-glutamina (GibcoBRL).
São plaqueadas 1x106 células na cultura mais antiga e 3x106 células
na cultura considerada nova. As células foram mantidas em estufa a 37 oC em
5% de CO2 e umidade de 95%. O meio de cultura é trocado a cada 3 ou 4 dias,
retirando-se 4 mL do meio acondicionado e substituindo-se por 4 mL de meio
fresco.
Quando as células em cultivo alcançavam confluência de
aproximadamente 80%, era feita a passagem. Removendo o meio de cultura
do frasco, as células mesenquimais aderentes permanecem aderidas ao
frasco. Essas células devem ser lavadas com DMEM sem soro para remover o
SFB residual e depois incubadas com 1 mL de tripsina e EDTA (StemCell
Technology), a 37 ºC até se destacarem (cerca de 4 minutos). Às células já
soltas, adiciona-se meio de cultura com 20% de SFB para neutralizar a ação da
tripsina. As células são centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos, então o
sobrenadante é removido e o pellet é ressuspenso em meio de cultura
completo (DMEM + 20% SFB). Essas células podem agora ser divididas em
novos frascos de 25 cm2 para cultura. A cultura de células antiga sofreu 4
passagens, sendo que na primeira a concentração foi de 1:4, na segunda,
terceira e quarta passagens foi de 1:10. Já a cultura nova permaneceu na
passagem até a realização dos experimentos.

1.3 Indução de diferenciação

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 O protocolo de indução da diferenciação das células-tronco
mesenquimais em células neurais consiste nas seguintes etapas:
Pré-indução: o meio de cultura é substituído pelo meio pré-indutor,
composto por DMEM / 20% SFB e 1 mM de b-mercaptoetanol (Sigma), sendo
as células incubadas nessa solução durante 24h.
Indução: posteriormente recebem tratamento com os indutores neurais
butil-hidroxi-anizol (BHA / butylated hydroxyanisole - Sigma) (200 mM) e
dimetil-sulfóxido (DMSO - Sigma) (2%) em DMEM. A solução de BHA deve ser
feita em álcool 70%. Para posterior realização da imunocitoquímica foram
adotados dois intervalos de tempo para a indução neural: 24 e 72 horas, após
os quais as células são fixadas.

1.4 Obtenção e cultivo das células-tronco neurais

As células-tronco neurais são obtidas a partir de encéfalo de embrião

E14 e da zona subventricular (SVZ) de adulto, ambos de camundongos da
linhagem balb/c. Os animais utilizados são sacrificados por deslocamento
cervical.
Tanto os embriões de camundongo E14 quanto o encéfalo de
camundongo adulto são depositados em uma placa de Petri contendo PBS
com 2% de glicose. A dissecação é feita em uma lupa e o material obtido é
transferido para um tubo adicionando-se em seguida 5 mL do meio de cultura
suplementado. A seguir o tecido é triturado passando pela pipeta com ponteira
de 1.000 mL seguido pela ponteira de 200 mL, até obter-se uma suspensão de
células únicas. As células obtidas são quantificadas e a viabilidade avaliada
usando Trypan Blue (GibcoBRL).
As células são plaqueadas em frascos T-25 canted neck (Corning) na
densidade de 2x105 células por mL em 10 mL de meio de cultura completo. O
meio de cultura para as células tronco neurais é composto por 10% de
NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements (StemCell Technology) e 90% de
NeuroCultTM NSC Basal Medium (StemCell Technologies), específicos para
murinos. Além disso, também deve ser adicionado hEGF (20 ng/mL), FGF-2
(20 ng/mL) e heparina (5 mg/mL). As neuroesferas são centrifugadas a 1.200

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rpm por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada frasco é trocado a
cada 3 ou 4 dias, substituindo por meio de cultura fresco. As neuroesferas
formadas são mantidas numa estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior
que 95%) e da proporção de CO2 (5%) no ar.

1.5 Indução de diferenciação

Primeiramente as neuroesferas devem ser dissociadas

mecanicamente – passando-se pelas ponteiras de 1.000 mL e de 200 mL – e
plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-lisina e laminina, que
promovem a adesão das células. Após terem aderido, permanecem em poços
(Multiwell de 12) contendo 1 mL de meio de cultura composto por NeuroCult TM
NSC Basal Medium, NeuroCultTM NSC Proliferation Supplements e 2% de soro
fetal bovino (SFB) (StemCell Technology), sem fatores de crescimento. As
células são mantidas nesse meio de cultura em estufa (37 ºC, 5% CO 2,
umidade > 95%) por 1 dia, quando inicia-se o tratamento com o meio de
indução de diferenciação.
Cada poço recebe uma combinação específica de compostos,
adicionados ao meio de cultivo descrito acima (volume final = 1 mL), que
induzem diferenciação em determinado tipo celular, como segue adiante:
a) Diferenciação neuronal: adiciona-se ácido-retinóico all-trans (RA)
(Sigma) e forscolina em concentração final de 0,1 mM e 5 mM,
respectivamente.
b) Diferenciação em astrócito: adiciona-se 50 ng/mL de proteína
morfogenética de osso-2 (BMP-2 - R&D System), 50 ng/mL de fator inibitório de
leucemia (LIF - Sigma) e 1% de soro fetal bovino (StemCell Technology).
c) Diferenciação em oligodendrócito: adiciona-se 500 ng/mL de IGF-1
(insulin-like growth factor-1 - R&D System).
As células permanecem no meio indutor de diferenciação por 5 dias,
que é substituído no terceiro dia.

2 Cientistas convertem células da pele em células

tronco

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 A hipótese de utilizar células-tronco para tratar de doenças antes
incuráveis é um sonho da medicina. Ela parece mais perto da realidade após
cientistas norte-americanos e japoneses anunciarem ter convertido células da
pele em células-tronco embrionárias. Mas o caminho para o uso em larga
escala dessa panacéia inventada pela engenharia genética ainda é longo e
tortuoso.

A notícia causou estardalhaço no fim de novembro: pesquisadores

norte-americanos e japoneses transformaram células da pele em equivalentes
de células-tronco embrionárias humanas, sem recorrer à clonagem ou à
produção de embriões. A técnica representaria, assim, um caminho
desimpedido nessa que é uma das mais promissoras fronteiras de pesquisa na
medicina. Ela não enfrentaria, em princípio, as questões éticas e religiosas em
que as outras alternativas se enredam. Tanto é que recebeu apoio
praticamente imediato do presidente norte-americano, George W. Bush –
interessado no apoio dos cristãos fundamentalistas integrantes de sua base
eleitoral – e de outros segmentos religiosos conservadores.

Células-tronco são, numa definição simples, células primitivas,

produzidas enquanto o organismo se desenvolve e capazes de originar outros
tipos de células. As pesquisas com elas têm animado os cientistas ao redor do
mundo pela possibilidade que oferecem de trazer cura para problemas hoje
incontornáveis pela medicina.

À maneira de curingas do baralho, elas poderiam ser introduzidas no

corpo do paciente para fazer as funções das células e tecidos lesionados.
Alguns tratamentos experimentais nessa área, como os realizados na
Faculdade de Medicina da USP em Ribeirão Preto (SP), têm obtido resultados
estimulantes. Mas as pesquisas ainda estão no início, e o que se sobressai por
enquanto é a polêmica sobre como conseguir essas células.

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 A primeira pesquisa envolvendo o uso de células-tronco embrionárias
humanas foi divulgada em 1998 pela equipe do professor James Thomson, da
Universidade de Wisconsin (Estados Unidos). Dois anos antes, a equipe do
cientista britânico Ian Wilmut havia divulgado o nascimento da ovelha Dolly, a
primeira clonagem bem-sucedida da história – e um caminho natural para a
obtenção de células-tronco.

Não demorou em surgir uma feroz oposição a essas linhas de

pesquisa, principalmente vinda de segmentos religiosos. A idéia de clones
humanos – mesmo que em princípio destinados a finalidades terapêuticas –
ainda é fortemente rejeitada e, para muitos, usar embriões em estudos como
esses significa liquidar possibilidades de vida. Não adiantou muito o fato de os
cientistas dizerem que usam em seus experimentos embriões descartados em
clínicas de fertilização, os quais teriam o lixo como destino certo. Para os
opositores da idéia, empregar embriões com essa finalidade é um assassinato
e ponto final.

É por isso que a possibilidade de obter células-tronco a partir de

células da pele atrai tanto. Em tese, essa alternativa elimina as objeções
políticas, religiosas e éticas, além de contornar o risco de rejeição por parte do
paciente.

Os estudos a esse respeito foram conduzidos, além da equipe de

Thomson, por pesquisadores liderados por Shinya Yamanaka, das

9
universidades de Kyoto e San Francisco (Califórnia, Estados Unidos). Por
processos semelhantes, segundo relataram respectivamente nas revistas
Science e Cell, os dois grupos induziram células cutâneas a voltar ao estágio
de embrionárias e, a partir daí, a se transformar em neurônios e em células
cardíacas. As novas estrelas dessa área receberam o nome de células-tronco
pluripotentes induzidas, ou iPS.

A chave para o sucesso foi à descoberta, por essas equipes, de que,

entre mais de mil genes capazes de reprogramar as células, quatro deles,
quando combinados, podem “ligar” ou “desligar” funções celulares – o que
permite que uma célula adulta se torne uma embrionária. Foi um grande
esforço de tentativa e erro: no caso dos japoneses, a proporção foi de uma
célula-tronco embrionária obtida para cinco mil células da pele inoculadas, ante
uma para dez mil nos experimentos norte-americanos.

2.1 Células-tronco embrionárias (CTE)

A primeira vez descrita foi no ano de 1981, através da realização de

testes em camundongos, como mencionado logo a cima. Já no ano de 1994 foi
iniciada a primeira vez pesquisa sobre CTE humanas, pelo isolamento dessas
células. No ano de 1998, há um grande avanço científico no desenvolvimento
de métodos para cultivo e manutenção das mesmas.

BLASTÓCITO DE CINCO DIAS

10
2.2 Cultura de células-tronco embrionárias humanas (CTEh

Células-tronco Embrionárias (CTE) apresentam vantagens e

desvantagens, a primeiras são: alta platicidade, elevada capacidade
proliferativa (diferenciação de celular rápida), alta telômeros/ telomerase. A
segunda, deve-se considerar a discussão ética e teratomas - é um tumor misto,
formado por resíduos fetais e tecidos embrionários. Um tipo de tumor de
células germinais derivado de células pluripotentes e constituído de elementos
de diferentes tipos de tecido de uma ou mais das três camadas de células
germinais; mais freqüentemente encontrado no ovário ou no testículo em
adultos e na região sacrococcígea em crianças. Os teratomas variam de
benignos (maturo, dermóide e cístico) a maligno (imaturo e sólido).
(DORLAND, 28ª ED)

3 AS FONTES E OS DIFERENTES TIPOS DE CÉLULAS-

TRONCO ADULTAS:

(A) CÉLULAS-TRONCO HEMATOPOÉTICA (CTH):

Elas são encontradas principalmente em: Medula óssea, Sangue
periférico (aférese), Sangue de Cordão Umbilical e Placentário (SCUP). Está
presente em cerca de 1% das células nucleadas da medula óssea e do SCUP.
Principais características: Auto-renovação, Diferenciação, Mobilização,
Homing. Quando em um adulto normal, a medula óssea produz por hora: 10¹º
eritrócitos e 10( dez elevada oitava) - 10 (dez elevada a nona) leucócito ou
seja: 3 milhões de células por segundo.
B) CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAL (CTM)
Artigos descrevem sua presença em: Tecido Adiposo, Pâncreas,
Medula Óssea, Fígado, Sistema Periférico Fetal, Tendão, Membrana Sinovial,
Líquido, Amniótico, Sangue Periférico pós-natal - Sangue de cordão umbilical,
Quantidades de CTM na Medula Óssea: 1 CTM para 10.000 a 100.000 células

11
da medula óssea. Suas duas funções: Dar suporte à hematopoese, formar
microambiente medular (estroma).

DIFERENCIAÇÃO CELULAR

3.1

DIFERENCIAÇÃO CELULAR

Uma chance de cura

As possíveis perspectivas terapêuticas – uma segunda chance a

muitos: Doenças do sistema nervoso central (doenças de Alzheimer e
Parkinson e reconstituição da medula espinhal de pacientes paraplégicos e
tetraplégicos); Insuficiência cardíaca e tratamento de pacientes que sofreram
infarto do miocárdio (tratamento do infarto do miocárdio, isquemia crônica,
miocardiopatia dilatada e doença de Chagas), diabetes; doenças
hematológicas, como leucemias e aplasias de medula; doenças genéticas;
doenças auto-imune: artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, esclerose
múltipla, esclerose. Sistêmica, esclerose lateral amiotrófica; acidente vascular
cerebral; doenças hepáticas (cirrose), doenças renais (insuficiência renal),
reconstituição óssea (traumas ou cirurgias com perda óssea), agressões

12
oftalmológicas com perda da visão (queimaduras por produtos químicos, calor
ou outros); transplante de órgãos como coração, rins, fígado, pâncreas
poderão, no futuro, ser substituídos pela terapia com células-tronco.

3.2 Vantagens da terapia com células-tronco:

Maior facilidade de obter células-tronco do que de encontrar um

doador de órgãos; o implante de células é um procedimento menos evasivo e
agressivo para o paciente do que é o transplante de órgãos; Custos do
tratamento deverão diminuir consideravelmente; a terapia com células-tronco
tem sido vista como uma ótima ferramenta para o futuro tratamento do câncer e
na terapia gênica.

3.3 Incidência de algumas doenças que poderão, no futuro,

serem tratadas com células-tronco:

Doenças genéticas: Cerca de 3% das crianças nascem com alguma

doença genética. Diabetes: no Brasil há 10 milhões de diabéticos, que
correspondem 6 % da população, 10% destes possuem Diabetes tipo 1,
numericamente são 1 milhão brasileiros.

Doenças do SNC:
Doença de Parkinson: atinge uma média de 10 a 13 pacientes entre
100.000 habitantes, doença de Alzheimer: atinge: 5% dos homens e 6% das
mulheres com mais de 60 anos. Acidente Vascular Cerebral (AVC): maior
causa de óbito e morbidade do mundo Lesão de medula espinhal, Brasil, 50
casos novos / milhão de habitantes / ano 9.500 pacientes tornam-se lesados
medulares anualmente no Senso de 2000: 934 mil brasileiros paraplégicos ou
tetraplégicos Em São Paulo: 300 mil pessoas em cadeira de rodas.
Doenças Cardíacas:
(Insuficiência cardíaca no Brasil 6,5 milhões pacientes Insuficiência
Cardíaca (IC) 1,2 milhão de internações no SUS em 2001 260 mil mortes

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(2001)80 mil por doença isquêmica do coração (2003) 2.2) Doença de
Chagas:Importante causa de insuficiência cardíaca na América Latina:16 - 18
milhões de pessoas infectadas Brasil: 6 milhões de pessoas afetadas 30%
indivíduos infectados progridem p/ fase crônica Incidência de algumas doenças
que poderão, no futuro, serem tratadas com células-tronco:

4 Transplante de células-tronco (TCT)

Histórico

1939: Primeiro relato do uso de transplante de medula óssea (MO)

realizado em mulher com anemia aplástica. Doador: irmão com grupo
sangüíneo idêntico. Paciente morreu 5 dias mais tarde.
1968: Primeiro transplante de MO realizado com sucesso em criança
com imudeficiência grave. Avaliação da histocompatiblidade.
1988: Paris: Primeiro relato de uso de células de sangue de cordão
umbilical e placentário (SCUP) em transplante realizado por Dr Eliane
Gluckman.
1993: Primeiro banco público de sangue de cordão umbilical humano
estabelecido no New York Blood Center pelo Dr. Pablo Rubinstein, em New
York.

4.1 Sangue de Cordão Umbilical e Placentário (SCUP):

Vantagens do TCT usando SCUP sobre TMO e aférese: oferta

ilimitada, disponibilidade imediata, menor incidência de DECH, menor risco de
doenças infecciosas, CMV, EBV, etc, Desvantagem do SCUP: volume limitado
principalmente quando usado em crianças.

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 Placentas em suporte para coleta

Sangue de Cordão Umbilical com volume reduzido para congelamento

Há 100 Bancos públicos de sangue de cordão umbilical de SCUP no

mundo. Destes 40 % estão na Europa, 30 % nos EUA, 20% Ásia e 10 % na
Austrália. Segundo NetCord há: 115.272 unidades congeladas e 4.519
pacientes receberam TCTH com SCUP no mundo. Destes 2.653 são crianças e
1.855 adultos (principalmente EUA e Europa).

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4.2 Lei de Biossegurança

A Lei 11.105 de 24 / 03 / 2005 menciona a respeito das Células-tronco

Embrionárias que é PROIBIDO: A) Engenharia Genética de Embriões, B)
Clonagem Reprodutiva ou Terapêutica, C) produção de Embriões humanos
para outros fins que não a reprodução, D) Comercialização de embriões
Humanos. É PERMITIDO: Obter células–tronco a partir de embriões desde
que, cumulativamente, esses embriões: sejam excedentes, foram produzidos
para reprodução por fertilização “in vitro”, estejam congelados por mais de três
anos ou que serão descartados por serem inviáveis (inadequados para a
reprodução).

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