Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl.44 micras de diâmetro. Entretanto. Basicamente.. embriões e plantas. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. Freqüentemente. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório.22 a 0. Recentemente. o que. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. bomba compressora de ar. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. Sistema de biorreator. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. gemas e plântulas. 1994). O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Nesse tipo de biorreator. Nesse caso. Onishi et al. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura.1972. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. Denchev et al. aço inoxidável. modelo compacto de 4 pares de frascos. para haver uma boa homogeneização do meio. 1988). Para isso. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. policarbonato.. 1994). Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. principalmente em hastes e gemas. 1994. 1992. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. Preil et al. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. regra geral. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . Akita & Takayama. Os frascos podem ser feitos de vidro. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento .. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. 1994). que servem não apenas de apoio. por onde circula água com temperatura pre-determinada. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco.. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. pH e oxigênio (Takayama & Akita. sensores de temperatura.nº 24. 1993. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. tecidos. ou maiores. 1994). O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros.janeiro/fevereiro 2002 . os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. principalmente na década de 80. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. 1994). causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. 1994). embora volumes menores como 250 e 500 ml. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. 1994). Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. além da germinação das sementes sintéticas. 1994). Inicialmente. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias.. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais.

o biorreator é do tipo coluna de bolha. Detalhe dos frascos do biorreator. O meio de cultura. Esse modelo apresenta bons resultados. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas.. 1983). Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. Takayama et al. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. em seguida. policarbonato ou polipropileno.. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. 1987). Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. que pode ser de teflon. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Entretanto. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. entretanto. bulbos. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. 1986). Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. 1989). bem como pela aeração do material em cultivo. órgãos e plântulas. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3.. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. silicone.janeiro/fevereiro 2002 . Eventualmente. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. 1985). o que pode comprometer o crescimento. por Takayama & Misawa (1981). sobretudo. pulverizado sobre o material em cultivo é. de células e tecidos. 1984). Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. 1994). Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples.nº 24. A homogeneização do meio. 1981. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. 1991). o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico.

Posteriormente. 1995. em cultivo. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. Etienne et al. em determinado momento.. (1952). ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. O modelo desenvolvido por Alvard et al.janeiro/fevereiro 2002 . para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. em outra posição. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. 1997. Pouco tempo depois.1 mg em meio gelificado para 98. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). 1997. um superior e um inferior. Esse procedimento era repetido a cada semana. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. não submerso. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. Em 1985. 1995). 1993).Figura 4. em meio gelificado com agar.nº 24. prontas para serem cultura. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Simonton et al. com diferentes tipos de explantes. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. 1999).. Cabasson et al.. Em seguida. no “auxophyton”. o explante se encontrava submerso e. Visando a contoraclimatadas nar esse problema.. permanecendo aí até que o ciclo recomece. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. no superior.6 mg em meio líquido. Etienne et al. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. no momento seguinte. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Nesse equipamento. um aumento da matéria fresca de 38. por 28 dias. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. Teisson et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção. com isso. 1993. conseguindo. Hastes de abacaxi. o que. Nesse sistema. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. de tal forma que. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. Mudas alongadas de abacaxi.. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. Após um período preestabelecido. submersos no meio líquido. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. conectados entre si por um tubo. em meio de multiplicação esse problema. por gravidade. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. que consistia de uma grande câmara de cultura. O modelo desenvolvido por Alvard et al.. Na realidade. Nesse tipo de biorreator. Steward et al. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. em biorreator de imersão temporária. Após esse período. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. em certa posição.. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. Segundo Harris & Mason (1983). faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. de tal forma que. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior.

descarga e troca do meio de cultura. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. montagem e funcionamento. etc. (1993) e Lorenzo et al. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. o que é determinado pela extensão das tubulações. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . de difícil manuseio. constituição. transparência. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. etc. sob regime de imersão temporária. os quais podem variar em tamanho. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio.. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg.. os resultados preliminares foram excelentes.nº 24. em termos gerais. g) o equipamento permite fazer. nitrogênio e gás carbônico. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. ainda. Por sua vez. fonte de ar comprimido.janeiro/fevereiro 2002 . como células e gemas. filtros de ar. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. Plantas aclimatadas de abacaxi. fotoperíodo e temperatura. Entretanto. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. cujo período pode ser definido pelo temporizador. formato. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. carga. fluxômetro. por 40 ex. Nos primeiros ensaios. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. (1999) para gemas de abacaxi. do ponto de vista de montagem e funcionamento. tipo de tampa. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. que permite uma grande versatilidade de uso. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. temporizadores. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos.. (1998). como o uso de um frasco relativamente grande. alguns problemas foram identificados. são necessários pequenos ajustes no equipamento. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. são equipamentos: a) complexos. mangueiras de silicone. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. f) no regime de imersão contínua. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. conexões metálicas. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. Figura 6. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. Em ambos os casos. No momento. Para isso. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. Esse sistema utiliza dois frascos. não permitindo versatilidade no seu uso. Por ser um equipamento recémdesenvolvido.

& Misawa. 1988. Vasquez.111131. 32:55-60. Ishibashi. desiccation tolerant white spruce (Picea glauca (Moench. & Jones. C.. T. plantlets in a bioreactor containing a single carbon and a single nitrogen source.. C. W. A. 1993. Rotating drum fermentor for plant cell suspension cultures. Development of an automated plant culture system. Org.. Ushiyama. F. 226:99100. New techniques for the investigation of metabolism. Plant & Cell Physiol. . p. F. 1991. Atken-Chistie. Wheat.M.A. ) tuberization by semicontinous liquid medium surface level control.I. Escalona. como a germinação de embrião zigótico in vitro.. 1989. C. 1999. 21:819.H. de forma semi-automática: cultivo de células embriogênicas e não embriogênicas. 1972. In Vitro Cell. Escalona.. Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion. M. Gonzalez. Onishi.. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. J. E. Somatic embryo production in bioreactors. Plant Cell. Lulsdorf. Cult. C. K. 34:1209-1213. Cell. S. 1952. 1997. P.. Referência Bibliográfica Akita. Aitken-Chistie. Dev.E. M..M. In vitro culture by temporary immersion: a new device. microestacas de várias espécies para fins de crescimento e multiplicação das hastes caulinares..J.. J. S. Plant Cell Rep. Espinosa. cultivo de raiz para experimentos diversos. Biol. 26:99-109. & Nystrom. Lartaud. Bot.. R.. 19:111-117. Alguns exemplos de uso podem ser enumerados para esse sistema de cultivo em meio líquido. Alvard. Biotechnol. N. Bioreactor culture of Picea glauca-engelmannii (interior spruce) somatic embryos. Automated propagation of microbulbs of lilies. 1994. In: Cell Cultures and Somatic Cell Genetics. Plant Cell. Alvard. Plant Sci. Bondrik. Gonzalez. 1988. Appl. P. Odawara. 1997. J. Cult.Y. Wix.. H. 1981.M.D. Bioreactor technology for plant propagation. M. Kessel.. A. W. The types of bioreactors used for shoots and embryos. S. R. Plant Cell.R. & Staba. B. R. incluindo a produção de metabólitos secundários. Pomeroy.H. 50:33-37. J. Cult.W. P. & Hirosawa. M. Plant Cell. D. D. Plant Cell.. D. & Teisson. Lorenzo. Mass propagation of Begonia x hiemalis) plantlets by shake culture. Teisson. ed. Bioeng. Plant Cell Tiss. N. Tissue and Org. S. -Plant 33:81-87. & Iwamoto. Biotechnol.. & Söndahl. Improvement of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis (Müll. H. New York. Biotechnologie ASIC.. Acta Horticult. J. 39:147-156. Berthouly. Vasil. 15e Colloque.I. Tissue and Org.. 22(3):461-467.K. Development of a semiautomated micropropagation system. H. em alta quantidade e em condições totalmente assépticas. C. & Millar. S. U. Borroto. 1991. S. Berthouly. Cult. Etienne. B. Cabasson. Caplin. I. Growth parameters. Cult. Teisson. Escalant. Merr) micropropagation in temporary immersion systems. Robacker. 1999. 1985. Academic Press Inc. M.K. bem como no uso e economia da fonte luminosa. New oxygen supplying methods for animal cell reactors. Lorenzo. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system.). 1987. Tiss.B. 1983. & Beck.E. 1994. Exp.L. Henke. 54:197-200. Tanaka. Takayama.. Bot.. I. Ollitrault. 13:184187. Cult. Vol. T. 27:211-218. Can. 39:137-145. 39(2):157-170. R. gemas axilares e apicais para fins de multibrotação. Michaux-Ferrierre. D. Investigations on growth and metabolism of plant cells. & Mason.) synthetic seeds in a bioreactor. A. p. J. Kikcio & Dunstan. Luttman. M.G. além de outras aplicações. Daquinta. Y. Nishijima.. Stimulation of potato (Solanum tuberosum L. N. & Fowke. Etienne-Bary. 230:81-87.. Cult. 5:107-117.. M & Takayama. 41 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . 1994. M. Swedlund. L. 13:601-606. Montpellier. Plant Cell. J. Hakko. Ann. Large scale culture techniques of plant cells and the secondary metabolite production. W-S. B. K.. & Preil. 38:46-51. M.K.. & Carr. 1992. K. Florek. M. W. D.R. & Etienne. Plant Cell.117-130. Tissue and Org. C. D. Two machines for in vitro propagation of plants in liquid medium. Towards automation: radiata pine shoot hedges in vitro. Gonzalez. Tiss. Tisserat. and Org. Silicone-tubing aerated bioreactors for somatic embryo production.. J.janeiro/fevereiro 2002 . M. 18(9):. Carron. A programable micropropagation apparatus using cycled liquid medium. In: Tissue Culture In Forestry and Agriculture. & Hughes. Cote. Takayama.. 25:2359-2370. Plantations 2(5):32-33. Direct sowing of Coffea arabica somatic embryos mass-produced in a bioreactor and regeneration of plants. 1994. Towards mass propagation by use of bioreactors. 16:5777.. Desjardins. M.P. Dambier. Vandercook. 1995. Preil. C. Arabic coffee micropropagation through somatic embryogenesis via bioreactors. The effect of dissolved oxygen concentration on growth and differentiation of carrot (Daucus carota) tissue. and Bioeng. Park. Attree.J. Biotechnol.H. Harris..V.C. Simonton. Microbiol.C.. Production of vigorous.73-81 1993. 1992. C. Takayama. Fujiwara. Cult. F. & Borroto. (Eds.melhora no funcionamento. & Etienne. Tissue and Org. Hu. Cultivation of Artemisia annua L.743-748. Denchev.B. Florek. & Teisson. Bertrand. T. 63:311-316. Suwa. and Org.C. C. M. Noriega. HortSci. Tautorus. Cote. & Ookuma. P. U. & Teisson. Plenum Press. M. C.M.. Plant Cell Rep.nº 24. 1987. Biotechnol. M. nutrition and growth in undifferentiated cells. & Scragg. & Davies. & Miwa. 1988... B. Tissue and Org. Synthetic seeds as an application of mass production of somatic embryos. Cult.P. To Kogyo 46:7-11. Plant Cell Rep. C. embriões somáticos de diferentes espécies. F. Spin filter bioreactor technology as applied to industrial plant propagation. 1984. T.J. Styer. 1986. 1994. 23:996-1007.. D. S.) using the temporary immersion technique. F. R. Alvard.) Voss.E. Acta Hortic. & Akita. 8:185-196. H. pp.. E. P.L. U. Plant Cell Rep. . B. Sakamoto. Pine- apple (Ananas comosus L. J. Tissue and Org. D. H. 1985.C. C. Hitachi Hyouron 69:301305.. 1983. J. 8. Kuklin. & Krueger.. Steward. Arg.J.

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