Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

36

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. Freqüentemente. tecidos... Denchev et al. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo..1972. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado.nº 24. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . além da germinação das sementes sintéticas. 1992. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo.22 a 0. 1994). 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. embriões e plantas. 1994). motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. aço inoxidável. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. 1994). Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. 1994). modelo compacto de 4 pares de frascos. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. sensores de temperatura. Entretanto. 1994. 1993. 1994).. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. para haver uma boa homogeneização do meio. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células.janeiro/fevereiro 2002 . bomba compressora de ar. 1994). Os frascos podem ser feitos de vidro. Inicialmente. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. 1988).. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. o que. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. ou maiores. embora volumes menores como 250 e 500 ml. Para isso. Sistema de biorreator. principalmente em hastes e gemas. gemas e plântulas.44 micras de diâmetro. Onishi et al. principalmente na década de 80. Basicamente. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. que servem não apenas de apoio. Preil et al. Nesse tipo de biorreator. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. por onde circula água com temperatura pre-determinada. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. 1994). Recentemente. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. Nesse caso. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. policarbonato. Akita & Takayama. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. pH e oxigênio (Takayama & Akita.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. 1994). pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. regra geral. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais.

1991). com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. Detalhe dos frascos do biorreator. 1985). Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Esse modelo apresenta deficiência na aeração.. entretanto. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. por Takayama & Misawa (1981).nº 24. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. policarbonato ou polipropileno. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. o biorreator é do tipo coluna de bolha. sobretudo. o que pode comprometer o crescimento. 1981.janeiro/fevereiro 2002 . Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. silicone. bem como pela aeração do material em cultivo.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. Entretanto. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. que pode ser de teflon. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. 1987). esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima.. A homogeneização do meio. Esse modelo apresenta bons resultados. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. pulverizado sobre o material em cultivo é. 1983). o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. 1984). uma vez que não há nenhum tipo de agitação. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. bulbos. Takayama et al. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. 1989). 1986). Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. em seguida.. órgãos e plântulas. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Eventualmente. 1994). Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. de células e tecidos. O meio de cultura.

O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. conseguindo. o explante se encontrava submerso e. um aumento da matéria fresca de 38. O modelo desenvolvido por Alvard et al. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. prontas para serem cultura. Nesse tipo de biorreator. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. 1995. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer.6 mg em meio líquido. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al.1 mg em meio gelificado para 98. Simonton et al. 1999). em cultivo. O modelo desenvolvido por Alvard et al. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. 1993). Cabasson et al. Mudas alongadas de abacaxi. Em 1985. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. conectados entre si por um tubo. no “auxophyton”. 1995).Figura 4. Etienne et al. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. em meio gelificado com agar. (1952). em outra posição. com isso. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. Nesse equipamento. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. no momento seguinte. de tal forma que. de tal forma que. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar.. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. em certa posição. em meio de multiplicação esse problema. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. 1997. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. 1993. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados.nº 24. por 28 dias. (1993) foi modificado no que se refere à construção. Esse procedimento era repetido a cada semana. Hastes de abacaxi. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. o que. por gravidade. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. Em seguida. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al.. Pouco tempo depois. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. permanecendo aí até que o ciclo recomece.. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. Após um período preestabelecido. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior.janeiro/fevereiro 2002 . Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. Etienne et al. 1997. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al.. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). apresentando resultados muito bons (Alvard et al. em determinado momento. Na realidade. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes.. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. submersos no meio líquido. Nesse sistema. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. um superior e um inferior. em biorreator de imersão temporária. Segundo Harris & Mason (1983). Após esse período.. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). Steward et al. com diferentes tipos de explantes. não submerso. Posteriormente. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. no superior. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. Teisson et al. que consistia de uma grande câmara de cultura..

do ponto de vista de montagem e funcionamento. cujo período pode ser definido pelo temporizador. (1998). em termos gerais. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. os quais podem variar em tamanho. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. temporizadores. por 40 ex. como células e gemas. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. ainda. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. nitrogênio e gás carbônico. fluxômetro. de difícil manuseio. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. fonte de ar comprimido. não permitindo versatilidade no seu uso. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. são necessários pequenos ajustes no equipamento. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg... além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . filtros de ar. tipo de tampa. mangueiras de silicone. transparência. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. Esse sistema utiliza dois frascos. No momento. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. (1999) para gemas de abacaxi. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. alguns problemas foram identificados. descarga e troca do meio de cultura. montagem e funcionamento. g) o equipamento permite fazer. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al.nº 24. conexões metálicas. o que é determinado pela extensão das tubulações. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. são equipamentos: a) complexos. Em ambos os casos. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. fotoperíodo e temperatura. Para isso. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. (1993) e Lorenzo et al. Figura 6. como o uso de um frasco relativamente grande.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. f) no regime de imersão contínua. etc.janeiro/fevereiro 2002 . além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. Por sua vez. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas.. constituição. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. formato. Nos primeiros ensaios. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. que permite uma grande versatilidade de uso. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. Entretanto. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. sob regime de imersão temporária. etc. os resultados preliminares foram excelentes. Plantas aclimatadas de abacaxi. carga. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI.

Berthouly. 39:147-156.) using the temporary immersion technique.K. de forma semi-automática: cultivo de células embriogênicas e não embriogênicas.H. J. Stimulation of potato (Solanum tuberosum L. & Teisson. 22(3):461-467. Appl. Tiss. U. Lulsdorf. K. Cabasson. D. and Org. Biotechnol.M. ) tuberization by semicontinous liquid medium surface level control. 230:81-87. Vasil. Montpellier.W.. W. Tissue and Org. & Etienne. Suwa. and Org. 1995.L. Bertrand.K. Gonzalez. M. C.. M. Lorenzo. Cult. Tiss. HortSci. T.J. Robacker. Plant Cell. I.. A. J. Aitken-Chistie. além de outras aplicações. P. Tissue and Org. Production of vigorous.G. F. Florek. 1991. Bioeng. Steward.H. Henke.743-748. Ollitrault. N. Escalant.E. 1994. . M. 1994. Mass propagation of Begonia x hiemalis) plantlets by shake culture.) synthetic seeds in a bioreactor. & Ookuma. 1992. Carron. Atken-Chistie. & Carr. Harris. Etienne. 1989. 32:55-60.. 1992.R. C. C. 50:33-37. Towards mass propagation by use of bioreactors. Plenum Press. C. M. In: Cell Cultures and Somatic Cell Genetics. Teisson.A. Plant Sci. Automated propagation of microbulbs of lilies.K. 1985. Cult. & Hirosawa. Plant Cell. 27:211-218. Vasquez. Gonzalez. Alguns exemplos de uso podem ser enumerados para esse sistema de cultivo em meio líquido. P. 1999. 18(9):. 25:2359-2370. Bondrik. D.C. Teisson.nº 24. Biotechnol. & Scragg.J. Org. 1991. Y. M & Takayama. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. H.. Cult.. C. Spin filter bioreactor technology as applied to industrial plant propagation. & Etienne. 54:197-200. P. U. & Misawa. Direct sowing of Coffea arabica somatic embryos mass-produced in a bioreactor and regeneration of plants. M. R. H. C. Arg. D. Daquinta.. B. 1999. 38:46-51. Plant Cell. Cult. gemas axilares e apicais para fins de multibrotação.73-81 1993. Lorenzo.. desiccation tolerant white spruce (Picea glauca (Moench. 1993. 1987. Can. and Bioeng. D. Arabic coffee micropropagation through somatic embryogenesis via bioreactors. Tissue and Org. Noriega.111131. Takayama. Merr) micropropagation in temporary immersion systems. 15e Colloque. C.. Espinosa.. C. bem como no uso e economia da fonte luminosa. Desjardins.117-130. 23:996-1007. em alta quantidade e em condições totalmente assépticas. Acta Horticult. Simonton. 1994.. Tisserat. Plant Cell Rep. S. S. J. 1983. 1987. Pomeroy. U. Kessel. Biol. W-S.C..C. Styer. 13:184187. Tissue and Org. Exp. Borroto. J. 5:107-117. embriões somáticos de diferentes espécies.. p. B. M.. incluindo a produção de metabólitos secundários. Improvement of Citrus somatic embryo development by temporary immersion. B. & Staba. Bioreactor technology for plant propagation. M.E. Sugarcane shoot formation in an improved temporary immersion system. & Preil. & Söndahl. Wix.. J. R. Alvard. & Hughes. & Borroto.R. J. Large scale culture techniques of plant cells and the secondary metabolite production. Pine- apple (Ananas comosus L. Cult. D. Cultivation of Artemisia annua L. 21:819.B. Nishijima. T. Dev. Ann. Tissue and Org. 34:1209-1213. Florek. Biotechnol.. Rotating drum fermentor for plant cell suspension cultures. M. Development of a semiautomated micropropagation system. Odawara. Vandercook. 41 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Wheat. 1985.. M. & Teisson. Gonzalez. L. W. I. Takayama. In Vitro Cell.. microestacas de várias espécies para fins de crescimento e multiplicação das hastes caulinares. Plantations 2(5):32-33. Caplin.. 1984. 1981. 1988. Cult. Luttman.. J. D. Onishi. Biotechnol. & Millar.. S. (Eds. New oxygen supplying methods for animal cell reactors. Berthouly.D. R.).. Acta Hortic. M. Park.melhora no funcionamento. C. 1983..M.. Cult.M. 1988.janeiro/fevereiro 2002 . -Plant 33:81-87. F. Ushiyama. A. nutrition and growth in undifferentiated cells.. 1994. Tanaka. Escalona. Bot. C. E.. & Nystrom. Hu. 19:111-117. 63:311-316. N. 226:99100. R. 1994. Plant & Cell Physiol. K. M. Plant Cell Rep. Hitachi Hyouron 69:301305. Ishibashi.L. 1997. ed. Referência Bibliográfica Akita. Cell. B. 1952.. Development of an automated plant culture system.B.. Preil. Swedlund. A. & Fowke.V. J. & Mason. B.J. D.P. 1972. plantlets in a bioreactor containing a single carbon and a single nitrogen source.. Cult. H. Attree. Two machines for in vitro propagation of plants in liquid medium. T. Denchev.. F. Kuklin.P. 16:5777. J.. 1997. F. Growth parameters. & Miwa. p. Bioreactor culture of Picea glauca-engelmannii (interior spruce) somatic embryos. Silicone-tubing aerated bioreactors for somatic embryo production. 8.. F. 39(2):157-170. Plant Cell. & Beck. S.. S. 13:601-606. Synthetic seeds as an application of mass production of somatic embryos. .C.I.. Fujiwara. 1988. Tautorus.. S. Etienne-Bary. In vitro culture by temporary immersion: a new device. & Jones. & Iwamoto. Vol. Escalona. E.. Plant Cell. Plant Cell. Tissue and Org. Bot. Plant Cell Rep. Somatic embryo production in bioreactors.J. H. cultivo de raiz para experimentos diversos.I. & Davies. Towards automation: radiata pine shoot hedges in vitro. M. Plant Cell. Alvard. Microbiol. 39:137-145. Alvard. D. & Akita. Takayama.. Investigations on growth and metabolism of plant cells. & Krueger. A programable micropropagation apparatus using cycled liquid medium. 26:99-109. pp. M. Cote. N. Hakko. C. In: Tissue Culture In Forestry and Agriculture. K. & Teisson. Plant Cell Tiss.H. W. S. como a germinação de embrião zigótico in vitro. Dambier.E. M. 8:185-196. Lartaud. Plant Cell Rep.) Voss. Cult. Improvement of somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis (Müll. P. New techniques for the investigation of metabolism. Kikcio & Dunstan. Cote. J. The types of bioreactors used for shoots and embryos. To Kogyo 46:7-11. The effect of dissolved oxygen concentration on growth and differentiation of carrot (Daucus carota) tissue. Sakamoto. P. C.Y. R. Michaux-Ferrierre.M. Biotechnologie ASIC. 1986. H. T. New York. Academic Press Inc.