Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

44 micras de diâmetro. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. bomba compressora de ar. Entretanto. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. pH e oxigênio (Takayama & Akita. 1994). 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. 1988). é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas.1972. Para isso. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. 1994).mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. sensores de temperatura. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. além da germinação das sementes sintéticas. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias.. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. embriões e plantas. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. 1992. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo.nº 24. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. 1994). O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta.22 a 0. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . principalmente na década de 80.. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião.. embora volumes menores como 250 e 500 ml. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. Os frascos podem ser feitos de vidro. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. por onde circula água com temperatura pre-determinada. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. principalmente em hastes e gemas. Preil et al. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. Recentemente. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. para haver uma boa homogeneização do meio. Denchev et al. Akita & Takayama. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. Basicamente.janeiro/fevereiro 2002 . os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. policarbonato. Inicialmente. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. 1994). Nesse tipo de biorreator. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. aço inoxidável. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. Freqüentemente. Nesse caso. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. 1994. tecidos. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. 1993. 1994). o que. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. ou maiores. modelo compacto de 4 pares de frascos. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. 1994).. 1994). Sistema de biorreator.. regra geral. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. que servem não apenas de apoio. 1994). gemas e plântulas. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. Onishi et al. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala.

O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. 1994). o que pode comprometer o crescimento. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. 1984). órgãos e plântulas. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. silicone. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas.nº 24. 1991)... 1989). Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. 1985). bem como pela aeração do material em cultivo. em seguida. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. Esse modelo apresenta bons resultados.janeiro/fevereiro 2002 . Takayama et al. bulbos.. Entretanto. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. policarbonato ou polipropileno. entretanto. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. o biorreator é do tipo coluna de bolha.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. sobretudo. por Takayama & Misawa (1981). Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. Eventualmente. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. 1983). 1986). uma vez que não há nenhum tipo de agitação. Detalhe dos frascos do biorreator. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. A homogeneização do meio. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. 1981. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. O meio de cultura. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. de células e tecidos. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. pulverizado sobre o material em cultivo é. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. 1987). que pode ser de teflon. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão.

Visando a contoraclimatadas nar esse problema. 1993. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. Nesse equipamento. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes.nº 24. 1993). 1997. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura.. por 28 dias. um superior e um inferior. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. Em seguida. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. não submerso. Hastes de abacaxi.1 mg em meio gelificado para 98.. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária..6 mg em meio líquido. Steward et al. Após esse período. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. Posteriormente. 1997. o explante se encontrava submerso e. Em 1985. Segundo Harris & Mason (1983). Etienne et al. Teisson et al. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. Pouco tempo depois. de tal forma que. (1993) foi modificado no que se refere à construção. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). em determinado momento. em meio gelificado com agar. em meio de multiplicação esse problema. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. 1995). Simonton et al. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. Esse procedimento era repetido a cada semana. em cultivo.. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. (1952). Na realidade. permanecendo aí até que o ciclo recomece. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. com isso. submersos no meio líquido. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. em outra posição.Figura 4. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al.janeiro/fevereiro 2002 . delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. Quando todo o meio passa para o compartimento superior.. prontas para serem cultura. no superior.. Nesse tipo de biorreator. O modelo desenvolvido por Alvard et al. conectados entre si por um tubo. um aumento da matéria fresca de 38. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. por gravidade. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório.. Cabasson et al. 1995. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. 1999). dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. Etienne et al. Após um período preestabelecido. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. em biorreator de imersão temporária. Mudas alongadas de abacaxi. com diferentes tipos de explantes. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. no momento seguinte. de tal forma que. que consistia de uma grande câmara de cultura. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. no “auxophyton”. o que. conseguindo. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. Nesse sistema. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. O modelo desenvolvido por Alvard et al. em certa posição.

transparência. tipo de tampa. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. carga. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. Plantas aclimatadas de abacaxi. alguns problemas foram identificados. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. (1993) e Lorenzo et al. fotoperíodo e temperatura. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. os quais podem variar em tamanho. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. por 40 ex. formato.. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. o que é determinado pela extensão das tubulações. cujo período pode ser definido pelo temporizador. No momento. Em ambos os casos. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. que permite uma grande versatilidade de uso. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. etc. (1998). os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. ainda. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. Por sua vez. Esse sistema utiliza dois frascos. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana.. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. de difícil manuseio. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . do ponto de vista de montagem e funcionamento. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. nitrogênio e gás carbônico. os resultados preliminares foram excelentes. em termos gerais. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. como células e gemas. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. não permitindo versatilidade no seu uso. Nos primeiros ensaios.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. Entretanto. como o uso de um frasco relativamente grande. conexões metálicas. etc. Figura 6. mangueiras de silicone. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. fluxômetro. sob regime de imersão temporária. Para isso. filtros de ar. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. descarga e troca do meio de cultura. são equipamentos: a) complexos. (1999) para gemas de abacaxi. são necessários pequenos ajustes no equipamento. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al.nº 24. fonte de ar comprimido.janeiro/fevereiro 2002 . constituição. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. montagem e funcionamento. g) o equipamento permite fazer. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. f) no regime de imersão contínua. temporizadores. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz..) podem ser de fácil aquisição ou feitura. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas.

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