Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que.44 micras de diâmetro. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. Basicamente. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. Para isso. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . 1994).. Entretanto.. que servem não apenas de apoio. 1993. 1994). 1992. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. 1994. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. Akita & Takayama.. Preil et al. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta.janeiro/fevereiro 2002 . o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. Inicialmente.. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. Sistema de biorreator.22 a 0. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. 1994). Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. aço inoxidável. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. embora volumes menores como 250 e 500 ml. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. Freqüentemente. regra geral. modelo compacto de 4 pares de frascos. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. por onde circula água com temperatura pre-determinada. Recentemente. 1994). Denchev et al. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. policarbonato. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. tecidos. 1994). os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. o que.nº 24. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. além da germinação das sementes sintéticas. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. principalmente na década de 80. sensores de temperatura. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. principalmente em hastes e gemas. bomba compressora de ar. 1994). pH e oxigênio (Takayama & Akita. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. 1994). para haver uma boa homogeneização do meio.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. 1988). 1994). seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. gemas e plântulas. embriões e plantas. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . Nesse caso. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. Nesse tipo de biorreator. Os frascos podem ser feitos de vidro. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros.1972. Onishi et al.. ou maiores. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita.

o que pode comprometer o crescimento. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. bulbos. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. 1983).janeiro/fevereiro 2002 . por Takayama & Misawa (1981). Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. de células e tecidos. 1986). Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . uma vez que não há nenhum tipo de agitação. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. 1994). Esse modelo apresenta deficiência na aeração. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. Eventualmente. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. 1984). com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas.nº 24. O meio de cultura. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. 1985).. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. em seguida. bem como pela aeração do material em cultivo. 1981. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. sobretudo. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Esse modelo apresenta bons resultados. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. 1991).. A homogeneização do meio. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. Takayama et al. o biorreator é do tipo coluna de bolha. que pode ser de teflon. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Detalhe dos frascos do biorreator. 1989). esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. Entretanto. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. órgãos e plântulas. 1987). entretanto. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. pulverizado sobre o material em cultivo é. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. policarbonato ou polipropileno. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. silicone..

com isso.1 mg em meio gelificado para 98. Etienne et al. O modelo desenvolvido por Alvard et al. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo.janeiro/fevereiro 2002 .nº 24. Etienne et al. Nesse sistema. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. 1997. Em seguida. O modelo desenvolvido por Alvard et al. Cabasson et al. Mudas alongadas de abacaxi. em meio gelificado com agar. por 28 dias. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. o que. 1993. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. não submerso. em cultivo. (1993) foi modificado no que se refere à construção. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. de tal forma que. 1997. 1995). Teisson et al.. 1995.. Simonton et al. no superior. (1952). O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Posteriormente. por gravidade.. em outra posição. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. de tal forma que. prontas para serem cultura. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. Na realidade. 1999).. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. Esse procedimento era repetido a cada semana. Segundo Harris & Mason (1983). o explante se encontrava submerso e. em certa posição. Pouco tempo depois. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. em determinado momento. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Nesse equipamento.. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. Nesse tipo de biorreator. apresentando resultados muito bons (Alvard et al.. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. permanecendo aí até que o ciclo recomece. um superior e um inferior. em meio de multiplicação esse problema. no momento seguinte. submersos no meio líquido. Hastes de abacaxi. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. conectados entre si por um tubo. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. um aumento da matéria fresca de 38. Em 1985. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura.6 mg em meio líquido. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. 1993). com diferentes tipos de explantes. em biorreator de imersão temporária. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. que consistia de uma grande câmara de cultura. no “auxophyton”. conseguindo. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. Steward et al. Após esse período. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”.Figura 4. Após um período preestabelecido. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda.. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al.

carga. conexões metálicas. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. em termos gerais. g) o equipamento permite fazer. são equipamentos: a) complexos. fluxômetro. filtros de ar. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. de difícil manuseio... fotoperíodo e temperatura. sob regime de imersão temporária. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema.nº 24. (1993) e Lorenzo et al. como células e gemas. cujo período pode ser definido pelo temporizador. do ponto de vista de montagem e funcionamento. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. Para isso. os resultados preliminares foram excelentes. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. descarga e troca do meio de cultura. f) no regime de imersão contínua. os quais podem variar em tamanho. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . fonte de ar comprimido. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. Figura 6. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. transparência. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. ainda. por 40 ex. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação.janeiro/fevereiro 2002 . uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. formato. Por sua vez. (1998). em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado.. não permitindo versatilidade no seu uso. constituição. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. nitrogênio e gás carbônico. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. (1999) para gemas de abacaxi. mangueiras de silicone. Esse sistema utiliza dois frascos. montagem e funcionamento. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. Nos primeiros ensaios. alguns problemas foram identificados. o que é determinado pela extensão das tubulações. tipo de tampa. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. que permite uma grande versatilidade de uso.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. como o uso de um frasco relativamente grande. são necessários pequenos ajustes no equipamento. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. temporizadores. Plantas aclimatadas de abacaxi. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. etc. Em ambos os casos. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. No momento. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. etc. Entretanto. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator.

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