Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. sensores de temperatura. embora volumes menores como 250 e 500 ml. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. Nesse caso. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. 1994). pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. Recentemente. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. bomba compressora de ar. 1994). É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. principalmente na década de 80. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. 1993. Akita & Takayama. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. que servem não apenas de apoio. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. 1992. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros.. Sistema de biorreator. 1994).22 a 0. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. Para isso. Denchev et al. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. 1988).. gemas e plântulas. para haver uma boa homogeneização do meio.. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita.janeiro/fevereiro 2002 . O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura.nº 24.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão.. o que. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos.1972. 1994). Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. pH e oxigênio (Takayama & Akita. aço inoxidável.. policarbonato. ou maiores. regra geral. Entretanto. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. 1994). a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. além da germinação das sementes sintéticas. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. Inicialmente.44 micras de diâmetro. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. tecidos. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. Nesse tipo de biorreator. 1994. Freqüentemente. modelo compacto de 4 pares de frascos. Onishi et al. Preil et al. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. principalmente em hastes e gemas. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. Basicamente. por onde circula água com temperatura pre-determinada. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. 1994). sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . 1994). causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. Os frascos podem ser feitos de vidro. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. embriões e plantas. 1994).

bulbos. 1987)... 1981. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. 1983). a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. Takayama et al. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. órgãos e plântulas.. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. de células e tecidos. 1994). esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. 1989). Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima.nº 24. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. bem como pela aeração do material em cultivo. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. por Takayama & Misawa (1981). Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. 1991). 1984). com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. Eventualmente. Detalhe dos frascos do biorreator. 1986). drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. policarbonato ou polipropileno. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. que pode ser de teflon. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. o biorreator é do tipo coluna de bolha. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. silicone. 1985). Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. A homogeneização do meio. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples.janeiro/fevereiro 2002 . uma vez que não há nenhum tipo de agitação. o que pode comprometer o crescimento. Esse modelo apresenta bons resultados. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. entretanto. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. Entretanto. em seguida. O meio de cultura. pulverizado sobre o material em cultivo é. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. sobretudo.

em meio de multiplicação esse problema. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. em determinado momento. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. 1995. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983).. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. Segundo Harris & Mason (1983). conectados entre si por um tubo. em cultivo. Esse procedimento era repetido a cada semana. de tal forma que. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. Etienne et al. um aumento da matéria fresca de 38.. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. no “auxophyton”. Nesse tipo de biorreator. o explante se encontrava submerso e. por gravidade. Teisson et al. em meio gelificado com agar.janeiro/fevereiro 2002 . Em seguida. o que. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. 1997. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. em certa posição.nº 24. de tal forma que. Pouco tempo depois. 1999). ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. 1993. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. por 28 dias. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo.. conseguindo. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. 1997. no momento seguinte.. Mudas alongadas de abacaxi. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Na realidade. O modelo desenvolvido por Alvard et al. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. Steward et al. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. O modelo desenvolvido por Alvard et al. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Etienne et al. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al.. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. Simonton et al. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. Após um período preestabelecido. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. Em 1985. 1993). Cabasson et al. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária..Figura 4. em outra posição.6 mg em meio líquido. prontas para serem cultura. um superior e um inferior. Após esse período. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. Nesse sistema. não submerso.. Posteriormente. em biorreator de imersão temporária. com isso. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). Visando a contoraclimatadas nar esse problema. (1952). Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. no superior.1 mg em meio gelificado para 98. submersos no meio líquido. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. (1993) foi modificado no que se refere à construção. que consistia de uma grande câmara de cultura. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. Hastes de abacaxi. com diferentes tipos de explantes. permanecendo aí até que o ciclo recomece. 1995). Nesse equipamento.

b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. por 40 ex.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. fluxômetro. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. carga. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . constituição. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. fotoperíodo e temperatura. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. que permite uma grande versatilidade de uso. Nos primeiros ensaios. Plantas aclimatadas de abacaxi. filtros de ar. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. No momento. não permitindo versatilidade no seu uso. como células e gemas. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões.janeiro/fevereiro 2002 . g) o equipamento permite fazer. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. Para isso. do ponto de vista de montagem e funcionamento. são equipamentos: a) complexos. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua.. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. descarga e troca do meio de cultura. os resultados preliminares foram excelentes. como o uso de um frasco relativamente grande. nitrogênio e gás carbônico. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. ainda. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. de difícil manuseio. formato. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. f) no regime de imersão contínua. temporizadores. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. Figura 6. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. etc. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. (1998). (1993) e Lorenzo et al. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. (1999) para gemas de abacaxi. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. montagem e funcionamento. Por sua vez. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. o que é determinado pela extensão das tubulações. em termos gerais. Em ambos os casos. cujo período pode ser definido pelo temporizador.nº 24. tipo de tampa. fonte de ar comprimido. Esse sistema utiliza dois frascos. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. conexões metálicas. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. sob regime de imersão temporária. etc. mangueiras de silicone. alguns problemas foram identificados. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. os quais podem variar em tamanho. são necessários pequenos ajustes no equipamento. Entretanto. transparência...

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