Pesquisa
BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor
Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular A micropropagação é uma forma
batista@cenargen.embrapa.br vegetativa de propagação de diferentes
Embrapa Recursos Genéticos e espécies de plantas por meio da técnica
Biotecnologia
denominada cultura de tecidos. Essa
técnica requer laboratórios bem estru-
turados e pessoal treinado.
Em resumo, o procedimento envol-
ve os seguintes passos: inicialmente, é
feita a escolha da planta matriz e do tipo
de material a ser utilizado, tais como
Figura 1. Sistema de biorreator gemas, segmentos nodais, folhas, flo-
de imersão temporária, res, etc. Em seguida, o material é desin-
desenvolvido pela Embrapa festado já em condições de laboratório
Recursos Genéticos e em ambiente estéril, e introduzido em
Biotecnologia, utilizando frascos igualmente estéreis, contendo
tanque de ar comprimido meio de cultura esterilizado. Esse meio
contém, todos os nutrientes necessários
ao crescimento e desenvolvimento do
material em cultivo, além de substâncias
reguladoras de crescimento. Os frascos
com o material são mantidos em salas
36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
de crescimento, sob condições de tem-
peratura, luminosidade e fotoperíodo
adequados.
Milhões de plantas são produzidas
anualmente, em todo o mundo, por
meio da micropropagação. Entretanto,
esse método de multiplicação é alta-
mente demandante de mão-de-obra e
só em condições especiais tal procedi-
mento deve ser utilizado. Basicamente,
a escolha da micropropagação frente a
outras formas de propagação baseia-se
no valor venal da muda ou do produto
a ser obtido pela muda micropropaga-
da.
A metodologia tradicional de micro-
propagação baseia-se em cultivos em
pequenos frascos, com número reduzi-
do de plântulas por frasco, e uso de
meio nutritivo gelificado, o que acarreta
intensa manipulação das culturas, e en-
volve, com isso um grande contingente
de mão-de-obra especializada.
Biorreatores podem ser conceitua-
dos como equipamentos para cultivo
sob imersão temporária ou permanente
de células, gemas, embriões ou qual-
quer tipo de propágulo que possa ser
utilizado na micropropagação.
Os biorreatores utilizam meio de
cultura líquido, permitem a renovação
do ar durante o cultivo, bem como o
monitoramento de alguns parâmetros
essenciais ao crescimento do propágu-
lo, tais como pH, oxigênio dissolvido,
temperatura, concentração de íons, etc.
Os primeiros biorreatores derivaram
dos equipamentos denominados fer-
mentadores, os quais foram, há muitas
décadas, desenvolvidos para cultivo de
fungos e bactérias para fins industriais.
Assim, os primeiros biorreatores testa-
dos para plantas continuaram sendo
chamados de fermentadores, por serem
utilizados basicamente para o cultivo de
células vegetais isoladas, de forma mui-

Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares de
frascos, utilizando bomba compressora de ar
to parecida com o que era feito com os
fungos e bactérias.
Inicialmente, os fermentadores fo-
ram empregados com pouca ou nenhu-
ma modificação para o cultivo de célu-
las vegetais. Para isso, pequenos ajustes
foram feitos na taxa de renovação do ar
e nas formas de agitação das células.
Biorreatores para cultivo de células ve-
getais foram bastante estudados, princi-
palmente na década de 80, e uma série
de modelos específicos para plantas
foram desenvolvidos.
Recentemente, os biorreatores co-
meçaram a ser utilizados para cultivo de
células, tecidos, gemas e plântulas, ten-
do como objetivo final a produção de
mudas em larga escala.
O primeiro relato sobre o uso de
biorreatores para propagação vegetal
foi primeiramente feito por Takayama e
Misawa (1981) para micropropagação
de begônia. Nesse caso, os autores
utilizaram segmentos nodais de plântu-
las estabelecidas in vitro, seguindo pro-
tocolos de cultivos convencionais em
meio gelificado. Procedimentos simila-
res foram adaptados para uma série de
outras espécies vegetais (Noriega &
Söndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994).
Os biorreatores são aplicados igual-
mente à produção de embriões somáti-
cos (Tautorus et al., 1992; Denchev et
al., 1992 e sementes sintéticas (Attree et
al., 1994; Onishi et al., 1994). Essa meto-
dologia exige completo domínio sobre
o processo de indução e seleção de
calos embriogênicos, bem como da di-
ferenciação e encapslulamento dos
embriões somáticos, além da germina-
ção das sementes sintéticas.
Constituição básica
dos biorreatores
A constituição dos biorreatores usa-
dos para cultura de embrião, gemas e
hastes caulinares para fins de micropro-
pagação é fundamentalmente a mesma
dos equipamentos utilizados para culti-
vo de fungos, bactérias e células vege-
tais (Takayama & Akita, 1994).
Basicamente, os biorreatores tradici-
onais apresentam os seguintes compo-
nentes: frasco de cultivo, motor elétrico
conectado a um eixo que se estende até
o interior do frasco, bomba compresso-
ra de ar, sensores de temperatura, pH e
oxigênio (Takayama & Akita, 1994).
O frasco de cultura é desenhado de
tal forma a permitir uma ótima aeração
do meio de cultura, bem como uma
homogeneização satisfatória com um
mínimo de dano mecânico do material
em cultivo. Os frascos podem ser feitos
de vidro, aço inoxidável, policarbonato,
polipropileno ou qualquer outro materi-
al que suporte a autoclavagem a uma
temperatura de 121 ° C durante 15 a 30
minutos. Freqüentemente, o frasco de
cultivo apresenta um envoltório metáli-
co em forma de jaqueta, por onde
circula água com temperatura pre-de-
terminada, para controle da temperatu-
ra de cultivo (Takayama & Akita, 1994).
A homogeneização do meio de cul-
tura e a aeração do material em cultivo
são feitos de diversas formas, sendo a
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
mais comum a injeção de um fluxo de ar
a uma determinada pressão, combinada
com o movimento de uma hélice no
interior do frasco de cultivo (Takayama
& Akita, 1994). O ar que entra no
sistema é esterilizado ao ser forçado a
passar através de uma membrana com
poros de 0,22 a 0,44 micras de diâmetro.
O tamanho do frasco de cultivo
normalmente varia entre 1 e 20 litros,
embora volumes menores como 250 e
500 ml, ou maiores, 20 ou até mesmo 300
litros já tenham sido utilizados. Entre-
tanto, a maioria dos frascos utilizados
está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama
& Akita, 1994).
Principais tipos de biorreatores
utilizados para cultivo de hastes
caulinares e embrião
Vários tipos de biorreatores têm sido
desenvolvidos e utilizados ou têm po-
tencial de uso em cultivo de gemas,
embriões e plantas. Esses biorreatores
são classificados pelo tipo de agitação e
construção do frasco (Takayama & Aki-
ta, 1994).
Biorreatores tipo
aerador agitador
(“aeration agitation
bioreactor”)
Esse tipo de biorreator é o mais
parecido com os fermentadores con-
vencionais. A agitação é basicamente
feita por meio de hélices conectadas a
um eixo giratório. É basicamente utiliza-
do para células e embriões somáticos
(Kessel & Carr ,1972; Preil et al., 1988). A
grande desvantagem desse modelo de
biorreator é que, para haver uma boa
homogeneização do meio, é necessário
que a hélice gire em velocidades sufici-
entemente elevadas, o que, regra geral,
causa dano mecânico acentuado ao
material em cultivo, principalmente em
hastes e gemas.
Biorreator tipo tambor rotató-
rio (“roller drum bioreactor”)
Nesse tipo de biorreator, o frasco de
cultivo gira suavemente em movimen-
tos rotacionais sobre dois eixos, que
servem não apenas de apoio, mas que
também são responsáveis por imprimir
ao frasco de cultivo o movimento rota-
tório. Nesse tipo de biorreator, o dano
mecânico é mínimo e é adequado ao
37

Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com células embriogênicas
de café em cultivo
cultivo de embriões e plantas. Entretan-
to, o nível de oxigenação só é adequado
quando se utilizam meios de cultura
com alta viscosidade (Tanaka et al.,
1983).
Biorreator tipo filtro rotatório
(“spin filter biorreactor”)
Biorreator de filtro rotatório apre-
senta um filtro conectado a um eixo
central, por onde o meio de cultura é
descarregado (Styer, 1985). Esse ele-
mento é responsável igualmente pela
homogeneização, bem como pela aera-
ção do material em cultivo. Esse tipo de
biorreator funciona satisfatoriamente
bem para propagação via embriogênese
somática (Wheat et al., 1986).
Biorreator tipo borbulhamento
(“air driven bioreactor”)
O biorreator tipo borbulhamento
apresenta uma constituição muito sim-
ples. A homogeneização do meio, bem
como a aeração são feitos via borbulha-
mento de ar no fundo do frasco. Pode
ser de dois tipos: aeração simples ou
coluna de bolha.
Biorreator de aeração
simples e coluna de bolha
(“bubble column bioreactor”)
A relação altura/diâmetro de 1 a 2
define o biorreator de aeração simples e
se a relação é 3 ou acima, o biorreator é
do tipo coluna de bolha. Esses modelos
38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
de biorreatores apresentam bons resul-
tados no cultivo de hastes caulinares,
bulbos, cormos e tubérculos (Takayama
& Misawa, 1981; Takayama et al, 1991).
Esse modelo de biorreator foi desenvol-
vido e utilizado primeiramente na mi-
cropropagacão, por Takayama & Misa-
wa (1981).
Biorreator do tipo
levantamento de ar
(“air lift bioreactor”)
O meio de cultura nesse tipo de
biorreator é movido de baixo para cima
dentro de um tubo situado verticalmen-
te no interior do frasco pelas bolhas de
ar produzidas no fundo do frasco de
cultivo. Esse modelo apresenta bons
resultados, uma vez que há uma boa
aeração e homogeneização do meio de
cultura e pouco dano mecânico ao
material em cultivo (Park et al, 1989). A
única diferença desse biorreator para o
modelo anterior é que o borbulhamento
de ar é feito dentro de um tubo centra-
lizado no frasco de cultivo.
Biorreator do tipo fase gasosa
(“gaseous phase bioreactor”)
Esse modelo é equipado com um
suporte perfurado sobre o qual o mate-
rial em cultivo é posicionado. O meio de
cultura, pulverizado sobre o material em
cultivo é, em seguida, drenado pela base
de suporte e novamente bombeado e
pulverizado a intervalos preestabeleci-
dos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de
biorreator apresenta excelentes resulta-
dos no cultivo de células, tecidos e
órgãos porque não há dano mecânico
nem agitação via borbulhamento. O
inconveniente desse modelo é a não
renovação do ar interno do frasco de
cultivo, o que pode ser contornado com
a inclusão de um sistema de aeração via
injeção de ar estéril.
Biorretor de aeração por
membrana porosa ao oxigênio
(“oxygen permeable
membrane aerator
bioreactor”)
O frasco de cultura desse tipo de
biorreator contém uma canalização fina
em forma de espiral feita de material
poroso ao oxigênio, que pode ser de
teflon, silicone, policarbonato ou poli-
propileno, através do qual o oxigênio
passa para o meio de cultura. Esse
modelo de biorreator não apresenta
problemas relacionados com o dano
mecânico, uma vez que não há nenhum
tipo de agitação, entretanto, a homoge-
neização do meio de cultura fica preju-
dicada (Luttman et al, 1994).
Biorreator do tipo
sobre-aeração
(“overlay aeration bioreactor”)
Nesse modelo, a aeração é feita por
sopramento do ar estéril sobre o meio de
cultura. Eventualmente, esse tipo de
aeração pode ser combinado com agita-
ção suave do meio (Ishibashi et al.,
1987). Esse modelo apresenta deficiên-
cia na aeração, o que pode comprome-
ter o crescimento, sobretudo, de células
e tecidos.
Biorreator de
imersão temporária
Em todos os modelos descritos ante-
riormente, com exceção daquele que
utiliza um sistema de pulverização do
meio, o material em cultivo permanece
imerso continuamente no meio de cul-
tura. Essa imersão contínua causa pro-
blemas de hiperhidratação dos tecidos,
órgãos e plântulas. Dependendo da es-
pécie e do tipo de meio utilizado, a
hiperhidratação dos tecidos pode cau-
sar distúrbios fisiológicos sérios, que
irão afetar o crescimento e desenvolvi-
mento do material em cultivo.
Visando a eliminar ou a minimizar

Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imersão
temporária, em meio de multiplicação
esse problema, foi desenvolvido um meio em contato com o material em
modelo de biorreator chamado de imer- cultivo. O ar é expelido através de um
são temporária (Alvard et al., 1993). orifício na tampa do compartimento
Nesse tipo de biorreator, o meio de superior. Após um período preestabele-
cultura permanece em contato com o cido, a pressão do ar no compartimento
explante por um período predetermina- inferior é aliviada, o que, por gravidade,
do. Em seguida, o meio é drenado e o faz com que o meio retorne ao compar-
explante deixa de ficar em contato timento inferior, permanecendo aí até
direto com o meio de cultura. que o ciclo recomece.
O modelo desenvolvido por Alvard O modelo desenvolvido por Alvard
et al. (1993) é constituído de um frasco
et al. (1993) foi modificado no que se
de dois compartimentos, um superior e refere à construção, mas mantendo as
um inferior, conectados entre si por ummesmas características de funcionamen-
tubo. O meio de cultura é colocado no to, dando origem ao sistema de biorre-
ator denominado RITA® (Teisson et al.,
compartimento inferior e o material a ser
1995).
cultivado, no superior. O meio de cultu-
ra passa do compartimento inferior para O sistema RITA® vem sendo utiliza-
do para uma série de espécies vegetais,
o superior pela injeção de ar no compar-
timento inferior. Quando todo o meio com diferentes tipos de explantes, apre-
passa para o compartimento superior, sentando resultados muito bons (Alvard
ocorre borbulhamento e aeração do et al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne
et al., 1997; Cabasson et al.,
1997; Etienne et al., 1999).
Na realidade, o princí-
pio da imersão temporária
para cultivo de fragmentos
vegetais relativamente gran-
des foi primeiramente des-
crito por Steward et al.
(1952) e relatado por Harris
& Mason (1983). Segundo
Harris & Mason (1983),
Steward et al. (1952) de-
monstraram que raízes de
cenoura imersos em meio
líquido não apresentavam
crescimento satisfatório e
concluíram que o motivo se
Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, após a tratava de deficiência de
multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de
imersão temporária, prontas para serem cultura. Visando a contor-
aclimatadas
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
nar esse problema, delinearam e cons-
truíram um equipamento que foi deno-
minado “auxophyton”, o qual movi-
mentava os frascos de cultura de forma
rotacional sobre uma roda, de tal forma
que, em determinado momento, os seg-
mentos de raiz eram expostos ao ar e, no
momento seguinte, submersos no meio
líquido, conseguindo, com isso, um
aumento da matéria fresca de 38,1 mg
em meio gelificado para 98,6 mg em
meio líquido, no “auxophyton”.
Posteriormente, um equipamento
desenvolvido por Harris & Mason (1983),
para cultivo de explantes de uva em
meio líquido em frascos tipo Erlen-
meyer, apresentava o mesmo princípio
relatado por Steward et al. (1952). Nesse
equipamento, o frasco tipo Erlenmeyer
era mudado automaticamente de posi-
ção a intervalos predeterminados, de tal
forma que, em certa posição, o explante
se encontrava submerso e, em outra
posição, não submerso. O estoque inici-
al de explantes era obtido através do
cultivo, por 28 dias, em meio gelificado
com agar. Após 90 dias de cultivo no
meio de imersão temporária, a produção
de brotos foi sete vezes superior ao
rendimento obtido pelo mesmo período
em meio com agar.
Em 1985, Tisserat & Vandercook
desenvolveram um sistema de cultivo
em imersão temporária, que consistia de
uma grande câmara de cultura, a qual
era periodicamente cheia de meio de
cultura. Embora o controle da troca
gasosa fosse insatisfatório, esse método
de cultivo por imersão temporária mos-
trou ser muito superior aos cultivos em
meios gelificados.
Atken-Christie & Jones (1987) utili-
zaram igualmente um sistema de cultivo
em imersão temporária na propagação
de Pinus. Nesse sistema, o meio nutriti-
vo líquido era colocado sobre o meio
sólido sobre o qual estavam os explan-
tes. O meio permanecia em contato com
o explante por 4 a 6 horas. Após esse
período, o meio era retirado através de
uma bomba de vácuo. Esse procedi-
mento era repetido a cada semana.
Pouco tempo depois, Aitken-Chistie
& Davies (1988) desenvolveram um sis-
tema semi-automático de cultivo sob
imersão temporária, no qual plântulas
eram cultivadas em um grande recipien-
te com meio gelificado, com adição e
remoção automática e periódica do meio
líquido.
Simonton et al. (1991) desenvolve-
39

Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas em
biorreator de imersão temporária
ram um equipamento automático de
micropropagação, no qual o meio líqui-
do era injetado sobre as plântulas em
cultivo, de acordo com um esquema de
tempo preestabelecido. Embora esse sis-
tema tenha apresentado uma excelente
performance quanto ao preciso contro-
le da exposição do explante ao meio de
cultura, alguns problemas foram identi-
ficados, como o uso de um frasco rela-
tivamente grande, de difícil manuseio,
além de alguns problemas de contami-
nação especialmente do tipo bacteria-
na.
Uma modificação mais recente do
modelo de biorreator de imersão tem-
porária foi feito por Lorenzo et al. (1998)
para micropropagação de gemas de
cana-de-açúcar e Escalona et al. (1999)
para gemas de abacaxi. Esse sistema
utiliza dois frascos, sendo um para culti-
vo do material vegetal e outro para
estocagem do meio de cultura. O meio
de cultura é transferido de um frasco
para o outro por meio de um vácuo de
250 mm de Hg. Entretanto, não foram
apresentados detalhes adicionais da
construção e funcionamento desse tipo
de biorreator.
Os modelos de biorreatores de imer-
são contínua encontrados na literatura
científica, em termos gerais, são equipa-
mentos:
a) complexos, do ponto de vista de
montagem e funcionamento;
b) destinam-se apenas ao cultivo sob
condições de imersão contínua, não
permitindo versatilidade no seu uso, por
40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
ex., transformação de um modelo de
imersão contínua para imersão tempo-
rária e vice-versa;
c) de difícil manipulação durante as
fases de esterilização, carga, descarga e
troca do meio de cultura.
Por sua vez, os modelos de imersão
temporária são mais simples na sua
concepção, montagem e funcionamen-
to.
Sistema de Biorreator
desenvolvido pela Embrapa
A Embrapa-Recursos Genéticos e
Biotecnologia desenvolveu e subme-
teu ao INPI, para fins de patenteamen-
to um sistema de biorreator tomando
como base o modelo desenvolvido por
Alvard et al., (1993) e Lorenzo et al.
(1998), que permite uma grande versa-
tilidade de uso. O equipamento apre-
senta as seguintes características não
encontradas em outros modelos de
biorreatores:
a) o equipamento pode utilizar dife-
rentes tipos de frascos, os quais
podem variar em tamanho, forma-
to, constituição, tipo de tampa,
transparência, etc.;
b) a montagem é simples e os com-
ponentes (válvulas solenóides, tem-
porizadores, fonte de ar comprimi-
do, filtros de ar, fluxômetro, cone-
xões metálicas, mangueiras de sili-
cone, etc.) podem ser de fácil aqui-
sição ou feitura;
c) o sistema foi desenhado para com-
portar diferentes números de fras-
cos de cultivo, o que é determina-
do pela extensão das tubulações,
bem como pela potência do com-
pressor ou da fonte de ar compri-
mido;
d) o equipamento pode ser montado
em diferentes ambientes de inten-
sidade de luz, fotoperíodo e tem-
peratura;
e) o equipamento pode ser utilizado
para cultivo em regime de imersão
temporária ou contínua.
f) no regime de imersão contínua, o
equipamento pode funcionar sob
regime de borbulhamento contí-
nuo com diferentes fluxos de ar ou
sob borbulhamento temporário,
cujo período pode ser definido
pelo temporizador. Para isso, são
necessários pequenos ajustes no
equipamento;
g) o equipamento permite fazer, ain-
da, uso de uma fonte de ar artificial
com dosagens específicas de oxi-
gênio, nitrogênio e gás carbônico;
h) o equipamento pode ser utilizado
tanto para cultivo de células e
embriões, quanto para gemas e
segmentos nodais e raiz.
Nos primeiros ensaios, o sistema foi
testado para cultivo de microestacas de
batata para microtuberização e hastes
de abacaxi visando à multibrotação e
ao alongamento das mudas, sob regi-
me de imersão temporária. Em ambos
os casos, os resultados preliminares
foram excelentes. No momento, estão
em andamento testes definitivos com
hastes de abacaxi, em experimentos de
multiplicação para fins de comparação
com o cultivo em meio líquido estaci-
onário e em meio gelificado. Estão
igualmente em andamento os primei-
ros testes de cultivo de células embrio-
gênicas de café.
Por ser um equipamento recém-
desenvolvido, várias modificações es-
tão sendo introduzidas no sistema,
como novos e mais adequados tipos de
frascos e tampas e novos sistemas de
iluminação com vistas a ajustá-lo para
cultivo de explantes específicos, como
células e gemas, além de propiciar uma
melhora no funcionamento, bem
como no uso e economia da fonte
luminosa.
Alguns exemplos de uso podem
ser enumerados para esse sistema de
cultivo em meio líquido, de forma
semi-automática: cultivo de células
embriogênicas e não embriogênicas,
embriões somáticos de diferentes es-
pécies, gemas axilares e apicais para
fins de multibrotação, microestacas
de várias espécies para fins de cresci-
mento e multiplicação das hastes
caulinares, cultivo de raiz para expe-
rimentos diversos, incluindo a produ-
ção de metabólitos secundários, além
de outras aplicações, como a germi-
nação de embrião zigótico in vitro,
em alta quantidade e em condições
totalmente assépticas.
Referência Bibliográfica
Akita, M & Takayama, S. Stimulation
of potato (Solanum tuberosum
L. ) tuberization by semiconti-
nous liquid medium surface level
control. Plant Cell Rep. 13:184-
187, 1994;
Alvard, D.; Cote, F. & Teisson, C.
Comparison of methods of liquid
medium culture for banana mi-
cropropagation. Plant Cell, Tiss.
and Org. Cult. 32:55-60, 1993;
Aitken-Chistie, J. & Davies, H. Deve-
lopment of a semiautomated mi-
cropropagation system. Acta Hor-
ticult. 230:81-87, 1988;
Atken-Chistie, J. & Jones, C. Towards
automation: radiata pine shoot
hedges in vitro. Plant Cell Tiss.
Org. Cult. 8:185-196, 1987;
Attree, S.M.; Pomeroy, M.K. & Fowke,
L.C. Production of vigorous, de-
siccation tolerant white spruce
(Picea glauca (Moench.) Voss.)
synthetic seeds in a bioreactor.
Plant Cell Rep. 13:601-606, 1994;
Cabasson, C.; Alvard, D.; Dambier, D.;
Ollitrault, P. & Teisson, C. Impro-
vement of Citrus somatic embryo
development by temporary im-
mersion. Plant Cell, Tiss. and
Org. Cult. 50:33-37, 1997;
Denchev, P.D.; Kuklin, A.I. & Scragg,
A.H. Somatic embryo production
in bioreactors. J. Biotechnol.
26:99-109, 1992;
Escalona, M; Lorenzo,J.C; Gonzalez,
B.; Daquinta, M.; Gonzalez, J.L.;
Desjardins,Y.; Borroto, C.G. Pine-
apple (Ananas comosus L. Merr)
micropropagation in temporary im-
mersion systems. Plant Cell Rep.
18(9):.743-748, 1999;
Etienne, H.; Lartaud, M; Michaux-Ferri-
erre, N. Carron, M.P. Berthouly, M.
& Teisson, C. Improvement of so-
matic embryogenesis in Hevea bra-
siliensis (Müll. Arg.) using the tem-
porary immersion technique. In
Vitro Cell. Dev. Biol. -Plant
33:81-87, 1997;
Etienne-Bary, D. Bertrand, B.; Vasquez,
N. & Etienne, H. Direct sowing of
Coffea arabica somatic embryos
mass-produced in a bioreactor and
regeneration of plants. Plant Cell
Rep. 19:111-117, 1999;
Harris, R.E. & Mason, E.B.B. Two ma-
chines for in vitro propagation of
plants in liquid medium. Can. J.
Plant Sci. 63:311-316, 1983;
Ishibashi, T.; Odawara, U.; Fujiwara, K.
& Ookuma, M. New oxygen sup-
plying methods for animal cell reac-
tors. Hitachi Hyouron 69:301-
305, 1987;
Kessel, R.H.J. & Carr,A.H.. The effect of
dissolved oxygen concentration on
growth and differentiation of car-
rot (Daucus carota) tissue. J. Exp.
Bot. 23:996-1007, 1972;
Lorenzo, J.C.; Gonzalez, B.L.; Escalona,
M.; Teisson, C. ; Espinosa, P. &
Borroto, C. Sugarcane shoot forma-
tion in an improved temporary im-
mersion system. Cell, Tissue and
Org. Cult. 54:197-200, 1988;
Luttman, R.; Florek, P. & Preil, W.
Silicone-tubing aerated bioreactors
for somatic embryo production.
Plant Cell, Tissue and Org. Cult.
39(2):157-170, 1994;
Noriega, C. & Söndahl, M.R. Arabic
coffee micropropagation through
somatic embryogenesis via biore-
actors. Biotechnologie ASIC, 15e
Colloque, Montpellier. p.73-81 1993;
Onishi, N.; Sakamoto, Y. & Hirosawa,
T. Synthetic seeds as an application
of mass production of somatic em-
bryos. Plant Cell, Tissue and
Org. Cult. 39:137-145, 1994;
Park, J.M. ; Hu, W-S. & Staba, E.J.
Cultivation of Artemisia annua L.
plantlets in a bioreactor containing
a single carbon and a single nitro-
gen source. Biotechnol. and Bi-
oeng. 34:1209-1213, 1989;
Preil, W.; Florek, P.; Wix, U. & Beck, A..
Towards mass propagation by use
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002
of bioreactors. Acta Hortic. 226:99-
100, 1988;
Simonton, W.; Robacker, C. & Krueger,
S. A programable micropropagation
apparatus using cycled liquid me-
dium. Plant Cell, Tissue and Org.
Cult. 27:211-218, 1991;
Steward, F.C.; Caplin, S.M. & Millar, F.K.
Investigations on growth and meta-
bolism of plant cells. I. New techni-
ques for the investigation of meta-
bolism, nutrition and growth in un-
differentiated cells. Ann. Bot. 16:57-
77, 1952;
Styer, D.J. Bioreactor technology for
plant propagation. In: Tissue Cultu-
re In Forestry and Agriculture. Henke,
R.R. & Hughes, K.W. (Eds.). Plenum
Press, New York, pp.117-130, 1985;
Takayama, S. & Akita, M. The types of
bioreactors used for shoots and em-
bryos. Plant Cell, Tissue and Org.
Cult. 39:147-156, 1994;
Takayama, S. & Misawa, M. Mass propa-
gation of Begonia x hiemalis) plan-
tlets by shake culture. Plant & Cell
Physiol. 22(3):461-467, 1981;
Takayama, S.; Swedlund, B. & Miwa, U.
Automated propagation of micro-
bulbs of lilies. In: Cell Cultures and
Somatic Cell Genetics. Vasil, I.K., ed.,
Academic Press Inc. Vol. 8, p.111-
131, 1991;
Tanaka, H.; Nishijima, F. Suwa, M. &
Iwamoto, T. Rotating drum fermen-
tor for plant cell suspension cultures.
Biotechnol. Bioeng. 25:2359-2370,
1983;
Tautorus, T.E.; Lulsdorf, M.M.; Kikcio &
Dunstan, D.I. Bioreactor culture of
Picea glauca-engelmannii (interior
spruce) somatic embryos. Growth
parameters. Appl. Microbiol. Bio-
technol. 38:46-51, 1992;
Teisson, C.; Alvard, D.; Berthouly, M.;
Cote, F.; Escalant, J.V. & Etienne, H.
In vitro culture by temporary immer-
sion: a new device. Plantations
2(5):32-33, 1995;
Tisserat, B.; Vandercook, C.E. Develop-
ment of an automated plant culture
system. Plant Cell, Tissue and
Org. Cult. 5:107-117, 1985;
Ushiyama, K. Large scale culture techni-
ques of plant cells and the secondary
metabolite production. Hakko. To
Kogyo 46:7-11, 1984;
Wheat, D.; Bondrik, R.P. & Nystrom, J.
Spin filter bioreactor technology as
applied to industrial plant propaga-
tion. HortSci. 21:819, 1986.
41