Relatório de Bioquímica

Introdução

Este relatório conta com os dados a respeito das práticas realizadas na disciplina de
Bioquímica I.
Prática I

Filtração Molecular

Nesta prática foram demonstrados os princípios da cromatografia de filtração em gel aplicada

à separação de proteínas.
A cromatografia de filtração em gel separa as proteínas com base no seu tamanho. A
coluna é constituída por uma matriz de pequenas esferas porosas empacotadas.
Ao fazer passar a solução de proteínas pela matriz da coluna, as moléculas pequenas
entram nos poros das esferas demorando a atravessá-los, enquanto que as grandes passam
entre as esferas sendo separadas primeiramente.

Na nossa prática foi-se utilizado Albumina (66 KD) e Verde de Bromo cresol ( 300 D) o
VBC em pH 4 reage especificamente com a albumina, tendo a cor mais intensa quanto a
concentração da proteína.Foi observado a eluência numa coluna de S-dex G-25, que apresenta
poros pequenos para a passagem da molécula de Albumina pelo interior da coluna, de modo
que o esperado é a eluência rápida da proteína, passando pelas laterais da coluna, entre os
poros.
Foram feitas três soluções e cada grupo presente na prática ficou com uma delas.

Solução 1 – Verde de Bromo cresol

Solução 2 - Verde de Bromo cresol (em maior quantidade) + Albumina
Solução 3 - Verde de Bromo cresol + Albumina (em maior quantidade)
Nosso grupo ficou com a solução 3.

Aplicamos 0,5 mL de Albumina + Verde de Bromo cresol na coluna e eluimos com citrato de
sódio 0,1M pH4 . A seguir fomos coletando o material que eluia e, frações de 1mL cada, no
total de 6 frações.
As frações iniciais eram mais claras, pois a Albumina complexada com o Verde de
Bromo cresol ainda não tinha percorrido toda a coluna, à medida que coletávamos notou-se
que se tornavam mais coloridas, indicando a rápida eluência do complexo, que por ter grande
tamanho (e massa) eluiu pelas paredes da coluna.

As seguintes perguntas foram propostas no Roteiro de Prática:

1- Qual a importância do estudo da interação ligante-proteína ?

2- Qual a importância do estudo dos sítios de ligação da albumina ?

3- Como a filtração molecular pode ser empregada nesses estudos ?

4- Como a interação verde de bromocresol-albumina pode ser empregada

na quantificação da albumina ?

5- Discorrer sobre 3 métodos empregados no estudo da interação ligante-

macromolécula.

Respostas:

1- A importância do estudo se dá no fato de que proteínas são entre suas várias funções,
importantes transportadores de substâncias no organismo, como fármacos, que se ligam
aos seus sítios ativos específicos possibilitando a ação dos mesmos no corpo. Na prática
observamos a complexação do Verde de Bromo Cresol nos sítios da Albumina.

2- A albumina é uma das proteínas mais abundantes no plasma e líquido tecidual e

também a mais importante no que concerne a ligação a fármacos, pois se liga a uma
quantidade abundante deles, fazendo dela uma proteína de interesse especial já que é
amplamente utilizada e importante para a industria de medicamentos e pesquisas.
3- A filtração molecular pode ser utilizada num estágio inicial de visualização da
capacidade de complexação da proteína com o ligante que se pesquisa, pode ser utilizada
para a separação da albumina com componentes plasmáticos, levando-se em conta o
tamanho esperado das moléculas e assim, utilizando colunas cromatográficas especificas
até se obter a proteína.

4- Sabendo-se que o Verde de bromo cresol se complexa de forma eficiente com a

albumina, utiliza-se o complexo corado que exibe um espectro de absorção diferente do
corante no seu estado livre, permitindo assim a dosagem da Albumina.

5- A) Método de Biureto: Utilizando-se cobre em meio alcalino, este se complexa com

proteínas, formando um quadrado planar com a ligação peptídica que apresenta absorção
nas bandas de 270nm e 540 nm. O método é aplicado para determinar a concentração de
proteínas totais.
B) Método de Lowry: Usando-se o reagente de Folin-Ciocalteau na presença de
catalisador de Cobre II, há uma redução que produz composto com absorção máxima à
750nm, tendo sido melhorado por Sargent e passando a ter uma absorção ainda melhor à
690nm.
C) Método de Bradford: Método baseado na interação entre o corante BG-250 e
macromoléculas protéicas que contem aminoácidos de cadeias laterais básicas ou
aromáticas. No pH de ração o equilíbrio desloca o corante para a forma aniônica, que
absorve fortemente em 595nm. É um método rápido e sensível.
 Prática II

Interação Proteína Ligantes e Aplicações

Nessa prática observou-se a complexação do Verde de Bromo cresol com a albumina

em diferentes concentrações, bem como seu espectro; O mesmo foi feito com a Gelatina.
Em posse de 8 tubos de ensaio ( 4 para cada proteína) adicionamos 0,5 mL de água em
todos eles, depois disso 0,5 mL de gelatina em um tubo e 0,5 de albumina em outro, obtendo-
se um total de 1 mL de cada; Foi então iniciado do processo : homogeneizava-se e depois
transferia-se 0,5 mL para o tubo seguinte, até obter nos tubos de cada proteína as diluições de
1/2, 1/4 ,1/8 e 1/16, sendo então as respectivas concentrações:
Adicionou-se então 0,5 mL de Verde de Bromo cresol em acetato de pH4. Escolhemos três
comprimentos a partir do gráfico que segue a baixo e foram feitas as medidas de
absorbâncias.
 Escolhemos os comprimentos de 300nm, 450nm e 640nm, que nos pareciam os
maiores segundo o gráfico e, portanto de melhor absorbância.
Abaixo, têm-se os valores observados ao espectrofotômetro e gráfico dos dados
obtidos.

Tabela de Absorbância

Concentração X Comprimento de Onda

BSA BSA BSA Gelatina Gelatina Gelatina

Absorbância Absorbância Absorbância Absorbância Absorbância Absorbância
Concentração no no no no no no
(proporção) comprimento comprimento comprimento comprimento comprimento comprimento
de onda de onda de onda de onda de onda de onda
300nm 450nm 640nm 300nm 450nm 640nm

1/2 0,555 0,000 0,394 0,350 0,090 0,080

1/4 0,293 0,000 0,370 0,160 0,056 0,040

1/8 0,243 0,000 0,312 0,295 0,050 0,036

1/16 0,082 0,000 0,180 0,055 0,000 0,059

 Curva de calibração externa de BSA e gelatina em diferentes comprimentos de onda.
Absorbância X Concentração (proporcional à solução concentrada).
0,450

0,400

0,350
BSA 640nm
Regressão logarítmica de BSA 640nm
0,300 Gelatina 640nm
Regressão linear de Gelatina 640nm

0,250
Absorbância

0,200

0,150 f(x) = 0,101 ln(x) + 0,489

R² = 0,891
0,100
f(x) = 0,123x + 0,016
0,050 R² = 0,938

0,000
0 1/10 1/ 5 3/10 2/ 5 1/ 2 3/ 5

Co n ce n tra çã o (p ro p o rcio n a l)

Interpretação dos resultados

O gráfico de bromocresol ligado a albumina apresenta uma curva que mais se

assemelha a uma curva logarítmica, porque pelo espectro é possível observar que
existem diferenças de absorbância entre o verde de bromocresol sozinho e ele
ligado a albumina, como a concentração de albumina vai diminuindo pela
metade a cada diluição, porém e´adicionado a mesma quantidade de verde de
bromocresol em todas as diluições, já era de se esperar que a relações gráficas
entre as diluições não fosse linear.

A gelatina não apresenta nenhum tipo de ligação com o verde de bromocresol,

e isso justifica os gráficos entre as diluições, ele basicamente se comporta como
uma adição de padrão, e as variações gráficas são em função apenas da
concentração da gelatina, porque foi adicionado a mesma quantidade de
bromocresol em todas as diluições.
 Prática III

Nesta prática realizamos o método de quantificação da Albumina com Verde de

Bromo cresol e de Lowry com objetivo de comparação dos métodos. E também quantificação
de uma gelatina para observação das diferenças.
O método de ensaio da proteína de Lowry para a determinação da concentração da
proteína é um dos ensaios os mais veneravelmente e os mais amplamente utilizados da
proteína. O método de Lowry foi descrito primeiramente em 1951 por Lowry e outros (Lowry
e outros, 1951).
O método é baseado em ambos a reação do biureto, em que as ligações de peptídicas
das proteínas reagem com o cobre sob circunstâncias alcalinas para produzir Cu+, que reage
com
o reagente do Folin, e a reação do Folin-Ciocalteau, que é compreendida deficientemente mas
phosphomolybdotungstate são reduzidos essencialmente ao azul do heteropolymolybdenum
pela oxidação cobre-catalisada de ácidos aminados aromáticos. As reações conduzem a uma
cor azul forte, que dependa em parte do índice da tirosina e do triptofano. O método é pena
sensível a aproximadamente 0.01 magnésio de proteína/mL, e é usado melhor em soluções
com concentrações na escala 0.01-1.0 mg/mL da proteína.

Foram feitas diluições da albumina em 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16 com grandes cuidados na
homogeneização e adicionados os corantes para quantificações pelos métodos de Lowry e
VBC, os valores obtidos de absorbância foram:

Concentração Absorbância de Albumina + Verde de Absorbância da Albumina pelo

Bromo cresol Método de Lowry

1/2 0,877 0,432

1/4 0,819 0,320
1/8 0,721 0,182
1/16 0,629 0,151
1/32 0,438 0,114
Branco 0,451 0,037
 Gráfico de interpretação dos resultados:

Gráfico comparando curvas de calibração de BSA com o método de Lowry.

Absorbância X Concentração (proporcional à solução concentrada).

0,500
BSA
Regressão logarítmica de
BSA
0,400
Método de Low ry
Regressão linear de Método
Absorbância

de Low ry
0,300

0,200
f(x) = 0,132 ln(x) + 0,525
R² = 0,987
0,100
f(x) = 1,452x + 0,013
R² = 0,990
0,000
0 1/ 8 1/ 4 3/ 8 1/ 2
Concentração (proporcional)

Gelatina
Concentração Absorbância
Absorbância
( Proporcional à Verde de
método de Lowry
concentração bromocresol
660 nm
original ) 600nm
Branco 0,455 0,076
1/32 0,471 0,224
1/16 0,513 0,238
1/ 8 0,604 0,363
1/ 4 0,692 0,507
1/ 2 0,778 0,648
C urva de c alibraç ão c omparativa entre verde de bromoc resol e método de Lowry para ge
Abs orbânc ia X F raç ão da c onc entraç ão original
0,700 V er de de bromoc r es ol 600nm
Regr es s ão logar ítmic a de V er de
de br omocr es ol 600nm
A bs or bânc ia do método de
0,600 Low r y s ubtr aído da abs or bânc ia
do v er de de Br omoc r es ol-( A
bsor bânc ia da gelatina isolada )
Regr es s ão linear de A bsor bân
-
0,500 cia do método de Low r y s ubtr - a
ído da absorbânc ia do v er de de
Bromoc r es ol ( A bs or bânc ia da
gelatina is olada )
0,400 Método de Low r y 660nm
Absorbância

Regr es s ão linear de Método de

Low r y 660nm
0,300
f(x) = 0,92x + 0,14
R ² = 0,95
0,200
f(x) = 0,11 ln(x) + 0,39
R ² = 0,99
0,100 f(x) = 0,32x + 0,1
R ² = 0,96
0,000
0 1/16 1/ 8 3/16 1/ 4 5/16 3/ 8 7/16 1/ 2
C o nce ntra çã o ( Fra çã o d a o rig in al )

A partir dos dados coletados pôde-se concluir a respeito da análise da Albumina e da gelatina
com os métodos empregados:

Nessa prática foi possível visualizar um exemplo de diferença de métodos de

quantificação de proteínas, entre o método de Lowry e o uso de verde de bromo cresol. O
primeiro é um método mais sensível, porém ele não consegue distinguir a gelatina da
albumina, que o verde de bromo cresol consegue, por causa da ligação com os sítios da
albumina. A junção dos dois métodos possibilita saber a concentração isolada de cada um. A
partir das equações encontradas provenientes dos pontos se calcula a concentração de
misturas.
 Resumo do Artigo “Structural Basis of The Drug-binding Specificity of Human Serum
Albumin”

O artigo discorre sobre o método de análise cristalográfica em Albumina humana

complexada com drogas e moléculas de pequenas toxinas. Com estudos que se baseiam nos
ligandos, para descobrir características da ligação entre albumina e fármacos, mostrando a
amplitude de moléculas que esta proteína é capaz de transportar e a importância do
detalhamento e precisão no trabalho com a mesma.
A Albumina é uma proteína em grande concentração no sangue, resultante do
metabolismo de alimentos protéicos no fígado, encontrada de forma abundante no plasma e
líquidos teciduais; ela se liga de forma notável a uma grande variedade de medicamentos,
restringindo assim a livre concentração de ativos. O maior problema relacionado à interação
Albumina-ligantes é a superação da afinidade de ligação dos compostos de chumbo para
HSA, representando grande desafio no desenvolvimento de drogas.

A albumina é um monômero contendo três domínios helicoidais homólogos (I, II e

III), cada um subdividido em subdomínios A e B.
A análise cristalográfica da proteína mostra que há dois sítios de ligação principais e
numerosos sítios de ligação secundários. Entre sua gama de ligantes endógenos encontram-se
ácidos graxos não esterificados, bilirrubina, hemina e tiroxina, sendo que os ligantes
relacionados a ácidos graxos são os ligantes primários da proteína, que são capazes de alterar
a polaridade dela e aumentar o volume do sítio de drogas 1. Estes resultados esclarecem a
interpretação dos dados acumulados sobre as drogas ligantes e fornecem um modelo útil para
os esforços de design modular de interações com HSA.
Um dos fatores mais importantes que afetam a distribuição, concentração ativa de
muitas drogas administradas é sua combinação com a albumina do soro humano;
Com a leitura do artigo achamos de grande importância ressaltas características sobre
o sítio 1, subdomínio II e sítio 2, subdomínio III de ligação.

A principal região de ligação está na região central do sitio 1 e parece possuir apnas
um subcompartimento que apenas é acessado por ligantes que induzem movimentos nas
cadeias laterais da proteina.
A entrada para o sitio 2 está “rodada” mais distante da entrada para o sitio de droga
( em comparação com o sitio I, dominio II), e deixa a entrada para este bolso de ligação mais
exposto a solvente; variações na estrutura da água podem ajudar fazendo com que o bloso de
ligação no sitio II seja mais adaptável.
As diferenças aumentam entre os sítios aumentam , embora os dois subdominios dos
sitios de ligação das drogas sejam subdominios estruturalemnte similares ,estes são embalados
em contexto diferente do restante da proteína.
A baixo seguem características gerais:

Características gerais do Sítio 1, subdomínio II:

• É um bolso de ligação que está dentro do subdomínio II A.

• Seletividade por fármacos lipofílicos com centro de carga negativa
 • Apresenta alterações conformacionais como resultado de ligação nas cadeias laterais
com ácidos graxos, como expansão do sítio.

Características gerais do Sítio 2, subdomínio III:

• Sítio 2 é menos que o sítio 1.

• Seletividade: Fármacos lipofílicos com carga negativa periférica.

• Bolso de ligação se expande para acomodar fármaco; e apesar de ser um bolso de

ligação menor pode se ligar a duas moléculas de ácidos graxos de cadeia longa ou uma
de tiroxina.

De Forma Geral, ligantes com ácidos graxos são conhecidos (além de tudo citado no
artigo) com uma grande mudança conformacional na HSA, envolvendo rotações dos dominios
I e III relativos ao dominio II, o que sugere um possivel mecanismo de interação alostérica
ente locais de ligação de ácidos graxos.