1.

Unidades de medida em microscopia e mtodos de investigao celular

Mtodos de Explorao Citolgica:
Microscopia de Luz Microscopia Eletrnica Citoqumica / Histoqumica Imunocitoqumica Radioautografia Criofratura Fracionamento Celular Cromatografia Eletroforese Cultura de Clulas Hibridizao in situ

1.1.

Microscopia:
de Luz (MO): limite de resoluo (distncia mnima entre duas clulas permitindo visualiz-las individualmente) = 0,25m Observao do material: observado por transparncia incidncia de luz incandescente; Se no fino suficiente, deve-se corta-lo ou desgasta-lo at uma espessura entre 30m 5m de espessura. Fixados ou no fixados; Incluso em parafina, gelatina, glicolmetacrilato ou sem incluso; So obtidos em micrtomo de navalha de ao ou vidro; Micrtomo de congelao (vaporizao de CO2 lquido); Criostato (cmara fria entre 30C e 25C); Micrtomo de parafina; Possvel a obteno de cortes seriados; Cortes devem ser corados.

1.1.1.Microscpio

Obteno de cortes: -

Figuras: 01-04 + pasta MO

1.1.2.Microscpio Eletrnico de Transmisso (MET ou TEM): resoluo de 2nm cerca de 200x aquele obtido pelo microscpio de luz. Observao do material:

O material bombardeado por feixes de eltrons acelerados, podendo ou no atravessar o material. Os eltrons que atravessam a amostra em suas reas ditas eltrons-lcidas alcanam uma tela de projeo onde so interpretadas como reas claras; os eltrons que no atravessam a amostra em suas reas ditas eltron-densas no alcanam a tela de projeo e traduzem reas em negro, ou diferentes tons de cinza. A composio destas reas formam a imagem a ser observada de forma direta na tela de projeo.

Obteno de cortes:

Material fixado e impregnado por vaporizao de metais pesados como o tetrxido de smio (OsO4), citrato de chumbo, acetato de uranila, posteriormente includo em resina (Epon, Araldite, Spur) para cortes ultrafinos (20-100nm) em ultramicrtomo com navalha de vidro ou diamante, sendo que, nestes casos, os cortes seriados so muito difceis.

Figuras: 05-07 + 44-46 + 56-57

1.1.3.Microscpio Eletrnico de Varredura (MEV ou SEM - scanning): resoluo

de 3 20 nm. Preparo da amostra:

a) Sem fixao prvia, amostra congelada em nitrognio lquido (-196C) ou

hlio lquido (-269C; -273C = zero absoluto, 0K) seguindo-se uma CRIOFRATURA (freeze-fracture) por lmina afiada de metal. Segue-se a sublimao (etching) com resfriamento do gelo e exposio das superfcies externas e/ou internas das quais obtm-se uma rplica (freeze-etch) em carbono e metal, como platina ou ouro, para observao, aps a remoo do tecido vivo com soluo cida ou hipoclorito de sdio. b) Previamente fixadas e dessecadas, amostras de 1cm ou mais, podem ser examinadas inteiras aps recobrimento com fina camada de ouro ou com platina depositada a vcuo. Observao do material: esta superfcie varrida por um feixe de eltrons que so refletidos em uma tela sensvel ligada a um computador, capaz de montar e colorir as imagens da superfcie analisada. Figuras: 08 10 + 42-43 + 53-55 + 58 1.1.4. Microscpio de Campo Escuro: Observao do material: feixe de luz produz brilho nas bordas do material analisado contra o escuro do fundo do campo, permitindo a observao do deslocamento sobre o meio de observao.

Figura: 11, axonema flagelar de ourio em presena de ATP, mostrando o deslizamento dos MTs. + 31,32 e 33.

1.1.5.Microscpio de Contraste de Fase e Interferncia: Possibilitam observao do

tecido, clula ou microrganismos vivos em cultura ou recm coletados, sem colorao. Observao do material: feixes de luz pareados so analisados aps passarem o tecido e o meio, paralelamente. Somando-se ou anulando-se os comprimentos de onda do feixe resultante, produzem brilho ou cor, definindo os contornos do material. Figura: 12, a)clula animal no-corada sob iluminao direta em microscpios de luz (campo claro); b) em microscpio de contraste de fase; c) em microscpio de contraste diferencial de interferncia (tipo Normasky). + 41

1.1.6.Microscpio

de Polarizao: Usando para o estudo da organizao molecular dos constituintes celulares, sua orientao ou arranjo, como a das fibrilas de celulose na PCV, disposio em pilhas, feixes, etc.

Observao do material: luz fragmentada (polarizada) por um prisma (filtro polarizador) sobre o condensador incide sobre o material analisado atravessando-o, feixes de luz alcanam um outro prisma na ocular (filtro analisador), que absorve ou deixa passar os feixes de luz que atravessaram as estruturas da amostra.

estruturas birrefringentes/anisotrpicas = visualizadas como reas claras, porque alteraram os feixes de luz e esta luz alterada pelas estruturas consegue atravessar o filtro analisador e formar imagem estruturas sem refringncia/isotrpicas = no so visualizadas, reas escuras que no alteraram os feixes de luz, que aps atravessarem a amostra, so absorvidos pelo filtro analisador sem formar imagem O feixe de luz aps passarem pela amostra coletado por uma tela sensvel e interpretadas em um analisador de imagens.

Figura: 13, a)fuso mittico em microscpio de contraste de fase; b)em microscpio de contraste de interferncia diferencial; c)em microscpio de luz polarizada. + 50-51

1.1.7.Microscpio

de Fluorescncia: Alguns compostos naturais so fluorescentes, isto , emitem luz quando seus eltrons so excitados por radiaes de certos comprimentos de onda. (ex: riboflavina vitamina B2; vitamina A; porfirinas).

Figura: 14, o microscpio usa a radiao ultrvioleta para excitar estes compostos ou outros, marcacados por corantes ou imunomarcadoresfluorescentes. Observao direta. +47-48

1.1.8.Microscopia Confocal a Laser (CSM = confocal scanning microscope)

Observao do material: cortes ou clulas vivas so analisadas camada por camada por feixes de luz acelerada (laser), e um computador interpreta e colori as imagens compondo-as tridimensionalmente, se desejado. Observao indireta. Figura: 15, fuso mittico com confocal. + 37-40

1.1.9.Microscpio

Eletrnico de Alta Voltagem: Eltrons so acelerados pela alta voltagem e, portanto tem maior poder de penetrao no material, por isso os cortes podem ser mais espessos, com 1 5 m de espessura.

1.1.10.Microscpio de Tunelamento: Alta resoluo para visualizao de molculas

at tomos. Figura: 16

1.2. Cito e Histoqumica:

Permite a localizao de substncias no tecido ou clula, atravs de reaes especficas com radicais ou molculas da substncia a ser identificada, nas quais o produto desta reao deve ser visvel e insolvel. Algumas reaes seguem a Lei de Lambert-Beer, produzindo uma intensidade de cor proporcional concentrao de substncia no tecido ou clula, assim, podese estimar sua quantidade atravs do citofotmetro, que mede a intensidade da cor observada. Alguns exemplos de reaes (testes histoqumicos): DNA e RNA: Hematoxilina de Harris, Delafield, Mayer, etc. Protenas bsicas: Eosina DNA: reao de Fuelgen RNA: Azul de toluidina Polissacardeos, glicognio, glicoprotenas: P.A.S. (cido peridico de Schiff). Glicosaminoglicanos (GAGs): Alcian Blue Protenas: Xilidine de Ponceau Lipdeos: Sudam III, IV ou Black

Protenas Enzimticas (marcadoras): Fc., TPPase, LDH, SDH, etc.

Figuras: 17-19 + 34-36 + 59-60

1.3. Imunocitoqumica:
Conceitos: -

Baseia-se na especificidade reao antgeno-anticorpo de ocorrncia natural no organismo vivo, aumentando, portanto, a segurana na localizao e identificao do composto a ser localizado. Anticorpo: marcador fluorescente, radioativo, ou no visvel. Anti-anticorpo: marcador do marcador, quando aquele no visvel, este deve ser usado com propriedades fluorescentes, radioativas ou ser precipitvel em uma reao secundria. Antgeno: substncia a ser localizada (protena de biomembrana, intra/extracelular) = protena X..

Obteno de um anticorpo: protena X (antgeno) extrada de um determinado rgo em um rato (homogeneizado) e esta injetada em um coelho, que produzir anticorpos para a protena X injetada (anticorpo especfico para a protena X). Do sangue do coelho obtm-se os anticorpos especficos que devero ser marcados (ou no) antes de utilizados para a deteco da protena X em qualquer outro tecido ou organismo similar. Reao Imunohistoqumica: Direta: injeta-se o purificado (anticorpo X) novamente no rato ou deposita-se sobre amostra fresca de qualquer tecido, decorrido algum tempo, localiza-se e quantifica-se a protena X nestes tecidos pela visualizao do marcador do antgeno (anti-anticorpo). Figuras 24 e 25 Indireta: injeta-se primeiro o marcador (anticorpo para a protena X) no visvel e, posteriormente, injeta-se um marcador do marcador (anti-anticorpo para a protena X) visvel pela presena de um radical fluorescente, radioativo ou sujeito reao posterior onde se produz um precipitado visvel no local da reao, localizando assim, indiretamente a protena X no tecido da clula. Figuras 23,26 e 27

1.4. Radioautografia: Consiste em localizar substncias do metabolismo marcadas

radiativamente pela incorporao de istopos radioativos como carbono radioativo (C14); trcio (H3); S35; I131; I125; e P 32, durante a sua sntese natural no organismo, desta forma a tcnica tambm permite determinar a velocidade da sntese. Os

istopos emitem partculas (eltrons) de fraco poder de penetrao, de modo que no causam dano s clulas. A identificao, do local de incorporao nos cortes histolgicos, se d com a exposio do tecido emulso fotogrfica enegrecendo no tecido os locais dos istopos ou por sobreposio de pelcula fotogrfica que reage com os istopos radiativos incorporados no tecido e quando esta revelada mostra pontos enegrecidos no local de depsito e pelo tamanho do ponto determina-se tambm sua quantidade relativa. Ressalta-se a obrigatoriedade de todo o processo dar-se em cmara escura sob luz vermelha. Figura: 20, a)glndula submandibular com grnulos secretores marcados pela incorporao de H3-fucose identificada nos pontos pretos, ao MO; b)mesma glndula, aqui a H3-fucose identificada por filamentos pretos, ao MET. + 52

Figuras adicionais: 21 comparao entre medidas 22 criostato, usado para 28-29 funcionamento dos microscpios eletrnicos 30 ultramiscrtomo, para fazer cortes a serem observados em ME 31-33 exemplos de foto com microscpio de campo escuro (33: laranja coberta com miclio de fungo) 34-36 exemplos de marcao citoqumica 37-40 exemplos de microscopia confocal 41 exemplo de microscopia de contraste de fase 42-43 criofratura, mquina de preparo e exemplo de foto 44-46 exemplos de ME e primeiro Mev. 47-48 exemplos de fotos com microscopia de fluoescncia 49 marcao de uma parte do crebro com histoqumica de metais pesados 50-51 comparao entre observao de slica nos tecidos entre microscopia de polarizao (51) e histoqumica (50). 52- exemplo de foto com tcnica de radioautograma 53-55 exemplos de MEVs. pasta MO exemplos de microscpios ticos atuais e antigos