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1 Unidades e Metodos de Investigacao Em Biologia Celular

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1.

Unidades de medida em microscopia e métodos de investigação celular
Métodos de Exploração Citológica:
Microscopia de Luz Microscopia Eletrônica Citoquímica / Histoquímica Imunocitoquímica Radioautografia Criofratura Fracionamento Celular Cromatografia Eletroforese Cultura de Células Hibridização “in situ”

1.1.

Microscopia:
de Luz (MO): limite de resolução (distância mínima entre duas células permitindo visualizá-las individualmente) = 0,25μm Observação do material: É observado por transparência à incidência de luz incandescente; Se não é fino suficiente, deve-se corta-lo ou desgasta-lo até uma espessura entre 30μm – 5μm de espessura. Fixados ou não fixados; Inclusão em parafina, gelatina, glicolmetacrilato ou sem inclusão; São obtidos em micrótomo de navalha de aço ou vidro; Micrótomo de congelação (vaporização de CO2 líquido); Criostato (câmara fria entre –30°C e –25°C); Micrótomo de parafina; Possível a obtenção de cortes seriados; Cortes devem ser corados.

1.1.1.Microscópio

Obtenção de cortes: -

-

Figuras: 01-04 + pasta MO

1.1.2.Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET ou TEM): resolução de 2nm cerca de 200x aquele obtido pelo microscópio de luz. Observação do material:

nestes casos. para observação. Observação do material: esta superfície é varrida por um feixe de elétrons que são refletidos em uma tela sensível ligada a um computador. -273°C = zero absoluto. Os elétrons que atravessam a amostra em suas áreas ditas elétrons-lúcidas alcançam uma tela de projeção onde são interpretadas como áreas claras.Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV ou SEM .3. os elétrons que não atravessam a amostra em suas áreas ditas elétron-densas não alcançam a tela de projeção e traduzem áreas em negro. permitindo a observação do deslocamento sobre o meio de observação. Araldite. b) Previamente fixadas e dessecadas. Spur) para cortes ultrafinos (20-100nm) em ultramicrótomo com navalha de vidro ou diamante. Figuras: 08 –10 + 42-43 + 53-55 + 58 1. Preparo da amostra: a) Sem fixação prévia. amostras de 1cm ou mais. Obtenção de cortes: - Material fixado e impregnado por vaporização de metais pesados como o tetróxido de ósmio (OsO4). Microscópio de Campo Escuro: Observação do material: feixe de luz produz brilho nas bordas do material analisado contra o escuro do fundo do campo. . capaz de montar e colorir as imagens da superfície analisada. como platina ou ouro. citrato de chumbo. podendo ou não atravessar o material. ou diferentes tons de cinza.- O material é bombardeado por feixes de elétrons acelerados.4. 0K) seguindo-se uma CRIOFRATURA (“freeze-fracture”) por lâmina afiada de metal. A composição destas áreas formam a imagem a ser observada de forma direta na tela de projeção.1. após a remoção do tecido vivo com solução ácida ou hipoclorito de sódio.scanning): resolução de 3 – 20 nm. os cortes seriados são muito difíceis. posteriormente incluído em resina (Epon. acetato de uranila.1. Figuras: 05-07 + 44-46 + 56-57 1. sendo que. Segue-se a sublimação (“etching”) com resfriamento do gelo e exposição das superfícies externas e/ou internas das quais obtêm-se uma réplica (“freeze-etch”) em carbono e metal. amostra é congelada em nitrogênio líquido (-196°C) ou hélio líquido (-269°C. podem ser examinadas inteiras após recobrimento com fina camada de ouro ou com platina depositada a vácuo.

+ 31.Microscópio de Fluorescência: Alguns compostos naturais são fluorescentes. feixes.1. porfirinas). vitamina A.  • estruturas birrefringentes/anisotrópicas = visualizadas como áreas claras. etc. Observação do material: luz fragmentada (polarizada) por um prisma (filtro polarizador) sobre o condensador incide sobre o material analisado atravessando-o. paralelamente.Microscópio de Polarização: Usando para o estudo da organização molecular dos constituintes celulares.Figura: 11. sem coloração. Somando-se ou anulando-se os comprimentos de onda do feixe resultante. b)em microscópio de contraste de interferência diferencial. áreas escuras que não alteraram os feixes de luz. Observação do material: feixes de luz pareados são analisados após passarem o tecido e o meio. são absorvidos pelo filtro analisador sem formar imagem O feixe de luz após passarem pela amostra é coletado por uma tela sensível e interpretadas em um analisador de imagens. (ex: riboflavina – vitamina B2. b) em microscópio de contraste de fase. mostrando o deslizamento dos MT’s.32 e 33.1. célula ou microrganismos vivos em cultura ou recém coletados. definindo os contornos do material.Microscópio de Contraste de Fase e Interferência: Possibilitam observação do tecido. 1.6. porque alteraram os feixes de luz e esta luz alterada pelas estruturas consegue atravessar o filtro analisador e formar imagem estruturas sem refringência/isotrópicas = não são visualizadas.1. isto é. disposição em pilhas. que absorve ou deixa passar os feixes de luz que atravessaram as estruturas da amostra. axonema flagelar de ouriço em presença de ATP. como a das fibrilas de celulose na PCV. + 50-51 1. a)fuso mitótico em microscópio de contraste de fase. Figura: 12. sua orientação ou arranjo. emitem luz quando seus elétrons são excitados por radiações de certos comprimentos de onda. + 41 1. feixes de luz alcançam um outro prisma na ocular (filtro analisador). Figura: 13. c) em microscópio de contraste diferencial de interferência (tipo Normasky). produzem brilho ou cor.5. . a)célula animal não-corada sob iluminação direta em microscópios de luz (campo claro). que após atravessarem a amostra. c)em microscópio de luz polarizada.7.

+47-48 1.Microscopia Confocal a Laser (CSM = confocal scanning microscope) Observação do material: cortes ou células vivas são analisadas camada por camada por feixes de luz acelerada (laser). (ácido periódico de Schiff). glicogênio. Cito e Histoquímica: Permite a localização de substâncias no tecido ou célula. Algumas reações seguem a Lei de Lambert-Beer.10. Alguns exemplos de reações (testes histoquímicos): DNA e RNA: Hematoxilina de Harris.Microscópio de Tunelamento: Alta resolução para visualização de moléculas até átomos.1. IV ou Black . por isso os cortes podem ser mais espessos. se desejado. Delafield. assim. que mede a intensidade da cor observada. + 37-40 1. glicoproteínas: P. o microscópio usa a radiação ultrvioleta para excitar estes compostos ou outros. através de reações específicas com radicais ou moléculas da substância a ser identificada.A.1. produzindo uma intensidade de cor proporcional à concentração de substância no tecido ou célula.8. etc. 1. Figura: 16 1. nas quais o produto desta reação deve ser visível e insolúvel. portanto tem maior poder de penetração no material. Mayer. com 1 – 5 μm de espessura. Figura: 15. marcacados por corantes ou imunomarcadoresfluorescentes.Microscópio Eletrônico de Alta Voltagem: Elétrons são acelerados pela alta voltagem e.9. Proteínas básicas: Eosina DNA: reação de Fuelgen RNA: Azul de toluidina Polissacarídeos. e um computador interpreta e colori as imagens compondo-as tridimensionalmente.S. Observação indireta.1. Glicosaminoglicanos (GAGs): Alcian Blue Proteínas: Xilidine de Ponceau Lipídeos: Sudam III. Observação direta. fuso mitótico com confocal.Figura: 14. podese estimar sua quantidade através do citofotômetro.2.

radioativo ou sujeito à reação posterior onde se produz um precipitado visível no local da reação. SDH. “Antígeno”: substância a ser localizada (proteína de biomembrana. “Anti-anticorpo”: marcador do marcador. Figuras: 17-19 + 34-36 + 59-60 1. Do sangue do coelho obtêm-se os anticorpos específicos que deverão ser marcados (ou não) antes de utilizados para a detecção da proteína X em qualquer outro tecido ou organismo similar. indiretamente a proteína X no tecido da célula. I125.. Os . aumentando. posteriormente. TPPase. Figuras 24 e 25 Indireta: injeta-se primeiro o marcador (anticorpo para a proteína X) não visível e. Reação “Imunohistoquímica”: Direta: injeta-se o purificado (anticorpo X) novamente no rato ou deposita-se sobre amostra fresca de qualquer tecido. ou não visível. S35. radioativo. Figuras 23.. Radioautografia: Consiste em localizar substâncias do metabolismo marcadas radiativamente pela incorporação de isótopos radioativos como carbono radioativo (C14).26 e 27 1. LDH. injeta-se um marcador do marcador (anti-anticorpo para a proteína X) visível pela presença de um radical fluorescente. intra/extracelular) = proteína X.3. trício (H3). durante a sua síntese natural no organismo. desta forma a técnica também permite determinar a velocidade da síntese. e P 32. Imunocitoquímica: Conceitos: - Baseia-se na especificidade reação “antígeno-anticorpo” de ocorrência natural no organismo vivo. - Obtenção de um anticorpo: proteína X (antígeno) é extraída de um determinado órgão em um rato (homogeneizado) e esta é injetada em um coelho. etc. este deve ser usado com propriedades fluorescentes. portanto. localiza-se e quantifica-se a proteína X nestes tecidos pela visualização do marcador do antígeno (anti-anticorpo). decorrido algum tempo. I131. localizando assim. que produzirá anticorpos para a proteína X injetada (anticorpo específico para a proteína X). a segurança na localização e identificação do composto a ser localizado. radioativas ou ser precipitável em uma reação secundária. quando aquele não é visível.- Proteínas Enzimáticas (marcadoras): Fác. “Anticorpo”: marcador fluorescente.4.

a)glândula submandibular com grânulos secretores marcados pela incorporação de H3-fucose identificada nos pontos pretos. Ressalta-se a obrigatoriedade de todo o processo dar-se em câmara escura sob luz vermelha. de modo que não causam dano às células. aqui a H3-fucose é identificada por filamentos pretos.isótopos emitem partículas β (elétrons) de fraco poder de penetração. + 52 . Figura: 20. do local de incorporação nos cortes histológicos. b)mesma glândula. A identificação. ao MET. se dá com a exposição do tecido à emulsão fotográfica enegrecendo no tecido os locais dos isótopos ou por sobreposição de película fotográfica que reage com os isótopos radiativos incorporados no tecido e quando esta é revelada mostra pontos enegrecidos no local de depósito e pelo tamanho do ponto determina-se também sua quantidade relativa. ao MO.

usado para 28-29 – funcionamento dos microscópios eletrônicos 30 – ultramiscrótomo. 47-48 – exemplos de fotos com microscopia de fluoescência 49 – marcação de uma parte do cérebro com histoquímica de metais pesados 50-51 – comparação entre observação de sílica nos tecidos entre microscopia de polarização (51) e histoquímica (50). 52.exemplo de foto com técnica de radioautograma 53-55 – exemplos de MEV’s.Figuras adicionais: 21 – comparação entre medidas 22 – criostato. pasta MO – exemplos de microscópios óticos atuais e antigos . para fazer cortes a serem observados em ME 31-33 – exemplos de foto com microscópio de campo escuro (33: laranja coberta com micélio de fungo) 34-36 – exemplos de marcação citoquímica 37-40 – exemplos de microscopia confocal 41 – exemplo de microscopia de contraste de fase 42-43 – criofratura. máquina de preparo e exemplo de foto 44-46 – exemplos de ME e primeiro Mev.

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