Slides TCC 09062011

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CINCIAS DA SADE CURSO DE FARMCIA
ESTUDO DA ATIVIDADE ANTIGENOTXICA DO LTEX DE Euphorbia tirucalli PELO TESTE DO MICRONCLEO EM MEDULA SSEA DE RATOS Dborah Munique Nogueira de Sousa
Banca examinadora: Profa. Dra. Aline Schwarz (Orientadora UFRN) Profa. Dra. Vivian Silbiger (UFRN) Msc. Iris Ucella de Medeiros
Natal, 16 de junho de 2011.
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Introduo
O homem est exposto diariamente concentraes sub-txicas de uma gama de substncias que podem provocar mutaes (ALBERTS et al., 2002); Sabe-se que essas substncias, por serem altamente reativas, provocam desde defeitos hereditrios, oriundos de mutaes em clulas germinativas, at a formao de tumores benignos ou malignos, resultantes de alteraes em clulas somticas (RIETJENS et al., 2005); Somente neste ano de 2011 estima-se que surgir mais de 489.270 novos casos de cncer no Brasil (BRASIL, 2009).
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Introduo
Devido a grande quantidade de efeitos adversos e ao insucesso oriundos dos tratamentos usuais (radioterapia, quimioterapia e cirurgia), muitos pacientes aderem s terapias complementares e/ou alternativas (CASSILETH e DENG, 2004); Sabe-se que diversas plantas medicinais podem possuir efeito anticarcinognico tais como a Chenopodium ambrosioides, popularmente conhecida como mastruz (KIUCHI et al., 2002; LIU, 2004; NASCIMENTO et al., 2006); a Annona muricata, conhecida por graviola (KOJIMA et al., 2008) e o cacto Opuntia fcus indica, conhecida por palma (NETO et al., 2005).
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Introduo
O uso emprico etnofarmacolgico dos extratos etanlico e aquoso do ltex de E. tirucalli como um agente antitumoral bem difundido na medicina popular para tratar doenas crnico-degenerativas (FURSTENBERGER, 1985; GARCIA et al., 2010); A espcie Euphorbia tirucalli Lineu (aveloz), pertence famlia Euphorbiaceae, de origem africana e tem distribuio cosmopolita (CORREIA, 1994; VARRICCHIO et al., 2008); O ltex custico de E. tirucalli, de acordo com a literatura, pode possuir atividades duplas: co-carcinognico e anticarcinognico (HECKER, 1968; SIGIURA, 1994; BOSCH, 2004); O grau de esterificao da cadeia diterpnica prediz a atividade promotora tumoral ou antitumoral do ltex dependendo das condies Page 4 ambientais (DATTA et al., 1999; WADA et al., 2002).
Introduo
Outras atividades tambm tm sido atribudas ao ltex como moluscicida (TIWARI E SINGH, 2005; AFONSO-NETO et al., 2010), larvicida (YADAV et al., 2002; RAHUMAN, 2008; RAMOS et al., 2009; MWINE et al., 2010), antiviral (BETANCUR-GALVIS et al. 2002; MAREGESI et al., 2010), citotxica (VALADARES et al, 2006) e antimicrobiana (LIRIO et al., 1998; PAREKH e CHANDA, 2006).
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Fontes:http://www.tudosobreplantas.com.br/blog/index.p hp/2011/01/26/avelos-e-eficiente-contra-o-cancer/
Fonte: http://www.princesadebobes.com.br/2010/07/hospitalalberteinstein-faz-pesquisa-contra-o-cancer/
Fonte: http://www.einstein.br/espaco-saude/tecnologiae-inovacao/Paginas/avelos-um-aliado-contra-oPage 6 cancer.aspx
Introduo
Neste estudo, o extrato aquoso de E. tirucalli a 0,05% (v/v) foi testado para a toxicidade geral e para a genotoxidade in vivo em clulas da medula ssea de ratos Wistar, utilizando como parmetro, o teste do microncleo. O teste do microncleo amplamente utilizado na deteco de alteraes provocadas por agentes clastognicos (que quebram cromossomos) e aneugnicos (que interferem nas fibras do fuso mittico) (RABELLO-GAY et al. 1991).
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Introduo
Microncleo (MN) ou corpsculo de Howell-Jolly: um pequeno corpo de DNA, localizado no citoplasma; aparece na telfase e resultante de fragmentos de cromossomos ou de cromossomos inteiros. Pode haver um ou mais por clula; Eritrcito policromtico (EP): um eritrcito jovem, que ainda contm ribossomos. Eritrcito normocromtico (EN): eritrcito maduro, sem ribossomos; O teste se caracteriza pela observao do efeito do agente testado em EP anucleados, que tm vida curta, e qualquer MN encontrado representa dano cromossmico recente.
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Introduo
Fonte: http://faqbio.blogspot.com/2011/04/ficha-resumo-divisao-celular-mitose_29.html Fonte: Adaptado de http://faqbio.blogspot.com/2011_04_01_archive.html
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Soluo aquosa De uma planta autenticada (nmero de registro: Euphorbia tirucalli L. - 10.110 D.M.N. Sousa) foi coletado 50l do ltex, que foi adicionado em um balo volumtrico de 100 mL. O volume do balo foi completado com gua destilada; A soluo foi feita minutos antes da administrao.
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Animais 20 ratos Wistar machos com 60 dias de vida (Protocolo CEUAUFRN: 040/2010); Foram alojados individualmente em gaiolas de polipropileno (40x50x20 cm), mantidas em sala adequada com temperatura (23 a 26 C) e umidade relativa do ar controlados e ciclo de luz claro/escuro de 12h; gua e rao foram oferecidas ad libitum durante todo o procedimento experimental; Os animais foram divididos em trs grupos: controle (n=6), que recebeu gua por gavagem diariamente, e dois grupos experimentais (n=7/grupo) que receberam, tambm por gavagem, 0,5mL ou 1,0mL da soluo aquosa do ltex 0,05% (v/v) diariamente, por 30 dias. Page 11

Animais Durante todo o tratamento o consumo de rao e a ingesto hdrica foram mensurados; Os animais foram pesados diariamente;
Ao final do tratamento (dia 30) os animais foram subdivididos em dois grupos menores. Metade recebeu soluo salina 0,9% (i.p.) e a outra metade recebeu ciclofosfamida 50mg/kg (i.p.);
24h aps, os animais foram submetidos eutansia com tiopental (70mg/kg; i.p.) para a exteriorizao do fmur e coleta de medula ssea utilizado no teste do microncleo.
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Controle + salina (n=3) Controle Controle + ciclofosfamida (n=3)
Soluo aquosa + salina (n=3) 0,5 mL da soluo aquosa Soluo aquosa + ciclofosfamida (n=4)
Soluo aquosa + salina (n=3) 1,0 mL da soluo aquosa Soluo aquosa + ciclofosfamida (n=4) Page 13

Teste do microncleo
Corante Rosenfeld
Fonte: arquivo pessoal.
5 minutos 1000 rpm
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Leitura das lminas Foi realizada a contagem e anlise de 1000 eritrcitos por lmina, em microscpio ptico com objetiva de aumento de 100 vezes (leitura em zigue-zague); Considera-se como normal a ocorrncia de 03 eritrcitos policromticos micronucleados (EPMN) para cada 1000 EP. Assim, foi anotada a frequncia de EPMN; Foi realizada tambm a contagem de EP e EN com o objetivo de verificar a proporo entre clulas jovens e maduras; A diminuio na proporo de eritrcitos imaturos (EP) reflete uma diminuio na relao EP/EN, sendo isso um parmetro de citotoxicidade ou depresso celular (HEDDLE E SALAMONE, 1981).
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Leitura das lminas
A colorao de Rosenfeld (Giemsa modificado) eritrcitos policromticos de normocromticos: diferencia
a) Eritrcito policromtico micronucleado (EPMN) b) Eritrcito policromtico (EP) c) Eritrcito normocromtico (EN)
http://eduep.uepb.edu.br/rbct/sumarios/pdf/mutagenese.pdf
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Estatstica
Foi empregada a anlise de varincia ANOVA seguida do post-hoc teste de Tukey, quando necessrio, na anlise dos dados obtidos. Para todos os dados foi considerada a diferena de 5%.
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Resultados
Consumo de rao, ingesto hdrica, peso corporal e ganho de peso corporal: A anlise de varincia revelou que os diferentes tratamentos no foram capazes de provocar alteraes no consumo de rao e na ingesto hdrica dos animais experimentais quando comparados com o grupo controle (Figuras 1 e 2); O peso corporal (dados no apresentados) e o ganho de peso corporal total (calculado a cada trs dias - Figura 3) tambm no foram alterados pelos tratamentos;
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Resultados
Controle 0,5mL da soluo aquosa 1,0mL da soluo aquosa

70
65
Consumo de rao (g)
60
55
50
45
40 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Perodo de tratamento
Figura 1- Consumo de rao (g) de ratos tratados ou no (grupo controle) com 0,5 mL ou 1,0 mL da soluo aquosa (0,05% v/v) do ltex de E. tirucalli, por 30 dias. (p>0,05 ANOVA; mdia erro padro). Page 19
Resultados

160
150
*
140
Volume (mL)
130
*
120
110
100
90 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
Figura 2- Ingesto hdrica (mL) de ratos tratados ou no (grupo controle) com 0,5 mL ou 1,0 mL da soluo aquosa (0,05% v/v) do ltex de E. tirucalli, por 30 dias. (*p<0,05 ANOVA e post-hoc teste de Tukey; mdia erro padro). Page 20
Resultados

80
60
Ganho de peso (g)
40
20
*
0
-20 D1-3 D3-6 D6-9 D9-12 D12-15 D15-18 D18-21 D21-24 D24-27 D27-30 D1-30
Figura 3 - Ganho de peso (g) de ratos tratados ou no (grupo controle) com 0,5 mL ou 1,0 mL da soluo aquosa (0,05%v/v) do ltex de E. tirucalli por 30 dias. (* p<0,05 ANOVA e posthoc teste de Tukey; mdia erro padro). Page 21
Resultados
Tabela 1- Efeito da soluo aquosa do ltex de E. tirucalli na clastogenicidade induzida por ciclofosfamida em medula ssea de ratos.
Grupos Controle + salina Controle + ciclofosfamida No EPMN 1,730,13 11,330,88***c % EPMN 0,170,01 0,110,01***c 0,570,07**a,d 1,200,15***b,e,f No EP 281,6010,03 200,335,41***c 265,0012,58**d 167,509,24***e,f No EN 716,6710,14 788,334,55***c 735,0012,58**d 832,509,24**e,f EP/EN 0,390,02 0,260,04**c 0,360,02**d 0,200,01**e,f
0,5 mL sol. 5,670,67**a,d aquosa + salina 0,5 mL sol. aquosa + ciclofosfamida 12,001,47***e,f
1,0 mL sol. 4,330,67*a **d aquosa + salina 1,0 mL sol. 3,670,67**b*e aquosa + ciclofosfamida
0,430,07*a,d 0,370,07*e,f
273,3310,14**d 230,0010,41*e,f
726,6710,14**d 770,0010,41*e,f
0,380,02**d 0,290,02*e,f
ANOVA seguida do post-hoc teste de Holm-Sidak (Mdia erro padro). ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05. (a) = sol. aquosa + salina vs controle + salina, (b) = sol. aquosa + ciclofosfamida vs controle + ciclofosfamida, (c) controle + ciclofosfamida vs controle + salina, (d) sol. aquosa + salina vs controle + ciclofosfamida, (e) sol. aquosa + Page 22 ciclofosfamida vs controle + salina, (f) sol. aquosa + ciclofosfamida vs sol. aquosa + salina.
Discusso
Consumo de rao, ingesto hdrica, peso corporal e ganho de peso corporal: Um estudo de toxicidade no desenvolvimento de ratos demonstrou que uma soluo aquosa 0,05% do ltex de E. tirucalli no provocou alteraes no peso e consumo de rao de ratas prenhes (SILVA et al., 2007); Em nosso estudo, a soluo do ltex de E. tirucalli (0,05%), administrada por 30 dias a ratos machos mostrou no ser capaz de promover alteraes no peso corporal, ganho de peso, consumo de rao e ingesto hdrica, conforme observado nas Figuras 1, 2 e 3; Entretanto, esses parmetros bsicos no so suficientes para concluir, apenas para sugerir, a respeito da toxicidade de frmacos ou drogas. Page 23
Discusso
Atividade genotxica:
Em nosso estudo, analisamos a genotoxicidade da soluo aquosa do ltex (0,05%) de E. tirucalli em medula ssea de ratos, pelo teste do microncleo, para podermos melhor entender sobre os efeitos nocivos e inclusive farmacolgicos que essa soluo pode exercer, j que a mesma empregada na medicina popular como antitumoral e no tratamento do cncer;
Empregamos o frmaco ciclofosfamida como controle positivo pelo fato de se conhecer bem sua interferncia no funcionamento normal do DNA por alquilao, provocando ligao inter cruzada dos seus filamentos.
Page 24
Discusso
Atividade genotxica: Microncleos fornecem fortes evidncias de genotoxicidade sistmica da substncia qumica avaliada e, sob condies experimentais apropriadas, os resultados negativos sugerem a concluso de que o agente teste no genotxico; Uma das formas de avaliao da citotoxicidade medular provocada por agentes qumicos feita atravs da relao entre eritrcitos policromticos e normocromticos (EP/EN); (HEDDLE e SALAMONE, 1981; TITENKO-HOLLAND et. al, 1997). Em nosso estudo, a soluo aquosa do ltex, isoladamente, revelou no ser capaz de promover citotoxicidade j que os valores de MN e as razes EP/EN estiveram prximo daqueles apresentados pelo grupo controle no tratado com ciclofosfamida.
Page 25
Discusso
Atividade genotxica:
A ciclofosfamida, como esperado, demonstrou apresentar genotoxicidade, j que ocorreu aumento no nmero de MN em todos os grupos (experimentais e controle) que receberam esse frmaco, com exceo do grupo experimental tratado com 1,0mL de soluo aquosa; A ciclofosfamida, como esperado, demonstrou apresentar citotoxicidade j que ocorreu reduo no nmero de EP e da razo EP/EN em todos os grupos (experimentais e controle) que receberam esse frmaco;
Page 26
Discusso
O efeito protetor (anti genotxico) atribudo ao maior volume da soluo aquosa do ltex de E. tirucalli possivelmente se deve presena de compostos qumicos chamados diterpenos. De acordo com a literatura, os diterpenos exercem ao anticancergena por inibir a proliferao da Protena Quinase C (PKC) nas clulas, convergindo numa ao antiproliferativa e proapopttica em vrias clulas humanas de cncer (PIANOWSKI, 2010).
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Concluso
Os diferentes volumes da soluo aquosa de E. tirucalli 0,05% (v/v), no alteraram o peso corporal, ganho de peso e o consumo de gua e rao. A soluo de E. tirucalli no provocou efeito genotxico nem citotxico em ratos tratados oralmente com 0,5 mL e 1,0 mL, durante 30 dias; Entretanto, o maior volume da soluo aquosa do ltex (1mL) inibiu a ao genotxica, mas no a citotxica, da ciclofosfamida na medula ssea dos ratos; Os resultados obtidos mostram que o menor volume de soluo de ltex (0,05% v/v) capaz de promover essa ao, em ratos, est entre 0,5 mL e 1,0 mL; Novos testes devem ser desenvolvidos para elucidar qual o menor volume, de fato, necessrio para promover essa ao em ratos.
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Referncias
AFONSO-NETO, I. S.; BESSA, E. A.; SOARES, G. L. G. Avaliao da atividade moluscicida do ltex de trs espcies de Euphorbia (Euphorbiaceae) sobre Leptinaria unilamellata d'Orbigny, 1835 (Gastropoda - Subulinidae). Rev. Bras. Plantas Med., Botucatu, v. 12, n. 1, p. 90-95. 2010. ALBERTS, B. et al. Fundamentos da Biologia Celular. Porto Alegre: Editora Artmed, 2002. (Edio Universitria) BANI, S. et al. Anti-arthritic activity of a biopolymeric fraction from Euphorbia tirucalli. Journal of Ethnopharmacology, v. 110, p. 9298, 2007.
BETANCUR-GALVIS, L. A. et al. Cytotoxic and antiviral activities of Colombian medicinal plant extracts of the Euphorbia genus. Mem. Instituto Oswaldo Cruz, v. 97, p. 541-546. 2002.
BOSCH, C. A. van den. Is endemic Burkitt's lymphoma an alliance between three infections and a tumour promoter? Lancet Oncol., v. 5, p. 738-746. 2004. BRASIL. Ministrio da Sade, Estimativa 2010: Incidncia de Cncer no Brasil. Instituto Nacional do Cncer, Rio de Janeiro, RJ. 2009. CASSILETH, B. R.; DENG, G. Complementary and alternative therapies for cancer. The oncologist, New York, v. 9, n. 1, p. 8089. 2004. CORRA, M. P. Dicionrio de Plantas teis do Brasil e das Exticas Cultivadas. vol. 63. Rio de Janeiro: Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 1994. DATTA, R. et al. Phorbol ester-induced generation of reactive oxigen species is protein kinase C- dependent and required for SAPK activation. J. Biol. Chem., v. 275, n. 52, p. 410-413. 1999. FURSTENBERGER G. On the active principles of the spurge family (Euphorbiaceae). The skin irritant and tumor promoting diterpenes esters of Euphobia tirucalli L. originaing from South Africa. Z. Naturforsch C, v. 40, n. 9-10, p. 631-646. 1985. GARCIA, S. et al. Physical chemical and citotoxic evaluation of highly diluted solutions of Euphorbia tirucalli L. prepared through the fifty milesimal homeopathic method. Int. J. High Dilution Res., v. 9, p. 63-73. 2010. HECKER,E. Co-carcinogenic principles from seed oil of Croton tiglium and other Euphorbiaceae. Cancer Research, v. 28, p. 23382349. 1968. Heddle JA, Salamone MF. The micronucleus assay in vivo. In: Stich H, San RHC. Proceddings of the International Workshop on Short-Term Tests for Chemical Carcinogens. New York: Springer-Verlag, 1981, 243-249. KIUCHI, F. et al. Monoterpene hydroperoxides with trypanocidal activity from Chenopodium ambrosioides. Journal of Natural Products, v. 65, p. 509512. 2002. KOJIMA, N. et al. Synthesis of C4-fluorinated solamins and their growth inhibitory activity against human cancer cell lines. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, v. 18, p. 64516453. 2008.
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Referncias
LIRIO, L. G.; HERMANO, M. L.; FONTANILLA, M. Q. Antibacterial activity of medicinal plants from the Philippines. Pharmaceutical Biology, v. 36, n. 5, p. 357-359. 1998. MAREGESI, S. et al. Screening of Tanzanian medicinal plants against Plasmodium falciparum and human immunodeficiency virus. Planta Med., v. 76, p. 195-201. 2010. MWINE, J.; DAMME, P. van; JUMBA, F. Evaluation of larvicidal properties of the latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) against larvae of Anopheles mosquitoes. Journal of Medicinal Plants Research, v. 4, n. 19, p. 1954-1959. 2010. NASCIMENTO, F. R. F. et al. Ascitic and solid Ehrlich tumor inhibition by Chenopodium ambrosioides L. treatment. Life Science, v. 78, n. 22, p. 2650-2653. 2006. NETO, J. X. A. et al. Avaliao do efeito mutagnico da palma forrageira (Opuntia fcus-indica Mill) atravs do Teste de Microncleos em medula ssea de ratos (Rattus novergicus, linhagem Wistar) IN VIVO. Revista de Biologia e Cincias da Terra, UEPB, v. 5, n. 2, p. 1519-5228. 2005. PAREKH, J.; CHANDA, S. In vitro Antimicrobial Activity and Phytochemical Analysis of Some Indian Medicinal Plants. Turk Journal of Biology, v. 31, p. 53-58. 2006. RAHUMAN, A. A. Larvicidal activity of some Euphorbiaceae plant extracts against Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Parasitol. Res., v. 102, p. 867-873. 2008. RAMOS, M. V. et al. Potential of laticifer fluids for inhibiting Aedes aegypti larval development: evidence for the involvement of proteolytic activity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ, v. 104, n. 6, p. 805-812. 2009. RIETJENS, I. M. C. M. et al. Flavonoids and akenylbenzenes: mechanisms of mutagenic action and carcinogenic risk. Mutation Res., v. 574, p. 124-38. 2005.
SIGIURA, M. Cryptic dysfunction of cellular immunity in asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) carriers and its actualization by an environmental immunosuppressive factor. In vivo, v. 8, n. 6, p. 1019-1022. 1994.
TIWARI, S.; SINGH, A. Alterations in carbohydrates and the protein metabolism of the harmful freshwater vector snail Lymnaea acuminata induced by the Euphorbia tirucalli latex extract. Environ Res., v. 99, p. 378-386. 2005. VARRICCHIO, M. C. B. N. Estudos integrados: biotecnologia, toxicologia, metablitos especiais e atividade antitumoral de Euphorbia tirucalli L. Dissertao (Mestrado em Biotecnologia Vegetal) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2005. YADAV, R et al. Larvicidal activity of latex and stem bark of Euphorbia tirucalli plant on the mosquito culex quinquefasciatus. J. Comm. Dis., v. 34, p. 264-269. 2002.
WADA, R. et al. Dramatic Switching of Protein Kinase C Agonist/Antagonist Activity by Modifying the 12-ester side chain of Phorbol Esters. Journal of American Chemical Society, USA, v. 124, p. 1065810659. 2002.
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Consumo de rao (g)

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Ganho de peso (g)

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