Catlise Enzimtica

A ao da enzima
Substrato S Estado de Transio T Produtos P

Se a enzima apenas se ligasse ao substrato, no haveria reao.

A enzima reconhece o substrato mas tambm Induz uma deformao que leva S ao estado de transio

Ao das Enzimas A Enzima fornece uma superfcie cataltica Esta superfcie estabiliza o estado de transio E transforma o estado de transio em produto.

B A A B
Superfcie Cataltica

A Enzima estabiliza o Estado de Transio

Variao Energia

ST
Energia requerida com catlise

T = Estado de Transio

CoE (1) (4)

Energia requerida sem catlise

S ES

EST

EP
Direo da Reao

Qual a diferena?

O Stio Ativo um bolso na Enzima

Por que a energia requerida para S alcanar T menor no stio ativo da enzima?

um bolso mgico

+
(2)

(3)

(1) Estabiliza Transio (2) Expulsa a gua (3) Tem grupos reativos (4) Auxlio Co-Enzima

O stio ativo evita a influncia da gua

+ -

Na ausncia de gua, possvel interaes inicas mais eficazes

80 60

[Produto]

40 20 0

Tempo (min)

Cintica Enzimtica
Atividade da Enzima Atividade da Enzima

Enzima A

Enzima B

1 2 3 [Substrato]

2 3 4 [Substrato]

Aumentando-se a concentrao de S percebemos uma mudana na atividade cataltica da enzima

Essencial da Cintica Enzimtica

Teoria do Estado Estacionrio

E +S

ES

E +P

A produo e consumo do estado de transio ocorrem na mesma velocidade. Portanto, a concentrao do estado de transio constante.

[ES] = constante S
Concentrao

ES
Tempo de Reao

Modelo de Michaelis e Menten: Equilbrio e estado estacionrio

k Km = 1 k 1

VO =

Vmax [S ] [S ] + K m

Modelo de Michaelis e Menten: Linearizao de Lineweaver-Burk

Km 1 1 1 = + VO Vmax Vmax [S ]
1/Vo

-1/Km

1/[S], M -1

Invertase (IT) IT

Sacarose
HOCH2 O
1 2

Glucose + Frutose
HOCH2 6 O
5 4 3 1 2 OH

HOCH2 HOCH2 O OH HO H2O

HOCH2 HOCH2 6 1 O
5

1 2 3 4 5 6

2 3 OH

CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

H2C-OH C=O HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

HOCH2 O

HOCH2 HOCH2 O O

Um exemplo com a Invertase

1) Use quantidade conhecida de Enzima E 2) Adicione vrias concentraes de substrato S 3) [produto] em funo do tempo reao (P/t) vo Vmax 4) (1/Vo vs 1/S) pelo grfico, estime o valor 5) Quando y = 1/2 Vmax calcule no x ([S]) Km 1 vo
-1 Km 1 Vmax

Vmax vo 1/2

1/S

Km

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Um Exemplo Real
Substrato Produto Velocidade Duplo Recproco

Dados

no

1 2 3 4

[S] Absorbncia v0 (mole/min) 0.25 0.21 0.42 0.50 0.36 0.72 1.0 0.40 0.80 2.0 0.46 0.92

1/S 4 2 1 0.5

1/v0 2.08 1.56 1.35 1.16

(1) O Produto foi medido por espectroscopia a 600 nm (2) Tempo de reao era de 10 minutos

Duplo Recproco

Grfico direto

1.0 v 0.5

2.0 1/v 1.0

1.0 -3.8
-2 0 2 4

[S]

-4

1/[S]

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Cintica Enzimtica
kcat /Km kcat
Nmero de Turn-Over

V [S] vo= max Km + [S]

Direto:

significado

Ordem zero 1a ordem Observe a variao de v a vrias [S]. Os resultados plotados Fornecem Vmax e Km E3 E2 E1

k3 [Et]
Atividade

Vmax

&

Km
Competitivo

1 mole min
Atividade Especfica

Velocidade Afinidade com Duplo recproco Mxima substrato Inibio

No competitivo

unit mg

Incompetitivo

Os Significados dos Parmetros

Obter

Vmax e Km

Vmax [S] vo = Km + [S]

Ordem zero

Proporcional a [Enzima]

1a Ordem [S] = Baixa Alta [S] = Fixa

E3 E2 E1

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Km: Afinidade com Substrato

vo =

Vmax [S] Km + [S]

Se vo=

Vmax 2

Quando usa-se diferentes S

Vmax S1
1/2

S2 S3

Vmax Vmax [S] = 2 Km + [S] Km + [S] = 2 [S]

S1 S2 S3

Km

Afinidade muda

Km = [S]

Exemplo de Km: Hexokinase

Glucose + ATP Glc-6-P + ADP

Glucose
1 2 3 4 5 6 CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Substrato

Allose

Mannose
CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH

Km =

8000

5 M

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Nmero de Turn Over, kcat

E+S

k1 k2

ES (v ) E + P
o

k3

Quando S em excesso, k3 = kcat, turn over number (t.o.n) Quando [substrato] baixa (IV)
Segunda Ordem

k3 Vmax [S] k3 [E][S] [E][S] vo = = = Km + [S] Km + [S] Km

Omitimos o S Afinidade

Turn Over Numbers para Enzimas

Enzimas Catalase Carbonic anidrase Acetilcolinesterase -Lactamase Fumarase RecA proteina (ATPase) Substrato
H2O2 HCO3Acetylcoline Benzylpenicillina Fumarate ATP

kcat (s-1) 40,000,000 400,000 140,000 2,000 800 0.4

Nmero de molculas no estado de transio convertidas a produto por uma enzima em um segundo.

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Chimotripsin e diferentes kcat /Km para diferentes Substratos

O R O H3CCNCCOCH3 H H

R= Glicina Norvalina Norleucina Fenilalanina H CH2CH2CH3 CH2CH2CH2CH3 CH2

kcat / Km
1.3 10-1 3.6 102 3.0 103 1.0 105 (M-1 s-1)

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CINTICA DE REAES ENZIMTICAS

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Catlise Enzimtica -Objetivos

Objetivo:
Estudar reaes catalisadas por enzimas. Usar espectofotmetro para acompanhar um processo cintico.

Catlise Enzimtica - Introduo

Introduo

Enzimas so protenas que catalisam reaes, aumenta 107 a 108 vezes.

catalase

2 H2O2 (aq)

2H2O (liq)

O2 (g)

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Catlise Enzimtica - Introduo

Centro ativo A regio da molcula onde a enzima e o substrato interagem Conformao bem prxima do estado de transio da reao Reduo da Ea Especificidade da enzima Substrato especfico ou muito semelhante Encaixe chave e fechadura.

Catlise Enzimtica - Introduo

Cintica
OH OH + 1 O2 2 Enzima O O + H2O

Abs
0 0 0 0 0 0 0

Vo Vmax

A = V o t

t tempo

Vmax 2

Km

[S]

Mecanismo de Michaelis-Menten

Vmax [S ] [S ] + K m Vmax= velocidade inicial mxima se independente da [S]. Km =constante de Michaelis-Menten. VO =

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Catlise Enzimtica - Introduo

Determinao experimental Vmax e Km Lineweaver e Burk

1/Vo

-1/Km

1/[S], M -1

K 1 1 1 = + m VO Vmax Vmax [S ]
Coeficiente: Angular Km/Vmax Linear 1/Vmax

Catlise Enzimtica -Experimenjtal

Experimento
1-Extrao da enzima
Polifenoloxidase
Batata

2-Mistura dos reagentes

OH OH + 1 O2 2 Enzima O O + H2O

3- Abs x tempo

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Catlise Enzimtica -Experimental

Abs
0 0 0 0 0 0 0

OH OH
1 + 2 O2

O O Enzima + H2O

A = V o t
Vo1 Vo2 Vo3

t tempo

0
UV, variando a [S]

Acompanhamento da oxidao do catecol com o tempo por

Cada [S] apresenta um grfico Abs x t com respectiva Vo

Catlise Enzimtica -Experimental

Lineweaver e Burk
1/Vo

-1/Km

1/[S], M -1

y = A + Bx
K 1 1 1 = + m VO Vmax Vmax [S ]

Determinao de Vmax e Km

20

21

Tempo (s)

Absorbncia 1a corrida

Absorbncia 2a corrida

Absorbncia 3a corrida

Absorbncia 4a corrida

0,160 0,166 0,171 0,176 0,182 0,187 0,191 0,193 0,198 0,202 0,207 0,213 0,218 0,223 0,228 0,232 0,236 0,241 0,245 0,248 0,251 0,254 0,258 0,262 0,266 0,269 0,272 0,275 0,279 0,282 0,283

0,186 0,197 0,207 0,217 0,228 0,236 0,243 0,250 0,256 0,264 0,273 0,281 0,290 0,298 0,304 0,310 0,316 0,323 0,332 0,340 0,348 0,354 0,360 0,366 0,372 0,379 0,385 0,391 0,395 0,400 0,405

0,149 0,166 0,180 0,194 0,203 0,209 0,216 0,223 0,231 0,239 0,248 0,258 0,270 0,284 0,297 0,307 0,318 0,328 0,336 0,344 0,353 0,361 0,370 0,377 0,384 0,388 0,392 0,395 0,401 0,408 0,415

0,102 0,125 0,142 0,155 0,167 0,181 0,195 0,207 0,219 0,231 0,242 0,255 0,269 0,283 0,294 0,305 0,316 0,326 0,336 0,346 0,355 0,364 0,371 0,378 0,386 0,392 0,398 0,405 0,411 0,418 0,423

[catecol] Corrida #1 [S]=1,7 mmol.L-1 Corrida #2 [S]=2,5 mmol.L-1 Corrida #3 [S]=3,3 mmol.L-1 Corrida #4 [S]=5,0 mmol.L-1

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

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