UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CINCIAS AGRRIAS CURSO DE AGRONOMIA DISCIPLINA: BIOTECNOLOGIA

MARCADORES GENTICOS1, Marcador gentico uma caracterstica que capaz de detectar diferenas entre dois ou mais indivduos ou organismos. Entre suas propriedades um marcador gentico: (i) deve ser capaz de diferenciar os progenitores (ii) deve ser reproduzido com preciso na prognie. Do ponto de vista molecular, um marcador gentico (ou loco marcador) serve para identificar um local ou uma regio de um cromossomo. Um marcador gentico ideal deve apresentar uma srie de atributos: (i) alto nvel de polimorfismo (ii) estabilidade em diferentes ambientes, (iii) detectar grande nmero de locos no ligados (iv) de herana simples. Entretanto, a simplicidade e os baixos custos do mtodo so fatores determinantes no uso de forma rotineira de um marcador molecular. Aqui ser apresentada uma descrio resumida dos principais tipos de marcadores genticos bem como suas principais aplicaes no melhoramento de plantas. M arcador m olecular - todo e qualquer fentipo molecular proveniente de um gene expresso, como no caso de isoenzimas , ou de um segmento especfico de DNA (correspondendo a regies expressas ou no do genoma). PRINCIPAIS TIPOS DE MARCADORES: 1) MARCADORES MORFOLGICOS At os meados da dcada de 60, os marcadores utilizados em estudos de gentica e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres morfolgicos, Em geral, caractersticas fenotpicas de variao discreta so utilizadas como marcadores morfolgicos desde os tempos de Mendel, como fentipos de fcil identificao visual, ex.: nanismo, deficincia cloroftica, cor de ptala ou morfologia foliar. Um nmero varivel de marcadores morfolgicos existem para as diferentes espcies de plantas, contudo insuficientes para mapeamento gentico ou outras aplicaes. Alm disso, esses marcadores freqentemente so afetados pela ao gnica de dominncia, efeito ambiental, pleiotropia e epistasia. O reduzido nmero e a natureza dos marcadores morfolgicos restringiram os estudos dos caracteres quantitativos (QTs) s espcies onde havia sido alcanada uma caracterizao gentica substancial. Sax (1923) verificou em feijo que as diferenas nas mdias do peso de gros estavam associadas a cor das sementes. Foi a primeira tentativa de caracterizao individual dos locos (QTL) envolvidos na expresso de um carter quantitativo (QT) com auxlio de marcadores morfolgicos. Marcadores morfolgicos apresentam a desvantagem de serem somente identificados em sua maioria, ao nvel de planta inteira ou adulta. Por outro lado, marcadores bioqumicos ou fragmentos de DNA, podem ser utilizados a partir de amostras de clulas ou de tecidos de partes da planta (folhas, embries, cotildones, plen, etc.) e tambm em qualquer estgio de desenvolvimento da planta.
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Dra. Adriana Cibele de Mesquita Dantas, acmdantas@cca.ufsc.br Dr. Rubens Onofre Nodari, nodari@cca.ufsc.br

Entretanto, o princpio bsico envolvidos na obteno e deteco de cada classe de marcador bioqumico ou de DNA reside no uso de eletroforese.

ELETROFORESE O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migrao de colides sob a influncia de um campo eltrico. Seu princpio simples: molculas de carga negativa migram para o plo positivo, e molculas com carga positiva migram para o plo negativo. A eletroforese visa separao de molculas em funo de suas cargas eltricas, de seus pesos moleculares e de suas conformaes, em suportes porosos (gis) e solues tampes (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente eltrica). Ou seja, na prtica a eletroforese consiste da extrao de amostras, seja de protenas, enzimas ou DNA obtido de um tecido vegetal e da migrao destas num gel (amido; agarose, acrilamida) submetido a uma corrente eltrica contnua. O sentido e a velocidade de migrao determinado pelo tamanho e carga das protenas. Por exemplo, quanto maior a carga eltrica de uma protena, mais rpido a sua migrao no gel em direo ao eletrodo de carga contrria, como observado na figura abaixo.

A passagem de corrente eltrica atravs de uma soluo-tampo segue a Lei de Ohm: V = R. I V = voltagem R= resistncia I = amperagem A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem (corrente) ou, ento, wattagem (potncia) constantes reguladas pela fonte eltrica. bom observar que para cada tipo de marcador a ser utilizado diferencia grandemente na corrente eltrica a ser utilizada.

A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose e gis de agarose, de amido ou de poliacrilamida. Para enzimas, gis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separao do que outros suportes. Para marcadores DNA os mais utilizados so gis de agarose e poliacrilamida.

A
A) Cuba de eletroforese horizontal para gel de agarose B) Cuba de eletroforese vertical para gel de acrilamida 2) MARCADORES BIOQUMICOS:

2.1) Marcador de protenas de sementes As protenas das sementes podem ser classificadas de acordo com a sua solubilidade em quatro diferentes grupos. Numerosos mtodos tm sido utilizados in vitro para caracterizar as protenas de sementes. Polipeptdeos variantes que apresentam distintos pesos moleculares podem ser separados em gel de poliacrilamida atravs da eletroforese de duas dimenses (SDSPAGE) tem habilidade de separar protenas pelo ponto isoeltrico (carga) e pelo peso molecular (tamanho). Diferentes variantes aparecem como distintas bandas num gel. Embora o nmero de variantes de uma protena (polimorfismo) relativamente alto, o nmero de protenas de sementes que podem ser analisados baixo. Apesar da base gentica complexa (normalmente so famlias de genes) a interpretao relativamente simples (Observar foto abaixo, Guimares et al. 2002).

2.2) Isoenzimas Na dcada de 1960, um novo tipo de marcador gentico foi desenvolvido: as isoenzimas, ento denominados de marcadores bioqumicos. Isoenzimas foram definidas como diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou similar, presente num mesmo indivduo (Markert & Moller, 1959). o resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas. As vantagens sobre os marcadores morfolgicos so a insensibilidade pleiotropria e epistasia, as isoenzimas so marcadores co-dominantes. Desde a sua resoluo pelos mtodos histoqumicos, a principal aplicao das isoenzimas nos estudos de diversidade gentica e evoluo,o que tm sido extremamente importantes para as investigaes sobre variao intraespecfica, gentica de populaes, tambm na evoluo e mapeamento gentico, j realizadas em centenas de espcies. Apesar de estar sendo utilizada em vrios programas de melhoramento, o reduzido nmero de sistemas enzimticos polimrficos impe limitaes variveis dependendo do objetivo do estudo ou atividade. Comumente muitas enzimas existem em mltiplas formas moleculares, mas apresentando a mesma especificidade. O princpio bsico da tcnica reside no uso de eletroforese em gel de amido ou poliacrilamida e na visualizao do produto enzimtico por mtodos histoqumicos (Hunter e Market, 1957). As distintas bandas observada no gel, representam diferentes formas moleculares que apresentam diferentes propriedades de mobilidade eletrofortica. Subsequentemente, a posio de uma enzima no gel de amido pode ser verificada pela sua atividade que detectada por um sistema de revelao colorimtrica. Este sistema inclui reagentes especficos para revelar uma determinada enzima. A conseqncia o aparecimento de uma ou mais bandas no gel. Portanto, as distintas formas de uma mesma enzima, as isoenzimas, codificadas por diferentes alelos, podem ser detectadas em diferentes regies do gel, caso apresentem diferentes mobilidades eletroforticas. Com esta tcnica o estudo da variabilidade gentica de populaes de uma dada espcie ser baseada na variao observada nas isoenzimas. Cada banda revelada no gel se constitui num marcador gentico, j que por marcador gentico entende-se a constituio genotpica de um loco num determinado indivduo. As isoenzimas comearam a ser utilizadas como marcadores genticos somente a partir de 1966 (Lewontin & Hubby, 1966). 2.2.1) Vantagens das isoenzimas em relao aos marcadores morfolgicos: a) determinao genotpica dos locos em qualquer parte da planta, b) ocorrncia de um nmero razovel de alelos, c) ausncia de efeitos deletrios associados com alelos isoenzmicos, d) herana Mendeliana simples com codominncia entre alelos na maioria dos locos, e) ausncia de efeitos epistticos, pleiotrpicos e ambientais. 2.2.2) Aplicabilidade das isoenzimas: A propriedade mais expressiva a base gentica simples envolvida na expresso destas enzimas (Soltis & Soltis, 1989), o que torna a identificao de polimorfismos rpida e simples (Brewer, 1970). A maioria das enzimas j reveladas em gel de amido tem mais de uma isoenzima. Como conseqncia, um grande quantidade de sistemas isoenzimticos so potencialmente informativos. A eletroforese de enzimas tem proporcionado dados teis na abordagem de questes importantes em sistemtica e evoluo de plantas (Crawford, 1989; Doebley, 1989). Do ponto de vista da variao intraespecfica, as isoenzimas tm contribudo para o estudo da organizao da variabilidade gentica e a identificao de raas (Singh et al., 1991a; 1991b). Alm da caracterizao da diversidade gentica de populaes naturais e gentipos cultivados, as isoenzimas tm sido utilizadas com bastante freqncia em outros estudos.

Ligao gentica entre sistemas enzimticos ou destes com outros locos tem aumentado a resoluo de mapas genticos em vrias espcies como Capsicum annuum, Cicer arientinum, Lens culinaris, Phaseolus acutifolius e Pisum sativum (Tanksley, 1984; Gauer & Slinkard, 1990; Havey & Muehlbauer, 1989; Garvin et al., 1989; Weeden, 1985). As isoenzimas tambm tm sido utilizadas na identificao de genes que controlam caracteres quantitativos em feijo, milho, soja e tomate (Koenig & Gepts, 1989; Graef, 1989; Kahler & Wehrhahn, 1986; Tanksley et al., 1982; Weller et al., 1988). 2.2.3) Base gentica dos marcadores isoenzimticos A premissa bsica de se utilizar dados enzimticos que diferenas na mobilidade de isoenzimas em um campo eltrico so resultantes de diferenas ao nvel de sequencias de DNA que codificam tais enzimas. Assim, se os padres de bandas de dois indivduos diferem, assume-se que estas diferenas possuem base gentica e sejam herdveis. O controle gentico ds isoenzimas ocorre atravs de vrios genes, que podem ser alelos de um mesmo loco, ou estar situados em diferentes locos. Isoenzimas codificadas por genes allicos so tambm chamados de aloenzimas. A expresso das isoenzimas co-dominante, isto , em um indivduo diplide ambos os alelos de um loco so expresso e visualizados, ou seja, discrima o heterozigoto do homozigoto.

3) MARCADORES DNA 3.1) MARCADORES BASEADOS EM RESTRIO E HIBRIDAO DE SEQUNCIAS DE DNA 3.1.1) RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) As variaes nos nucleotdeos do DNA devido a mutao, deleo, insero e inverso, podem ser detectadas se ocorrerem num stio de corte das enzimas de restrio. Se o DNA de plantas diferindo num ou vrios desses nucleotdeos forem expostos essas enzimas, fragmentos de diferentes tamanhos, portanto polimrficos, so gerados e podem ser identificados e clonados. Tais fragmentos so denominados de RFLPs ('Restriction Fragment Length Polymorphims'; fragmentos polimrficos de DNA) e foram desenvolvidos por Botstein et al. (1980). Os polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrio ou polimorfismo de tamanho de fragmento so locos no DNA que podem ser identificados e mapeados. Os RFLPs tm sido suficientemente numerosos na maioria dos cruzamentos e tm permitido uma cobertura adequada do genoma, proporcionando a construo de densos mapas genticos de ligao, que possibilitam a realizao de anlises genticas e moleculares e vrias aplicaes no melhoramento de plantas, como clonagem de genes e mapeamento de QTLs (Nodari et al., 1993). O elevado custo e o tempo necessrio na gerao destes marcadores restringem drasticamente seu uso de forma freqente, principalmente em pases como o Brasil. A obteno de RFLPs envolve vrias etapas. Em primeiro lugar preciso extrair e purificar o DNA de um indivduo. Aps, este DNA deve ser digerido (cortado) por enzimas de restrio (ER) que so capazes de reconhecer um pequena seqncia de pares de bases (pb) e ento cortar o DNA neste stio de reconhecimento ou clivagem. Entretanto, a maioria das plantas contm mais de um bilho de pb. Como conseqncia, a digesto do DNA de uma planta com apenas uma ER produz milhares de fragmentos que variam em comprimento de acordo com a distribuio dos stios de clivagem. Tal quantidade impossibilita a anlise de todos de um s vez. Contudo esta tcnica permite a individualizao desses fragmentos. A terceira etapa do processo consiste em separar esta mistura de fragmentos de diferentes comprimentos pela eletroforese em gel de agarose. A migrao dos fragmentos de DNA num gel dependente do seu tamanho, migrando mais rapidamente, os menores. Subseqentemente, os fragmentos de DNA na condio de fita simples (aps tratamento com hidrxido de sdio), so transferidos para uma membrana de nylon ou celulose (carregada positivamente), tcnica que denominada de Southern blot, e que proporciona um suporte slido para o DNA que passa a ser imobilizado neste suporte. Agora possvel analisar individualmente cada um destes fragmentos. A prxima etapa do RFLP a hibridizao do DNA destas plantas j imobilizados em membranas com uma sonda (ou probe)(que pode ser um fragmento de DNA da prpria planta, um clone) radioativa de DNA complementar ao fragmento de interesse. Para que haja hibridizao, h a necessidade que pelo menos parte da sonda seja complementar ao fragmento de interesse. Existem outras alternativas de marcao de sondas que no a radioativa. A ltima etapa, a autoradiografia, consiste da exposio da membrana hibridizada com a sonda radioativa a um filme de Raio X, que queimado somente onde houve as hibridizaes. A sonda sendo radioativa, emite radiao que pode ser detectada por filmes de Raio X. J que a sonda s hibridiza com fragmentos complementares, a preciso elevadssima. Portanto, as cpias nicas (genes) normalmente aparecem uma vez s no genoma, e portanto apenas uma banda pode ser detectada nos indivduos homozigotos. Assim, a associao enzima de restrio e sonda identificam um loco RFLP, que tem herana mendeliana. Admitindo-se que duas plantas diferem em um stio de reconhecimento, apresentaro fragmentos de diferentes comprimentos, com relao a uma sonda complementar. Tais fragmentos localizam-se em diferentes posies na membrana. Consequentemente, apresentaro bandas ocupando diferentes posies no filme, indicando a existncia do polimorfismo ao nvel de DNA, portanto genotpico. Os fragmentos de diferentes tamanhos, so denominados de alelos, e apresentam herana mendeliana. A principal caracterstica da tcnica do RFLP a sua habilidade em detectar tais diferenas.

As seqncias genmicas de duas plantas de uma mesma espcie so muito parecidas. Entretanto, as plantas sofrem freqentes alteraes a nvel de DNA: mutaes simples, rearranjamentos e recombinao; as quais podem ocasionalmente alterar a seqncia ou substituir bases nitrogenadas em um ou mais stios de reconhecimento de uma determinada ER. Numa populao, estas variaes podem ocorrer numa planta e no em outra. Tais diferenas (que normalmente so denominadas de variao gentica) produzem fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (polimorfismo de comprimento de fragmento) quando o DNA exposto a estas enzimas. Os RFLPs mais informativos so aqueles cuja seqncia ocorre somente uma vez no genoma, denominados de cpia nica (single copy). Desta forma, os RFLPs so especficos. Os RFLPs nucleares exibem codominncia, ou seja, possvel distinguir os homozigotos entre si e estes do heterozigoto. Pleiotropia e epistasia que afetam a resoluo dos marcadores morfolgicos, no tm o menor efeito sobre os RFLPs. Alm disso, os RFLPs apresentam alta estabilidade. O DNA a ser analisado pode ser extrado de qualquer parte da planta. Outra caracterstica fundamental a de que a herdabilidade deste tipo de marcadores virtualmente 1. Isto possibilita a realizao da seleo indireta, cuja teoria foi desenvolvida h bastante tempo, mas sua implementao no existiu por falta de marcadores com as caractersticas dos RFLPs. Por sua segura informao genotpica e ocorrncia em grande nmero, estes marcadores possibilitam o desenvolvimento de mapas gentico de ligao altamente saturados. Estes, so a ferramenta bsica para estudos de gentica, evoluo e melhoramento de plantas. Especificamente no melhoramento de plantas os RFLPs tm muitas aplicaes. Em primeiro lugar, o desenvolvimento de mapas de ligao, altamente saturados com marcadores. Estes mapas, servem de base para o mapeamento de outras caractersticas de importncia agronmica, principalmente as de natureza quantitativa e governada por muitos genes. Desta forma possvel verificar as associaes (ligaes genticas) entre os marcadores moleculares e os genes que afetam um carter quantitativo. Quando isto est estabelecido, o critrio de seleo agora pode ser um ou vrios RFLPs e no mais o fentipo, j que selecionando-se um RFLP, teoricamente seleciona-se os genes prximos a este RFLP. Assim possvel se fazer uma seleo genotpica ao invs de seleo fenotpica, que muito menos eficiente. A seleo indireta faz sentido mesmo para um carter qualitativo, quando este muito caro ou difcil para ser avaliado, como o caso de resistncia a nematides ou produo de uma determinada protena ou substncia de interesse industrial ou farmacolgico. Os RFLPs ainda tm outras utilidades como a identificao de germoplasma, a identificao de variedades, o controle de qualidade na produo de sementes hbridas, a caracterizao gentica de populaes, o monitoramento nos retrocruzamentos e auxlio na identificao e clonagem de genes, entre outras. 3.1.2) Minissatlites Os minissatlites ou locos VNTR ('Variable Number of Tandem Repeats') so regies dispersas no genoma que contm um nmero varivel de seqncias repetidas e enfileiradas (tandem) de DNA que tm um ncleo comum de 10 a 15 pares de bases (Jeffreys et al., 1985). Podem ser analisados tanto atravs de RFLPs ou PCR. Muitos dos minissatlites so altamente polimrficos, produzindo um grande nmero de bandas. Por estarem espalhadas por todo o genoma e apresentarem um nmero varivel de repeties em diferentes indivduos em relao a uma mesma regio cromossmica (loco), os minissatlites simultaneamente proporcionam um conjunto de marcadores genticos que se constitui no que tem sido denominado de impresses digitais de DNA, consequentemente, indivduo-especficos. Para a obteno do padro de bandas utiliza-se o mesmo procedimento utilizado para o RFLP, com exceo de que a sonda contendo repeties de sequncia conhecida.

3.2) MARCADORES BASEADOS EM PCR (polymerase chain reaction) 3.2.1) RAPDs (Randomly Amplified Polymorphic DNA) Na dcada de 80, surgiu um novo tipo de marcador molecular denominado de RAPDs ('Randomly Amplified Polymorphic DNA'; DNA polimrfico amplificado; Welsh & McClelland, 1990; Williams et al., 1990). O uso da reao da polimerizao em cadeia (PCR) proporciona a amplificao de um segmento de DNA, delimitado por dois iniciadores (ou primers), comumente com 10 pares de bases, que so complementares a dois stios de nucleotdeos, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distncia geralmente no superior a 4kb. Os produtos resultantes da amplificao podem ser visualizados como bandas em gis de agarose ou poliacrilamida. Diferenas ao nvel de DNA so inferidas pela presena ou ausncia de um determinado fragmento amplificado (banda no gel). Em relao aos RFLPs, os RAPDs so mais baratos, requerem pouco tempo e no necessitam de radioistopos. Nos ltimos anos, alguns mapas desenvolvidos com RFLPs e isoenzimas, se tornaram altamente saturados com RAPDs, como em soja, tomate, milho, feijo, ervilha, amendoim, Arabidopsis e em muitas outras espcies domesticadas ou no. Outros mapas foram desenvolvidos s com marcadores RAPDs. O princpio dos RAPDs est igualmente baseado na identificao de diferenas a nvel de DNA. Entretanto a metodologia totalmente diferente daquela dos RFLPs e se baseia na reao de polimerizao em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction). Esta reao foi concebida em 1983 por Kary Mullis (Prmio Nobel em 1993), publicada em 1985, mas utilizada de forma rotineira a partir de 1988 (Saiki et al., 1988). Esse mtodo tem a habilidade de amplificar um fragmento de DNA, normalmente de at 4.000pb, mas em condies especiais de at 30 kb). Para amplificar, o primer (ou iniciador) utilizado, que um oligonucleotdeo de aproximadamente 10 nucleotdeos, precisa anelar com seqncias complementares e invertidas com relao as duas fitas que foram previamente separadas pelo aumento da temperatura (9294?C). O anelamento entre os primers e as seqncias complementares efetuada a uma temperatura de 35 a 50?C. Uma Taq DNA polimerase estende (ou sintetiza) as cadeias originadas pelos primers, cuja temperatura tima de catlise de 72?C. Existem mquinas programveis de PCR, os termocicladores, capazes de modificar a temperatura rapidamente. Na realidade cada ciclo da PCR composto de trs etapas: a separao das fitas (92-94?C), o anelamento do primers com o DNA (35 a 50?C) e a extenso ou polimerizao da cadeia (72?C). Os tempos utilizados em cada fase so aproximadamente de 1 min, 1 min e 2 min, respectivamente. A rigor, uma vez atingida as temperaturas de cada fase, so necessrios poucos segundos para que a reao ocorra. E as mquinas de PCR tem a capacidade de alterar a temperatura de forma rpida e repetir o ciclo tantas vezes quantas ordenadas. O nmero de fragmentos amplificados duplica a cada ciclo. Sucessivos ciclos de separao, anelamento e de sntese produzem milhes de fragmentos virtualmente idnticos, em apenas algumas horas. Os produtos da PCR podem ser facilmente visualizados num gel de agarose. Esta visualizao possvel com auxlio do brometo de etila, que quando presente no gel, se interpe entre as duas fitas do DNA e se torna avermelhado com absoro da luz ultravioleta. Em plantas, os RAPDs tm facilitado a realizao de estudos em gentica e melhoramento, at ento, considerados inexequveis com as tcnicas tradicionais. Uma diferena entre duas plantas a nvel de DNA que ocorra na regio de anelamento do primer identificada pela ausncia da referida banda em uma delas e presena da banda na outra. No caso de indivduos heterozigotos, estes produzem as mesmas bandas que os homozigotos. De fato, os marcadores RAPDs so dominantes.

Padro de bandas polimorficas em marcador RAPD

3.2.2) Microssatlites Entre as diversas seqncias repetidas em tandem, algumas so simples, formadas por um ou poucos nucleotdeos. Tais repeties curtas em tandem (STR - 'Short Tandem Repeat') so denominadas de microssatlites. Microssatlites, ou STR ou SSRP ('Simple Sequence Repeat Polymorphisms') ou STMS ('Sequence Tagged Microsatellite Sites') so sequncias repetidas de um, dois, trs ou quatro nucleotdeos e que esto espalhadas pelo genoma de um indivduo. Em plantas uma das primeiras constataes foi feita por Nybom et al., (1992). So altamente polimrficos em plantas, animais e microorganismos. Em plantas seria mais fcil utilizar microssatlites GA (ou CT) e GT (ou CA), pois os AT, embora freqentes, causam problemas. Assim, cada regio genmica que contenha um determinado nmero de repeties de uma destas sequncias constitui-se num loco gentico, altamente varivel entre indivduos e multiallico, portanto, altamente informativo (Ferreira e Grattapaglia, 1995). Comparativamente aos RFLPs, os microssatlites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo ou informao. Entretanto, para o uso rotineiro dos microssatlites, h a necessidade de primeiro amplificar uma regio, posteriormente sequenci-la e em terceiro lugar, sintetizar os iniciadores especficos para cada loco. Uma vez feito isto, o loco marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espcie. Desta forma, existe um custo elevado e trabalho no incio, mas o custo subsequente baixo e a simplicidade a posteriori, muito grande. O mapeamento gentico e a caracterizao varietal para fins de proteo e de germoplasma para fins de conservao de vrias espcies est sendo feito com o uso dos marcadores microssatlites. Seu uso est associado principalmente caracterizao varietal para fins de proteo e de conservao germoplasma. Os microssatlites so altamente polimrficos em plantas, animais e microorganismos. Em plantas seria mais fcil utilizar microssatlites GA e GT, pois os AT, embora freqentes, causam problemas. A caracterizao gentica e mapeamento gentico do arroz e outras espcies est sendo feito com o uso dos marcadores microssatlites. Comparativamente aos RFLPs, os microssatlites proporcionam 3 a 4 vezes mais polimorfismo. Entretanto, para o uso rotineiro dos microssatlites, h a necessidade de primeiro amplificar uma regio, posteriormente sequenciar e em terceiro lugar, sintetizar os iniciadores (primers) especficos para cada loco. Uma vez feito isto, o loco marcador pode ser utilizado indefinidamente naquela espcie. Desta forma, existe um custo elevado e trabalho no incio, mas o custo subsequente baixo e a simplicidade a posteriori, muito grande.

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Os microssatlites j esto sendo utilizados em larga escala para as principais espcies de importncia agrcola e nas espcies modelos. Em breve, eles se tornaro os marcadores mais comuns nos laboratrios.

Analise em gel de microssatlites

M

homozigoto

heterozigoto

Revelao de microssatlites em gel de poliacrilamida 4% corado com nitrato de prata

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3.2.3) AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism ) Os polimorfismos de comprimento de fragmentos amplificados (AFLPs; Zabeau, 1993) resultante do uso combinado de enzimas de restrio e da reao da polimerizao em cadeia. Suas principais caractersticas so a alta especificidade e resoluo e poder de amostragem.
5------GAATTC --------TTAA-----3 3 ------CTTAAG---------AATT-----5

1
Digesto do DNA

EcoR I

Mse I

5------GAATTC --------TTAA-----3 3 ------CTTAAG---------AATT-----5

Ligao de adaptadores
EcoR I adaptador adaptador

AATTC --------T G---------AAT TTAA TA

Mse I adaptador adaptador

AATTC --------TTA

3
Pr- amplificao
EcoR I primer E-A EcoR primer -

TTAAG--------- AAT

AATTCA --------GTTA TTAAGT---------CAAT

Mse I primer M - C Mse

Amplificao Amplificao
EcoR I primer E- ACA EcoR I primer E-

AATTCAACA -----------GTGGTTA TTAAGTTGT------------ CACCAAT

Mse I primer M - CAC Mse primer -

Protocolos dos AFLP consta de quatro etapas: 1) digesto do DNA, 2) ligao dos adaptadores, 3) pr- amplificao, 4) amplificao. Etapa 1. O DNA e digerido por duas enzimas de restrio, uma que corta stios de seis pares de base (geralmente a EcoRI) e a outra que corta seqncias de 4 pares de bases (geralmente a MseI). Este processo de clivagem gera milhes de fragmentos de distintos tamanhos. O DNA utilizado deve ser de alta qualidade. De preferncia utilizar um protocolo ou etapa que inclua fenol. A qualidade do DNA a base de todo o processo. Etapa 2. O processo de ligao dos adaptadores envolve o uso de ligases que permite que os fragmentos de DNA que foram cortados se liguem a pequenos oligonucleotdeos de DNA de seqncia conhecida. Etapa 3. Subseqentemente feita a pr- amplificao, que consiste na amplificao dos fragmentos agora ligados aos adaptadores atravs da reao da polimerizao em cadeia com o uso de iniciadores, complementares aos adaptadores com uma base a mais. Isto importante, pois somente 25% dos fragmentos sero amplificados, caso contrrio todos os fragmentos cortados seriam amplificados e a resoluo no gel seria virtualmente impossvel. Neste ponto do protocolo importante verificar se a reao foi bem feita. Para tanto deve-se rodar um gel com parte da reao de amplificao. Dependendo do resultado se continua ou no o processo. Etapa 4. A amplificao final feita com uma pequena amostra da primeira amplificao. Neste caso so utilizados iniciadores que so compostos de todas as bases dos primers da primeira amplificao, mais duas a trs bases, dependendo do nvel de polimorfismo da espcie ou da populao. Caso isto no seja conhecido, h a necessidade de experimentar diferentes combinaes de iniciadores. Para os laboratrios que usam radioistopos, neste quarto passo tambm feita simultaneamente a marcao radioativa dos produtos da PCR, para posterior deteco em filme de raio X. Na realidade se marca s um dos iniciadores porque o sinal suficiente para deteco.

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3.2.4) SCARs (Sequence characterized amplified RAPD) As etapas principais no desenvolvimento de um SCAR so: 1) identificao de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks de DNA com fentipos contrastantes, 2) o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor (plasmideo), 3) sequenciamento do fragmento isolado, 4) desenho dos iniciadores de tamanho maior que os decmeros e 5) o teste final (Paran e Michelmore, 1993). Para a identificao de um iniciador que confere polimorfismo a dois bulks contrastantes, necessria a extrao de DNA de plantas da gerao F2. Posteriormente, estas plantas F2 ou a sua prognie (F2:3) so testadas com relao a uma caracterstica, resistncia a uma raa de uma doena por exemplo. Desta forma, as plantas F2 so agrupadas em duas classes fenotpicas ou alternativamente se for utilizado as plantas F em trs classes fenotpicas. 2:3 Misturando-se quantidades equimolares de DNA de seis plantas de mesmo fentipo (ex: resistncia), pode-se dizer que os seis gentipos tm uma seqncia de DNA em comum, que em relao ao gene que confere o referido fentipo e talvez um conjunto adicional de pares de bases. Da mesma forma se constri o outro bulk, com base no fentipo contrastante (susceptibilidade). Desta forma, os dois bulks s so diferentes, genotipicamente com relao a caracterstica analisada. Testando iniciadores que amplificam seqncia arbitrrias de DNA, por pura chance, possvel encontrar iniciadores de 10 pares de bases (decmeros) capazes de amplificar o DNA de um bulk e no o do outro. Quando se testa este iniciador em todos os DNAs das demais plantas F2 e a seqncia realmente est ligada, ou seja quando todas (ou a maioria) das plantas resistentes apresentam a banda e todas ou uma minoria das plantas susceptveis no apresentam a banda, conclui-se que o segmento amplificado est ligado ao gene de interesse. Pela quantidade de recombinao entre o local do anelamento do iniciador e o fentipo das plantas pode-se estimar a distncia entre o marcador e o gene de interesse. O Ideal que o marcador deve estar o mais prximo possvel do gene, para que possa ser utilizado como critrio de seleo. O segundo passo o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado em um vetor, geralmente um plasmdeo. Posteriormente, os plasmdeos contendo os fragmentos de DNA desejados so utilizados para transformar bactrias. Das colnias transformadas preciso separar as que contm o fragmento daquelas que no contm o fragmento de DNA desejado. Posteriormente deve se crescer as colnias selecionadas e extrair o DNA do plasmdeo. Como o DNA vai para sequenciamento, h a necessidade de alta pureza. Existem vrios mtodos e kits comerciais disponveis para clonar este fragmento. O melhor seria a purificao com cloreto de csio, mas o mtodo trabalhoso. Aps a obteno do DNA plasmidial, deve verificar se os plamdios contem o fragmento desejado. Ento digere-se com uma enzima de restrio capaz de cortar o plamdio em stios que flanqueiam o inserto. Corre-se um gel e verifica-se quais os plamdios com insertos. O terceiro passo o sequenciamento do fragmento isolado. O sequenciamento necessrio para se conhecer a seqncia do fragmento, ou seja, as bases que esto entre os iniciadores. De posse da seqncia, se desenha os iniciadores (quarto passo) com comprimento varivel entre 16 e 24 pares de bases. A idia de um iniciador mais comprido surgiu de clculos feitos sobre o comprimento mnimo de um iniciador capaz de amplificar uma seqncia nica num genoma da maioria das plantas. Desta forma, espera-se a presena de uma nica banda com o uso dos referidos iniciadores. Existem critrios que so levados em considerao no desenho de iniciadores: a incluso do decmero que originou a banda, uma percentagem mnima de 50% de C e G, tamanho mnimo que proporciona uma temperatura de anelamento maior que 56 C, a terminao em C ou G e a possibilidade de formao de estrutura secundrio (hairpin ou loopback). Existem programas de computador que auxiliam a tomada de deciso, j que proporcionam valiosas informaes comparativas a respeito de diferentes iniciadores que so gerados quando fornecido ao programa uma determinada seqncia de bases. Finalmente, de posse nos iniciadores, se fazem os testes incluindo-se tanto os bulks como tambm um certo nmero de amostras da populao F2 e de outras plantas da mesma espcie. Isto foi feito e se obteve um SCARs que ligado a um novo gene de resistncia a antracnose e pode ser utilizado em programa de melhoramento. Um trabalho cientfico est em fase final de elaborao e ser submetido para publicao em breve.

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4) Anlise comparativa entre os marcadores Atualmente, os RFLPs e os RAPDs apresentam o maior potencial de uso nos diversos tipos de estudos e aplicaes em plantas, se considerados os atributos de cada um deles. Esses dois tipos de marcadores genticos apresentam algumas semelhanas entre si com relao ao nvel de polimorfismo, distribuio ao acaso no genoma, estabilidade e elevado nmero. Entretanto, apesar do baixo nvel de informao, os RAPDs so mais eficientes no mapeamento gentico que os RFLPs, pelas seguintes razes: maior nmero de bandas por reao, menor quantidade de trabalho e menor quantidade e qualidade do DNA para as anlises. Na realidade, os RAPDs tm sido utilizados para alcanar uma maior saturao dos mapas de ligao previamente estabelecidos com isoenzimas e/ou RFLPs. No futuro, o emprego de microssatlites via PCR, poder se tornar igualmente eficiente (ou superior) aos RAPDs no mapeamento gentico e caracterizao de germoplasma. Entretanto um dos grandes atributos do AFLP sua capacida mutiplex , onde um grande nmero de locos pode ser amostrado em um nico gel de AFLP. (ver Figura 1 e Tabela 1).

Figura 1. Comparao de tcnicas de marcadores moleculares quanto ao contedo informativo. Foram considerados trs componentes que influenciam o contedo informativo mdio de cada tcnica: o nmero de locos amostrados por ensaio (capacidade multiplex): o nmero de alelos identificados por loco e a proporo de locos polimrficos observados em cada ensaio (SAT = minissatlite) 5) Aplicaes dos marcadores moleculares Na rea da sade, a tcnica da PCR est sendo utilizada intensamente (Vosberg, 1989). Uma das aplicaes na diagnose de doenas causada por vrus como Hepatite, AIDS, etc. Nestes casos, utiliza-se os primers que anelam a regies especficas do DNA do vrus causador da doena. Portanto, primers com sequncia conhecida e pr-estabelecida. Se houver amplificao de uma banda a partir do DNA de uma pessoa, porque existe DNA do vrus nas clulas humanas. Es te diagnstico, rpido e confivel, j est sendo feito em vrias cidades brasileiras. Existe um esforo integrado entre a Secretaria da Sade e a UFSC no desenvolvimento deste sistema aqui em Florianpolis. O mais fascinante, entretanto, a amplificao de DNA de espcies extintas fossilizadas ou conservadas na forma de mmia, o que denominado de DNA ancestral (ancient DNA). Atualmente possvel amplificar segmentos de DNA extrado de ossos e outros tecidos macios, o que tem permitido conhecer seqncias de DNA de vrios mamferos fsseis. Outra maneira de conhecer o DNA dos fsseis ou espcies extintas, seria a de decodificar o DNA extrado de insetos sugadores, embebidos em amber a milhes de anos atrs. Amber a designao dada a resina solidificada de rvores antigas e tem a capacidade de proteo contra gua e o ar. Tais insetos podem carregar nas estruturas que usam para sugar ou no aparelho digestivo, o sangue de animais. Estas descobertas auxiliaram a realizao do filme Jurassic Park. Em maio de 1995, do interior de uma abelha envolta de amber e que teria vivido h 20-25 milhes de anos atrs, foi isolada uma bactria que est se reproduzindo normalmente e de cujo

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DNA, foram amplificados vrios fragmentos via PCR. A sequncia destes fragmentos mostraram grande similaridades com o DNA da bactria Bacillus. Os marcadores moleculares esto facilitando a realizao de estudos de gentica, taxonomia e evoluo de plantas proporcionando um substancial avano no conhecimento cientfico. As principais implicaes deste avano no conhecimento se refletem no poder, preciso e rapidez na manipulao da variabilidade gentica. Assim o melhoramento de plantas pode se beneficiar de vrias maneiras atravs dos marcadores moleculares. 5.1.) Construo de mapas genticos - Em primeiro lugar o grande volume de marcadores disponveis possibilitam o desenvolvimento de densos mapas de ligao, uma ferramenta tanto para pesquisa bsica quanto aplicada. Os marcadores de DNA segregam em propores mendelianas e no interferem na segregao de outros genes. Quando em grande quantidade segregando num cruzamento, possvel a construo de um mapa gentico de ligao, cuja densidade depende da quantidade de marcadores. Mapas genticos de alta densidade eram praticamente utopia numa fase anterior ao desenvolvimento desses marcadores. Nos ltimos anos foram construdos mapas genticos de ligao das principais espcies vegetais cultivadas, de animais domesticados e de espcies utilizadas como modelo em laboratrio. Alm de mapas, os marcadores facilitam o mapeamento de genes especficos. cDNA uma molcula de DNA sintetizada a partir do mRNA. Portanto, o cDNA seria um gene (DNA) sem os introns. Quando o cDNA obtido de um mRNA de um gene conhecido, sabe-se a funo deste cDNA. O gene patatin foi mapeado numa extremidade do cromossomo 8 tanto em batata quanto em tomate (Ganal et al., 1991). Alm disso, uma outra regio contendo apenas a parte regulatria desse mesmo gene, foi localizada no cromossomo 3. Em tomate, as duas formas da enzima SOD, citoslica e cloroplstica, foram mapeadas nos cromossomos 1 e 11 respectivamente (Perl-Treves et al., 1990). 5.2) Caracterizao da variabilidade gentica - Entre 1966 e 1984 (18 anos) a eletroforese foi utilizada em 1111 espcies, para estudos de gentica e evoluo. De maneira geral, foram avaliados em mdia de 23 locos em mais de 200 indivduos. Uma vez caracterizado o germoplasma disponvel, o melhorista pode escolher genotipicamente os progenitores para um cruzamento tanto com o objetivo de maximizar a segregao de genes de importncia agronmica como restringir esta segregao a poucos genes. Alm da escolha dos progenitores, ser possvel identificar os recombinantes desejados. 5.3) Monitoramento - Monitorar a recuperao do genoma do pai doador nos retrocruzamentos (intra e interespecficos) atravs de marcadores especficos pode diminuir o tempo e a quantidade de trabalho necessrios para a introgresso de um ou poucos genes. A avaliao genotpica atravs de marcadores moleculares de 120 linhagens BCF6 de tomate, provenientes do cruzamento entre L. pennellii e L. esculentum e retrocruzadas para o L. esculentum, foi verificado que 21 delas cobrem 95% do genoma da espcie L. pennellii. 5.4) "Fingerprinting" - Fingerprinting ou a caracterizao gentica de um gentipo outra aplicao dos marcadores moleculares. Isoladamente os mini ou microssatlites ou em conjunto com outros marcadores moleculares, podem ser utilizados para caracterizar e distinguir uma variedade de outra. Para a diferenciao varietal trs requisitos bsicos so essenciais: 1) distino - diferentes gentipos devem apresentar distintos padres de bandas; 2) uniformidade - o mesmo padro de bandas deve ser obtido se o procedimento for repetido e 3) estabilidade o padro de bandas no se altera mesmo que o gentipo for cultivado em diferentes ambientes. Dependendo da legislao brasileira de proteo s cultivares e regras de patenteamento a ser definida, as impresses digitais de DNA ('fingerprinting') podero ter grande utilidade. 5.5) Mapeamento gentico de QTLs - A maioria das caractersticas relacionadas com os processos de crescimento em plantas dependem da expresso de muitos genes. Historicamente, a biometria possibilitava a anlise em massa desses genes, sem a caracterizao da contribuio individual de cada um dos componentes do sistema. Com o advento dos mapas genticos de ligao, altamente saturados, foram criadas as condies para o estudo individualizado dos QTL (Quantitative Trait Loci), pois tais mapas proporcionam marcadores moleculares em todas as regies do genomas, em alguns casos espaados apenas de menos de 2 cM. Neste caso, a prognie oriunda do cruzamento entre plantas que diferem para um QT (Quantitative trait), so agrupadas com base num marcador molecular e ento estimada a mdia

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e varincia da caracterstica fenotpica das plantas de cada classe. Uma diferena significativa entre as mdias das classes, indica a relao entre o marcador e a caracterstica, mais especificamente, uma ligao entre o marcador de DNA e um dos alelos que afeta este carter. Vrios QTL relacionados com as caractersticas do fruto em tomate (Paterson et a., 1988, 1991) e com as interaes entre bactria e feijo comum (Nodari et al., 1993). No primeiro caso, foram identificados seis QTL afetando o tamanho do fruto e explicando 58% da variao fenotpica do carter. Alguns desses QTLs demonstraram efeito sobre o carter em dois ou mais ambientes e outros em apenas um s ambiente. Cinco QTLs associados com a tolerncia a baixo teor de fsforo foram identificados em milho com auxlio de um mapa de RFLP (Reiter et al., 1991). Todos os cinco QTLs apresentaram efeitos apenas aditivos. Entretanto, uma interao entre dois QTLs foi significativa. Alelos que contribuem para a tolerncia foram detectados em ambos os progenitores. O mapeamento de QTLs proporciona a identificao no s de alelos envolvidos na expresso do carter, mas o que mais importante, as possveis interaes entre os QTLs, proporcionado ao melhorista informaes que podem ser teis na escolha dos progenitores para a realizao dos cruzamentos. Proporciona ainda condies para o desenvolvimento de estoques genticos com diferentes composies genticas. Tais combinaes permitiro a comprovao dos efeitos individuais dos QTLs, anteriormente estimados. Existem programas que permitem determinar as distncias genticas entre marcadores como o caso do Linkage-1 (Suiter et al., 1983) e outros que facilitam a construo de mapas como o MAPMAKER (Lander et al., 1987). 5.6) Seleo assistida por marcadores (MAS) - A prtica da seleo indireta para caracteres de baixa herdabilidade poder ser intensamente explorada desde que os genes de interesse estejam fortemente ligados a marcadores moleculares. A seleo indireta e genotpica (marcador molecular como critrio de seleo), possibilita ainda a seleo de alelos com efeitos positivos provenientes dos dois ou mais progenitores envolvidos na gerao da populao segregante (Lande e Thompson, 1990). A ligao entre o alelo Aps1 da fosfatase cida e o gene Mi (distncia de 1cM) que codifica a resistncia ao nematide, tem possibilitado a seleo de plantas de tomate resistentes em populaes segregantes atravs da eletroforese desde 1974, quando foi iniciado por Charles Rick. O alelo Aps1 que est ligado do gene Mi que causa resistncia ao nematide em L. esculentum foi transferido do L. peruvianum atravs do sistema por retrocruzamento (mais de 30 retrocruzamentos para o L. esculentum). Um segundo exemplo relaciona-se com a incorporao de trs genes de resistncia ferrugem em feijo realizada por James Kelly, da Universidade de Michigan, utilizando marcadores RAPDs, altamente ligados aos 3 principais genes de resistncia (Kelly e Miklas, 1996). O procedimento 'Bulked Segregant Analysis' (Michelmore et al., 1991) em conjugao com a PCR uma alternativa eficiente de mapear genes especficos e selecionar indiretamente gentipos desejados. 5.7) Clonagem de genes de interesse agronmico - Em stimo lugar, os marcadores auxiliam na clonagem e transferncia de genes. Entre os mais freqentemente citados encontram-se os genes de resistncia a pragas e doenas. Entretanto, outros genes podem causar profundo impacto nos produtos finais das plantas. Trata-se dos genes que podem proporcionar s plantas o uso de rotas metablicas alternativas, resultando em produtos novos ou modificados, em muitos casos de alto valor econmico. Os genes j caracterizados pela gentica clssica, tm seu fentipo conhecido, m as normalmente seu produto desconhecido. Um marcador de DNA que est prximo de um desses genes, pode ser o ponto de partida para o sua identificao e clonagem. Uma das alternativas pela tcnica denominada de 'caminhar no cromossomo (chromosome walking). Esta tcnica compreende o isolamento de vrios clones com sobreposio parcial. O marcador de DNA utilizado inicialmente como sonda para identificar um desses clones. Pela sub-diviso desse clone identificado, possvel a identificao de um segundo clone, adjacente ao primeiro, e similar a este na regio de sobreposio. Este segundo clone ento utilizado como sonda para identificar um terceiro clone e assim por diante. Esta 'caminhada' pode eventualmente atingir o gene de interesse, que estaria contido num dos clones. Recentemente, vrios genes foram isolados com auxlio deste 'caminhar no cromossomo'. Entretanto esta tcnica difcil, cara e demorada. Ainda apresenta alguns problemas como seqncias repetidas de DNA que podem estar em um grande nmero de clones,

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impossibilitando a 'caminhada' na direo exata do gene de interesse. O outro problema, referese a grande distncia entre um marcador e o gene de interesse. Recentes avanos como a possibilidade de clonar fragmentos de grande tamanho (YAC; Yeast Artificial Chromosome) e de separar grandes molculas de DNA (PFGE; Pulse Field Gel Electrophoresis) facilitaro a clonagem de um gene a partir de um marcador molecular 5.8) Estudos de crescimento e desenvolvimento das plantas - O crescimento e o desenvolvimento das plantas esto sob o controle de muitos genes. Vrios desses genes j foram identificados, inicialmente atravs da gentica clssica e mais recentemente com auxlio da gentica molecular (Young, 1993). Exemplos: fitocromo e genes que afetam o padro de cor das plantas. O gene Phs responsvel pela produo da faseolina como a principal protena de reserva das sementes de feijo foi mapeado com auxlio de marcadores moleculares (Nodari et al., 1993). O gene nts (nodulao tolerante ao nitrato) foi mapeado com auxlio de marcadores moleculares numa populao F2 (10cM). 5.9) Modificaes na organizao do genoma - Existem amplas evidncias do surgimento de variantes durante a regenerao a partir de cultura de tecidos. Variao somaclonal que ocorre ao nvel do DNA, tanto nos stios de reconhecimento de uma enzima de restrio ou na regio de anelamento de um primer podem ser detectadas via RFLP ou RAPD, respectivamente. Variao no nmero de cpias tambm pode ser detectadas pela intensidade de hibridizao, via RFLP. Os RFLPs tambm tm potencial para detectar variao fenotpica decorrente de alteraes no padro de metilao, j verificado em milho (Phillips et al., 1991). Variao somaclonal em milho foi atribuda a variao ocorrida ao nvel do DNA (Brown et al., 1991).

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Tabela 1 - Anlise comparativa entre os marcadores moleculares Protenas Atributos Isoenzimas de sementes RFLPs Nvel de baixo alto baixo-alto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta ambiental Nmero de locos moderado (<50) baixo (<10) alto Expresso gentica co-dominate co-dominante co-dominante Nmero de alelos 2-5 multiallico multiallico por loco Distribuio no regies de cpia regies de cpia vrias genoma nica nica Acessibilidade muito alta muito alta mdia tecnolgica Aplicabilidade no rpido, rpido, lento, melhoramento baixo custo baixo custo custo mdio Identificao de baixa baixa gentipos Avaliao de mdia baixa germoplasma Mapeamento baixa muito baixa gentico Mapeamento de baixa inadequado regies especficas Mapeamento baixa inadequado comparativo Gentica de baixa baixa Autgamas Gentica de mdia baixa Algamas Anlise Filogentica mdia baixa Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995). alta alta alta mdia muito alta mdia mdia muito alta

RAPDs baixo-alto alta alto dominante 2 ao acaso muito alta rpido, baixo custo muito alta alta alta muito alta baixa alta alta mdia

Microssatlites muito alto alta alto co-dominante multiallico ao acaso muito baixa lento, custo alto

AFLPs muito alto alta alto dominante 2 ao acaso mdia rpido, custo baixo muito alta muito alta alta muito alta baixa muito alta muito alta mdia

muito alta alta muito alta mdia alta muito alta muito alta alta

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