Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection

Mestrado em Engenharia Biomdica: Especializao em EBTO Biosensores e Nanotecnologia 2 ano 1 semestre

Snia Vaz Ano lectivo 2012-2013

Mtodo de diagnstico in vitro

Especificidade e selectividade

Cancro, doenas cerebrais e cardiovasculares

Mtodo: Aptameros alinhados e conjugados a

nanotubos de carbono (ACNTs) Scanning probe microscopy (SPM)

Nanotubos de Carbono (CNT): Estrutura tridimensional fechada

Grafeno

Pequenos fragmentos de DNA ou RNA sintetizados quimicamente com afinidade para uma determinada molcula.

Caractersticas Elevada afinidade

Elevada selectividade
Reutilizvel Cadeia molecular simples

Pequenos fragmentos de DNA ou RNA sintetizados quimicamente com afinidade para uma determinada molcula.

Sondas de captura
Elevada sensibilidade de reconhecimento

Scanning Probe Microscopy (SPM)

Elevada resoluo espacial Traduo da interaco entre a ponta e a amostra em respostas mecnicas Vantagem: no necessrio marcar as biomolculas!

AFM

Atomic Force Microscopy

Fonte:http://www3.physik.uni-greifswald.de/method/afm/eafm.htm

Tapping mode (tmAFM) and Non-contact mode (KPFM) Sem contacto entre a ponta e a amostra

Adaptado de:Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Padronizao (de linhas com CNT) Substrato: silcio Deposio do catalisador (Fe) por deposio qumica por vapor (CVD) Crescimento do CNT a partir do catalisador
Linha recta =4,4nm

Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Funcionalizao 1. Adio grupos carboxilo 2. Soluo que activa grupo carboxilo 3. Adio do aptamero de DNA 5-amina-TTT TTT GGT TGG TGT GGT TGG-3

1.

2./3.
Trombina
Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Padronizao com CNT

Vantagens Rentvel Sem necessidade de processos de padronizao caros Requisitos Crescimento contnuo e em linha recta Dimetro uniforme

 = 4,4 1,5 Rugosidade <1nm

Adaptado de: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamerfunctionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Trombina marcada (fluorescente)

CNT

ACNT

4,41,5

2nm (rugosidade <1nm)

42,9mV
-142,5mV

Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

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ACNT tratado com trombina

Dobro da altura mdia

ACNT

2nm (rugosidade <1nm) -263,8mV

-142,5mV

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Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Quantificao das ligaes com medidas adimensionais

Altura - =

0 0 0 0

Potencial de superfcie - =

Limite sensibilidade altura=10 pM

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Sensibilidade de deteco de 1 pM
Sem marcadores nem amplificao do sinal

Considerar potencial de superfcie

Verificao da robustez bioensaio com antitrombina

Aplicao: Estudo da inibio de mecanismos por frmacos

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Magnitudes significativamente inferiores

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Diminuio dos spots fluorescentes

tmAFM

Quantificao adimensional
Ineficiente a concentraes da biomolcula inibitria >10pM

KPFM

Quantificao com concentraes mais elevadas da biomolcula inibitria

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Avaliao da robustez

Avaliao da robustez
Ocorrncia de fisissoro indesejvel?
Protenas testadas: HSA Fibrinognio Tranferrina
tmAFM
KPFM

Ausncia de fisissoro indesejada

Sensibilidade de deteco

Ressonncia de plasmon de superfcie 5nM Mtodo amperomtrico 10nM Microbalana de cristal de quartzo 0,1nM ACNT 1pM

Medio da morfologia de superfcie e o potencial de superfcie da trombina especificamente ligada ao ACNT

Condies do solvente (pH, [sal],)

Influencia ligao de afinidade

Efeito da [sal]

Influencia interaces electroestticas

Testou-se diferentes concentraes de sal

Diminuio do nmero de ligaes com o

aumento da [sal]

Tratar a amostra antes do diagnstico (eliminar ies de sal)

Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Condies do solvente (pH, [sal],)

Influencia ligao de afinidade

Efeito do pH Impacto na afinidade das ligaes

Testou-se solues com trombina a diferentes pH Mxima afinidade a pH=7,4

Mtodo criticamente dependente do pH do solvente

Fonte: Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM/c2jm33688j

Condies ptimas da soluo tampo para uma elevada sensibilidade [sal] = 0 M pH = 7,4

Prximo trabalho: usar amostra mais realista (ex: sangue) no bioensaio e ter em conta mtodos para controlar a [sal] e pH, com o intuito de melhorar sensibilidade de deteco

 Vantagens Sem necessidade de marcadores e/ou amplificaes de sinal Deteco mesmo em pequenas concentraes (1 pM) Ligaes especficas (sem fisissoro indesejvel) Caracterizao quantitativa de interaces/inibies biomoleculares A melhorar Testar amostras reais Processamento do amostra ([sal] e pH)

 Nam K., Eom K., Yang J., Park J., Lee G., Jang K., Lee H., Lee S. W., Yoon D. S., Lee C. Y. & Kwon T. (2012). Aptamer-functionalized nano-pattern based on carbon nanotube for sensitive, selective protein detection. Journal of Materials Chemistry. Disponvel em: http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/JM /c2jm33688j