Caracterização de Aeromonas Spp. Isoladas de Águas Não Tratadas para Consumo Humano

CARACTERIZAO DE AEROMONAS SPP.
ISOLADAS DE GUAS NO TRATADAS PARA CONSUMO HUMANO
Dissertao de Mestrado em Biologia Clnica Laboratorial
Maria Ermelinda de Aguiar Ribeiro
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Vila Real, 2008
Instituio Curso Titulo Autor Orientadores
Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Mestrado em Biologia Clnica Laboratorial Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo Humano Maria Ermelinda Aguiar Ribeiro Prof. Doutora Maria Jos Flix Saavedra Prof. Doutor Antnio Jos Martnez - Murcia
As Doutrinas espostas no presente trabalho so da exclusiva responsabilidade do autor
Este trabalho foi expressamente elaborado como dissertao original para o efeito de obteno do grau de Mestre em Biologia Clnica Laboratorial.
AGRADECIMENTOS
Ao Magnifico Reitor da Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro, Professor Doutor Armando Mascarenhas Ferreira, a minha especial gratido pela compreenso e condies proporcionadas, sem as quais no teria sido possvel a realizao deste trabalho. Professora Doutora Maria Jos Saavedra, o meu muito obrigada por se ter disponibilizado para a orientao cientfica deste trabalho, pelo apoio imprescindvel que sempre me dispensou, bem como pela amizade e compreenso manifestadas. Ao Professor Antnio Martnez-Murcia, Director do Laboratrio de I&D Molecular Diagnostic Center (MDC), Alicante, Espanha, o meu profundo reconhecimento por ter aceite a co-orientao deste trabalho, pela compreenso e incentivo demonstrado em todos os momentos e disponibilidade para realizao da sequenciao dos isolados bacterianos. s colegas de Mestrado, Dr. Anabela Borges e Dr.Carla Dias, pela amizade, cumplicidade demonstradas no decorrer do trabalho analtico, pelo apoio informtico, o meu mais sincero e reconhecido agradecimento. Ao Departamento de Cincias Veterinrias, pela disponibilizao dos meios necessrios para a realizao deste trabalho. Ao meu marido Jos Joo, que nos momentos mais difceis conseguiu sempre apoiar-me e incentivar-me mostrando uma total dedicao e disponibilidade, pelo que expresso a minha mais reconhecida gratido. Aos meus filhos, Joo e Ana Filipa, por todos os momentos que deixei de partilhar com eles. A todos, familiares, colegas e amigos, por todo o seu apoio demonstrado na realizao deste trabalho.
FINANCIAMENTOS
A realizao deste trabalho foi possvel mediante o apoio das seguintes entidades: CECAV- Centro de Estudos de Cincia Animal e Veterinria, Universidade de Trs-os Montes e Alto Douro.
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TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE
CONGRESSOS INTERNACIONAIS Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., and Martnez-Murcia A., 2008. Antimicrobial resistance patterns of Aeromonas spp. in drinking water from Portugal. Proceedings of the 9th International Symposium on Aeromonas and Plesiomonas, 10th _12th September, UTAD, Vila Real.
JORNADAS NACIONAIS Ribeiro E., Borges A., Santos D., Saavedra M.J., e Martnez-Murcia A., 2008. Perfil de resistncia a antibiticos de Aeromonas spp. isoladas de guas de consumo no tratadas em Portugal. Livro de resumos das 2asJornadas de Biologia, 7 e 8 de Outubro, UTAD, Vila Real.
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RESUMO ____________________________________________________________
O gnero Aeromonas forma uma unidade monofiltica dentro do sub-grupo gama -3 das Proteobactrias. Bactrias do grupo das Aeromonas surgem em diversos ambientes aquticos. Est tambm comprovada a presena de Aeromonas spp. em guas para consumo humano, tratadas e no tratadas. Os organismos deste grupo so frequentemente referidos como patognicos emergentes sendo pesquisados
obrigatriamente no Canad, Itlia e Holanda. Assim, pretende-se com este estudo, fazer uma avaliao da presena de organismos do gnero Aeromonas em guas no tratadas de fontes, poos e nascentes, para consumo humano em dois concelhos do Distrito de Vila Real. Pela sua importncia, diversidade gentica, e o seu nvel de resistncia a antibiticos foi o gnero seleccionado para a elaborao deste trabalho. A identificao das estirpes foi realizada por sequenciao dos genes 16S rRNA, gyrB, gyrA e rpoD. Foram obtidos um total de 34 isolados agrupados em sete espcies distintas A. hydrophila, A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veroni, A. bestiarum e A. encheleia e um grupo distinto dos actualmente identificados, que pela sua distncia filogentica poder corresponder a uma espcie ainda no descrita. Foi efectuada a determinao da susceptibilidade para um total de 27 antibiticos sendo utilizados -lactmicos como as penicilinas (aminopenicilinas), cefalosporinas (1, 2, 3 e 4 gerao), monobactmicos e carbapenemos. Adicionalmente outros antibiticos foram testados como: tetraciclinas, quinolonas, aminoglicosdeos, sulfamidas e cloranfenicol. Dos antibiogramas realizados verificou-se que todas as estirpes apresentaram multiresistncia. Para a amoxicilina e cefalotina obtiveram-se ndices de resistncia de 100%. Para o carbapenemo testado (imipenemo) 3% das estirpes apresentaram resistncia e 13% foram consideradas intermdias. Todas as estirpes foram sensveis para a piperaciclina/tazobactan, aminoglicosdeos, aztreonamo e tetraciclina.
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ABSTRACT ____________________________________________________________
The genus Aeromonas forms a monophyletic unit within the gamma-3 subgroup of the class Proteobacteria. Bacteria of Aeromonas spp. are widely spread in aquatic environments. They also occur in untreated and treated drinking water. Members of this genus are considered as emerging pathogens and have been the focus of studies in Canada, Italy and Holland. Thus, it is intended with this study, to evaluate the presence of organisms of the genus Aeromonas in untreated water sources, wells and springs, for human consumption in two counties of the District of Vila Real. The reason for the selection of this genus for study is its clear importance in terms of health, genetic diversity, and its level of resistance to antibiotics. The identification of strains was performed by sequencing of 16S rRNA, gyrB, rpoD and gyrA. A total of 34 isolates were obtained which were clustered into seven distinct species - A. hydrophila, A. eucrenophila, A. caviae, A. tecta, A. veronii, A. bestiarum and A. encheleia- and a distinct group not identified, which by their phylogenetic relationship may correspond to a new species of Aeromonas. The antibiotic susceptibilities of these species were determined using 27 antibiotics including -lactams such as penicillins
(aminopenicillins), cephalosporins (1st, 2nd, 3rd and 4 generation), monobactams and carbapenems. Additionally other classes of antibiotics were also tested e.g. tetracyclines, quinolones, aminoglycosides, sulphonamides and chloramphenicol. From antibiograms performed it was found that the strains showed multidrug-resistance. To amoxicillin and cephalothin rates of resistance were 100%. For the carbapenems tested (imipenem) 3% of the isolates showed resistance and 13% were considered as having intermediate resistance. All isolates were sensitive to piperaciclina/tazobactan, aminoglycosides, tetracycline and aztreonam.
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NDICE
AGRADECIMENTOS FINANCIAMENTOS TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE RESUMO ABSTRACT NDICE NDICE DE FIGURAS NDICE DE QUADROS NDICE DE TABELAS
v vi vii viii ix x xiii xiv xv
1. INTRODUO 1.1. A qualidade da gua para consumo 1.2. O gnero Aeromonas 1.2.1. Ecologia e Patogenicidade 1.2.2. Taxonomia e Filogenia 1.2.3. Mtodos de Identificao 1.2.3.1. Mtodos microbiolgicos convencionais 1.2.3.2. Mtodos genticos 1.2.3.3. Sequenciao do gene que codifica para o rRNA 16S 1.2.3.4. Sequenciao de genes Housekeeping 1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA 1.2.3.4.2. Gene rpoD 1.3. Agentes antimicrobianos 1.3.1. Principais mecanismos de resistncia 1.3.2. Antibiticos antiparietais 1.3.2.1. -lactmicos 1.3.3. Inibidores de -lactmicos
1 2 6 7 9 12 12 13 14 14 16 18 18 19 20 21 22
x
1.3.4. Antibiticos inibidores da sntese proteica 1.3.4.1. Aminoglicosdeos 1.3.4.2. Tetraciclinas 1.3.4.3. Cloranfenicol 1.3.4.4. Macrlidos 1.3.5. Antibiticos inibidores da sntese dos cidos nucleicos 1.3.5.1. Quinolonas 1.3.6. Antibiticos antimetabolitos 1.3.6.1. Sulfonamidas/Trimetropim 1.3.7. Antibioresistncia no gnero Aeromonas 2. OBJECTIVOS 3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Origem das amostras 3.1.1. Mtodo de recolha das amostras 3.1.2. Isolamento pela tcnica de filtrao por membrana 3.1.3. Conservao das estirpes 3.2. Caracterizao preliminar dos isolados 3.2.1. Colorao diferencial de Gram 3.2.2. Prova da citromo-oxidase 3.2.3. Prova da catalase 3.3. Identificao das estirpes bacterianas 3.3.1. Extraco de DNA de culturas puras 3.3.2. Amplificao de DNA por reaco de PCR 3.3.3. Purificao dos produtos de PCR 3.3.4. Sequenciao 3.3.5. Anlise de sequncias e construo dos dendogramas 3.4. Caracterizao bioqumica pelo API 20NE 3.5. Perfil de susceptibilidade a agentes antimicrobianos 4. RESULTADOS E DISCUSSO 4.1. Estirpes isoladas 4.2. Identificao por sequenciao de isolados bacterianos
23 23 24 24 25 25 26 26 26 27
31 32
33 34 34 35 35 35 36 36 37 37 38 38 39 41 41
42
44 45 47
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4.2.1. Identificao dos isolados por sequnciao do gene 16S rRNA 4.2.1. Identificao dos isolados bacterianos por sequnciao do gene gyrB 4.2.2. Identificao dos isolados bacterianos por sequnciao do gene gyrA 4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp. 4.4. Caracterizao fenotpica da estirpe MDC 2464 4.4.1. Mtodos bioqumicos 4.4.2. Sistema de biotipificao numrico API 20NE 4.5.Caracterizao bioqumica da espcie Aeromonas spp. 4.5.1. Sistema de biotipificao numrico API 20NE 4.6. Perfil de susceptibilidade a antibiticos 5. CONSIDERAES FINAIS 6. BIBLIOGRAFIA
47 48 52 53 55 55 55 57 57 59 66 68
ANEXOS AnexoI-Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por 16s RNA Anexo II-Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por gyrB, gyrA e rpoD
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NDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografia de microscopia electrnica de bacilos de Aeromonas hydrophila colonizando o tecido epitelial de intestino humano Figura 2 - Estrutura da DNA girase. Indicao das subunidades funcionais, GyrA e GyrB Figura 3 - Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos 7 17 19
Figura 4 - Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a regio do gene que foi amplificada e, em negrito, as posies do primer, e primeiro e ltimo nucletido amplificado segundo a numerao de E. coli (Huang, 1996) 49
Figura 5 - rvore filogentica baseada na sequncia do gene gyrB dos isolados obtidos neste trabalho 50
Figura 6 - rvore filogentica baseada na sequncia do gene rpoD. Est representada nesta figura a estirpe representativa do grupo Aeromonas spp. 54
Figura 7 - Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE do isolado F9 (MDC 2464)57
Figura 8 - Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE dos isolados F1BCa1 (MDC 2510) e F1BC1a2 58
Figura 9 - Perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos dos isolados de Aeromonas em estudo 59
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NDICE DE QUADROS
Quadro 1 - Estirpes actualmente aceite no gnero Aeromonas Quadro 2 - Tcnica de filtrao por membrana Quadro 3 - Procedimento de Colorao pelo mtodo de Gram Quadro 4 - Metodologia de execuo da prova da oxidase Quadro 5 - Metodologia de execuo da prova da catalase Quadro 6 - Metodologia de extraco do DNA de estirpes bacterianas Quadro 7 - Oligonucleotidos utilizados para reaco de PCR Quadro 8 - Protocolo de Purificao de produtos de PCR Quadro 9 - Oligonucleotidos utilizados em reaco de sequenciao Quadro 10 - Protocolo de precipitao dos produtos de sequenciao Quadro 11 - Procedimento para a realizao do sistema API 20 NE Quadro 12 - Tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos
11 32 35 35 36 37 38 39 40 40 41 43
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NDICE DAS TABELAS
Tabela 1 - Locais de amostragem e nmero de amostras Tabela 2 - Identificao da amostra, origem, localizao e referncia atribuda Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene 16s RNA Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene por gyrB Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene por gyrA Tabela 6 Perfil bioqumico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC2464 Tabela 7- Resistncia a mltiplos antibiticos das espcies de Aeromonas
33 46 47 51 53 56 63
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1. INTRODUO
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Introduo
1.1. Qualidade da gua para consumo

Desde a poca do Imprio Romano que se sabe que a gua um potencial transportador de doenas. O controlo microbiolgico das guas de consumo humano tem sido praticado desde o inicio do sculo XX. Sendo a gua um dos elementos essenciais para o Homem, necessrio que esta seja utilizada em condies de potabilidade. Em Portugal, cerca de 1 milho de pessoas no possui gua canalizada, recorrendo a gua de diversas origens, nomeadamente poos, minas, furos e fontes. Nestes casos, sobretudo no interior do pas, a contaminao representa um perigo para a sade pblica, nomeadamente no que se refere aos perigos microbiolgicos (Saavedra, 2000). De entre os microrganismos presentes na gua, destacam-se os de natureza exgena, como os oriundos de matria fecal humana e animal, tais como os coliformes totais, coliformes fecais e enterococos. Os coliformes pertencem famlia das Enterobacteriaceae e incluem vrios membros dos gneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Existem ainda os de natureza autctone, que englobam diversas espcies e fazem parte da microbiota natural da gua, entre elas as bactrias mveis dos gneros Aeromonas e Pseudomonas (Palumo et al., 1996). A Organizao Mundial de Sade refere a utilizao de microrganismos intestinais como indicadores de poluio fecal, sendo estes microrganismos universalmente aceites para a monitorizao e avaliao da qualidade microbiolgica da gua. A existncia de enteropatognicos em amostras de gua para consumo humano indica potencial contaminao, requerendo ateno imediata e alertam-nos para a necessidade do seu tratamento (OMS, 2003). Na Europa so vrias as directivas relativas a esta anlise, nomeadamente a directiva n 98/83/CE que refere os critrios e normas de qualidade da gua. Em Portugal, o Decreto-Lei n 306/2007, de 27 de Agosto, estabelece o regime da qualidade da gua destinada ao consumo humano, tendo por objectivo proteger a sade humana dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminao dessa gua e assegurar a
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Introduo
disponibilizao tendencialmente universal de gua salubre, limpa e desejavelmente equilibrada na sua composio. A qualidade da gua para consumo humano, estabelecida por parmetros microbiolgicos e baseada em valores paramtricos de microrganismos patognicos indicadores de poluio fecal, fixados nas partes I e II do decreto-lei. Nos pases em vias de desenvolvimento as condies socioeconmicas favorecem a incidncia e prevalncia de quadros diarreicos, pelo que a preocupao dos microbiologistas clnicos, incide essencialmente na identificao dos patognicos clssicos como a Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter e Yersinia (Payment et al., 1991; Lund, 1994; Asmat e Gires, 2002; Castro- Escarpulli et al., 2003; Schets et al., 2008). Actualmente E. coli utilizada como sendo a principal indicadora de monitorizao da poluio da gua potvel (OMS, 2003), sendo mesmo considerada um indicador superior (Edberg et al., 2000) e est associada a contaminao fecal recente (APHA, 2005). Cada vez mais existem estudos em que outros gneros so considerados como patognicos emergentes, e possveis de ser objecto de monitorizao (Asmat e Gires, 2002). Nos pases industrializados a circulao de muitos patognicos tem vindo progressivamente a diminuir nos ltimos anos, pelo contrrio, infeces causadas por patognicos emergentes (i) bacterianos como: Pseudomonas, Legionella, Arcobacter e Aeromonas; (ii) parasitas como: Cryptosporodium e Giardia; e (iii) vrus: norovrus, rotavrus, enterovrus, e astrovrus tm vindo a aumentar (Aulicino, et al., 2005; Sansebastiano et al., 2008; Schets et al., 2008). Alguns autores referem que se deveria considerar o gnero Aeromonas como um indicador na monitorizao do funcionamento do sistema de tratamento e potabilizao das guas (Szewezyk et al., 2000; Asmat e Gires, 2002). Assim, na Holanda, Itlia e Canad as autoridades de sude pblica, na sequncia do aumento do isolamento de Aeromonas spp. estabeleceram o valor mximo de 200 UFC/100ml em guas para consumo (Carnahan e Josephh, 2005). Em Itlia limites provisrios e cautelar foram estabelecidos em 1997 para guas minerais naturais na sua origem (10 UFC/100ml) e (100 UFC/100ml) depois de serem engarrafadas. Contudo o papel da gua de consumo nas infeces causadas por Aeromonas spp. ainda no est claro (Kirov 1997; Edberg et al., 2007). Fuzihara e colaboradores (1995)
Introduo
verificaram a ocorrncia de Aeromonas spp. em amostras de gua tratada e no tratada concluindo estes autores que o consumo dessas guas representam um risco para a sude dos consumidores. Estudos referem que a espcie de Aeromonas hydrophila tem maior prevalncia em guas no poludas, enquanto Aeromonas caviae est associada a guas com um elevado grau de poluio (Hanninen et al., 1995). A frequncia de outras fenoespcies deste gnero parece no estar relacionada com condies ambientais (Fiorentini et al., 1998). Em 1998, Borrel e colaboradores, isolaram Aeromonas de diferentes espcies em guas para consumo onde no foram detectados coliformes mostrando que no existe uma correlao com estes indicadores. O gnero Aeromonas foi reconhecido como um enteropatognico em humanos, e desde 1970 tem ocorrido um maior interesse na investigao do mesmo. Desde 1995 que este gnero foi indicado pela EPA (Environmental Protection Agency) como organismo patognico emergente (Merino et al., 1995), e a espcie Aeromonas hydrophila como indicadora desse organismo, tendo sido proposta a Candidata Lista dos Contaminantes nos Estados Unidos por esta agncia. A biodiversidade de habitats onde estes agentes patognicos tm sido isolados, e o crescente nmero de infeces associadas a este gnero nas ltimas dcadas tem despertado interesse na comunidade cientfica de forma a estabelecer o risco que este gnero representa para a sade pblica. Em 1954 na Jamaica, descrito o primeiro caso de infeco, miosite aguda, em humanos por Aeromonas (Hill et al., 1954), posteriormente numerosos casos de infeces foram publicadas (Von Graevenitz, 1968). As doenas infecciosas so um dos principais problemas que os pases em vias de desenvolvimento enfrentam. Estudos revelam que a gua desempenha um importante papel na transmisso do gnero Aeromonas para humanos e animais (Joseph e Martin-Carnahan, 2000; Crivelli et al., 2001; Figueras, 2005). importante saber que os isolados ambientais so potenciais patognicos para o ser humano, havendo subpopulaes ou subespcies de
Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano
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Aeromonas com maior virulncia e que representam um risco para a sade humana (Daily et al., 1981; Bin Kingombe et al., 1999; Figueras, 2005). Em humanos o quadro clnico mais comum est relacionado com gastroenterites ou com uma condio conhecida como a diarreia do viajante. Infeces gastrointestinais foram observadas em doentes immunodeprimidos, com doenas intestinais malignas, doenas hepatobiliares e baixa acidez gstrica aps a ingesto de alimentos e gua contaminada (Janda, 1991; Braddour, 1992, Harf-Monteil, 2008). Numerosos casos tm sido relatados descrevendo o isolamento de Aeromonas spp. em doentes com diarreia, mas o papel destas bactrias em processos de gastroenterite continua a ser controverso (Kirov,1993; Janda e Abbott, 1998, Von Gravaenitz, 2007) mesmo depois de serem isoladas em doentes saudveis (Janda, 2001; Albert et al., 2000; Tsai et al., 2006; Figueras, 2005). Em 1986, Holmberg e colaboradores num estudo que visava avaliarem aspectos clnicos e epidemiolgicos de gastroenterites associadas a Aeromonas spp. concluram que o consumo de gua no tratada constitui um factor de risco para o Homem. As trs espcies consideradas patognicas de maior importncia para o Homem so Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii (com 2 biotipos sobria e veronii), Aeromonas caviae, e constituem assim 85% de todos os isolados clnicos envolvidos em infeces gastrointestinais como tambm em infeces extra-intestinais (Janda, 1991; Braddour, 1992; Abbott, 1998; Janda e Abbott, 1998; Kirov, 2001; Figueras, 2005; Miana-Galbis et al., 2007;Von Gravaenitz, 2007). Em contrapartida, Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei e Aeromonas trota, so consideradas patognicos de menor relevncia (Sen e Rodgers, 2004; Donohue et al., 2007; Tena et al., 2008), mas tambm esto implicadas em doenas nos humanos. Segundo Edberg e colaboradores (2007) somente trs espcies A. hydrophila, A. caviae e A. veronii biovar sobria, so clnicamente importantes. Balotescu e colaboradores (2003) referem uma alta mortalidade por infeces de estirpes do gnero Aeromonas nomeadamente de certas fenoespcies (A. hydrophila e A. veronii) em pacientes imunocomprometidos. Para os microbiologistas essa alta
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taxa de mortalidade provavelmente devida ao pouco conhecimento no que respeita aos aspectos de antibioresistncia em estirpes de Aeromonas, pois tratamentos com antibiticos para bactrias que apresentam resistncia constitutiva levam a resultados sem sucesso, como tambm, a crescente tendncia de multiresistncia que as espcies de Aeromonas apresentam a alguns grupos de antibiticos (Levy et al., 2005). claramente necessrio, que intervenes preventivas e programas de monitorizao eficazes, relativamente a guas destinadas ao consumo humano, a actividades recreativas de lazer e qualidade ambiental, sejam aplicados (Sansebastiano et al., 2008), de modo a serem conhecidos outros bioindicadores assim como o seu potencial de resistncia.
1.2. O gnero Aeromonas

O termo Aeromonas, que deriva das palavras gregas aer que significa ar ou gs e monas que significa unidade, ou seja unidades produtoras de gs (MartinCarnahan e Joseph, 2005). Aeromonas um gnero da famlia Aeromonadaceae. Actualmente esta famlia inclui ainda os gneros Oceanimonas, Tolumonas, Oceanisphaera e Zobellella (Euzby, 2008). So organismos autctones do meio ambiente aqutico considerados patognicos no s para os peixes e anfibios, tendo actualmente uma importncia crescente em humanos. O gnero Aeromonas inclui um grupo de bactrias Gram negativo, anarobias facultativas, no esporuladas, normalmente oxidade e catalase positiva, capazes de degradar os nitratos a nitritos, fermentam a D-glucose como fonte principal de carbono e energia. Estes bacilos no so haloflicos e so resistentes ao agente vibriosttico O/129 (2,4-diamino-6,7-diisopropylpteridina) a concentraes de 10 e 150 g (MartinCarnahan e Joseph, 2005). Todas as espcies com excepo de Aeromonas salmonicida e Aeromonas media so mveis e geralmente movimentam-se por um flagelo polar (Figura 1). O tamanho varia de 0,3 a 1,0 m de dimetro e de 1,0 a 3,5 m de longitude. Podem aparecer como bacilos ou cocobacilos independentes, aos pares ou em cadeias curtas (Popoff, 1984), a sua temperatura mnima de crescimento de 4 C, a mxima de
Introduo
45C. O seu crescimento ptimo a 30 C. A sua tolerncia ao pH varia entre 4.5 a 9.0. Estas espcies produzem exoenximas como amilase, fosfolipase, protease e DNAse (Popoff, 1984; Kirov, 1997; Kirov et al 2004; Carnahan e Joseph, 2005).
Figura 1 Micrografa electrnica de bacilos de Aeromonas hydrophila colonizando o tejido epitelial intestinal humano (Northwest Fisheries science Center, NOAA).
1.2.1. Ecologia e patogenicidade

Aeromonas spp. so microrganismos de ocorrncia amplamente difundida no ambiente aqutico nomeadamente gua doce, gua potvel, guas contaminadas, gua do mar, sistemas de distribuio de gua para consumo, guas termais, lagos, rios, mar, esgotos, e solos (Hazen et al., 1978; Borrel et al., 1998; Saavedra, 2000; Biscardi et al., 2002; Abbott, 2003; Pal et al., 2006; Libisch et al., 2008; Sepe et al., 2008). Existem poucos dados relativamente presena de Aeromonas spp. no solo, contudo estudos referem que estas podem persistir e mesmo multiplicar-se, mantendo as suas caractersticas de virulncia, o que sugere a importncia do solo como reservatrio deste microrganismo (Brandi et al., 1996). A incidncia de Aeromonas spp. nos sistemas de distribuio de guas para consumo tem sido alvo de interesse, dada a sua importncia em termos de sude pblica. A concentrao destes microrganismos varia com as estaes do ano, e quando a temperatura ambiente superior a 20 C, verifica-se um aumento, correspondendo poca de maior incidncia de quadros diarreicos, o que apoia a hiptese de considerar que a gua e alimentos so os principais veculos de transmisso deste gnero (Schubert, 1991; Kirov, 1993; Chopra e Houston, 1999; Hernould, 2008).
Introduo
Estes microrganismos tm tambm sido isolados numa grande variedade de alimentos tais como carnes, pescado, mariscos, alimentos preparados, produtos de pastelaria, leite, derivados lcteos e verduras (Palumo et al., 1989; Knochel e Jeppesen, 1990; Kirov et al., 1993; Hnninen e Siitonen, 1995; Castro - Escarpulli et al., 2003; Bin Kingombe et al., 2004; Ottaviani et al., 2006). Por este motivo alguns autores consideram que Aeromonas deveria incluir-se na lista de microrganismos que podem actuar como causadores de toxoinfeces alimentares (Kirov, 1993). As fontes de infeco em humanos podem ser agrupadas em duas grandes categorias: a primeira devida ao complexo ambiente - gua - animais; e a outra ser mediante a ingesto de comida contaminada, sendo este gnero cada vez mais referenciado como o principal causador de diversas infeces ao nvel da clnica humana (Joseph e Martin-Carnahan, 2000; Ko et al., 2000; Hsiu-Tsun et al., 2003; Figueras, 2005). medida que a diversidade do gnero Aeromonas foi sendo descrita aumentou a sua importncia como agente patognico (Carson et al., 2001). Algumas espcies tm sido reconhecidas como patognicas para o Homem causando infeces intestinais e extraintestinais, incluindo septicmia, feridas, infeces da pele, tecidos moles e no sangue (Janda 1991; Chang et al., 1997; Krzyminska et al., 2008), como tambm nos animais especialmente em peixes, anfbios e repteis (Martin-Carnahan e Joseph, 2005; Figueras, 2005; Tena et al., 2007). Vrios estudos referem que as Aeromonas constituem um grupo de organismos patognicos primrios, sendo a primeira causa de doenas extraintestinais, e esto fortemente associadas a infeces gastrointestinais em humanos (Janda, 1991; Braddour, 1992; Subashkumar et al., 2006). O facto de no se conseguir reproduzir em animais de laboratrio os sintomas diarreicos observados no Homem, tambm no tem permitido demonstrar a capacidade enteropatognica desta bactria (Janda e Abbott, 1998; Von Graevenitz, 2007). Assim o papel de Aeromonas spp. como agente causador de gastroenterite continua a ser objecto de investigao e mesmo especulao.
Bardhan e colaboradores em 1998 consideraram Aeromonas spp., Escherichia coli e Klebsiella spp. como os agentes mais importantes de diarreia infantil no Bangladesh.
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Introduo
Estudos recentes tm demonstrado que a presena de Aeromonas spp. na gua um potencial risco para a sade pblica, uma vez que estes microrganismos
produzem uma ampla gama de factores de virulncia, deste modo a patogenicidade das infeces associadas a estes microrganismos considerada complexa e multifactorial (Chopra et al., 2000). A presena de factores de virulncia nas espcies de Aeromonas spp. um facto comprovado, sendo referido tanto componentes estruturais como produtos extracelulares (Cahill,1990; Thornley et al., 1997; Chacn et al., 2003; HarfMonteil et al., 2004a; Ardi, 2005). Os componentes estruturais mais estudados e que esto esto associados ao processo de invaso e patogenicidade so flagelos; cpsula; pli; a camada S; os lipopolissacarideos e as protenas de membrana externa (Merino et al., 1998; Gavn et al., 2002; Gavn et al 2003; Kirov et al., 2004). Aeromonas spp. produzem ainda uma grande variedade de substncias extracelulares , tais como, enterotoxinas, hemolisinas, citotoxinas, DNAses, RNAses, elastases, lecitinases, amilases, proteases e lipases, substncias envolvidas nos processos de patogenicidade (Nord et al., 1975; Popoff, 1984; Cahill,1990; Kirov, 1997; Schiavano et al., 1998; Chopra e Houston, 1999; Santos et al., 1999; Fivaz et al., 2001; Asmat e Gires, 2002; Gonzlez- Serrano et al., 2002; Kirov et al., 2004; Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Os factores de virulncia referidos no gnero Aeromonas tm sido descritos quer em estirpes clnicas, estirpes isoladas em guas e tambm em alimentos (Bin Kingombe et al., 1999; Martins et al., 2002; Gonzlez- Serrano et al., 2002; Sen e Rodgers, 2004).
1.2.2. Taxonomia e Filogenia

A taxonomia do gnero Aeromonas um pouco complexa e por vezes confusa, devido falta de congruncia entre as caractersticas fenotpicas e genotpicas das espcies que constituem este gnero (Hasan et al., 2006). A caracterizao fenotpica extremamente difcil e ambgua (Martin-Carnahan e Joseph, 2005). Ao longo dos ltimos anos, o gnero Aeromonas foi sujeito a numerosas revises ao nvel da taxonomia e da nomenclatura. Bacillus punctatus foi o primeiro nome atribudo a um isolado deste gnero (Zimmerman, 1890). Na stima edio do Manual de Bergeys (Snieszko, 1957) este gnero foi includo na famlia Pseudomonadaceae, englobando
Introduo
quatro espcies, trs espcies mesfilas mveis (A. hydrophila, A. punctata, A. liquefaciens), e uma psicrfila imvel (A. salmonicida). Nos finais dos anos sessenta, Schubert (1969) props a classificao do gnero em trs espcies com oito subespcies: duas espcies mveis, A. hydrophila com as subespcies A. hydrophila subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. anaerognes e A. hydrophila subsp. proteolytica, A. punctata com as subespcies A. punctata subsp. punctata e A. punctata subsp. caviae; e uma espcie imvel, A. salmonicida com as subespcies A. salmonicida subsp. salmonicida, A. salmonicida subsp. achromogenes e A. salmonicida subsp. mausocida. Esta proposta foi a publicada na oitava edio do Manual de Bergeys (Schubert, 1974), sendo este gnero includo na famlia Vibrionacaeae. Colwell e colaboradores (1986) atravs de estudos moleculares de Aeromonas baseados na anlise da sequncia do rRNA 5S demonstraram que o gnero Aeromonas apresentava uma posio filogentica suficientemente distante das famlias
Enterobacteriaceae e Vibrionaceae constituindo uma familia independente, propondo elevar este gnero categoria de famlia com o nome taxonmico de Aeromonadaceae. Em 1994 na edio do Manual de Bacteriologia de Bergeys o gnero Aeromonas segue ainda includo na famlia Vibrionaceae (Holt et al., 1994). MartnezMurcia e colaboradores em 1992a realizam o primeiro estudo filogentico baseado na anlise do rRNA 16S em Aeromonas. Neste estudo foi ratificada a proposta de elevar o gnero Aeromonas categoria de famlia, demonstrando que forma uma linha diferente dento da sub classe gamma-Proteobacteria. Esta proposta foi aceite, e assim aparece na nova edio do Manual de Bergeys 2001, mantendo-se assim na nova edio deste manual (Martin-Carnahan e Joseph, 2006). No mesmo trabalho foi tambm ratificado que o gnero Aeromonas engloba um grupo de espcies muito parecidas, com uma similitude de sequncia que varia de 97,8% a 100%, e os resultados deste estudo esto em concordncia com os obtidos com a hibridao DNA-DNA. Este gnero encontra-se em constante evoluo no somente pela descrio de novas espcies mas tambm pela sua reclassificao (Martnez- Murcia et al., 1992b;Yez et al., 2003; Miana-Galbis et al., 2004, 2007; Huys et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2008).
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Recentemente foi proposta a espcie Aeromonas sharmana, com base num nico isolado obtido de guas termais, GPTSA-6T, (Saha e Chakrabarti, 2006), no entanto Martnez-Murcia e colaboradores em 2007, esta espcie no foi considerada como um membro do gnero Aeromonas. Em 2005 eram 18 as espcies descritas (Martin- Carnahan e Joseph, 2005; Saavedra et al., 2006) mas em 2009 esse valor aumentou para 22 (Quadro 1), com a descrio de uma nova espcie, Aeromonas fluvialis (Alperi et al., 2009).
Quadro 1. Espcies actualmente aceitem no gnero Aeromonas
Espcie A. hydrophila A. bestiarum A. salmonicida A. caviae A. media A. eucrenophila A. sobria A. veronii A. jandaei A. schubertii A. trota A. allosaccharophila A. encheleia A. popoffii A. culicicola A. simiae A.molluscorum A.bivalvium A. aquariorium A. tecta A. piscicola A. fluvialis
Estirpe tipo ATCC 7966T ATCC 51108T NCIMB 1102T ATCC 15468T ATCC 33907T NCIMB 74T NCIMB 12065T ATCC 35624T ATCC 49568T ATCC 43700T ATCC 49657T CECT 4199T CECT 4342T LMG 17541T MTC 3249T IBS S6874
T
Origem Leite Peixe doente Salmo Cobaia gua de piscicultura Peixe da gua doce Peixe Muco Fezes humanas Abcesso cutneo Fezes humanas Enguia Enguia gua potvel Mosquito Fezes de macaco Molusco bivalve Bivalve Aqurio Isolado clnico e ambiental Peixe gua (Rio)
Autores Stainer, 1943 Ali et al., 1996 Griffin et al., 1953 Schubert e Hegazi, 1988 Allen et al., 1983 Schubert e Hegazi, 1988 Popoff et al., 1981 Hickman-Brenner et al., 1987 Carnahan et al., 1991a Hickman-Brenner et al., 1988 Carnahan et al., 1991b Martnez-Murcia et al., 1992b Esteve et al., 1995b Huys et al., 1997 Pidiyar et al., 2002 Harf-Monteil et al., 2004 Miana-Galagis et al., 2004 Miana-Galagis et al., 2007 Martnez-Murcia et al., 2008 Demarta et al., 2008 Hidalgo et al., 2008 Alperi et al., 2009
CECT 5864 CECT 7113 MDC47T/DSM 18362T CETC7082T MDC91T S1.2T CECT 7401=LMG 24681
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No sentido da resoluo de algumas ambiguidades, obtidas mediante a sequnciao de genes 16S rRNA, tm sido pesquisados outros marcadores filogenticos que correspondem s sequncias dos genes denominados, Housekeeping, aqueles que esto envolvidos em manter as suas funes vitais na clula. Estudos baseados na sequenciao do gene gyrB e do gene rpoD (Yez et al., 2003, Soler et al., 2004; Martnez-Murcia et al., 2005; Saavedra et al., 2006, 2007) revelaram uma boa correlao com as metodologias anteriormente utilizadas, nomeadamente a hibridao DNA-DNA e a sequenciao do gene 16S rRNA, assim mostrou-se capaz de solucionar, com maior clareza certas ambiguidades existentes (Martnez- Murcia et al., 2005).
1.2.3. Mtodos de Identificao

1.2.3.1. Mtodos microbiolgicos convencionais O gnero Aeromonas em geral de difcil identificao laboratorial. A elevada variabilidade de caractersticas bioqumicas dos elementos deste gnero faz com que as tcnicas habitualmente usadas baseadas no fenotpo por vezes aportam resultados ambguos e muitas vezes incorrectos. Os mtodos convencionais de identificao baseiam-se nas propriedades fentipicas dos microrganismos, isto , um conjunto de marcadores fentipicos como fisiolgicos, bioqumicos, estruturais, e todas as caractersticas que porpocionam o aspecto global do individuo (Roman-Aravena et al., 2008). A falta de concordncia entre os mtodos de identificao bioqumica e gentica, especialmente nos isolados de origem ambiental, baseiam-se no facto dos esquemas de identificao bioqumica utilizados no distinguirem as espcies de Aeromonas existentes (rmen et al., 2005), como tambm a descoberta de novas espcies que no esto contempladas nos esquemas de identificao frequentemente utilizados (Abbout et al., 2003). As bases de dados para a identificao de Gram negativo aerbios ou anaerbios facultativos at pouco tempo incluam apenas A. hydrophila ou Aeromonas spp.. Actualmente existem pelo menos 14 sistemas comerciais que contm na sua base de dados diversas espcies pertencentes a este gnero, mas a sua utilidade em
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determinados casos duvidosa (Joseph e Carnahan, 1994; Vivas et al., 2000). Um problema geralmente associado a elementos deste gnero a confuso com algumas das espcies do gnero Vibrio (Vivas et al., 2000; Park et al., 2003). Estudos de Abbott e seus colaboradores (1998) referem um caso concreto da identificao de duas estirpes de Aeromonas, identificadas pelo sistema de biotipificao numerica (API 20NE), como membros do gnero Vibrio. Deste modo, o uso sistemas de biotipificao numrica no diagnstico no so aconselhveis quando se pretende uma identificao precisa (Valera e Esteve, 2002). O de metodologias capazes de identificar todas as espcies de Aeromonas crucial. A sub identificao dos elementos deste gnero poder gerar consequncias ao nvel da sade pblica. Por este motivo desde a dcada de oitenta tem vindo a ser desenvolvidas diferentes tcnicas baseadas na anlise de DNA que se tm mostrado mais estveis e fiveis. 1.2.3.2. Mtodos genticos
A poro do gentipo que se expressa em cada estirpe portanto o fentipo, estas propriedades so muito variveis pela capacidade de adaptao das bactrias a qualquer ecossistema, e por outro lado apresentam uma interpretao subjectiva e complicada. A aplicao de mtodos genticos abre novas perspectivas aos microbiologistas para a identificao ou tipificao de alguns gneros fastidiosos na determinao da taxonomia e filgenia (Castro-Escarpulli et al., 2003). O desenvolvimento das tcnicas de biologia molecular nos ltimos anos tornou possvel a identificao de espcies bacterianas directamente atravs da anlise gentica do seu DNA (mtodos genotpicos). O DNA bacteriano contm toda a informao biolgica da clula, quer se expresse ou no e de uma forma geral o gentipo mais estvel durante a sua evoluo. Apesar da introduo de novos mtodos de identificao de espcies, no somente para o gnero Aeromonas, mas tambm para outros, o mtodo DNA-DNA hibridao considerado por alguns autores como a gold standard para a identificao taxonmica de novas espcies (Stackebrandt et al., 2006; Janda e Abbott, 2007).
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1.2.3.3. Sequnciao do gene que codifica para o 16S rRNA A sequncia nucleotdica do genoma bacteriano a impresso digital de cada bactria. O estudo da sequncia do 16S rRNA um dos mtodos mais discriminativos e precisos para determinar o nvel de relao filogentica entre bactrias (Woese, 1987). A sua utilizao permitiu a identificao de quase todas as espcies no entanto quando se pretende estudar relaes filogenticas prximas, como o caso de espcies de um mesmo gnero, esta tcnica apresenta algumas limitaes (Martnez-Murcia et al., 1992; Martnez-Murcia et al., 1999; Janda e Abbott, 2007), visto ser uma molcula extremamente conservada, verificando-se frequentemente situaes em que espcies distintas apresentam poucas diferenas nucleotdicas (Janda e Abbott, 2007). A anlise do gene 16sRNA (com aproximadamente 1500pb) pode ser potencialmente aplicada a todas as bactrias. Este gene, o 16S rRNA, que codifica a unidade de rRNA altamente conservado, mas ao mesmo tempo possui uma zona hipervariavel com cerca de 138 pb na regio 5 terminal que permite a identificao da maior parte das espcies (Mendes et al., 2003), sendo normalmente usado para a classificao taxonmica, e considerado um bom marcador molecular (Woese, 1990; Amann et al., 1995). Ainda que, a maioria destes resultados estejam em concordncia com os obtidos com a tcnica de hibridao DNA-DNA, tambm se encontram sequncias de 16S rRNA idnticas para espcies que apresentam grupos de hibridao distintos, como o caso de A. salmonicida e A. bestiarum que representando duas espcies distintas deste gnero ao nvel da sequncia de rDNA 16S no se verifica nenhuma diferena nucleotidica (Martnez-Murcia et al., 2005). Por esta razo foi necessrio pesquisar outros mtodos eficazes para a identificao das estirpes deste gnero.
1.2.3.4. Sequenciao de genes Housekeeping A sequenciao um mtodo simples e preciso que permite a identificao da maioria das espcies bacterianas, sendo til quando impossvel obter um resultado fidedigno pelos mtodos fentipicos convencionais usados habitualmente pelos
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laboratrios de rotina. Nos ltimos anos tm aparecido cada vez mais estudos taxonmicos e filogenticos baseados em genes Housekeeping, genes que codificam para protenas de funo vital na clula. A utilizao de genes alternativos para a identificao molecular de certas espcies aumenta ainda as potencialidades da sequenciao. Deste modo estes genes apresentam um conjunto de qualidades que permitem a sua utilizao em filogenia. Estas vantagens de forma simplificada e objectiva so defenidas em trs pontos principais: i) So protenas com uma funo vital na clula logo representam uma funo ancestral e encontram-se em todas as clulas; ii ) So protenas sobre as quais j existem estudos cientficos que estudaram a correlao com os estudos de hibridao DNA-DNA e as concluses filogenticas das duas tcnicas so semelhantes o que demonstra que na maioria dos casos no existe transferncia horizontal destas protenas ou que caso exista baixa; iii ) O facto de se tratar de uma sequncia que codifica para uma protena a percentagem de substituio nucleotdica superior encontrada no rDNA 16S, o que se torna til para o esclarecimento de relaes filogenticas mais prximas. A utilizao de genes alternativos para a identificao molecular de certas espcies aumenta ainda as potencialidades da sequenciao. Diferentes genes tm vindo a ser utilizados para a classificao de bactrias ao nvel intra-genrico tais como os genes recA (Kullen et al., 1997), groEL (Haake et al., 1997), hps 75 (Pai et al., 1997), tuf (Chavagnat et al., 2002), rpoD (Yamamoto et al., 2000; e gyrB (Kasai et al., 2000; Yez et al., 2003; Soler et al., 2004). Actualmente existem estudos a demonstrar que estes genes esclarecem de forma mais objectiva as relaes filogenticas interespcies no gnero Aeromonas (Yez, 2003; Soler et al., 2004; Kupfer et al., 2006) e caracterizao de novas espcies
Introduo
(Pidiyar et al., 2002). O estudo das sequncias nucleotdicas e de aminocidos destes genes tem permitido esclarecer os pontos controversos das rvores filogenticas elaboradas com base na sequenciao dos genes ribossmicos (Feng et al., 1997; Doolitle, 1999).
O gene gyrB e rpoD parecem bons indicadores da evoluo do genoma, pelo que podem ser utilizados como marcadores filogenticos para a sistemtica bacteriana (Kim et al., 1999; Watanabe et al., 2001). Apenas existe uma cpia do gene e no sofre transferncia horinzontal (Sawada et al., 1999). Estes dois genes housekeeping tm sido os mais utilizados como uma ferramenta filogentica, dada a sua aplicao j anteriormente descrita, no gnero Aeromonas (Soler et al., 2004). 1.2.3.4.1. Genes gyrB e gyrA A DNA girase pertence famlia das topoisomerases de tipo II. As DNA topoisomerases intervm em processos biolgicos to essenciais como a replicao, transcrio e recombinao das molculas de DNA, atravs do controlo que exercem sobre o grau de superenrolamento da molcula de DNA numa reaco que no requer energia (Huang, 1996). Estas enzimas classificam-se atendendo sua funo em tipo I, tipo II, tipo III ou Tipo IV. A primeira toipomerase do tipo II a ser descoberta foi a DNA girase em Escherichia coli que constituda por duas subunidades, GyrA e GyrB de 97 kDa e 90 kDa respectivamente (Figura 2), e que se integram numa holoenzima de estequiometria A2B2 (Cove et al., 1997). A sua funcionalidade est dividida pelos seus domnios. Esta diviso apoiada por anlises bioqumicas e pela determinao cristalogrfica da estrutura da protena (Wigley, 1995). A protena GyrB apresenta o extremo N-terminal, onde ocorre a hidrlise do ATP (domnio ATPase), necessria ao superenrolamento negativo da molcula de DNA circular. Este processo endoenergtico, desfavorecido termodinamicamente, pelo que a energia necessria obtm-se a partir da hidrlise de uma molcula de ATP. O extremo C-terminal, zona de unio protena A (GyrA), a zona da molcula de enrolamento do DNA (Cabral et al., 1997). O extremo N-terminal
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da protena GyrA contm o centro activo para a tirosina (Tyr 122) necessria para o reconhecimento do DNA, aqui que ocorre a ligao covalente protena-DNA e se ligam tambm as quinolonas. O extremo C-terminal a zona de enrolamento do DNA (Huang, 1996; Cove et al., 1997).
Figura 2- Estrutura da DNA girase. Com indicao das subunidades funcionais, gyrA (A) e gyrB (B)
Apenas existe uma variao de 40 resduos entre as classes de proteobacterias gamma e psilon, a sub unidade A da DNA girase tem 850 aminocidos em todas as espcies bacterianas estudadas. A classe epsilon, aparece separada do resto dos grupos de proteobacterias devido insero dos 40 resduos, sendo que esta diferena de aminocidos se localiza no extremo C-terminal da protena. A subunidade B da DNA girase em bactrias pode apresentar dois tamanhos diferentes, num grupo representado pela E. coli, esta enzima tem aproximadamente 800 aminocidos e todas as proteobacterias conhecidas pertencem a este grupo. O outro grupo, representado pelo Bacillus subtilis apresenta cerca de 650 aminocidos. Os 150 aminocidos extra das girases do grupo de E. coli formam um bloco no domnio II da protena. A ausncia desta regio nas DNA girases de B. subtilis sugere que este fragmento no necessrio para a reaco enzimtica da topoisomerizao. Deste modo, a insero destes 150 aminocidos (450 nucletidos) a que permite separar o grupo de proteobacterias do grupo de Gram positivo. A sequncia nucleotdica do gene gyrB permitiu estudar as relaes filogenticas de gneros como: Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999); Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000); Salmonella, Shigella e Escherichia (Fukshima et al., 2002) e Aeromonas (Yanez et al., 2003). Todos os trabalhos realizados demonstram a fiabilidade e versatilidade da
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utilizao deste gene marcador molecular. Yanez e colaboradores em 2003 demonstraram que a sequenciao deste gene em estudos moleculares de elementos do gnero Aeromonas era coerente com as outras tcnicas antes utilizadas.
1.2.3.4.2. Gene rpoD O gene rpoD uma ferramenta til para o reconhecimento de novas linhas filogenticas no gnero Aeromonas (Alperi et al., 2008). A RNA polimerase a enzima responsvel pela sntese de RNA dirigida pelo DNA.Todas as clulas tm RNA polimerase e nas bactrias uma variedade destas enzimas sintetiza todos os RNAs celulares, com excepo dos primers utilizados na replicao do DNA. A RNA polimerase de E. coli uma protena de 480 KD composta por quatro subunidades 2 `; duas subunidades (encoded by the rpoA gene), uma subunidade (rpoB), uma subunidade `(rpoC) e ainda a subunidade (Kupfer et al., 2006). A subunidade tambm chamada de factor separa-se do ncleo da enzima aps a iniciao da sntese do DNA e continua isoladamente o processo de polimerizao (Ishihama, 2000; Borukhov e Nudler, 2003). Nas bactrias expressam-se diferentes tipos de factores 70. O factor 70 responsvel por 99% da transcrio celular, codificado pelo gene rpoD (Borukhov e Nudler, 2003). Dependendo das necessidades da clula e das condies do meio so utilizados outros factores de transcrio. A sequncia nucleotdica do rpoD foi utilizada no estudo taxonmico dos gneros Acinetobacter (Yamamoto et al., 1999); Pseudomonas (Yamamoto et al., 2000) e Aeromonas (Soler et al., 2004).
1.3. Agentes antimicrobianos

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Cada grupo de antibiticos tem um alvo especfico na clula bacteriana (Figura 3). Dependendo da zona de actuao, e de algumas caractersticas dos agentes antimicrobianos como a estrutura qumica e o peso molecular a sua actividade ser varivel, devendo encarar-se cada antibitico em particular e no como um todo. Segundo Sousa (2002) para que as molculas de antibiticos possam exercer uma eficiente actividade, sem que existam problemas de toxicidade para com os animais
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(includo o Homem), so investigadas as diferenas entre a clula bacteriana (procariotica) e as clulas dos animais (eucariota).
Figura 3 Representao dos locais de actuao dos diferentes grupos de antibiticos. Adaptado de Sousa, 2006.
Um agente antibacteriano poder eventualmente no actuar sobre um determinado agente patognico por causas intrnsecas (por ex. elevado peso molecular para atravessar as membranas celulares), nestas situaes esse agente patognico apresenta resistncia inata a esse antibitico no fazendo parte do seu espectro de aco. Apesar disso, sabe-se que molculas inicialmente activas contra determinadas espcies bacterianas hoje j no o so (Lipsitch e Levin, 1997). A resistncia bacteriana aos antibiticos vai evoluindo dada a presso selectiva exercida pela antibioterapia, gerando mutaes espontneas ou a transmisso horizontal de genes de resistncia por transferncia de outras estirpes. Pois o fluxo de genes de resistncia entre o cromossoma e elementos genticos mveis, como plasmdeos, transposes ou integres, leva a que a ecologia gentica de resistncia se propague facilmente (Kummerer, 2004).
1.3.1. Principais mecanismos de resistncia

A resistncia aos antibiticos um problema global, com implicaes em sade pblica. O uso generalizado de antibiticos permitiu s bactrias sobreviver e multiplicar-se sob a presso dos antibiticos devido sua flexibilidade gentica (Cohen, 1997; Kapil, 2005; Levy, 2005). A resistncia aos antibiticos pode ser intrnseca ou
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adquirida (Courvalin, 1996; Sousa, 2001; Kapil, 2005; Sousa, 2006). Os mecanismos de resistncia que se podem observar esto relacionados com a forma de aco dos antibiticos, existindo quatro mecanismos principais (Gilman et al., 1996; Ferreira e Sousa, 1998; Sousa, 2006). A adopo de determinado mecanismo de resistncia por parte das bactrias est intimamente relacionada com o seu modo de aco e mecanismos de aquisio de resistncia dos antibiticos. As bactrias por vezes combinam diferentes mecanismos de resistncia, o que as torna multiresistntes. Pseudomonas aeruginosa apresenta resistncia aos carbapenemos e poder dever-se combinao da produo de -lactamases, aumento das bombas de efluxo e alteraes na parede celular da bactria (Sousa, 2001). A emergncia da resistncia antimicrobiana pode ser uma ameaa para o ambiente e sade pblica, maior que o aparecimento de novos agentes patognicos ou o reaparecimento de antigos. Compreender e reconhecer os problemas da resistncia antimicrobiana e usar os agentes qumicos apropriadamente da maior importncia para a preveno da sua propagao (Levy, 1990; Cohen, 1997). As bactrias so melhores engenheiros genticos que o Homem e vo continuar a escapar ao efeito dos antibiticos. A melhor soluo usar os antibiticos quando necessrios, evitar a antibioterapia sem conhecimento do agente patognico em questo e o cumprimento de regras rgidas com fins profilticos.
1.3.2. Antibiticos antiparietais

Os antibiticos antiparietais so inibidores na fase de sntese do peptidoglicano (molcula caracterstica da parede celular bacteriana) e actuam nas diferentes fases da biossntese desta macromolcula. Apenas iremos abordar os antibiticos -lactmicos, e fosfomicina. Os -lactmicos constituem um grupo muito importante, uma vez que so amplamente utilizados na clnica, devido sua baixa toxicidade e boa eficcia teraputica (Essack, 2001; Sousa, 2006). Os restantes compostos englobados neste grupo apenas manifestam aco sobre organismos Gram positivo.
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1.3.2.1. -lactmicos Os antibiticos -lactmicos englobam na sua totalidade quatro grupos de antibiticos distintos, como as penicilinas, as cefalosporinas, os monobactmicos e os carbapenemos. As penicilinas foram o primeiro grupo de antibiticos a ser comercializado, a sua descoberta em 1928 por Alexander Fleming revolucionou a teraputica das doenas infecciosas. Os antibiticos -lactmicos no so homogneos na sua composio, nem nos seus efeitos. Entre si apresentam um anel -lactmico constitudo por 3 tomos de carbono e um de nitrognio com radicais substituintes. Este anel encontra-se fundido com um anel tiazolidina nas penicilinas enquanto nas cefalosporinas com um anel dihidrotiazina. Relativamente aos monobactmicos apenas temos o anel -lactmico, nos carbapenemos observa-se a presena de um C a substituir o S no anel tiazolidina (Sousa, 2006). Este grupo de antibiticos como inibem PBPs irreversivelmente as D-D-
carboxitranspeptidases,
conhecidas
(Penicillin-Binding-Proteins),
impedindo assim o establecimento das pontes interpeptdicas entre as cadeias peptdicas vizinhas. Estes antibiticos s so activos sobre bactrias em crescimento (Essack, 2001; Sousa, 2005; Sousa, 2006). Existem vrias molculas de caractersticas distintas que foram desenvolvidas para rebater certas limitaes destes compostos, como reaces alrgicas e elevada resistncia microbiana (carboxipenicilinas,
ureidopenicilinas, aminopenicilinas (Sousa, 2001; Sousa, 2006)). So exemplos deste grupo a penicilina, a ampicilina, a carbenicilina, a piperacilina e a amoxicilina. As cefalosporinas actualmente comercializadas podem ser classificadas em primeira, segunda, terceira e quarta gerao, de acordo com o seu espectro de actividade. medida que se avana nas diferenas de geraes, o espectro para as bactrias Gram negativo amplia-se, perdendo-se actividade contra as Gram positivo. A ceftazidima, a cefotaxima, a cefoxitina e o cefepime so exemplos de Cefalosporinas (Sousa, 2001, Sousa, 2006). Tm sido desenvolvidos outros -lactmicos no clssicos, os monobactmicos e os carbapenemos.
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O aztreonamo a nica molcula actualmente comercializada no grupo dos monobactmicos. Este antibitico muito activo para bactrias aerbias Gram negativo, e dotado de grande estabilidade para as -lactamases de largo espectro. Os carbapenemos dentro dos -lactmicos, so o grupo com maior actividade - antibiticos de largo espectro que resistem hidrlise de grande parte das -lactamases existentes (Sousa, 2001; Sousa, 2006). No mercado nacional existem trs molculas a ser comercializadas (imipenemo, meropenemo e ertapenemo), porm este grupo est reservado ao uso hospitalar como ltimo recurso para estirpes multiresistentes. O mecanismo de resistncia mais importante para esta famlia a hidrlise enzimtica por -lactamases. Estas enzimas plasmdicas ou cromssomicas catalizam a hidrlise do anel -lactmico (ligao CO-N) inactivando o antibitico (Bonomo, 2003). Em Pseusomonas aeruginosa a ausncia de porinas justifica a sua resistncia aos carbapenemos (Essack, 2001; Sousa, 2006). Actualmente existem centenas de -lactamases descritas. As -lactamases dependendo da sua especificidade so muitas vezes chamadas penicilases, cefalosporinases e carbapenemases. Outra forma de classificao em relao ao centro activo, as serino--lactamases tm a serina no seu centro activo e as metalo-lactamases que tm zinco no centro activo.
1.3.3. Inibidores de -lactmicos

Com a finalidade de expandir o espectro destes compostos usual a sua associao com compostos inibidores de -lactamases. As substncias inibidoras devem ser estruturalmente semelhantes ao antibitico. O sulbactam, cido clavulnico e o tazobactam, tm estruturas parecidas com o anel -lactmico que a enzima o hidrolisa ficando unida, irreversivelmente, no podendo voltar a actuar sobre outras molculas -lactmicas (Poole, 2004), ao contrrio do que sucede com os antibiticos convencionais.
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1.3.4. Antibiticos inibidores da sntese proteica

Os antibiticos inibidores da sntese proteica actuam no complexo ribossomal 70S. Este complexo formado pela associao das subunidades 30S e 50S). A subunidade 30S composta de rRNA 16S (aproximadamente 1.500 nucletidos) e 21 protena, enquanto a unidade 50S constituida por rRNA 5S (aproximadamente 120 nucletidos), rRNA 23S (aproximadamente 2.900 nucletidos) e por 31 proteinas. As mitocondrias presentes nas clulas eucariotas, possuem ribossomas do tipo bacteriano 70S, assim podem ser vulnerveis aos efeitos destes antibiticos se estivermos perante molculas lipfilas (cloranfenicol) que com grande facilidade atravessam as membranas mitocondriais inibindo a sua sntese proteica. Este grupo de antibiticos inclui os aminoglicosdeos, as tetraciclinas o cloranfenicol, macrlidos lincosamidas e o cido fusdico (Sousa, 2006) 1.3.4.1. Aminoglicosdeos Os antibiticos aminoglicosdeos juntamente com os -lactmicos so considerados os principais agentes na terapia de infeces severas provocadas por bacilos Gram negativo e cocos Gram positivo (Sousa, 2006). Os elementos deste grupo so bastante heterogneos quanto sua composio qumica, propriedades antibacterianas e propriedades farmacolgicas. A gentamicina, a canamicina, a neomicina, a estreptomicina a tobramicina, a amicacina, e a netilmicina so alguns dos elementos deste grupo. Estes antibiticos apresentam um anel aminoclitol, derivado do inositol, unido a acares aminados, atravs de ligaes glicosdicas. Tm marcada actividade contra bacilos Gram negativo aerbios (Kotra et al., 2000). As estirpes produtoras de aminoglicosdeos desenvolveram um mecanismo de auto-defesa, a fim de escaparem ao suicdio produzem metilases para o rRNA 16S, impedindo a aco dos antibiticos na subunidade 30S. Recentemente no Japo foram detectados plasmdeos codificadores destas metilases (gene armA e rmtB). Estes genes tm-se disseminado rapidamente para outras espcies representando j um mecanismo de relevncia neste grupo (Yamane et al., 2004; Gonzlez-Zorn et al., 2005).
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Introduo
1.3.4.2. Tetraciclinas As tetraciclinas constituem uma famlia de antibiticos contendo um ncleo hidroxinaftaceno, formado por quatro anis benznicos fundidos. A tetraciclina o prottipo do grupo e os restantes elementos possuem caractersticas bastante semelhantes a esta. Estes antibiticos inibem a sntese proteica, actuando ao nvel da subunidade 30S dos ribossomas. Inibem a ligao dos aminoacil- tRNA(s) aos ribossomas, impedindo estericamente a ligao codo anticodo ente o tRNA e o local A dos ribossomas (Chopra et al., 2001). As bombas de efluxo so o principal mecanismo de resistncia bacteriana aos antibiticos desta famlia. O sistema de efluxo especificado por diferentes determinantes genticos, os genes tet, que codificam as protenas TET (Orth et al., 2000). Estes antibiticos so considerados de largo espectro, activos contra bacilos Gram positivo e Gram negativo, aerbios e anaerbios (Chopra e Roberts, 2002), no entanto tem se vindo a observar uma elevada prevalncia de resistncias s tetraciclinas. 1.3.4.3. Cloranfenicol Trata-se de um antibitico de largo espectro abrangendo bactrias Gram positivo e Gram negativo, inibidor da sntese proteica, bacteriosttico, actuando na subunidade 50S, impedindo a actuao da transpeptidase. O cloranfenicol liga-se subunidade 50S do ribossoma, impedindo portanto a transpeptidase durante a fase de alongamento (Sousa, 2006). Dada a sua lipofilia atravessa a dupla membrana mitocondrial, inibe a sntese proteica em mitocondrias na medula ssea provocando alteraes hemticas graves (aplasia medular) (Sousa, 2006). O mecanismo de resistncia mais comum a inactivao enzimtica do cloranfenicol por
acetiltransferases bacterianas. O gene cat codifica as O-acetiltransferases bacterianas que promovem a acetilao da molcula de cloranfenicol em C3 originando derivados acetoxi, destitudos de propriedades antibiticas (Yoo et al., 2003). Estes genes podem ter localizao plasmdica ou cromossmica.
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Introduo
1.3.4.4. Macrlidos Os macrlidos tm um espectro bacteriano alargado, sendo activos contra bactrias Gram positivo. Englobam compostos como a eritromicina, e so inibidores da sntese proteica. Bactrias Gram negativo so intrinsecamente resistentes eritromicina com excepo de Neisseria spp., Haemophilus spp., Legionella spp., Campylobacter spp., Mycoplasma spp., Chlamydia spp. (Sousa, 2006). Este grupo apresentam uma apetncia reversvel para as subunidades 50S dos ribossomas e bloqueiam o local P, prejudicando a transpetidao e/ou a translocao, exercendo deste modo uma aco bacteriosttica. Estas molculas anfilticas moderadamente lipfilas so incompatveis com os canais de porina (via hidrfila) e com a superfcie predominantemente hidrfila de muitas bactrias Gram negativo. A difuso atravs das regies fosfolipdicas da membrana externa assim a principal via de entrada destes compostos. A mais frequente forma de resistncia deste grupo a resistncia cruzada aos Macrlidos-Lincosamidas-Sptreptogramina B (resistncia MLSB). Esta resistncia devese N.N-dimetilao da adenina na posio 2058 no rRNA 23S, mediada por uma metilase, produto do gene erm (Schwarz et al., 2002). Estes genes podem ter localizao cromossmica ou plasmdica e podem se exprimir constitutivamente ou por induo. As bombas de efluxo, geradas por produtos do gene mef, tm tambm importncia na resistncia bacteriana dos macrlidos no entanto, este mecanismo no eficaz em todas as molculas do grupo (Wierzbowski et al., 2005).
1.3.5. Antibiticos inibidores da sntese dos cidos nucleicos

Fazem parte deste grupo de antibiticos a rifampicina, o metronizadol e as quinolonas. Actuam sobre a sntese dos cidos nucleicos provocando a morte celular (Sousa et al., 1998).
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Introduo
1.3.5.1.Quinolonas As quinolonas so antibiticos de sntese, derivados do cido naladxico sendo que este foi a primeira quinolona a ser utilizada em 1962 no tratamento da cistite causada por bactrias Gram negativo (Oliphant e Green 2002; Sousa, 2006). Actualmente esta famlia de antimicrobianos tem sofrido grande evoluo, pelo que classificada, tal como as cefalosporinas, em quatro geraes com base na sua actividade antimicrobiana. Ao longo das geraes estes antibiticos vo aumentando
sucessivamente o seu espectro de aco. As quinolonas so inibidores directos da sntese do DNA e actuam mediante a inibio da DNA girase (Topoisomerase II) codificada pelos genes gyrA e gyrB (principal alvo nas bactrias Gram negativo) e a toipomerase IV codificada pelos genes parC e parE. Ao actuarem contra as topoisomerases, as quinolonas interferem com o enrolamento do DNA, impedindo a replicao e a transcrio do DNA. Assim sendo, a forma de resistncia mais comum a mutao das enzimas alvo (Topoisomerase II e IV). So exemplos desta famlia de antibiticos o cido naladxico, a ciprofloxacina, a norfloxacina, a ofloxacina e a levofloxacina.
1.3.6. Antibiticos antimetabolitos

1.3.6.1. Sulfonamidas / Trimetopim O cido para-aminobenzoico (PABA) um factor indispensvel para o crescimento celular, pois sem ele no h sntese dos cidos nucleicos. Todas as molculas que inibam esta cadeia metablica, como as sulfamidas, sulfonas, PAS e Trimethopim so conhecidas como anti-metabolitos ou como inibidores da sntese dos cidos nucleicos. As sulfamidas, PAS e sulfonas competem com o PABA impedindo a sua adio pteridina, bloqueando assim a sntese de cido dihidropteroico. O enzima dihidropteroato sintetase tem mais afinidade para as sulfonamidas do que para o se substrato natural (PABA). Trimetopim inibe competitivamente a dihidro-folato redutase, o enzima que reduz dihidrofolato a tetrahidrofolato (tambm conhecido como co-factor folato, indispensvel sntese de timidina, purinas e N-formilmetionina).
Introduo
Trimetopim, um anti-metabolito, siner-geticamente associado a sulfametoxazol, largamente utilizado na teraputica. As sulfamidas inibem portanto a sntese de DNA, RNA e sntese proteica.Tm efeito bacteriosttico
1.3.7. Antibioresistncia no gnero Aeromonas

O aparecimento de resistncias uma estratgia dos procariotas prpria da sua evoluo natural, ocorre na natureza, mas ns temos acelerado este curso natural com a sua sobre-presso selectiva que torna mais rpido o aparecimento de uma grande variedade de respostas (Levy, 2005). A transferncia da resistncia ocorre entre bactrias patognicas e comensais, mas tambm nas presentes no solo, gua, esgotos, estrume, efluentes e plantas. A emergncia de isolados clnicos e isolados ambientais resistentes a antibiticos constitui um srio problema a nvel mundial, principalmente a ocorrncia de bactrias resistentes a antibiticos provenientes de ambientes naturais, dado que estes microrganismos no so expostos directamente aos antibiticos (Blasco et al., 2008). Considerando as crescentes evidncias de que a resistncia clnica est intimamente associada ambiental (Prabhul et al., 2007; Abriouel et al., 2008), a presena de resistncia a diferentes grupos de antibiticos em microrganismos no patognicos, isolados de ambientes aparentemente incuos como o caso das guas de consumo, um procedimento promissor e emergente, relativamente disseminao dos genes responsveis por este tipo de resistncia, s quais a investigao deve responder (Sayah et al., 2005). No mbito de determinar o perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos comercializados actualmente, vrios estudos tm sido efectuados com isolados de Aeromonas. Apesar disso, a maioria dos trabalhos que estudam a sensibilidade in vitro a antimicrobianos incide apenas sobre as espcies fenotpicas A. hydrophila, A. caviae e A. sobria, porque a identificao habitual das estirpes realizada mediante testes bioqumicos, que segundo o anteriormente descrito, no
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Introduo
identificam com exactido os elementos deste gnero ao nvel de espcie. As estirpes de Aeromonas hydrophila isoladas de ambientes aquticos no Bengladehs por McNicol e colaboradores em 1980 revelaram sensibilidade gentamicina, canamicina e cido naladxico, contudo apresentaram um fntipo de resistncia mltiplo estreptomicina e tetraciclina. Num trabalho realizado por Kampfer e colaboradores (1999) testou a sensibilidade de 217 estirpes, representativas das 14 espcies descritas at aquele momento, a 69 agentes antimicrobianos. Estes autores verificaram que no existiam diferenas significativas entre as espcies. No entanto, o trabalho de Overman e Janda (1999) em que foi testado o efeito de 18 antibiticos em 56 estirpes, compara a susceptibilidade de estirpes pertencentes s espcies: A. jandaei, A. schubertii, A. trota e A. veronii, tendo verificado que A. jandaei era a espcie que apresentava maior nvel de resistncia aos antibiticos testados e A. trota seria a espcie mais susceptvel. De uma forma geral admite-se que os indivduos deste gnero so resistentes penicilina, ampicilina e carbenicilina (-lactmicos - penicilinas). Em vrios trabalhos referido que estas estirpes so intrinsecamente resistentes ampicilina de tal forma que, para o seu isolamento foi generalizada a adio deste antibitico ao meio de cultivo (Ceylana et al., 2003; Vila et al., 2003; Vivekanandhana et al., 2005). Estudos descrevem que 100% dos isolados apresentam resistncia ampicilina (Vila et al., 2002). Contudo, outros estudos tm vindo a descrever estirpes com sensibilidade a este antibitico (Goi-Urriza et al., 2000a; Saavedra et al., 2004). Num trabalho de Saavedra e seus colaboradores (2004), realizado com estirpes de Aeromonas isoladas de trutas de aquacultura, concluiu-se que 35% das estirpes testadas apresentaram susceptibilidade ampicilina, referindo que o facto de se considerar estas estirpes intrinsecamente resistentes ampicilina foi baseado em estirpes clnicas, nas estirpes ambientais, em que a presso selectiva significativamente diferente, os resultados podem ser diferentes.
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Introduo
Relativamente ao perfil de susceptibilidade em estirpes de origem alimentar existem tambm diferentes estudos (Radu et al., 2003; Vivekanandhan et al., 2005; Pal et al., 2006; Akinbowale et al., 2007). Em 2006, Pal e colaboradores verificaram que todas as estirpes de Aeromonas spp.de origem alimentar (alfaces), eram sensveis cefotaxima, ceftazidima, imipenemo, amicacina, gentamicina, tobramicina,
ciprofloxacina, cloranfenicol e trimetropim- sulfametoxazol. No entanto h estudos em que para o trimetropim- sulfametoxazol os valores de resistncia variam entre os 18,8% em Aeromonas isoladas de trutas e os 100% em estirpes obtidas de tilapia e pacu (Belm-Costa e Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2007) No tratamento de infeces por Aeromonas, aconselha-se, como primeira escolha, as fluoroquinolonas, e como alternativa o trimetropim-sulfametoxazole, aminoglicosdeos, carbapenemos, cefalosporinas de segunda e terceira gerao, e as tetraciclinas (Overman e Janda, 1999,Vila et al., 2003; Otaviani et al., 2006). Diferenas no perfil de susceptibilidade a antibiticos em estirpes de origem ambiental esto associadas a zonas de elevado impacto humano (Ko et al., 1996; GoiUrriza et al., 2000a). Assim, podemos inferir pelos diferentes trabalhos que o perfil de susceptibilidade para este gnero pode ser bastante diversificado e continua por clarificar.
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2. OBJECTIVOS
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Objectivos
Este trabalho tem como objectivo avaliar a presena, as espcies e a incidncia de membros do gnero Aeromonas em guas para consumo humano, tratadas e no tratadas. Contribuir tambm para aumentar o conhecimento sobre a ecologa deste grupo de microorganismos e no futuro poder contribuir para evitar processos infecciosos em humanos e em animais. Para a concretizao deste estudo estabeleceram-se objectivos especficos: Obter de uma coleco de estirpes bacterianas do gnero Aeromonas; Determinar o perfil de susceptibilidade a diferentes grupos de antibiticos dos isolados de Aeromonas; Caracterizar, os isolados obtidos, por mtodos genticos e identific-los
filogeneticamente, recorrendo anlise de genes housekeeping. Estes mtodos sero usados para uma identificao inequvoca especie.
Pretende-se, assim, com os resultados deste trabalho, alertar para a presena de resistncia a diferentes grupos de antibiticos em microrganismos no patognicos, isolados de ambientes aparentemente incuos como o caso das guas de consumo, que no s preocupante, como coloca questes importantes, relativamente disseminao dos genes responsveis por este tipo de resistncia, s quais a investigao deve responder.
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3. MATERIAL E MTODOS
Material e Mtodos
3.1. Origem das amostras

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Neste estudo foram analisadas amostras de guas no tratadas, provenientes de fontes, poos e nascentes, localizadas em dois Concelhos do Distrito de Vila Real de acordo com a tabela 1.
Tabela 1 - Locais de amostragem e nmero de amostras Concelho Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Real Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Vila Pouca de Aguiar Total Localizao Agarz Constantim Escariz Estao Fonteita Guies Nascente do Hospital Nascente do Maro S. Mamede S. Cibro Lordelo Parada de Cunhos F. Piscinas Vila Pouca de Aguiar Capelos Soutelo de Aguiar Cerdeira de Jales Vreia de Jales Campo de Jales Alfarela de Jales Jales N de Amostras 3 2 1 1 2 3 1 1 1 2 3 3 1 1 1 1 1 1 2 1 2 34
As amostras foram analisadas na Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro no Departamento de Cincias Veterinrias nos laboratrios de Microbiologia Alimentar e Microbiologia Mdica. O estudo filogentico ocorreu nas instalaes do laboratrio Molecular Diagnostics Center (MDC) com sede em Orihuela (Alicante Espanha).
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Material e Mtodos
3.1.2. Mtodo de recolha das amostras

As amostras de gua foram recolhidas para frascos de polipropileno estreis e o tempo mximo decorrido entre a colheita da amostra de gua e a sua anlise laboratorial. A recolha foi realizada seguindo as regras estabelecidas pela ISO 5667-2 (1991) aprovada como Norma Portuguesa NP EN 25 667-1 (1997), que se reporta norma europeia EN 25 667 (1993).
3.1.3. Isolamento pela tcnica de filtrao por membrana

O mtodo de isolamento utilizado foi o mtodo de filtrao por membrana (ISO 9308-1,1990) que permite determinar o nmero de microrganismos presentes na gua, quando se filtra um determinado volume de amostra de gua atravs de uma membrana de nitrocelulose com uma porosidade de 0.45m de dimetro (Quadro 2).
Quadro 2- Tcnica de filtrao por membrana 1. De cada amostra de gua, depois de homogeneizada, passar 100 ml, por uma membrana de nitrocelulose (Gelman) de 0.45m de porosidade; 2. Retirar com a ajuda de uma pina estril a membrana de filtrao, e colocar superfcie do meio de GSP, (Meio 1- Anexo I); 3. Incubar a 30C, durante 24horas.
Dado este estudo incidir apenas sobre o gnero Aeromonas, o meio de cultura utilizado foi o G. S. P. (Glutamato Amido Vermelho de Fenol) MERCK 10230 que segundo especificao da empresa fabricante selectivo e diferencial para Pseudomonas spp. e Aeromonas spp.. A cultura pura das colnias presuntivas de Aeromonas, colnias amarelas, foi obtida por expanso clonal, seguida de diversas provas morfofisiolgicas, bioqumicas e identificao por mtodos fenotpicos e genotipicos.
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Material e Mtodos
3. 1. 3. 1. Conservao das estirpes De colnias isoladas, procedeu-se inoculao da cultura em meio lquido de B.H.I-Oxoid CM 0225- e foi a incubar a 30 C, durante 24 horas. Foram conservadas alquotas de B.H.I. com glicerol a 15% a -70 C.
3.2. Caracterizao preliminar dos isolados

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3.2.1. Colorao diferencial de GRAM

A colorao de Gram um dos primeiros passos para a caracterizao morfofisiolgica dos isolados, o gnero Aeromonas so Gram negativo. O procedimento para a realizao desta colorao encontra-se no quadro 3.
Quadro 3 Colorao pelo mtodo de Gram 1. Esfregao; Laminas microscpicas limpas e desengorduradas; 2. Fixao; Coloca-se a lmina acima da chama, a uma altura que a mo possa suportar o calor; Espalha-se em camada muito fina; aoPassa-se duas a trs vezes a lmina pela chama; Secar ar ou suavemente chama. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Deixa-se arrefecer Ansa esterilizada; Deixa-se arrefecer;
Corante inicial Violeta de metilo (1minuto); Mordente- Lugol (30 segundos); Diferenciao- alcool/acetona at se tornar incolor; 2 Lavagem- gua; Corante de contraste- Vermelho neutro (1 a 2 minutos), 3 Lavagem- gua; Secagem- entre duas folhas de papel de filtro;
10. Observao- objectiva de X 100 (com leo de emerso).
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Material e Mtodos
3.2.2. Prova da citromo-oxidase

A prova da oxidase utiliza-se na identificao de bactrias aerbias Gram negativo, apesar de muitas bactrias Gram positivo apresentarem um sistema citocromo dectetvel. O sistema de citocromos possui hemoprotenas que contm ferro que transferem electres ou hidrognio at ao oxignio com a formao de gua. As bactrias com reaco positiva possuem um sistema citocromo oxidase de transporte de electres, as negativas no possuem este sistema, embora estas possam ter outros citocromos. As reaces lentas ou mesmo negativas esto relacionadas com nveis baixos de citocromo oxidase. O gnero Aeromonas geralmente oxidase positivo. Para a realizao desta prova foi preparada uma soluo de tetrametil p-fenileno de amina. As colnias suspeitas foram inoculadas com umas gotas deste reagente seguindo a metodologia descrita no quadro 4.
Quadro 4 Prova da Oxidase 1. Colocar uma tira de papel de filtro sobre uma tampa de uma placa de petri, colocando duas a trs gotas do reagente oxidase sobre a tira; Com uma pipeta de Pasteur retira-se uma pequena poro de colnia e coloca-se sobre a tira de papel de filtro; Se houver mudana de cor. (Azul prpura junto zona em que se colocou a poro de colnia) a reaco positiva.
2.
3.
3.2.3. Prova da catalase

A catalase uma enzima hemoproteica que contm ferro, decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio. A actividade da catalase manifesta-se na maior parte das bactrias aerbias, mas apenas em algumas anaerbias. O gnero Aeromonas catalase positivo. Esta prova realiza-se inoculando uma poro de cultura da estirpe em estudo em perxido de hidrognio, a metodologia utilizada encontra-se descrita no quadro 5.
Material e Mtodos
Quadro 5 - Prova da catalase 1. Numa lmina desengordurada e passada previamente ao bico de Busen, colocar uma gota de gua oxigenada; 2. De um meio sem sangue, recolher um de uma colnia sobre a gota de gua oxigenada; 3. Ao verificar efervescncia diz-se que a reaco positiva, ou seja, revela-se a produo de catalase.
3.3. Identificao das estirpes bacterianas
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A identificao dos isolados foi realizada atravs da sequenciao do gene gyrB que codifica para a subunidade da DNA girase, atravs da metodologia validada por Yez e colaboradores (2003). Em ocasies que o justifica-se, foi sequenciado o 16S rRNA, gyrA e o rpoD gene que codifica para o factor 70 da RNA polimerase.
3.3.1. Extraco de DNA

Antes de proceder sequenciao dos genes necessrio efectuar a extraco do DNA a partir de cultura pura. A metodologia seguida est descrita no quadro 6.
Quadro 6 Metodologia de extraco do DNA de estirpes bacterianas 1. 2. Suspender num tubo de 1,5 ml contendo 100 l de TE, uma colnia de cultura recente. Adicionar 200 l de chelex, previamente preparado na concentrao de 20% (Bio-Rad). Agitar no vortex durante cerca de 1 minuto. Submeter a mistura a uma sucesso de trs ciclos de choques trmicos, alterando 10 minutos de aquecimento a 95 C com um perodo de 10 minutos de congelao a -20 C. Agitar novamente o tubo no vortex. Centrifugar durante 5 minutos a 13000 r.p.m. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e armazenar a -20 C.
3. 4. 5. 6.
7.
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Material e Mtodos
3.3.2. Amplificao de DNA por reaco de PCR

Para a amplificao dos genes 16S rRNA, gyrB, rpoD e gyrA utilizaram-se os oligonucletidos descritos no quadro 7.
Quadro 7 Oligonucletidos utilizados em reaco de PCR
Posio gyrB 3F gyrB 14R rpoD 70F rpoD 70R gyrA 16S 0F 16S 15R 8/27 1492/1510 334/354 1464/1444 280/302 1139/1117 Sequncia (5`--- 3`) TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT TTG TCC GGG TTG TAC TCG TC ACG ACT GAC CCG GTA CGC ATG TA ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT MLPA analysis of the genus Aeromonas AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Referncia Yez et al., 2003 Yez et al., 2003 Yamammoto et al., 2000 Yamammoto et al., 2000 Martnez-Murcia et al. (MS submitted) Martnez-Murcia et al., 1999 Martnez-Murcia et al., 1999
Nota: * posio segundo numerao de E. coli (Huang, 1996).
A mistura da PCR foi realizada para um volume final de 50 l, contendo 75mM de Tris HCl (pH 9.0), 2mM de MgCl2, 50mM de KCl, 20mM de (NH4) 2 SO4, 1 l de DNA genmico, 2,5mM de cada dNTP, 10 pmol de cada oligonucletido e 1 U Taq polimerase (BIOTOOLS). As condies de amplificao a que se submeteram as misturas, foram diferentes conforme os genes a amplificar. Para a amplificao dos genes gyrB e rpoD foram utilizadas as seguintes condies: desnaturao inicial durante 5 minutos temperatura de 94C, 35 ciclos de amplificao (desnaturao a 94c durante 15 segundos, hibridao a 55C durante 30 segundos e extenso a 72c durante 45 segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extenso final a 72C por um perodo de 5 minutos. Para a amplificao do 16S rRNA a mistura foi submetida inicialmente a um perodo de 5 minutos temperatura de 94 C para a desnaturao, de seguida foi submetida a 35 ciclos de amplificao (desnaturao a 94 C durante 15 segundos, hibridao a 55 C durante 30 segundos e extenso a 72 C durante 1 minuto e 30
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segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extenso final a 72 C por um perodo de 5 minutos. Para amplificao do gene gyrA foram utilizadas a seguintes condies: desnaturao inicial durante 5 minutos temperatura de 94 C, 35 ciclos de amplificao (desnaturao a 94 C durante 15 segundos, hibridao a 55 C durante 30 segundos e extenso a 72 C durante 45 segundos). Para finalizar submeteu-se a mistura a um ciclo de extenso final a 72 C por um perodo de 5 minutos.
3.3.3. Purificao dos produtos de PCR

A purificao dos produtos de PCR foi realizada com o Kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), seguindo o procedimento aconselhado pelo fabricante, cujos passos esto indicados no quadro 8.
Quadro 8 Protocolo de purificao dos produtos de PCR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11 Colocar 250 l de Buffer PB num tubo de 1,5 ml e adicionar o produto da PCR (50 l). Colocar a mistura numa coluna QIAquick. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m. Rejeitar o que passa para o tubo colector. Adicionar 750 l de Buffer PE coluna, para lavar. Centrifugar durante 1 minuto a 13000 r.p.m. Rejeitar e centrifugar novamente durante 1 minuto a 13000 r.p.m. Colocar a coluna num tubo de 1,5 ml. Adicionar 30 l de H2O M.Q. para eluir o DNA. Centrifugar novamente. Guardar a -20 C.
3.3.4. Sequenciao
Os produtos de amplificao purificados foram preparados com o Kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), segundo recomendaes do fabricante, sendo a reaco de sequenciao preparada para um volume final de 10 l,
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adicionando-se 4 l da soluo Premix; 4 l de DNA genmico e 2 l de primer a 2 M. Os oligonucletidos utilizados esto descritos no quadro 10. A mistura foi submetida a uma sucesso de 25 ciclos. As condies para cada ciclo foram: desnaturao a 96 C durante 10 segundos, hibridao a 50 C durante 5 segundos e extenso a 60 C durante 4 minutos.
Quadro 9 Oligonucletidos utilizados nas reaces de sequenciao
Posio gyrB 3F gyrB 7F rpoD 8F rpoD 9R gyrA 16S 0F 16S 9R 16S15R 8/27 926/908 1492/1510 334/354* 792/812* 740/757# 800/782# Sequncia (5`--- 3`) TCC GGC GGT CTG CAC GGC GT GGG GTC TAC TCG TTC ACC AA GT CAA TTC CGC CTG ATG C ATA GAA ATA ACC AGA CGT AAG TT MLPA analysis of the genus Aeromonas AGA GTT TGA TCA TGG CTCAG CCG TCA ATT CAT TTG AGT TT GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Referncia Yez et al., 2003 Yez et al., 2003 Soler et al., 2004 Soler et al., 2004 Martnez-Murcia et al. (MS submitted) Martnez-Murcia et al., 1999 Martnez-Murcia et al., 1999 Martnez-Murcia et al., 1999
Nota: * posio segundo numerao de E. coli (Huang, 1996). # posio segundo numerao de E. coli posio segundo numerao de E. coli (Stern et al., 1988).
Os produtos da reaco de sequenciao foram precipitados conforme a metodologia descrita no quadro 10.
Quadro 10 Protocolo de precipitao dos produtos de sequenciao 1. 2. Colocar num tubo de 1,5 ml: 2,5 l de EDTA (125 mM) e 30 l de Etanol a 100%. Adicionar os 10 l da reaco de sequenciao e misturar por inverso, deixando temperatura ambiente durante 15 minutos. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Centrifugar durante 20 minutos a 14000 r.p.m. temperatura de 4 C. Eliminar a soluo de etanol e EDTA Adicionar 100 l de etanol a 70%. Centrifugar durante 2 minutos a 14000 r.p.m a 4 C e eliminar na totalidade a soluo de etanol. Secar o pellet (10 minutos no Concentrator-Vacufuge Eppendorf). Armazenar o pellet seco a -20 C.
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Material e Mtodos
Para a ressuspenso do pellet, adiciona-se 20 l de formamida desionizada e deixa-se repousar 5 a 10 minutos temperatura ambiente. Centrifuga-se brevemente durante alguns minutos. Por fim, carrega-se a placa do sequenciador automtico ABI 3100 Avant Genetic Analiser (Applied Biosystems).
3.3.5. Anlise de sequncias e construo de dendogramas

As sequncias nucleotdicas obtidas foram analisadas pelo programa Chromas lite verso 2.0. O alinhamento foi realizado com o programa Clustal X, verso 1.8 (Tompson et al., 1997). As rvores evolutivas construram-se pelo mtodo de Neighbour-Joining (Saitou e Nei, 1987) com o programa MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis - verso 2.1 (Kumar et al., 2001).
3.4. Caracterizao bioqumica pelo API 20NE

____________________________________________________________________________________
As provas bioqumicas convencionais e o sistema de biotipificao numrico so mtodos de identificao que se baseiam nas caractersticas fentipicas dos microrganismos isto , os caracteres fisiolgicos, bioqumicos e estruturais que o microrganismo apresenta. O sistema de identificao utilizado foi o sistema de biotipificao nmerico API 20NE, que um sistema padronizado para identificao de bacilos Gram negativos no enterobacterias e no fastidiosos como Pseudomonas, Acinectobacter, Vibrio e Aeromonas. Este sistema composto por 8 testes convencionais, 12 testes de assimilao e uma base de dados. Para a realizao do sistema da bioMerieux API 20NE foi seguida a metodologia fornecida pelo fabricante, cujos passos esto indicados no quadro 11.
Quadro 11 Procedimento para a realizao do sistema API 20NE 1. Preparar a cmara de incubao, colocando aproximadamente 5ml de gua destilada nos alvolos para criar uma atmosfera hmida. Aps retirar a galeria do invlucro hermtico, coloca-la na cmara; 2. Preparao do inculo abrir uma ampola de meio de auxiliar (API 20/NE Mdium).
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Material e Mtodos
3.Preparar uma suspenso com opacidade superior a 4 da escala de McFarland. Transferir 1 ml desta suspenso para o meio auxiliar; 4. Homogeneizar; e distribuir o meio nas galerias enchendo at cpula; 5. Vedar com parafina lquida; 6 Inocular a 30 C durante 48 h; 7. Observar os resultados s 24 e 48h.
3.5. Perfil de Susceptibilidade a agentes antibacterianos
____________________________________________________________________________________
O perfil de resistncia aos agentes antibacterianos foi efectuado pelo mtodo de difuso em disco em Agar Muller-Hinton seguindo o procedimento do quadro 12. Foram testados vinte e sete antibiticos (Oxoid) pertencendo a diferentes grupos: -lactmicos: (i) Penicilinas-
Amoxicilina
(AML10);
Amoxicilina
/ cido Clavulnico
(AMC30); Piperacilina (PRL100); Piperacilina / Tazobactan (TZP110); Ticarcilina (TIC75);

Ticarcilina Cefoxitina
/ cido (FOX30);
Clavulnico
(TIM85); (ii) Cefalosporinas - Cefalotina (KF30); (CFP30);

Ceftazidime
Cefoperazona
(CAZ30);
Cefepime
(FEP30);
Cefotaxime (CTX30); Ceftriaxona (CRO30); (iii) Monobactmicos- Aztreonamo (ATM30); (iv) Carbapenemos (IMP10); AminoglicosdeosGentamicina
(CN10;)
Canamicina
(K30); Tobramicina (TOB10);
Amicacina (AK30); Estreptomicina (S) Quinolonas- Ciprofloxacina (CIP5); cido nalidixico (NA) Macrlidos- Eritromicina (E15); Cloranfenicol (C30); Tetraciclina (TE30); Sulfamidas- Co trimoxazol (SxT25); Fosfomicina (FOS).
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Material e Mtodos Quadro 12 Protocolo da tcnica de difuso em agar com discos de antibiticos
1.
Preparar uma suspenso bacteriana de cada estirpe em estudo a partir de 3 4 colnias em soro fisiolgico estril. A suspenso deve ter uma turvao equivalente a metade do grau 1 da escala de McFarland;
2.
Mergulhar uma zaragatoa na suspenso bacteriana retirando o excesso e semear em placas de agar MuellerHinton;
3.
Aplicar os discos dos antibiticos sobre a superfcie do meio de cultura, aps a secagem do inoculo e vai incubar a 37 C, durante 18 horas;
4. Com uma craveira medir os dimetros dos halos de inibio de crescimento para cada antibitico.
Os resultados foram analisados segundo as normas do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007) que segundo o dimetro do halo formado pela aco dos antibiticos classifica as estirpes em sensvel, resistente ou intermdio.
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4. RESULTADOS E DISCUSSO
___________________________________________________________
Resultados e Discusso
4.1. Estirpes isoladas

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Para a obteno das estirpes necessrias elaborao deste trabalho, foram realizadas 34 amostras de gua para consumo humano no tratadas, provenientes de dois Concelhos do Distrito de Vila Real, nomeadamente o Concelho de Vila Real e Vila Pouca de Aguiar, j referidas no captulo de Material e Mtodos. A sementeira realizou-se em meio de G.S.P (Glutamato Amido Vermelho Fenol) - MERCK 10230que segundo especificao do fabricante selectivo e diferencial para Pseudomonas spp. e Aeromonas spp. Das 34 amostras de gua no tratadas para consumo humano, utilizadas neste estudo com origem em fontes, poos e nascentes. No total foram obtidos 87 isolados, sendo que 43 destes revelaram oxidase e catalase positiva. Os restantes isolados (n=44), referem-se a bactrias com oxidase e catalase negativa, que no foram objecto de estudo neste trabalho. s estirpes isoladas foi atribuda uma codificao constituda por uma letra e um nmero. A letra faz referncia origem da amostra (F- Fonte, P- Poo e N Nascente), e o nmero corresponde colnia isolada. As estirpes foram depositadas na coleco de Aeromonas da Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro, no Departamento de Cincias Veterinrias e as amostras que foram seleccionadas para sequenciao, nas instalaes do Molecular Diagnstics Center (MDC), foi atribuda uma referncia dessa coleco. Na tabela 2 encontram-se os isolados (n=43), obtidos por amostra como tambm a sua origem. Pela anlise desta tabela verifica-se que o nmero de isolados obtidos nas fontes superior ao obtido nos poos. Este facto no significa obrigatoriamente que exista maior incidncia de isolados do gnero Aeromonas nas fontes.
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Tabela 2- Identificao da amostra, origem, localizao e referncia atribuda.
Amostra F1 F1B
Origem Fonte Centro Povo Fonte do Senhor
Localizao Guies Guies
Referncia dos Isolados F1 AL; F1b

F1BC 1a 1(MDC 2510); F1BC 1a2; F1BC2; F1BA1; F1BA2.1; F1BA2.2;F1BA3
F2 F4 F5B F7 F8 F9 F10 F11 F12 F13 F24 F25 F27 F28 P1 P2 P3 P4 P5 P6 Nascente 1
Fonte do Corgo Fonte da Estrada Fonte da Aldeia Fonte do Mouco Fonte Fonte do Largo Fonte da Cerdeira Fonte da Igreja Fonte Nova Fonte de Reguenga Fonte do Cruzeiro Fonte Central Fonte do Pao Fonte Poo Poo Poo Poo Poo Poo N. do Hospital
Piscinas Escariz Parada de Cunhos V. Pouca de Aguiar Capelos Soutelo de Aguiar Cerdeira de Jales Vreia de Jales Campo de Jales Alfarela de Jales Andres S. Cibro Torneiros Arroios Constantim Lordelo Jales Fonteita Jales Estao Constantim Lordelo
F2.1; F2. 2a2; F4A F5.B1; F5.B2 F7A; F7 R F8 F9 (MDC2464) ; F9Ap F10AA F11 B; F11 R F12 F13 F24. 2 F25. 1; F25. 2.1; F25. 3 F27. 1a; F27. 1b; F27. 2 F28 1a; F28 1b P1. a1 P2. 1a; P2.1b P3. 1a; P3. 1aa; P3.1b1 P4. 2 P5. 1.1; P6 N1.1
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4.2. Identificao por sequnciao de isolados bacterianos

____________________________________________________________________________________
4.2.1. Identificao de isolados por sequnciao do gene 16S rRNA

A sequenciao por 16S rRNA permite determinar as relaes filogenticas entre bactrias, sendo que este mtodo considerado o mais correcto na identificao dos microrganismos. Nove isolados foram seleccionados por apresentarem caractersticas
morfolgicas distintas; (i) colnias rosa ou laranja em GSP; (ii) Gram negativo; (iii) oxidase positiva; (iv) catalase positiva - presuntivas de Pseudomonas/ Plesiomonas. De referir ainda que no estudo do perfil de susceptibilidade, quatro dos isolados apresentaram resistncia ao imipenemo. Os resultados da identificao por sequenciao do gene 16sRNA para os nove isolados encontram-se na tabela 3.
Tabela 3 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene 16S rRNA Referncia dos isolados F1AL F1b F10AA F11Bp F11R F12 F13 F281a F281b Identificao das estirpes Chryseobacterium spp. Pseudomonas costantinii Chryseobacterium spp. Pseudomonas brenneri Pseudomonas brenneri Pseudomonas savastanoi Pseudomonas veronii Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens
Pela anlise desta tabela verifica-se que todos os isolados foram obtidos de fontes. Os quatro isolados seleccionados (F281a, F281b, F1AL e F10AA) apresentavam
um fentipo de resistncia ao imipenemo, contudo em GSP a morfologia das colnias era diferente entre eles, tendo os isolados (F281a, F281b) cor rosa e os isolados (F1AL, F10AA) cor laranja. Com estas caractersticas fentipicas e aps a sequenciao do gene 16sRNA dois dos isolados foram identificados como Pseudomonas fluorescens e os outros dois como pertencentes ao gnero Cryseobacterium spp.. De referir que os isolados (F1AL, F10AA) revelaram perfis de susceptibilidade diferentes aos antibioticos testados (Anexo I). O imipememo um carbapenemo de uso hospitalar e referido em vrios estudos (Chin-Chen Lai et al., 2007) como ltimo recurso para estirpes multiresistentes nosocomiais. Relativamente amostra F11 os isolados obtidos (F11Bp e F11R) apresentavam caractersticas morfolgicas distintas, e perfil de susceptibilidade idntico, no entanto a identificao dos isolados bacterianos foi a mesma (Pseudomonas
brenneri). Este facto refora a necessidade da utilizao de mtodos gentipicos para a
correcta identificao. Da tabela anlise da tabela 3 observa-se que as sequncias obtidas pertencem a 5 espcies do gnero Pseudomonas - P. costantinni, P. brenneri, P. savastonoi, P.veronni e P. fluorescens. Algumas espcies de Pseudomonas so patgenicas para os animais, incluindo o Homem. A espcie Pseudomonas aeruginosa considerada um importante patognico nosocomial em doentes com fibrose quistica (Spilker et al., 2004), e em queimaduras e feridas (Muller et al., 2009).
4.2.1. Identificao de isolados bacterianos por sequenciao do gene gyrB

Algumas espcies de bactrias no podem ser diferenciadas entre si apenas pela sequenciao do gene 16S rRNA. A utilizao de genes alternativos para a identificao molecular de certas espcies aumenta as potencialidades da sequenciao. A identificao da espcie a que pertencem as 34 estirpes foi realizada por sequenciao de genes housekeeping. Amplificou-se e determinou-se a sequncia nucleotdica do gene gyrB em 29 isolados presuntivos de Aeromonas: i) colnias amarelas em GSP, ii) Gram negativo, iii) oxidase e catalase positivam.
O fragmento de gyrB amplificado foi de 1100 nucleotidos (Figura 4), dos quais se sequenciaram entre 989 e 1100 pares de bases. Este fragmento representa aproximadamente 40% da sequncia completa (seguindo como referncia a sequncia de gyrB da E. coli, que apresenta 2415 nucletidos; Huang, 1996) e contm 70% dos nucletidos correspondentes ao domnio ATPase da protena. Foi comparado um fragmento contnuo de 989 pares debases, desde a posio 393 at posio1389. O nmero de posies variveis no fragmento de, gyrB analisado foi de 241 pb que corresponde a 24,4% do total comparado, ou seja, o nmero de posies conservadas (isto , com idntica composio) corresponde a 75% dos nucletidos sequenciados.
5 334
gyrB3F
1464
gyrB14R
Figura 4 Esquema do gene gyrB da E. coli. O fragmento azul indica a regio do gene que foi amplificada, as setas indicam a localizao dos primers utilizados e em negrito encontram-se as posies do primeiro e ltimo nucletido amplificado seguindo a numerao de E. coli (Huang, 1996).
Estas sequncias foram comparadas com as da base de dados do MDC para poder inferir acerca de quais as espcies representadas. A rvore filogentica obtida dessa anlise encontra-se na figura 4. Desta anlise observa-se que as sequncias obtidas pertencem a 6 espcies do gnero Aeromonas - Aeromonas hydrophila, Aeromonas bestiarum, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii e Aeromonas encheleia. Verifica-se ainda, a formao um cluster filogentico independente dos grupos pertencentes a todas as espcies actualmente reconhecidas neste gnero, pelo que poder representar uma espcie ainda no descrita. A estirpe deste grupo ser denominada de Aeromonas spp.
Pgina 49
54 37
98 52 29 38 24
MDC181 P5 1.1 MDC57 99 MDC41 MDC260 MDC39T MDC28T MDC100 MDC561

32 47 27
52
A. veronii /culicicola
MDC1TA
A. allosacharophila
MDC12
70
MDC45
MDC99
26
99
67 55
20 32 68 99
MDC17T MDC105 MDC103 MDC104 MDC10T MDC219 MDC241 MDC250 60 MDC273

99 99
81
A. sobria
A. media
MDC149T
MDC30 MDC9 MDC23 83 MDC15
A. popoffii
87
32
F27.1b F27.1a 58 63 MDC165 30 MDC162 25 P6 30 N1.1 F5B1 MDC34 29 82 MDC11T MDC4 36 MDC26 MDC19T 53 MDC148 55 MDC25 50
A. bestiarum
A. salmonicida
43 43 13 99
86 81 37 61 81 31 18
MDC44 MDC5 MDC24 MDC64 MDC16T-A.HG11 MDC63 MDC37T MDC14 MDC93 F9=MDC2464 MDC91T MDC92 MDC94 99 MDC95
42 50
A. encheleia
A. tecta
MDC20T
100 52
25
MDC74 MDC72 47 MDC73 MDC43
A. molluscorum
55 40 32
96
F1BC1a1 F7R MDC256 P2.1b F7A

MDC147 P2.1a
86
Aeromonas spp.
53
42 66 73
A. eucrenophila
99
MDC32T MDC21 98 MDC146 F8 MDC87T MDC88 A.

92 99
bivalvium
52 51
MDC574 MDC575 A.schubertii MDC2T MDC18-A.G501 MDC2374 100 MDC54T A. simiae 100 MDC55
96 38 84 30 63
MDC51 MDC52 MDC33 MDC40T MDC49

52 38
A. caviae
MDC48 MDC2475
F4A
23
MDC240
55
P3.1b1
51 59 54
75
36
MDC27 F25.2.1 MDC231 P4.2 MDC35T

67 41 25
A. hydrophila
40
98
99 67 45 23 53
46
MDC13T MDC578 MDC582 MDC580 MDC579 99 MDC581 MDC38T MDC36 MDC90 MDC89 MDC576 MDC577
A. jandaei
A. trota
45 37 72
36
MDC317 MDC573 MDC442 55 MDC259 MDC2406 58 MDC310 39 MDC47 55 MDC318
A. aquariorum
0.02
Figura 5- rvore filogentica obtida com a sequnciao do gene gyrB das estirpes isoladas neste estudo
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Na tabela 4 esto representadas as espcies de Aeromonas identificadas por sequenciao do gene gyrB, bem como a referncia dos isolados.
Tabela 4 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene gyrB
Referncia dos isolados F1BC1a1 (MDC2510); F1BC1a2; F1BC2; F1BA1; F1BA3 F1BA2.1; F1BA2.1 F9 (MDC2464); F9Ap P5. 1.1 F4A P3. 1b1 P4. 2 F25. 1; F25. 2.1; F25. 3; F24. 2 F7R F7A F8 P2. 1a P2. 1b P6 F5.B1; F5.B2 F27. 1a; F27. 2 F27. 1b N1.1
Identificao das espcies por gyrB
Aeromonas spp. Aeromonas encheleia Aeromonas tecta Aeromonas veronii Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Aeromonas eucrenophila Aeromonas eucrenophila Aeromonas eucrenophila Aeromonas eucrenophila Aeromonas eucrenophila Aeromonas bestiarum Aeromonas bestiarum Aeromonas bestiarum Aeromonas bestiarum Aeromonas bestiarum
Neste estudo e de acordo com a tabela 4 e 5 a espcie com maior incidncia foi a espcie Aeromonas hydrophila (n=10), com uma percentagem de 29,4%. Estes
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resultados so semelhantes aos obtidos por Villari e colaboradores em 2003 num estudo realizado a partir de guas naturais minerais. No Mxico, Castro-Escarpulli e colaboradores (2003), a partir de guas de diferentes origens referem percentagens semelhantes para a espcie de Aeromonas hydrophila, e os mesmos resultados foram referenciados por Tequianes-Bravo et al., 2005 em amostras de gua potvel. Para estes autores a alta frequncia de Aeromonas hydrophila sugere que guas contaminadas por estes microrganismos apresentam um potencial risco de infeces ao Homem, dado que algumas estirpes de Aeromonas possuem um vasto conjunto de factores de virulncia como enterotoxinas, citotoxinas e aerolisinas (Nzeako et al., 1991; Gonzlez-Serrano et al., 2002). Num trabalho de Kosal e colaboradores (2007) a prevalncia desta espcie foi de 46%, no entanto num estudo efectuado por Razzolini e colaboradores (2008) com o intuito de detectar Aeromonas e suas toxinas em guas de reservatrios e fontanrios os valores obtidos foram de 15,7%. Neste trabalho e relativamente s espcies Aeromonas bestiarum, Aeromonas eucrenophila e Aeromonas caviae (n=2), a percentagem obtida foi de 21%, 15% e 6% respectivamente. De Aeromonas encheleia, Aeromonas veronii, Aeromonas tecta apenas foi isolada 1 estirpe pertentente a cada uma das espcies. Uma particularidade dos resultados deste estudo reside no facto de todas as espcies consideradas patognicas para o Homem (Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biotype sobria e Aeromonas caviae), foram por ns identificadas o que de extrema importncia quando se considera a sua ampla distribuio ambiental, tendo como origem poos. Clnicamente estas espcies so as mais importantes (Figueras, 2005; Edberg et al., 2007
4.2.2. Identificao de isolados bacterianos por sequnciao do gene gyrA

A sequenciao nucleotdica do gene gyrA (Martnez-Murcia et al. (MS submitted) foi realizada a 5 estirpes bacterianas presuntivas de Aeromonas e os resultados da sequenciao esto representadas na tabela 5.
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Tabela 5 - Isolados bacterianos identificados por sequenciao do gene gyrA Referncia dos isolados F2.1 F2.2a2 P1.a1 P3.1a P3.1aa Identificao das estirpes gyrA Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila Aeromonas caviae Aeromonas caviae
Da anlise da tabela 5 podemos referir que a espcie Aeromonas hydrophila foi isolada tanto em Fontes como em Poos, o que bem demonstrativo da sua ubiquidade. A espcie Aeromonas caviae foi tambm por ns identificada. de salientar que ambas as espcies A. hydrophila e A. caviae pertencem a uma das trs espcies consideradas clinicamente patognicas para o Homem (Borchardt et al., 2003; Tsai et al., 2006), sendo que A. hydrophila est intimamente associada a septicmia em doentes queimados (Chin-Cheng Lai et al., 2007).
4.3. Isolados identificados como Aeromonas spp.

________________________________________________________
Os resultados da anlise filogentica pela sequenciao do gene gyrB revelaram a presena de um grupo de estirpes distinta de todos os grupos filogenticos que representam as espcies de Aeromonas descritas e/ou dos grupos de homologia DNA-DNA formados dentro deste gnero. Como forma de confirmar a formao desse grupo independente constituido pelos isolados de Aeromonas spp., foi realizada a sequenciao do gene rpoD para a estirpe MDC 2510. O fragmento de rpoD amplificado foi de 859 pb, dos quais foram sequenciados entre 722 a 850 nucletidos, o que representa cerca de 45% da protena no englobando o centro activo da protena. Quando se realizou o alinhamento desta estirpe com as sequncias da base de dados do MDC foi comparado um fragmento contnuo de 683 pb, este apresenta 252 posies variveis, o que corresponde a 36,9% da sequncia total comparada. A rvore filogentica obtida dessa anlise encontra-se na figura 6.
Pgina 53
91
32
22
58
48
52
42
55
100
55
79
53
43
98
100
MDC30 MDC9 MDC23 A. popoffii MDC15 100 81 MDC149T MDC165 MDC34 89 MDC4 93 A. bestiarum 68 MDC11T 66 MDC162 MDC26 MDC148 100 MDC25 78 A. salmonicida MDC44 99 36 MDC19T 74 MDC5 98 MDC27 34 MDC240 39 MDC48 A. hydrophila 100 MDC231 MDC35T 55 MDC2475 57 MDC317 99 28 MDC259 MDC318 100 MDC573 A. aquariorum MDC310 36 MDC47T 46 34 MDC442 85 MDC2406 46 MDC105 61 MDC104 A. sobria 100 MDC17T MDC103 100 MDC-579 46 MDC581 81 MDC13T A. jandaei 100 MDC580 MDC578 100 MDC582 76 MDC577 57 MDC8 39 MDC90 38 A. trota MDC38T 100 MDC576 MDC3 65 MDC1T 48 MDC99 MDC45 14 A. allosaccharophila 71 MDC100 MDC12 100 MDC561 19 MDC28T 39 MDC181 A. culicicola/ A. veronii 45 MDC41T MDC57 24 17 MDC39T 42 MDC260 100 MDC51 56 MDC52 A. caviae MDC33 100 34 MDC49 MDC40T 40 MDC250 39 MDC273 97 A. media MDC241 MDC219 MDC10T 62 MDC24-HG11 Aeromonas sp. (HG11) 45 MDC63-encheleia-HG11 63 MDC16-HG11 MDC37T 100 100 A. encheleia MDC14 MDC64 100 MDC94 34 MDC95 60 A. tecta MDC92 100 MDC91T MDC93 F1BC1a1 Aeromonas MDC147 MDC256 100 A. eucrenophila MDC146 24 34 MDC32T 100 MDC21 100 MDC87 A. bivalbium MDC88 97 MDC72 MDC74 A. molluscorum 100 MDC73 63 MDC20T 60 MDC43 70 MDC55 100 MDC54T A. simiae MDC2374 MDC18-HG13 MDC574 100 100 MDC575 A. schubertii 45 MDC2T
53 76 100
sp.
0.02
Figura 6. Arvore filogentica baseada na sequncia do gene rpoD.
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Os resultados obtidos indicam que os isolados de Aeromonas spp. representam linhas figenticas independentes das descritas at ao momento. A utilizao de diversos genes que codificam funes essenciais (housekeeping) como gyrB, gyrA e rpoD, graas a sua maior variabilidade intra e interespecfica, tm demonstrado ser ferramentas teis para a diferenciao da taxonomia do gnero Aeromonas (MartnezMurcia, 2008). As espcies de Aeromonas mais relacionadas com este novo grupo formado so Aeromonas tecta e Aeromonas eucrenophila.
4.4. Caracterizao fenotpica da estirpe MDC 2464

4.4.1 Mtodos bioqumicos
Procedeu-se caracterizao fentipica da estirpe com a referncia MDC 2464 por mtodos bioqumicos, por se tratar de uma espcie ainda no descrita em isolados ambientais ao contrrio do descrito por Demarta e colaboradores (2008) a espcie Aeromonas tecta foi descrita em isolados clnicos, mediante utilizao de genes housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia. Os perfis bioqumicos foram comparados com a espcie tipo F518T (MDC 91) obtida de amostras de fezes de criana com diarreia em 1992, e outras estirpes de Aeromonas (MDC92, MDC93, MDC94, MDC95). Os resultados da caracterizao fenotpica esto representados na tabela 6. O isolado F9Ap que corresponde estirpe com a referncia MCD 2464 oxidase e catalase positiva, resistente ao agente vibriosttico O/129 (150g), apresenta crescimento nas concentraes de 0 e 3% de NaCl. Fermenta a glucose com produo de cido e gs, e outros carboidratos como a maltose, manose e trealose. negativa para a lactose, sacarose, xilose celobiose e rafinose. Para as provas bioqumicas complementares ser de referir, que a estirpe analizada reduz os nitratos a nitritos, no degrada o aminocido triptofano, e revelou reaco negativa para a urease e VogesProskaeur. Constata-se tambm a hidrlise da gelatina, esculina (48 horas), e lisina descarboxilase (LDC). Relativamente ao teste da ornitina descarboxilase (ODC) obtivemos um resultado positivo na estirpe tipo (MDC 91), como tambm para o isolado deste estudo (MDC 2464). O resultado desta prova difere do descrito por Demarta e colaboradores (2008) que referem poder ser varivel. Todas as provas bioqumicas no apresentaram diferenas.
Tabela 6. Perfil bioqumico das estirpes de A. tecta e do isolado MDC 2464

Estirpes Provas Ferm/Gs Glucose Lactose Manose Maltose Sacarose Xilose Celobiose Trealose Rafinose Inositol Sorbitol Manitol Esculina ODC LDC Indol Metil Red Voges-Proskaeur Urease Nitratos Gelatina Citrato TSI +/+ -/+/+ +/+ -/-/-/+/+ -/-/-/+/+ + + + + + + K/A Ferm/Gs +/+ -/+/+/+ -/-/-/+/-/-/-/+/+ + + + + + + K/A Ferm/Gs +/-/+/+/-/-/-/+/-/-/-/+/+ + + + + + + K/A Ferm/Gs +/+ -/+/+ +/+ -/-/-/+/+ -/-/-/+/+ + + + + + K/A Ferm/Gs +/+ -/+/+ +/+ -/-/-/+/+ -/-/-/+/+ + + + + + + K/A Ferm/Gs +/+ -/+/+ +/+ -/-/-/+/+ -/-/-/+/+ + + + + + K/A
(+ 48h)
MDC91
MDC92
MDC93
MDC94
MDC95
MCD2464
Legenda: ODC (Ornitina descarboxilase); LDC (Lisina descarboxilase); TSI (Triple Iron Sugar); + = positivo; - = negativo Nota: K/A- Acidez da Glucose e alcalinizao da Lactose e Sacarose
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4.4.2. Sistema de biotipificao numrico API 20NE

Procedeu-se tambm caracterizao bioqumica do isolado MDC 2464, recorrendo-se utilizao de um sistema miniaturizado sob a forma de kit, o API 20NE (bioMerieux) (figura 7). A metodologia est descrita no quadro 11 (Material e Mtodos). Este procedimento justifica-se por se tratar de uma espcie ainda no descrita em isolados ambientais ao contrrio do descrito por Demarta e colaboradores (2008), em que a espcie Aeromonas tecta foi descrita em isolados clnicos, mediante utilizao de genes housekeeping como ferramentas de taxonomia e filogenia.
Figura 7- Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE do isolado MDC 2464
Pela figura 7 acima referida, possvel observar que o isolado de Aeromonas tecta caracterizado bioquimicamente por API 20NE, revela pelo perfil de resultados a ocorrncia da degradao do aminocido triptofano, ao contrrio do verificado quando se caracterizou fenotipicamente esta estirpe, o que bem demonstrativo da contradio dos resultados obtidos e da ambiguidade da identificao de espcies por mtodos fenotpicos. Para as restantes provas, os resultados obtidos foram similares aos estudos realizados com o intuito de caracterizar bioqumicamente a estirpe por mtodos bioqumicos convencionais.
4.5. Caracterizao bioqumica da espcie de Aeromonas spp.

4.5.1. Sistema de biotipificao numrica API 20NE
A espcie identificada como Aeromonas spp. refere-se aos isolados (F1BC1a1- MDC 2510 e F1BC1a2. Esta caracterizao bioqumica efectuou-se por se tratar de uma
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espcie ainda no descrita no gnero Aeromonas. Na figura 8 est representado o perfil numrico dos isolados anteriormente referidos.
Figura 8- Perfil do sistema de biotipificao numrico API 20NE dos isolados FBC1a1- MDC 2510 - e FBC1a2
Pela figura 8 possvel observar que os resultados dos isolados de Aeromonas spp., apresentam perfil bioqumico idntico, com excepo da arginina dihidrolase que para o isolado FBC1a (MDC 2510) deu resultado positivo, ao contrrio do verificado para o isolado FBC1a2) com reaco negativa s 24 horas, mas s 48 horas o resultado desta prova foi positivo. Em ambos os isolados ocorreu a reduo dos nitratos, indol e urease positiva, hidrlise da esculina e gelatina, fermentao da glucose. De salientar que o perfil numrico obtido para os isolados da espcie A. tecta (F9 e F9Ap) e Aeromonas spp. (F1BC1a1 e F1BC1a2), com leitura s 24 horas no foi possvel obter qualquer identificao pela consulta no livro ndex do sistema de biotipificao respectivo. Este facto corrobora a necessidade de se fazer a identificao por mtodos genticos como referido (Figueras et al., 2000; Castro-Escarpulli et al., 2003; MartnezMurcia et al., 2007; Hidalgo et al., 2008). A caracterizao bioqumica apresenta problemas ao nvel das bactrias do gnero Aeromonas, dado que o mtodo de biotipificao numrica utilizado tem como base de dados, resultados de ensaios em estirpes clnicas. Assim e de acordo com Daz e colaboradores (2006) referido que num laboratrio de anlises microbiolgicas de guas, Aeromonas hydrophila a espcie mais frequentemente identificada (62,5%), Aeromonas caviae (20,3%), Aeromonas veronii biovar sobria (9,3%), e Aeromonas spp. (7,8%). Tal como referido por vrios autores sabe-se que os sistemas comerciais para identificao bioqumica das espcies de Aeromonas so errneos, existindo mesmo sistemas que apenas incluem nas suas bases de dados a espcie Aeromonas hydrophila (Vivas et al., 2000). No nosso trabalho essa dificuldade foi constatada, em ambas as
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espcies (Aeromonas tecta e Aeromonas spp.). A escassa coincidncia entre os mtodos de identificao fenotpica e gentica evidenciada pela falta de provas fenotpicas claras e concisas para diferenciar entre espcies de Aeromonas. Diferenas entre a identificao fenotipica/gentica foram reportadas em estudos anteriores (Abbott et al., 1998; Vivas et al., 2000; Park et al., 2003; Daz et al., 2006), e est de acordo com os nossos resultados. Hidalgo e colaboradores (2008) referem que 73,5% dos isolados identificados fenotipicamente como A. hydrophila, mediante identificao gentica resultaram em A. hydrophila (22,4%), A. sobria (28,6%) e A. bestiarum (22,5%).
4.6. Perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos

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Foi realizado o perfil de susceptibilidade, pelo mtodo de difuso em disco (Quadro 12, Material e Mtodos) a 27 antibioticos de vrios grupos em 34 estirpes. As tabelas com os perfis individuais das estirpes em estudo encontram-se no anexo II. Os resultados globais do perfil de susceptibilidade dos isolados obtidos apresentam-se na figura 9.
TE STX C E S K TOB CN AK CIP NA FOS FEP CFP CRO CTX CAZ FOX KF IPM ATM TZP PRL TIM TIC AMC AML
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90% 100%
Resistente
Sensvel
Intermdio
Figura 9. Perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos dos isolados de Aeromonas em estudo

Ao longo dos vrios anos, estudos relativos ao perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos tm sido efectuados com estirpes Aeromonas de origem clnica e ambiental (Overman e Janda, 1999; Huddleston et al., 2006; Pal et al., 2006). Pela anlise da figura 9 podemos verificar que as estirpes estudadas apresentaram uma percentagem elevada de resistncia amoxicilina assim, os ndices obtidos foram de 100%. Estudos anteriores (Vila et al., 2002; Radu et al., 2003) referem 100% de resistncia a estes antibiticos, referindo que as estirpes do gnero Aeromonas so intrinsecamente resistentes penicilina (Hatha et al., 2005). No entanto, nos trabalhos de Saavedra e colaboradores (2004) apresentam-se valores de 35% de sensibilidade a estes antibiticos. Em relao cefalotina, cefalosporina de primeira gerao, todas as estirpes foram resistentes a este antibitico, resultados obtidos tambm por Bizani e Brandelli (2001). Verificmos ainda que 85% das estirpes testadas eram resistentes ticarcilina, estando estes resultados em concordncia com os obtidos por Blasco e seus colaboradores em 2008, num estudo onde foi comparada a multiresistncia de patognicos (Aeromonas spp., Pseudomonas spp. e Legionella spp.) isolados em gua de reservatrios, gua engarrafada e sistemas de refrigerao. Podemos constatar que as estirpes de Aeromonas estudadas apresentaram uma elevada percentagem de sensibilidade ureidopenicelina (piperaciclina). semelhana do referido por Vila et al., (2002) e Fosse et al., (2003) verificamos que as ureidopenicelinas se revelaram mais activas do que as carboxipenicelinas contra as estirpes testadas, como se pode observar na figura 16, a percentagem de estirpes sensvel piperaciclina de 100%, enquanto a percentagem de estirpes sensvel ticarcilina de 5%. Relativamente s cefalosporinas testadas verificamos que a percentagem de estirpes resistentes cefalotina (100%), a nica cefalosporina de 1 gerao testada, estava de acordo com os valores obtidos noutros trabalhos (Bizani e Brandelli, 2001). No que se refere cefalosporina de 2 gerao testada, a cefoxitina, 9% das estirpes analisadas eram resistentes. No estudo de Costa e colaboradores em 2002 com estirpes obtidas num matadouro de frangos e no estudo de Pal e colaboradores em 2006 com estirpes obtidas de alfaces foram obtidos valores de resistncia cefoxitina (32%) superiores aos obtidos no nosso estudo. Para as cepalosporinas de 3 e 4 gerao
obtivemos valores de 100% de sensibilidade revelando-se assim efectivas contra Aeromonas spp.. Estes resultados semelhantes aos obtidos em vrios estudos, (Kmpfer et al., 1999; Bizanni e Brandelli, 2001; Fosse et al., 2003; Sader e Jones, 2005), em que todas as estirpes analisadas querem de origem ambiental, quer de origem clnica eram susceptveis a este subgrupo de antibiticos. Por outro lado os resultados por ns obtidos de isolados de Aeromonas spp., em guas no tratadas para consumo humano, esto de acordo com os de Ottaviani e colaboradores (2006) num estudo que visou pesquisar a presena deste gnero em melhixes no mar Adritico. Constatamos ainda, que da associao do inibidor de -lactamases, o cido clavulnico com a aminopenicilina, amoxicilina, permitiu reduzir a resistncia deste antibitico de 100% para 56% o que revela a sua eficincia. Este inibidor quando associado carboxipenicilina, ticarcilina, essa diminuio no foi to significativa pois passou de 85% para 68%, o que corresponde a uma reduo de 17%. Estes resultados esto de acordo com os obtidos noutros estudos (Vila et al., 2002; Saavedra et al., 2004). Relativamente ao tazobactam, constatamos que da sua associao ureidopenicelina (piperaciclina) no houve qualquer eficincia, pois todas as estirpes eram sensveis. Os nossos resultados revelaram que 100% das estirpes estudadas eram sensveis ao aztreonamo o que est de acordo com outros estudos publicados (Ko et al., 1996; Kmpfer et al., 1999; Sader e Jones, 2005). No entanto, no estudo de Koksal e colaboradores (2007), com estirpes isoladas de gua para consumo em IstambulTurquia, para este antibitico foram obtidos ndices de sensibilidade de 89% e no trabalho de Daz e colaboradores (2006), com estirpes isoladas de gua apenas 58% das estirpes eram sensveis ao aztreonamo. Para o carbapenemo testado, imipenemo, 3% das estirpes apresentaram resistncia, 12% foram consideradas intermdias e as restantes 84% sensveis. Estes resultados so de realar pelo facto de este antibitico ser de ltimo recurso em estirpes nosocomiais multiresistentes, nomeadamente Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumanni como referido em vrios trabalhos (Hughes et al., 2002; Hsueh et al., 2005; Poirel e Nordmann (2006); John e McGowan (2006). Em estudos anteriores obtiveram-se, no que se refere ao imipenemo, estirpes de origem clnica e ambiental com resistncia a este carbapenemo (Hughes et al., 2002; Obi et al., 2007; Koksal et al., 2007). De referir
que no nosso estudo a estirpe Aeromonas eucrenophila foi a que apresentou resistncia a este agente antibacteriano. No presente trabalho verificou-se que para as quinolonas testadas todas as estirpes de Aeromonas eram sensveis ciprofloxacina (Penders e Stobberingh, 2008), enquanto a sensibilidade revelada ao cido naladxico foi de 91%. Castro-Escarpulli e colaboradores (2003) reportam que 58,5% das estirpes de peixe congelado para consumo, que analisaram, eram resistentes ciprofloxacina, Koksal e colaboradores (2007) referem para ambos os antibiticos valores de 1% e 2% respectivamente. Em vrios estudos referida a susceptibilidade das estirpes de Aeromonas, aos aminoglicosdeos testados com diferentes origens, (Kmpfer et al., 1999; Vila et al., 2002; Pal et al., 2006). Neste estudo, a estreptomicina revelou ser o menos efectivo, com 44% das estirpes analisadas a apresentarem-se resistentes. Em 2007 Akinbowale e colaboradores obtiveram valores de resistncia semelhantes (33%) em estirpes isoladas de trutas na Austrlia. Em contrapartida, outros autores, referiram valores de resistncia para este antibitico superiores, 65% em estirpes isoladas de gua de dois rios Europeus (Goi-Urriza et al., 2000), e 75% em estirpes isoladas de peixe congelado para consumo, no Mxico (Castro-Escarpulli et al., 2003). Para os restantes
aminoglicosdeos verificamos que 100% das estirpes estudadas eram sensveis amicacina, canamicina, gentamicina, e tobramicina, valores comparveis aos obtidos em outros estudos (Overman e Janda, 1999; Castro-Escarpulli et al., 2003). No nosso estudo detectamos um elevado nmero de estirpes resistentes eritromicina (89%) semelhana do reportado noutros trabalhos (Kmpfer et al., 1999; Blasco et al., 2008), Koksal e colaboradores (2007) obtiveram 48%. Verificamos ainda que 11% das estirpes revelaram sensibilidade a este antibitico. Alguns autores referem a existncia de uma resistncia intrnsica do gnero Aeromonas eritromicina (Kmpfer et al., 1999). Relativamente ao sulfametoxazol-trimetoprim, 97% das estirpes eram sensveis a este antibitico. Nos estudos de Pal e colaboradores (2006) as estirpes analisadas de origem alimentar eram todas sensveis, mas segundo Castro-Escarpulli e colaboradores em 2003 obtiveram valores de resistncia de 49%, valores muito superiores aos obtidos por ns (3%). No que se refere ao cloranfenicol e tetraciclina verificou-se que todas as estirpes analisadas, eram sensveis a estes antibiticos o que est de acordo com (Penders e Stobberingh, 2008). De referir no entanto que Costa e
colaboradores (2002) descrevem que 75% das estirpes obtidas em diferentes pontos da linha de abate de aves, eram resistentes tetraciclina enquanto Koksal e colaboradores (2007) num estudo efectuado em guas para consumo obtiveram valores de resistncia de 12% para este antibitico. A existncia de multiresistncia tem sido referida em estudos anteriores (Morita et al., 1994; Radu et al., 2003; Ottaviani et al., 2006) e est de acordo com os nossos resultados. Neste trabalho todas as estirpes estudadas apresentaram resistncia a trs ou mais antibiticos.
Tabela 7- Resistncia a mltiplos antibiticos das espcies de Aeromonas
Fnotipo de Resistncia
AML, KF; E AML; AMC; KF AML; TIC; KF; E AML; AMC; KF; S AML; TIC; TIM; KF; E AML; AMC; TIC; TIM; KF AML; AMC; TIC; KF; E AML; TIC; KF; S; E AML; AMC; TIC; TIM; KF; E AML; TIC; TIM; KF; S; E; AML; AMC; TIC; TIM; KF; S AML; TIC; KF; S; E; SXT AML; AMC; TIC; TIM; KF; S; E AML; TIC; TIM; KF; FOX; NA; E AML; AMC; TIC; TIM; IMP; KF; S; E AML; AMC; TIC; TIM; KF; FOX; NA; S; E F8; F5B2; F27.2 F7R P6 F7A
Isolados
F2.1; F1BA2.1; F1BA2.2 F2.2a2 F5B1 F27.1b; F1BC1a1; F1BC1a2 P2.1a; F4A; F24.2; F25.1; F25.2.1; F25.3; N1.1; P31b1 F1BC2; F1BA1; F1BA3 P5.1.1 F27.1a F9; F9Ap; P4.2 P1a1 P2.1b P3.1a; P3.1aa
Huddleston e colaboradores (2006) referem no entanto a inexistncia de estirpes multiresistentes. Dos 34 isolados submetidos ao teste de sensibilidade a antimicrobianos, 38% apresentaram resistncia a seis antibiticos e 11,7% a sete, em
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combinaes diferentes. de referir que em 6% das estirpes analizadas se detectou multiresistncia a nove antibiticos, sendo que a combinao dos antimicrobianos verificada a mesma. Estas estirpes foram identificadas como Aeromonas caviae, dados estes que corroboram com os obtidos para a mesma espcie por Costa e colaboradores (2003). Apesar da espcie A. caviae ser considerada de menor patogenicidade, quando comparada A. hydrophila a presena de estirpes dessa espcie, resistente a um amplo espectro de antimicrobianos, deve ser motivo de preocupao. A estirpe onde se detectou a ocorrncia de resistncia a oito antibiticos, entre os quais imipenemo, foi a espcie Aeromonas eucrenophila. A multiresistncia amoxicilina, cefalotina e eritromicina foi detectada em 9% das estirpes analisadas, verificando-se a presena de resistncia amoxicilina e cefalotina em 100% das estirpes.
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5. CONSIDERAES FINAIS
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Consideraes Finais
As amostras de gua no tratada para consumo humano, utilizadas neste trabalho so provenientes de fontes, poos e nascentes, cujo controlo e frequncia na monitorizao da qualidade microbiolgica destas guas dever ser de acordo com o Decreto-lei 306/2007, sendo esta no entanto escassa ou nula. Pois estas guas no so distribudas pelas entidades gestoras responsveis por essa distribuio, logo no existe obrigatoriedade da realizao desta anlise. Desta forma o risco de transmisso de bactrias patognicas ou comensais elevado. O isolamento e a identificao de diferentes espcies de Aeromonas nas guas no tratadas nesta regio, sugerem uma elevada prevalncia destas espcies, e refora a afirmao dos riscos que estas guas representam para a sade pblica pelo seu consumo directo ou como veculo de contaminao de alimentos. A sequenciao dos genes gyrB, gyrA e rpoD utilizados na metodologia para identificao dos 34 isolados obtidos neste estudo mostraram ser bastante eficazes, o que possiblitou a identificao de sete espcies distintas Aeromonas hydrophila, Aeromonas eucrenophila, Aeromonas caviae, Aeromonas tecta, Aeromonas veronii, Aeromonas bestiarum e Aeromonas encheleia. de referir que a espcie Aeromonas tecta ainda no tinha sido descrita em isolados ambientais, tendo sido possvel a sua deteco neste trabalho pelas ferramentas utilizadas. A anlise filogentica demonstrou a existncia de um grupo de estirpes que, com base na sua relao com as restantes espcies do gnero Aeromonas poder representar uma espcie no descrita deste gnero. No que se refere aos perfis de susceptibilidade aos antibiticos testados conclui-se que a piperaciclina, o aztreonamo, as cepalosporinas de 3 e 4 gerao e a ciprofloxacina apresentavam boa actividade contra Aeromonas spp. Detectou-se multiresistncia em todos os isolados, sendo de salientar que em 6% das estirpes analisadas foi observada multiresistncia a nove antibiticos. Os resultados alertam para o facto de que isolados da mesma espcie podem apresentar comportamentos de susceptibilidade diferente aos grupos de antibiticos.
6. BIBLIOGRAFIA
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Pgina 90
ANEXOS _______________________________________________________
Anexo I
Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por 16s RNA
AML
AMC
TIC
TIM
PRL
TZP
ATM
IMP
KF
FOX
CAZ
CTX
CRO
CFP
FEP
FOS
NA
CIP
AK
CN
TOB
SXT
TE
F1AA F1b F10AA F11B F11R F12 F13 F281a F281b
R R R R R R R R R
R10 R R R R R R R R
R R R R R R R R R
R10 R R R R R R R R
R11 S R17 S S S S S S
S S R17 S S S S S S
R S R R R R R S S
R S R11 S S S S R11 R11
R R R R R R R R R
R13 R14 R S R R R R R R S S S S S S S S
R S R R R R10 R R12 R11
R R10
R10 S
S S R S S S S S S
R S R S S S S R R
S S S S S S S I14 I17
S S S S S S S S S
R14 S R14 S S S S S S
I14 S R9 S S S S S S
R S R S S S S S S
R S
R S
I18 R R8 R R R R R R
S I16 R12 R10 R I16 R10 R11 R12
S S S S S S S S S
S S R9 S S S S S S
R12 R15 R R R R I15 I17 S S S S I19 I18
R10 R10 S S S S S S S S I14 S S S
Anexo II
Perfil de susceptibilidade a antibiticos dos isolados identificados por gyrB, gyrA e rpoD
AML
AMC
TIC
F2.1 F2. 2a2 P3. 1a P3. 1aa P3. 1b1 F4A F7R F7A F9 F9Ap P5.1.1 P2.1b P4.2 P1.a1 N1.1
R R R R R R R R R R R R R R R
S R R13 R13 R11 R13 R10 R9 R7 R R11 R10 R10 I15 R
R R R10 R9 R9 R S I16 R R R R13 R13 R10 R
TIM 10
PRL
TZP
ATM
IPM
KF
FOX
CAZ
CTX
CRO
CFP
FEP
FOS
NA
CIP
AK
CN
TOB
SXT
TE
S S S S S19 S S S S S S S S S S
S S S S S S S S S S S S S S S
S S S S S S S S S S I15 R13 I15 S S
R R R10 R12 R R R R R8 R8 R R R R R
S S R R I16 S S S S S S S S R S
S S S S S ND S S S S S S S S S
S S R R S S S S S S S S S R S
S S R11 R11 I14 S I13 R11 R11 R11 R11 R R10 S

15
R S R12 R11 R14 R S S R14 R14 S R R R16 R
R R10 R11 R10 R12 S S R R R9 R12 R12 R12 R
ND-No determinado
AML
AMC
TIC
TIM
PRL
TZP
ATM
IMP
KF
FOX
CAZ
CTX
CRO
CFP
FEP
FOS
NA
CIP
AK
CN
TOB
SXT
TE
F8 F5B1 F5B2 F24.2 F25.1 F25.2.1 F25.3 F27.1a F27.1b F27.2 P2.1a P6 1BA3 1BA2.1 1BA2.2 1BC2 1BA1 F1BC1a1 F1BC1a2
R R R R R R R R R R R R
10
S R13 I16 R R R R I15 S20 I16 R10 I15 I I

15 16 18
S R I18 R R R R R I16
S S S R R R R I16 I18
S S S S S S S S S S S S
10 11 13 13 22 24 22 22
S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
S S S S S S S S S S
R R R R
S S S S
18
S16 17
S S S S S S S
16
11
S S S S S S S R S S S S S S S S S S S
R11 S R R R R R S S S S S
R14 S R10 S R8 R R R S S S S S S S S S S S S S
R11 R12 S R11 R12 S S I12 S R S S

10 15 15 10 12 11 11
R12 S R13 R12 R12 S R R R R R R R

6
R15 S R13 S R R R R R R R R
16 15 12 15 12
I15 R S S S I
15
R R R R R R R R
S S S S S S S S
R R R R R R R I I I
R R R R R I I
S S S S S S S
S I
15
S S S S
R R R R
15 17 17
12
22
S S S
18 17

Caracterização de Aeromonas Spp. Isoladas de Águas Não Tratadas para Consumo Humano

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Caracterização de Aeromonas Spp. Isoladas de Águas Não Tratadas para Consumo Humano

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CARACTERIZAO DE AEROMONAS SPP.

ISOLADAS DE GUAS NO TRATADAS PARA CONSUMO HUMANO

Dissertao de Mestrado em Biologia Clnica Laboratorial

Maria Ermelinda de Aguiar Ribeiro

Universidade de Trs-os-Montes e Alto Douro Vila Real, 2008

Instituio Curso Titulo Autor Orientadores

As Doutrinas espostas no presente trabalho so da exclusiva responsabilidade do autor

TRABALHOS APRESENTADOS COM BASE NESTA TESE

v vi vii viii ix x xiii xiv xv

Figura 9 - Perfil de susceptibilidade a diferentes antibiticos dos isolados de Aeromonas em estudo 59

NDICE DAS TABELAS

1.1. Qualidade da gua para consumo

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.2. O gnero Aeromonas

1.2.1. Ecologia e patogenicidade

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.2.2. Taxonomia e Filogenia

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.2.3. Mtodos de Identificao

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.3. Agentes antimicrobianos

1.3.1. Principais mecanismos de resistncia

1.3.2. Antibiticos antiparietais

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.3.3. Inibidores de -lactmicos

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.3.4. Antibiticos inibidores da sntese proteica

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.3.5. Antibiticos inibidores da sntese dos cidos nucleicos

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

1.3.6. Antibiticos antimetabolitos

1.3.7. Antibioresistncia no gnero Aeromonas

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.1. Origem das amostras

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.1.2. Mtodo de recolha das amostras

3.1.3. Isolamento pela tcnica de filtrao por membrana

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.2. Caracterizao preliminar dos isolados

3.2.1. Colorao diferencial de GRAM

10. Observao- objectiva de X 100 (com leo de emerso).

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.2.2. Prova da citromo-oxidase

3.2.3. Prova da catalase

3.3. Identificao das estirpes bacterianas

3.3.1. Extraco de DNA

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.3.2. Amplificao de DNA por reaco de PCR

Nota: * posio segundo numerao de E. coli (Huang, 1996).

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.3.3. Purificao dos produtos de PCR

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

Caracterizao de Aeromonas spp. isoladas de guas no tratadas para consumo humano

3.3.5. Anlise de sequncias e construo de dendogramas

3.4. Caracterizao bioqumica pelo API 20NE