Sudre AnaPaulaNorberto M

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Engenharia de Alimentos
ANA PAULA NORBERTO SUDRÉ
DETERMINAÇÃO DA VARIABILIDADE DA RESISTÊNCIA À

DESSECAÇÃO DE CEPAS DE SALMONELLA ENTERICA E MODELAGEM DA
SOBREVIVÊNCIA EM FARELO DE SOJA
Campinas
2020
ANA PAULA NORBERTO SUDRÉ
Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas de Salmonella

enterica e modelagem da sobrevivência em farelo de soja.
Dissertação apresentada à Faculdade de

Engenharia de Alimentos da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do título
de Mestra em Ciência de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À TESE DEFENDIDA

PELA ALUNA ANA PAULA NORBERTO SUDRÉ E
ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDERSON DE SOUZA
SANT’ANA.
Campinas
2020
Agência de fomento e n° do processo: CNPq N° 132500/2017-5
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos
Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Sudré, Ana Paula Norberto, 1992

Su23d Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas de
Salmonella enterica e modelagem da sobrevivência em farelo de soja. / Ana
Paula Norberto Sudré. – Campinas, SP: [s.n.], 2020.
Orientador: Anderson de Souza Sant'Ana.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade
de Engenharia de Alimentos
1. Farelo de soja. 2. Salmonella. 3. Modelagem preditiva. 4. Atividade de

água. I. Sant'Ana, Anderson de Souza. II. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Determination of the variability of resistance to desiccation of

Salmonella enterica strains and modeling of soybean meal survival.
Palavras-chave em inglês:
Soybean meal
Salmonella
Predictive modeling
Water activity
Área de concentração: Ciência de Alimentos
Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos
Banca examinadora:
Anderson de Souza Sant'Ana
Magdevis Yanet Rodriguez Caturla
Humberto Moreira Húngaro
Data de defesa: 27-02-2020
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)

ORCID do autor : 0000-0002-4019-2217
Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/0307275452371767
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________
Dr. Anderson de Souza Sant’Ana (Orientador)

Universidade Estadual de Campinas (DCE-FEA)
________________________________________________________
Dra. Magdevis Yanet Rodriguez Caturla

Universidade Estadual de Campinas (DCE-FEA)
________________________________________________________
Dr. Humberto Moreira Húngaro

Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
A ATA da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora,

consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa
da Unidade.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por tudo.
Aos meus pais, Júlia e Juscelino, e minhas irmãs, Taísa e Joseane, pela
disponibilidade em me ouvir e aconselhar todas as vezes que precisei. Por
fortalecerem em mim a certeza de que sempre terei pra onde voltar e sempre serei
recebia com o maior amor do mundo.
Ao meu esposo, Ronaldo, que sempre esteve ao meu lado, nos momentos felizes e
tristes. Obrigada por tudo.
A professora Dra. Verônica por sempre me apontar um caminho e me ajudar quando

preciso.
Ao meu orientador, Professor Dr. Anderson de Souza Sant’Ana.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico Tecnológico (CNPq) pelo apoio

financeiro (processo nº 132500/2017-5) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código de financiamento 001.
Aos meus colegas de laboratório.
A UNICAMP pela oportunidade.
A todos que de alguma forma contribuíram nessa fase.

RESUMO
Apesar de carnes, ovos e vegetais serem associados a presença de Salmonella, tem
sido frequente o isolamento deste patógeno em alimentos de baixa atividade de água.
Nesses alimentos, os micro-organismos podem desenvolver diferentes mecanismos,
desde mudanças fisiológicas a genéticas, que contribuem para sua adaptação e
sobrevivência. Além dos produtos de consumo direto, o farelo de soja, matéria prima
de baixa umidade e utilizada em larga escala para produção de ração animal, tem sido
reportado pela contaminação por Salmonella. Neste sentido, faz-se necessário
estudos para compreender a sobrevivência deste patógeno nesta matriz alimentar.
Sendo assim, este trabalho teve por objetivo, avaliar a sobrevivência de cepas de
Salmonella em farelo de soja durante a estocagem. Inicialmente, para seleção de 2
cepas resistentes a dessecação, 38 cepas de diferentes sorotipos, isoladas da cadeia
produtiva de farelo de soja, foram inoculadas individualmente no farelo e submetidas
a secagem a 25°C/ ± 18h com redução da aw de 0,98 a 0,60. Os resultados foram
expressos como a diferença do log de unidades formadoras de colônia (log UFC/g),
entre a contagem inicial e final do processo de secagem. Para avaliação da
sobrevivência durante a estocagem, dois métodos de inoculação (úmido e seco) foram
aplicados. Na inoculação úmida o inóculo líquido era transferido diretamente para o
farelo, já na inoculação a seco foi utilizado areia como transportador e as temperaturas
de estocagem foram de 25 e 37°C. Na primeira etapa, as duas cepas mais resistentes
a dessecação, compreendem os sorotipos Schwarzengrund (IOC 5691) e Havana
(IOC 2307), com redução de 0,58 e 0,62 log UFC/g respectivamente. Estas cepas
portanto, foram selecionadas para avaliação posterior de sobrevivência durante a
estocagem do farelo. Além dessas, Salmonella entérica Typhimurium (ATCC 14028),
também foi utilizada nos testes posteriores de estocagem, com o objetivo de comparar
a sobrevivência desse sorotipo aos isolados da cadeia produtiva de farelo de soja,
citados anteriormente. Na sobrevivência durante a estocagem, o modelo Weibull foi
utilizado para todos os resultados obtidos, uma vez que se ajustou melhor aos dados.
Avaliando o tempo necessário para redução de 1 log da população microbiana (δ), os
sorotipos Schwarzengrund, Havana e Typhimurium, estocadas a 25°C apresentaram
respectivamente δ de 40, 45 e 22 (por inoculação úmida) e 50, 36 e 21 dias (por
inoculação seca). Já na temperatura de 37 °C os valores de δ são bem inferiores.
Sendo de 2,7, 3,9 e 3,5 (por inoculação úmida) e 7,9, 4,3 e 3,2 dias (por inoculação
seca). De fato, a redução das células tendem a aumentar quando estas são expostas
a estresses térmicos, pois podem ocorrer mudanças na membrana, extravasamento
citoplasmático e desidratação celular. Já na temperatura de 25°C, as cepas
apresentaram δ prolongado, sendo ainda maiores para as isoladas da cadeia
produtiva do farelo de soja, demostrando uma possível pré-adaptação destes
sorotipos. Os resultados de análise de variância (ANOVA) demostram que a
temperatura a cepa e a interação temperatura×cepa influenciaram significativamente
(p<0,001) a sobrevivência de Salmonella durante o armazenamento. Já o método de
inoculação, não influênciou significativamente em nenhuma das condições.
Palavras-chave: Farelo de soja, Salmonella, modelagem preditiva, atividade de água

ABSTRACT
Although meats, eggs and vegetables are associated with the presence of Salmonella,
the isolation of this pathogen in foods with low water activity has been frequent. In
these foods, microorganisms can develop different mechanisms, from physiological to
genetic changes, which contribute to their adaptation and survival. Besides the
products for direct consumption, soybean meal, a low-moisture raw material that have
been used on a large scale for the production of animal feed, has been reported for
contamination by Salmonella. In this sense, studies are needed to understand the
survival of this pathogen in this food matrix. Therefore, this study aimed to evaluate
the survival of Salmonella strains in soybean meal during storage. Initially, for the
selection of 2 strains resistant to desiccation, 38 strains of different serotypes, isolated
from the soybean meal production chain, were individually inoculated in the bran and
subjected to drying at 25 ° C / ± 18h with a reduction in aw of 0,98 until 0,60. The
results were expressed as the difference in the log of colony-forming units (log UFC /
g), between the initial and final count of the drying process. For the evaluation of
survival during storage, two inoculation methods (wet and dry) were applied. In wet
inoculation, the liquid inoculum was transferred directly to the bran while in dry
inoculation sand was used as a carrier, and the storage temperatures were 25 and 37
°C. In the first stage, the 2 strains most resistant to desiccation were the serotypes
Schwarzengrund (IOC 5691) and Havana (IOC 2307) with a reduction of 0.58 and 0.62
log UFC / g respectively. Therefore, these strains were selected for further evaluation
of survival during the storage of the bran. In addition to these, Salmonella enterica
Typhimurium (ATCC 14028) was also used in the subsequent storage tests in order to
compare the survival of this serotype with the isolates of the soybean meal production
chain mentioned above. In the survival during storage, the Weibull model was used for
all the obtained results since it was better adjusted to the data. Evaluating the time
required to reduce 1 log of the microbial population (δ), the serotypes
Schwarzengrund, Havana and Typhimurium stored at 25 ° C showed δ of 40, 45 and
22, respectively for the wet inoculation and 50, 36 and 21 days for the dry inoculation.
At 37 ° C, δ values are much lower, and it were 2,7, 3,9 and 3,5 for wet inoculation and
7,9, 4,3 and 3,2 days for dry inoculation. In fact, the reduction in cells tends to increase
when they are exposed to thermal stresses, as changes in the membrane, cytoplasmic
leakage and cell dehydration can occur. At 25 ° C, the strains showed a prolonged δ
and it were even higher for those isolated from the soybean meal production chain,
which demonstrate a possible pre-adaptation of these serotypes. The results of
analysis of variance (ANOVA) show that the temperature of the strain and the
temperature × strain interaction significantly influenced (p <0.001) Salmonella survival
during storage. The inoculation method, however, did not significantly influence any of
the conditions.
Keywords: Soybean meal, Salmonella, predictive modeling, water activity

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Revisão Bibliográfica:
Figura 1: Fluxograma de produção de ração para animais 17
Capitulo 1:
Figura 1: Sobrevivência de três diferentes sorotipos de Salmonella, Shwarzengrund
(A), Typhimurium (B) e Havana (C) no farelo de soja durante o armazenamento a 25°C
por (●) inoculação Úmida (▲) Inoculação seca e (■) areia e a 37°C por (○) Inoculação
Úmida (∆) Inoculação a seco e (□) Areia. As linhas representam os modelos gerados
em (__) inoculação Úmida, (_ _) Inoculação seca e (...) areia em ambas temperaturas.
42
Figura 2: Análise de componentes principais (PCA) da influência dos fatores na
sobrevivência de Salmonella durante o armazenamento. 43
Figura 3: Tempo de redução decimal δ (dias) de três diferentes sorotipos de
Salmonella (Shwarzengrund, Typhimurium e Havana) inoculados no farelo de soja por
método úmido e seco e armazenados a temperatura de 25°C (A) e 37°C (B). 43
Sumário
INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 12

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................................. 14
Salmonella em alimentos de baixa atividade de água ............................................... 15
Farelo de soja e ração animal ................................................................................... 16
Métodos de inoculação (úmida e a seco) em análises microbiológicas de alimentos
.................................................................................................................................. 18
Modelagem preditiva em alimentos ........................................................................... 19
REFERÊNCIAS.... ................................................................................................................. 21
CAPITULO 1....... ................................................................................................................... 27
Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas e Salmonella
enterica e modelagem da sobrevivência em farelo de soja............................................ 27
1.Introdução..... ...................................................................................................................... 29
2. Material e Métodos ............................................................................................................ 30
2.1 Seleção de cepas ................................................................................................ 30
2.2 Preparo do inóculo .............................................................................................. 31
2.3 Armazenamento .................................................................................................. 32
2.4 Análises estatísticas ............................................................................................ 32
3.Resultados e discussão..................................................................................................... 32
4.Conclusão................................................................................................................36
5.Referências.... ..................................................................................................................... 37
DISCUSSÃO GERAL ............................................................................................................ 44
CONCLUSÃO GERAL .......................................................................................................... 46
REFERÊNCIAS GERAIS...................................................................................................... 47
12
INTRODUÇÃO GERAL
Salmonella é uma enterobactéria patogênica responsável por infecções em

homem e animais. A contaminação ocorre por contato fecal-oral direto, ingestão de
água ou produtos de origem animal contaminados (principalmente ovos e carnes).
Pode inserir-se na cadeia produtiva de alimentos de modo direto ou indireto, por
rações servidas para animais de corte. Diferentes fatores influenciam o risco de
introdução de Salmonella em rações para animais, incluindo ingredientes, ambiente
de processamento contaminado, por recontaminação pós processo e por aves
selvagens e roedores (Andrés-Barranco et al., 2014; Crump, 2002). Dados de
literatura comprovam que as rações para animais apresentam quantidade, em alguns
casos elevadas, de sorovares que são infectantes para animais e humanos (EFSA,
2008; Wierup e Häggblom, 2010; Wierup e Kristoffersen, 2014)
Como o farelo de soja é um dos principais ingredientes da ração e é

frequentemente associado a contaminação por Salmonella, este ingrediente pode ser
uma fonte comum de introdução deste patógeno na cadeia produtiva de aves e outros
animais de corte para consumo humano (Wierup e Kristoffersen, 2014). Devido sua
capacidade de sobrevivência à condições adversas ao longo do processamento
(Nascimento et al., 2012; Spector e Kenyon, 2012; Vestby et al., 2009) e no período
de estocagem (Davies, R. H., & Hilton, 2000), o monitoramento da qualidade
microbiológica da ração bem como suas matérias primas, torna-se imprescindível em
programas de controle de Salmonella pré-abate. Depois de ingerida, a Salmonella
pode colonizar o trato gastro-intestinal dos animais hospedeiros, disseminando a
contaminação na cadeia produtiva de alimentos (Jones e Richardson, 2004; Torres et
al., 2011).
Os testes de desafio tem sido frequentemente empregados pela indústria para

compreender a adaptação e sobrevivência dos micro-organismos nos alimentos.
Alguns testes, tem demostrado que a Salmonella é capaz de sobreviver por longos
períodos em alimentos de baixa atividade de água, como por exemplo, condimentos
(Bowman et al., 2015), nozes (Blessington, Elizabeth e Linda, 2012), fórmula infantil
em pó (Barron e Forsythe, 2007) entre outros. No challeng test, vários fatores podem
influenciar os resultados, entre eles, a formulação as cepas e o método de inoculação
utilizado (IFT, 2001). Por isso, conhecer o processo, as possíveis formas de
13
contaminação e os micro-organismos associados a contaminação, tornam os testes

mais realistas e com resultados mais confiáveis.
Dessa forma, conhecendo a importância do farelo de soja para economia do

país e seu potencial como contaminante da ração animal, desenvolver pesquisas que
demostrem o comportamento da Salmonella nessa matéria prima, é primordial para
desenvolver estratégias de controle microbiológico, contribuindo assim, com a saúde
pública.
14
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
15
Salmonella em alimentos de baixa atividade de água
A Salmonella entérica é reconhecida em todo o mundo como uma das

principais bactérias responsável por doenças de origem alimentar. Segundo o CDC
estima-se que a Salmonella cause cerca de 1,2 milhão de doenças, 23.000
hospitalizações e 450 mortes nos Estados Unidos a cada ano. Sendo os alimentos,
responsáveis por cerca de 1 milhão desses casos (CDC, 2019). No Brasil, esse
patógeno é o segundo maior responsável por doenças veiculadas por alimentos,
considerando surtos registrados nos últimos 10 anos (SVS, 2019).
Os produtos frequentemente associados a presença de Salmonella são

matérias-primas como ovo in natura, vegetais e carnes não processadas (Duggan et
al., 2010; Whiley e Ross, 2015; Zweifel e Stephan, 2012). Porém, é crescente os
surtos de salmonelose associados a consumo de alimentos de baixa atividade de
água. Entre os alimentos incriminados podemos citar; manteiga, chocolate,
amendoim, sementes, especiarias, cereais de aveia e pimenta preta (Burgess et al.,
2016).
Experimentos demostraram que cepas de Salmonella podem sobreviver por

meses em alimentos de baixa atividade de água como biscoitos (Beuchat e Mann,
2015) pasta de amendoim (Burnett et al., 2000), condimentos (Bowman et al., 2015)
sementes de gergelim (Torlak, Sert e Serin, 2013) e por períodos superiores a um
ano em sementes de nozes (Blessington, Elizabeth e Linda, 2012), amêndoas (Uesugi
e Harris, 2006) e fórmula infantil em pó (Barron e Forsythe, 2007).
Em condições de estresse osmótico, algumas respostas fisiológicas são

induzidas pela Salmonella para sua sobrevivência. Entre as repostas temos o
aumento na concentração de solutos e omoprotetores no interior da célula, mantendo
seu equilíbrio osmótico com o meio (Burgess et al., 2016), aumento da degradação
de RNA ribossômico contribuindo na adaptação das células estressadas (Deng, Li e
Zhang, 2012; Deutscher, 2006), aumento do metabolismo de ácidos graxos na
membrana (Li et al., 2012), indução do estado VNC (VBNC, do inglês, viable but
nonculturable) (Deng, Li e Zhang, 2012; Gruzdev, Pinto e Sela Saldinger, 2012;
Habimana et al., 2014) e aumento da expressão de genes de virulência.
Outro aspecto extremamente preocupante é que a exposição a condições de

estresse osmótico e dessecação favorece a tolerância cruzada de Salmonella a
diversos estresses. Como resultado, por exemplo, pode-se observar o aumento da
16
tolerância à tratamentos térmicos (Chiewchan, Pakdee e Devahastin, 2007; Fong e

Wang, 2016) e outros estresses como, irradiação UV, sais biliares, etanol, hipoclorito
de sódio e peróxido de hidrogênio (Gruzdev, Pinto e Sela, 2011).
Além das implicações mencionadas acima, a exposição de Salmonella a baixa

atividade de água por longos períodos pode induzir a sua entrada em um estado
fisiológico adormecido, denominado "viável, mas não cultivável" (VBNC, do inglês,
viable but nonculturable) (Deng, Li e Zhang, 2012; Gruzdev, Pinto e Sela Saldinger,
2012; Habimana et al., 2014). Apesar de neste estado, a atividade metabólica ser
significativamente reduzida, as células são capazes de manter sua viabilidade por
longos períodos, recuperando sua atividade quando em ambiente propício (Gupte et
al., 2003).
Farelo de soja e ração animal
A alimentação animal é um dos fatores econômicos mais importantes na cadeia

produtiva de frangos de corte, pois a qualidade da ração influência diretamente no
custo de produção e no desempenho animal (Melo et al., 2016). As formulações das
rações disponibilizam todos os nutrientes exigidos para garantir a nutrição e saúde do
animal. Além disso, os produtos utilizados nas formulações devem ser seguros, do
ponto de vista microbiológico, e de qualidade, do ponto de vista nutricional
(EMBRAPA, 1996). O milho e a soja são as principais matérias-primas utilizadas na
fabricação de ração para aves (Beski, Swick e Iji, 2015).
O controle do processo de fabricação da ração é importante para garantir a

segurança do produto. No que se refere à Salmonella, três medidas podem ser
empregadas: prevenir a contaminação no início do processamento, prevenir a
multiplicação microbiana na planta e aplicar procedimentos para eliminar Salmonella
do produto (Jones, 2011). A figura 1 apresenta o fluxograma de produção de ração
para animais.
17
Figura 1: Fluxograma de produção de ração para animais
A prevalência de Salmonella ao longo da cadeia produtiva de aves, nas carnes

e produtos cárneos derivados de aves e em ovos é amplamente reconhecida, assim
como sua associação com casos de salmonelose por consumo desses produtos
(Antunes et al., 2016; Chousalkar et al., 2018; Gantois et al., 2009; Namata et al.,
2009; Vandeplas et al., 2010). Diversos estudos conduzidos ao longo das últimas
décadas tem demonstrado a ocorrência de surtos de salmonelose cujas fontes
originais do patógeno foram as rações animais (Bucher et al., 2007; Clark, Gangarosa
e Thompson, 1973; Hinton, 1988; Hirsch e Sapiro-Hirsch, 1958; Jones e Richardson,
2004; Pennington et al., 1968; Semple, Turner e Lowry, 1968; Shirota et al., 2001;
Veldmam et al., 1995; Wasyl et al., 2006). A ocorrência de Salmonella em rações,
pode ter como justificativa a contaminação de matérias-primas e do ambiente de
processamento por esta bactéria (Cox et al., 1983; Davies e Wray, 1997; Hirsch e
Sapiro-Hirsch, 1958; Jones e Richardson, 2004; Veldmam et al., 1995).
Apesar de matérias primas de origem animal estarem frequentemente

relacionadas a contaminação das rações (Hofer et al., 1998) , alguns estudos relatam
a incidência de Salmonella em ingredientes de origem vegetal como milho, soja e
sorgo (Jones e Richardson, 2004; Wierup e Häggblom, 2010). O relatório de zoonoses
da European Food Safety Authorithy também indica uso de oleaginosas, como a soja
e derivados, como um fator de risco para a introdução de Salmonella na cadeia
produtiva dos alimentos (EFSA, 2010). Além disso, pesquisas demostram a incidência
de Salmonella na cadeia produtiva de farelo de soja (Binter et al., 2011; Maqsood,
2012; Morita et al., 2006; Wierup e Kristoffersen, 2014), e há inclusive, estudos que
reportam a utilização de derivados de soja na fabricação de rações como fator de risco
18
para a presença deste patógeno. Osterberg (2006), em um estudo na Suécia, detectou

Salmonella em remessas de proteína vegetal, em especial o farelo de soja. A
Salmonella também foi detectada nos farelos importados, principalmente de países
da América do Sul, que apresentaram risco 2,4 vezes maior de estarem contaminados
por esta bactéria quando comparados aos produtos importados de outros países
(Wierup e Häggblom, 2010).
Conhecendo a importância do farelo de soja como materia prima na produção

de ração animal, e a associação dessa matéria prima a presença de Salmonella, faz-
se necessário estudos que colaborem com medidas para evitar a contaminação e a
disseminação da Salmonella na cadeia produtiva de frangos de corte.
Métodos de inoculação (úmida e a seco) em análises microbiológicas de

alimentos
Os testes de desafio (challeng test) são aplicados pela indústria para obter
informações que possam contribuir com a seguridade dos alimentos, no que diz
respeito ao crescimento e inativação microbiológica, durante o processo e no
armazenamento (IFT, 2001). No challeng test, vários fatores podem influenciar os
resultados, entre eles, o método de inoculação (IFT, 2001). Atualmente, o método de
inoculação mais usado é o úmido, porém a inoculação úmida pode ser ineficiente para
alimentos de baixa atividade de água, visto que podem mudar a textura do produto e
sua umidade, mesmo após o processo de secagem (Blessington, Theofel e Harris,
2013; Palipane e Driscoll, 1992).
Como alternativa a inoculação úmida os métodos a seco vem sendo estudados

de maneira a assegurar bons resultados em testes de sobrevivência microbiana em
alimentos de baixa atividade de água. O método de inoculação a seco, além de não
interferir na umidade e atividade de água do alimento, facilita a distribuição
homogênea das células na matriz e elimina a necessidade se secagem pós
inoculação. Além disso em alguns casos pode imitar possíveis rotas de contaminação
do alimento (Blessington, Theofel e Harris, 2013).
Entre os métodos de inoculação a seco, temos o uso de uma amostra da

própria matriz, inoculada por via úmida, seca e misturada de forma homogênea a uma
porção maior do mesmo alimento (Liu et al., 2019; Villa-Rojas et al., 2017). A
19
liofilização de culturas bacterianas (Flowers et al., 1990; Xu et al., 2018) e também,

uso de transportadores, como pó de giz (Beuchat e Mann, 2011a; b), talco (Enache et
al., 2015) e areia (Blessington, Theofel e Harris, 2013; Shrestha e Nummer, 2016).
Os estudos citados, reportaram bons resultados quanto ao uso de

transportadores secos na inoculação de Salmonella em alimentos de baixa atividade.
Porém, deve atentar-se ao fato do inóculo apresentar problemas quanto aglomeração
e dificultado de homogeneização (Beuchat e Mann, 2011a). O talco pode conter
amianto, podendo influenciar na sobrevivência do micro-organismo (American Cancer
Society, 2016; Liu et al., 2019). O inóculo deve apresentar boa dispersão na matriz do
alimento, além de simular a contaminação de forma mais realista possível (IFT, 2001).
Nesse contexto a areia tem maior potencial como transportador seco. Inerte, ela
apresenta como principal composto o dióxido de sílico (SiO2) que é puro e não tóxico,
interferindo minimamente na matriz do alimento (Liu et al., 2019).
Modelagem preditiva em alimentos
A microbiologia preditiva é a área da microbiologia que utiliza conceitos

matemáticos e estatísticos de forma a criar modelos que descrevem o comportamento
dos micro-organismos através de dados experimentais como pH, aw, temperatura
entre outros. Os primeiros trabalhos realizados nessa área, foram descritos no ano de
1920, por Bigelow, Esty e Meyer (1920).
Os modelos preditivos podem ser classificados em três tipos; Os modelos

primários, que descrevem a multiplicação ou inativação microbiana em função do
tempo sem haver variação nas condições ambientais. Os secundários que descrevem
alterações no comportamento microbiano em relação a mudanças ambientais. E os
modelos terciários que utiliza a combinação dos modelos primários e secundários a
softwares (Buchanan, 1993; Jagannath e Tsuchido, 2003).
O modelo de Bigelow (Eq1), representa um modelo de inativação microbiana.
𝑡
𝑙𝑜𝑔10 𝑁(𝑡) = 𝑙𝑜𝑔10 𝑁(0) − (1)
𝐷
20
Onde, N(t) é a concentração de sobreviventes expressa em log10 UFC/g em um

tempo t (min); N(0) é a concentração inicial do micro-organismo em log10 UFC/g; D é o
tempo de redução decimal (min).
No modelo de Bigelow, considera-se que todas as células apresentam a

mesma sensibilidade ao calor aplicado e o mesmo tempo de morte. Gerando assim,
uma equação log-linear.
Mafart e colaboradores (2002), readaptaram o modelo de Bigelow com base na

distribuição de Weibull, de forma a avaliar a inativação de micro-organismos que não
obedecem a ordem linear. Surgiu então o modelo de Weibull descrito pela equação 2.
𝑡 𝑝
𝑙𝑜𝑔10 𝑁(𝑡) = 𝑙𝑜𝑔10 𝑁(0) − ( ) (2)
𝛿
Onde, N(t) é a concentração de sobreviventes expressa em log10 UFC/g em um

tempo t (min); N(0) é a concentração inicial do micro-organismo em log1 UFC/g, δ é o
tempo para primeira a redução decimal e p é o parâmetro de curvatura. Neste caso o
parâmetro de curvatura pode apresentar concavidade para cima (ρ<1) ou concavidade
para baixo (ρ>1) de acordo com o perfil do modelo, além de outros comportamentos,
como ombro e cauda. Descrevendo assim, de forma mais precisa o comportamento
microbiano.
Farakos e colaboradores (2013), analisaram dados de literatura sobre a

sobrevivência de Salmonella em alimentos de baixa atividade de água. Os resultados
obtidos, demonstraram que o modelo Weibull se ajusta melhor aos dados em 75%
dos casos avaliados, quando comparados ao modelo log-linear.
A aplicação de softwares que utilizam modelos matemáticos que descrevem o

comportamento dos micro-organismos é de extrema importância. A previsão, nos
permite melhorar processos e armazenamento de produtos, aumentando a segurança
microbiológica e consequentemente a qualidade dos alimentos.
21
REFERÊNCIAS
AMERICAN CANCER SOCIETY. Talcum Powder and Cancer. Disponível em:

<https://www.cancer.org/cancer/cancer-causes/talcum-powder-and-
cancer.html>.
ANDRÉS-BARRANCO, S.; VICO, J. P.; GRILLÓ, M. J.; MAINAR-JAIME, R. C.
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27
CAPITULO 1
Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas e

Salmonella enterica e modelagem da sobrevivência em farelo de soja.
Artigo formatado segundo as normas da revista “Food Microbiology”

28
Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas de

Salmonella enterica e modelagem da sobrevivência em farelo de soja.
Ana Paula Norberto¹, Verônica Ortiz Alvarenga², Anderson Souza Sant’Ana¹
1- Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos -

UNICAMP.
2- Departamento de Alimentos, Faculdade de Farmácia - UFMG
Resumo
Os alimentos de baixa atividade de água tem sido frequentemente incriminados

quanto a presença de Salmonella. Além disso, o farelo de soja, matéria prima de baixa
umidade e importante na alimentação de animais de corte, tem sido reportado pela
presença deste patógeno. Visto a importância da ração animal na disseminação da
Salmonella na cadeia produtiva de alimentos, faz-se necessário estudos do
comportamento deste patógeno nesta matriz alimentar. Diante disso, foram avaliadas
a sobrevivência de três cepas de Salmonella em farelo de soja durante a estocagem.
Duas compreendem os sorotipos Schwarzengrund (IOC 5691) e Havana (IOC 2307),
isoladas da cadeia produtiva do farelo e a terceira, Salmonella entérica Typhimurium
(ATCC 14028). Dois métodos de inoculação (seco e úmido) e duas temperaturas de
estocagem 25 e 37° foram aplicadas para avaliar a sobrevivência das cepas.
Analisando o tempo necessário para redução de 1 log da população microbiana (δ),
os sorotipos Schwarzengrund, Havana e Typhimurium, estocadas a 25°C
apresentaram respectivamente δ de 40, 45 e 22 (por inoculação úmida) e 50, 36 e 21
dias (por inoculação seca). Já na temperatura de 37 °C os valores de δ são bem
inferiores. Sendo de 2,7, 3,9 e 3,5 (por inoculação úmida) e 7,9, 4,3 e 3,2 dias (por
inoculação seca). Os resultados de análise de variância (ANOVA) demostram que a
temperatura a cepa e a interação temperatura×cepa influenciaram significativamente
(p<0,001) a sobrevivência dos sorotipos durante o armazenamento. Já o método de
inoculação, não influênciou significativamente em nenhuma das condições.
Palavras-chave: Farelo de soja, Salmonella, modelagem preditiva, atividade de água.

29
1. Introdução
Nos Estados Unidos são estimados 1,35 milhões de casos e 420 mortes,
relacionados a Salmonella anualmente (CDC, 2019). No Brasil, entre os anos de 2000
e 2017, 35% dos casos de surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA’s),
foram associados a Salmonella (SVS, 2018). Entre os principais alimentos associados
a contaminação por esse patógeno estão os ovos e produtos à base de ovos, vegetais
in natura e carnes em especial carne de frango (CDC, 2019; Ford et al., 2018; Jackson
et al., 2013). Contudo, alimentos de baixa atividade de água também tem sido
vinculado a surtos de Salmonelose (Beuchat et al., 2013; CDC, 2013, 2014; Russo et
al., 2013). Nesses alimentos, poucas células são necessárias para causar doença
(Jacobs et al., 1983; Rowe et al., 1987), sendo apenas uma célula suficiente para
causar infecção (D’Aoustl et al., 1974). Estudos comprovam que a baixa atividade de
água pode contribuir para resistência da Salmonella frente a outros estresses, como
tratamento térmico, irradiação e sanificantes (Chiewchan, Pakdee e Devahastin, 2007;
Fong e Wang, 2016; Gruzdev, Pinto e Sela, 2011).
Além dos alimentos citados, autores relatam a incidência de Salmonella na

cadeia produtiva de farelo de soja (Maqsood, 2012; Morita et al., 2006; Osterberg et
al., 2006; Wierup e Häggblom, 2010; Wierup e Kristoffersen, 2014) um produto de
baixa atividade de água (0,650) (Sordi, Surek e Tavernari, 2008) e utilizado
largamente na produção de ração animal (Beski, Swick e Iji, 2015). Nesse sentido, o
farelo de soja pode ser uma importante fonte de introdução da Salmonella na ração,
colonizando o trato gastro-intestinal dos animais hospedeiros disseminando assim o
patógeno na cadeia produtiva de alimentos, principalmente frangos de corte e porcos
(Wierup, 2017; Wierup e Kristoffersen, 2014). Portanto, faz-se necessário conhecer o
comportamento da Salmonella nesta matriz alimentar, a fim de desenvolver
estratégias que garantam a inocuidade da ração e consequentemente a segurança
dos alimentos.
Os testes de desafio (challeng test) são utilizados para obter informações que
possam contribuir no desenvolvimento de processos que garantam a seguridade dos
alimentos, no que diz respeito ao crescimento e inativação microbiológica, durante o
processo e no armazenamento (IFT, 2001). Sabendo que fatores intrínsecos e
extrínsecos podem influenciar a sobrevivência dos micro-organismos nos alimentos
(Farakos, Schaffner e Frank, 2014) o challeng test deve ser o mais realista possível,
considerando por exemplo, as possíveis rotas de contaminação do produto analisado.
30
Em alguns produtos de baixa atividade de água, tem sido empregado o método

de inoculação a seco (Beuchat e Mann, 2011; Blessington, Theofel e Harris, 2013;
Enache et al., 2015; Shrestha e Nummer, 2016). Esse método além de não interferir
na umidade e atividade de água do alimento, facilita a distribuição homogênea das
células na matriz, elimina a necessidade se secagem pós inoculação e em alguns
casos pode imitar possíveis rotas de contaminação (Blessington, Theofel e Harris,
2013). Dentre os transportadores na inoculação a seco, a areia tem se mostrado uma
boa opção, pois apresenta boa dispersão e baixa interferência na matriz do alimento
(Liu et al., 2019).
Este trabalho teve o objetivo avaliar a resistência à dessecação de diferentes

cepas de Salmonella isoladas da cadeia produtiva de farelo de soja e estimar a
sobrevivência destas durante a estocagem do farelo sob temperaturas de 25 e 37°C,
utilizando dois métodos diferentes de inoculação (úmido e seco).
2. Material e Métodos
2.1 Seleção de cepas
Em estudo anteriormente conduzido no LMQA (Laboratório de Microbiologia

Quantitativa de Alimentos FEA/Unicamp), mais de 800 cepas foram isoladas do farelo
e ambientes de processamento do farelo de soja. Das cepas isoladas, 190 foram
testadas quanto a capacidade de sobrevivência após dessecação em placas de 90
poços a 37°C por 7 dias. O estudo demonstrou variabilidade de resistência nas cepas,
sendo as 37 que apresentaram maior resistência (menor redução de população
microbiana) selecionadas para os testes sequentes de dessecação no farelo de soja.
Para seleção de duas cepas resistentes a dessecação no farelo, cada cepa

(n=37) de Salmonella foi cultivada individualmente em Caldo Triptona de Soja (TSB;
Kasvi, Itália) à 37°C/24 h. As células foram centrifugadas a 5000 × g durante 5 min e
lavadas com água peptonada estéril 0,1% (Acumédia, Michigan, EUA). Os
procedimentos de lavagem e centrifugação foram repetidos duas vezes. Então, os
pellets de cada cepa foram ressuspendidos individualmente em água peptonada
0,1%, seguindo-se para ajuste da concentração final do inóculo para
aproximadamente 107 UFC/mL (Lambertini et al., 2016).
Para avaliação da tolerância a dessecação, duas placas de petri (A e B), cada

uma com 5 g de farelo de soja (previamente descontaminado) foi inoculada com 5 mL
31
da suspensão de Salmonella a 107 UFC/mL. A contagem foi realizada logo após a

inoculação (placa A) e depois de ± 18 horas de secagem, em fluxo laminar a
temperatura ambiente com aw de aproximadamente 0,60 (placa B). Os resultados
foram expressos como a diferença do log de unidades formadoras de colônia (log
UFC/g), entre a contagem inicial e final do processo de dessecação. Além das duas
cepas de maior resistência a dessecação, Salmonella entérica Typhimurium (ATCC
14028), também foi utilizada nos testes posteriores de estocagem, com o objetivo de
comparar a sobrevivência desse sorotipo aos isolados da cadeia produtiva de farelo
de soja, citados anteriormente.
2.2 Preparo do inóculo
Inóculo Seco
Para o preparo do inóculo seco, foi utilizado areia fina (granulometria de 0,05 a
0,2 mm) como transportador seco. Inicialmente, cada cepa de Salmonella selecionada
no item 2.1 foi inoculada individualmente em 100 mL seguida de dois repiques para
250 e 700 mL de TSB. Cada repique foi armazenado a 37°C por 24h. Ao final dos
repiques, o meio crescido foi centrifugado a 4000 × g por 8 minutos a uma temperatura
de 4°C (Sorvall Legend XTR, Thermo Scientific, Alemanha). Após a centrifugação, os
pellets eram lavados com solução de água peptonada 0,1% por 3 vezes. Na sequência
os pelettes eram reidratados e ajustados para concentração de 10 9 UFC/mL através
de leitura em espectofotômetro seguido de confirmação em plaqueamento em Ágar
Desoxicolato Lisina Xilose (XLD, Acumedia, Michegan, EUA) e incubado a 37°C por
24h. Depois do preparo, o inóculo foi adicionado na proporção de 1:2 (m/m) na areia,
de acordo com procedimento adaptado, realizado por Blessington, Theofel and Harris
(2013). A areia inoculada foi disposta homogeneamente em bandejas de alumínio
cobertas por papel, seguindo de secagem em estufa a 35°C/ ± 24h. Se necessário,
posteriormente a areia era seca em fluxo laminar até atingir a aw de 0,65.
Inóculo Úmido
As amostras de farelo de soja, foram inoculadas pelo método de inoculação

úmida, dentro do fluxo laminar, como descrito por Gabriel, Tongco e Barnes (2017). O
crescimento e centrifugação foram realizados como descrito anteriormente. Depois da
inoculação e centrifugação, uma suspenção celular com 10 7 UFC/mL era adicionada
32
ao farelo de soja na proporção de 1:1 (m/m). Após a inoculação, o farelo de soja era
mantido em fluxo laminar até atividade de água atingir 0,65.
2.3 Armazenamento
A areia contendo Salmonella, foi transferia para o farelo de soja na proporção

de 1:2 (g/g). O farelo inoculado por via seca e via úmida era transferido para
embalagens metalizadas com barreira de umidade e dispostas em estufas a 25 e
37°C. As amostras foram analisadas periodicamente de forma a obter-se um número
mínimo de 10 pontos para ajuste dos modelos preditivos.
As amostras iniciais e as amostras coletadas nos diferentes pontos ao longo do
período de estocagem foram enumeradas por drop plate utilizando-se meio de cultivo
XLD. A atividade de água das amostras coletadas ao longo do experimento foi
mensurada usando-se o equipamento CX-2, AquaLab. Os resultados obtidos foram
expressos como log UFC/g, para cada cepa, temperatura de estocagem e amostra
estudada.
2.4 Análises estatísticas
Para análise de significância dos fatores, considerando tratamento,

temperatura e cepas em relação a sobrevivência da Salmonella sp, foi realizada uma
Análise de Variância (ANOVA), utilizando-se o software R (versão 3.3.1) (The R
Foundation for Statistical Computing Viena, Áustria).
3. Resultados e discussão
As duas cepas de Salmonella que apresentaram melhor resistência a
dessecação no farelo (menor redução da população microbiana) compreendem os
sorotipos Schwarzengrund (IOC 5691), Havana (IOC 2307), isoladas da cadeia
produtiva do farelo de soja, respectivamente, do pé do elevador de soja e do farelo de
soja (produto final). As cepas apresentaram, respectivamente, redução de 0,58 e 0,62
log UFC/g após ± 18h a temperatura ambiente com redução da aw de 0,98 para
aproximadamente 0,60. A tabela 1 apresenta os dados de redução da população
microbiana após a dessecação no farelo de soja.
Tabela 1
Para este estudo, utilizou-se a areia como transportador na inoculação a

seco. O uso deste transportador já foi realizado em outras pesquisas e simula uma
33
possível rota de contaminação de farelo de soja, considerando o isolamento deste

patógeno em amostras ambientais e de poeira na cadeia produtiva do farelo (Wierup
e Kristoffersen, 2014).
No preparo do inóculo seco, houve uma queda de 1,1 a 1,8 log UFC/g em
relação a contagem inicial e imediatamente após a secagem da areia. Shrestha e
Nummer (2016), também observaram declínio de 1 log UFC/g durante a secagem da
areia. Já reduções superiores de até 2,5 log UFC/g são relatados por Blessington,
Theofel, and Harris (2013). Esses valores demostram a estabilidade do inóculo
durante o processo de secagem, tornando viável a utilização da areia fina para
inoculações a seco, mesmo quando a população inicial necessita ser alta.
A sobrevivência dos três diferentes sorotipos de Salmonella, Shwarzengrund,

Typhimurium e Havana, analizadas pelos diferentes métodos de inoculação (seco e
úmido) e também na areia, durante o armazenamento nas temperaturas de 25 e 37°C
são apresentadas na figura 1.
Figura 1
Em todas as condições analisadas observou-se uma cinética de inativação de

primeira ordem e o modelo Weibull foi utilizado por apresentar melhor ajuste aos
dados. Farakos, Schaffner e Frank (2014), demonstraram em analise de dados de
literatura, que o modelo de Weibull fornece ajustes adequados aos dados em 75%
das curvas, comparados a modelos log-lineares na avaliação da sobrevivência de
Salmonella em alimentos de baixa atividade de água. Além disso, os fatores como
temperatura, cepa e método de inoculação (seco e úmido) são fatores globais que
influenciam a sobrevivência deste patógeno nesses ambientes.
Para analisar a influencia dos fatores (temperatura, cepa e método de

inoculação) foi realizado uma análise de variância (ANOVA). Os resultados
demostram que a temperatura a cepa e a interação temperatura×cepa influenciaram
significativamente (p<0,001) a sobrevivência da Salmonella durante o
armazenamento.
A Análise de Componentes Principais (PCA) (figura 2) demostra que a

temperatura foi o fator de maior impacto na sobrevivência.
Figura 2
34
A influência da temperatura a 37°C na rápida redução da bactéria, pode ser

notada em todos os tratamentos e cepas. Outros autores também descrevem este
comportamento (Álvarez-Ordónez et al., 2012; Farakos, Schaffner e Frank, 2014).
Quando submetidas a altas temperaturas (~60°C), a membrana pode sofrer danos
severos, o que facilita a morte das células. Porém, em temperaturas não tão elevadas,
como a 37°C, apesar de não ocorrer danos severos, podem favorecer pequenos
vazamentos de íons citoplasmáticos o que também contribui para perda da viabilidade
celular (Ebrahimi, Csonka e Alam, 2018).
As membranas celulares são compostas principalmente por uma bicamada

lipídica e proteínas de transporte. Os micro-organismos desenvolvem mecanismos
que alteram a composição da membrana, tornando-a mais fluída e facilitando sua
adaptação a diferentes condições ambientais, tais como estresse osmótico (Denich et
al., 2003; Singer, 1972). O estresse osmótico pode ser acarretado por soluções
hiperosmótica ou desidratação (Burgess et al., 2016; Sleator e Hill, 2001). Quando as
células são submetidas a ambientes de baixa atividade de água, ocorre aumento da
pressão osmótica do meio, favorecendo a perda de água da célula para o meio
ambiente e posteriormente sua morte (Kedem e A, 1958; Wood, 1999; Yannick Mille,
Laurent Beney, 2002).
Estudos que combinam a temperatura com a pressão osmótica, demostram

que ocorre maior perda de viabilidade celular com o aumento da temperatura em
ambiente de alta pressão osmotica (Yannick Mille, Laurent Beney, 2002). Esses dados
colaboram com os resultados que demostram a sobrevivência prolongada da
Salmonella a 25°C e seu rapido decaimento a 37°C, considerando a baixa atividade
de água e alta pressão osmotica durante a estocagem do farelo. Segundo Farakos,
Schaffner e Frank (2014), quando ocorre o aumento da temperatura, há uma
diminuição nos valores de log-D, que é assosciada a diminuição da resistência da
Salmonella. O mesmo foi observado neste trabalho quando comparada a
sobrevivência a 25 e 37°C (figura 3).
Além da temperatura, os fatores cepas e a interação temperatura×cepa

apresentaram efeito significativo (p<0,001) na sobrevivência da Salmonella no farelo
de soja. Considerando o método de inoculação úmida o tempo necessário para
redução de 1 log da população microbiana (δ) dos sorotipos Schwarzengrund (IOC
5691), Havana (IOC 2307) e Typhimurium (14028), foi respectivamente, 40, 45 e 22
dias a 25°C e 2,7, 3,9 e 3,5 dias a 37°C (figura 3)
35
Figura 3
Considerando a temperatura de 25°C, todas as cepas apresentaram boa

resistência. O farelo de soja inoculado tanto por via úmida quanto por via seca
apresentaram estabilidade durante o período de armazenamento. Outros autores
relatam a sobrevivência prolongada de Salmonella em alimentos de baixa atividade
de água, chegando a meses em alimentos como biscoitos (Beuchat e Mann, 2015)
pasta de amendoim (Burnett et al., 2000), condimentos (Bowman et al., 2015)
sementes de gergelim (Torlak, Sert e Serin, 2013) e por períodos superiores a um
ano em sementes de nozes (Blessington, Elizabeth e Linda, 2012), amêndoas (Uesugi
e Harris, 2006) e fórmula infantil em pó (Barron e Forsythe, 2007).
Estudos de análise de transcriptona de Salmonella tem contribuído para

desvendar formas de adaptação e resistência desse patógeno em condições de baixa
atividade de água. Na S. Typhimurium (14028) foram identificados 61 genes que
codificam proteínas e seis regiões intergênicas que contribuem para a sobrevivência
durante um estresse de dessecação. Alguns dos genes identificados estava
relacionado a produção e conversão de energia necessárias para manter o
metabolismo basal, recombinação e reparo para superar os danos no DNA (Mandal e
Kwon, 2017). Apesar desse estudo não ter sido realizado nos sorovares
Schwarzengrund (IOC 5691) e Havana (IOC 2307), sabe-se que diversos mecanismos
são empregados pela Salmonella para sobrevivência em condições de baixa atividade
de água. Entre os mecanismos podemos citar; a regulação positiva do catabolismo de
ácidos graxos na membrana (Li et al., 2012), expressão de transportadores
osmoprotetores (proP , proU e osmU) mantendo o equilíbrio osmótico da célula com
o meio (Finn et al., 2013; Li et al., 2012), aumento do influxo de potássio pelo canal
transportador kdp (Gruzdev et al., 2012), aumento do nível de degradação de
RNA ribossômico que tem sido descrito como contribuinte na adaptação das células
estressadas (Deng, Li e Zhang, 2012; Deutscher, 2006). Esses entre outros
mecanismos, podem justificar a sobrevivência prolongada da Salmonella no farelo de
soja.
Os resultados obtidos pelo método de inoculação a seco, apresenta diferença,

porém, não significativa em relação ao método de inoculação úmida. Estudos
realizados por Blessington (2013), aplica o método de inoculação seca e úmida para
avaliar a sobrevivência de Salmonella em amêndoas e nozes. Os resultados obtidos
também não diferem significativamente entre os métodos. Nota-se portanto que este
36
método é eficiente para testes onde o método de inoculação úmida é inapropriado,

pois o mesmo apresentou boa dispersão e baixa influência nos resultados de
sobrevivência das cepas analisadas.
Os dados de sobrevivência dos diferentes sorotipos apenas na areia durante o

armazenamento, apresentam similaridade a sobrevivência do patógeno no farelo.
Dessa forma, nota-se que a areia não interfere na estabilidade do inóculo.
4. Conclusão
O estudo demostrou que cepas de Salmonella podem sobreviver por longos
períodos no farelo de soja, sendo uma possível fonte de contaminação da ração
animal. Dentre os fatores avaliados (temperatura x cepa x método de inoculação) a
temperatura apresentou maior influência na sobrevivência das cepas. O método de
inoculação a seco e úmido não apresentou diferença significativa nos resultados. O
método de inoculação a seco, utilizando areia como transportador, mostrou-se
eficiente, apresentando boa dispersão quando inoculado no farelo de soja e
estabilidade durante o armazenamento, podendo ser utilizado em testes onde o
método de inoculação úmida é inapropriado. A resistência apresentada pelas cepas
na areia, durante o armazenamento, também representa um grande fator de
importância, isso devido ao isolamento de Salmonella em pó e ambientes de
processamento do farelo, indicando possibilidade de contaminação cruzada. Sendo o
farelo de soja uma matéria prima imprescindível na fabricação de ração animal e um
produto de grande impacto no agronegócio do Brasil, este estudo contribui para
conscientização de implementação ferramentas como BPF (Boas Práticas de
Fabricação) e APPCC (Análise de Perigo e Pontos Críticos de Controle). Com isso,
garantindo a qualidade e inocuidade do produto e consequentemente resultando na
proteção da saúde pública.
37
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41
Tabela 1: Número de reduções de Salmonella sp. após dessecação em farelo de

soja a 37°C/±18h com redução de aw de 0,98 a 0,60.
Redução
IOC Sorotipo
(log UFC/g)
5691 Schwarzengrund 0,58 ± 0,11

2307 Havana 0,62 ± 0,03
2320 Rugosa 0,64 ± 0,14
5690 Montevideo 0,81 ± 0,22
5694 Ohio 0,95 ± 0,01
2294 Rugosa 1,08 ± 0,02
4263 Infantis 1,12 ± 0,80
5728 Morehead 1,22 ± 0,28
5659 Ohio 1,34 ± 0,02
2317 Mbandaka 1,39 ± 0,30
5638 Akuafo 1,38 ± 0,34
4274 Tennessee 1,39 ± 0,24
2322 Anatum 1,45 ± 0,10
4272 Mbandaka 1,45 ± -,37
5680 Tennessee 1,53 ± 0,12
5688 Ohio 1,55 ± 0,28
2280 Brooklyn 1,58 ± 0,04
2224 enterica (O:16) 1,58 ± 0,20
5650 Agona 1,64 ± 0,19
2319 Senftenberg 1,67 ± 0,11
4268 Akuafo 1,70 ± 0,16
5666 Mbandaka 1,72 ± 0,08
5720 Montevideo 1,74 ± 0,56
2325 Agona 1,75 ± 0,05
2305 Agona 1,79 ± 0,18
5651 Ohio 1,80 ± 0,05
4269 Tennessee 1,82 ± 0,05
5653 Ohio 1,82 ± 0,11
5604 Akuafo 1,90 ± 0,22
5677 Montevideo 1,93 ± 0,15
2310 Havana 1,93 ± 0,07
5641 Agona 1,93 ± 0,02
5592 Derby 1,95 ± 0,05
5676 Agona 1,96 ± 0,26
5601 Derby 2,00 ± 0,24
2309 Infantis 2,03 ± 0,20
5593 Derby 2,26 ± 0,22
42
Figura 1: Sobrevivência de três diferentes sorotipos de Salmonella, Shwarzengrund (A),

Typhimurium (B) e Havana (C) no farelo de soja durante o armazenamento a 25°C por (●)
inoculação Úmida (▲) Inoculação seca e (■) areia e a 37°C por (○) Inoculação Úmida (∆)
Inoculação a seco e (□) Areia. As linhas representam os modelos gerados em (__) inoculação
Úmida, (_ _) Inoculação seca e (...) areia em ambas temperaturas.
43
Figura 2: Análise de componentes principais (PCA) da influência dos fatores na sobrevivência

de Salmonella durante o armazenamento.
Figura 3: Tempo de redução decimal δ (dias) de três diferentes sorotipos de Salmonella

(Shwarzengrund, Typhimurium e Havana) inoculados no farelo de soja por método úmido e
seco e armazenados a temperatura de 25°C (A) e 37°C (B).
44
DISCUSSÃO GERAL
A sobrevivência das cepas analisadas durante a dessecação do farelo de

soja com a redução da aw de 0,98 até 0,6o, apresentaram uma baixa redução da
população microbiana durante a dessecação, visto que as maiores reduções foram de
2,03 e 2,26 log UFC/g para os sorotipos Infantis e Derby, respectivamente. Já as
menores reduções obtidas, correspondem aos sorotipos Schwarzengrund (IOC 5691),
Havana (IOC 2307), sendo respectivamente 0,58 e 0,62 log UFC/g.
Para análise da sobrevivência das três cepas de Salmonella durante a

estocagem, os métodos de inoculação utilizados (seco e úmido) não apresentaram
diferença significativamente nos resultados. Neste caso, o método de inoculação a
seco, utilizando areia como transportador, mostrou-se eficiente, podendo ser utilizado
em testes onde o método de inoculação úmida é inapropriado. No preparo do inóculo
seco, houve uma queda de 1,1 a 1,8 log UFC em relação a contagem inicial e
imediatamente após a secagem da areia. Shrestha e Nummer (2016), também
observaram declínio de 1 log UFC durante a secagem da areia. Já reduções
superiores de até 2,5 log UFC são relatados por (Blessington, Theofel, and Harris
(2013). Neste caso, a sobrevivência durante o processo de secagem favorece o uso
deste método mesmo quando a inoculação inicial no produto necessita ser alta.
Para modelagem da sobrevivência da Salmonella em farelo de soja durante

o armazenamento, foram utilizadas dois sorotipos mais resistentes a dessecação no
farelo Schwarzengrund (IOC 5691) e Havana (IOC 2307) além da S. Typhimurium
(14028). Considerando o método de inoculação úmida o tempo necessário para
redução de 1 log da população microbiana (δ) das cepas citadas, foi respectivamente,
40, 45 e 22 dias a 25°C e 2,7, 3,9 e 3,5 dias a 37°C. A análise de variância (ANOVA)
demostrou que a temperatura a cepa e a interação temperatura×cepa foram os fatores
que influenciaram significativamente (p<0,001) a sobrevivência da Salmonella durante
o armazenamento. Em ambiente de alta pressão osmótica pode ocorrer a perda de
viabilidade celular com o aumento da temperatura (Yannick Mille, Laurent Beney,
2002). Danos na membrana e vazamento citoplásmático são algumas das causas de
rapido declino populacional nessas condições (Ebrahimi, Csonka e Alam, 2018). A 25°
°C as cepas apresentaram maior sobrevivência e o tempo necessário para redução
de 1 log da população microbiana foi maior para os sorotipos Schwarzengrund (IOC
45
5691) e Havana (IOC 2307) (isolados da cadeia produtiva do farelo de soja) do que
da Typhimurium (14028). Isso demostra a alta resistência e a possibilidade de
sobrevivência por longos períodos no farelo de soja, o que torna essa matéria prima
um potencial contaminante da ração animal.
A justificativa para sobrevivência da Salmonella em ambientes de baixa

atividade de água está relacionado a mecanismos desenvolvidos por essas bactérias.
Mudança da conformação da membrana (Li et al., 2012), regulação osmótica da célula
com o meio (Finn et al., 2013; Li et al., 2012), aumento do influxo de potássio
pelo canal transportador kdp (Gruzdev et al., 2012), aumento do nível de degradação de
RNA ribossômico que tem sido descrito como contribuinte na adaptação das células
estressadas (Deng, Li e Zhang, 2012; Deutscher, 2006). Outras mudanças fisiológicas
e genéticas podem ocorrer, favorecendo a adaptação desses micro-organismos ao
meio em que se encontram.
46
CONCLUSÃO GERAL
O estudo demostrou que cepas de Salmonella podem sobreviver por longos

períodos no farelo de soja, sendo uma possível fonte de contaminação da ração
animal, possibilitando a disseminação do patógeno na cadeia produtiva de alimentos.
A resistência apresentada pelas cepas na areia também representa um grande fator
de importância, isso devido ao isolamento de Salmonella em pó e ambientes de
processamento do farelo, indicando possibilidade de contaminação cruzada. Sendo o
farelo de soja uma matéria prima imprescindível na fabricação de ração animal e um
produto de grande impacto no agronegócio do Brasil, este estudo contribui para
conscientização de implementação ferramentas como BPF (Boas Práticas de
Fabricação) e APPCC (Análise de Perigo e Pontos Críticos de Controle). Com isso,
garantindo a qualidade e inocuidade do produto e consequentemente resultando na
proteção da saúde pública.
47
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Sudre AnaPaulaNorberto M

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Engenharia de Alimentos

ANA PAULA NORBERTO SUDRÉ

DETERMINAÇÃO DA VARIABILIDADE DA RESISTÊNCIA À

Determinação da variabilidade da resistência à dessecação de cepas de Salmonella

Dissertação apresentada à Faculdade de

Orientador: Prof. Dr. Anderson de Souza Sant’Ana

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À TESE DEFENDIDA

Sudré, Ana Paula Norberto, 1992

Orientador: Anderson de Souza Sant'Ana.

1. Farelo de soja. 2. Salmonella. 3. Modelagem preditiva. 4. Atividade de

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Determination of the variability of resistance to desiccation of

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a)

Dr. Anderson de Souza Sant’Ana (Orientador)

Dra. Magdevis Yanet Rodriguez Caturla

Dr. Humberto Moreira Húngaro

A ATA da defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora,

A Deus, por tudo.

A professora Dra. Verônica por sempre me apontar um caminho e me ajudar quando

Ao meu orientador, Professor Dr. Anderson de Souza Sant’Ana.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico Tecnológico (CNPq) pelo apoio

Aos meus colegas de laboratório.

A UNICAMP pela oportunidade.

A todos que de alguma forma contribuíram nessa fase.

Palavras-chave: Farelo de soja, Salmonella, modelagem preditiva, atividade de água

Keywords: Soybean meal, Salmonella, predictive modeling, water activity

INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................................... 12

Salmonella é uma enterobactéria patogênica responsável por infecções em

Como o farelo de soja é um dos principais ingredientes da ração e é

Os testes de desafio tem sido frequentemente empregados pela indústria para

contaminação e os micro-organismos associados a contaminação, tornam os testes

Dessa forma, conhecendo a importância do farelo de soja para economia do

Salmonella em alimentos de baixa atividade de água

A Salmonella entérica é reconhecida em todo o mundo como uma das

Os produtos frequentemente associados a presença de Salmonella são

Experimentos demostraram que cepas de Salmonella podem sobreviver por

Em condições de estresse osmótico, algumas respostas fisiológicas são

Outro aspecto extremamente preocupante é que a exposição a condições de

tolerância à tratamentos térmicos (Chiewchan, Pakdee e Devahastin, 2007; Fong e

Além das implicações mencionadas acima, a exposição de Salmonella a baixa

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