Araujo 9788575413937 PDF

Doena de chagas:
manual para experimentao animal
Tania C. Arajo-Jorge Solange L. de Castro (Orgs.)
SciELO Books / SciELO Livros / SciELO Libros JORGE, TCA., and CASTRO, SL., orgs. Doena de chagas: manual para experimentao animal [online]. Rio de Janeiro: Editora FIOCRUZ, 2000. 368 p. Antropologia e Sade collection. ISBN 8585676-75-2. Available from SciELO Books <http://books.scielo.org>.
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Edio comemorativa aos 90 anos da descoberta da doena de Chagas (1909-1999) Tania C. Arajo-Jorge & Solange L. de Castro
organizadoras
Copyright 2000 dos autores Todos os direitos desta edio reservados FUNDAO OSWALDO CRUZ / EDITORA ISBN: 85-85676-75-2
Capa, projeto grfico e tratamento de imagens Anglica Mello Editorao eletrnica Beatriz de Moraes Vieira Preparao de originais e copidesque Solange L. de Castro Reviso Marly Willcox Reviso final Marcionlio Cavalcanti de Paiva
Catalogao-na-fonte Centro de Informao Cientfica e Tecnolgica Biblioteca Lincoln de Freitas Filho
J82d
Jorge, Tania C. de Arajo (org.) Doena de chagas: manual para experimentao animal. / Organizado por Tania C. de Arajo-Jorge e Solange Lisboa de Castro. Rio de Janeiro : Editora Fiocruz / Instituto Oswaldo Cruz, 2000. 368p., il., tab. 1. Doena de Chagas-induzido quimicamente 2. Animais de Laboratrio 3. Manuais de Laboratrio [tipo de publicao] I. Castro, Solange Lisboa de (org.)
CDD - 20.ed. 616.9363 2000 EDITORA FIOCRUZ Rua Leopoldo Bulhes, 1480, trreo Manguinhos 21041-210 Rio de Janeiro RJ Tels.: (21) 598-2701 e 598-2702 Telfax: (21) 598-2509
Para Carlos Chagas, o pai, o desbravador de um caminho que hoje muitos pesquisadores brasileiros esto seguindo, mirando-se no seu exemplo nico e admirvel de cientista, mdico e formador de investigadores para lidar com problemas que atingem a gente brasileira.
Carlos Chagas, o filho, que nos conduziu pelos caminhos da cincia, da filosofia e da tica, atravs de suas aulas, conselhos e apoio para atividades de divulgao e popularizao cientficas, alm das muitas caronas na volta para casa aps o dia-a-dia da rotina com que nos formamos cientistas no Instituto de Biofsica que leva seu nome. O prazer do convvio com este grande mestre s no suplanta o privilgio de termos podido estar e aprender com ele.
Maria P. Deane, a cientista brilhante, a mulher de fibra, ousada na vida e na cincia, a voz dos pesquisadores em tantas lutas, questionadora de paradigmas, e sobretudo a grande mestra na experimentao animal, que nos ensinou a ter um profundo respeito pelos animais de laboratrio. Sentimos sua ausncia.
Agr adecimentos ra
Este trabalho foi realizado com o estmulo de muitos colegas, a quem agradecemos. Gostaramos de apresentar agradecimentos especiais
aos nossos alunos, que nos vm desafiando para uma postura mais ativa e criativa no ensino da parasitologia, biologia celular e imunologia, e que testaram, na prtica, cada um dos protocolos apresentados neste manual, por vezes assinando a co-autoria de alguns captulos; aos nossos primeiros orientadores, professores Wanderley de Souza, Maria de Nazareth Meirelles e Mcia M. Oliveira, que alm de nos apresentarem ao Trypanosoma cruzi e aos camundongos infectados, nos brindam com sua amizade firme e constante; ao professor Jos Rodrigues Coura, incansvel mestre e batalhador, que est sempre pronto a nos ajudar, seja com aulas, textos, conselhos, sugestes e, sobretudo, pelo empenho para a edio final desta publicao; ao professor Zigman Brener, que vem acompanhando e influenciando, continuamente, nosso trabalho desde os tempos de estudantes, at nossa atuao profissional, sempre com sugestes oportunas e com inestimvel ajuda cada vez que solicitamos. No sem razo que ele vem participando, sistematicamente, das diversas bancas de teses que doutoraram os pesquisadores do nosso departamento; aos colegas do Departamento de Ultra-estrutura e Biologia Celular do IOC que nos deram cobertura logstica, dividindo muitas das atribuies que deixamos acumular por conta do tempo necessrio para a concluso deste trabalho; aos nossos colaboradores para a redao dos diferentes captulos, no s pela qualidade das contribuies, como pela pacincia at a publicao final; pacientemente nos aguardaram chegar tarde, dias seguidos, para que conclussemos o preparo destes originais.
aos nossos filhos Julia, Pedro, Luiza e Bruno, e aos nossos companheiros, Luiz e Alexandre, alm da Lcia, que
A u t o res
Ana Maria Jansen - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - jansen@gene.dbbm.fiocruz.br Ana Paula S. Pinho - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - pinhoap@gene.dbbm.fiocruz.br Andrea Henriques Pons - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - andreah@gene.dbbm.fiocruz.br Andreia Pereira de Souza - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - souzaap@gene.dbbm.fiocruz.br Angela C. V. Junqueira - Depto de Medicina Tropical, IOC/Fiocruz - junqueir@gene.dbbm.fiocruz.br Bianca Perdigo Olivieri - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - olivieri@gene.dbbm.fiocruz.br Celia V. P. Cardoso - Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz - cardoso@cecal.fiocruz.br Claude Pirmez - Depto de Bioqumica e Biologia Celular, IOC/Fiocruz -/Fiocruz - pirmez@gene.dbbm.fiocruz.br Claudia M. L. M. Coutinho - Instituto de Cincias Biolgicas/UFF - claudia@gene.dbbm.fiocruz.br Cristiane V. Lisboa - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - gltp@gene.dbbm.fiocruz.br David A. Campbell - School of Medicine/Universidade da Califrnia/LA/EUA - dcp@pop.ucla.edu Edmundo Chapadeiro - Disciplina de Parasitologia/Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro Elen Mello de Souza - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - elen@gene.dbbm.fiocruz.br Eliane Lages-Silva - Disciplina de Parasitologia/Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro Elisa Cupolillo - Depto de Imunologia, IOC/Fiocruz - ecupoli@ioc.fiocruz.br George A. dos Reis - Lab. de Biologia Imunitria, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho/UFRJ - gdosreis@ibccf.ufrj.br Gisline A. Martins - Depto de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto/USP
- gmartins@fmrp.usp.br
Helene Santos Barbosa - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - helene@ioc.fiocruz.br Jacenir S. Mallet - Depto de Entomologia, IOC/Fiocruz - jacenir@gene.dbbm.fiocruz.br Joo Santana Silva - Depto de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto/USP
- jsdsilva@fmrp.usp.br
Jos Rodrigues Coura - Depto de Medicina Tropical, IOC/Fiocruz - jcoura@ioc.fiocruz.br Julio C. S. Aliberti - Depto de Parasitologia, Microbiologia e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto/USP
- jaliberti@atlas.niaid.nih.gov
Katia S. Calabrese - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - calabres@gene.dbbm.fiocruz.br Luis Eduardo Ramrez - Disciplina de Parasitologia/Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro parasito.fmtm@mednet.com.br
Marcelo Einicker-Lamas - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - einicker@ibccf.biof.ufrj.br Marcos Antonio P. Marques - Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz - marques@cecal.fiocruz.br Maria da Glria Boneceni-Almeida - Depto de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, CPHEC/Fiocruz galmeida@gene.dbbm.fiocruz.br
Maria de Nazareth Meirelles - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - meirelle@gene.dbbm.fiocruz.br Maria Nazar Soeiro - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - nazare@gene.dbbm.fiocruz.br Maria Teresa Rivera - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - jean.vanderpas@skynet.be
Mecia M. Oliveira - Lab. de Biomembranas, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho/UFRJ - mecia@chagas.biofis.ufrj.br Mirian C. Pereira - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - mirian@gene.dbbm.fiocruz.br Octavio Fernandes - Depto de Medicina Tropical, IOC/Fiocruz - octaviof@gene.dbbm.fiocruz.br Paulo Renato Antas - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - pzuquim@gene.dbbm.fiocruz.br Pedro H. Cabello - Depto de Gentica, IOC/Fiocruz - cabello@gene.dbbm.fiocruz.br Regina Helena Mangia - Depto de Medicina Tropical, IOC/Fiocruz Renato Marchewsky - Lab. de Neurovirulncia, Biomanguinhos/Fiocruz Ricardo de Mattos Santa-Rita - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz -santarit@gene.dbbm.fiocruz.br Sebastio Enes R. Couto - Centro de Criao de Animais de Laboratrio/Fiocruz - scouto@cecal.fiocruz.br Silvana Marques Arajo - Depto Anlises Clnicas/Universidade Estadual de Maring - marqueslima@wnet.com.br Solange Lisboa de Castro - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - solange@ioc.fiocruz.br Sonia G. Andrade - Centro de Pesquisa Gonalo Moniz/Fiocruz - sgandrade@cpggm.fiocruz.br Suzana Corte-Real Faria - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - scrf@ioc.fiocruz.br Sylvio Celso G. Costa - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - sycosta@gene.dbbm.fiocruz.br Tania C. Arajo-Jorge - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - taniaaj@ioc.fiocruz.br Tania Zaverucha do Vale - Depto de Protozoologia, IOC/Fiocruz - taniazo@gene.dbbm.fiocruz.br Valdo D. Silva - Disciplina de Fisiologia/Faculdade de Medicina do Tringulo Mineiro Vinicius Cotta-de-Almeida - Depto de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC/Fiocruz - vinicius@gene.dbbm.fiocruz.br Wilson Savino - Depto de Imunologia, IOC/Fiocruz - savino@gene.dbbm.fiocruz.br
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Sumrio
Apresentao ...................................................................................................................................................................................... 13
Parte I Conceitos atuais em doena de Chagas humana e experimental

1. Desafios da pesquisa cientfica aps 90 anos da descoberta da doena de Chagas 1.1 Questes da doena humana para trabalho em modelos animais Tania C. Arajo-Jorge & Solange L. de Castro ...................................................................................................................... 17 1.2 A doena de Chagas humana e seus modelos de estudo Jos Rodrigues Coura ............................................................................................................................................................... 19 2. Vetores da doena de Chagas e sua relao com o hospedeiro vertebrado e o parasita Jacenir R. dos Santos Mallet .................................................................................................................................................... 25 3. A ecologia e a complexidade dos ciclos de transmisso do Trypanosoma cruzi na natureza Ana Maria Jansen, Cristiane V. Lisboa, Ana Paula S. Pinho, Renato Sergio Marchewsky, Regina H. R. Mangia, Elisa Cupolillo & Octavio Fernandes .................................................................................................. 33 4. Resposta do hospedeiro infeco 4.1 Respostas imune inata, inflamatria e de fase aguda na doena de Chagas Tania C. Arajo-Jorge ............................................................................................................................................................ 39 4.2 A resposta imune celular na infeco experimental por Trypanosoma cruzi George A. Dos Reis ................................................................................................................................................................ 48 4.3 A resposta imune humoral e as funes do linfcitos B na infeco por Trypanosoma cruzi Maria Teresa Rivera ................................................................................................................................................................ 51 4.4 Participao de citocinas no determinismo de resistncia ou susceptibilidade infeco experimental por Trypanosoma cruzi Gisline A. Martins, Julio C. S. Aliberti & Joo S. Silva ...................................................................................................... 55 4.5 O timo como rgo-alvo na infeco pelo Trypanosoma cruzi Vincius Cotta-de-Almeida & Wilson Savino ......................................................................................................................... 60 4.6 Imunomodulao da resposta T-dependente na doena de Chagas experimental Sylvio Celso G. da Costa, Katia S. Calabrese & Tania Zaverucha do Vale .............................................................................. 65 5. Hormnios na doena de Chagas 5.1 Sistema adrenrgico Mecia M. Oliveira ................................................................................................................................................................... 87 5.2 Hormnios sexuais Solange L. de Castro & Elen Mello de Souza ........................................................................................................................ 90 5.3 Prolactina Maria Teresa Rivera ................................................................................................................................................................ 93 6. Relao materno-fetal na infeco chagsica experimental Maria Teresa Rivera & Silvana Marques de Arajo .............................................................................................................. 103 7. Quimioterapia experimental Solange L. de Castro, Ricardo de Mattos Santa-Rita & Marcelo Einicker-Lamas ................................................................. 111
Parte II Protocolos e mtodos de trabalho em doena de Chagas experimental

8. Normas de segurana para o trabalho com Trypanosoma cruzi Tania C. Arajo-Jorge & Claude Pirmez .............................................................................................................................. 125
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9. Modelos animais para o estudo in vivo da doena de Chagas 9.1 Camundongo Tania C. Arajo-Jorge .......................................................................................................................................................... 134 9.2 Rato Luis Eduardo Ramrez, Valdo D. Silva, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro ........................................................... 140 9.3 Calomys callosus Sonia G. Andrade ................................................................................................................................................................. 143 9.4 Hamster Luis Eduardo Ramrez, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro .................................................................................... 145 9.5 Coelho Luis Eduardo Ramrez, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro ................................................................................... 149 9.6 Co Sonia G. Andrade ................................................................................................................................................................. 157 9.7 Macaco Maria da Glria Boneceni-Almeida ........................................................................................................................................ 160 10. Planejamento de experimentos e escolha dos modelos: hospedeiro e parasita 10.1 Critrio de escolha para o modelo de hospedeiro animal e da cepa do parasita Solange L. de Castro & Tania C. Arajo-Jorge .................................................................................................................... 175 10.2 Trypanosoma cruzi: cepas de eleio Octavio Fernandes & David A. Campbell .............................................................................................................................. 178 10.3 Planejamento de um experimento com infeco in vivo pelo Trypanosoma cruzi Tania C. Arajo-Jorge .......................................................................................................................................................... 182 10.4 Manuteno e obteno dos diferentes estgios evolutivos em laboratrio Helene Santos Barbosa .......................................................................................................................................................... 184 11. Cuidados especiais com animais no biotrio de experimentao Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera, Celia V. P. Cardoso & Sebastio E. R. Couto ................................................ 197 12. Controle da qualidade dos animais antes da infeco experimental Celia V. P. Cardoso, Marcos Antonio P. Marques, Tania C. Arajo-Jorge, Solange L. de Castro & Maria Teresa Rivera .............................................................................................................................................. 203 13. Sangria de animais e preparo de inculos para infeco experimental Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera, Solange L. de Castro & Marcos Antonio P. Marques ............................................................................................................................................................................ 215 14. Avaliao de parmetros parasitolgicos e de mortalidade Solange L. de Castro, Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera & Angela C. V. Junqueira .............................................................................................................................................................................. 219 15. Quantificao de marcadores humorais de inflamao, de resposta imune e de leso tissular nos animais infectados Tania C. Arajo-Jorge, Paulo R. Z. Antas & Solange Lisboa de Castro ............................................................................... 237 16. Preparo de clulas para avaliao de parmetros inflamatrios e imunolgicos Tania C. Arajo-Jorge, Vincius Cotta-de-Almeida, Bianca P. Olivieri & Andrea Henriques-Pons ....................................... 251 17. Coleta e processamento de rgos e tecidos para avaliao da infeco Andra Pereira de Souza, Suzana Crte-Real Faria, Claudia M. L. M. Coutinho, Maria Nazar C. Soeiro & Claude Pirmez ..................................................................................................................................... 265 18. Obteno de clulas de camundongo para estudos in vitro em cultivo primrio 18.1 Interao do Trypanosoma cruzi com as clulas hospedeiras: estudos in vitro Maria de Nazareth L. Meirelles & Tania C. Arajo-Jorge ................................................................................................... 289 18.2 Protocolos de cultura primria Helene S. Barbosa, Mirian C. S. Pereira & Maria de Nazareth S. L. Meirelles .................................................................... 297 19. Sistematizao e anlise de resultados: confeco de planilhas, tabelas, grficos e anlises estatsticas Solange L. de Castro, Tania C. Arajo-Jorge & Pedro H. Cabello ........................................................................................ 315 20. Anexos ....................................................................................................................................................................................... 331
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A p res e n t a o
A doena de Chagas no apenas uma das maiores endemias da Amrica Latina. a doena que marcou, profundamente, a histria da Escola de Manguinhos, como era conhecido o Instituto Oswaldo Cruz (IOC) no incio do sculo. Marcou, pelo orgulho do IOC em ter sediado o trabalho cientfico e intelectual de Carlos Chagas, caso nico na histria da medicina em que o mesmo cientista descreve uma doena at ento desconhecida, identifica seu agente etiolgico e seu mecanismo de transmisso. Esse grande cientista no s atraiu outros colegas como tambm formou novos pesquisadores, compondo uma equipe atuante nos mais diversos campos como patologia, diagnstico e terapia. Marcou, tambm, pela forte influncia que exerceu na conduo das pesquisas no IOC ao longo deste sculo prestes a terminar. Desde a clssica tese de doutorado de Emmanuel Dias, aluno de Carlos Chagas, o Instituto conta, s centenas, as teses que tm sido orientadas por seus pesquisadores nas temticas bsicas e clnicas da doena de Chagas, sobre os mais variados aspectos do comportamento biolgico do seu causador, o Trypanosoma cruzi, em humanos e em diferentes modelos animais, ou nos triatomneos, seus vetores naturais. Desde sua descoberta, em 1909, por Carlos Chagas, a doena de Chagas tem sido estudada ininterruptamente no Instituto e em um nmero crescente de instituies brasileiras, latino-americanas e de outros pases. Tem sido ensinada em cursos de graduao (medicina, farmcia, enfermagem, biomedicina etc.), em diversas disciplinas (doenas infecciosas, patologia, cardiologia, gastroenterologia, epidemiologia etc.). Em cursos de ps-graduao, a doena de Chagas aparece em disciplinas semelhantes, em nveis mais aprofundados. Porm, onde mais se aprende e se atualiza sobre esta doena nas reunies anuais sobre pesquisa bsica e sobre pesquisa aplicada em doena de Chagas e leishmaniose, as j famosas reunies de Caxambu e de Uberaba, respectivamente. Nelas se forjou uma comunidade cientfica integrada, nacional e internacionalmente, que contribuiu para um forte impacto da participao brasileira no cenrio da cincia mundial, especialmente em parasitologia. Nessas e em outras reunies promovidas por sociedades cientficas como as de medicina tropical, epidemiologia, parasitologia, protozoologia, imunologia, entre outras, tm se formado geraes de pesquisadores brasileiros ativos na investigao sobre doena de Chagas no Brasil. Em 1999, aps noventa anos da descoberta da doena, temos a grata satisfao de observar que este manual, editado para suprir uma lacuna na rea de experimentao animal em doena de Chagas, foi em grande parte escrito por profissionais e alunos tanto do IOC como de outras unidades da Fundao Oswaldo Cruz (Fiocruz), como o Centro de Pesquisas Gonalo Moniz e o Centro de Criao de Animais de Laboratrio. Das 49 pessoas envolvidas na redao deste manual, 38 so da Fiocruz, uma desmonstrao de que a instituio ingressar no prximo milnio com um trabalho cada vez mais integrado entre suas diversas equipes de pesquisa e produo. Quando organizamos a disciplina Doena de Chagas Experimental, verificamos que no conhecamos nenhuma disciplina acadmica, em qualquer curso de graduao ou ps-graduao no Brasil, que focalizasse especificamente essa temtica. O desafio de orientar estudantes de mestrado e doutorado em trabalhos de pesquisa sobre modelos animais da doena de Chagas, e articul-los com aspectos da doena humana, nos levou a tentar sistematizar, em uma disciplina, o ensino dos aspectos bsicos da doena e dos procedimentos para o trabalho com animais. O curso, essencialmente prtico, se propunha a apresentar um experimento completo para estudo de um determinado aspecto do desenvolvimento da infeco experimental em camundongos. Na primeira verso, em 1994, para cinco alunos, reunimos uma bibliografia geral, com captulos de livros e revises em
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peridicos, que nos serviram para introduzir, conceitualmente, os problemas e preparamos as primeiras apostilas de protocolos de trabalho experimental. Na segunda verso da disciplina, para vinte alunos, em 1996, o CNPq financiou a vinda da Prof. Maria Teresa Rivera para um perodo de quarenta dias no Brasil. Introduzimos, ento, alm das atividades prticas, uma srie de conferncias de pesquisadores do IOC e de outros centros. Essas aulas tericas sobre diversos aspectos da doena de Chagas tiveram um grande sucesso, levando a dois desdobramentos. O primeiro foi a organizao deste livro, que sistematiza e consolida as contribuies dos pesquisadores que participaram e prontamente redigiram os captulos que o compem. A eles nossos profundos agradecimentos. O segundo desdobramento foi a extenso da disciplina para uma outra: Atualizao em Doena de Chagas. Atualmente ambas so oferecidas a cada dois anos na ps-graduao do IOC, com ampla participao de pesquisadores do Instituto e de convidados. com orgulho, e com muito prazer, que apresentamos comunidade este livro, inspirado no pioneiro, editado em 1983 por Carlos Morel no seu curso Genes and Antigens of Parasites, que tem servido como livro base de procedimentos em bioqumica e imunologia de tripanosomatdeos para muitas geraes de novos cientistas. Assim como os cursos, o livro compe-se de duas partes, uma com conceitos tericos atuais sobre a doena e a resposta do hospedeiro infeco, e outra que sistematiza procedimentos prticos para abordagens parasitolgicas e imunopatolgicas da doena de Chagas em modelos animais. claro que a atual multidisciplinaridade indispensvel cincia moderna nos impede de fazer uma publicao completa e nos remete a outros manuais de protocolos prticos, seja em bioqumica, em imunologia ou em biologia celular. Da mesma forma, referimos um conjunto de publicaes recentes que podem complementar os aspectos introduzidos nos captulos tericos deste manual. Na falta de um manual prtico atual de parasitologia experimental, esperamos que essa publicao possa ser til. Pretendemos que o livro contribua tambm para o engajamento futuro de outros colegas na redao de aspectos tericos e prticos da experimentao animal que certamente ainda precisam ser desenvolvidos e, por isso, permanecem como lacunas nesta edio. Esperamos que a verso em CD-ROM, que se seguir a este manual, garanta agilidade e a possibilidade de atualizao de arquivos a todos os que se interessarem por esse trabalho, agora e no futuro. A escolha da lngua portuguesa foi definida pelo pblico que pretendemos atingir: estudantes brasileiros e latino-americanos, que formaro a nova gerao de cientistas com que o Brasil contar no incio dos prximo sculo e milnio, e que ainda encontraro cinco a seis milhes de indivduos chagsicos sob o risco de morte por cardiopatia a desafiar nossa capacidade de explicao para o fato de que alguns desenvolvem a doena enquanto outros equilibram muito bem seu convvio na relao parasita-hospedeiro. Todas as contribuies de leitores na avaliao deste livro, seja em sua utilidade como guia prtico ou em seus aspectos terico-conceituais, sero muito bem-vindas e agradecidas.
Rio de Janeiro, agosto de 1999 Tania C. de Arajo-Jorge & Solange Lisboa de Castro
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Desafios da pesquisa cientfica aps 90 anos da descoberta da doena de Chagas
Con ceitos A tu ais em D oena de Ch a g as Conceitos tuais H um an a e E rimental uman ana Expe xperimental xpe
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Captulo 1
De sa f ios d a pe squisa cientf Desa saf pesquisa cientfii c a aps 90 anos d a de scobe rta d a doena de Ch a g as descobe scoberta da
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Questes da Doena Humana para Trabalho em Modelos Animais

Tania C. Arajo-Jorge & Solange L. de Castro
Quando Dr. Carlos Chagas viu pela primeira vez, sob as lentes de seu microscpio, o protozorio flagelado que denominou Schizotrypanum cruzi, em homenagem a seu mestre e amigo Oswaldo Cruz, comeou a estudar a biologia desse interessante microorganismo e seu comportamento em animais experimentais. Este fato, nico na medicina, da mesma pessoa descobrir e descrever o quadro clnico de uma nova doena, com um novo agente etiolgico, o ciclo de vida desse agente, seus vetores e reservatrios, foi explicado mais tarde pelo prprio Chagas (Chagas 1922): ...quando no sangue perifrico de uma criana febril, observamos o flagelado patognico, de sua biologia j possuamos noo completa, adquirida em demorados estudos anteriores, usando sobretudo animais inoculados experimentalmente com a urina de triatomneos ou com o sangue de macacos infectados. Desde essa poca, cientistas em todo o mundo tentam desvendar questes obscuras dessa relao parasitahospedeiro para as quais hoje, aps noventa anos da descoberta da doena, no se tem resposta. Como o Trypanosoma cruzi entra em tantos tipos celulares diferentes? Como pelo menos parte da populao de parasitas que infecta um indivduo escapa da potente resposta imune e mantm uma carga parasitria latente e em equilbrio com seu hospedeiro por todo o longo perodo em que permanece assintomtico? Os prprios pacientes e seus parentes tambm formulam claramente questes ainda no esclarecidas como: doutor, por que meu irmo, que sempre viveu nas mesmas condies que eu, tem o corao bom e o meu est assim to doente? ou doutor, no tem um remdio que possa matar o bicho que est causando esse inchao na minha barriga? ou ainda doutor, por que esse remdio que o senhor me deu est me fazendo to mal?. Com o sucesso da iniciativa das Organizaes Mundial e Pan-americana da Sade no programa de erradicao da transmisso vetorial, e com a melhoria nas tcnicas de diagnstico e da qualidade do sangue visando a interrupo da transmisso transfusional ou atravs de transplante de rgos, o problema de novos casos de doena de Chagas na Amrica Latina poder estar resolvido na primeira dcada do novo sculo se as medidas que tm sido
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DOENA DE CHAGAS: MANUAL DE EXPERIMENTAO ANIMAL
eficientes para o controle da infestao de casas por Triatoma infestans forem igualmente eficazes para diferentes vetores como Rhodnius prolixus e outras espcies. O Uruguai j teve xito na interrupo da transmisso vetorial e h previso de certificao da interrupo da transmisso no Brasil e no Chile para 2001 (WHO, 1999). Com isso, o foco dos estudos deve, necessariamente, ser direcionado mais para os pacientes chagsicos e para as leses que evoluem durante as fases indeterminada e crnica da infeco. Acreditamos que, nesse campo, permanecem como desafios o encontro de respostas definitivas a questes como:
qual a fisiopatologia da miocardite chagsica, dos megas, e das leses neurolgicas? que fatores determinam a patognese em rgos especficos? quais os mecanismos decisivos para a cronificao da infeco: mecanismos de imunossupresso ou de
imunopatognese? Ou ambos?
o que protege da doena os indivduos infectados em fase indeterminada? que fatores concorrem para a evoluo de pacientes da fase indeterminada para a crnica, disparando o surgimento
de leses com diferentes aspectos antomo-clnicos? qual a influncia da infeco materna na transmisso congnita e no desenvolvimento de doena em seus descendentes? existem, ou no, populaes de parasitas com tropismo por certos rgos? h possibilidades reais de imunoproteo e perspectivas concretas para o desenvolvimento de vacinas? Quais as estratgias mais promissoras de imunoproteo? a eficcia de quimioterpicos tripanocidas est associada a diferentes populaes parasitrias? como aprimorar o tratamento etiolgico de individuos infectados? Como intervir, terapeuticamente, na fase indeterminada da infeco? como melhorar o tratamento sintomtico de pacientes crnicos? como melhorar a qualidade de vida dos seis milhes de pacientes ainda infectados? como proceder profilaxia e ao tratamento de infeces por T. cruzi reativadas por imunossupresso, e quais as conseqncias do no-tratamento? Uma pesquisa sobre a produo cientfica recente em doena de Chagas, na base de dados bibliogrficos MedLine, feita em julho de 1999, identificou o seguinte quantitativo:
Palavra-chave 1964-1999 5.240 415 523 816 5.206 234 222 324 1995-1999 1.098 129 128 172 1.279 69 92 99 1990-1999 2.155 250 224 355 2.487 155 157 186
Chagas disease Chagas disease & review Chagas disease & chemotherapy Chagas disease & pathology T. cruzi T. cruzi & review T. cruzi & animal models T. cruzi & experimental infection
Mais de 90% das referncias correspondem a trabalhos originais e apenas 6% dos trabalhos esto associados a estudos com infeco experimental. At estudos de quimioterapia, reconhecidamente pouco numerosos frente necessidade de novas drogas clnicas e profilticas, atingem cerca de 10% da produo cientfica em doena de Chagas, um percentual maior que o de estudos com infeco experimental. Talvez a heterogeneidade de resultados obtidos em diferentes modelos e a complexidade do trabalho com experimentao animal estejam na origem dessa carncia de estudos, bem como na ausncia de consenso quanto aos modelos mais adequados para cada aspecto da doena a ser estudado. Como parte das comemoraes dos noventa anos da descoberta da doena de Chagas, muitas revises e livros vm sendo lanados sobre o assunto e fica patente a necessidade de um uso mais objetivo dessa ferramenta j usada por Carlos Chagas: o estudo do curso da infeco por T. cruzi em modelos experimentais. A presente publicao se insere nesse contexto comemorativo e aponta a aplicabilidade dos modelos experimentais para a busca de respostas a questes como as levantadas acima.
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Finalmente, uma vez que a deteco das fases indeterminada e crnica tpicas da doena de Chagas em animais domsticos naturalmente infectados nas reas endmicas (como, por exemplo, o co) ainda no tem base bibliogrfica segura, apesar de no poder ser descartada, ressaltamos que este manual tratar da experimentao animal sobre a doena de Chagas, no sentido de reproduzir o mais fielmente possvel, aspectos da doena humana. Dos diferentes modelos revisados (ver Captulo 9), h ntida predominncia de dados obtidos em camundongos, um reflexo da produo global da pesquisa bsica em doena de Chagas. Talvez a sistematizao de protocolos para estudos em murinos, apresentada nos captulos finais deste manual, incentive a produo de um conjunto de protocolos para estudo em humanos, de modo a acelerar o encontro de respostas s questes acima.
1.2
A Doena de Chagas Humana e seus Modelos de Estudo

Jos Rodrigues Coura
Nenhum dos modelos experimentais da infeco chagsica utilizados, at o presente, reproduz rigorosamente a infeco e a doena humana como ela ocorre na natureza, nem mesmo quando se utilizam primatas filogeneticamente mais prximos do homem. Este fato se deve a diferenas espcie-especficas e intra-especficas, relacionadas, de um lado aos mecanismos de defesa de cada espcie de hospedeiro, particularmente ao seu sistema imune, e de outro s caractersticas das diversas cepas e clones do Trypanosoma cruzi, de seus determinantes antignicos, receptores e mecanismos de escape, os quais denominamos de complexo cruzi em trabalhos anteriores (Coura et al., 1966, 1990). Por outro lado, os mecanismos de seleo clonal por passagens sucessivas de cepas do T. cruzi em diferentes vetores e reservatrios, inclusive no prprio homem, e as transformaes por elas sofridas ao longo do tempo, quando mantidas em meios artificiais de cultura, transformam-nas em verdadeiras cepas de laboratrio, com perda total ou parcial de suas caractersticas originais. Dois outros aspectos extremamente importantes, no que se refere s diferenas entre os estudos experimentais e a infeco natural do homem pelo T. cruzi, so a quantidade de parasitas inoculados nos estudos experimentais (inculo), em contraste com o nmero de parasitas que penetram no homem em uma primo-infeco natural ou em reinfeces, e o tipo de parasito (epi ou tripomastigota) utilizado, o que em ltima anlise depende, na infeco experimental, da deciso do pesquisador e, na natural, da qualidade do vetor e das chances de penetrao do T. cruzi na ocasio de sua deposio na pele ou mucosa do homem. Geralmente os inculos experimentais so enormes em relao s infeces naturais do homem. Por exemplo, um inculo considerado pequeno na maioria dos estudos de 103 (1.000 parasitas) para um camundongo jovem de 8 a 10 g, enquanto uma dejeo de triatomneo infectado contm em mdia 140 parasitas (Pereira et al., 1988), dependendo naturalmente da espcie vetora, do sexo, do tempo de infeco e evacuao, e do estgio do parasita (Wood, 1951; Dias, 1956; Zeledon et al., 1977; Perlowagora-Szumlewicz & Mller, 1979). Quantos desses parasitos depositados na pele ou na mucosa de uma criana ou adulto teriam a chance de penetrar? Dez, vinte, quarenta? Por outro lado os inculos experimentais so total, ou predominantemente, com formas infectantes (tripomastigotas), enquanto a metaciclognese do T. cruzi
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para formas infectantes, na infeco natural, varia muito de acordo com o vetor (Perlowagora-Szulemwicz & Moreira, 1994). Em reviso sobre os determinantes epidemiolgicos da doena de Chagas humana a infeco, a doena e sua morbi-mortalidade , apresentamos em detalhe (Coura, 1988) as diversas variveis condicionantes daqueles determinantes. Por outro lado, Andrade (1990), analisando a influncia de diversas cepas de T. cruzi, na patognese da miocardiopatia crnica em camundongos inbred e outbred, conclui que:
embora no descartando a influncia da cepa do hospedeiro, a anlise estatstica dos nossos resultados indicou a cepa do parasita como o fator mais importante na determinao da leso cardaca no camundongo, especialmente quando as cepas do tipo III so consideradas.
Em sntese, a interao parasita-hospedeiro de fundamental importncia na modulao da infeco, da doena e de sua morbi-mortalidade, tanto na infeco natural humana como na infeco experimental (Postan et al., 1987). Por infeco entende-se a penetrao, multiplicao e desenvolvimento do parasita no hospedeiro, enquanto doena so os danos causados no organismo pelo parasita e seus produtos ou pela prpria resposta do hospedeiro. O equilbrio ou desequilbrio entre o parasita e o hospedeiro definem a infeco, a doena e a sua morbi-mortalidade. Definitivamente no h uma correlao entre a virulncia e a patogenicidade de uma cepa de T. cruzi do homem, principalmente na fase crnica da infeco ou da doena, em relao infeco experimental com a mesma cepa (Schlemper Jr., 1982). Embora o homem seja o modelo ideal para estudos experimentais sobre a infeco e a doena de Chagas, por motivos ticos apenas os estudos observacionais podem ser realizados no homem, ou seja, observaes retrospectivas ou prospectivas sobre a prevalncia, a incidncia, a morbidade, a mortalidade e a letalidade decorrentes da infeco e da doena. Diversos tipos de estudos clnicos e epidemiolgicos descritivos e analticos podem ser realizados para definir a histria natural da doena de Chagas.
1.2.1 Estudos Descritivos

Os estudos descritivos so os mais freqentemente utilizados para avaliao da infeco e da doena de Chagas e analisam a forma e a distribuio da doena, enquanto os estudos analticos avaliam os seus determinantes. Para descrever a ocorrncia da doena, algumas questes amplas tm que ser respondidas: quem est afetado? onde e quando os casos ocorrem?, ou seja, necessrio especificar pessoa, lugar e tempo, de acordo com a epidemiologia clssica. Embora exista um nmero infinitamente grande de variveis relacionadas com a pessoa, as seguintes so
Figura 1 Prevalncia sorolgica da infeco chagsica por ida- Figura 2 Distribuio das formas clnicas de portadores de doena de Chagas de acordo com a faixa etria. Rio de Janeiro, 1960-1983 de e sexo. Virgem da Lapa, Minas Gerais, 1976
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fundamentais na investigao sobre a doena de Chagas: idade, sexo, grupo tnico ou raa, ocupao, classe social e exposio infeco. A infeco chagsica cumulativa e proporcional ao tempo e intensidade da exposio; portanto lgico que a prevalncia da infeco aumente com a idade, como pode ser observado na Figura 1. Da mesma forma a doena de Chagas, sendo uma doena evolutiva, tende a aumentar com a idade at a quarta/quinta dcada da vida (Figura 2), quando se estabiliza ou decresce devido mortalidade (Coura et al., 1983). Quanto ao sexo, por fatores ainda desconhecidos, a prevalncia da infeco chagsica, na maioria dos estudos, tem se mostrado maior no sexo feminino, enquanto a doena incide mais no masculino. Admite-se que a mulher, por permanecer mais tempo em casa, esteja mais exposta infeco, enquanto no homem, embora menos exposto, a infeco evolui mais freqentemente para a doena devido ao maior esforo fsico que desenvolve em suas atividades. Por outro lado, o negro, possivelmente por fatores coadjuvantes como a hipertenso arterial, tem tendncia ao agravamento mais freqente e precoce da doena de Chagas. A ocupao, a classe social e a exposio infeco esto intimamente relacionadas. A infeco e a doena de Chagas so mais freqentes em pessoas procedentes de reas rurais, de baixa condio social, que habitam ou habitaram cafuas, geralmente infestadas por triatomneos, portanto, com maior chance de exposio de seus habitantes infeco. Outros fatores pessoais como estado civil, variveis familiares como tamanho da famlia, ordem de nascimento, idade materna ao nascer, parecem de pouca importncia na prevalncia da infeco e da doena. Entretanto, a mortalidade precoce dos pais e irmos um dos indicadores importantes da doena de Chagas. Os estudos sobre fatores genticos como os sistemas ABO e HLA so ainda controversos e necessitam ser ampliados para melhores concluses. As variveis lugar e tempo (onde e quando) so muito importantes na investigao epidemiolgica da doena de Chagas. O lugar est intimamente relacionado distribuio e adaptao de triatomneos ao domiclio e o tempo est diretamente relacionado freqncia e intensidade da exposio. indispensvel em uma investigao epidemiolgica sobre a infeco chagsica que se mostre ao paciente uma coleo de triatomneos, adultos e ninfas, dos trs gneros (Panstrongylus, Rhodnius e Triatoma) e que a ele se pergunte: conhece? de onde? existe ou existia em sua residncia? j foi picado por esse inseto? quando e onde? qual a freqncia? Deve-se indagar ainda sobre o tipo de residncia, viagens e migraes e sobre a existncia de casos idnticos na famlia. De grande importncia a histria de cirurgias, partos, transfuso de sangue, manipulao de animais e de materiais potencialmente contaminados, principalmente em laboratrios.
1.2.2 Estudos Analticos

Os estudos analticos avaliam os determinantes ou as razes da maior ou menor freqncia de um certo evento. Em sntese, eles estudam o porqu, atravs de formulao de hipteses. Para testar uma hiptese sobre a causa de um evento, de uma doena ou de sua evoluo, h duas possibilidades: observao ou experimentao. No caso da doena de Chagas, por motivos ticos, como j foi referido, os estudos devem ser observacionais. Excepcionalmente podem-se fazer experimentos naturais, ou seja, observar um fenmeno que ocorre naturalmente, sem interromp-lo; por exemplo, verificar a incidncia da doena de Chagas, em uma rea com transmisso ativa, desde que a responsabilidade do controle no seja nossa. De qualquer forma esse tipo de estudo criticvel do ponto de vista tico. Os estudos analticos podem ser retrospectivos, prospectivos, seccionais, longitudinais e histricos prospectivos.
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1.2.2.1 Estudos retrospectivos

Os estudos retrospectivos necessariamente so compostos de casos e controles. No caso da infeco chagsica, casos so indivduos com sorologia, xenodiagnstico, hemocultura e/ou PCR positivo para infeco chagsica, enquanto controles so indivduos do mesmo grupo social, idade e sexo, porm com exames negativos para infeco chagsica. Vantagens dos estudos retrospectivos: so relativamente baratos, necessitam de um menor nmero de participantes, apresentam resultados relativamente rpidos e so mais adequados para doenas raras ou pouco freqentes. Desvantagens: informaes incompletas, possibilidade de variveis confusionais e de medir apenas o risco relativo. Para avaliao da doena de Chagas pareamos indivduos da mesma rea, idade e sexo, com sorologia positiva, com outros com as mesmas caractersticas e com sorologia negativa, os quais submetemos rotineiramente anamnese e a exames clnico, eletrocardiogrfico e radiolgico do corao e do esfago e ocasionalmente do clon. Exames mais sofisticados como ecocardiografia, eletrocardiografia dinmica (holter), ultrassonografia, eletrofisiologia cardaca e digestiva com estimulao e at bipsias cardaca e do aparelho digestivo orientadas, podem ser feitos; os trs primeiros no invasivos, sem restrio, e os trs ltimos com as restries ticas desses tipos de procedimentos na investigao clnica (Borges-Pereira et al., 1998).
1.2.2.2 Estudos prospectivos

Os estudos prospectivos ou de coortes, embora mais precisos, so pouco ou quase nunca utilizados na infeco chagsica devido a restries ticas, ao deixarmos deliberadamente um grupo de pessoas expostas infeco para analisarmos a sua incidncia e evoluo. Por outro lado, seriam estudos caros, necessitando o acompanhamento de um grande nmero de indivduos, por um longo perodo de tempo e com possibilidade de muitas perdas devido migrao, morte ou abandono do estudo.
1.2.2.3 Estudos seccionais

Este talvez seja o tipo de estudo mais utilizado em trabalhos de campo sobre a doena de Chagas. Nele definimos uma determinada populao exposta ao risco da infeco chagsica e verificamos os infectados atravs da prevalncia sorolgica e os no infectados, ou sorologicamente negativos, utilizando uma populao definida ou uma amostra representativa. Podemos determinar a intensidade da exposio pelo ndice de triatomneos domiciliados e infectados com T. cruzi, pelo tempo de exposio da populao e pela prevalncia sorolgica da infeco nos diversos grupos etrios. Podemos ainda determinar a morbidade da doena pareando, por idade e sexo, indivduos sorologicamente positivos e negativos e procedendo aos diversos tipos de estudos sorolgicos, parasitolgicos, clnicos, radiolgicos, eletrocardiogrficos e outros j mencionados para avaliao do risco relativo ou excesso de risco dos infectados. Tomando-se as devidas providncias para a interrupo da transmisso, atravs dos rgos encarregados do controle da doena de Chagas ou quando possvel com recursos prprios, estaremos eticamente autorizados a prosseguir o estudo evolutivo da morbidade, mortalidade e letalidade pela doena. Naturalmente essa populao dever receber a devida assistncia enquanto permanecermos na rea.
1.2.2.4 Estudos longitudinais

Embora seja um tipo de estudo prospectivo, no caso da doena de Chagas deve-se afastar o risco de novos casos, acompanhando casos e controles, aps a sua definio no primeiro estudo seccional. Periodicamente, de forma ideal anualmente, os casos e os controles devem ser reexaminados com a mesma metodologia ao longo do tempo. Dessa forma podemos acompanhar a morbidade, a mortalidade e a letalidade e estudar, at certo ponto, a histria natural da doena. Dentro dessa linha, os chamados estudos prospectivos histricos tendem a combinar as vantagens dos
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estudos retrospectivos, atravs de anotaes anteriores, com os estudos prospectivos, como no caso da doena de Chagas, com as limitaes j mencionadas para esse tipo de estudo.
Alguns modelos de estudos realizados

O primeiro estudo epidemiolgico que realizamos sobre a doena de Chagas foi do tipo descritivo multidisciplinar, visando caracterizar o ciclo ou os ciclos da doena no antigo estado da Guanabara (Coura, 1965), hoje municpio do Rio de Janeiro, que constou de avaliao sobre reservatrios e triatomneos silvestres, de estudo sorolgico em populaes autctones, de demanda hospitalar e doadores de sangue, da doena em doadores e receptores de sangue e de um estudo descritivo histrico em uma srie de migrantes e no migrantes do Rio de Janeiro. De forma analtica, podemos caracterizar dois tipos de ciclos do complexo cruzi (Coura et al., 1966): um silvestre entre animais e triatomneos, que somente acidentalmente atingia o homem e outro inter-humano, em nvel hospitalar, entre doadores e receptores de sangue. A partir daquele estudo, analisamos prospectivamente uma srie histrica, inicialmente de cem pacientes entre 170 estudados (Coura, 1965), acrescidos posteriormente para 260 (Coura, 1976) e depois para 510 (Coura et al., 1983), de vrios estados do Brasil, mostrando importantes diferenas regionais da morbidade da doena de acordo com a rea de procedncia dos pacientes. Em uma srie de trabalhos seccionais e longitudinais, realizados nos estados de Minas Gerais, Paraba, Piau e Amazonas (Coura et al., 1984, 1985, 1994a,b, 1995, 1996), confirmamos as variaes regionais da doena de Chagas e praticamente definimos a sua histria natural, desde a sua origem, como ocorre por exemplo na Amaznia, na forma de antropozoonose (infeco de animais que se transmite ao homem), onde triatomneos silvestres atacam o homem (Coura et al., 1994a), para reas intermedirias, como as do Nordeste, onde triatomneos como o T. brasiliensis so ubiquitrios, vivendo e transmitindo a infeco dentro e fora do domiclio, entre animais e o homem, sob a forma de anfixenose, at reas mais antigas, onde o T. infestans , ou foi, totalmente domiciliado e a infeco praticamente uma zooantroponose (zoonose mantida pelo homem). Na nossa experincia, nas reas primitivas, onde a infeco predominantemente silvestre, a doena de baixa morbidade por falta de adaptao do T. cruzi ao homem, enquanto nas reas intermedirias a morbidade da infeco humana menor que nas reas de zooantroponoses (reas antigas), onde o T. cruzi muito bem adaptado ao homem e a morbidade da doena de Chagas alta.
Referncias Bibliogrficas
ANDRADE, S. G. Influence of Trypanosoma cruzi strain on pathogenesis of chronic myocardiopathy in mice. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 85:17-27,1990. BORGES-PEREIRA, J.; XAVIER, S. S.; PIRMEZ, C. & COURA, J. R. Chagas disease in Virgem da Lapa, Minas Gerais, Brazil. IV. Clinical and epidemiological aspects of left ventricular aneurism. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 31:457463, 1998. CHAGAS, C. Descoberta do Trypanosoma cruzi e verificao da tripanozomase americana. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 15:6776, 1922. COURA, J. R. Contribuio ao estudo da doena de Chagas no Estado da Guanabara, 1965. Tese, Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro. COURA, J. R. Evolutive pattern in Chagas disease and life-span of Trypanosoma cruzi. In: American Trypanosomiasis Research Symposium. PAHO/WHO, Scientific Publication, 318:378-383, 1976. COURA, J. R. Determinantes epidemiolgicos da doena de Chagas no Brasil: a infeco, a doena e sua morbi-mortalidade. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 83 (Supl.I):192-402, 1988.
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COURA, J. R. Avanos do conhecimento sobre o complexo cruzi e a doena de Chagas. Boletim da Academia Nacional de Medicina, 151:141-144, 1990. COURA, J. R.; ABREU, L. L.; DUBOIS, L. E. G.; CORREIA LIMA, F. G.; ARRUDA Jr., E.; WILLCOX, H. P . F.; ANUNZIATO, N. & PETANA, W. Morbidade da doena de Chagas. II. Estudos seccionais em quatro reas de campo do Brasil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 79:101-124, 1984. COURA, J. R.; ABREU, L. L.; PEREIRA, J. B. & WILLCOX, H. P . F. Morbidade da doena de Chagas. IV. Estudo longitudinal de dez anos em Pains e Iguatama, Minas Gerais, Brasil. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 80:73-80, 1985. COURA, J. R.; ANUNZIATO, N. & WILLCOX, H. P . F. Morbidade da doena de Chagas. I. Estudo de casos procedentes de vrios estados do Brasil, observados no Rio de Janeiro. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 78:363-372, 1983. COURA, J. R.; BARRETT, T. V. & ARBOLEDA, M. N. Ataque de populaes humanas por triatomneos silvestres no Amazonas: uma nova forma de transmisso da infeco chagsica? Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 27:251-253, 1994a. COURA, J. R.; BORGES-PEREIRA, J.; ALVES FILHO, F. I.; CASTRO, J. A. F.; CUNHA, R. V.; COSTA, W. & JUNQUEIRA, A. C. V. Morbidade da doena de Chagas em reas do Serto da Paraba e da Caatinga do Piau. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 29:197-205, 1996. COURA, J. R.; FERREIRA, L. F.; PEREIRA, N. C. & SILVA, J. R. Tripanosoma do complexo cruzi em reservatrio silvestre no Estado da Guanabara. Estudo de sua patogenicidade. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 8: 125-133, 1966. COURA, J. R., JUNQUEIRA, A. C., GIORDANO, C. M. & FUNATSU, R. K. Chagas disease in the Brazilian Amazon. I - A short review. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 36:363-368, 1994b. COURA, J. R.; WILLCOX, H. P. F.; ARBOLEDA, M. N.; FERNANDES, O. & PAIVA, D. D. Chagas disease in the Brazilian Amazon. III. A cross-sectional study. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 37:415-420, 1995. DIAS, E. Observaes sobre a eliminao de dejees e tempo de suco em alguns triatomneos sulamericanos. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 54: 115-124, 1956. PEREIRA, J. B.; PESSOA, I. & COURA, J. R. Observaes sobre as dejees e o nmero de T. cruzi eliminados em diferentes espcies de triatomneos durante a alimentao. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 83 (Supl.):195, 1988. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A. & MOREIRA, C. J. C. In vivo differentiation of Trypanosoma cruzi. 1. Experimental evidence of the influence of vector species on metacyclogenesis. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 89:603-618, 1994. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A. & MLLER, C. A. Experiments in a search for an insect model for xenodiagnosis of chronic Chagas disease. I. The prevalence and intensity of infection of Trypanosoma cruzi in nine vector species. Anais do Congresso Internacional sobre Doena de Chagas, Rio de Janeiro, 1979, E11-E16. POSTAN, M.; BAILEY, J. J.; DVORAK, J. A.; McDANIEL, J. P . & POTALLA, E. W. Studies of Trypanosoma cruzi clones in inbred mice. Histopathological and eletrocardiographical response to chronic infection. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 37:541-549, 1987. SCHLEMPER Jr. B. R. Caracterizao de cepas do Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes com diferentes formas clnicas da doena de Chagas. 1982. Tese, Rio de Janeiro: Universidade Federal do Rio de Janeiro. WHO. Chile and Brazil to be certified free of transmission of Chagas disease. TDR News 59:10, 1999. WOOD, S. F. Importance of feeding and defecation times of insect vectors in transmission of Chagas disease. Journal of Economics Entomology, 44:52-54, 1951. ZELEDON, R.; ALVARADO, R. & JIRN, L. F. Observations on the feeding and defecation patterns of three triatomine species (Hemiptera-Reduviidae). Acta Tropica, 34:65-67, 1977.
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Vetores da doena de chagas e sua relao com o hospedeiro vertebrado e o parasita
Captulo 2
Vetores da Doena de Chagas e sua Relao com oHospedeiro Vertebrado e o Parasita

Jacenir R. dos Santos-Mallet
Os estudos relativos aos transmissores de doenas so vastos, abordando aspectos diversos da morfologia, fisiologia, controle, resistncia ao jejum, ecologia, taxonomia e muitos outros. Ao escrever este captulo no h pretenso de esgotar o assunto e sim levar ao estudante um resumo que relacione esses aspectos to diversos. O barbeiro, nome vulgar do vetor de Trypanosoma cruzi no Brasil, pertence Classe Insecta, Filo Arthropoda, que abrange uma grande variedade de espcies de importncia mdica como, por exemplo, membros da Ordem Diptera: Subordem Braquicera: Famlia Muscidae (mosca domstica = Musca domestica, promovendo a disseminao de bactrias, bacilos da febre tifide, cistos de protozorios e at mesmo ovos de helmintos); Famlia Cuterebridae (mosca do berne = Dermatobia hominis); Famlia Calliphoridae (mosca da bicheira = Cochiliomyia hominivorax); Famlia Sarcophagidae (moscas que produzem miases) e Famlia Glossinidae (moscas transmissoras da tripanosomase africana). Subordem Nematocera: Famlia Psycodidae (flebotomneos, transmissores das leishmanioses); Famlia Simuliidae (borrachudos, envolvidos na transmisso da oncocercose); Famlia Ceratopogonidae (maruins, incluindo espcies vetoras de filrias); Famlia Culicidae abrangendo espcies transmissoras de malria (mosquitos-prego ou pernilongos do gnero Anopheles), de dengue, arboviroses, filariose linftica e febre amarela (mosquitos dos gneros Culex e Aedes); Ordem Siphonaptera (pulgas, envolvidas na transmisso da peste bubnica e do tifo murino) e da Ordem Anoplura (piolhos, provocam ftirase e atuam como agente causal do tifo exantemtico, febre das trincheiras e febre recorrente na forma epidmica). Os insetos de interesse mdico so estudados em conjunto com espcimes da Ordem Acari (produzem dermatite, s vezes paralisia motora, transmitindo febre maculosa, febre Q e febre recorrente na forma endmica), constituindo a disciplina entomologia mdica, ministrada nos cursos de parasitologia das cadeiras da rea de sade. Todos estes artrpodos atuam como vetores na transmisso de vrus, bactrias, protozorios e helmintos. Ressalto aqui a importncia dos trabalhos entomolgicos dirigidos para o conhecimento da biologia e ecologia dos vetores, pois so indispensveis para um controle efetivo das grandes endemias atravs do combate antivetorial. Exemplo disso pode ser constatado ao relembrarmos as palestras do saudoso mestre Dr. Lenidas de Mello Deane*, quando relatava fatos ocorridos ao ser chamado para combater a malria no Nordeste, onde a doena se alastrava independente do combate ao Anopheles. Naquela ocasio, o pesquisador observou que nas palmeiras havia uma espcie de planta que armazenava quantidade de gua suficiente para formar um criadouro, e subindo at o local constatou a presena de uma outra espcie do mosquito caracterizando-a como mais uma espcie vetora naquela regio a qual, por estar fora do alcance do inseticida se alastrava cada vez mais.
* Dr. Lenidas Deane foi pesquisador do Departamento de Entomologia do Instituto Oswaldo Cruz, de 1980 a 1993, que chefiou por muitos anos, tendo sido para todos ns exemplo de dedicao e sabedoria.
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2.1. O Barbeiro na Escala
Zoolgica
De todas as classes zoolgicas, os insetos so os mais numerosos em espcies e inegvel a sua importncia na natureza, como dispersores de sementes, polinizadores, alm de sua utilidade para o homem, como o caso das abelhas e do bicho-da-seda, entre outros. Por outro lado, existem os insetos nocivos ao homem, como as pragas que atingem a agricultura, os ectoparasitas hematfagos e os transmissores de doenas. Os barbeiros apresentam a seguinte classificao: Reino: ANIMALIA (METAZOA); Filo: ARTHROPODA; Subfilo: MANDIBULATA; Classe: INSECTA; Subclasse: PTERIGOTA; Ordem: HEMIPTERA; Subordem: GYMNOCERATA; Superfamlia: REDUVIOIDEA; Famlia: REDUVIIDAE; Subfamlia: TRIATOMINAE. comum nos referirmos a esses insetos como hempteros, reduvideos ou triatomneos. Com base nesta classificao, conclui-se que o melhor termo, por ser mais especfico, seria triatomneo, uma vez que a Ordem Hemiptera abrange uma variedade muito grande de insetos. Atualmente so conhecidas 123 espcies de triatomneos, agrupados em cinco tribos e 145 gneros (Jurberg, 1996). Duas destas tribos, Triatomini e Rhodniini, contm os gneros mais importantes, do ponto de vista de transmisso da doena de Chagas: Triatoma, com 69 espcies (Figura 1) e Panstrongylus, com treze espcies (Figura 2) referentes primeira tribo, e o gnero Rhodnius, com treze espcies (Figura 3), referente segunda tribo citada. queles que desejarem informaes mais detalhadas sobre a sistemtica destes insetos, sugerimos consultar Costa Lima (1940) e Lent & Wygodzinsky (1979). A tabela abaixo lista alguns nomes vulgares pelos quais os triatomneos so conhecidos em diferentes pases.
Nome vulgar
BARBEIRO; BICHO DE PAREDE; BICIMO; CHUPO; FINCO; PROCOT; VUM-VUM BLOOD-SUCKING CONE NOSE; KISSING-BUG CHINCHORRO CHINCHA-VOLADORA CHIPO CHUPN VINCHUCA*
Pas Brasil Estados Unidos Equador Mxico Colmbia, Venezuela Venezuela Argentina, Bolvia, Chile, Paraguai, Uruguai
* Este nome originrio do povo inca, significando o que cai por terra; o que vem de cima, lembrando que estes insetos so comumente encontrados nos telhados de palha das habitaes.
Figuras 1-4 Triatomneos adultos, ovos e ninfas. 1. Gnero Triatoma: Triatoma infestans (Klug, 1834); 2. Gnero Panstrongylus: Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835); 3. Gnero Rhodnius: Rhodnius prolixus (Stal, 1859); 4. Ovos (a) e ninfas (b)
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2.2.
Caractersticas Gerais dos Triatomneos
Os barbeiros, como todos os insetos, possuem o corpo dividido em trs regies: cabea, trax e abdmen. A cabea, sempre mvel, possui os apndices sensoriais, que so as antenas, peas bucais e olhos compostos. O trax, formado pela unio do protrax, mesotrax e metatrax, apresenta a insero dos apndices locomotores, ou seja, dois pares de asas e trs pares de patas (Figura 5). O nome Hemiptera refere-se morfologia do primeiro par de asas, que apresenta a metade anterior coricea e a posterior membranosa, denominada hemlitro (hemi = metade; litro = asa ) (Figura 6). O abdmen, geralmente achatado e largo, com as margens laterais expandidas (conexivo), constitudo de onze segmentos. Atravs do 8o e 9o segmentos (genitlia interna) podemos identificar machos e fmeas (Figura 7). Os insetos da ordem Hemiptera apresentam morfologia varivel, com alguns espcimes bem conhecidos como o caso da maria-fedida, dos percevejos e das baratas dgua. Estes apresentam, geralmente, um cheiro caracterstico em decorrncia da presena de glndulas odorferas situadas na regio torcica. Nos barbeiros, a responsvel pelo odor caracterstico a glndula de Brindley. Em relao aos hbitos alimentares, existem formas predadoras (rostro recurvado em forma de gancho, com trs segmentos), fitfagas (rostro reto, com quatro segmentos) e hematfagas (rostro reto, com trs segmentos, dispostos quase paralelamente cabea). Os triatomneos enquadram-se nesta ltima categoria, apresentando o seu aparelho bucal do tipo picador-sugador, com as mandbulas e as primeiras maxilas transformadas em estiletes quitinosos. Na Figura 8, podemos comparar e diferenciar os tipos de aparelho bucal dos hempteros. Os triatomneos so insetos hematfagos em todos os estgios de desenvolvimento, ou seja, em todas as fases, de ninfa at a fase adulta, incluindo machos e fmeas. Do ponto de vista epidemiolgico, este fato muito importante na transmisso da doena. Esta ocorre durante ou logo aps a picada, quando os insetos iniciam as dejees. Uma vez infectados, transmitem o T. cruzi, atravs das fezes, ao indivduo ou animal que est sendo sugado. Sem o repasto sangneo no ocorrer desenvolvimento, isto , as ninfas faro no mximo uma ecdise (muda). A tolerncia destes insetos ao jejum muito grande, existindo espcies que ficam mais de seis meses sem alimentao; porm, quando esta ocorre, logo a seguir a muda volta a acontecer normalmente. Estes insetos possuem tamanho e cores variadas, sob a forma de manchas espalhadas em diversas regies do corpo, que permitem, dentre outros caracteres, diferenciar espcies. Obviamente, no podemos esquecer que para uma classificao apurada, necessrio uma chave dicotmica para sistemtica, publicada em vrias obras especializadas que se encontram citadas nas referncias ao final do captulo. A diferenciao dos trs gneros de interesse mdico pode ser feita atravs da localizao do tubrculo antenfero, ponto de insero das antenas na cabea (Figura 9).
Gnero Triatoma Apresenta a cabea de tamanho mdio, com a insero das antenas na metade da distncia
entre os olhos e o pice da cabea.
Gnero Panstrongylus Apresenta a cabea curta, de aspecto robusto, com a insero das antenas na regio
imediatamente anterior aos olhos.
Gnero Rhodnius Apresenta a cabea alongada, com a insero das antenas bem prxima ao pice da cabea.
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Figuras 5-9 Esquemas da morfologia de triatomneos. 5. Aspecto geral da morfologia externa; 6. Hemlitro com a asa tpica da ordem Hemptera, suas pores anterior coricea (a) e posterior membranosa (b); 7. Abdmen de um macho com vistas dorsal (a), ventral (b) e de uma fmea com vista dorsal (c); 8. Tipos de aparelho bucal de hempteros: hematfago (a), predador (b), fitfago (c); 9. Diferenciao dos gneros Panstrongylus (a), Triatoma (b) e Rhodnius (c)
2.3.
Ciclo de Vida
So insetos ovparos e hemimetablicos, isto , apresentam a fase de ovo, ninfa e adulto. A diferena entre as formas jovens (ninfas) e os adultos est na presena de asas nos adultos e na ausncia de aparelho reprodutor completo nas ninfas. A fmea realiza a postura cerca de vinte a trinta dias aps a fecundao, com uma quantidade varivel, dependendo da espcie. Na literatura encontramos exemplos de at 220 ovos para P . megistus em posturas variadas. A colorao dos ovos aps a postura igual para todas as espcies, apresentando-se brancos inicialmente, tornando-se amarelados, e medida que o embrio vai se desenvolvendo, passam a rosados chegando a rubros
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prximo ecloso. Esses ovos tm caractersticas morfolgicas do crio (cobertura protetora) distintas, fornecendo por isso, bom material para a classificao das espcies. O tempo de ecloso tambm varia de acordo com as espcies, sendo de oito a quinze dias (Figura 4 a, b). Aps a ecloso, que se d por uma abertura denominada oprculo, a ninfa se apresenta rosada e, medida que o tempo passa, o contato com o ar faz com que adquira a colorao definitiva. Este fato tambm observado cada vez que ocorre uma ecdise, ou seja a troca do tegumento velho por um novo e maior. Uma vez despojado, o tegumento recebe o nome de exvia. A partir da sada do ovo, cada perodo compreendido entre uma muda e outra denominado estdio. So cinco estdios de ninfa seguidos de um adulto alado, completando um ciclo de aproximadamente duzentos a 250 dias sob condies de laboratrio.
2.4.
Espcies Transmissoras e sua Distribuio Geogrfica
Nos gneros considerados de importncia mdica temos como principais espcies transmissoras da doena de Chagas no Brasil:
Espcie Distribuio geogrfica Bahia, Gois, Maranho, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraba, Paran, Pernambuco, Piau, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, So Paulo, Sergipe, Tocantins Alagoas, Bahia, Cear, Distrito Federal, Esprito Santo, Gois, Maranho, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Par, Paraba, Paran, Pernambuco, Piau, Rio de Janeiro, Rio Grande do Norte, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, So Paulo, Sergipe, Tocantins Alagoas, Bahia, Cear, Gois, Maranho, Minas Gerais, Paraba, Pernambuco, Piau, Rio Grande do Norte, Sergipe, Tocantins Bahia, Distrito Federal, Gois, Maranho, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paran, Pernambuco, Piau, Rio Grande do Sul, Santa Catarina, So Paulo, Tocantins Alagoas, Bahia, Cear, Distrito Federal, Gois, Maranho, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Paraba, Pernambuco, Piau, Rio Grande do Norte, Sergipe, Tocantins
Triatoma infestans Panstrongylus megistus
Triatoma brasiliensis Triatoma sordida Triatoma pseudomaculata
Rhodnius prolixus pode ser encontrado no Brasil nos estados do Amazonas, Gois e Tocantins, porm esta espcie possui maior importncia na transmisso em pases da Amrica Latina, como o caso da Venezuela.
2.5.
As Zoonoses Parasitrias
Zoonoses so enfermidades que so transmitidas naturalmente dos animais ao homem. O conceito de zoonose bastante complexo, envolvendo o homem, em alguns casos, outro vertebrado, um artrpode, o agente causador da doena e o ambiente como um todo, formando um conjunto biolgico que ativado por aes recprocas entre todas as partes. A natureza se compe de uma interao destes conjuntos que so modificados constantemente por mudanas no ambiente. Isto leva a alteraes nos hbitos de todos os envolvidos no conjunto. Tomemos por exemplo os triatomneos. Certamente, a infeco por tripanosomatdeos estava restrita, inicialmente, ao ectopo silvestre, ou seja, as espcies que viviam unicamente em habitats silvestres utilizavam como fonte de alimentao animais silvestres (roedores, marsupiais, aves, morcegos, tatus). Com o desmatamento e a colonizao dessas reas pelo homem, houve substituio dos animais silvestres pelo homem e seus animais domsticos (aves, co, gato e pequenos mamferos). Essa modificao provocou uma mudana no hbito alimentar de vrias espcies, ou seja, espcies que eram essencialmente silvestres iniciaram um processo de ocupao do peridomiclio chegando em alguns casos at a domiciliao.
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Baseados nestes aspectos, podemos classificar as espcies de triatomneos em silvestres, peridomiciliadas e domiciliadas. Vejamos como as espcies transmissoras mais importantes se enquadram.
T. infestans: uma espcie domiciliada, com raros focos silvestres, vivendo nas casas em frestas de parede,
telhados de palha, embaixo de colches e caixas, atrs de quadros e objetos pendurados nas paredes. Podem habitar tambm o peridomiclio, alimentando-se de animais que vivem em galinheiros e currais, podendo tambm ser encontrada sob pedras, tocos ou folhas prximos a estes locais. P. megistus: espcie domiciliada, podendo, ser encontrada no peridomiclio e nos ectopos naturais como ninhos de pssaros, copa de palmeiras, bromlias, ninhos de gambs, etc. T. brasiliensis: espcie domiciliada, podendo ser encontrada no peridomiclio e no meio silvestre em buracos de pedra. T. pseudomaculata: espcie domiciliada, encontrada tambm no peridomiclio e no meio silvestre, principalmente em oco de rvores. T. sordida: espcie domiciliada, localizando-se algumas vezes no peridomiclio e no meio silvestre em troncos de rvores, razes expostas, palmeira, bromlia, parede de pedra. R. prolixus: espcie domiciliada, localizando-se principalmente nos telhados das casas, feitos de palha, onde seus ovos encontram-se aderidos. encontrado tambm no peridomiclio e ectopos naturais (como tocas de tatu e ninhos de aves).
2.6.
Controle
A doena de Chagas uma das mais importantes endemias dentre as que ocorrem na Amrica Latina. Devido a isso, os governos tm dedicado ateno especial aos mtodos de controle de triatomneos, que so prioridade em sade pblica. Quando se fala em controle, porm, no podemos levar em conta somente os aspectos sociais e epidemiolgicos que envolvem a doena. Devemos lembrar que para um pas, alm dos aspectos citados, tambm importante analisar as implicaes econmicas que uma populao doente traria no seu desenvolvimento como um todo e, por outro lado, o benefcio que o controle da endemia traria nos diversos aspectos. Uma srie de fatores envolvem o controle da doena de Chagas. A simples eliminao do vetor no resolver o problema. Antes de qualquer medida necessrio ensinar a populao a identificar os barbeiros como transmissores de uma doena grave e a levar estes insetos aos postos de sade para determinar se esto ou no infectados, possibilitando aos tcnicos em sade pblica determinar as reas endmicas. Feito isso, o segundo passo seria melhorar as condies de vida daquela populao, substituindo as casas de pau-a-pique, palha e outros materiais que favorecem a proliferao desses insetos, por habitaes mais adequadas, com reboco interno e externo nas paredes. Para um controle efetivo, o primeiro passo seria a pesquisa entomolgica ou triatomnica, que nada mais do que a busca de vetores ou de vestgios destes, isto , a presena de fezes nas paredes e ovos. No caso de ser a primeira investigao na rea, esta pesquisa, denominada levantamento triatomnico, possibilita conhecer que espcies esto presentes na rea, bem como o grau de domiciliao, infeco e densidade destas. Quando se trata de reas onde j houve tratamento com inseticidas, essa pesquisa possibilita determinar a extenso e a freqncia de utilizao dessas substncias. Como esses insetos normalmente se escondem em frestas das paredes, para facilitar a captura utiliza-se um desalojante qumico (piriza); porm todas as superfcies internas e externas das residncias devem ser revistadas, bem como mveis e objetos. Alm do ambiente intradomiciliar, todos os ambientes do peridomiclio, principalmente os que servem de abrigo ou viveiro de animais, cercas e muros, devem ser verificados. Feita a pesquisa, inicia-se a aplicao de inseticidas, devendo os agentes ter o cuidado de esclarecer populao a necessidade de sua aplicao para o controle da doena. Vrios pesquisadores relatam em suas aulas e conferncias o fato de a populao mal informada lavar as paredes das casas logo aps a utilizao dos inseticidas. Os inseticidas recomendados so piretrides de sntese como, por exemplo, ciflutrina, cipermetrina,
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deltametrina e lambdacialotrina, com doses determinadas por tcnicos especialistas em utilizao de praguicidas para uso em sade pblica. Alm destes procedimentos, a Fundao Nacional de Sade recomenda que seja feita uma avaliao sorolgica, para verificar o impacto do controle vetorial na transmisso da doena.
BRENNER, R. I. L. & STOKA A. I. M. Chagas Disease Vectors. Boca Raton: CRC Press, 1988. vols. 1-3. COSTA-LIMA, A. M. Insetos do Brasil. Hemptera. Rio de Janeiro: Editora Imprensa Nacional, 1940. p.351. JURBERG, J. A taxonomia de triatomneos baseada nas estruturas flicas (H.R.)., 1996. Tese, Rio de Janeiro: Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. LENT H. & WYGODZINKY P . Revision of the Triatominae, Hemiptera, Reduvidae and their significance as vectors of Chagas disease. Bulletin of the American Museum of Natural History, 163:23-520, 1979. SCHOFIELD, C. J. Triatominae - Biologa y Control. Eurocommunica Publications Ed., 1994. p. 67.
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A ecologia e a complexidade dos ciclos de transmisso do Trypanosoma cruzi na natureza
Captulo 3
A Ecologia e a Complexidade dos Ciclos de Transmisso do Trypanosoma cruzi na Natureza

Ana Maria Jansen, Cristiane V. Lisboa, Ana Paula S. Pinho, Renato Srgio Marchewski, Regina H.R. Mangia, Elisa Cupolillo & Octavio Fernandes
O Trypanosoma cruzi, protozorio flagelado digentico pertencente Ordem Kinetoplastida, Famlia Trypanosomatidae, um dos parasitas de maior e mais bem-sucedida distribuio na natureza. Capaz de infectar um amplo espectro de mamferos, distribudos entre oito ordens, transmitido principalmente atravs de contaminao de fezes infectadas dos vetores, triatomneos dos gneros Rhodnius, Triatoma e Panstrongylus. Um dos aspectos mais interessantes e discutidos do T. cruzi a extrema variabilidade intra-especfica. A estrutura populacional do parasita clonal e uma das hipteses que explicaria a significativa variabilidade gentica deste parasita seria uma divergncia e a evoluo clonal antiga e independente (Tibayrenc & Ayala, 1988). Classicamente admitem-se dois ciclos de transmisso: o ciclo domstico envolvendo o homem, animais sinantrpicos, domsticos e triatomneos domiciliados, e o ciclo silvestre envolvendo animais e triatomneos silvestres. A invaso do ectopo silvestre pelo homem ou a domiciliao de triatomneos e/ou mamferos silvestres explicariam a ligao entre estes dois ciclos. No entanto, temos observado que o assim chamado ciclo silvestre do T. cruzi bem mais complexo, na medida em que, em um mesmo segmento de floresta, podem ocorrer distintos e independentes ciclos de transmisso e que o estabelecimento de um ciclo domiciliar depender da presena de animais infectados com uma determinada subpopulao do parasita (Fernandes et al., 1993).
3.1
A Heterogeneidade da Espcie
As distintas formas sangcolas chamaram a ateno dos primeiros pesquisadores que estudaram a biologia do parasito. Assim, considerava-se serem as formas finas e largas, gametas masculinos e femininos, respectivamente (Chagas, 1909) formas jovens e adultas (Brumpt, 1912). Depois destes estudos iniciais, as vrias tentativas que vm sendo feitas no sentido de correlacionar alguma caracterstica morfolgica, biolgica ou bioqumica dos isolados com as diferentes formas da doena humana ou com o curso da infeco em animais de laboratrio, chegaram a resultados ainda bastante controvertidos (Brener, 1973; Gonalves et al., 1984; Luquetti et al., 1986; Carneiro et al., 1991). No entanto, marcadores bioqumicos e moleculares tm permitido esclarecer alguns aspectos da epidemiologia do parasita. A anlise do perfil eletrofortico de enzimas isofuncionais de numerosos isolados obtidos de doentes humanos, reservatrios silvestres e triatomneos permitiu que se definissem trs zimodemas (Z1, Z2 e Z3), de acordo com a circulao do parasita no ambiente domiciliar (Z2) ou silvestre (Z1 e Z3) (Miles et al., 1977; Barrett et al., 1980). A anlise do perfil eletrofortico dos produtos de
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digesto de DNA do cinetoplasto por enzimas de restrio discriminou ainda mais a heterogeneidade do parasita (Gonalves et al., 1984). A possibilidade de caracterizar, bioquimicamente, as subpopulaes do T. cruzi, demonstrou que a variabilidade desta espcie pode ser maior do que aquela encontrada em outros taxa bem definidos e que os mtodos de manuteno do parasita in vitro e in vivo favoreciam ou eliminavam subpopulaes e/ou clones (Dvorak et al., 1972; Deane et al., 1984). Caracterizaes moleculares (RAPD - randomly amplified polymorphic DNA e seqncias de genes de miniexon e da subunidade 24Sa ribosomal) sugeriram duas linhagens distintas e bastante distantes filogeneticamente. A linhagem 1 foi correlacionada ao ciclo domiciliar e a linhagem 2 ao ciclo silvestre de transmisso do T. cruzi. Mais recentemente as subpopulaes de T. cruzi foram agrupadas em dois grandes grupos. Assim, isolados caracterizados como zimodema 1, linhagem 2, tipo III e ribodema II/III, passaram a compor o grupo T. cruzi I. As subpopulaes caracterizadas como zimodema 2, linhagem 1, tipo II e ribodema I foram incluidas no grupo T. cruzi II (Andrade et al., 1974; Miles et al., 1977; Clark & Pung, 1994; Tibayrenc,1995; Souto et al., 1996; Zingales et al., 1997; Luquetti et al., 1999).
3.2
As Peculiaridades da Infeco nos Mamferos Silvestres
Embora se saiba que basicamente cada espcie de mamfero e/ou triatomneo possa representar um elemento selecionador de subpopulaes do parasita, pouco se conhece sobre a dinmica da transmisso do T. cruzi na natureza e as variveis biticas e abiticas envolvidas. Os estudos realizados, na maioria das vezes, refletem situaes momentneas da enzootia, sem aprofundar a questo das diferentes interaes entre os reservatrios, vetores e seus padres comportamentais que certamente so fundamentais na manuteno e disperso dessa protozoose. Os estudos sobre a interao do T. cruzi com marsupiais da Famlia Didelphidae, que so considerados os mais antigos e importantes reservatrios do parasita (Stevens et al., 1998), no s resultaram no esclarecimento de numerosas questes relacionadas com a biologia e epidemiologia do T. cruzi, mas tambm levantaram outras tantas: a) observou-se que gambs controlam a infeco pelo T. cruzi desde muito jovens (45 dias, ainda inteiramente dependentes do marspio). Representam um filtro biolgico bastante seletivo: mantm indefinidamente, com alto percentual de hemocultivos positivos, as infeces experimentais por cepa F e isolados silvestres, todos de zimodema 1, mas controlam muito rapidamente, chegando em alguns casos a eliminar, as infeces experimentais pelas cepas Y e FL (Deane et al., 1984; Jansen et al., 1997); b) o ciclo do T. cruzi, como conhecido, envolve duas fases de multiplicao, uma intracelular, na forma amastigota em diversos tecidos do hospedeiro vertebrado e a outra inteiramente extracelular como epimastigota na luz do tubo digestivo do inseto vetor. Entretanto, Deane et al. (1984) observaram que os dois ciclos podem ocorrer simultaneamente no gamb Didelphis marsupialis, no qual o parasita pode multiplicar-se extracelularmente (na forma epimastigota) e diferenciar-se na luz das glndulas de cheiro. O encontro, nestas glndulas do D. marsupialis, de formas evolutivas do T. cruzi antes descritas apenas no tubo digestivo dos triatomneos, demonstrou ser o gamb ao mesmo tempo reservatrio e vetor, e apontou a necessidade de reviso cuidadosa da biologia dos tripanosomatdeos de um modo geral, e do T. cruzi em particular, a fim de esclarecer a importncia deste achado na manuteno do parasita na natureza. Vale assinalar que glndulas de cheiro so encontradas na grande maioria dos mamferos e esto relacionadas a numerosos padres comportamentais tais como acasalamento, defesa e marcao de territrio. Tripanosomatdeos em geral, e o T. cruzi em particular, so parasitas extremamente eclticos no que se refere a substrato nutricional e aos diversos microhbitats oferecidos pelos numerosos hospedeiros (Vickerman, 1994). A adaptao do parasita s glndulas de cheiro, hbitat to inusitado, reflete este ecletismo e provavelmente uma aquisio secundria na histria da interao do T. cruzi com o gamb (Jansen et al., 1997). A importncia epidemiolgica do parasitismo nas glndulas de cheiro ainda desconhecida, j que no se avaliou a sua capacidade vetorial. Vale mencionar que, se por um lado o encontro de gambs com parasitas nas
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glndulas de cheiro raro (Naiff et al., 1987; Steindel et al., 1988; Fernandes, 1993), por outro, surtos endmicos de malria ou leishmaniose se mantm com ndices de infeco dos vetores em torno de 1%. So vrios os relatos na literatura de alta prevalncia de infeco natural entre gambs onde a populao de triatomneos praticamente ausente; portanto, a raridade de glndulas de cheiro naturalmente infectadas no exclui a possibilidade de ser este um mecanismo importante na manuteno da circulao de T. cruzi no meio ambiente. Epidemias circunscritas da doena de Chagas, no explicveis pelos mecanismos habituais de transmisso por triatomneos, so de h muito conhecidas. Muito antes da descrio do ciclo do T. cruzi nas glndulas anais do gamb, j se havia sugerido uma correlao entre a presena de gambs e um surto epidmico da doena de Chagas em Nova Teutnia, RS (NeryGuimares et al., 1968). Em condies artificiais foi possvel infectar camundongos com alimentos contaminados com contedo de glndulas de cheiro infectadas. Avaliando, comparativamente, o curso da infeco natural de gambs e de cucas (Philander frenata), um outro marsupial didelfdeo que vive em simpatria com D. marsupialis, observamos que tambm estes didelfdeos apresentam infeces estveis por T. cruzi, embora no mantenham o ciclo de multiplicao extracelular nas glndulas de cheiro. As leses histopatolgicas no so severas, mas so um pouco mais importantes do que as dos gambs. Este estudo foi realizado em um fragmento de Mata Atlntica de altitude (Terespolis, RJ) onde se observaram altas taxas de infeco nas duas espcies: 50% em P. frenata e 60% de D. marsupialis. A busca de vetores resultou na coleta de 23 R. prolixus, dos quais 13 estavam infectados. A caracterizao biolgica (acompanhamento do curso da infeco experimental em camundongos suos) separou os isolados de gambs e cucas em dois grupos distintos: um, bastante virulento para camundongos, onde predominaram os isolados de cucas, e outro, constitudo principalmente por isolados de gambs e barbeiros, que no resultava em mortalidade de camundongos experimentalmente inoculados. A caracterizao bioqumica (anlise dos perfis eletroforticos de enzimas isofuncionais) tambm separou os isolados dos marsupiais em dois grandes grupos: um incluindo todos os isolados dos vetores e a maioria dos isolados de gambs; no outro predominaram os isolados de cucas. Foram observados 15 zimodemas e, como era esperado, uma maior variabilidade gentica entre os isolados de cucas. A tipagem molecular (anlise da seqncia de gens de miniexons) mostrou 40% de cucas infectadas com subpopulao T. cruzi II. A correlao entre os marcadores empregados no foi absoluta, mas evidenciou a circulao na natureza de subpopulaes do T. cruzi vinculadas s infeces humanas, alm de sua associao preferencial com a cuca P . frenata. Estes resultados, e a observao prvia de que cucas no so filtros biolgicos seletivos, levantaram a hiptese de que estas duas espcies, to prximas filogeneticamente e que vivem em simpatria, estariam participando de dois ciclos independentes de transmisso do T. cruzi. Esta hiptese foi reforada na medida em que, em condies experimentais, R. prolixus foi capaz de manter os dois grupos do parasita. Esta questo nos levou a estender o espectro de espcies de animais estudados e que ocupassem diferentes estratos florestais na mata. Passamos ento a avaliar animais pertencentes s ordens Primata, Rodentia, Quiroptera e Edentata da Reserva Biolgica de Poo das Antas. A Reserva Biolgica de Poo das Antas situa-se no municpio de Silva Jardim, limitando-se com Casimiro de Abreu e Araruama, RJ. A vegetao caracterizada por florestas secundrias em diferentes estgios sucessionais e por reas bastante devastadas. O local ainda conta com uma rica fauna de mamferos tpicos e endmicos e algumas espcies vegetais primrias. Neste local vem sendo desenvolvido um dos mais reconhecidos programas de conservao de espcie animal endmico e em extino: o mico-leo-dourado (Leontopithecus rosalia). O programa de conservao inclui a reintroduo e a translocao desta espcie (Kleinman et al., 1990; Beck et al., 1991). Dentro do programa de translocao, grupos isolados de micos-lees-dourados encontrados em pequenos fragmentos remanescentes de Mata Atlntica, so transferidos para uma outra reserva (Reserva Biolgica Unio). No programa de reintroduo, fazendas adjacentes reserva Poo das Antas so repovoadas com micos criados em diversos zoolgicos do mundo. Estes programas levam sempre em considerao a distribuio original da espcie. A maioria dos primatas tem uma estrutura social bastante estvel. Cada grupo de micos-lees-dourados conta com quatro a seis indivduos. Cada membro do grupo fica responsvel por diferentes tarefas que incluem
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reproduo, cuidado com os filhotes, alimentao e estratgia de defesa. So territoriais, tm atividade diurna, ocupam o estrato arbreo/intermedirio e se abrigam em ocos de rvores. At o momento, observamos que o T. cruzi circula pelo menos entre quatro ordens de mamferos da Reserva de Poo das Antas: primata (mico-leo-dourado), edentados (preguia-de-coleira), roedores (rato silvestre) e marsupiais (gamb). A enzootia em Poo das Antas apresenta caractersticas bastante peculiares quando comparada com Terespolis. O percentual de marsupiais naturalmente infectados foi 5%, bastante baixo em relao s descries de outros autores e de nossas observaes em outras reas. Entre os roedores encontramos 13% infectados. Por outro lado, 50% da populao de L. rosalia se mostrou infectada. Os micos-lees-dourados infectam-se provavelmente logo aps o desmame, no tendo sido observada transmisso vertical; pesquisa realizada em quatro animais recapturados entre trs e doze meses, mostra que a enzootia est se expandindo, o que pode ser comprovado pela existncia da infeco em alto percentual de L. rosalia reintroduzidos nas fazendas adjacentes reserva. Em todos os grupos examinados encontramos micos-lees-dourados infectados, mas a prevalncia foi maior nos grupos que pernoitam no mesmo oco, o que sugere que a fonte da infeco se localize neste local. A caracterizao molecular (anlise de gens de miniexon) dos isolados de micos-lees-dourados correspondeu linhagem 1 (T. cruzi II), ao contrrio dos isolados dos demais animais que correspondem linhagem 2 (T. cruzi I). A caracterizao biolgica mostrou que estes isolados tendem a ser mais virulentos para camundongos suos, com taxas de mortalidade entre 40% e 100%. Os isolados dos demais animais resultaram sempre em parasitemia patente baixa, com raros exames de sangue a fresco positivos e 100% de sobrevivncia. Estes resultados confirmam a complexidade do ciclo silvestre do T. cruzi, na medida em que observamos distintos ciclos de transmisso, que independem do estrato florestal, podendo acontecer em um mesmo ectopo. O encontro de micos-lees-dourados naturalmente infectados por uma subpopulao de T. cruzi correlacionada com a infeco humana torna fundamental avaliar a importncia desses animais como fonte de disperso do parasita na natureza e, principalmente, para indivduos humanos, uma vez que os micoslees-dourados vm sendo muito manejados dentro dos programas de reintroduo e translocao acima mencionados. importante tambm que sejam repensados todos os programas de translocao e reintroduo no s desta espcie, uma vez que a metodologia usada no projeto mico-leo-dourado serve como modelo para outros programas de conservao de animais em extino. Alm das implicaes epidemiolgicas devese levar em considerao o impacto sobre as outras espcies animais que possa resultar do manejo dos micos infectados. Nossos resultados mostram que, em relao circulao do T. cruzi na natureza, se deveriam mencionar os ciclos silvestres do T. cruzi uma vez que vrios e independentes ciclos de transmisso podem ocorrer num mesmo segmento de floresta. Mais ainda, os nossos estudos indicam que as variveis envolvidas na circulao do T. cruzi na natureza so nicas para cada rea, o que inviabiliza qualquer estudo de impacto ambiental baseado em dados secundrios. Cada vez mais o homem vem intervindo nas florestas em funo de diferentes objetivos, que incluem desde a explorao at os numerosos programas de conservao, que sempre resultam em fluxos migratrios humanos, translocao e reintroduo de animais, o que torna obrigatrio o conhecimento dos fatores determinantes da disperso, no somente do T. cruzi, mas das parasitoses de um modo geral.
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ANDRADE S. G. Caracterizao de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas no Recncavo Baiano. Revista de Patologia Tropical 3:65121,1974. BARRETT, T. V.; HOFF, R. H.; MOTT, K. E.; MILES, M. A.; GODFREY, D. G. TEIXEIRA, R. & ALMEIDA DE SOUZA, J. A. Epidemiological aspects of three Trypanosoma cruzi zymodemes in Bahia State, Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 74:84-89, 1980. BECK, B. B. , KLEIMAN, D. G. , DIETZ, J. M. , CASTRO, J. & B. RETTBERG-BECK. Losses and reproduction in reintroduced golden lion tamarin. DoDo 27: 50-61, 1991. BRENER, Z. Biology of Trypanosoma cruzi. Annual Review Microbiology 27:240-247, 1973. BRUMPT, E. Trypanosoma cruzi volue chez Conorhisus megistus, Cimex lectularius, Cimex bourti ornithodorus moubata. Bulletin de la Socit de Pathologie Exotique, 5:360-367, 1912. CARNEIRO, M.; ROMANHA, A. J. & CHIARI, E. Biological characterization of Trypanosoma cruzi strains from different zymodemes and schizodemes. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 86:387-394, 1991. CHAGAS, C. Nova tripanosomase humana. Estudos sobre a morfologia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen.,n. sp., agente etiolgico de nova entidade mrbida do homem. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 1:159-218, 1909. CLARK, C.G. & PUNG, O. Host especificity of ribosomal DNA variation in sylvatic Trypanosoma cruzi from North America. Molecular and Biochemical Parasitology 66:174-179, 1994. DEANE, M. P .; JANSEN, A. M. & LENZI, H. L. Trypanosoma cruzi: vertebrate and invertebrate cycles in the same mammal host the opossum Didelphis marsupialis. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 79:513-515, 1984. DVORAK, J. A.; HARTMAN, D. L. & MILES, M. A. Trypanosoma cruzi: correlation of growth kinetics to zimodeme type in clones derived from various sourcers. Journal of Protozoology, 27:472-474, 1972. FERNANDES, A. P .; NELSON, K. & BEVERLEY, S. M. Evolution of nuclear ribosomal RNAs in kinetoplastid protozoa: perspectives on the age and origin of parasitism. Proceedings of the National Academy of Sciences 90:11608-11612, 1993. GONALVES, A. M.; NEHME, N. S. & MOREL, C. M. Trypanosomatid characterization by schizodeme analysis. In: Genes and Antigens of Parasites. A laboratory manual, 2nd ed., Rio de Janeiro: Fundao Oswaldo Cruz, 1984. p. 95-109. JANSEN, A. M.; MADEIRA F.; CARREIRA, J. C.; MEDINA-ACOSTA, E. & DEANE, M. P . Trypanosoma cruzi in the opossum Didelphis marsupialis: a study of the correlations and kinectics of the systemic and scent gland infections in naturally and experimentally infected animals. Experimental Parasitology 86: 37-44,1997. KLEINMAN, D. G.; BECK, B. B.; BAKER, A. J.; BALLOU, J.D.; DIETZ, L.A. & DIETZ, J. M. The conservation program for the golden lion tamarin. Endangered Species UPDATE, 8:82-85, 1990. LUQUETTI, A. D.; MILES, M.; RASSI, A.; REZENDE, J. M.; SOUZA, A. A.; POVOA, M. M. & RODRIGUES, I. Trypanosoma cruzi: zymodemes associated with acute and chronic Chagas disease in Central Brasil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 80:462-470, 1986. LUQUETTI, A.; PRATA, A.; MONCAYO, A.; ROMANHA, A.; JANSEN, A.; ZINGALES, B.; MOREL, C.; PONCE, C.; CHIARI, E.; CUPOLILLO, E.; GUHL, F.; MOMEN, H.; COURA, J. R.; STEINDEL, M.; MILES, M.; TIBAYRENC, M.; FERNANDES, O.; OLIVEIRA, R.; ZELEDN, R.; ANDRADE, S.; BARRET, T.; MACDO, V. & BRENER, Z. Recommendations from a satellite meeting. Simp. Int. sobre Avanos do Conhecimento da Doena de Chagas 90 anos aps sua Descoberta. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 94(suppl.I): 429-432,1999. MILES M. A., TOY, P . J.; OSWALD, S. C., GODFREY, D. G. The identification by isoenzyme patterns of two distinct straingroups of Trypanosoma cruzi, circulating independently in a rural area of Brazil. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 71:217-225, 1977. NAIFF, R. D.; NAIFF, M. F.; BARRETT, T. V. & ARIAS, J. R. Trypanosoma cruzi nas glndulas anais do Didelphis marsupialis: primeiro registro de infeces naturais. Anais do X Congresso da Sociedade Brasileira de Parasitologia, 1987. Resumo 165. NERY-GUIMARES, F; da SILVA, N. N.; CLAISELL, D.; de MELLO, A. L.; RAPONE, T.; SNELL, T & RODRIGUES, N. Um surto epidmico de doena de Chagas de provvel transmisso digestiva ocorrido em Teutonia (Estrela-Rio Grande do Sul). O Hospital, 73:1767-1804, 1968. SOUTO, R.; FERNANDES, O.; MACEDO, A. M.; CAMPBELL, D. A. & ZINGALES, B. DNA markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Molecular Biochemical Parasitology 83:141-152,1996. STEINDEL, M.; SCHOLZ, A.; TOMA, H. K. & SCHLEMPER, B. R. Presence of Trypanosoma cruzi in the anal glands of naturally infected opossum (Didelphis marsupialis). Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 79:513-515, 1988.
37
STEVENS J.; NOYES, H. & GIBSON, W. The evolution of trypanosomes infecting humans and primates. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 93:669-676, 1998. TIBAYRENC, M. Genetic epidemiology of parasitic protozoa and other infectious agents: the need for an integrated approach. International Jounal of Parasitology 28:85-104,1995. TIBAYRENC, M. & AYALA, F. J. Isoenzyme variability in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease: genetical, taxonomical and epidemiological significance. Evolution, 42:277-292, 1988. VICKERMAN, K. The evolutionary expansion of the trypanosomatid flagellates. International Journal of Parasitology, 24:13171331, 1994. ZINGALES, B.; SOUTO, R. P.; MANGIA, R. H.; LISBOA, C. V.; CAMPEBELL, D. A.; COURA, J. R.; JANSEN, A. M. & FERNANDES, O. Molecular epidemiology of American trypanosomiasis in Brazil based on dimorphisms of rRNA and miniexon gene sequences. International Journal of Parasitology 28:105-112, 1998.
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Resposta do hospedeiro infeco
C apt u l o 4

4. 1
Respostas Imune Inata, Inflamatria e de Fase Aguda na Doena de Chagas

Tania C. Arajo-Jorge
A infeco humana pelo Trypanos oma cruzi deflagra um conjunto de reaes que levam ao reconhecimento do parasita e montagem de uma resposta imune especfica bastante eficaz, capaz de controlar o crescimento parasitrio por toda a vida do indivduo. Parasitemias subpatentes e a resistncia reinfeco pass am ento a caracterizar a infeco humana e de outros modelos experimentais mamferos, inclusive em camundongos. Os sinais tpicos da fase aguda humana so o chagoma (leso na porta de entrada do parasita) e a parasitemia (presena do parasita no sangue circulante). A parasitemia desenvolve-se por uma fase indetectvel microscopicamente (perodo pr-patente), outra detectvel e crescente e uma terceira, detectvel e decrescente (Figura 1). Este estgio da doena pouco compreendido em humanos devido aos poucos casos estudados . As fontes principais de estudos so casos de infeco acidental em laboratrio (Hofflin et al., 1987; Grauert et al., 1993) e casos de infeco congnita. Tal escassez est relacionada curta durao dessa fas e (um a dois meses) e presena de uma sintomatologia to fugaz, que pode passar totalmente desapercebida (Antas et al., 1999). Aps a fase aguda, geralmente benigna e inaparente, segue-se uma fase clnica conhecida como indeterminada ou inaparente, na qual associam-se ausncia de sintomatologia clnica com sorologia positiva. Aps vinte a trinta anos, cerca de 20% dos indivduos infectados desenvolvem a fase crnica, sintomtica, com diferentes formas clnicas: cardaca, digestiva ou neurolgica. Nos indivduos imunocompetentes, a articulao da resposta imune ocorre em trs etapas (Figura 1). A primeira se desenvolve nas duas primeiras semanas ps-infeco, antes do aparecimento de parasitemia patente e ascendente, e depende dos mecanismos efetores da re s pos ta imune inata, tambm chamada imunidade natural, com destaque para a resposta inflamatria. A segunda etapa, que se desenvolve nos estgios intermedirio e tardio da fase aguda da infeco, quando a fase ascendente da parasitemia refreada e controlada at atingir novamente nveis subpatentes, depende dos componentes celulares e humorais da re s pos ta imune es pe cfica adquirida. A terceira etapa, tambm dependente da resposta imune especfica, se mantm por toda a fase crnica da infeco e responsvel pela manuteno da parasitemia subpatente por longo prazo, por forte sorologia positiva e pela me mria imunolgica que garante resistncia reinfeco (e
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portanto ausncia de reagudizao por qualquer outra cepa do T. cruzi ) no hospedeiro imunocompetente, mas no no imunossuprimido. Essa fase abolida se o indivduo infectado for tratado durante a fase aguda e for curado parasitologicamente.
Parasitemia
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Dias aps a infeco
clulas T -----------------------
clulas B anticorpos especficos e lticos
---------------------------------------------------------------------Resposta Imune Resposta Imune Adquirida Inata ou Natural Componentes: Componentes:
Celular:macrfagos citocinas Celular: clulas T CD4 e CD8 e reconhecimento mastcitos aminas vasoativas clulas B clulas endoteliais mol.adeso e citocinas clulas instersticiais do estroma clulas NK (natural killers) IFN- clulas T IFN- IL-4 clulas T naturais Humoral: resposta de fase aguda: lectinas e reconhecimento complemento colectinas molculas de adeso anticorpos naturais Humoral: anticorpos proteases e citlise inibidores de proteases molculas opsonizantes
Figura 1 Cinticadasrespostasimuneinataeadquiridaduranteainfeco por Trypanos oma cruzi , avaliadaapartir dadeteco daparasitemia
4. 1 . 1 Evoluo da Infeco no Stio de Inoculao

Historicamente, a primeira questo colocada e confirmada no modelo do camundongo foi a infectividade das formas metacclicas obtidas dos triatomneos infectados capturados em campo, bem como das sangneas obtidas de animais infectados. Em 1912, Brumpt referia que em algumas horas tripomastigotas sangneos inoculados por via subcutnea j podiam ser encontrados no sangue, e em 1934 Dias relatou que 40 minutos aps uma inoculao subcutnea, e 165 minutos aps uma intraperitoneal, j se podiam evidenciar parasitas circulantes. A porta de entrada foi investigada experimentalmente em camundongos tambm por Romaa (1943). Este autor demonstrou que as mucosas permitiam a instalao e expanso da infeco, ao contrrio da pele ntegra, que se constitua numa barreira penetrao do T. cruzi . O parasita s coloniza a pele por inoculao subcutnea, por escarificao e manuteno por duas horas do inculo com fezes de triatomneo contaminadas com metacclicos.
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A evoluo da infeco no stio de inoculao subcutnea foi tambm abordada no modelo do camundongo e indica a relao parasita-clula hospedeiro in vivo (Dias, 1934; Romaa, 1943). Durante o primeiro perodo de multiplicao intracelular do T. cruzi (trs primeiros dias) no ocorrem fenmenos infiltrativos celulares. S quatro a cinco dias aps inoculao, em seguida s primeiras rupturas de clulas parasitadas, que aparecem as primeiras clulas de infiltrado inflamatrio: leuccitos polimorfonucleares, moncitos, linfcitos e mobilizao e ativao de macrfagos tissulares. Enquanto as c lulas esto ntegras no ocorre inflamao em torno, mas medida que aumenta o nmero de clulas destrudas pela multiplicao parasitria, aumenta a infiltrao celular. freqente o encontro de clulas parasitadas no tecido conjuntivo subcutneo e entre os feixes musculares, em especial macrfagos e fibroblastos, mas a invaso de fibras musculares vizinhas ao ponto de inoculao um fenmeno um pouco mais tardio. O processo inflamatrio inicial dependenteda presena do parasita e envolve o recrutamento de macrfagos, clulas NK, neutrfilos e alguns eosinfilos nestas regies focais. Isso foi reanalisado por Deutschlnder et al. (1978). Inoculando a cepa Brazil, subcutaneamente, na pata de camundongos NMRI, os autores observaram a presena de granulcitos dois dias aps a inoculao, de macrfagos infectados quatro dias aps a infeco, forte infiltrado inflamatrio somente nove dias ps-infeco, em todos os tecido da pata, com ninhos de parasitas ainda em macrfagos e pseudocistos em clulas musculares ntegras. Aps dezoito dias no havia mais parasitas nos macrfagos mas havia muitos pseudocistos nas fibras musculares, junto com forte reao inflamatria, necrose de fibras e reao de cicatrizao causada pela ruptura dos pseudocistos. portanto comum o encontro de macrfagos parasitados, servindo como hospedeiros para o parasita e sem capacidade microbicida imediata sobre eles. Com a formao do infiltrado inflamatrio e a ativao celular, podem ser encontrados macrfagos com parasitas ntegros e em diviso e outros com parasitas destrudos (Romaa, 1943). comum tambm a destruio de clulas adiposas, e h relatos de que clulas de parede de vaso (endoteliais) tambm podem ser encontradas parasitadas (Dias, 1934). Recentemente foi demonstrado que a carga parasitria na fase aguda decisiva no desenvolvimento da patologia, do parasitismo e da ativao do sistema imune na fase crnica da infeco (Marinho et al., 1999). Um recente estudo de Monton et al. (1996) confirmou que o primeiro infiltrado inflamatrio no stio de inoculao subcutnea do T. cruzi ocorre com polimorfonucleares aps 1 hora, atinge um pico em 24 horas e no mais visto aps sete dias. J o infiltrado mononuclear inicia-se aps um dia, mximo aps quinze dias, ainda detectvel aos trinta dias, e regride totalmente em oitenta dias ps-infeco. No stio de inoculao s foi possvel detectar o parasita histologicamente e por imunocitoqumica 1 ou 15 minutos aps a infeco; no entanto, por PCR detecta-se DNA de T. cruzi desde um at quinze dias. Aps trinta ou 180 dias nem mesmo por PCR os autores detectaram vestgios do parasita no stio de inoculao. J miosite e miocardite foram detectadas em intensidade crescente aps sete, quinze e trinta dias, sempre acompanhadas de infiltrado mononuclear e da deteco do T. cruzi por PCR. O parasitismo decresce histologicamente aps 180 dias mas mantm-se positivo por PCR, assim como a miosite e a miocardite. Os autores acima referidos geralmente concordam em que os macrfagos tm papel decisivo na etapa inicial de proliferao parasitria:
A completa mudana do paras itis mo no stio de inoculao para o compartimento mus cular sugere que a quantidade de parasitas e os macrfagos dis ponveis no s tio inflamatrio s o fatores determinantes na fas e inicial da infec o (Deutchlnder et al., 1978).
Em 1929, Galliard chamou a ateno para o fato de que no peritnio dos camundongos, onde h grande disponibilidade de macrfagos residentes, se desenvolve uma infeco muito mais intensa que a percebida pelo exame do sangue. Desde muito cedo (dois dias aps a infeco) j se pode detectar uma quantidade aprecivel de tripomastigotas no lquido peritoneal.
41
4. 1 .2 A Resposta Imune Inata

Considerada por muito tempo como um vestgio ancestral de resposta imune, apenas recentemente a resposta imune inata vem sendo reexaminada. Seu papel no desenvolvimento e na articulao das respostas especficas adquiridas e em problemas de imunorregulao e imunopatologia vem sendo reinterpretado e considerado chave nas definies da intensidade e do tipo de resposta especfica (Fearon & Locksley, 1996). Os sistemas imune inatos, naturais, so compostos por protenas solveis e receptores de membrana produzidos pelas linhagens germinativas para ide ntificar s ubs tncias pote ncialmente nocivas . Seus principais componentes solveis so o sis te ma comple me nto e as prote nas de fas e aguda, com destaque para as colectinas (mannos e -binding prote in e outras), as pentraxinas e os inibidores de proteases. Seus principais componentes celulares so os macrfagos tissulares e inflamatrios (macrfagos ativados inespecificamente), as c lulas NK (linfcitos natural killers ), outras c lulas apre s e ntadoras de antge nos (especialmente clulas dendrticas), e algumas c lulas T ( e clulas T naturais ). A caracterstica comum a todas essas clulas a expresso de molculas de superfcie com capacidade de reconhecimento dos componentes solveis da resposta inata (receptores para complemento e para diversas protenas de fase aguda), bem como de reconhecimento de padres estruturais diferentes do prprio (non-s elf), especialmente carboidratos e glicolipdios complexos comuns em microorganismos. Assim, diversos tipos de receptores de superfcie so molculas de reconhecimento caractersticas dessas clulas, tais como os receptores scavenger , os receptores para complemento, o receptor para LPS (CD14) e os receptores lectnicos como o receptor de manose ou as galactinas. Por meio de sinalizao desses receptores so estimuladas a sntese de IL-1, IL-6, IL-12 e TNF (fator necrosante de tumor). J a resposta imune adquirida, que envolve o rearranjo dos elementos V, D, e J dos genes RAG 1 e RGA 2 para gerar bilhes de clones com distintos BCR e TCR, baseia-se num sistema de deteco de peptdeos que fornece uma faixa de reconhecimento de estruturas moleculares mais ampla do que os carboidratos, mas no distingue patgenos potenciais, que precisam de uma resposta imune, de substncias incuas para as quais uma resposta imune pode ser desnecessria ou at mesmo problemtica, como no caso de antgenos prprios. Articulando as respostas imune inata e adquirida encontram-se as citocinas, que se classificam em classes funcionalmente distintas: TNF, TGF, IL-1, IL-6, IL-8 e MCP-1 que so consideradas a resposta de fase aguda; CNF, SCF, TPO e EPO que so citocinas envolvidas na hematopoiese e INF, IL-2, -4, -6, -7, -10, -12, -13 e -15, que so as citocinas ditas reguladoras da funo imune adquirida (Les & Van Voorhis, 1995). A intensidade de apresentao de um determinado antgeno o primeiro determinante da montagem da resposta especfica adquirida pelo reconhecimento por clulas T auxiliadoras. Todos os sistemas de endocitose mediada por receptores em macrfagos e clulas dendrticas que facilitem a apresentao de antgenos parasitrios (por exemplo, lectinas e receptores diversos de remoo de componentes fis iolgicos) conferem, portanto, capacidade de instruo da resposta imune inata para a resposta especfica adquirida. Do mesmo modo, todos os sistemas ativadores do complemento, que geram C3d, potencializam a resposta imune humoral, pois o receptor para C3d (CD21) na membrana dos linfcitos B ao interagir com seu ligante estabiliza a ligao de CD19 com o BCR. No hospedeiro no imune os ativadores do complemento so as IgM naturais, a pentraxina CRP , as colectinas ou a via alternativa. A resposta inflamatria a primeira fase da resposta imune inata (Figura 2), e tem sido estudada com diversos agentes infecciosos e traumticos (S tadnyk & Gauldie, 1991), mas pouco com T. cruzi. Macrfagos e mastcitosso asprincipais clulasefetoras inflamatriasresidentesnos tecidos. Alm destas, asclulasintersticiais do estroma conjuntivo (fibroblastos) e as clulas endoteliais dos vasos sangneos das regies afetadas, compem o universo celular responsvel pela orquestrao da resposta inflamatria e pelo recrutamento de clulas inflamatriascirculantescomo linfcitos, neutrfilos, eosinfilos, basfiloseplaquetas. Estasltimasso provavelmente as geradoras dos primeiros sinais para a ativao de macrfagos tissulares, quimiocinas PF4 e TG e a citocina TGF-, secretados por plaquetas que ativam macrfagos a secretar asduas primeiras citocinas pr-inflamatrias,
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IL-1/TNF-, e os fatores de crescimento PDGF e FGF, que atuam sobre as clulas intersticiais do estroma do tecido lesado. Dessa ativao de plaquetas, moncitos, mastcitos e fibroblastos derivam a amplificao da resposta local e a montagem de uma resposta sistmica. A resposta local constitui-se de um aumento de permeabilidade vascular causado principalmente por aminas vasoativas, xido ntrico (NO), prostaglandinas e leucotrienos, ativao do endotlio vascular e de clulas do estroma, causada por IL-1 e TNF, com aumento de expresso e da funcionalidade de diversas molculas de adeso e liberao de estmulos quimiotticos (leucotrienos -LTB4- e quimiocinascomo IL-8 e MCAF), para a marginao vascular de neutrfilos, linfcitos e moncitos. A resposta sistmica constitui-se de uma ao de IL-1, IL-6, TNF e prostaglandinas ao nvel do sistema nervoso central, levando febre, produo de cortisol, de IL-1, IL-6 e TNF ao nvel heptico, estimulando a resposta de fase aguda, dos fatores estimuladores de colnias (GM-CSF e G-CSF) e de IL-3 ao nvel da medula ssea para aumento do nmero de leuccitos e, finalmente, pelo efeito de IL-1 e IL-6 na inicializao da resposta imune por clulas B e T.
INFLAMAO LOCAL NO STIO DE INOCULAO
macrfago macrfago residente residente
TGF TGF
mastcito mastcito
plaquetas
moncito IL1,TNF,IL6 PDGF,FGF clulas intersticiais do estroma
Resposta Local
Aumento da permeabilidade vascular (vasodilatao e constrico)
Resposta Sistmica
Sistema nervoso central (febre e produo de cortisol)
histamina, NO metablitos do c. araquidnico (PGs, LTD4, TXs,) PAF adenosina

Ativao do endotlio e de clulas do estroma: expresso de ICAM-1 e selectinas
IL-1 IL-6 TNF PGs MIF

Hepatcito: resposta de fase aguda
IL-1 e TNF
Marginao e quimiotaxia de leuccitos (neutrfilos, linfcitos e moncitos)
IL-6, IL-1 TNF, LIF

Medula ssea: leucocitose
quimiocinas: alfa: IL-8 e outras GM-CSF, G-CSF beta: MIP1, MCP, RANTES IL-3 PAF Clulas T e B: resposta imune metablitos do ac. araquidnico (LTB4) complemento (C5a) IL-1, IL-6 IL-12 TTh1IFN-
Ativao de clulas NK para produo de IFN- Ativao de macrfagos
IL-12
em itlico: os mediadores das diversas respostas
Figura 2 Clulasemediadoresenvolvidosnaresposta defaseaguda

43
4. 1 .3 A Resposta Imune Inata na Doena de Chagas

Existem poucos estudos sobre a resposta inflamatria imediata inoculao subcutnea com T. cruzi , prottipo da infeco natural ou acidental. Alm disso, a infeco por via vetorial ocorre, provavelmente, mais por via da mucosa ocular do que por via subcutnea, posto que o T. cruzi no est presente na saliva e sim nas fezes que o triatomneo deposita na regio onde lesou um vaso sangneo para seu repasto. Num stio de inoculao intradrmico, provavelmente as plaquetas so as primeiras sinalizadoras para a inflamao. O processo de invaso de macrfagos e clulas no fagocticas bastante complexo, envolvendo mecanismos ativos e passivos, tanto por parte do parasita quanto da clula-alvo, bem como numerosos componentes da membrana de ambos (revisto em Arajo-Jorge et al., 1992a e em Burleigh & Andrews, 1995). Aps vrios ciclos reprodutivos, as formas amastigotas sofrem diferenciao para tripomastigotas, que so liberados aps ruptura da clula, podendo invadir clulas vizinhas ou serem levados a outros tecidos pela corrente sangnea; por isso a parasitemia no detectvel nos primeiros sete a dez dias de infeco, quando a proliferao parasitria ainda est restrita leso de porta de entrada. Num estudo de infeco acidental, a parasitemia foi detectada apenas 33 dias aps a infeco (Hofflin et al., 1987). O chagoma de inoculao cutnea a primeira reao observada no mamfero aps o contato com as formas infectantes e lembra uma reao tipo hipersensibilidade retardada (Romaa, 1943). Aps o incio da disseminao por circulao sangnea ou linftica, quando um a dois parasitas j podem ser observados numa gota de sangue perifrico, h uma fase rpida de expanso parasitria (fase ascendente rpida da parasitemia) devida sobretudo proliferao em macrfagos de bao e fgado. Essa fase logo em seguida refreada pela ao eficiente de uma resposta especfica mediada por clulas T (ver item 4.2).
4. 1 .3. 1
Citocinas pr-inflamatrias e molculas de adeso na fase aguda
Alguns estudos j abordaram as variaes e o papel das citocinas IL-1, IL-6, TNF- e TGF-, principais orquestradoras da resposta inflamatria durante a infeco experimental por T. cruzi (Tarleton, 1988, 1990; Russo et al., 1989; Russo & S tarobinas, 1991; S tarobinas et al., 1991; S ilva et al., 1991, 1995; Truyens et al., 1994; Zhang & Tarleton 1996; Laucella et al., 1996). Todas so detectveis, aumentam rapidamente, ge ralmente precedem de uma semana o aumento da parasitemia, elevam-se cerca de dez vezes mais que o normal entre o 14o e o 17o dias, a depender do inculo utilizado, e decaem posteriormente para valores trs a cinco vezes os iniciais, normalizando-se aps quarenta dias de infeco. A produo de TNF- por camundongos C57BL/6 pode ser induzida mesmo utilizando-se parasitas fixados como estmulo (Tarleton, 1988). Os nveis de parasitemia no necessariamente se correlacionam com o nvel de produo de TNF- (Russo et al., 1989). Alm disso, a susceptibilidade de uma linhagem a um certo isolado de T. cruzi parece ser o resultado do conjunto de interaes que ocorrem via rede de citocinas, e no do efeito isolado de uma delas, pois em diferentes combinaes camundongo/parasita so detectadas produes de todas as citocinas citadas, com pequenas variaes de cintica (Zhang & Tarleton, 1996). A produo de IFN-, TNF-, IL-1- e IL-6 por camundongos Balb/C infectados com duas diferentes cepas de T. cruzi (Tulahuen e CA-1) foi estudada, tanto no bao, como no corao (Laucella et al., 1996). O interessante que no corao h intenso aumento da produo de todas as citocinas testadas, que em alguns casos chega a ser maior do que no bao. Estes autores tambm analisaram os nveis da molcula de adeso ICAM -1e mostraram que, como previsto pela presena de citocinas inflamatrias, foi possvel a deteco de nveis elevados de ICAM-1 solvel, bem como de expresso aumentada de ICAM1na superfcie de clulas. Essa molcula fundamental para o extravasamento de clulas inflamatrias nos stios de leso, mediando o reconhecimento dos leuccitos com o endotlio pela interao de ICAM-1 com a integrina LFA-1.
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4. 1 .3.2
A tivao inespecfica de macrfagos
Os macrfagos tm um papel essencial nas infeces. S ecretam uma vasta gama de mediadores qumicos e de citocinas que podem regular a resposta T emergente (funes endcrinas e parcrinas). Adquirem, processam e apresentam antgenos para clulas T e B, e so uma fonte de molculas co-estimulatrias para a ativao dessas clulas. Uma vez sensibilizados (primados ) por citocinas, eles podem se desenvolver em clulas ativadas para uma atividade efetora citotxica deflagrada por citocinas (como IFN- e TNF-) ou outros co-sinais, como LPS ou produtosdo alvo. S ecretam ento muitosprodutoscom atividade microbicida (metablitosreativosde nitrognio e de oxignio, lisozimas e citocinas citotxicas como TNF-), efetivos a depender da susceptibilidade do alvo. Um trabalho clssico de Hoff, em 1975, mostrou a cintica de ativao de macrfagos in vivo, em camundongos C3H infectados com T. cruzi. Os macrfagos peritoneais se tornavam resistentes infeco in vitro apenas 21 dias aps a infeco, no final da fase ascendente da parasitemia. Mostrou tambm que as curvas de parasitemia dos animais infectados no se modificavam em indivduos imunizados com BCG ou com Lis te ria monocytoge ne s , maseram reduzidasem animais previamente imunizados com formas epimastigotas de T. cruzi . No ano seguinte, Brener & Cardoso (1976) mostraram que a imunizao com Coryne bacte rium parvum reduzia a parasitemia e retardava a mortalidade de camundongos inoculados com altas doses de T. cruzi . Em 1977 uma srie de trabalhos de Nogueira (Nogueira et al., 1977a,b) mostraram que tanto a imunizao com epimastigotas como com BCG pode ativar macrfagos a exercerem atividade fagoctica e citotxica contra T. cruzi in vitro, e que nesses casos j na primeira semana ps-infeco era possvel detectar a ativao dosmacrfagos. Portanto, s ea ativao ine s pe cfica demacrfagospe lo BCG for e ficie nte , podecontribuir para a re s is t ncia infe co. A julgar pelo aumento da expresso de molculas de MHC classe II, a cin tica de ativao de macrfagos de pe nde do nme ro de paras itas inoculados e da via de inoculao. A porcentagem de macrfagos Ia+ aumenta de trs para cem em oito dias aps um inculo intraperitoneal de 105 parasitas, mas apenas aps 12 dias com o mesmo inculo intradrmico, e aps 28 dias com um inculo ID de 102 parasitas (Behbehani et al., 1981). O curso temporal da ativao de macrfagos in vivo acompanha o aumento nos nveis IFN-, a principal citocina responsvel pela ativao. Outras citocinas como GM-CSF, M-CSF e TNF- tambm podem contribuir sinergicamente ao efeito do IFN-. Estudos mais recentes mostraram que as citocinas IFN-, e TNF- so as principais mediadoras dessa ativao de macrfagos (ver Captulo 4.4) e que IFN- e IL-12 compem um sistema autcrino de fe e d-back positivo que amplifica os nveis de IFN- para ativao de macrfagos e de IL-12 para produo e ativao de clulas NK e Th1.
4. 1 .3.3
A resposta de fase aguda
A resposta de fase aguda o nome dado para um padro caracterstico de alteraes metablicas que ocorrem em resposta a diferentes formas de infeco, inflamao ou danos tissulares (Koj, 1984). Estas mudanas metablicas incluem leucocitose, diminuio da concentrao plasmtica de zinco e ferro, aumento da concentrao de cobre, aumento do catabolismo protico e gliconeognese, aumento da sntese protica total e febre, entre outros. Os nveis de complemento aumentam (Scharfstein et al., 1982), mas animais deficientes no componente C5 do complemento desenvolvem curso normal de parasitemia e apresentam nveis similares de mortalidade a animais com o sistema complemento funcionante (Dalmasso & Jarvinen, 1980). Alm disso, tripomastigotas so resistentes ativao direta da via alternada do complemento, por possurem molcula com atividade similar que apresenta decay accele rating factor humano (DAF, CD55) (Norris et al., 1991). O complemento pode tambm ser ativado por pentraxinas, como CRP , ou por colectinas, como mannos e -binding protein (M BP). No entanto o T. cruzi apresenta um antgeno de superfcie que mimetiza CRP humana, a julgar pela capacidade de interagir com anticorpos poli- e monoclonais anti CRP humana (Coutinho et al., 1998), que pode tambm contribuir para o escape do parasita aos efeitos do sistema complemento. Quanto possvel participao da MBP , que reconhece padres de manoses comumente
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expostos na superfcie dos microorganismos, ela no reconhece formas tripomastigotas, contribuindo, desse modo, possivelmente, para o escape lise por complemento na fase inicial da infeco (Kahn et al., 1995). J as formas amastigotas se ligam MBP , atravs de glicoprotenas de superfcie, da famlia S A85 (Kahn et al., 1996). Durante a inflamao, h um grupo bem definido de protenas, conhecidas como protenas de fase aguda, cujos nveis plasmticos aumentam. Entre elas temos: (a) protena C reativa (CRP), que funciona como uma opsonina no especfica para aumentar a fagocitose de bactrias; (b) -2-macroglobulina (A2M) e outros inibidores de proteases; (c) protena fibrinognio da coagulao; (d) protena amilide do soro (SAP); (e) haptoglobina; (f ) fibronectina solvel (Fn). A maioria das alteraes nas concentrae s plasmticas pode ser diretamente atribuda a alteraes nos nveis de sntese dessas protenas plasmticas por hepatcitos, que por sua vez so regulados primariamente por IL-1 /TNF- e por IL-6. At o presente, pouco se sabe a respeito do papel dos elementos da resposta de fase aguda na doena de Chagas. Do conjunto de protenas de fase aguda apenas trs foram estudadas em camundongos: SAP , A2M e Fn. A SAP aumenta drasticamente no plasma de camundongos C57BL/6, em paralelo ao aumento da parasitemia, dependendo do inculo utilizado (Scharfstein et al., 1982; Luz et al., 1994). J em camundongos C3H seus nveis no se alteram em resposta infeco (Luz et al., 1994), e em camundongos Balc/C aumentam, mas muito menos do que em C57BL/6 (Luz et al., 1994; Truyens et al., 1994). Crianas na fase aguda da doena de Chagas tambm apresentam uma resposta heterognea quanto elevao de CRP (o homlogo da S AP de camundongos), com predomnio de aumento (Medrano-Mercado et al., 1996a). S abe-se que a CRP ativa complemento, atua como um opsonizante e ativa macrfagos e neutrfilos (revisto em S teel & Whitehead, 1994). Os componentes C3 e C4 do complemento tambm aumentam na fase aguda da infeco experimental (Scharfstein et al., 1982). Tanto camundongos como crianas infectadas apresentaram nveis elevados de -macroglobulinas, inibidores fisiolgicos de proteinases, durante a fase aguda (Luz et al., 1994, 1995; M edrano-Mercado et al., 1996a,b). O aumento do nvel de A2M mais significativo nas crianas assintomticas do que naquelas sintomticas, que se encontravam hospitalizadas no momento da colheita do soro (Medrano-M ercado et al., 1996b). Camundongos Balb/C que sobreviveram infeco aguda apresentaram nveis mais elevados de A2M plasmtica comparvel queles que morreram (Arajo-Jorge et al., 1992b). No entanto, tal como para SAP tambm grande a heterogeneidade observada nos animais e em humanos quanto elevao dos nveis de A2M (Luz et al., 1994, 1995; Medrano-Mercado et al., 1996b). Como conhecido o envolvimento de proteinases de T. cruzi em eventos moleculares ligados sua interao com clulas hospedeiras (revisto em Arajo-Jorge et al., 1992a), o efeito de A2M nesse processo foi estudado in vitro e mostrou-se que A2M pode inibir a invaso de macrfagos e fibroblastos por parasitas das cepas Y, Colombiana e CL, possivelmente devido sua ao inibidora sobre proteinases. Alm disso, a pr-incubao de macrfagos peritoneais residentes com A2M resulta em um aumento na endocitose e na destruio celular de tripomastigotas da cepa Y. Um papel potencialmente importante e ainda pouco explorado da AM sua atividade como carreadora de citocinas (revisto em Borth, 1992 e em Legrs et al., 1994). Esta ligao resulta na reduo de atividade dessas citocinas, ou no aumento de sua meia-vida. A2M ligase a TGF-, TNF-, IL-1, IL-2 e IL-6. Finalmente, foi demonstrado que tambm a Fn apresenta nveis ligeiramente elevados na fase aguda da infeco experimental (Truyens et al., 1995), resultado encontrado tambm em crianas chagsicas na fase aguda (Antas, 1996). Em ambos os casos foi mostrado que h elevao dos nveis de anticorpos anti Fn. Estudos in vitro sugerem que Fn tenha papel como adjuvante na penetrao do parasita nas clulas do hospedeiro vertebrado (Wirth & Kierszenbaum, 1984; Ouaissi et al., 1985), e que anticorpos anti Fn podem ter efeito protetor na infeco (Ouaissi 1988). Apesar desse conjunto de dados, ainda no foi esclarecido o real papel que essas protenas de fase aguda apresentam in vivo na infeco.
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4. 1 .4 Atividade de Clulas NK e de Clulas T

Quando ativadas, as clulas NK cumprem duas funes primordiais: sintetizar IFN- e lisar alvos reconhecidos por seus receptores. Um dos sistemas de ativao das clulas NK a interao. Na dcada de 80 foi observado um aumento de atividade NK no bao de animais C57BL/6 e C3H infectados experimentalmente (Hatcher et al., 1981), bem como a induo de atividade citotxica em macrfagos peritoneais. Essa atividade pode ser verificada tanto utilizando-se parasitas vivos como mortos por calor. Com base em seus resultados, os autores discutiram que no havia indcios de que clulas NK desempenhassem um papel direto na proteo durante a infeco por T. cruzi . A administrao de indutores da atividade NK, como o cido poliinosino-citidlico (Hatcher & Kuhn, 1982), gera clulas NK com atividade tripanocida. Do mesmo modo, a administrao de tilerone (James et al., 1982), indutor de atividade NK, aumenta a resistncia infeco. No entanto, o papel-chave das clulas NK como secretoras de INF- e participantes da resistncia do hospedeiro infeco por T. cruzi foi recentemente demonstrado (S ilva et al., 1995), especialmente quando da sua depleo in vivo por anticorpos anti NK (ver item 4.4). J a subpopulao de linfcitos T pode ser ativada por antgenos contendo prenil-pirofosfato (componentes de membranas de microorganismos envolvidos na ligao de carboidratos), e no precisam de processamento intracelular ou de associao com produtos M HC. Secretam IFN- e TNF e induzem a diferenciao de clulas Th1. S eu nmero aumenta bastante durante a infeco (Minoprio et al., 1989). Essas clulas podem modular a parasitemia em certos modelos (Cardillo et al., 1993) e a inflamao caracterstica da miocardite aguda (Santos-Lima & Minoprio, 1996).
4. 1 .5 Regulao da Resposta Imune Inata

H muitas evidncias de que a resposta imune inata se auto-regula, reduzindo a ativao de macrfagos e a produo local de xido ntrico (NO). Em excesso, altos nveis de TNF-, de IFN- e de NO podem ser extremamente prejudiciais ao prprio hospedeiro (Hunter et al., 1997; M eyer zum Buschenfelde et al., 1998). Assim, nas situaes experimentais de resoluo da fase aguda, tanto a resposta imune adquirida, especfica anti T. cruzi , como o controle da ativao da resposta inata tm um papel decisivo (ver item 4.3). As citocinas responsveis por essa desativao so IL-10 e TGF-, cuja sntese aumenta. IL-10 comea a ser detectada trs semanas aps a infeco em Balb/c, tanto com cepa virulenta como atenuada de T. cruzi (Revelli et al., 1999) e apresenta maiores nveis sricos, justamente no modelo mais resistente, sem leso tissular. A produo de IL-10 necessria para controlar os efeitos inflamatrios letais de citocinas tipo 1 produzidas durante a infeco (Hunter et al., 1997) e camundongos resistentes apresentam maior produo de IL-10 quando comparados com susceptveis (Zhang & Tarleton, 1996). O declnio da sntese de TNF-, NO e IL-13, medidos por deteco do mRNA por RT-PCR no tecido cardaco (Powell et al., 1998) mais rpido num modelo experimental resistente do que num susceptvel infeco. Esse conjunto de evidncias e estudos so claros indicativos de que a resposta imune inata ativa durante a infeco por T. cruzi , colabora para o estabelecimento da resposta imune especfica e, dependendo da regulao homeosttica de seus componentes efetores, pode ser decisiva para o estabelecimento de resistncia ou susceptibilidade fase aguda, bem como ao desenvolvimento posterior de patologia associada fase crnica da infeco.
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4.2
A Resposta Imune Celular na Infeco Experimental por Trypanosoma cruzi

George A. Dos Reis
A infeco experimental de camundongos por Trypanos oma cruzi induz a uma srie de alteraes no sistema imune: imunossupresso, ativao policlonal linfocitria e hiperproduo de imunoglobulinas (Igs), alm de resultar na persistncia indefinida do parasita nos tecidos do hospedeiro e na leso dos tecidos nervoso e cardaco (revisto em Brener, 1994 e em Dos Reis & Lopes, 1999). Estas caracters ticas em muitos aspectos mimetizam a infeco humana conhecida como doena de Chagas ou tripanosomase americana. O camundongo constitui o principal modelo experimental disponvel para o estudo dos mecanismos patognicos e imunoprotetores relacionados infeco chagsica, com a ressalva de que ser sempre necessrio verificar a validade das observaes descritas atravs da sua ocorrncia em humanos infectados. A discusso aqui apresentada no tenciona rever os dados j publicados, mas sim discutir alguns aspectos controvertidos sobre o tema que permanecem por ser esclarecidos.
4.2. 1 A Resposta Imune: Proteo e leso

Como outros microorganismos patognicos intracelulares, o T. cruzi capaz de infectar o hospedeiro mamfero vertebrado, resistindo indefinidamente ao ataque da resposta imune. Esta no entanto, aps um perodo de imunossupresso e ativao policlonal generalizada, torna-se capaz de controlar o nvel de parasitismo nos tecidos. S egundo a tendncia atual mais aceita, o controle imunolgico da carga parasitria nos tecidos que gera mecanismos de leso tecidual progressiva (Tarleton, 1995). No entanto, no est descartado que mecanismos imunolgicos de auto-reconhecimento disparados pelo processo infeccioso tambm possam ter um papel adicional na patognese das leses observadas (Ribeiro dos S antos et al., 1992). O nvel de conhecimento obtido sobre a imunidade celular contra o parasita, apesar de sofisticado em alguns casos, descritivo. Osmecanismosdepersistncia do T. cruzi , ea natureza dasalteraesimunolgicasquepermitem esta persistncia so amplamente ignorados, devido s limitaes do conhecimento atual sobre imunorregulao. Diferentes grupos de pesquisa, utilizando diferentes isolados de T. cruzi e diferentes linhagens isognicas de camundongo, esto estudando aspectos da imunidade inata e da imunidade adquirida contra o parasita, geralmente baseados na produo de diferentes citocinas regulatrias da resposta imune. Numerosas evidncias recentes indicam um papel importante da imunidade inata, no s como primeira linha de defesa do hospedeiro, mas tambm no direcionamento instrutivo da qualidade da resposta imune adquirida subseqente (Fearon & Locksley, 1996). Vrios estudos demonstraram um importante papel de clulas NK (natural kille r) na defesa inicial contra a infeco por T. cruzi (Cardillo et al., 1996), cuja funo protetora est ligada
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produo da citocina IFN- por estas clulas. Esta citocina tem um papel protetor inicial na infeco chagsica (Reed, 1988), presumivelmente devido sua capacidade de ativar a produo de metablitos do xido ntrico (NO), com atividade tripanocida em macrfagos infectados (Gazzinelli et al., 1992). Por outro lado, a ativao intensa de clulas NK parece dependente da produo da citocina IL-12, alm de TNF-, por macrfagos infectados pelo T. cruzi (Aliberti et al., 1996). J foi amplamente demonstrado que a produo local de IL-12 e IFN- por mecanismos inatos de defesa facilita a induo subseqente de clulas T CD4 especficas para antgeno com o fentipo secretrio de clulas Thl. Esta deve ser a razo pela qual uma onda de ativao de clulas Thl ocorre primeiro na infeco chagsica, predominando no incio da fase aguda (Zhang & Tarleton, 1996). Ainda durante a resposta imune inata, ocorre produo das citocinas regulatrias IL-10 (Reed et al., 1994) e TGF- (S ilva et al., 1992), com uma cintica mais retardada em relao ao IFN-. Estas citocinas, entre outros mecanismos, antagonizam a ao ativatria do IFN- ao nvel da resposta dos macrfagos teciduais a esta citocina. Tanto macrfagos (Reed et al., 1994) como clulas B CD5 (Minoprio et al., 1993) podem produzir IL-10, e possvel que esta produo seja necessria para minimizar os efeitos txicos causados por uma grande produo das citocinas inflamatrias IL-12 e IFN-. As clulas B CD5 correspondem a uma subpopulao primitiva de linfcitos B, com algumas caractersticas semelhantes a macrfagos, apesar de rearranjarem os genes de Ig (H ardy et al., 1994). As Igs formadas reconhecem, em geral, determinantes antignicos localizados em antgenos polissacardicos nicos de microorganismos, e a ativao destas clulas requer citocinas que podem aparentemente ser supridas por clulas NK como clulas auxiliadoras (Snapper & Mond, 1996). A maior resistncia de animais deficientes de clulas B CD5 infeco chagsica foi atribuda a uma maior produo de IFN- e reduzida produo de IL-10 neste caso (Minoprio et al., 1993). Tambm as clulas T , uma linha de defesa intermediria entre a resposta inata e a adquirida, e que reconhecem um grupo restrito de determinantes antignicos comuns a vrios microorganismos, podem modular a parasitemia e o grau de leso tecidual na infeco chagsica (Cardillo et al., 1993). A resposta imune inata tem um papel inicial importante na defesa anti T. cruzi , controlando parcialmente a infeco. Animais geneticamente deficientes de respostas adquiridas (animais RAG knockout cujos linfcitos no fazem rearranjo gnico) controlam a infeco to bem como animais normais durante a primeira semana de infeco, perdendo, a seguir, o controle da parasitemia, enquanto animais normais conseguem resolv-la (Abrahamsohn & Coffman, 1996). A resposta imune adquirida, mediada por linfcitos T CD4 e CD8 convencionais (TCR ) e pelos anticorpos produzidos por clulas B convencionais, absolutamente essencial para o controle da parasitemia e para a sobrevivncia do hospedeiro. Estes dados foram obtidos infectando-se camundongos deficientes na expresso de molculas de histocompatibilidade classe I ou classe II, deficientes em clulas T CD8 ou CD4 maduras, respectivamente (Tarleton et al., 1992; Rottenberg et al., 1993). Os animais so altamente susceptveis morte pela infeco. Existe ainda uma correlao entre o grau de leso tecidual e a imunocompetncia do hospedeiro na fase aguda. Os animais deficientes em clulas T CD8 ou CD4 apresentam alta carga parasitria nos tecidos, mas pouca ou nenhuma leso tecidual (Tarleton et al., 1992, 1995). Estes dados sugerem que a leso tecidual conseqncia inescapvel do processo de controle do parasitismo tecidual por linfcitos efetores competentes (Tarleton, 1995). A necessidade de clulas T CD4 na defesa poderia estar relacionada com a ativao imunolgica de macrfagos infectados e com a destruio intracelular de parasitas por clulas do tipo Thl, produtoras de IFN- e, no caso de clulas Th2, com a induo da produo de anticorpos lticos protetores (Brener, 1986). Um estudo recente demonstrou a existncia de uma onda de atividade Thl na infeco chagsica que posteriormente se extingue, dando lugar a uma onda de atividade Th2 que persiste durante a infeco crnica (Zhang & Tarleton, 1996). O mecanismo de inativao das clulas Thl no est claro, podendo derivar da induo de anergia clonal ou de morte celular programada. Por ltimo, a necessidade de clulas T CD8 na defesa deve estar relacionada com a capacidade do parasita de infectar qualquer tipo celular do hospedeiro, incluindo clulas que no expressam MH C classe II, apenas MH C classe I. Neste caso, a defesa anti T. cruzi deve estar relacionada com a atividade citotxica de efetores do tipo T CD8. No entanto, o estudo deste importante
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aspecto da resposta imune celular tem sido prejudicado pela inexplicvel dificuldade de se demonstrar e isolar clulas T CD8 citotxicas especficas para antgenos do parasita. Foi demonstrado que clulas T CD8 da infeco chagsica sofrem um processo de morte celular por apoptose espontnea quando explantadas imediatamente de animais infectados (Lopes et al., 1995), o que poderia ter relao com a dificuldade de isolar clulas funcionais viveis nesta infeco. Vrios estudos identificaram a presena de uma etapa de imunossupresso generalizada in vitro de linfcitos T (Harel-Bellan et al., 1985) e foi sugerido que esta etapa crtica para o escape e persistncia do parasita nos tecidos (Kierszenbaum, 1981). Estudos recentes apontam para dois mecanismos distintos de imunossupresso: um mediado por produtos de macrfagos ativados, e outro mediado por um programa de morte programada induzida por ativao pelo TCR da clula T. Confirmando estudos anteriores, uma investigao recente identificou um mecanismo de supresso de clulas T CD4 na infeco aguda por T. cruzi mediado por clulas aderentes/macrfagos (Abrahamshon & Coffman, 1995). Neste trabalho, contudo, foi demonstrado que aps ativao linfocitria, a produo exacerbada de IFN- levou tambm produo de radicais de NO por macrfagos, que inibiram a proliferao celular de linfcitos T (Abrahamshon & Coffman, 1995). Portanto, este mecanismo resulta de respostas Thl exacerbadas que culminam com a produo de mediadores txicos por macrfagos ativados. Utilizando um modelo de infeco de baixa virulncia, com formas metacclicas de T. cruzi , outros estudos identificaram um defeito intrnseco na ativao de clulas T CD4 via o re ce ptor antig nico (TCR), mas no atrav s da via alte rnativa de ativao me diada pe lo antgeno CD69 (Lope s& Dos Reis, 1994, 1996). Neste modelo, no se encontrou evidncia de anergia nas clulas T (Lopes & Dos Reis, 1996), mas o defeito intrnseco foi identificado como morte programada induzida por ativao, levando apoptose linfocitria (Lopes et al., 1995). Neste estudo, clulas T CD8 morriam espontaneamente por deprivao de fatores (exausto clonal? ), mas no morriam aps ativao (Lopes et al., 1995). A morte por ativao de clulasT CD4 parece ser um fenmeno imunorregulatrio decorrente da extensa ativao policlonal, e causa supresso das respostas proliferativas in vitro, estando ausente quando a ativao se processa por vias alternativas como CD69 e Ly-6 (Lopes & Dos Reis, 1996). Em conjunto, estes estudos indicam a operao de mecanismos supressores distintos, possivelmente atuando em fases distintas da infeco. A imunorregulao de clulas T CD8 na infeco permanece pouco entendida. Os dados discutidos aqui revelam um avano significativo na compreenso da patognese da infeco chagsica. No entanto, as vrias lacunas existentes ainda no permitem estabelecer com clareza as anomalias imunolgicas que resultam na cronificao da infeco. Animais geneticamente alterados em determinadas vias moleculares de regulao imunolgica (como citocinas, receptores sinalizadores de apoptose e protenas protetoras contra a exausto clonal) sero ferramentas importantes para dissecar estes processos in vivo. Tambm faltam modelos adequados para definir os mecanismos imunopatognicos de leso do tecido cardaco, e resolver se esta primariamente causada pela presena do parasita, ou por linfcitos T auto-reativos, sensibilizados durante o processo agudo de ativao policional. Uma ltima fronteira pouco explorada a identificao de molculas e mecanismos utilizados pelo parasita para subverter local e sistemicamente a imunidade celular. Nesta linha situam-se os trabalhos recentes de identificao do TIF (fator imunossupressor de tripomastigotas) (Majunder & Kierszenbaum, 1996), e do glicoinositol fosfolipdeo (GIPL) de T. cruzi (Gomes et al., 1996) como molculas capazes de bloquear respostas imunes celulares do hospedeiro.
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4.3
A Resposta Imune Humoral e As Funes do Linfcito B na Infeco por Trypanosoma cruzi

Maria Teresa Rivera
A forma aguda da infeco pelo Trypanos oma cruzi se caracteriza por uma intensa multiplicao parasitria. A parasitemia aumenta rapidamente, associada morte de um certo nmero de indivduos. Naqueles que sobrevivem, o controle da infeco se traduz por uma diminuio progressiva da parasitemia, que se tornar praticamente indetectvel na forma crnica da infeco. Os parasitos circulantes no so eliminados completamente, apesar de o hospedeiro parasitado na fase crnica ter se tornado resistente a uma nova infeco. A infeco por T. cruzi apresenta, assim, o paradoxo encontrado freqentemente nas relaes parasitahospedeiro, ou seja, a persistncia de uma populao parasitria no hospedeiro imune. Alm disso, a infeco acarreta uma desregulao do sistema imune, com uma ativao policlonal dos linfcitos B e T, um certo grau de hipergamaglobulinemia e um estado de imunossupresso, que so, provavelmente em parte, a origem da patologia da doena de Chagas.
4.3. 1 A Ativao Policlonal dos Linfcitos B

No camundongo infectado pelo T. cruzi ocorre logo uma ativao policlonal de clulas B na fase aguda, que persiste na fase crnica (D Imperio Lima et al., 1985, 1986; Minoprio et al., 1986a). Esta ativao causa uma hipergamaglobulinemia poliisotpica importante e reversvel, sendo caracterizada por um aumento considervel de imunoglobulinas e uma resposta especfica ao parasita, que tambm poliisotpica e estvel. Nesta resposta se detectam altas concentraes de IgG2a e IgG2b entre os anticorpos anti T. cruzi, e IgG2a entre os anticorpos inespecficos (Spinella et al., 1992; El Bouhdidi et al., 1994), podendo esse isotipo atingir 50% das imunoglobulinas totais do soro (H ontebeyrie-Joskowicz, 1994). Esta ativao policlonal foi bem demonstrada no modelo murino da doena de Chagas, porm na infeco humana ainda no est totalmente estabelecida (Kierszenbaum & Sztein, 1994). Existem, no entanto, os seguintes relatos indicativos de sua ocorrncia em humanos: (1) num caso de infeco acidental em laboratrio foi estudado o curso da produo de imunoglobulinas especficas anti T. cruzi , bem como de imunoglobulinas dirigidas para autoantgenos (Grauert et al., 1993); foi demonstrada hipergamaglobulinemia precoce desde 17 at 66 dias (mxima em trinta dias) aps a infeco, quando a parasitemia se tornou subpatente, de IgM e IgG, de carter poliisotpico (IgA, IgM e IgG), e tambm com elevados nveis de auto-anticorpos IgM e das s ubclasses de IgG; (2) foi demonstrado que pacientes chagsicos crnicos apresentam na circulao uma alta freqncia de clulas ativadas (Dutra et al., 1994), tanto B como T, caractersticas de condies patolgicas com respostas auto-imunes, hiperimunes e policlonais, e que esta ativao se mantm mesmo aps a cura
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parasitolgica (Dutra et al., 1996). Recentemente foi identificado um antgeno de T. cruzi de 24 kDa com capacidade de ativao policlonal de clulas B (Silva et al., 1998), que utilizada para sorologia em ELISA correlaciona-se aos resultados obtidos com o mtodo de deteco de anticorpos lticos (Krautz et al., 1994; Taibi et al., 1995).
4.3.2 A Funo das Clulas B CD5

As clulas B CD5 constituem uma populao de linfcitos B, presentes principalmente durante a vida fetal, que participam da seleo dos linfcitos maduros (M inoprio et al., 1989). Estas clulas aumentam consideravelmente durante a infeco por T. cruzi , e assim poderiam estar implicadas nas reaes auto-imunes associadas doena de Chagas (M inoprio, 1991). Em pacientes crnicos tambm foi demonstrada alta freqncia de clulas B CD5 (Dutra et al., 1996). Camundongos geneticamente deficientes em linfcitos B CD5 (mutao Xid) controlam a parasitemia de modo mais eficaz, no apresentando alteraes no estado geral (caquexia) e desenvolvendo somente poucas leses inflamatrias no incio da fase crnica da infeco. Alm disso, produzem nveis menores de imunoglobulinas tanto no especficas (policlonais) como anticorpos especficos anti T. cruzi (dez vezes menores do que nos animais sem mutao) (M inoprio et al., 1993). Estas informaes sugerem que as clulas B CD5 esto implicadas na maturao das clulas B seja diretamente, ou aumentando a atividade dos linfcitos CD4 Th2; no camundongo Xid, a deficincia em linfcitos B CD5 poderia produzir uma inibio das clulas CD4 Th2 e uma ativao das clulas CD4 Th1 (Hontebeyrie-Joskowics, 1991), aumentando assim a resistncia infeco por T. cruzi . Em concluso, as clulas B CD 5 permitiriam uma forte ativao das clulas B convencionais com uma produo dos isotipos IgG2a e IgG2b, acarretando leses inflamatrias e auto-imunes associadas com a doena de Chagas (M inoprio et al., 1991).
4.3.3 A Produo dos Anticorpos Especf icos anti T. cruzi

A investigao de anticorpos anti T. cruzi por meio de diferentes tcnicas a base do diagnstico imunolgico da doena de Chagas (Brenire et al., 1985; Carlier et al., 1985; Brener & Krettli 1990; Tanowitz et al., 1992). Na infeco experimental, a resposta especfica poliisotpica com um predomnio dos anticorpos IgG2a, IgG2b e IgM (Spinella et al., 1992; El Bouhdidi et al., 1994). Um trabalho clssico no estudo dos mecanismos humorais de proteo demonstrou que, associados ao estado de proteo do hospedeiro, estavam apenas os anticorpos reativos contra formas vivas de tripomastigotas (e no formas fixadas ou extratos e fraes celulares), que podiam mediar nestas a lise por complemento (Krettli & Brener, 1982). Essa linha de investigao firmou o conceito de anticorpos anti T. cruzi lticos, reativos apenas contra formas vivas do parasita, e que decaem quando ocorre cura parasitolgica aps terapia tripanocida (e proposto como critrio de cura parasitolgica), e anticorpos anti T. cruzi convencionais, capturveis com antgenos de parasitas fixados, extratos ou fraes. Um polipeptdeo de 160 kDa da s uperfcie dos tripomastigotas foi identificado como alvo para os anticorpos protetivos (Martins et al., 1985), e posteriormente foi clonado um antgeno de 160 kDa (gp160) que capaz de induzir a sntese de anticorpos lticos e que apresenta homologia com o DAF (CD55) humano (Norris et al., 1991). O papel protetor dos anticorpos foi bem estudado no modelo camundongo (Kagan & Norman, 1961; Kierszenbaum & Howard, 1976). Estes anticorpos aparecem a partir da terceira semana de infeco (Kre ttli & Brener, 1976) e participam da eliminao dos parasitas circulantes (Kipnis et al., 1981; Umekita et al., 1988).
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Diferentes experincias evidenciam sua funo protetora:
a parasitemia e a mortalidade so muito mais elevadas em camundongos que so, geneticamente, maus
produtores de anticorpos do que naqueles bom produtores (Kierszenbaum & Howard, 1976; Brener & Krettli, 1990); a pr-incubao de tripomastigotas com um soro de forma crnica diminui sua infectividade (MacH ardy, 1977); a depleo de linfcitos B por injeo de anticorpos torna os animais mais susceptveis infeco (Okabe et al., 1980); a transmisso passiva de soros imunes ou de imunoglobulinas purificadas provenientes de animais na fase crnica protegem os camundongos contra uma infeco letal (Scott & Goss-Sampson, 1984; Brener 1986); por outro lado, nveis elevados de infeco so obtidos em animais sem clulas B; a transferncia de clulas imunes do bao sem linfcitos B, no induz a uma proteo nestes animais (Scott, 1981). A proteo depende da poro Fc dos anticorpos (Umekita et al., 1988), e mais especificamente dos isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b, que aumentam a eliminao dos parasitos circulantes (Takehara et al., 1981; Brodskyn et al., 1988, 1989). Diferentes mecanismos dependentes de anticorpos podem contribuir para a eliminao de tripomastigotas extracelulares:
sua aglutinao com soros imunes especficos diminui sua infectividade (Krettli & Brener 1976; Brener &
Krettli, 1990); a infeco de clulas no fagocticas (como clulas miocrdicas e fibroblastos) pode ser inibida por anticorpos (Wirth & Kierszenbaum, 1988); anticorpos capazes de reconhecer um eptopo galactosil--1-3galactose presente na superfcie da forma tripomastigota de T. cruzi destroem os parasitas, participando assim na diminuio da parasitemia das formas aguda e crnica da infeco (Gazinelli & Brener, 1991; Gazinelli et al., 1991); esta lise pode tambm ser mediada pela via clssica ou alternativa do complemento (Krettli et al., 1979), no necessariamente pela poro Fc dos anticorpos, mas sim pelo bloqueio que estes possam ter sobre o inibidor da C3 convertase presente na superfcie de tripomastigotas circulantes (Joiner et al., 1988; Norris et al., 1994); a opsonizao dos parasitas por anticorpos pode contribuir para sua eliminao atravs de mecanismos de AD DC (citotoxicidade celular dependente de anticorpos). D iferentes populaes celulares apresentam receptores FcR na sua superfcie, como eosinfilos (Sanderson et al., 1977), macrfagos (Okabe et al., 1980) e mastcitos (Tambourgi et al., 1989), podendo assi m contribuir para a eliminao dos parasitas. A expresso dos FcRII/III de baixa afinidade est aumentada nas clulas de camundongos infectados (Arajo-Jorge et al., 1993). M esmo assim, os parasitas opsonizados por anticorpos so mais facilmente fagocitados e lisados por macrfagos. A atividade tripanocida dos macrfagos resulta de sua ativao por certas citocinas liberadas por linfcitos T sensibilizados (Nogueira et al., 1981), como o IFN- , cuja funo foi claramente demostrada in vitro e in vivo (Golden & Tarleton, 1991). Outras citocinas podem entrar em sinergia com IFN- e contribuir para uma maior ativao dos macrfagos. Este o caso de TNF-, produzido pelos prprios macrfagos durante a infeco por T. cruzi (Tarleton, 1988), e que tambm tem uma funo protetora demostrada in vitro e in vivo (De Titto et al., 1986; Starobinas et al., 1991). IL-1, GM-CSF e IL-3 parecem possuir tambm uma ao sobre a ativao de macrfagos, porm inferior a de IFN- e TNF- (Reed, 1998). Alm disso, a IL-1 complementada com a IL-2, estimula tambm a funo das clulas T helper, participando deste modo na resposta imune dos linfcitos B (Reed et al., 1989).
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4.3.4 Diagnstico Imunolgico da Doena de Chagas

A deteco de anticorpos anti T. cruzi um instrumento muito importante, sobretudo no diagnstico e na avaliao da forma crnica da infeco (Ferreira, 1992). Extratos antignicos do parasita preparados a partir de formas epimastigotas de cultivo ou de tripomastigotas obtidos por cultivo celular, so utilizados em diferentes reaes sorolgicas como fixao do complemento (reao de M achado-Guerreiro), hemaglutinao, imunoprecipitao, imunofluorescncia e ELISA (Carlier et al., 1985; Brenire et al., 1987). Estas tcnicas permitem o diagnstico de infeces crnicas em 95 a 99% dos casos. Alm do diagnstico clnico, estes mtodos so utilizados no controle de doadores em bancos de sangue e em estudos epidemiolgicos. O problema ocasionado por reaes falso-positivas levou ao desenvolvimento de tcnicas de diagnstico sorolgico muito mais especficas. A utilizao de antgenos purificados especficos para T. cruzi , ou de anticorpos monoclonais permitem eliminar as reaes cruzadas devido a outros tripanosomatdeos encontrados na Amrica Latina (Le is hmania e T. range li) (Dragon et al., 1985; Lemesre et al., 1986; Martin et al., 1990; Paranhos-Bacalla et al., 1994). Tambem graas deteco de anticorpos antiidiotpicos especficos para T. cruzi , pode-se diferenciar pacientes crnicos assintomticos daqueles que apresentam doena crnica grave (D Avila Reis et al., 1993b). A deteco de anticorpos que inibem a atividade da enzima transialidase de T. cruzi permite avaliar a infeco crnica e a congnita. Tal como os anticorpos lticos, estes anticorpos neutralizantes podem servir tambm como marcadores de remisso no acompanhamento de pacientes submetidos a quimioterapia (Leguizamon et al., 1994). Porm, uma resposta humoral especfica contra um extrato total de T. cruzi e contra o peptdeo R-13 (derivado da protena ribosomal P do parasita) mostra que os anticorpos anti R-13 permitem diferenciar formas da patologia chagsica: estes anticorpos se apresentaram em grande proporo em pacientes chagsicos cardacos e ausentes em outros pacientes que apresentavam formas digestivas desta enfermidade; respostas positivas anti-R-13 tambm foram detectadas em recmnatos infectados por via congnita (Aznar et al., 1995). A deteco de anticorpos lticos, que foi classicamente feita pelo teste de lise mediado por complemento (Krettli & Brener 1982), est sendo aprimorada. J foram descritos mtodos de citometria de fluxo (Martins-Filho et al., 1995) e de ELISA (Krautz et al., 1994; Taibi et al., 1995), utilizando respectivamente tripomastigotas de cultura de clulas como agente de captura, ou antgenos purificados ou recombinante (Tc-24), que tambm diferenciam a infeco por T. cruzi da infeco por T. rangeli . Apesar de anticorpos lticos estarem presentes em vrios mamferos, uma caracterstica importante da doena de Chagas a presena somente em humanos (e em primatas do Novo Mundo, mas no em camundongos) de anticorpos antigalactose, capturveis por laminina de camundongo ou outros antgenos ricos no eptopo Gal-1-3-Gal (Szarfman et al., 1982; Milani & Travassos, 1988). So precoces e intensamente estimulados durante a infeco pelo T. cruzi (Gazzinelli et al., 1988; Grauert et al., 1993); so capazes de induzir a lise dos parasitas em presena de complemento (Almeida et al., 1991) e apresentam-se em nveis mais elevados em pacientes crnicos assintomticos do que em sintomticos (Gazzinelli, 1992). Estudos com crianas infectadas em rea endmica da infeco demonstraram que a presena desses anticorpos em diluies sricas de 1:5.000 pode ser indicativa da presena de infeco recente (Medrano-Mercado et al., 1996a, b; Antas et al., 1999).
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4.4
Participao de Citocinas no Determinismo de Resistncia ou Susceptibilidade Infeco Experimental por Trypanosoma cruzi
Gisline A. Martins, Jlio C. S. Aliberti & Joo S. Silva
Ne ste captulo dis cutiremos o pape l de algumas citocinas e quimiocinas e de alguns dos possveis mecanismos que influe nciam no dete rminismo da res istncia e/ou susce ptibilidade e m camundongos infe ctados por Trypanos oma cruzi . Durante a fase inicial da infeco por e sse paras ita, os ndices paras itmicos e a mortalidade do hos pede iro de pe nde m intrinse camente da ce pa de T. cruzi e das caractersticas ge nticas do animal infe ctado, incluindo os genes do s istema principal de histocompatibilidade (Wrightsman et al., 1982). Algumas cepas de parasitas s o capaze s de matar todos os animais infectados enquanto outras so quase avirulentas, induzindo baixa paras itemia e aus ncia de mortalidade. Ce rtas linhagens de camundongos s o re sis te nte s infe co enquanto outras so altame nte s uscetve is e morre m durante ou logo aps a fase aguda (Andrade et al., 1985; S ilva et al., 1992). A resposta imune protetora e/ou auto-imunidade desenvolvida durante a infeco pelo T. cruzi e o tipo de clula T auxiliar (Th) a ser expandido so certamente influenciados pelas citocinas presentes no ambiente durante o processo de diferenciao celular. Citocinas como IFN-, IL-4, IL-10 e IL-12, IL-13, IL-14 e IL-18 podem dirigir a diferenciao de subpopulaes de clulas T com conseqente ativao preferencial de linfcitos Th1 ou Th2. Estas subpopulaes de clulas T foram definidas com base em seu padro de secreo de citocinas (M osmann et al., 1986), assunto recentemente revisto por M osmann & Sad (1996). Com o desenvolvimento do padro de resposta Th1 h um predomnio da secreo de IL-2 e IFN-, induzindo preferencialmente ativao de macrfagos e resposta mediada por clulas (Cher & Mosmann, 1987; S tout & Bottomly, 1989), enquanto o desenvolvimento de Th2 leva sntese preferencial de IL-4, IL-5 e IL-10 favorecendo a resposta mediada por anticorpos (Coffmann et al., 1988). IFN- inibe a proliferao de clulas Th2 (Gajewski & Fitch, 1988) e IL-4 inibe a expresso de receptores de IL-2 e produo de IFN- (Peleman et al., 1989; Martinez et al., 1990). Por sua vez, IL-10 inibe a sntese de citocinas por Th1 (Fiorentino et al., 1989). O balano entre estas citocinas determina o padro de resposta celular a ser gerada, ditando as classes de anticorpos a serem produzidas e a resposta eferente a ser desenvolvida.
4.4. 1 O Papel de IFN-

O IFN- uma das citocinas mais estreitamente implicadas na resistncia infeco pelo T. cruzi e desempenha papel central em induzir a ativao de macrfagos e a inibio da replicao intracelular dos parasitas (Nogueira & Cohn, 1978; Silva et al., 1991; Gazzinelli et al., 1992), e quando administrado in
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vivo em camundongos aumenta a resistncia infeco, levando diminuio de parasitemia e ao aumento da sobrevida (Reed, 1988). A importncia de IFN- no controle da infeco por T. cruzi foi definitivamente estabelecida por experimentos nos quais a neutralizao por meio de tratamento in vivo com anticorpos monoclonais (Cardillo et al., 1996) ou a deleo gnica (Martins et al., 1999) de IFN- aumentou drasticamente a susceptibilidade infeco. Resultados obtidos mais recentemente em nosso laboratrio demonstram que alm de ser necessrio para a eliminao dos parasitas, atravs da induo da produo de xido ntrico (NO), o IFN- participa ainda da modulao da expresso das molculas Fas e Fas-L, expressas em nveis significativamente elevados nas clulas esplnicas aps a infeco. Em seguida, baseados em uma srie de experimentos realizados com animais geneticamente deficientes de IFN-, sugerimos que essa citocina est indiretamente implicada no controle da resposta imune, atravs da induo de NO e expresso de Fas e Fas-L e, conseqente induo de apoptose nos linfcitos dos animais na fase aguda da infeco com T. cruzi (Martins et al., 1999). Contudo, experimentos recentes mostraram que camundongos resistentes e susce ptveis secretam quantidades semelhantes de IFN- quando infectados por T. cruzi . Esse achado sugere que outras citocinas secretadas durante a infeco poderiam inibir os efeitos de IFN-.
4.4.2 O Papel de TGF- e IL-1 0

Citocinas que sabidamente inibem os efeitos de IFN- em macrfagos so TGF- e IL-10 (Ding et al., 1990). Investigando a possibilidade dessas citocinas participarem do controle da resposta ao T. cruzi , mostramos a presena de TGF- biologicamente ativo e de IL-10 em sobrenadantes de esplencitos de animais infectados. A presena de tais citocinas coincidiu com o aumento da produo de IFN- e com o incio do aparecimento de parasitemia patente nos animais. Experimentos in vitro mostraram que tanto TGF- como IL-10 so capazes de inibir o efeito tripanocida de macrfagos ativados por IFN- (Silva et al., 1991, 1992). Adicionalmente, conclumos que TGF- e IL-10 atuam in vivo durante a infeco com T. cruzi , pois o tratamento dos animais infectadoscom TGF- recombinanteou com anticorpo anti IL-10 resultou em aumento ediminuio deparasitemia e mortalidade, respectivamente (S ilva et al., 1991; Reed et al., 1994). Por outro lado, o tratamento com anticorpo anti IFN- determinou aumento da mensagem para IL-10, sugerindo que a produo de IL-10 e de IFN- em camundongos infectados regulada por um mecanismo de fe e d-back negativo (Reed et al., 1994). Uma srie de experimentos foi realizada com o intuito de determinar a cintica de produo e o papel das citocinas sintetizadas logo aps o primeiro contato dos parasitas com as clulas-alvos. Os resultados demonstraram que o tratamento com anticorpo anti IFN- foi mais eficaz em determinar o aumento de parasitemia quando realizado mais prximo do dia de infeco dos animais. O inculo de anticorpo anti IFN- no 11o dia aps infeco, ou mais tarde, foi completamente ineficaz em determinar o aumento de parasitemia ou mortalidade dos animais. Isto , neste perodo ainda que produzido em grande quantidade, IFN- j no mais efetivo em controlar a infeco, possivelmente pela presena de TGF- e IL-10. Com o objetivo de entender a regulao da resposta anti T. cruzi logo no incio da infeco, incubamos esplencitos normais com tripomastigotas vivos e verificamos que animais resistentes e susceptveis produziram quantidades similares de IFN-. Entretanto, animais resistentes produziram quantidades significativamente menores de IL-10 que os susceptveis. Este dado sugere que a susceptibilidade pode estar relacionada maior produo de IL-10. Investigamos em seguida quais clulas envolvidas na resposta imune inata eram responsveis pela produo de IFN-. Verificamos que tripomastigotas vivos foram capazes de induzir a produo de IFN- tanto em clulas esplnicas de camundongos eutmicos como de atmicos, o que demonstrou que a produo de IFN- independente de clulasT. Como a depleo de clulas NK bloqueou a produo de IFN-, sugerimos que estas seriam as principais responsveis pela produo desta citocina aps o estmulo inicial com T. cruzi ,
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num perodo da infeco no qual ainda no h resposta imune especfica. Nestes experimentos mostramos tambm que sobrenadantes de esplencitos aderentes cultivados com T. cruzi foram capazes de induzir a produo de IFN- por esplencitos normais, sugerindo que as clulas produtoras desta citocina no necessitam contato direto com o parasita, mas sim com algum fator presente no sobrenadante, o qual produzido aps a interao macrfagos-tripomastigotas (Cardillo et al., 1996). Em seguida, mostramos que macrfagos cultivados com tripomastigotas vivos, mas no epimastigotas ou parasitas mortos, secretam IL-12, que por sua vez foi capaz de induzir a produo de IFN- por esplencitos normais. Nesses ensaios, a adio de anticorpo monoclonal neutralizante anti IL-12 aos sobrenadantes bloqueou completamente a capacidade de induzir a sntese de IFN-. O papel da IL-12 durante o curso da infeco in vivo, foi melhor entendido quando camundongos infectados e tratados com anticorpo anti IL-12 apresentaram aumento de parasitemia e mortalidade. Estes resultados levaram-nos a sugerir que IL-12, produzida por macrfagos quando da interao com T. cruzi, participa conferindo resistncia ao hospedeiro, levando a uma diminuio da parasitemia e mortalidade durante a fase aguda da infeco por T. cruzi (Aliberti et al., 1996). De fato, o tratamento com IL-12 recombinante levou a uma diminuio da parasitemia dos animais (Hunter & Araujo, 1996).
4.4.3 A Participao das Quimiocinas

Quimiocinas so mediadores inflamatrios amplamente implicados na modulao dos fenmenos que levam ao acmulo de populaes especficas de leuccitos em processos inflamatrios agudos e crnicos em uma srie de doenas. Em termos gerais, as quimiocinas podem ser liberadas por diferentes tipos celulares depois da ativao e desempenham atividade quimiottica potente tanto in vivo como in vitro. Alm da grande implicao na migrao dos leuccitos, as quimiocinas podem participar, ainda, de outros eventos extremamente importantes para o estabelecimento da resposta imune, como proliferao de linfcitos T e diferenciao dos padres Th1 e Th2, entre outros. Estudando a possvel participao das quimiocinas na resposta imune contra o T. cruzi , experimentos realizados em nosso laboratrio demonstraram que macrfagos inflamatrios obtidos da cavidade peritoneal de camundongos produzem as -quimiocinas JE/MCP-1, MIP-, MIP- e RANTES quando cultivados in vitro com tripomastigotas vivos de T. cruzi . Adicionalmente, essas quimiocinas foram diretamentes implicadas na induo da produo de NO e inibio do crescimento dos parasitas nesse sistema (Aliberti et al., 1999). Em concordncia com esses resultados, Villalta et al. (1998) demonstraram que tambm em macrfagoshumanos, a atividadetripanocida via produo deNO podeser induzidain vitro pelasquimiocinas RANTES, MIP- e MIP-, sugerindo portanto que as quimiocinas devem estar amplamente implicadas na resposta imune contra o T. cruzi . Nesse contexto, cabe ressaltar que a produo dessas quimiocinas poderia estar envolvida tambm nos mecanismos mediadores de processos patolgicos agudos e crnicos como a ocorrncia de miocardite freqentemente observada aps a infeco com T. cruzi .
4.4.4 O Papel do xido Ntrico e TNF-

A atividade tripanocida dos macrfagos ativados foi inicialmente atribuida ge rao de pe rxido de hidrognio (Nogueira & Cohn, 1978; Reed e t al., 1987). Entretanto, a quantidade de perxido de hidrognio liberada por macrfagos durante a infe co de camundongos s usceptveis pode s er mais alta que a observada em animais re sis te nte s(Russo e t al., 1989) e tratame ntoscapazes de exaurir ou eliminar os metablitos do burs t res piratrio de macrfagos ativados no inibiram a atividade tripanocida destas c lulas . Mesmo macrfagos incapaze s de ativar o burs t res pirat57
rio matam paras itas intracelulares com a mes ma eficincia que macrfagos normais (Gazzinelli et al., 1992). Ess es dados s uge riram que a atividade tripanocida de macrfagos indepe ndente da gerao de perxido de hidrog nio. Adicionalmente, as citocinas que facilitam a replicao dos parasitas (IL-10 e TGF-) tamb m inibem a induo da enzima xido ntrico s intase (NOS i). Ao contrrio, IFN- tem atividade tripanocida e ativa a NOS i. Realmente, o bloqueio des sa enzima por inibidores e spe cficos abole completame nte a atividade tripanocida de macrfagos ativados, de monstrando que o NO e fe tivame nte controla a replicao intrace lular do T. cruzi (Ve spa et al., 1994). Resultados obtidos em nosso laboratrio demonstraram que clulas esplnicas de camundongos na fase aguda da infeco secretam altas quantidades de NO, sendo essa produo mais rpida nos animais resistentes. Camundongos infectados e tratados com inibidores da NOSi tornam-se mais susceptveis infeco, apresentando maiores parasitemias e mortalidade, sugerindo que o NO tambm importante para controlar a replicao dos parasitas in vivo. De fato, tripomastigotas so altamente susceptveis morte induzida por NO, visto que quando incubados com uma droga doadora de NO como SNAP (S-nitrosoacetil-penicilamina), mas no com seu anlogo penicilamina, morrem de maneira, dose e tempo dependente. Assim, sugerimosque formasamastigotasou tripomastigotasdeT. cruzi so mortasno interior demacrfagos por um mecanismo dependente de NO (Vespa et al., 1994). Em outros experimentos avaliamos o papel de TNF- em induzir a produo de NO em clulas isoladas ou em animais infectados. Verificamos que a adio de TNF- sobre macrfagos infectados, tratados ou no com IFN- no induziu qualquer atividade tripanocida, nem potenciou o efeito de IFN- . Contudo, a adio de anticorpo anti TNF- s culturas de macrfagos infectados e estimulados com IFN- promoveu uma diminuio significante da produo de NO e um aumento da replicao dos parasitas intracelulares. Verificamos, ainda, que TNF- produzido por macrfagos na presena de tripomastigotas vivos e que a adio de IFN- exgeno potenciou essa produo em pelo menos dez vezes. Esses resultados permitiram sugerir que tripomastigotas de T. cruzi induzem liberao de TNF- por macrfagos que, na presena de IFN-, atuam de maneira autcrina, promovendo a produo de NO. Desta forma, juntos IFN- e TNF- desempenham importante papel no controle da quantidade de parasitas circulantes em animais infectados por T. cruzi . Alm de IFN- e TNF-, a produo de NO pelos macrfagos infectados com T. cruzi pode ser modulada tambm pelo fator ativador de plaquetas ou PAF (do ingls plate le t-activating factor), como demonstrado por experimentos realizados recentemente em nosso laboratrio. Os resultados desses experimentos indicam que a atividade indutora de produo de NO exercida por PAF nos macrfagos infectados in vitro tambm dependente de TNF-, ilustrando assim a importncia de TNF- na induo dos mecanismos tripanocidas. Com efeito, o tratamento de camundongos infectados com anticorpo anti TNF- provoca aumento de parasitemia e mortalidade e conseqente diminuio da produo de NO, confirmando os resultados obtidos in vitro (S ilva et al., 1995).
4.4.5 xido Ntrico e Hiporresponsividade

Apesar da importncia do NO como mecanismo microbicida na fase aguda da infeco experimental com T. cruzi ser patente, tem sido demonstrado que o NO tambm induz imunossupresso nessa fase da infeco (Abrahamsohn & Coffmann, 1995). De fato, tratamentos in vivo que levam diminuio da produo de NO, como os tratamentos com os anticorpos monoclonais anti TNF- ou anti IFN- ou com o inibidor da enzima NOS i, foram capazes de restaurar, ao menos parcialmente, a resposta proliferativa de clulas esplnicas de animais infectados ante a mitgenos. Ainda esses tratamentos promoveram aumento da viabilidade celular observada nestas clulas aps cultura por 24 horas (Martins et al., 1998). O efeito imunossupressor do NO foi anteriormente demonstrado em outras infeces causadas por protozorios como T. bruce i (S ternberg & McGuidan, 1992; S chleifer & Mansfield, 1993), Toxoplas ma gondii (Candolfi et al., 1995), e Plas modium vinke i (Rockett et al., 1994), ou por bactrias, como Lis te ria monocytoge ne s(Gregory et al., 1993). Nessasinfeces, a resposta proliferativa pode ser parcial ou totalmente restaurada pelo tratamento in vivo ou in vitro com inibidores da NOS i.
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Os mecanismos pelos quais o NO exerce funo imunossupressora ainda no so claros, entretanto, foi demonstrado que o NO pode inibir a apresentao de antgenos por macrfagos regulando negativamente a expresso de molculas do complexo principal de histocompatibilidade (Sicher et al., 1994). Adicionalmente, alguns trabalhos demonstram que o NO pode alterar o funcionamento de complexos enzimticos imprescindveis para o metabolismo celular (Granger & Lehninger, 1982; Kilbourn et al., 1984), inibir a duplicao de DNA (Lepoivre et al., 1990) ou causar danos diretos no DNA (Nguyen et al., 1992) sugerindo que o NO no s pode inibir a replicao mas tambm pode induzir a morte celular. De fato, o NO tem sido identificado como indutor de apoptose em macrfagos ativados in vitro com LPS e IFN- (Albina et al., 1993; Sarih et al., 1993), em clulas tumorais (Granger & Lehninger, 1982), clulas das ilhotas pancreticas (Kaneto et al., 1995), timcitos (Fehsel et al., 1995) e em clones de clulas T antgeno-especficas (Stefani et al., 1994), entre outros. Por outro lado, o NO tambm pode bloquear a induo de apoptose em determinadas circunstncias. Resultados obtidos em nosso laboratrio tm demonstrado que em animais agudamente infectados pelo T. cruzi , um dos possveis mecanismos pelo qual o NO poderia participar mediando imunossupresso seria atravs da induo de apoptose. Inicialmente demonstramos que durante a fase aguda da infeco por T. cruzi h um aumento da porcentagem de clulas em apoptose no bao dos animais infectados por T. cruzi . Nesses animais os maiores ndices de apoptose foram encontrados justamente quando os ndices parasi tmicos e de produo de N O estavam elevados. Esses primeiros achados possi bilitaram a formulao da hiptese de que o NO produzido em ndices elevados durante a fase aguda da infeco experimental por T. cruzi poderia participar na modulao da induo de apoptose. Tal possibilidade foi posteriormente confirmada quando experimentos in vitro demonstraram que, aps 48 horas de cultivo, a porcentagem de apoptose em esplencitos obtidos de animais agudamente infectados por T. cruzi poderia ser reduzida se fossem adicionados s culturas inibidores da enzima NOSi ou anticorpos monoclonais anti TN F- ou anti I FN - . Quando os animais infectados receberam esses mesmos tratamentos in vivo, a porcentagem de apoptose nas clulas esplnicas foi menor que a dos controles infectados e tratados com salina ou anticorpo controle (M artins et al. 1998). Em conjunto, os resultados apresentados (ver sumrio na Figura 3.), alm de demonstrarem o papel fundamental de citocinas na induo dos mecanismos efetores da morte dos parasitas, tambm documentam a importncia desses mediadores na regulao de tais mecanismos. Nossos resultados comprovam a importncia do NO como agente tripanocida e simultaneamente sugerem um mecanismo pelo qual o NO participaria na induo de imunossupresso durante a fase aguda da infeco experimental pelo T. cruzi . Tais achados contribuem para um melhor entendimento da relao hospedeiro-parasita na infeco por T. cruzi e podem abrir perspectivas para futuras intervenes imunoterpicas em pacientes chagsicos.
Th0 NK
IFN- IFN-
IL-10 IL-4
IFN-
Th2
Th1 IFN- TNF- IL-12 IL-10 TGF- T. cruzi TNF- TGF-

IFN-
IL-10
IL-4 IL-5 IL-10 IL-13
MO
NO
Apoptose Imunossupresso
Figura3 Principaisinteraesdecitocinase clulasquepodem resultar em modulao da res pos taimuneem camundongosinfectados com Trypanos oma cruzi . Mf: macrfagos, NK: clulas natural killer, NO: xido ntrico, Th: clulasT auxiliar. S etascontnuasindicam ativao esetasinterrompidasindicam inibio. Ver explicaesno texto.
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4.5
O Timo como rgo-alvo na Infeco pelo Trypanosoma cruzi

Vincius Cotta-de-Almeida & Wilson Savino
O sistema imunolgico determinante na resistncia antiparasitria durante o curso da infeco pelo Trypanos oma cruzi (Tarleton, 1991, 1995). Isto pode ser verificado quando camundongos atmicos so infectados pelo T. cruzi (Gonalves-da-Costa et al., 1984), bem como aps depleo especfica de linfcitos T CD4+ (Minoprio et al., 1987; Russo et al., 1988) ou de CD8+ (Tarleton, 1990). Nesses animais ocorre aumento de parasitemia, concomitante a um alto grau de parasitismo tecidual, com uma diminuio no infiltrado inflamatrio intracardaco, demonstrando assim, que ambas as subpopulaes CD4 e CD8 parecem ser relevantes no controle da infeco (Tarleton, 1991, 1995). Paralelamente, diversas alteraes no ramo celular da resposta imunolgica celular podem ocorrer como, por exemplo, uma ativao policlonal macia concomitante a uma imunossupresso (revisado em M inoprio et al., 1989). Destaca-se ainda uma diminuio na produo de IL-2 (H arel-Bellan et al., 1983; Nabors & Tarleton, 1991), reduo na expresso de molculas de superfcie de linfcitos T (Kierszenbaum et al., 1989) e presena importante de apoptose de linfcitos T (Lopes et al., 1995). Outro ponto relevante refere-se presena de um componente auto-imune na miocardite da fase crnica da doena (Takle & Hudson, 1988; Cunha-Neto et al., 1995). Nesse fenmeno, foi sugerida a participao de linfcitos T, aps estudo em camundongos, mostrando que as clulas T CD4+ so responsveis pela efetuao de uma resposta auto-imune antimsculo cardaco que ocorre em animais cronicamente infectados (Ribeiro-dos-Santos et al., 1992). Entretanto, a demonstrao de que clulas CD8+ predominam em stios inflamatrios no corao de pacientes chagsicos (D Avila Reis et al., 1993a) sugere uma participao dessas clulas na leso cardaca da fase crnica. Esses distrbios na imunidade celular nos levam a imaginar um possvel comprometimento tambm na gerao de clulas T. De fato, a influncia do timo no curso da infeco pelo T. cruzi pode ser evidenciada pela noo de que a infeco em animais timectomizados (Schmunis et al., 1971) ou em camundongos atmicos (Kierszenbaum & Pienkowski, 1979; Gonalves-da-Costa et al., 1984), apresenta-se com um grau maior de severidade, com os animais apresentando parasitemia e mortalidade mais altas. importante ressaltar que a timectomia em animais adultos, seguida de infeco pelo T. cruzi , determina nestes animais reduo na resposta policlonal de linfcitos B, e que pode ser evidenciada diminuio no nmero de clulas secretoras de Ig, principalmente em relao aos isotipos de IgG (Minoprio et al., 1989). Alm disso, a deteco de formas amastigotas no timo (Savino et al., 1989) demonstra como este rgo pode ser diretamente afetado na infeco pelo T. cruzi . Antes de descrevermos as diversas alteraes que ocorrem no timo aps a infeco pelo T. cruzi , importante ressaltar alguns aspectos da fisiologia deste rgo.
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4.5. 1 O Timo e a Diferenciao de Clulas T

O timo um rgo linfide primrio onde clulas precursoras dos linfcitos T se diferenciam e aqueles selecionados para sobreviver, ao terminar o processo de maturao, deixam o rgo e vo se localizar nas regies timo-dependentes dos rgos linfides perifricos. Esse processo ocorre em ntimo contato com o microambiente tmico, uma rede tridimensional formada essencialmente por clulas epiteliais, clulas dendrticas, macrfagos e elementos da matriz extracelular (ver revises de Boyd et al., 1993; S avino et al., 1993; Anderson e t al., 1996). As clulas epiteliais tmicas (TEC) formam o principal componente celular do microambiente tmico e apresentam significante heterogeneidade morfolgica e fenotpica (Boyd et al., 1993). As TEC so capazes de produzir diversas citocinas que esto envolvidas na proliferao e diferenciao de timcitos (ver reviso de Carding et al., 1991). Alm disso, uma caracterstica fundamental das TEC a expresso de molculas de classe I e classe II do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), capazes de apresentar peptdeos ao receptor clonal de clulas T (TCR) expresso pelos timcitos, com a participao, respectivamente, dos coreceptores CD8 e CD4, tambm expressos na superfcie dos timcitos. Dentre as TEC, importante destacar um grupo de clulas que apresenta um certo grau de organizao celular e possveis funes especficas, os complexos linfo-epiteliais denominados de clulas nurs e do timo (TNC). Estes complexos, compostos de uma clula epitelial envolvendo de dois a duzentos timcitos, obtidos a partir de digesto enzimtica de fragmentos de timo, foram primeiramente descritos por Wekerle & Ketelsen (1980). Eles parecem ser relevantes no processo de diferenciao, provavelmente participando em eventos de seleo positiva e negativa de timcitos (Kyewski, 1986; Aguilar et al., 1994). Os complexos TNC tm provvel localizao na regio cortical tmica (Kyewski & Kaplan, 1982; Houben-Defresne et al.,1982; van de Wijngaert et al., 1984; van Vliet et al., 1984; Andrews & Boyd, 1985), e os timcitos intra TNC (TNC-T) apresentam caractersticas fenotpicas e funcionais de clulas imaturas (Kyewski & Kaplan, 1982; van Vliet et al., 1984; de Waal Malefijt et al., 1986; Leene et al., 1988; Li et al., 1992; Philp et al., 1993). Entre tanto, ensaio em membrana crio-alantica, onde TNCs de galinha so depositadas e TNC-T interagem com molculas de MHC classe II expressas nessa membrana, demonstrou freqncia alta de TNC-T com capacidade alo-reativa e autoreativa (Wick & Oberhuber, 1986; Wick et al., 1991; Penninger & Wick, 1992). Alm disso, as TNCs secretam hormnios tmicos e citocinas, expressam protenas de MHC classe I e classe II, produzem protenas de matriz extracelular e ainda apresentam junes comunicantes (ver reviso Villa-Verde et al., 1995). no contexto deste microambiente de TEC, macrfagos e clulas dendrticas, e de matriz extracelular, que ocorre um intenso processo de migrao, concomitante a um vasto corpo de interaes celulares e moleculares desde a chegada de precursores at a sada de linfcitos T imunocompetentes do timo. Durante a diferenciao, as clulas precursoras passam por diversos estgios de maturao, caracterizados, em parte, pela expres so diferencial de algumas molculas de superfcie (para reviso, ver Fowlkes & Pardoll, 1989; Godfrey & Zlotnik, 1993). As primeiras clulas linfides a colonizarem o timo, os pr-timcitos, foram identificados em camundongos como precursores, expressando baixas quantidades de CD4 (CD4lo), sendo negativos para CD8 e CD3 (Wu et al., 1991), mas positivos para CD44. Em seguida estas clulas comeam a expressar CD24 e CD90 (Thy-1) em nveis mais altos, perdem a molcula CD4, e passam a expressar tambm CD25, resultando na subpopulao de timcitos CD4-CD8-TCR-, referidos como triplo-negativos. Neste estgio as clulas passam a estar comprometidas com a linhagem de clulas T (Godfrey & Zlotnik, 1993), sendo precursoras das outras subpopulaes timocitrias: os timcitos duplo-negativos, os timcitos imaturos corticais CD4+CD8+, ditos duplo-positivos, e os simples-positivos CD4+CD8- e CD4-CD8+, considerados maduros (Figura 4) e que migraro para a periferia (revisado em Fowlkes & Pardoll, 1989; Godfrey & Zlotnik, 1993; Anderson et al., 1996).
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Figura 4 Diferenciao intratmicadelinfcitosT. Adaptado apartir deOliveira-Dos-S antos(1997) eGodfrey & Zlotnik (1993)
Dentre essas subpopulaes, importante destacar os timcitos duplo-positivos TCRlo, que correspondem subpopulao tmica mais freqente e que, com a expresso do TCR/CD3, representam tambm o estgio no qual ocorre o principal evento da maturao timocitria, o fenmeno de seleo intratmica. Este fenmeno define quais dos inmeros receptores gerados no processo de rearranjo do TCR daro origem ao repertrio de clulas T maduras que povoar a periferia (S prent et al., 1988). Dois so os processos envolvidos naquele fenmeno, a s e le o pos itiva (Bevan, 1977) e a s e le o ne gativa (Kappler et al., 1987). A seleo negativa tem como efeito a eliminao ou inativao de clones de timcitos com potencial auto-reativo, e a seleo positiva tem como efeito duplo permitir que as clulas progridam para a maturao (ao invs de morrerem) e definir o caminho de maturao. Essa definio se d como conseqncia do reconhecimento pelos timcitos de complexos peptdeo-MHC apresentados por clulas do microambiente tmico (fenmeno de restrio ao MHC). Assim, paralelamente ao aumento da expresso deTCR/CD3 (Bonifacino et al., 1990), dependendo da interao com molculas do MHC, apenas uma das molculas acessrias, CD4 ou CD8, permanecer (Guidos et al., 1990). Desse modo, se um linfcito T, durante o processo de desenvolvimento, reconhecer um peptdeo em associao com a molcula de MHC de classe II, ser uma clula simples-positiva CD4 que no expressa CD8 e, reciprocamente, se a especificidade da clula T for dirigida a um peptdeo complexado ao MHC de classe I, expressar apenas CD8 (von Boehmer & Kisielow, 1993; von Boehmer et al., 1993). Essas subpopulaes de clulas CD4 e CD8 agora maduras, localizadas na regio medular dos lbulos tmicos, emigraro do rgo indo povoar as reas T-dependentes dos rgos linfides perifricos (ver esquema da Figura 4).
4.5.2 Alteraes no Compartimento Linf ide aps Infeco pelo T. cruzi

A atrofia uma das principais caractersticas relacionadas ao timo em condies de imunodeficincia, estando entre elas diversas doenas infecciosas (revisado em Savino, 1990; Savino et al., 1992). Uma das caractersticas observadas na fase aguda da infeco pelo T. cruzi em murinos uma atrofia tmica
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progressiva, com perda de massa e celularidade do rgo (Savino et al., 1989; Leite-de-M oraes et al., 1991). A severa diminuio na celularidade tmica se reflete, principalmente, na diminuio de clulas imaturas de fentipo CD4+CD8+ (duplo-positivas). Nesse contexto, verificou-se em paralelo um aumento na freqncia de clulas simples-positivas CD 4+CD8- e CD4-CD8+ e duplo negativas CD 4CD8-. Alm disso, a deteco de aumento na freqncia de clulas CD3hi corroboram a noo de que as clulas resi stentes so, em sua mai or parte, do tipo medular (Lei te-de-M oraes et al., 1991). H istologicamente destaca-se uma reduo na regio cortical e at mesmo desaparecimento quando a atrofia bastante intensa. Outro aspecto marcante a presena de muitos ncleos picnticos de timcitos na regio cortical remanescente. Como estas alteraes se assemelham quelas vistas em animais injetados com hidrocortisona, e como detectou-se no soro de animais infectados em fase aguda nveis trs vezes aumentados de glicorticides circulantes, as mesmas anlises foram feitas em animais adrenalectomizados e infectados. Estas anlises mostraram que o padro das alteraes se manteve semelhante quelas descritas em animais intactos (Leite-de-Moraes et al., 1991). Outro importante achado foi a demonstrao de que toda esta modulao nas subpopulaes de timcitos parece ser transitria, tendo em vista que as subpopulaes de timcitos, definidos pela expresso de CD3, CD4 e CD8, retornam aos valores normais quando se analisa o timo de animais infectados na fase crnica da doena (Leite-de-Moraes et al., 1992). Nesse sentido, cabe frisar que ao final da fase aguda da doena expe rimental em camundongos isognicos da linhagem C3H/HeJ, detectamos um aumento de clulas CD25+ e clulas em ciclo, que podem corresponder a timcitos em fases iniciais de diferenciao (Leite-de-Moraes et al., 1992). M ais recentemente, a anlise do repertrio de timcitos de animais infectados revelou um aumento na porcentagem de clulas CD4-CD 8+Vb5+ e CD4-CD 8+Vb14+, e apenas um ligeiro aumento na porcentagem de clulas CD 4+CD 8- Vb5+ e CD4+CD8-Vb14+ (Leite-de-M oraes, 1993). Estas alteraes ao nvel do repertrio devem ser analisadas luz da presena de antgenos parasitrios no timo, visto que recentemente foi demonstrada atividade do tipo superantignica associada ao T. cruzi (Leite-de-Moraes, 1993), que pode ser detectado parasitando o parnquima tmico (S avino et al., 1989; Gonalves-da-Costa et al., 1991). A anlise funcional dos timcitos no curso da fase aguda da infeco experimental demonstrou, ainda, reduzida resposta proliferativa concanavalina A (Con A) e ao anticorpo anti CD3 (Leite-de-Moraes et al., 1994). Demonstrou-se, tambm, aumento na atividade citotxica inespecfica destes timcitos. Estas alteraes podem ser explicadas pela modulao na produo de citocinas por timcitos de animais infectados em fase aguda. Assim, a resposta proliferativa diminuda se deve, provavelmente, insuficiente produo de IL-2, visto que a adio deste fator restaura a atividade proliferativa. Esta insuficincia na produo de IL-2, por sua vez, se deve, provavelmente, aos nveis aumentados na produo de IFN-e IL-10, j que a resposta proliferativa Con A e a produo de IL-2 so recuperadas ao se utilizar anticorpos contra estas duas citocinas. Por outro lado, a atividade citotxica inespecfica exacerbada se deve, provavelmente, aos nveis aumentados na produo de IL-4, IL-5 e IL-6 pelos timcitos dos animais infectados (Leite-de-Moraes et al., 1994).
4.5.3 Alteraes Fenotpicas e Funcionais na Rede Epitelial Tmica

Em paralelo s alteraes fenotpicas e funcionais de timcitos na fase aguda da infeco experimental pelo T. cruzi , demonstrou-se que o microambiente tmico tambm est modificado. Nos animais infectados apresentando atrofia tmica, observou-se um processo de densificao da rede epitelial do rgo. Um estudo mais detalhado desta rede foi realizado atravs de anlise imunohistoqumica utilizando-se um painel de anticorpos dirigidos contra diferentes protenas da famlia de citoqueratinas. Assim, clulas reconhecidas pelo anticorpo monoclonal (mAb) ER-TR.5, que em timos normais esto presentes exclusivamente na medula, passam a ser encontradas tambm no crtex subcapsular e interno. Alm disso, clulas CK8/18+, normalmente restritas regio cortical, passam a ser detectadas tambm na medula tmica (S avino et al., 1989).
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Um dado bastante relevante para a anlise da patologia tmica na doena de Chagas a observao de uma expresso maior de antgenos de classe II do MHC concomitante atrofia que ocorre no timo de animais infectados (S avino et al., 1989). Este efeito seria, possivelmente, secundrio ao processo de densificao da rede epitelial, mas talvez tambm decorra de induo por IFN-, cujos nveis intratmicos esto bastante elevados na fase aguda da doena (Leite-de-Moraes et al., 1994). Por outro lado, a anlise da produo do hormnio tmico timulina mostrou pequena reduo nos nveis sricos e no nmero de clulas timulina-positivas (Savino et al., 1989). Outra importante obs ervao corres ponde ao aume nto progre ssivo na re de intralobular de prote nas de me mbrana basal fibronectina, do colgeno IV e do antgeno reconhe cido pe lo mAb ER-TR.7 (S avino et al., 1989).
4.5.4 Distrbios nas Interaes Timcitos/Microambiente

As alte rae s, tanto no compartimento linfide como no microambiente tmico, nos le varam a inves tigar poss ve is alteraes das interaes fisiolgicas que aconte cem e ntre timcitos/microambiente, no curs o da infeco pe lo T. cruzi . Ass im, rece nteme nte , estudando os comple xos nurs e do timo, ve rificamos uma diminuio no nme ro des te s, be m como alterae s no tamanho, granularidade, e divers os danos e m nve l ultra-es trutural (Cotta-de-Almeida et al., 1997). Obs ervamos tamb m aumento na fre q ncia de timcitos mortos no inte rior des se s comple xos nurs e , bem como aumento na e xpress o de protenas de matriz extrace lular, com aumento concomitante na liberao de timcitos dos comple xos isolados de animais infectados (Cotta-de-Alme ida e t al., 1997). Estes dados devem ser analisados em conjunto com os dados recentes em que demonstramos que aps infeco aguda pelo T. cruzi h um aumento progressivo na expresso de ligantes de matriz extracelular, por exemplo fibronectina e laminina, bem como na expresso de respectivos receptores VLA-4/VLA-5 e VLA-6 (Cotta-de-Almeida, 1996). Interessante a observao de que o aumento pode ser percebido antes de haver uma clara atrofia do rgo. Definimos ainda, por citometria de fluxo, que a expresso de VLA-4 se mostrava aumentada j no 15o dia de infeco, porm de forma mais exuberante no 22o dia de infeco. A expresso de VLA-5 e VLA-6 mostrava discretas flutuaes nos dias analisados, com a subpopulao de clulas duplo-positivas sendo, provavelmente, o grupo-alvo do aumento observado na expresso das integrinas (Cotta-de-Almeida, 1996). Interessantemente, a infeco aguda pelo T. cruzi, alm de determinar alteraes na expresso de ligantes de matriz extracelular que possuem propriedades adesivas, provoca tambm importante modulao na expresso de tenascina, uma protena de matriz extracelular que apresenta propriedades imunorregulatrias, tendo sido descrita como uma protena de de-adeso (Chiquet-Ehrismann, 1995). Anlises imunocitoqumicas in s itu da expresso de tenascina no timo mostraram uma marcao essencialmente restrita medula do rgo, com o crtex expressando tenascina apenas no nvel da membrana basal de vasos sangneos e pouca ou nenhuma marcao na membrana basal subseptal e subcapsular. J no nono dia de infeco, os timos de animais infectados mostravam aumento de tenascina; progressivamente percebemos que a infeco induzia aparecimento de tenascina no crtex, bem como uma forte marcao na membrana basal de cpsula e septos (Cotta-de-Almeida, 1996). Alm disso, estudando funcionalmente in vitro a adeso de timcitos com clulas epiteliais tmicas, fenmeno este sabidamente mediado por ligantes e receptores de matriz extracelular, pudemos observar que, ao contrrio da expresso de ligantes e receptores de matriz extracelular, a adeso de timcitos obtidos de animais infectados se encontrava diminuda em relao aos timcitos de animais controles. Por outro lado, quando esses timcitos eram colocados sobre clulas epiteliais tmicas infectadas, observamos um bloqueio parcial na diminuio da adeso, o que ocorria em paralelo com um aumento de matriz extracelular nas culturas de clulas epiteliais tmicas infectadas (Cotta-de-Almeida, 1996). O conjunto de dados discutidos acima sugere que o
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processo de adeso/de-adeso/migrao intratmica de clulas T, sob influncia das alteraes na expresso de ligantes e receptores de matriz extracelular, esteja modificado no curso da infeco experimental pe lo T. cruzi , com provvel influncia no processo normal da diferenciao intratmica de clulas T. Nesse sentido, importante salientar dados recentes em que evidenciamos em linfonodos e bao de animais infectados a presena de nmero anormalmente alto de clulas duplo-positivas nesses rgos durante a infeco aguda. De fato, essas clulas tambm foram detectadas na fase crnica da infeco. Anlises por citometria de fluxo dos antgenos de membrana CD3 e CD24 (HSA), demonstraram um fentipo imaturo dessa populao de clulas duplo-positivas. Embora seja necessria a demonstrao inequvoca da origem tmica dessas clulas, esses resultados novamente apontam para a existncia de distrbios na migrao e, conseqentemente na diferenciao intratmica de clulas T durante a infeco pelo T. cruzi . Os achados de atrofia e depleo linfocitria, juntamente com as diversas alteraes no timo de animais infectados, e a deteco de formas amastigotas no parnquima tmico, parecem definir a existncia de uma verdadeira patologia tmica na infeco experimental pelo T. cruzi .
4.6
Imunomodulao da Resposta T-dependente na Doena de Chagas Experimental

Sylvio Celso G. da Costa, Katia S. Calabrese & Tania Zaverucha do Vale
4.6. 1 Inflamao e Resistncia da Antigidade aos Dias Atuais

O emprego de uma terapia de imunoestimulao visando aumentar a resistncia de um doente contra infeces e doenas parasitrias, ou controlar o desenvolvimento de um cncer, bastante sedutor. o futuro da medicina j conhecido h longo tempo. Assim, Chamfort relata em suas Mximas que os pacientes com paludismo encontravam-se relativamente protegidos contra a peste, fato este que j conhecido desde o s culo XVIII. Os egpcios j haviam constatado, empiricamente, que os doentes portadores de certos abcessos resistiam melhor que pessoas sadias a epidemias, conforme mencionado na histria clssica da imunoestimulao. Ao fim do s culo pas sado, Elie Metchnikoff, trabalhando no Instituto Pasteur, des cobriu a fagocitose . Ele es tava longe de imaginar que levaramos quase cem anos para compreender como os leuccitos passam pelo endotlio vascular para alcanar o local da inflamao (revisto por Girard & S pringer, 1995). O papel do endotlio no trfico de clulas entre o sangue e os tecidos comeou a ser esclarecido no incio dos anos 80, ficando pouco a pouco evidenciado o pape l das mol culas de adeso na tarefa de capturar c lulas circulante s nos vasos vizinhos de um foco inflamatrio. Este assunto de importncia para e xplicar a propagao de me ts tas escance rosas , onde clulas tumorais pode ms er de tectadas no s angue circulante , um ass unto j conhe cido h mais tempo, tendo o Dr. Pimenta de Me llo, do Instituto Os waldo Cruz, s ido um dos pione iros nes te as sunto (Pime nta de Mello, 1963). Molculas pre sentes nas
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clulas dos vasos e dos glbulos brancos so ativadas em determinados momentos do desenvolvimento do processo inflamatrio, envolvendo pares de molculas em misses especficas. Gallatin et al. (1983) evidenciaram a primeira destas molculas por meio de anticorpos monoclonais (M EL -14). Aps purificao, elas foram denominadas selectinas, cujo stio ativo, a lectina, se liga aos acares dos polimorfos nucleares e dos moncitos, que so as primeiras clulas atradas para o local da inflamao (Lasky et al., 1992; Baumhueter et al., 1993). Por outro lado, as molculas de adeso, situadas na superfcie dos leuccitos, do tipo integrinas (como a LFA-1), so ativadas por molculas quimiotticas como a PAF (plate le t activating fator), a IL-8 e outras que so produzidas pelo endotlio sob influncia de mediadores da inflamao (a trombina e a histamina). Essas molculas, aps serem secretadas nos vasos e antes de circularem, se associam a outras molculas da superfcie do endotlio, principalmente com a CD44 (Tanaka et al., 1993). Em uma fase subseqente, molculas como PECAM-1 (plate le te ndothe lial adhe s ion mole cule -1) ou CD31 participam da aproximao dos leuccitos e tambm da ativao das integrinas. Algumas molculas de adeso intervm apenas no sentido de retardar a locomoo dos leuccitos na circulao (Butcher, 1991; Lawrence & Springer, 1991). Fazendo uma anlise rpida dos modelos que descrevemos nos trabalhos, vamos ver que os imunomoduladores que empregamos esto em primeiro plano modulando a entrada de clulas no local da inflamao e, em uma segunda etapa, ativando-as. Uma vez ativadas, as integrinas mudam de forma e podem se ligar s molculas de adeso da superfcie endotelial como ICAM-1 (inte rce llular adhe s ion mol cule -1), VCAM-1 (vas cular ce ll adhe s ion mole cule -1) e CD31, que garantem uma forte adeso dos leuccitos ao endotlio. Estes estudos podero explicar porque, em casos de reativao da doena de Chagas, devido evoluo da sndrome de imunodeficincia adquirida (Aids), ocorre, preferencialmente, o comprometimento do sistema nervoso central, usualmente apresentando sintomas de meningoencefalite (Rocha et al., 1994). A reativao da doena de Chagas ocorre apenas em pacientes imunossuprimidos (Krettli, 1983), sendo ne stes casos muito freqente o comprometimento do sistema nervoso central. Este fato tem sido assinalado em casos de transplantes (Jost et al., 1977; Pizzi et al., 1982; Leiguarda et al., 1990), leucemias (Frana et al., 1969; Monteverde et al., 1976; Kohl et al., 1982; Corona et al., 1988), linfomas (Monteverde et al.,1976) e Aids (Meneses et al., 1992; Odd et al., 1992; Rosemberg et al., 1992). Em pacientes imunocomprome tidos, tm sido descritas leses pseudotumorais no sistema nervoso central devidas ao T. cruzi (Gluckstein et al., 1988, 1992; Del Castillo et al., 1990; Ferreira et al., 1991). De maneira semelhante, a ativao de tripanosomase, pela ao da cortisona em macacos rhesus com infeco por Trypanos oma vicke rs ae na ndia, mostrou alta incidncia de encefalomielite. Assim, poderamos perguntar quais fatores da resposta imunolgica estariam atuando, ou deixando de atuar, sobre a barreira hemato-enceflica favorecendo estas alteraes? Seria conseqncia da depleo das clulas CD4+ e dos fatores por elas induzidos que deixariam de atuar na regulao do endotlio vascular? Os estudos com pacientes aidticos so sugestivos. A alta taxa de destruio de clulas T CD4+ o principal fator que leva ao desencadeamento da patognese ligada ao HIV-1 (Ho et al., 1992). Entre vrios aspectos desta patognese, destacam-se problemas ligados ao parasitismo do sistema nervoso central, com leses envolvendo T. gondii e T. cruzi. Por outro lado, pacientes crnicos imunocomprometidos em conseqncia de imunoterapia supressora devido a um transplante cardaco apresentam leses cutneas nodulares (Jatene, 1987). Leses cutneas similares foram encontradas em camundongos atmicos (Calabrese & Gonalves da Costa, 1992), mostrando que o modelo murino importante neste aspecto. Quando estudamos na leishmaniose tegumentar o espectro das diferentes formas clnicas, o plo que aparece nos pacientes com leses localizadas e benignas, bem como o plo anrgico com formas difusas extremamente graves, podemos analisar este espectro pelo perfil imunolgico da pele.
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Seria interessante lembrar que a idia da existncia de uma imunidade rgo-especfica remonta ao incio do sculo, tendo sido este assunto levantado no Instituto Pasteur de Paris por Alexandre Bessedka, colaborador de Ilya Metchnikoff (Silverstein, 1989). Fichtelius et al. (1970) publicaram um artigo no qual chegaram a sugerir que a pele seria um rgo linfide de primeira linha, comparvel at com o timo. Esta concluso foi obtida com base nas estruturas linfoepiteliais que ocorrem na pele dos recm-nascidos e fetos humanos. Estes acmulos linfides podem reaparecer nos adultos, sendo ento diagnosticados como linfomas cutneos benignos. Esta proposta constitui a hiptese mais interessante para explicar a origem de certas doenas cutneas de proliferao linfide no maligna. Entretanto, o conceito que estabelece a pele como um rgo de primeiro nvel linfide no tem bases consistentes. O sistema imune cutneo (SIC) um complexo de clulas que interagem com a resposta imune, envolvendo um conjunto de fatores humorais que podem estar mais relacionados com a imunidade natural (queratincito, histicitos, moncitos, granulcitos e mastcitos) ou com a imunidade adquirida (clulas de Langerhans, clulas T e clulas endoteliais). O processo imunorregulador da pele tem sido descrito como composto de trs fases distintas (Nickoloff, 1988): recrutamento, reteno/proliferao, recirculao. A fase de recrutamento envolve o extravasamento de leuccitos atravs da estrutura vascular e o subseqente movimento destas clulas para a epiderme. As fases de reteno e de proliferao compreendem a interao entre as clulas de Langerhans, queratincitos, clulas T e citocinas, bem como a subseqente proliferao destas clulas T que induziro a formao do infiltrado inflamatrio que poder evoluir para um granuloma. Finalmente a fase de recirculao ativada aps a eliminao do componente de agresso da pele e envolve processos regulatrios cujos sinais so originados das clulas de Langerhans e dos queratincitos. As leses cutneas decorrentes da reativao do doena de Chagas em pacientes imunocomprometidos sugerem algumas questes.
Seriam conseqncia de uma colonizao latente da derme, resultado de um estado de imunidade

concomitante que foi reativada pelas alteraes dos mecanismos regulatrios do SIC? Seriam resultado de alteraes dos sistemas regulatrios das estruturas vasculares, que parecem ocorrer tambm no sistema nervoso central de pacientes chagsicos aidticos? Na leishmaniose tegumentar, os dois plos da doena apresentam alteraes marcantes tanto na derme quanto na epiderme: as formas localizadas apresentam na epiderme um nmero elevado de clulas de Langerhans e de queratincitos expressando ICAM e MHC, ao passo que na forma difusa os queratincitos no expressam ICAM ou MHC, ocorrendo um pequeno nmero de clulas de Langerhans. Observando-se a derme na leishmaniose cutnea, nota-se o acmulo de clulasT epidermotrpicas e uma resposta imunolgica do tipo Th1, enquanto na forma difusa a resposta do tipo Th2 (Tapia et al., 1994). No momento, desenvolvemos diferentes modelos experimentais, o que permite termos um espectro da doena de Chagas, cujas posies extremas so as seguintes:
plo constitudo pelos camundongos atmicos e que, por conseguinte, apresenta uma ausncia marcante
de resposta T-dependente e ausncia de miocardite; plo constitudo por camundongos resistentes pela imunopotenciao da resposta T-dependente especfica, com 100% de sobrevida infeco aguda e insignificante miocardite nesta fase. O estudo da imunologia rgo-especfica que estamos iniciando poder esclarecer muitos destes aspectos ainda obscuros da tripanosomase americana (Figura 5).
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Figura 5 Esquemamostrando acolonizao do sistemalinfidepelo Trypanos oma cruzi ea correlao entre ainvaso tissular e a reao inflamatriaem diferentesrgos, iniciando osprocessosimunopatolgicos.
Reao inflamatria
Imunopatologia e resistncia
4.6.2 A Infeco pelo T. cruzi na Ausncia de Reao Inflamatria

Camundongos atmicos OF1 (S wiss Websten, Albin) ou singnicos de linhagens sensveis, intermedirios e resistentes ao T. cruzi (Nude, C3H/He, Balb/C e C57BL/6, respectivamente) infectados com 104 tripomastigotas oriundos de culturas em clulas, ou tripomastigotas sangucolas, apresentam uma infeco com parasitemias elevadssimas, sem os perfis observados nos camundongos eutmicos. Apresentam, tambm, uma correspondente exarcebao da colonizao tissular, de carter sistmico. As cepas Y e CL, ditas polares do T. cruzi pela colonizao preferencial de clulas do sistema fagoctico mononuclear ou do msculo, respectivamente, quando inoculadas em camundongo Balb/C Nude apresentam o mesmo perfil, mostrando que a resposta T-dependente modula o chamado tropismo de cepas do T. cruzi (Gonalves da Costa et al., 1984, 1986). O estudo histopatolgico tem demonstrado que na ausncia da resposta T-dependente no ocorre nenhum infiltrado inflamatrio. A transferncia de clulas T de camundongos cronicamente infectados pelo T. cruzi , ou mesmo de camundongos normais, restaura o infiltrado inflamatrio, ocorrendo a destruio de pseudocistos quando transferimos clulas T de camundongo com trinta dias de infeco (Gonalves da Costa et al., 1984). Com o emprego de anticorpos monoclonais anti CD4+, ficou evidenciado que a depleo deste tipo celular favorece o aumento da parasitemia e a densidade das formas amastigotas nos tecidos, bem como a diminuio do infiltrado inflamatrio numa evidncia clara sobre o papel das clulas CD4+ na resistncia e na patologia da doena de Chagas experimental (Russo et al., 1988). Foi demonstrado que estas clulas so capazes de provocar a destruio de coraes singnicos de camundongos recm-nascidos
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transplantados para camundongos adultos (transplante inserido na orelha de camundongos adultos) (Mengel et al., 1988). Em recente publicao, Kierszenbaum (1995) pergunta: O que esto fazendo realmente as subpopulaes de clulas T na doena de Chagas? A complexidade da participao destas clulas reque r, evidentemente, muitos estudos. Tarleton (1995) sugere que as clulas T tm um papel regulador na replicao dos parasitas, no apenas no incio da fase aguda, mas tambm na fase crnica. Nos resultados obtidos por Tarleton et al. (1994), tanto a depleo de clulas CD8+ ou CD4+ em torno do 20o dia e dias subseqentes, resulta numa diminuio moderada da inflamao e no aumento da colonizao do corao quando avaliada no 30o dia da infeco. Recentemente foi demonstrado que a miocardite chagsica crnica dependente de subpopulaes CD8+. O nmero destas clulas aparece elevado nos pacientes portadores de leses contendo antgenos do T. cruzi , enquanto as clulas CD4+ permanecem baixas. Esta ltima observao refora a proposio de que ocorre uma imunodepresso seletiva na fase crnica da doena (Higuchi, 1996).
4.6.3 Imunomodulao Empregando a Frao de Flagelo Associada ao BCG

O emprego de fraes subcelulares como antgenos na tripanosomase americana determinou o desenvolvimento de mtodos especiais de fracionamento visando a pureza das preparaes contendo as organelas. Os trabalhos iniciais (Segura et al., 1974, 1977) no apresentavam grau de pureza aprecivel, o que constitua um obstculo srio para a anlise bioqumica e imunolgica dasfraes. Visando a obteno defrae ssubcelulares com um grau elevado de pureza, foram desenvolvidos alguns mtodos para obteno de fraes subcelulares de tripanosomatdeos (Pereira et al., 1978; Dwyer, 1980). Outras investigaes confirmaram que o fracionamento subcelular de tripanosomatdeos complexo e que diferentes fraes subcelulares no podem ser obtidas simultaneamente nem empregando um nico esquema de fracionamento (Piras et al., 1981). Fraes enriquecidas de flagelo de T. cruzi tm se mostrado como imungenos importantes, capazes de induzir resistncia e imunidade celular (Segura et al., 1977; Gonalves da Costa & Lagrange, 1981), mas apresentando uma estrutura complexa. Vrios trabalhos tm sido publicados sobre a biologia celular dos flagelos e sua caracterizao ultra-estrutural, onde se destaca a estrutura paraxial com vrios componentes macromoleculares (Cunha et al., 1984). No caso do T. bruce i causador da doena do sono e de um complexo de doenas de interesse veterinrio, em grande parte da frica esses estudos esto bem avanados, tendo sido determinada a principal protena da estrutura paraxial do flagelo e os genes que a codificam (Schlaeppi et al., 1989). A localizao e isolamento de imungenos do T. cruzi de grande importncia, no apenas para o desenvolvimento de mtodos de diagnstico mais sensveis e especficos para a doena de Chagas (Patruco et al., 1978; Petry et al., 1987; Lafaille et al., 1989; Affranchino et al., 1989), como tambm para melhor conhecimento dos processos imunopatolgicos (Carlomagno et al., 1994; Gonalves da Costa et al., 1994, Hansen et al., 1996). A frao purificada de flagelo (Pereira et al., 1978) e os antgenos recombinantes FRA e CRA (Lafaille et al., 1989), vm sendo empregados no Laboratrio de Imunomodulao, em estudos imunobiolgicos no modelo murino, j que o flagelo se constitui na organela mais importante para a doena de Chagas, do ponto de vista antignico. Os resultados de estudos comparando a ao imunognica de diferentes fraes subcelulares do T. cruzi mostraram que a frao flagelar (FF) tem maior capacidade de induzir proteo e apresenta a vantagem de induzir poucos efeitos imunopatolgicos (Ruiz et al., 1985). Outros autores, entretanto, realizando estudos sobre o papel de diferentes componentes da FF tm fornecido resultados interessantes. Com o emprego de anticorpos monoclonais, vrios antgenos foram identificados e purificados pela tcnica
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de imunoafinidade. Um destes antgenos (antgeno 123) apresentou propriedades imunossupressoras, e estudos sobre a seqncia de aminocidos de alguns peptdeos isolados do antgeno 123 mostraram homologia com as alfa-fetoprotenas humanas e de ratos (Carlomagno et al., 1994). A capacidade que as micobactrias tm de modificar a resposta imunolgica tem sido empregada para fins prticos h longo tempo (Freund & McDermott, 1942), e se baseou na observao de Dienes (1928), que mostrou que quando se inocula um antgeno no local previamente preparado por uma injeo de bacilos da tuberculose mortos, algumas vezes obtemos hipersensibilidade retardada (HR) a estes antgenos. Assim, o adjuvante de Freund completo (AFC) tem sido usado durante muito tempo como a maneira mais efetiva de se obter HR (Lagrange & Hurtrel, 1979; Gonalves da Costa & Lagrange, 1980; Gonalves da Costa et al., 1986) e resistncia, associado ou no a antgenos parasitrios (Andrade & Carvalho, 1969; Hommel et al., 1982). O us o de imunoestimulantes no tratamento de doenas humanas teve origem nos Estados Unidos da Amrica, com o uso de toxinas bacterianas para o tratamento do cncer por William B. Coley. Um nmero limitado de agentes, entretanto, se encontra liberado para a clnica mdica. Entre eles est o BCG, que largamente empregado nos Estados Unidos e na Europa no tratamento do cncer de bexiga (ver Hadden, 1993) e do carcinoma escamoso (Bier et al., 1980). S eu emprego com interesse veterinrio tambm ocorre, tendo sido usado no tratamento do carcinoma escamoso da vaca, por aplicao intralesional, com excelentes resultados (Bier et al., 1980). Um grande nmero de publicaes tem mostrado uma certa ao estimulatria da imunidade natural por imunomoduladores como o BCG e o Coryne bacte rium parvum. Estes podem influenciar o curso de infeces parasitrias, como a doena de Chagas experimental (Kierszenbaum, 1975; Brener & Cardoso, 1976; Gonalves da Costa & Lagrange, 1981), babesiose (Clark et al., 1977), malria (Clark et al., 1976) e leishmaniose (Fortier et al., 1987; Gonalves da Costa et al., 1988), ou controlar o desenvolvimento de tumores (Bast & Bast, 1976). Injees intralesionais produzem uma reao inflamatria local capaz de provocar a cicatrizao de leses por L. brazilie ns is (Gonalves, A. P ., comunicao pessoal) e provocar a regresso de tumores (S alomon & Cream-Goldberg, 1980). Resultados muito interessantes foram observados quando pacientes com cncer de pele, sensibilizados com compostos orgnicos de baixo peso molecular, como o 2,4-dinitrochlorobenzeno, receberam uma segunda dose do produto no local do tumor, ocorrendo a erradicao da leso (Klein, 1968). A explorao da reao inflamatria como um elemento de controle da propagao de tumores e de infeces, entretanto, tem seus resultados mais importantes quando se baseia no fenmeno de Dienes & Schoenheit (1930): antgenos comuns como albumina do ovo, protenas sricas e plen, induzem uma HR do tipo tuberculnico quando introduzidos no local de uma infeco pelo bacilo tuberculnico. A explorao que se tem deste fenmeno se deve, em grande parte, aos trabalhos desenvolvidos por George Mackaness e Phillipe Lagrange no Trudeau Institute, Saranac Lake, em Nova Iorque, tendo esta linha de pesquisa mais tarde prosseguido no Instituto Pasteur de Paris. Foi demonstrado que a imunopotenciao exercida pelo BCG sobre o antgeno superpos to se estende tanto imunidade humoral quanto celular. A resposta imunolgica efetiva quando o BCG e o outro antgeno so introduzidos de forma a serem drenados num linfonodo comum (Miller et al., 1973). A H R induzida pelo eritrcito de carneiro (EC), sem ou com modulao por diferentes agentes (BCG, ciclofosfamida -CY-, AFC, etc.), fornece diferentes tipos de HR (Ohmichi et al., 1976). Desta forma, tmse desenvolvido estudos em que tumores e diferentes microorganismos so inoculados junto com a dose de revelao do EC nestes diferentes modelos de HR e o crescimento tumoral ou o curso das infeces so acompanhados (Lagrange et al., 1978; Lagrange & Trickston, 1979; Gonalves da Costa & Lagrange, 1981). Estes diferentes tipos de HR so mediados por diferentes subpopulaes de linfcitos T, como foi sugerido inicialmente por Lagrange & Mackaness (1975), Hahn et al. (1979) e mais tarde confirmado. No caso do T. cruzi , o mais primitivo dos processos inflamatrios, um granuloma de corpo estranho, capaz de promover um certo nvel de resistncia (De Mesquita, 1979). Um nvel maior de resistncia alcanado quando a dose desafio de tripomastigotas aplicada juntamente com a dose de revelao de HR em camundongos previamente sensibilizados (Gonalves da Costa & Lagrange, 1980). Em infeces por L. amazone ns is , entretanto, experimentos similares conduzem a um estado de facilitao (Calabrese & Gonalves da Costa, 1992) ao passo que uma reao de HR inespecfica, de tipo tuberculnico, confere proteo contra L. e nrie tti (Behin et al., 1977).
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Um nvel muito mais elevado de resistncia tem sido obtido quando se substitui o EC pela frao purificada de flagelo (FPF) (Gonalves da Costa & Lagrange, 1980, 1981). A substituio da FPF por tripomastigotas viveis em camundongos previamente tratados pelo BCG e FPF capaz de revelar uma HR. Esta HR amplificada pela CY injetada dois dias antes da dose de sensibilizao com FPF (Gonalves da Costa & Lagrange, 1981; Abrahamsohn et al., 1981). A anlise histopatolgica mostrou um intenso processo inflamatrio no local da inoculao da dose de infeco no camundongo tratado pelo BCG e muito mais intensa ainda quando ambos os imunomoduladores so usados. A CY provoca alteraes importantes no fluxo de clulas leucocitrias (Calabrese et al., 1996) e deve influir no teor de linfocinas que tm um papel crtico no curso de infeces. Aps uma fase de depresso, em virtude da ao txica da CY, ocorre uma exploso de PM N e moncitos no sangue circulante, em estrita correlao com um aumento da miocardite (Calabrese et al., 1996). Embora estas clulas monocitrias sejam clulas hospedeiras de alta afinidade para a multiplicao do T. cruzi , os macrfagos tm sido considerados um elemento-chave no controle do parasito, desde que ativados (H off, 1975). Assim, a atividade tripanosomicida depende da ativao de clulas T CD 4 pela produo de g-interferon cuja produo vai mediar a ativao macrofgica (M cCabe et al., 1991; Vandekerckhove et al., 1994). interessante assinalar que estas reaes de H R so T-dependentes (Lagrange & Trickston, 1979). Como demonstrou M ackaness (1964), no caso de microorganismos que colonizam macrfagos, o controle da infeco depende essencialmente da imunidade celular, sendo a imunidade humoral insignificante. Um comeo efetivo e posterior propagao da resposta imunolgica requer a produo de um perfil de linfocinas apropriado que vai influenciar o curso da infeco, como veremos mais adiante. A resistncia infeco pelo T. cruzi , induzida por vrias formas de H R no camundongo, de certa forma pode explicar os resultados pouco claros sobre o papel de subpopulaes de clulas T auxiliares no controle desta infeco. O conhecimento que se tem sobre o papel de subpopulaes Th na doena de Chagas menos claro que aquele j estabelecido na leishmaniose tegumentar. A funo de clulas auxiliares e o estudo de secrees de linfocinas vm sendo desenvolvidos em linhagem de clulas T, denominada G-05, derivada de linfonodo de camundongo cronicamente infectado (Spinella et al., 1990). Estas clulas tm o perfil de clulas Th2, secretando I L-4 mas no I L-2 ou -I FN e induzindo clulas B a produzir anticorpos, produo esta mediada por linfocinas liberadas em cultura, principalmente IL-4, I L-5 e IL-6. Esta linhagem de clulas T induz, in vi vo, a ativao de clulas B, que produzem principalmente I gG2a e I gG2b (Spinella et al., 1990), de forma semelhante ao que se observa em infeces murinas pelo T. cruzi . Esta expresso da clula B considerada, por muitos autores, como resultado de uma ati vao policlonal e a ela tem se dado muita ateno recentemente (Ortiz-Ortiz et al., 1980; D I mperio Lima et al., 1986; M inoprio et al., 1986a,b; H ontebeyrie-Joskowicz, 1991). interessante analisar neste aspecto o papel dos anticorpos naturais anti Gal identificados inicialmente por Muniz & Santos (1950), que mostraram que anticorpos com propriedades aglutinantes anti T. cruzi se ligam em uma frao polissacardica presente na superfcie deste parasito. Como estes anticorpos so absorvidos dos soros de pacientes chagsicos por eritrcito de carneiro, foram chamados de anti corpos heterfilos. Os aspecto da imuni dade humoral na doena de Chagas foram discutidos no Captulo 4.3.
Agrade cime ntos : a Luciana Freitas Pereira pelo trabalho de preparao do manuscrito, bem como pela organizao de um banco de dados em doena de Chagas e a Marlene Lopes Lucena pela elaborao da Figura 5.
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ABRAHAMSOHN, I. A. & COFFMAN R. L. Cytokineand nitric oxideregulation of the immunosuppression in Trypanos oma cruzi infection. J ournal of Immunology , 155:3955-3963, 1995. ABRAHAMSOHN, I. A. & COFFMAN, R. L. Trypanos oma cruzi : IL-10, TNF , IFN-, eIL-12 regulate innateand acquired immunity to infection. Expe rimental Paras itology , 84:231-239, 1996. ABRAHAMSOHN, I. A.; BLOTTA, M. H. S. L. & CURROTTO, M. A. Enhancement of delayed-type hypersensitivity to Trypanos oma cruzi in mice treated with Mycobacterium bovisBCG and cyclophosphamide. Infection and Immunity, 31: 1145-1151, 1981. AFFRANCHINO, J. L.; IBANEZ, C. F .; LUQUETTI, A. O.; RASSI, A.; REYES, M. B.; MACINA, R. A.; ASLUND, L.; PETTERSSON, U. & FRASH, A. C. C. Identification of aTrypanos oma cruzi antigen that isshed during acute phaseof Chagas disease. Molecular & Bioche mical Paras itology, 34:221-228, 1989. AGUILAR, L. K.; AGUILAR-CORDOVA, E.; CARTWRIGHT, J. R. J. & BELMONT, J. W. Thymic nursecellsaresitesof thymocyteapoptosis. J ournal of Immunology, 152:2645-2651, 1994. ALBINA, D. J.; HARMON, B. V. & ROBERTS, S. A. Nitric oxide-mediated apoptosisin murineperitoneal macrophages. J ournal of Immunology, 150:5080-5085, 1993. ALIBERTI, J. C. S.; CARDOSO, M. G. A.; MARTINS, G. A.; GAZZINELLI, R. T.; VIEIRA, L. Q. & SILVA, J. S. IL-12 mediatesres istenceto Trypanos oma c ruzi in miceand isproduced by murinemacrophagesin responseto livetrypomastigotes. Infection & Immunity , 64:1961-1967, 1996. ALIBERTI, J. C. S.; MACHADO, F .S .; GAZZINELLI, R. T.; TEIXEIRA, M. M. & SILVA, J. S . Platelet-activatingfactor induces nitric oxide synthesisin Trypanos oma cruzi -infected macrophages and mediatesresistanceto parasite infection in mice. Infection & Immunity , 67:810-2814, 1999b. ALIBERTI, J. C. S.; MACHADO, F . S.; SOUTO, J. T.; CAMPANELLI, A. P .; TEIXEIRA, M. M.; GAZZINELLI, R. T. & SILVA, J. S. -Chemokinesenhance parasiteuptakeand promote nitric oxide-dependent microbiostatic activity in murine inflamatory macrophagesinfected with Trypanos oma cruzi. Infe ction & Immunity , 67:4819-4826, 1999. ALMEIDA, I. C.; MILANI, S. R.; GORIN, P . A. & TRAVASSOS, L. R. Complement-mediated lysisof Trypanos oma cruzi trypomastigotesby human anti--galactosyl antibodies. J ournal of Immunology 146:2394-2400, 1991. ANDERSON, G.; MOORE, N. C.; OWEN, J. J. T. & JENKINSON, E. J. Cellular interactionsin thymocytedevelopment. Annual Review Immunology , 14:73-99, 1996. ANDRADE, S. G. & CARVALHO, M. L. Efeito daexcitao do sistemareticulo-endotelial pelo adjuvantedeFreund, nadoena deChagasexperimental. Re vis ta do Ins titutodeMedicina Tropical de SoPaulo, 11:229-235, 1969. ANDRADE, V.; BARRAL-NETTO, M. & ANDRADE, S. G. Patternsof resistanceof inbred mice to Trypanos oma cruzi are determined by parasitestrain. Brazilian Journal of Me dical and Biological Res arch, 18:499-506, 1985. ANDREWS, P . & BOYD, R. L. The murine thymic nurse cell: an isolated thymic microenvironment. European J ournal of Immunology, 15:36-42, 1985. ANTAS, P . R. Z. Quantificao deprotenasdefas eaguda em crianaschags icasbus cando, identificar marcadoresdae voluoda infe copeloTrypanos oma cruzi, 1996. TesedeMestrado em BiologiaParasitria, Rio deJaneiro: Instituto Oswaldo Cruz. ANTAS, P . R. Z.; MEDRANO-MERCADO, N.; TORRICO, F .; UGARTE-FERNANDEZ, R.; GMEZ , F .; OLIVEIRA, R. C.; CHAVESA.; ROMANHA A. J. & ARAJ O-JORGET. C. Early, intermediate, and lateacutestagesin Chagas disease: astudy combining anti-galactoseIgG, specific serodiagnosis, and polymerasechain reaction analysis. Ame rican Journal of Tropical Medicineand Hygiene61:308-314, 1999. ARAJO-JORGE, T. C.; BARBOSA, H. S. & MEIRELLES, M. N. L. Trypanos oma cruzi: recognition by macrophagesand musclecells: opening perspectivesafter a15-yearsstudy. MemriasdoIns tituto Os waldoCruz, 87 (Suppl.V):43-56, 1992a. ARAJO-JORGE, T. C.; EL BOUHDIDI, A.; RIVERA, M. T.; DAERON, M. & CARLIER, Y. Trypanos oma cruzi infections in mice enhancesthe membrane expression of low affinitty Fc receptorsfor IgG and the release of their soluble forms. Paras iteImmunology, 15:539-546, 1993. ARAJO-JORGE, T. C.; LAGE, M. J. F .; RIVERA, M. T.; CARLIER, Y. & VAN LEUVEN, F . Trypanos oma cruzi : enhanced -macroglobulin levels correlate to resistance of BALB/CJmice to acute infection. Paras itology Res earch, 78:215-221, 1992b.
72
AZNAR, C.; LOPEZ-BERGAMI, P .; BRANDARIZ, S.; MARIETTE, C.; LIEGEARD, P .; ALVES, M. D.; BARREIRO, E. L.; CARRASCO, R.; LAFON, S. & KAPLAN, D. Prevalenceof anti-R-13 antibodiesin human Trypanos oma cruzi infection. FEMSImmunol Me d Microbiol, 12:231-238, 1995. BAST, R. C. & BAST, B. S. Critical review of previously reported animal studiesof tumor immunotherapy with non specific immuno-stimulants. Annalsof theNew York Academyof S cience s , 277:60-93, 1976. BAUMHUETER, S .; SINGER, M. S.; HENZEL, W.; HEMMERICH, S.; RENZ, M.; ROSEN, S. D. & LASKY, L. A. Binding of L-selectin to thevascular sialomucin CD34. Scie nce , 262:436-438, 1993. BEHBEHANI, K.; PAN, S. C. & UNANUE, E. R. Marked increase in Ia-bearing macrophagesduring Trypanos oma cruzi infection. Clinical Immunologyand Immunopathology, 19:90-195, 1981. BEHIN, R.; MAUEL, J. & ROWE, D. S. Mechanismsof protective immunity in experimental cutaneousleishmaniasisof the guineapig. III. Inhibition of leishmanialesion theguinea pig delayed-hypersensibility reaction to unrelated antigens. Clinical & Experimental Immunology, 29:320-325, 1977. BEVAN, M. J. In aradiation chimaera, host H-2 antigensdetermine immune responsivenessof donor cytotoxic cells. Nature , 269:417-418, 1977. BIER, J.; PICKARTZ, H.; SCHLESINGER, S.; ZBAR, B.; RAPP , H.; BORSOS , T.; KLEINSCHUSTER, S.; RLLINGHOFF , M. & WAGNER, H. Intralesional injection of emulsified BCG-cell wallsin patientswith squamouscell carcinomaof the head and neck region. Cancer Immunologyand Paras iteImmunology, 97:187-198, 1980. BONIFACINO, J. S.; McCARTHY, S. A.; MAGUIRE, J. E.; NAKAYAMA, T.; SINGER, D. S.; KLAUSNER, R. D. & SINGER, A. Novel post-translational regulation of TCR expression in CD4+CD8+ thymocytes influenced by CD4. Nature, 344: 247-251, 1990. BORTH W. A2-macroglobulin, amultifunctional bindingprotein with targeting characteris tics . FAS EBJ ournal, 6:3345-3353, 1992. BOYD, R. L.; TUCEK, C. L.; GODFREY , D. I.; IZON, D. J .; WILS ON,T. J .; DAVIDS ON, N. J .; BEAN, A. G.D.; LADYMAN, H. M.; RITTER, M. A. & HUGO, P . Thethymic microenvironment. ImmunologyToday, 14:445-459, 1993. BRENER, Z. Why vaccinesdo not work in Chagas disease. Paras itologyToday, 2: 196-199, 1986. BRENER, Z. Thepathogenesisof Chagas disease: an overview of current theories. In: Chagas diseaseand thenervoussystem. PAHO Scientific Publication, 547: 30-46, 1994. BRENER, Z. & CARDOSO, J. E. Non-specific resistanceagainst Trypanos oma cruzi enhanced by Corynebacte rium parvum. J ournal of Paras itology , 62:645-646, 1976. BRENER, Z & KRETTLI, A. U. Immunology of Chagas disease. In: Modern paras itebiology: cellular, immunological and mole cular as pects . New Y ork: Wyller DJ, Freeman WH & Co, 1990. p. 247-261. BRENIERE, F . S.; CARLIER, Y.; CARRASCO, R.; MOLINEDO, S.; LEMESRE, J. L.; DESJEUX, P .; DESJEUX, P .& AFCHAIN, D. S pecific immunodiagnosisof Chagasdisease: immunodiffusion test using aspecific serum anti-Trypanos oma cruzi component 5. Tropical and Geographical Medicine39: 281-286, 1987. BRENIERE, S. F .; CARRASCO, R.; MIGUEZ, H.; LEMESRE, J. L. & CARLIER, Y. Comparisonsof immunologica l test for serodiagnosisof Chagas disease in Bolivian patients. Tropical and Ge ographical Me dicine , 37:231-238, 1985. BRODSKYN, C. I.; SILVA, A. M. M.; TAKEHARA, H. A. & MOTA, I. Characterization of antibody isotype responsiblefor immuneclearencein miceinfected with Trypanos oma cruzi . ImmunologyLette rs , 18:255-258, 1988. BRODSKYN, C. I.; SILVA, A. M. M.; TAHKEHARA, H. A. & MOTA, I. IgG subclassesresponsiblefor immuneclearancein miceinfected with Trypanos oma cruzi . Immunologyand Cellular Biology, 67:343-341, 1989. BRUMPT, E. Pntration du Schizotrypanum cruzi travers la muqueuse oculaire saine. Bulletin dela SocitdePathologie Exp rimentale, 5:723, 1912. BURLEIGH, B. A. & ANDREWS, N. W. Themechanism of Trypanos oma cruzi invasion of mammalian cells. Annual Re view of Microbiology ,49:175-200, 1995. BUTCHER, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: threeor more stepsto specificity and diversity. Cell, 67:1033-1036, 1991. CALABRESE, K. S. & GONALVESDA COSTA, S. C. Enhancement of Leis hmania amazonens isinfection in BCG nonresponder mice by BCG-antigen specific vaccine. Memriasdo Ins tituto Os waldo Cruz, 87 (Suppl. I):49-56, 1992. CALABRESE, K S.; LAGRANGE, P . H. & GONALVES DA COSTA, S. C. Chagas disease: Enhancement of systemic inflammatory reaction in cyclophosphamidetreated mice. International J ournal of Immunopharmacology, 18:505-514, 1996.
73
CANDOLFI, E.; HUNTER, C. A. & REMINGTON, J. S. Rolesof IFN- and other cytokinesin supression of thespleen cell proliferativeresponseto concanavalin A and toxoplasmaantigen during acute toxoplasmosis. Infe ction & Immunity , 63:751756, 1995. CARDILLO, F., FALCO, R. P ., ROSSI, M. A. & MENGEL, J. An age-related T cell suppressor activity correlateswith the outcomeof autoimmunity in experimental Trypanos oma cruzi infection. European J ournal of Immunology , 23:597-2605, 1993. CARDILLO, F .; VOLTARELLI, J. C.; REED, S. G. & SILVA, J. S. Regulation of Trypanos oma cruzi infection in miceby IFN-g and IL-10: Roleof NK cells. Infection & Immunity , 64:128-134, 1996. CARDING, S. R.; H AYDAY, A. & BOTTOMLY, K. Cytokines in T-cell development. ImmunologyToday, 12:239-245, 1991. CARLIER, Y.; BRENIERE, F . S.; LEMESRE, J. L.; CARRASCO, R.; DESJEUX, P . & AFCHAIN, D. The interest of immnoprecipitation test in theimmunological diagnosisof Chagas disease. Annale sdela Socie tBe lgedeMe dicineTropicale , 65:85-94, 1985. CARLOMAGNO, M. A.; HANSEN, D.; VILLACRS-ERIKSSON, M.; AKERBLOM, L.; HELLMAN, V.; SEGURA, E. L. & MOREIN, B. Immunesuppression by Trypanos oma cruzi antigensidentified by monoclonal antibodiesprepared with Trypanos oma cruzi ISCOMS. Intenational Congres sof Paras itology , Izmir, Turquia, 1994. Abstracts, p. 81. CHER, D. J. & MOSMANN, T. R. Two typesof murinehelperT cell clone. II. Delayed-typehypersensitivity ismediated by Th1 clones. J ournal of Immunology, 138:3688-3692, 1987. CHIQUET-EHRISMANN, R. Tenascins, a growing family of extracellular matrix proteins. Experie ntia, 51:853-862, 1995. CLARK, I. A.; ALLISON, A. C. & COX, F . E. Protection of miceagainst Babes ia and Plas modium with BCG. Nature , 259: 309311, 1976. CLARK, I. A.; WILLS, E. J.; RICHMOND, J. E. & ALLISON, A. C. Suppression of babesiosisin BCG-Infected mice and its correlation with tumor inhibition. Infe ction & Immunity, 17:430-438, 1977. COFFMANN, R. L.; SEYMOUR, B.; LEBMAN, D.; HIRAKI, D.; CHRISTIANS EN, J. SHRADER, B. CHERWINSKI, H.; SAVELKOUL, H.; FILKENMAN, F .; BOND, M. & MOSMANN, T. M. Theroleof helperT cell productsin mouseB cell differentiation and isotyperegulation. Immunological Revie ws ,102:5-28, 1988. CORONA, S. S.; AMANALES, C.; AVARIA, M. B. & DE LOS, A. Granuloma chagsico del cerebro en un paciente con leucemina linfoblastica. Re vis ta Me dica do Chile , 116:676-680, 1988. COTTA-DE-ALMEIDA, V. O timona imunopatologia da doena deChagasexperimental. Es tudoss obreasalte rae sfe notpicase funcionaisna dife re nciaoemigrao intratmicasdeclulasT, 1996. Tesede Doutorado, ProgramadeBiologia Celular e Molecular, Rio deJ aneiro: Instituto Oswaldo Cruz. COTTA-DE-ALMEIDA, V.; BERTHO, A. L.; VILLA-VERDE, D. M. S .& S AVINO, W. Phenotypicand functional alterations of thymic nursecellsfollowing acute Trypanos oma cruzi infection. Clinical Immunology Immunopathology, 82:125-132, 1997. COUTINHO, C. M. L. M., CAVALCANTI, G. H., BONALDO, M. C., MORTENSEN, R. F . & ARAJO-JORGE, T. C. Trypanos oma cruzi: detection of asurfaceantigen cross-reactiveto human C-reactive protein. Experime ntal Paras itology, 90:43-153, 1998. CUNHA, N. L.; SOUZA, W. & HASSN-VOLOCH, A. Isolation of theflagellum and characterization of theparaxial structure of Herpe tomonasme gas aliae .J ournal of S ubmicros copicCytology, 16:705-713, 1984. CUNHA-NETO, E.; DURANTI, M.; GRUBER, A.; ZINGALES, B.; DE MESSIAS, I.; STOLF , N.; BELLOTTI, G.; PATARROYO, M. E.; PILLEGGI, F . & KALIL, J. Autoimmunity in Chagasdiseasecardiopathy: biological relevanceof a cardiac myosin-specific epitopecroosreactiveto an immunodominant Trypanos oma cruzi antigen. Proce e dingsof theNational Academyof S ciencesUSA, 92: 3541-3545, 1995. DALMASSO, A. P & JARVINEN, J. A. Experimental Chagas disease in complement-deficient miceand guineapigs. Infe ction & Immunity 28:434-440, 1980. D AVILA REIS, D.; GAZINELLI, R. T.; GAZINELLI, G. & COLLEY, D. G. Antibodiesto Trypanos oma cruzi expressidiotypic patternsthat can differentiate between patientswith asymtomatic or severeChagas disease. J ournal of Immunology, 150: 1611-1618, 1993b. D AVILA REIS, D.; JONES, E. M.; TOSTES, S.; LOPES, E. R.; GAZINELLI, G.; COLLEY, D. G. & CURLEY, M. C. Characterization of inflammatory in chronic Chagasmyocardial lesions: Presenceof afewTNF- cells , and apredominanceof granzyme A+ CD8+ lymphocytes. Ame rican J ournal of Tropical Me dicine& Hygie ne , 48:637-644, 1993a.
74
DEL CASTILLO, M.; MENDONZA, G.; OVIEDO, J.; BIANCO, R. P .P .; ANSELMO, A. E. & SILVA, M. AIDSand Chagas diseasewith central nervoussystem tumor-likelesion. American Journal of Medicine , 88:693-694, 1990. DE MESQUITA, R. P . Theprotectiveeffect of non-immunologic granulomatousinflammation in Trypanos oma cruzi infection of mice. Revis ta Bras ileira deBiologia, 39:99-102, 1979. DE TITTO, E. H.; CATTERALL, J. R. & REMINGTON, J. S. Activity of recombinant tumor necrosisfactor on Toxoplas ma gondii and Trypanos oma cruzi. J ournal of Immunology, 137:1342-1345, 1986. DEUTSCHLNDER, N.; VOLLERTHUN, R. & HUNGERER, K-D. Histophatology of experimental Chagasdiseasein NMRI-mice: along term study following paw infection. Tropenme dicineund Paras itology , 29:323-329, 1978. DE WAAL MALEFIJT, R.; LEENE, W.; ROHOLL, P . J. M.; WORMMEESTER, J. & HOEBEN, K. A. T cell differentiation within thymic nurse cells. LaboratoryInves tigation, 55:25-34, 1986. DIAS, E. Estudossobreo S chizotrypanum cruzi . MemriasdoIns titutoOs waldoCruz 27:1-110, 1934. DIENES, L. Further observationsconcerning thesensitization of tuberculousguinea pigs. J ournal of Immunology, 15:153-174, 1928. DIENES, L. & SCHOENHEIT, E. W. Certain characteristicsof theinfectionsprocessin connection with theinfluenceexerted on theimmunity response. J ournal of Immunology, 19:44-61, 1930. D IMPERIO LIMA, M. R.; EISEN, H.; MINOPRIO, P .; JOSKOWICZ, M. & COUTINHO, A. Persitenceof polyclonal B cell activation with undetectableparasitemiain latestages of experimental Chagas disease. J ournal of Immunology, 137:353356, 1986. D IMPERIO LIMA, M. R.; JOSKOWICZ, M.; COUTINHO, A.; KIPNIS, T. & EISEN, H. Very largeand isotypically atypical polyclonal plaqueforming cell responsesin mice infected with Trypanos oma cruzi . Europe an J ournal of Immunology, 15:201203, 1985. DING, A.; NATHAN, C. F .; GRAYCAR, J.; DERYNCK, R.; STUEHR, D. J. & SRIMAL S. Macrophagesdeactivating factor and transforming growth factors-1, 2, 3 inhibit induction of macrophage nitrogen oxide synthesisby IFN-. Journal of Immunology, 145:940-944, 1990. DOSREIS, G. & LOPES, M. F . A respostaimuneinfeco pelo Trypanos oma cruzi em modelosexperimentais: Viasdeacesso a mecanismosde imunoproteo e de patognese na doena de Chagas. In: Trypanos oma cruzi edoe na deChagasRio de Janeiro: GuanabaraKoogan, 1999, Captulo 9, p.153-169. DRAGON, E. A.; BROTHERS, V. M.; WRIGHTHSMAN, R. A. & MANNING, J. A Mr. 90000 surface polypeptide of Trypanos oma cruzi asa candidatefor aChagas disease diagnostic antigen. Mole cular Bioche mical Paras itology, 16:213-219, 1985. DUTRA, W. O.; LUZ, Z. M.; CANADO, J. R.; PEREIRA, M. E.; BRIGIDO-NUNES, R. M.; GALVAO, L. M.; COLLEY, D. G.; BRENER, Z.; GAZZINELLI, G. & CARVALHO-PARRA, J. F . Influenceof parasitepresenceon theimmunologic profile of peripheral blood mononuclear cells from chagasic patients after specific drug therapy. Paras iteImmunology, 18:579-585, 1996. DUTRA, W. O.; MARTINS-FILHO, O. A.; CANADO, J. R.; PINTO-DIAS , J. C.; BRENER, Z.; FREEMAN JUNIOR, G. L.; COLLEY, D. G.; GAZZINELLI, G. & PARRA, J. C. Activated T and B lymphocytesin peripheral blood of patients with Chagas disease. Inte rnational Immunology, 6:499-506, 1994. DWYER, D. M. Isolation and partial characterization of surfacemembranesfrom Le is hmania donovani promastigotes. Journal of Protozoology, 27:176-182, 1980. EL BOUHDIDI, A.; TRUYENS, C.; RIVERA, M. T.; BAZIN, H. & CARLIER, Y. Trypanos oma cruzi infection in miceinduces apolyisotypic both hypergammaglobulinemiaand parasite-specific responseinvolving high levelsof IgG2aand highly avid IgG1 antibodies. Paras iteImmunology, 16:69-76, 1994. FEARON, D. & LOCKSLEY, R. M. Theinstructiveroleof innateimmunity in theacquired immuneresponse. S cie nce , 272:5054, 1996. FEHSEL, K.; KRNCKE, K. D.; MEYER, K. L.; HUBER, H.; WAHN, V. & KOLB-BACHOFEN, V. Nitric oxideinduces apoptosisin mousethymocytes. J ournal of Immunology, 155:2858-2865, 1995. FERREIRA, A. W. Testsfor Chagasdiseaseserodiagnosis: areview. In: Chagas Dis eas e(Ame rican Trypanos omias is ): Itsimpact on trans fus ion and clinical me dicine . So Paulo: ISBT-Brazil, 1992. p. 179-193. FERREIRA, M. S.; NISHIOKA, S. A.; ROCHA, A.; SILVA, A. M.; FERREIRA, R. G.; OLIVIER, W. & TOSTESJr, S. Acute fatal Trypanos oma cruzi meningoencephalitisin ahuman immunodeficiency virus-positivehemophiliac patient. Ame rican J ournal of Tropical Me dicine& Hygie ne , 45:723-727, 1991.
75
FICHTELIUS, K. E.; GROTH, O. & LIDN, S. The skin, a first level lymphoid organ?International Archivesof Allergy, 37:607-620, 1970. FIORENTINO, D. F .; BOND M. A. & MOSMANN, T. R. Two typesof mouse helper T cell. IV. Th2 secrete a factor that inhibitscytokine production by Th1 clones. J ournal of Expe rimental Me dicine , 179:2081-2095, 1989. FORTIER, A. H.; MACK, B. A.; MELTZER, M. S. & NACY, C. A. Mycobacterium bovisBCG-induced protection against cutaneousand systemic Le is hmania major infectionsof mice. Infection & Immunity, 55:1707-1714, 1987. FOWLKES, B. J. & PARDOLL, D. M. Molecular and cellular eventsof T cell development. Advancesin Immunology, 44:207264, 1989. FRANA, L. C. M.; FLEURY , R. N.; RAMOSJ r., H. A.; LEMOS, S.; MELARAGNO FILHO, R. & PAS TERNAK, J. Mols tia de Chagas crnica associadaa leucemia linftica. Ocorrncia de encefalite agudacomo alterao do estado imunitrio. ArquivosdeNe urops iquiatria, 27:59-66, 1969. FREUND, J. & MCDERMOTT, K. Sensitization to horse serum by meansof adjuvants. Procedingsof SocietyExpe rimental Biology and Medicine , 49:548-553, 1942. GAJEWSKI, T. F . & FITCH, F . W. Anti-proliferativeeffect of IFN- in immune regulation. I. IFN- inhibitstheproliferation of Th2 but not Th1 murine helper T lymphocyte clone. J ournal of Immunology, 140:4245-4252, 1988. GALLATIN, W. M.; WEISSMAN, I. L. & BUTCHER, E. C. A cell-surfacemolecule involved in organ-specific homing of lymphocytes. Nature , 304:30-34, 1983. GALLIARD, H. Envahissemen prcoceet intensedelacavit abdominalechez lasourisau coursdesinfectionsaTrypanos oma cruzi . AnnalesdeParas itologie , 7:377-380, 1929. GAZINELLI, R. T. Natural anti-Gal antibodiesprevent, rather than cause autoimmunity in human Chagas disease. Re s e arch in Immunology, 42:164-167, 1992. GAZZINELI, G. & BRENER, Z. Immuneresponsein Chagas disease. Res e arch in Immunology, 142:180-182, 1991. GAZZINELLI, R. T.; GALVO, L. M.; CARDOSO, J. E.; CANADO, J. R.; KRETTLI, A. U.; BRENER, Z. & GAZZINELLI, G. Anti-Trypanos oma cruzi and anti-laminin antibodiesin chagasic patientsafter specific treatment. J ournal of Clinical Microbiology 26:1795-1800, 1988. GAZZINELLI, R. T.; OSWALD, I. P .; HIENY, S.; JAMES, S. L. & SHER, A. The microbicidal activity of IFN--treated macrophagesagainst Trypanos oma cruzi involvesan L-arginine-dependent, nitrogen oxide-mediated mechanism inhibitable by IL-10 and TGF-. Europe an J ournal of Immunology, 22:2501-2506, 1992. GAZINELLI, R. T.; PEREIRA, M. E. S .; ROMANHA, A.; GAZINELLI, G. & BRENER, Z. Direct lys isof Trypanos omac ruzi: A novel effector mechanism of protection mediated by human anti-gal antibodies . Paras iteImmunology, 13:345-356, 1991. GIRARD, J. P . & SPRINGER, T. A. High endothelial venulesHEVS: Specialized endothelium for lymphocyte migration. ImmunologyToday, 16:449-457, 1995. GLUCKSTEIN, D.; CIFERRI, F . & RUS KIN, J. Chagas disease: another caus eof cerebral massin theacquired immunodeficiency syndrome. American Journal of Me dicine , 92:429-432, 1992. GLUCKSTEIN, D.; RUSKIN, J.; CIFERRI, F .; WEICHL, W. D. & GROGL, M. Chagas disease: A new case of cerebral mass in AIDS . In: Inte rs cie nceconfe re nc eon antimicrobial ag e ntsand c he mothe rapy, 28, LosAngeles, Ame rican S oc ie tyfor Microbiology, 1988. abstr, n 1230. GODFREY, D. I. & ZLOTNIK, A. Control pointsin early T-cell development. ImmunologyToday, 14:547-553, 1993. GOLDEN, J. M. & TARLETON, R. L. Trypanos oma cruzi : cytokineeffectson macrophagetrypanocidal activity. Expe rime ntal Paras itology, 72: 391-402, 1991. GOMES, N. A.; PREVIATO, J. O.; ZINGALES, B.; MENDONA-PREVIATO, L. & DOSREIS, G. A. Down regulation of T-lymphocyteactivation in vitro and in vivo induced by glycoinositolphospholipidsfrom Trypanos oma cruzi : assignment of theT-cell suppressive determinant to ceramine domain. J ournal of Immunology, 156:628-635, 1996. GONALVESDA COSTA, S. C. & LAGRANGE, P . H. Immunemodulation which increasesresistanceto Trypanos oma cruzi infection. Cancer Immunologyand Paras iteImmunologyINSERM, 97:383-405, 1980. GONALVESDA COSTA, S. C. & LAGRANGE, P . H. Development of cell mediated immunity to flagellar antigensand acquired resistance to infection by Trypanos oma cruzi in mice. Me mriasdo Ins titutoOs waldoCruz, 76:367-381, 1981. GONALVESDA COSTA, S. C.; BARBOSA SANTOS, E. & LAGRANGE, P . H. Vaccination of mice against Le is hmania mexicana amazone ns iswith microsomal fraction associated with BCG. Annale sdel Ins titut Pas te ur Immunologie, 139:143156, 1988.
76
GONALVES-DA-COSTA, S. C.; CALABRESE, K. S.; BAUER, P . G.; SAVINO, W. & LAGRANGE, P . H. S tudieson the thymusin Chagas disease. III. Colonization of the thymusand other lymphoid organs of adult and newborn mice by Trypanos oma cruzi . PathologyBiology, 39:91-97, 1991. GONALVESDA COSTA, S. C.; CALABRESE, K. S.; OLEMANN, W. & LAGRANGE, P . H. , 1994. Immunopotentiation of protectiveantigensin experimental Chagas disease. Inte rnational Congre s sof Paras itology, Izmir, Turquia: Abstracts, p. 82. GONALVESDA COSTA, S. C.; HURTREL, B. & LAGRANGE, P . H. Non specific resistanceof miceto Trypanos oma cruzi strain CL induced by delayed type hypersensitivity to unrelated antigen. Atasda SociedadedeBiologia doRio deJaneiro, 26:15-24, 1986. GONALVESDA COSTA, S. C.; LAGRANGE, P . H.; HURTREL, B.; KERR, I. & ALENCAR, A. Roleof T lymphocytesin theresistance and immunopathology of experimental Chagas disease. I. Histopathological studies. Annale sdImmunologie Ins itutePas te ur, 135:317-332, 1984. GRANGER, D. & LEHNINGER, A. L. S itesof inhibition of mitochondrial electron transport in macrophage-injuried neoplastic cells. J ournal of Cell Biology, 95: 527-35, 1982. GRAUERT, M. R.; HOUS SAYER, M. & HONTEBEYRIE-JOS KOWCIZ, M. Trypanos omacruzi infection enhancespolyreactivity antibody response in an acutecase of human Chagas disease. Clinical and Experimental Immunology93:85-92, 1983. GREGORY, S. H.; WING, E. J.; HOFFMAN, R. A. & SIMMONS, R. L. Reactivenitrogen intermediatessuppresstheprimary immunologic response to Lis teria. J ournal of Immunology, 150:2901-2909, 1993. GUIDOS, C.; DANS KA, J . S.; FATHMAN, C. G. & WEISSMAN, I. L. T cell receptor-mediated negativeselection of autoreactive T lymphocyte precursorsocursafter commitment to the CD4 or CD8 lineages. Journal Experime ntal Medicine , 172:835845. 1990. HADDEN, J.W. Immunostimulants. ImmunoogyToday14:275-280, 1993. HAHN, H.; KAUFMANN, S. H. E.; MILLER, T. E. & MACKANESS, G. B. Peritoneal exudateT-lymphocyteswith specificity to sheep red blood cells: I. Production and characterization asto function and phenotype. Immunology, 36:691-696, 1979. HANSEN, D. S.; ALIEVI, G.; SEGURA, E. L.; CARLOMAGNO, M.; MOREIN, B.; VILLACRES-ERIKSSON, M. The flagellar fraction of Trypanos oma cruzi depleted of an immunosuppressiveantigen enhancesprotection to infection and elicitsspontaneousT cell responses. Paras iteImmunology 18:607-615, 1996. HARDY, R. R.; CARMACK, C. E.; SHENG, Y. & HAYAKAWA, K. Distinctive developmental originsand specificitiesof murineCD5+ B cells. Immunological Reviews , 137:90-118, 1994. HAREL-BELLAN, A.; JOS KOWICZ, M.; FRADELIZI, D. & HEISEN, H. Modification of T-cell proliferation and interleukin 2 production in miceinfected with Trypanos oma cruzi . Proce e dingsof theNational Acade myof S cie nce sUS A, 80:3466-3469, 1983. HAREL-BELLAN, A.; JOSKOWICS, M.; FRADELIZI, D. & EISEN, H. T lymphocytefunction during experimental Chagas disease: Production of and responseto interleukin 2. Europe an J ournal of Immunology , 15:438-442, 1985. HATCHER, F .M. & KUHN, R.E. Destruction of Trypanos oma cruzi by natural killer cells. S cie nce218:295-296,1982. HATCHER, F .M.; KUHN, R. E.; CERRONE, M. C. & BURTON, R. C. Increased natural killer cell activity in American trypanosomiasis. J ournal of Immunology 127: 1126-1128, 1981. HIGUCHI, M. L. Chronic chagasic myocarditisisTrypanos oma cruzi antigen and CD8+ T cell-dependent. Me mriasdoIns tituto Os waldo Cruz, 91 (Suppl.): 42, 1996. HO, J. L.; REED, S. G.; SOBEL, J.; ARRUDA, S.; HE, S. H.; WICK, E. A. & GRABSTEIN, K. H. Interleukin-3 induces antimicrobial activity against Le is hmania amazone ns isand Trypanos oma cruzi and tumoricidal activity in human peripheral blood-derived macrophages. Infection & Immunity, 60:1984-1993, 1992. HOFF , R. Killing in vitro of Trypanos oma cruzi by macrophagesfrom miceimmunized with Trypanos oma cruzi or BCG, and absenceof cross-immunity on challengein vivo. Journal of Experime ntal Me dicine, 142:299-311, 1975. HOFFLIN, J. M.; SADLER, R. H.; ARAUJO, F .G.; PAGE, W. E. & REMINGTON, J. S. Laboratory-acquired Chagasdisease. Trans actionsof theRoyal S ocie ty of Tropical Me dicine& Hygiene81:437-440, 1987. HOMMEL, M.; DAVID, P . H.; GURLLOTTE, M. & PEREIRA DA SILVA, L. Protection against Plas modium chabaudi malaria. I - Vaccination of mice with merozoitesand Freund sadjuvants. Annale sd ImmunologieIns t. Pas te ur, 133C:57-67, 1982. HONTEBEYRIE-JOSKOWICS, M. Murine Trypanos oma cruzi infection: a role for Th2 cellsin the immunopathology of chronic infection. Res earch Immunology, 142: 141-143, 1991.
77
HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Humoral and cellular immunity to Trypanos oma cruzi infection and disease. In: Chagas dis e as eand thenervouss ys tem. Washington DC: PAHO, 1994. Sci. Publi. no 547, p. 273-283. HOUBEN-DEFRESNE, M. P .; VARLET, A.; GOFFINET, G. & BONIVER, J. Thymic nursecellsarethefirst site of virus replication after inoculation of theradiation leukemia virus. Leukemia Re s earch, 2:231-241, 1982. HUNTER, C. A. & ARAUJO, F. IL-12-mediated resistanceto Trypanos oma cruzi isdependent on TNF- and IFN-. Infe ction & Immunity , 64:2381-2386, 1996. HUNTER, C. A.; ELLIS-NEYES, L. A.; SLIFER, T.; KANALY, S.; GRUNIG, G.; FORT, M.; RENNICK, D.; ARAUJO, F .G. IL-10 is required to prevent immune hyperactivity during infection with Trypanos oma cruzi. J ournal of Immunology 158:3311-3316, 1997. JAMES, S. L.; KIPNIS, T.; SHER, A. & HOFF , R. Enhanced resistanceto Trypanos oma cruzi in micetreated with an interferon inducer. Infection & Immunity 35:588-591, 1982. JATENE, A. D. Transplantede corao em pacientescom miocadiopatia chagsica. Revis ta da S ociedadeBras ile ira deMe dicina Tropical, 20 (Supl. II):C5-C6, 1987. JOINER, K. A.; DA SILVA, W. D.; RIMOLDI, M. T.; HAMMER, C. H.; SHER, A. & KIPNIS , T. L. Biochemical characterization of a factor produced by trypomastigotesof Trypanos oma cruzi that acceleratesthe decay of complement C3 convertase. J ournal of Biological Chemis try, 263:11327-11335, 1988. JOST, L.; TURIN, M.; ETCHEGOYEN, P .; LEIGUARDA, R.; TARATUTO, A. L. & TOFFI, R. Meningoencefalitischagsica em paciente com tratamiento immunosupresor por transplanterenal. Re vis ta Ne urologica Argentina, 3:425-428, 1977. KAGAN, I. G. & NORMAN, L. Immunological s tudiesof Trypanos omacruzi . III. Duration of acquired immunity in miceinitially infected with aNorth American strain of Trypanos oma cruzi. J ournal of Infe ctionsDis e as e s108:213-217, 1961. KAHN, S.; WLEKLINSKI, M.; ARUFFO, A.; FARR, A.; CODER, D. & KAHN, M. Trypanos oma c ruzi amastigoteadhesion to macrophagesisfacilitated by themannose receptor. J ournal of Experime ntal Medicine182:1243-1258, 1995. KAHN, S . J.; WLEKLINSKI, M.; EZEKOWITZ, R.A.. CODER, D.; ARUFFO, A. & FARR, A. Themajor surfaceglycoprotein of Trypanos oma cruzi amastigotesareligandsof thehuman serum mannose-binding protein. Infe ction & Immunity64:26492656, 1996. KANETO, H.; FUJII, J.; SEO, H. G.; KEIICHIRO, S.; MATSUOKA, T.; NAKAMURA, M.; TATSUMI, H.; YAMASAKI, Y.; KAMADA, T. & TANIGUCHI, N. Apoptotic cell death triggered by nitric oxide in pancreatic-cells. Diabetes , 44:733734, 1995. KAPPLER, J. W.; ROEHM, N. & MARRACK, P . T cell toleranceby clonal elimination in thethymus. Ce ll, 49:273-280, 1987. KIERSZENBAUM, F . Enhancement of resistanceand suppression of immunization against experimental Trypanos oma cruzi infection by Coryne bacterium parvum. Infe ction & Immunity, 12:1227-1229, 1975. KIERSZENBAUM, F . On evasion of Trypanos oma cruzi from the host immuneresponse. Lymphoproliferative responsesto trypanosomal antigensduring acuteand chronic experimental Chagas disease. Immunology , 44:641-648, 1981. KIERSZENBAUM, F . What areT-cell subpopulationsreally doing in Chagas disease?Paras itologyToday, 11:6-7, 1995. KIERSZENBAUM, F . & HOWARD, J. G. Mechanism of resistance against experimental Trypanos oma cruzi infection: the importanceof antibody forming in theBiozzi high and low responder mice. J ournal of Immunology, 116:1208-1211, 1976. KIERSZENBAUM, F . & PIENKOWSKY, M. M. Thymus-dependent control of host defensemechanismsagainst Trypanos oma cruzi infection. Infe ction & Immunity, 24:117-120, 1979. KIERSZENBAUM, F . & SZTEIN, M. B. Chagas diseaseAmerican Trypanosomiasis. In: Paras iticinfectionsand theimmune s ys te m. Academic PressInc., 1994. p.53-85. KIERSZENBAUM, F .; SZTEIN, M. B. & BELTZ, L. A. Decreased human IL-2 receptor expression due to a protozoan pathogen. ImmunologyToday, 10:129-131, 1989. KILBOURN, R. G.; KLOSTERGAARD J. & LOPEZ-BERESTEIN, G. Activated macrophagessecreteasoluble factor that inhibitsmitochondrial respiration of tumor cells. J ournal of Immunology, 133:2577-2581, 1984. KIM, Y. M.; BOMBECK, C. A. & BILLIAR, T. R. Nitric oxide asabifunctional regulator of apoptosis. Circulation Res e arch 84 253-256, 1998. KIPNIS, T. L.; JAMES, S. L.; SHER, A. & DAVID, J. R. Cell-mediated cytotoxicity to Trypanos oma cruzi . II. Antibodydependent killing of bloodstream formsby mouse eosinophilsand neutrophils. American J ournal of Tropical Medicine& Hygiene, 30: 47-53, 1981. KLEIN, E. Tumorsof skin. X- Immunotherapy of cutaneousand mucos al neoplas ms. J ournal of Me dicine , 68:900-911, 1968.
78
KOHL, S.; PICKENING, L. K.; FRANKEL, L. S. & YAEGER, R. G. Reactivation of Chagas diseaseduring therapy of acute lymphocytic leukemia. Cance r, 50: 827-828, 1982. KOJ, A. Definition and classification of acutephaseproteins. In: Theacutephas eres pons etoinjuryand infe ction. Amsterdan, New York, Oxford: Elsevier, 1984. p.139-144. KRAUTZ, G. M.; COUTINHO, M. G.; GALVO, L. M.; CANADO, J. R. & KRETTLI, A. U. S olubleantigensreleased by Trypanos oma cruzi trypomastigotesused in ELISA to detect curein chagasic patientsfollowing specific treatment. Re vis ta da Socie dadeBras ileira deMedicina Tropical 27:199-207, 1994. KRETTLI, A. U. Resposta imunehumoral na doenade Chagas. Inte rcincia, 8:374-382, 1983. KRETTLI, A. U. & BRENER, Z. Protectiveeffectsof specific antibodiesin Trypanos oma cruzi infections. J ournal of Immunology , 116:755-760, 1976. KRETTLI, A. U. & BRENER, Z. Resistance against Trypanos oma cruzi associated to anti-living trypomastigoteantibodies. J ournal of Immunology, 128:2009-2012, 1982. KRETTLI, A. U.; WEISZ-CARPINGTON, P . & NUSSENSZWEIG, R. S. Membrane bound antibodiesto bloodstream Trypanos oma cruzi in mice. Strain differencesin susceptibility to complement-mediated lysis. Clinical and Expe rimental Immunology, 37:416-423, 1979. KYEWSKI, B. A. Thymic nurse cells: possible sitesof T-cell selection. ImmunologyToday, 12:374-379, 1986. KYEWSKI, B. S. & KAPLAN, H. S. Lymphoepithelial interactionsin the mousethymus: phenotypic and kinetic studieson thymic nursecells. J ournal of Immunolgy , 128:2287-2294, 1982. LAFAILLE, J. J.; LINSS, J.; KRIEGER, M. A.; SOUTO-PADRN, T.; DE SOUZA, W. & GOLDENBERG, S. S trutureand expression of two Trypanos oma cruzi genesencoding antigenic proteinsbearing repetitiveepitopes. Mole cular & Bioche mical Paras itology, 35:127-136, 1989. LAGRANGE, P . H. & HURTEL, B. Theinfluenceof BCG vaccination on murineleprozy in C57 BL/6 and C3H mice. Annale s dImmunology Ins titutePas teur, 130C: 687-709, 1979. LAGRANGE, P . H. & MACKANESS, G. B. A stable form of delayed-type hypersensitivity. J ournal of Expe rime ntal Medicine , 141:82-96, 1975. LAGRANGE, P . H. & TRICKSTON, P . M. In vivoantitumor activity of variousformsof delayed-type hypersensibility in mice. Journal of theNational Cancer Ins titute, 62:429-436, 1979. LAGRANGE, P . H; TSIANG, H.; HURTREL, B. & RAVISSE, P . Delayed-typehypersensitivity to rabiesvirusin mice: Assay of activeor passive sensitization by thefootpad test. Infe ction & Immunity, 21:931-939, 1978. LASKY, L. A.; SINGER, M. S.; DOWBENKO, D.; IMAI, Y.; HENZEL, W.J.; GRIMLEY, C., FENNIE, C.; GILLETT, N.; WATS ON, S. R. & ROSEN, S. D. An endothelial ligand for L-selectin isanovel mucin-likemolecule. Ce ll, 69:927-938, 1992. LAUCELLA, S.; SALCEBO, R.; CASTAOS-VELEZ, E.; RIARTE, A.; DETITTO, E.H.; PATARROYO, M.; ORN, A. & ROTTENBERG, M.E. Increased expression and secretion of ICAM-1 during experimental infection with Trypanos oma cruzi . Paras iteImmunology , 18:227-239, 1996. LAWRENCE, M. B. & SPRINGER, T. A. Leukocytesroll on as electin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequis ite for adhesion through integrins. Cell, 65:859-873, 1991. LEENE, W.; DE WAAL MALEFIJT, R.; ROHOLL, P . J. M. & HOEBEN, K. A. Lymphocytedepletion in thymic nursecells: A tool to identify in situ lympho-epithelial complexeshaving thymic nursecellscharacteristics. Ce ll Tis s ueRe s e arch, 253:61-68, 1988. LEGRS, L. G.; POCHON, F .; BARRAY, M.; HEINRICH, P .C.; DELAIN, E. Human 2-macroglobulin asacytokine-binding plasmaprotein. AnnalsNew York Acade myof Sciences , 737:439-443, 1994. LEGUIZAMON, M. S.; CAMPETELLA, O.; RUS SOMANDO, G.; ALMIRON, M.; GUILLEN, I.; GONZALEZ CAPPA, S. M. & FRASCH, A. C. C. Antibodiesinhibiting Trypanos oma cruzi trans-sialidaseactivity in serafrom human infections. Journal of InfectiousDis e as e s , 170:1570-1574, 1994. LEIGUARDA, R.; RONCORONI, A.; TARATUTO, A.L.; JOS T, L.; BERTHIER, M.; NOGUES , M. & FREILIG, H. AcuteCNS infection by Trypanos oma c ruzi Chagas diseasein immunosupressed patients. Ne urology, 40:850-851, 1990. LEITE-DE-MORAES, M. C. tudede salte rationsthymiquese t du r pertoirede sce llule sT che z le ss ourisinfe ct e spar leTry panos oma cruzi, 1993. Ph.D. Thesis. Paris: UniversitParisV. LEITE-DE-MORAES, C.; HONTEBEYRE-JOSKOWICZ, M.; LEBOULENGER, F .; SAVINO, W.; DARDENNE, M. & LEPAULT, F . Studieson thethymusin Chagas disease. II. Thymocytesubset fluctuationsin Trypanos oma cruzi -infected mice: relationship to stress. Scandinavian J ournal Immunology, 33: 267-275, 1991.
79
LEITE-DE-MORAES, M. C.; HONTEBEYRIE-JOS KOWICZ, M.; DARDENNE, M. & SAVINO, W. Modulation of thymocyte subsetsduring acuteand chronic phasesof experimental Trypanos oma cruzi infection. Immunology, 77:95-98, 1992. LEITE-DE-MORAES , M. C.; MINOPRIO, P .; DY, M.; DARDENNE, M.; SAVINO, W. & HONTEBEYRIE-JOS KOWICZ, M. EndogenousIL-10 and IFN- production controlsthymic cell proliferation in miceacutely infected by Trypanos oma cruzi. Scandinavian J ournal Immunology , 39:51-58, 1994. LEMES RE, J. L.; AFCHAIN, D.; OROZCO, O.; LOYENS , M.; BRENIERE, F . S.; DES JEUX, P .; CARLIER, Y.; MARTIN, U.; NOGUEIRA-QUEIROZ, A.; LE RAY, D. & CAPRON, A. Specific and sensitiveimmunological diagnosis of Chagas diseaseby competitive antibody enzymeimmunoassay using aTrypanos oma cruzi -specific monoclonal antibody. Ame rican J ournal of Tropical Medicine& Hygie ne , 35:86-93, 1986. LEPOIVRE, M.; CHENAIS, B.; YAPO, A.; LEMAIRE, G.; THELANDER, L. & TENU, J. P . Alterationsof ribonucleotide reductaseactivity following induction of nitrite-generation pathway in adenocarcinomacells. J ournal of Biological Che mis try , 265:14143-14149, 1990. LES, W. C. & VAN VOORHIS, W. C. Review: nomenclatureand biologic significanceof cytokinesinvolved in inflammation and thehost immuneresponse. Journal of Infe ctiousDis eas e s , 172:1573-1580, 1995. LI, Y.; PEZZANO, M.; PHILP , D.; REID, V. & GUYDEN, J. Thymic nursecellsexclusively bind and internalizeCD4+CD8+ thymocytes. Ce llular Immunology, 140:495-506, 1992. LOPES, M. F . & DOSREIS, G. A. Trypanos oma cruzi -induced immunosuppression: Blockadeof costimulatory T cell responses in infected hostsdueto defectiveT cell receptor-CD3 functioning. Infection & Immunity , 62:1484-1488, 1994. LOPES, M. F . & DOSREIS, G. A. Trypanos oma cruzi -induced immunosuppression: selectivetriggering of CD4+T-cell death by theT-cell receptor CD3 pathway and not by the CD69 or Ly-6 activation pathway. Infection & Immunity , 64: 1559-1564, 1996. LOPES, M. F .; DA VEIGA, V. F .; SANTOS, A. R.; FONSECA, M. E. F . & DOSREIS, G. A. Activation-induced CD4+ T cell death by apoptosisin experimental Chagas disease. J ournal of Immunology, 154:744-752, 1995. LUZ, M. R. P .; VAN LEUVEN, F . & ARAJO-JORGE, T. C. Heterogenity on theplasmalevelsof two acutephaseproteinsin micefrom inbred strainsduring Trypanos oma cruzi infection. Paras itology Res earch, 80:439- 441, 1994. LUZ, M. R. M. P .; VAN LEUVEN, F . & ARAJO-JORGE, T. C. Heterogeneity on the synthesisof alpha-macroglobulinsin outbred Swissalbino miceacutely infected with Trypanos oma cruzi . Paras itologyRes earch, 81:662-667, 1995 McHARDY, N. Passive immunization of mice against Trypanos oma cruzi using convalescent mouse serum. Tropenmedizin Paras itologie, 28:195-201, 1977. MACKANESS, G. B. Theimmunological basisof acquired cellular resistance. J ournal of Expe rimental Me dicine , 120:105-120, 1964. MAJUMDER, S. & KIERSZENBAUM, F . Mechanismsof Trypanos oma cruzi -induced down-regulation of lymphocytefunction. Inhibition of transcription and expression of IL-2 receptor (p64IL-2R) and (p70IL-2R) chain moleculesin activated normal human lymphocytes. J ournal of Immunology, 156:3866-3874,. 1996. MARINHO, C. R.; D IMPERIO-LIMA, M. R.; GRISOTTO, M. G. & ALVAREZ, J. M. Influenceof acute-phaseparasiteload on pathology, parasitism, and activation of the immune system at the late chronic phase of Chagas disease. Infection & Immunity 67:308-318, 1999. MARTIN, U. O.; TAIBI, A.; LOYENS , M.; MAIDANA, C.; CORNETTE, J .; CANDOITI, C.; MARTELEUR, A.; AFCHAIN, D.; MARTY, B.; VELGE, P .; OAIS SI, M. A. & CAPRON, A. Trypanos omacruzi: IgM antibodiesto 84 kDapolypeptideepitopeasa pos s iblemarker of theacutephaseof human Chagas dis eas e. Me dic al S c ie nc eR e s e arch, 18:725-726, 1990. MARTINEZ, O. M.; GIBBONS, R. S.; GAROVOY, M. R. & ARONSON, F . R. IL-4 inhibitsIL-2 receptor expression and IL2-dependent proliferation of human cells. J ournal of Immunology, 144:2211-2215, 1990. MARTINS, G. A.; CARDOSO, M. G. A.; ALIBERTI, J. C. S. & SILVA, J. S. Nitric oxide-induced apoptotic cellsdeath in the acutephase of Trypanos oma cruzi infection in mice. ImmunologyLe tters63:113-120, 1998. MARTINS, G. A.; VIEIRA, L. Q.; CUNHA, F . Q. & SILVA, J. S. Gammainterferon modulatesCD95 (Fas) and CD95 ligand (Fas-L) expression and nitric oxide-induced apoptosisduring theacutephaseof Trypanos oma cruzi infection: apossiblerole in immune responsecontrol. Infection & Immunity67:3864-3871, 1999. MARTINS, M. S.; HUDSON, L.; KRETTLI, A. U.; CANADO, J. R. & BRENER, Z. Human and mouseserarecognizethe same polypeptide associated with immunological resistance to Trypanos oma cruzi infection. Clinical and Experimental Immunology 61:343-350, 1985.
80
MARTINS-FILHO, O. A.; PEREIRA, M. E.; CARVALHO, J. F .; CANADO, J. R. & BRENER, Z. Flow cytometry, anew approach to detect anti-live trypomastigote antibodiesand monitor theefficacy of specific treatment in human Chagas disease. Clinical Diagnos ticfor LaboratoryImmunology 2:569-573, 1995. MCCABE, R. E.; MEAGHER, S. G. & MULLINS, B. T. Endogenousinterferon, macrophage activation, and murine host defenseagainst acuteinfection with Trypanos oma cruzi . J ournal of Infe ctiousDis e as es , 163:912-915, 1991. MEDRANO-MERCATO, N.; LUZ, M. R. M. P .; CABELLO, P .; TAPIA, G. T.; VAN LEUVEN, F . & ARAJO-JORGE, T. C. Acute Chagas disease: plasma levels of -2-macroglobulin and C-reactiveprotein in children under 13 yearsin a high endemic area of Bolivia. J ournal of Tropical Pediatrics , 42:68-74, 1996a. MEDRANO-MERCATO, N.; LUZ, M. R. M. P .; TORRICO, F . T.; TAPIA, G. T.; VAN LEUVEN, F . & ARAJO-JORGE, T. C. Acutephase proteinsand serological profilesof chagasic children from an endemic areain Bolivia. Ame rican Journal of Tropical Medicineand Hygiene, 54:154-161, 1996b. MENESES, A. C. O.; ROCHA, A.; FERREIRA, M. S.; NETO, A. N.; TORQUATO Jr., G.; ALMEIDA, E. A.; METZE, K.; MACIEL Jr., J. A. & LOPES, E. R. AIDSand Chagas disease. In: Ne uropathologyInte rnational S cie ntificExchange , Niteroi, 1992. p. 2. MENGEL, J. O.; LANS, J. L.; ROSSI, M. M. O.; ROSSI, M. A.; SAVINO, W. & RIBEIRO DOSSANTOS, R. Anticardiac muscleautoreactivelymphocytesin micechronically infected with Trypanos oma cruzi bear theCD4 phemotype. Me mrias doIns tituto Os waldo Cruz, 83 (Suppl. I):167, 1988. MEYER ZUM BUSCHENFELDE, C.; CRAMER, S .; FLEISCHER, B.; FROS CH, S. Resis tanceto Trypanos omacruzi infection in micedoesnot necessarily correlatewith production of interferon-gammain vivo. Me dical and Microbiological Immunology (Berl) 187:107-113, 1998. MILANI, S. R. & TRAVASSOS, L. R. Anti--galactosyl antibodiesin chagasic patients. Possiblebiological significance. Brazilian Journal of Me dical and Biological Res earch, 21:1275-1278, 1988. MILLER, T. E.; MACKANESS, G. B. & LAGRANGE, P . H. Immunopotentiation with BCG. II. Modulation of theresponse to sheep red blood cells. Journal of theNational Cancer Ins titute , 51:1669-1676, 1973. MINOPRIO, P .; CURY-EL-CHEIKH, M.; ROSS, D.; COUTINHO, A.; EISEN, H. & HONTEBEYRIE-JOSKOWICS, M. Chagas disease: consequenceof unbalanced immune system. Me mriasdo Ins tituto Os waldo Cruz, 86 (Suppl. I):39-40, 1991. MINOPRIO, P .; CURY -EL-CHEIKH, M.; MURPHY , E.; HONTEBERYE-J OS KOWICS , M.; COFFMAN, R.; COUTINHO, A. & O GARRA, A. Xid-associated resistanceto experimental Chagas diseasein IFN--dependent. J ournal of Immunolology , 151:4200-4208, 1993. MINOPRIO, P .; EISEN, H.; JOS KOWICZ, M.; PEREIRA, P . & COUTINHO, A. S upres sion of polyclonal antibody production in Trypanos oma cruzi -infected mice by treatment with anti-L3T4 antibodies. J ournal of Immunology , 139:545-550, 1987. MINOPRIO, P .; ITOHARA, S.; HEUSSER, C.; TONEGAWA, S. & COUTINHO, A. Immunobiology of murineTrypanos oma cruzi infection: the predominance of parasite-nonspecific responsesand the activation of TCRI T cells. Immunological Reviews , 112:183-207, 1989. MINOPRIO, P .M.; COUTINHO, A.; J OS KOWICZ, M.; D IMPERIO LIMA, M.R. & EIS EN, H. P olyclonal lymphocytere s pons esto murineTrypanos o mac ruzi infection. II. CytotoxicT lymphocytes .S c andinavian J ournal of Immunology , 24: 669-679, 1986b. MINOPRIO, P .M.; EISEN, H.; FORNI, L.; D IMPERIO LIMA, M.R.; JOSKOWICZ, M. & COUTINHO, A. Polyclonal lymphocyteresponsesto murineTrypano s o macruzi infection. I. Quantitation of both T- and -B-cell responses. S candinavian J ournal of Immunology, 24:661-668, 1986a. MONTON, V.; FURUZAWA-CARBALLEDA, J.; ALEJANDRE-AGUILAR, R.; ARANDA-FRAUSTRO, A.; ROSALESENCINA, J.L. & REYES, P . A. American trypanosomosis: in s itu and generalized featuresof parasitism and inflammation kineticsin amurine model. Expe rimental Paras itology , 83:267-274, 1996. MONTEVERDE, D.A.; TARATUTO, A.L. & LUCATELLI, N. Meningoencefalite chagsica aguda en pacientes imunossuprimidos. Re vis ta Neurologica Argentina, 2:260-266, 1976. MOSMANN, T. R. & SAD, S. Theexpanding universeof T-cell subsets: Th1, Th2 and more. ImmunologyToday, 17:138-146, 1996. MOSMANN, T. R.; CHERWINSKI, H.; BOND, M. W.; GIEDLIN, M A. & COFFMAN, R.L. Two typesof murinehelper T cell clone. I. Definition according to profilesof lymphokine activitiesand secreted proteins. J ournal of Immunology, 136: 2348-2355, 1986. MUNIZ, J. & SANTOS, M. C. F . Heterophile antibodiesin American trypanosomiasis. O Hos pital, 38:601-610, 1950.
81
NABORS, G. S. & TARLETON, R. L. Differential control of IFN- and IL-2 production during Trypanos oma cruzi infection. J ournal of Immunology , 146:3591-3598, 1991. NGUYEN, T.; BRUNSON, D.; CRESPI, C. L.; PENMAN, B. W.; WISHNOK, J. S. & TANNENBAUM, S. R. DNA damage and mutation in human cellsexposed to nitric oxidein vitro. Proce edingsof theNational Acade myof S cie nceUS A, 89: 30303034, 1992. NICKOLOFF , B. J. Role of Interferon- in cutaneous trafficking of lymphocytes with emphasis on molecular and cellular adhesion events. Archivesof Dermatology, 124:1835-1843, 1988. NOGUEIRA, N. & COHN, Z.A. Trypanos oma cruzi : in vitroinduction of macrophagemicrobicidal activity. J ournal of Experimental Medicine , 148:288-300, 1978. NOGUEIRA, N.; GORDON, S. & COHN, Z. Trypanos oma cruzi : theimmunological induction of macrophageplasminogen activator requiresthymus-derived lymphocytes. Journal of Expe rime ntal Medicine, 146:172-183, 1977a. NOGUEIRA, N.; GORDON, S. & COHN, Z. Trypanos oma cruzi : modification of macrophage function during infection. Journal of Expe rimental Medicine, 146: 157-171, 1977b. NOGUEIRA, N.; ELLIS, J.; CHAPLAN, S. & COHN, Z. Trypanos oma cruzi : in vivoand in vitro correlation between T-cell activation and susceptibility in inbred strainsof mice. Expe rimental Paras itology, 51:325-334, 1981. NORRIS, K. A.; BRADT, B.; COOPER, N. R. & SO, M. Characterization of aTrypanos oma cruzi C3 binding protein with functional and geneticsimilaritiesto thehuman complement regulatory protein, decay-acceleratingfactor. J ournal of Immunology 147:2240-2247, 1991. NORRIS, K. A.; GALVO, L. M. C.; SCHRIMPF , J. E.; CANADO, J. R. & KRETTLI, A. U. Humoral immuneres ponseto the Trypanos oma cruzi complement regulatory protein asan indicador of parasitologic clearancein human Chagas disease. Infe ction & Immunity, 62:4072-4074, 1994. ODD, D.; CASANOVA, M.; ACUNA, G.; BALESTEROS, J. & MORALES, B. Acute Chagas disease, trypanosomas is americana, in acquired immunodeficiency syndrome: report of two cases. Human Pathology, 23:41-44, 1992. OHMICHI, Y.; NOMOTO, K.; YAMADA, H. & TAKEYA, K. Relationship among differentiated T-cell sub-populations. I Dissociated development of tuberculin-typehypersensibility, Jones-Motehypersensibility and activation of helper function. Immunology, 31:101-110, 1976. OKABE, K.; KIPNIS, T. L.; CALICH, V. L. G. & DIASDA SILVA, W. Cell-mediated cytotoxicity to Trypanos oma cruzi. I. Antibody dependent cell mediated cytotoxicity to trypomastigotes bloodstream forms. Clinical Immunology & Immunopathology, 46:344-353, 1980. OLIVEIRA-DOS-SANTOS, A. J. Interaescelulareshe terotpicasdurantea diferenciao intratmica delinfcitosT: e s tudoem camundongosnocautes , 1997. Tese de Doutorado. Programa de Biologia Celular e Molecular, Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz. ORTIZ-ORTIZ, L.; P ARKS , D. E.; RODRIGUEZ, M. & WEIGLE, W. O. P olyclonal B lymphocyteactivation duringTrypanos oma cruzi infection. J ournal of Immunology, 124:121-126, 1980. OUAISSI, M. A. Roleof RDG sequencein parasite adhesion to host cells. Paras itologyToday , 4:169-173, 1988. OUAISSI, M. A.; CORNETTE, J.; AFCHAIN, D.; CAPRON, A.; GRAS-MASSE, H. & TARTAR, A. Trypanos oma cruzi infection inhibited by peptidesmodeled from afibronectin cell attachment domain. Science, 234:603-306, 1986. PARANHOS-BACALLA, G. S.; SANTOS, M. R. M.; COTRIM, P . C.; RASSI, A.; JOLIVET, M.; CAMARGO, M. E. & DA SILVEIRA, J. F . Detection of antibodiesin serafrom Chagas diseasepatientsusing aTrypanos oma cruzi immunodominant recombinant antigen. Paras iteImmunology, 16:165-169, 1994. P ATRUCO, A.; CERIS OLA, J . A.; MICHEL, M.; CHIALE, P .; ALVAREZ, M. & S EGURA, E. L. Flagellar antigensand theleucocyte migration-inhibition test in Chagaspatients. Trans actionsof theRoyal S oc ie tyof Tropical Me dic ine& Hyg ie ne , 72:425-426, 1978. PELEMAM, R.; WU, J.; FARGEAS, C. & DELESPESSE, G. Recombinant IL-4 suppressestheproduction of IFN- by human mononuclear cells. Journal of Experimental Medicine , 170:1751-1756, 1989. PENNINGER, J. & WICK, G. Thymic nursecell lymphocytesreact against self major histocompatibility complex. European J ournal of Immunology, 22:79-83, 1992. PEREIRA, N. M.; TIMM, S. L.; GONALVESDA COSTA, S. C.; REBELLO, M. & DE SOUZA, W. Trypanos oma cruzi : isolation and flagellar fractions. Expe rime ntal Paras itology , 46:225-234, 1978. PETRY, K.; SCHOTTELIUS , J. & BALTZ, T. H. Characterization of a19.000 mol. wt. flagellum-specificprotein of Trypanos oma cruzi , Trypanos oma dionis ii and Trypanos oma ve s pe rtilionisby monoclonal antibody. Paras itologyRe s e arch, 73:180-181, 1987.
82
PHILP , D.; PEZZANO, M.; LI, Y.; OMENE, C.; BOTO, W. & GUYDEN, J. The binding, internalization, and release of thymocytesby thymic nurse cells. Ce llular Immunolgy, 148:301-315, 1993. PIMENTA DE MELLO, R. A new method for detection of cancer cellsin peripheral blood using the Bertalanffy sfluorochrome method. Acta Cytologica, 7:62-65, 1963. PIRAS, M. P .; DE RODRIGUEZ, O. O. & PIRAS, R. Trypanos oma cruzi antigenic composition of axonemasand flagellar membranesof epimastigotesculturein vitro. Expe rime ntal Paras itology, 51:59-73, 1981. PIZZI, T.; CROIZET, V. A.; SMOK, G. & DIAS, M. Enfermedad deChagasen un pacientecon transplanterenal y tratamiento immunosupresor. Re vis ta Medica do Chile , 110:1207-1211, 1982. POWELL, M. R.; MORGAN, J.; GUARNER, J. & COLLEY, D.G. CytokinemRNA levelsin theheartsof inbred micethat develop different degreesof cardiomyopathy during infection with Trypanos omacruzi. Paras iteImmunology20:463-471,1998. REED, S. G. In vivoadministration of recombinant IFN- inducesmacrophage activation, and preventsacute disease, immune suppression, and death in experimental Trypanos oma cruzi infections. J ournal of Immunology, 140: 4342-4347, 1988. REED, S.G. Immunology of Trypanos oma cruzi infections. Che mical Immunology70:124-143, 1998. REED, S. G.; BROWNELL, C. E.; RUSSO, D. M.; SILVA, J. S.; GRABSTEIN, K. H. & MORRISSEY P . J. IL-10 mediates susceptibility to Trypanos oma cruzi infection. J ournal of Immunology, 153:3135-3140, 1994. REED, S. G.; NATHAN, C. F .; PIHL, D. L.; RODRICK, S. P .; SHANEBECK, K.; CONLON, P . J. & GRABSTEIN, K. H. Recombinant granulocyte/macrophagecolony-stimulating factor activatesmacrophagesto inhibit Trypanos oma cruzi and release hydrogen peroxide. Journal of Expe rimental Medicine , 166:1734-1746, 1987. REED, S. G.; PIHL, D. L. & GRABSTEIN, K. H. Immunedeficiency in chronicTrypanos oma cruzi infection. Recombinant IL1 restoresTh function for antibody production. J ournal of Immunology , 142:2067-2071, 1989. REVELLI, S.; GOMEZ, L.; WIETZERBIN, J.; BOTTASSO, O. & BASOMBRIO, M. A. Levelsof tumor necrosisfactor alpha, gamma interferon, and interleukins 4,6, and 10 as determined in mice infected with virulent or attenuated strains of Trypanos oma cruzi. Paras itologyRes earch 85:147-150, 1999. RIBEIRO-DOS-SANTOS, R.; ROSSI, M. A.; LAUS, J. L.; SANTANA-SILVA, J.; SAVINO, W. & MENGEL, J. Anti-CD4 abrogatesrejection and reestablisheslong-term tolerance to syngeneic newborn heartsgrafted in mice chronically infected with Trypanos oma cruzi . J ournal Expe rime ntal Me dicine , 175:29-39, 1992. ROCHA, A.; MENEZES, A. C.O.; S ILVA, A. M.; FERREIRA, M. S.; NISHIOKA, S. A.; BURGARELLI, M. K. N.; ALMEIDA, E.; TURCATO J r, G.; METZE, K. & LOPES , E. Pathology of patientswith Chagas diseaseand acquired immunodeficiency syndrome. American J ournal of Tropical Me dicine& Hygiene , 50:261-268, 1994. ROCKETT, K. A.; AWBURN, M. M.; ROCKETT, E. J.; COWDEN, W. B. & CLARK, I.A. Possibleroleof nitric oxidein malarial immunosuppression. Paras iteImmunology, 16:243-249, 1994. ROMAA, C. Contribuio ao conhecimento dapatogeniadatripanosomoseamericana: perodo inicial deinfeco. Me mriasdo Ins titutoOs waldo Cruz, 39:253-264, 1943. ROSEMBERG, S.; CHAVES, C. J.; HIGUSHI, M. L.; LOPES, M. B. S.; CASTRO, L. H. M. & MACHADO, L. R. Fatal meningoencephalitiscaused by reactivation of Trypanos oma cruzi infection in apatient with AIDS. Ne urology , 42:640-642, 1992. ROTTENBERG, M. E.; BAKHIET, M.; OLSSON, T.; KRIS TENS SON, K.; MAK, T.; WIGZELL, H. & ORN, A. Differential susceptibilitiesof micegenomically deleted of CD4 and CD8 to infectionswith Trypanos oma cruzi and Trypanos oma bruce i. Infection & lmmunity , 61:5129-5133, 1993. RUIZ, A. M.; ESTEVA, M.; CABEZA MECKERT, P . & LAGUENS, M. Protective immunity and pathology induced by inoculation of mice with different subcellular fractionsof Trypanos oma cruzi , ActaTropica, 42:299-309, 1985. RUSSO, M. & STAROBINAS, N. Macrophageactivation and resistanceto Trypanos oma cruzi infection. Re s e arch on Immunology , 142:144-146, 1991. RUSSO, M.; STAROBINAS, N.; MINOPRIO, P .; COUTINHO, A. & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Parasitic load increasesand myocardial inflammation decreases in Trypanos oma cruzi infected mice after inactivation of helper T cells. AnnalesdImmunologieIns titutePas teur, 139:225-236, 1988. RUS SO, M.; S TAROBINAS , N.; RIBEIRO-DOS -SANTOS , R.; MINOPRIO, P .; EIS EN, H. & HONTEBEYRIE-J OS KOWICZ, M. Susceptiblemicepresent higher macrophageactivation than resistant miceduring infectionswith myotropic strainsof Trypanos oma cruzi . Paras iteImmunology, 11:385-395, 1989. SALOMON, J. C. & CREAM-GOLDBERG, N. Treatment of primary methylcholanthreneinduced tumorsby intramoral BCG. In: Israel, Lagrange & S alomon, Cance r Immunologyand Paras iteImmunology, INSERM, 97:255-265, 1980.
83
SANDERSON, C. J.; LOPEZ, A. F . & BUNN MORENO, M. M. Eosinophilsand not lymphoid K cellskill Trypanos oma cruzi epimastigotes. Nature , 268: 340-341. SANTOS-LIMA, E. C. & MINOPRIO, P . Chagas disease is attenuated in mice lacking gamma deltaT cells. Infection & Immunity 64:215-221, 1996. SARIH, M.; SOUVANNAVONG, V. & ADAM, A. Nitric oxidesynthaseinducesmacrophagedeath by apoptosis. Bioche mical Biophys ical Res earch Communication, 191:503-508, 1993. SAVINO, W. The thymic microenvironment in infectiousdiseases. Memriasdo Ins tituto Os waldoCruz, 85:255-260, 1990. SAVINO, W.; LEITE DE MORAES, M. C.; HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. & DARDENNE, M. S tudieson thethymus in Chagas disease. I. Changesin thethymic microenvironment in miceacutely infected with Trypanos oma cruzi . Europe an J ournal of Immunology, 19:1727-1733, 1989. SAVINO, W.; LEITE DE MORAES, M. C.; SILVA BARBOSA, S. D.; FONSECA, E. C.; COTTA DE ALMEIDA, V. & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Isthethymusa target organ in infectiousdiseases. Me mriasdoIns tituto Os waldo Cruz, 87 (Suppl. V):73-78, 1992. SAVINO, W.; VILLA VERDE, D. M. S. & LANNESVIEIRA, J. Extracellular matrix proteinsin intrathymicT cell migration and differentiation?ImmunologyToday, 14:158-161, 1993. SCHARFSTEIN, J.; BARCINS KI, M. A. & LEON, L. L. Indication of theacute-phaseprotein serum amyloid Pin experimental Chagas disease. Infection & Immunity , 35:46-51, 1982. SCHLAEPPI, K.; DEFLORIN, J. & SEEBECK, T. The major component of the paraflagellar rod of Trypanos oma bruce i isa helical protein that isencoded by two identical, tandemly linked genes. J ournal of Cell Biology 109(4 Pt 1):1695-1709, 1989. SCHLEIFER, K. W. & MANSFIELD, J. M. Suppressor macrophagesin African trypanosomiasisinhibit T cell proliferative responsesby nitric oxide and prostaglandins. J ournal of Immunology, 151:5492-5503, 1993. SCHMUNIS, G. A.; CAPPA, S. M. G.; TRAVERSA, O. C. & JANOVSKY, K. The effectsof immuno-depression due to neonatal thymectomy on infectionswith Trypanos oma cruzi in mice. Trans actionsof theRoyal S ociety of Tropical Me dicine& Hygiene, 65:89-94, 1971. SCOTT, M T. Delayed hypersensitivity to Trypanos oma cruzi in mice: specific suppressor cellsin chronic infection. Immunology 44:409-417, 1981. SCOTT, M. T. & GOSS-SAMPSON, M. Restricted IgG isotypeprofilesin Trypanos oma cruzi infected miceand Chagas disease patients. Clinical Experimental Immunology, 58:372-379, 1984. SEGURA, E. L.; CURA, E. N.; PAULONE, I.; VAZQUEZ, C. & CERISOLA, J. A. Antigenic makenp of subcellular fractions of Trypanos oma cruzi . J ournal of Protozoology, 21:571-574, 1974. SEGURA, E. L.; VAZQUEZ, C.; BRONZINA, A.; CAMPOS, J. M.; CERISOLA, J. A. & GONZALEZ CAPPA, S. M. Antigensof thesubcellular fractions of Trypanos oma cruzi . II - Flagellar and membrane fraction. J ournal of Protozoology, 24:540-543, 1977. SICHER, C. S.; VAZQUEZ, M. A. & LU, C. Y. Inhibition of macrophageIaexpression by nitric oxide. J ournal of Immunology, 153:1293-1300, 1994. SILVA, A. C.; ESPINOZA, A. G.; TAIBI, A.; OUAISSI, A.; MINOPRIO, P. A 24,000 MW Trypanos oma cruzi antigen isaB-cell activator. Immunology94:189-196, 1998. SILVA, J. S.; MORRISSEY, P . J.; GRABSTEIN, K. H.; MOHLER, K M.; ANDERSON, D. & REED, S. G. IL-10 and IFN- regulation of experimental Trypanos oma cruzi infection. J ournal of Expe rime ntal Me dicine , 175169-174, 1992. SILVA, J. S.; TWARDZIK, D. R. & REED, S. G. Regulation of Trypanos oma cruzi infectionsin vitro and in vivo by TGF-. Journal of Experime ntal Me dicine , 174: 539-545, 1991. SILVA, J. S.; VESPA, G. N.; CARDOSO, M. A.; ALIBERTI, J. C. & CUNHA, F . Q. TNF-amediatesresistanceto Trypanos oma cruzi infection in miceby inducing nitric oxideproduction in infected IFN--activated macrophages. Infe ction & Immunity , 63:4862-4867, 1995. SILVERSTEIN, A. M. A his tory of immunology. New Y ork: Acad. Press, 1989. p. 269. SNAPPER, C. M. & MOND, J. J. A model for induction of T-cell independent humoral immunity in responseto polysaccharide antigens. J ournal of lmmunology , 157: 2229-2233, 1996. SPINELLA, S.; LIEGEARD, P . & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Predominanceof IgG2ain nons pecifichumoral response during experimental Chagas disease. Experimental Paras itology, 74:6-56, 1992.
84
SPINELLA, S.; MILON, G. & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. A CD4+ Th2 cell line isolated from mice chronically infected with Trypanos oma cruzi inducesIgG2 polyclonal responsein vivo. Europe an J ournal of Immunolology, 20:10451051, 1990. SPRENT, J.; LO, D.; GAO, E.-K. & RON, Y. T cell selection in the thymus. Immunological Re views , 101:73-190, 1988. STADNYK, A. & GAULDIE, J. Theacute phaseprotein responseduring parasitic infection. ImmunologyToday 12:A7-A12, 1991. STAROBINAS, N.; RUSSO, M.; MINOPRIO, P . & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Is TNF- involved in early susceptibility of Trypanos oma cruzi -infected C3H/Hemice?Res earch in Immunology, 142:177-122, 1991. STEEL, D. M. & WHITEHEAD, A. S. Themajor acutephasereactants: C-Reactiveprotein, serum amyloid P component and serum amyloid A protein. ImmunologyToday , 15:81-87, 1994. STEFANI, M. M. A.; MLLER, I. & LOUIS, J. Le is hmania major-specific CD8+T cellsareinducersand targetsof nitric oxide produced by parasitized macrophages. European J ournal of Immunology, 24:746-752, 1994. STERNBERG, J. & MCGUIDAN, F . Nitric oxide mediates suppression of T cell responses in murine Trypanos oma brucei infection. European J ournal of Immunology, 22:2741-2744, 1992. STOUT, R. D. & BOTTOMLY, K. D. Antigen specific activation of effector macrophagesby IFN-producing Th1. T cell clones. Failure of IL-4-producingTh2. T cell clonesto activate effector function in macrophages. J ournal of Immunology, 142:760-765, 1989. SZARFMAN, A., TERRANOVA, V. P ., RENNARD, S. I., FOIDART, J-M., LIMA, M. F ., S CHEINMAN, J. ., MARTIN, G. R. Antibodiesto laminin in Chagas disease. J ournal of Expe rime ntal Me dicine155:1161-1171, 1982. TAIBI, A.; GUEVARA-ESPINOZA, A.; SCHONECK, R.; YAHIAOUI, B. & OUAISS I, A. Improved specificity of Trypanos oma cruzi identification by polymerasechain reaction using an oligonucleotidederived from theamino-terminal sequence of a Tc24 protein. Paras itology 111:581-590, 1995.; errata em Paras itology, 112:437,1996. TAKEHARA, H. A.; PERINI, A.; DA SILVA, M. H. & MOTA, I. Trypanos oma cruzi : role of different antibody classes in protection against infection in themouse. Journal of Experime ntal Me dicine , 52:137-146, 1981. TAKLE, G. B. & HUDSON, L. Autoimmunity and Chagas disease. Curre nt Topicsin Microbiology& Immunology, 145:79-92, 1988. TAMBOURGI, D. V.; KIPNIS, T. L. & DIASDA SILVA, W. Trypanos oma cruzi : antibody-dependent killing of bloodstream trypomastigotesby mousebonemarrow-derived mast cell and by mastocytoma cells. Experimental Paras itology, 68:192201, 1989. TANAKA, Y.; ADAMS, D. H. & SHAW, S . Proteoglycanson endothelial cellspresent adhesion-inducing cytokinesto leukocytes. ImmunologyToday, 14: 111-115, 1993. TANOWITZ, H. B.; KIRCHHOFF , L. V.; SIMON, D.; MORRIS, S. A.; WEISS, L. M. & WITTNER, M. Chagas disease. Clinical Microbiology Re vie w, 5: 400-419. TAPIA, F . J., CCERES-DIFFMAR, G. & SNCHEZ, M. A. 1994. Inadequate epidermial homing leadsto tissuedamagein human cutaneosleishmaniasis. ImmunologyToday, 15:160-165, 1992. TARLETON, R. L. Tumor necrosisfactor cachectin. Production during experimental Chagas disease. Clinical Expe rime ntal Immunology, 73:186-190, 1988. TARLETON, R.L. Depletion of CD8+ T cellsincreasessusceptibility and reversesvaccine-induced immunity in miceinfected with Trypanos oma cruzi . J ournal of Immunology , 144:717-724, 1990. TARLETON, R.L. Regulation of immunity in Trypanos oma cruzi infection. Experime ntal Paras itology, 73:106-109, 1991. TARLETON, R.L. Therole of T cellsin Trypanos oma cruzi infection. Paras itologyToday, 1:7-9, 1995. TARLETON, R. L.; KOHLER, B. H.; LATOUR, A. & POSTAN, M. Susceptibility of 2-microglobulin-deficient miceto Trypanos oma cruzi infection. Nature , 356:338-340, 1992. TARLETON, R. L.; SUN, J.; ZHANG, L. & POSTAN, M. Depletion of T-cell subpopulations results in exacerbation of myocarditisand parasitism in experimental Chagas disease. Infection & Immunity, 62:1820-1829, 1994. TRUYENS, C.; ANGELO-BARRIOS, A.; TORRICO, F .; VAN DAMME, J.; HEREMANS, H. & CARLIER, Y. Interleukin6 production in miceinfected with Trypanos oma cruzi : effect of itsparadoxical increaseby anti-IL-6 monoclonal antibody treatment on infection and acute-phase and humoral response. Infection & Immunity , 62:692-696, 1994. TRUYENS, C.; RIVERA, M. T.; OUASSI, A. & CARLIER, Y. High circulating levelsof fibronectin and antibodiesagainst its RDG adhesion siteduring mouseTrypanos oma cruzi infection: relation to survival. Expe rime ntal Paras itology , 80 499-506, 1995.
85
UMEKITA, L. F .; TAKEHARA, H. A. & MOTA, I. Role of theantibody Fc in theimmune clearance of Trypanos oma cruzi . Immunological Le tters , 17:85-89, 1988. VANDEKERCKHOVE, F .; DARJI, A.; RIVERA, M. T.; CARLIER, Y.; VRAY, B.; BILLIAU, A. & DE BAETSELIER, P . Modulation of T-cell responsiveness during Trypanos oma cruzi infection: analysisin different lymphoid compartments. Paras iteImmunology, 16:77-85, 1994. VAN DEWIJ NGAERT, F .P .; KENDALL, M. D.; S CHUURMAN, H.-J .; RADEMAKERS , L. H. P . M. & KATER, L. Heterogeneity of epithelial cellsin thehuman thymus. An ultrastructural study. Ce ll Tis s ueRe s e arc h, 237:227-237, 1984. VAN VLIET, E.; MELIS, M. & EWIJK, W. V. Immunohistology of thymic nursecells. Ce llular Immunology, 87:101-109, 1984. VESPA, G. N. R.; CUNHA, F . Q. & SILVA, J . S. Nitric oxideisinvolved in control of Trypanos oma cruzi -induced parasitemiaand directly kills the parasite in vitro. Infection & Immunity , 62:5177-5182, 1994. VILALTA, F .; ZHANG, Y.; BIBB, K. E.; KAPPES, J. C. & LIMA, M. F . Thecysteine-cysteinefamily of chemokinesRANTES, MIP-1 and MIP-1 inducetrypanocydal activity in human macrophagesvianitric oxide. Infe ction & Immunity66:46904695, 1998. VILLA-VERDE, D. M. S.; MELLO COELHO, V.; LAGROTA-CANDIDO, J.; CHAMMAS, R. & SAVINO, W. Thethymic nursecell complex: an in vitro model for extracellular matrix-mediated intrathymic T cell migration. Brazilian J ournal of Me dical Biology Res earch, 28:2259, 1995. VON BOEHMER, H. & KISIELOW, P . Lymphocytelineagecommitment: instruction ve rs usselection. Ce ll, 73:207-208, 1993. VON BOEHMER, H.; SWAT, W. & KISIELOW, P . Positiveselection of immature T cells. Immunological Re views , 135:67-79, 1993. WEKERLE, H. & KETELSEN, U-P. Thymic nursecells-Ia-bearing epithelium involved in T-lymphocyte diferentiation? Nature, 283:402-404, 1980. WICK, G. & OBERHUBER, G. Thymic nurse cells: aschool for alloreactiveand autoreactivecortical thymocytes?European J ournal of Immunology, 16:855-858, 1986. WICK, G.; RIEKER, T. & PENNINGER, J. Thymic nursecells: asitefor positives election and differentiation of T cells. Curre nt Topicsin Microbiology & Immunology, 173:99-105, 1991. WIRTH, J. J. & KIERSZENBAUM, F . Fibronectin enhancesmacrophageassociation with invasiveformsof Trypanos oma cruzi. J ournal of Immunology , 133:460-464, 1984. WIRTH, J. J. & KIERSZENBAUM, F . Recombinant tumor necrosisfactor enhacesmacrophagedestruction of Trypanos oma cruzi in the presenceof bacterial endotoxin. J ournal of Immunology, 141:286-288, 1988. WRIGHTSMAN, R.; KRASS NER, S . & WATSON, J. Genetic control of responsesto Trypanos oma cruzi in mice: multiplegenes influencing the parasitemia and survival. Infection & Immunity , 36:637-644, 1982. WU, L.; SCOLLAY, R.; EGERTON, M.; PEARSE, M.; SPANGRUDE, G. J. & SHORTMAN, K. CD4 express ed on earlies t Tlineageprecursor cellsin the adult murine thymus. Nature, 349:71-74, 1991. ZHANG, L. & TARLETON, R. Characterization of cytokineproduction in murine Trypanos oma cruzi infection by in s itu immunohistochemistry: lack of dissociation between susceptibility and type2 cytokine production. European Journal of Immunolology , 26:102-109, 1996.
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Hormnios na Doena de Chagas
Captulo 5
Hormnios n a Doena de Ch a g as na
5.1
Sistema Adrenrgico
Mecia M. Oliveira
Neste captulo iremos discutir o conhecimento atual, que resulta de estudos em pacientes e em modelos experimentais, sobre a participao do sistema adrenrgico na etiopatogenia da doena de Chagas. Este um tpico controverso, que vem se desenvolvendo desde o reconhecimento desta doena como uma entidade nosolgica diversa de outras sndromes. A literatura especializada neste assunto muito vasta, sendo impossvel mencion-la em sua totalidade. Sugerimos para consulta duas excelentes revises (PAHO, 1994; Rassi, 1995). O consenso atual sobre a etiopatogenia desta doena que esta o resultado multifatorial da infeco pelo Trypanosoma cruzi e da reao do paciente afetado. O sistema adrenrgico (simptico) e o sistema colinrgico (parassimptico), formam o sistema nervoso autnomo, tambm chamado sistema nervoso visceral, vegetativo ou involuntrio. Sua representao anatmica consiste de gnglios e plexos que provm a enervao do corao, vasos sangneos, glndulas, outras vsceras e msculo liso. Os dois sistemas, atravs de seus mediadores qumicos exercem funes opostas, regulando as atividades de estruturas que no esto sob controle voluntrio, funcionando abaixo do nvel da conscincia, como respirao, circulao, digesto, temperatura corporal, metabolismo, etc. Como Claude Bernard enfatizou, a constncia do meio interno, a homeostase de um organismo principalmente controlada pelo sistema nervoso autnomo (Mello-Aires, 1991). Alm dos efeitos farmacodinmicos, a adrenalina (mediador qumico adrenrgico) e seus congneres produzem uma gama de efeitos metablicos. Para que a adrenalina exera suas funes, existe uma bem orquestrada srie de reaes em que, primeiramente, este neurotransmissor reconhecido pelo seu receptor especfico ao nvel da membrana da clula-alvo, iniciando uma cascata de eventos em que o sinal qumico extracelular transduzido para o interior da clula numa complexa cascata de reaes. Os receptores para a adrenalina so diversos em sua estrutura e conferem especificidade funcional cascata de sinalizao, utilizando diferentes segundos-mensageiros celulares. Por exemplo, os receptores do tipo -adrenrgicos tm o AMP cclico (cAMP) como segundo mensageiro celular (Sutherland, 1972). Esta funo, nos receptores -adrenrgicos, exercida por inositoltrifosfato e diacilglicerol (Nishizuka, 1992; Berridge, 1993). Em todos os casos, estes compostos estimulam proteno-quinases, que ao fosforilar protenas do acervo de cada clula, provocam os efeitos metablicos e farmacodinmicos das catecolaminas (Pelech, 1993).
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5.1.1 Alteraes do Sistema Adrenrgico em Pacientes Chagsicos

Chagas & Villela (1922) observaram alteraes nos batimentos cardacos de pacientes chagsicos; talvez este tenha sido o comeo da teoria do comprometimento do sistema nervoso autnomo na doena da Chagas. O comprometimento adrenrgico na cardiopatia chagsica foi postulado a partir do reconhecimento da desnervao dos gnglios colinrgicos cardacos. Com esta destruio haveria um desequilbrio do sistema nervoso autnomo cardaco, com predominncia relativa do sistema simptico, que atuando sem o necessrio antagonismo do sistema parassimptico, submeteria a fisiologia cardaca a um ritmo de trabalho antieconmico. Este postulado parte da teoria da desnervao desenvolvida por Kberle (1958, 1968, 1970), a partir de achados antomopatolgicos, que explicariam: as vrias manifestaes clnicas da doena, a cardiopatia, o megaesfago e o megaclon. Outra interpretao do aumento dos nveis plasmticos de substncias adrenrgicas em pacientes chagsicos (Iosa et al., 1989) seria a de que na doena de Chagas haveria um bloqueio dos receptores adrenrgicos, resultando em elevao das concentraes plasmticas neurotransmissoras, produzindo desnervao autonmica (Iosa et al., 1990). A patologia da cardiopatia chagsica mostra, no estgio inicial, alteraes eletrocardiogrficas representadas por graus discretos de retardo da condio trio-ventricular ou no ramo direito, anormalidades da repolarizao ventricular e ocorrncia de extra-sstoles ventriculares unifocais, que se desenvolvem, na cardiopatia crnica, para graves e complexas alteraes no eletrocardiograma. Esta fase se encontra associada com a grande deteriorizao do miocrdio, geralmente progressiva, com reduo importante de clulas cardacas e diminuio progressiva da funo contrtil, por excessiva distenso das clulas remanescentes. Finalmente a contrao do miocrdio se v limitada por extensas reas de fibrose (Laranja et al., 1956; Dias, 1989; Andrade & Andrade, 1993). Contudo, o mecanismo preciso que produz essa destruio est ainda sujeito a controvrsias. Outros estudos sugerem a presena de mecanismos imunolgicos que tambm produziriam leses no sistema nervoso autnomo (Teixeira et al., 1975; Ribeiro dos Santos & Hudson, 1981; Petry & Van Voorhis, 1991). Uma interessante reviso sobre este assunto foi escrita por Brener & Krettli (1990). Dentro deste contexto, Borda et al. (1984) isolaram um anticorpo especfico contra receptores -adrenrgicos de soro de pacientes chagsicos. O mesmo grupo mostrou que este anticorpo pode se ligar especificamente a receptores -adrenrgicos no corao de cobaios. Alm do mais, pode interagir com o complexo receptor-adenilato ciclase, induzindo a atividade desta enzima e ento simulando os efeitos biolgicos das catecolaminas. Posteriormente, o mesmo grupo (Pascual et al., 1987) mostrou que esta imunoglobulina produz um aumento na contratilidade do miocrdio, com um aumento paralelo ao nvel de cAMP e modulao das protenas transportadoras de ons. Eles tambm mostraram que os efeitos so inibidos por bloqueadores de receptores -adrenrgicos. Os autores deste estudo propem que a patognese da cardiomiopatia chagsica se deve a alteraes da funo cardaca normal pela interao dos anticorpos com receptores para neurotransmissores no corao. Esta proposta interessante e outros estudos so necessrios para sua confirmao.
5.1.2
Alteraes no Sistema Adrenrgico em Doena de Chagas Experimental
O uso de modelos animais em que a doena reproduzida tem trazido importantes subsdios para o conhecimento da etiopatogenia chagsica e o surpreendente reconhecimento das variadas reaes que dependem do acervo gentico do hospedeiro e tambm da cepa de T. cruzi utilizada. Um fato comum em todos os casos que a severidade das leses ganglionares do sistema nervoso vegetativo se correlaciona com a intensidade do processo inflamatrio e do parasitismo. As leses observadas em camundongos (Tafuri, 1970), ces (Andrade et al., 1984),
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macacos (Falasca et al., 1990), ratos (Chapadeiro et al., 1988), coelhos (Teixeira et al., 1983) etc., so similares s encontradas em humanos (Andrade, 1994) (ver Captulo 9). Embora muito trabalho tenha sido investido nesta questo, ainda difcil determinar se o sistema nervoso autnomo ou a fibra miocrdica que primariamente afetada, e qual dentre estas duas alteraes a causa primria de insuficincia cardaca. Outro enfoque experimental foi utilizado para responder questo se as cardiopatias chagsicas se devem a um overdrive do sistema nervoso simptico. Foram realizados experimentos de administrao crnica de substncias adrenrgicas em animais de laboratrio, com acompanhamento da evoluo por anatomia patolgica. Os resultados mostraram extraordinrias semelhanas entre as alteraes morfolgicas macro e microscpicas, particularmente na presena de aneurisma de ponta da cardiopatia chagsica crnica e da cardiopatia experimental por administrao de drogas simpaticomimticas (estimulantes dos -receptores adrenrgicos), sugerindo fortemente que ambas pudessem ter a mesma patogenia (Oliveira, 1969). Estes dados so muito interessantes e deveriam ser mais estudados, podendo levar a uma estratgia teraputica, visando a uma melhoria do estado fsico de pacientes com doena de Chagas.
5.1.3
Sistema Adrenrgico em T. cruzi
Um conceito j bem estabelecido na biologia moderna o de que sistemas de modulao e controle de metabolismo podem ser detectados nos estgios iniciais da evoluo. O cAMP , segundo mensageiro celular do sistema adrenrgico, alm de suas funes bem conhecidas em eucariontes superiores, tem tambm um papel regulatrio em organismos unicelulares, inclusive em protozorios parasitas. Uma excelente reviso sobre este assunto foi feita por De Castro & Luz (1993). Todos os componentes da transduo de sinal do sistema adrenrgico j foram descritos em T. cruzi. Primeiramente a adenilciclase foi descrita pelo grupo de W. Colli (Da Silveira et al., 1977) em fraes de membrana, seguido pelo grupo de Torres (Torruella et al., 1986). Ainda o primeiro grupo demonstrou flutuaes no nvel de cAMP e de cAMP-fosfodiesterase (Gonalves et al., 1980) durante a fase de cultura de epimastigotas. O acoplamento funcional do estmulo adrenrgico com uma resposta no protozorio foi primeiramente descrito por Oliveira et al. (1984), quando demonstramos uma inibio de proliferao de epimastigotas quando os nveis intracelulares de cAMP estavam aumentados, quer por estmulo por isoproterenol (ligante adrenrgico), por administrao do anlogo permeante do cAMP ou por inibio da enzima cAMP-fosfodiesterase. Essencialmente os mesmos resultados foram obtidos com amastigotas in vitro. O efeito do isoproterenol era revertido por propanolol e alprenolol, sugerindo um efeito mediado por receptores -adrenrgico (De Castro et al., 1987). Efetivamente, estes receptores foram identificados utilizando-se o mtodo de ligao especfica (De Castro & Oliveira, 1987). Recentemente o receptor adrenrgico de T. cruzi foi clonado e expresso num sistema heterlogo (Krieger et al., 1995). Esses resultados, em conjunto, apontam para um controle inibitrio da proliferao de T. cruzi exercido por um sistema adenilciclase/cAMP, mediado por ligantes adrenrgicos. O controle positivo de proliferao exercido pelo outro sistema sinalizador, ocorrendo uma interao dos dois sistemas (Oliveira et al., 1993). Alm da proliferao, o cAMP tambm modula a diferenciao celular de T. cruzi. Este fato foi observado na transformao de amastigotas para epimastigotas (De Castro et al., 1987) e de epimastigotas para tripomastigotas (Rangel-Aldao et al., 1983, 1987; Gonzales-Perdomo et al., 1988). importante notar que a forma tripomastigota (no-replicativa) apresenta nveis maiores de adenilciclase que as outras, resultados revelados por citoqumica ultra-estrutural (De Castro et al., 1991). Presentemente no se conhece qual seria a eventual contribuio deste controle adrenrgico da biologia de T. cruzi para o desenvolvimento da patologia encontrada na doena de Chagas.
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5.1.4
Sistema Adrenrgico na Interao T. cruzi -Hospedeiro
Neste item, a maioria dos trabalhos vem do laboratrio de Kierszenbaum, que essencialmente demonstrou que nveis aumentados de cAMP inibem a interao parasita-macrfago. A bibliografia extensa e apenas citaremos dois trabalhos (Wirth & Kierszenbaum, 1982; Ayala & Kierszenbaum, 1990) publicados por este grupo. Outro grupo que vem se dedicando a este assunto o de Morris et al. (1988, 1992) cujos esforos so concentrados em seguir alteraes do sistema adenilciclase no hospedeiro. Devido sua grande importncia, este assunto certamente necessita de mais pesquisa.
5.2
Hormnios Sexuais
Solange Lisboa de Castro & Elen Mello de Souza
O dimorfismo sexual na resistncia ou susceptibilidade a vrias infeces foi relatado por diferentes grupos de pesquisa. Apesar de mecanismos sociais e epidemiolgicos serem responsveis por algumas dessas diferenas associadas ao sexo, tem sido evidenciada a interao entre o ambiente hormonal do hospedeiro modulando o sistema imunolgico (Bundy, 1988; Roberts et al., 1996). A incidncia e a gravidade de infeces em mulheres menor que em homens no caso dos seguintes patgenos: Nocardia brasiliensis (Hernndez-Hernndez et al., 1995), Leishmania (Lynch et al., 1982), Paracoccidioides brasiliensis (Restrepo et al., 1984), Coccidioides immitis (Drutz & Catanzaro, 1978; Barbee et al., 1991) e Tricophyton mentagrophytes (Jones, 1983). Em animais de experimentao, fmeas tm tendncia a uma maior resistncia a infeces causadas por Trypanosoma rhodesiense (Greenblatt & Rosentreich, 1984), Giardia lamblia, e maior susceptibilidade a Plasmodium (Goble & Knopka, 1973), Toxoplasma gondii (Kitta et al., 1984; Roberts et al., 1995) e Schistosoma mansoni (Eloi-Santos et al., 1992). Diferentes situaes fisiolgicas nas quais ocorrem alteraes nos nveis de hormnios sexuais gravidez, suplementao com estrognio e etapas do ciclo menstrual podem tambm afetar tanto a aquisio como o curso de infeces bacterianas (Kass, 1960), fngicas (Vaughan & Ramirez 1951) e virais. De um modo geral, ocorre predisposio a uma maior susceptibilidade a infeces em situaes de alto teor endgeno de estrognio (revisto por Styrt & Sugarman, 1991). Vrios trabalhos mostraram tambm que a administrao exgena de hormnio altera a resistncia de animais de experimentao. Foi relatada queda na resistncia aps tratamento de camundongos infectados com T. gondii (Pung & Luster, 1986), Listeria monocytogenes (Pung et al., 1984, 1985), Trichinola spiralis (Luebke et al., 1984), Chlamydia trachomatis (Rank et al., 1982), Staphylococcus (Toivanen 1967), Tritrichomonas foetus (St.Claire et al., 1994; Van Ando et al., 1996), T. danilewsky (Wang & Boosevic, 1994), Gonococcus (Kitta et al.,1985), Mycoplasma hominis (Furr & Robinson, 1989) e Trichomonas vaginalis (El-Boulaqi et al., 1984). Por outro lado,
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tratamento com estradiol aumentou a resistncia de infeces causadas por P. yoeli e P. vinckei (Cottrel et al., 1977), Babesia microti (Benten et al., 1992), T. lewisi (Maukau 1975), Pneumococcus, Pausterela spp. e Salmonela spp. (Nicol et al.,1964). O ambiente hormonal do hospedeiro pode tambm influir no curso de diferentes infeces por uma ao direta sobre o agente infectante (revisto por De Castro & Luz, 1993), uma vez que j foi apontada a possibilidade de interao entre receptor-like em patgenos com hormnios sexuais de mamferos. As evidncias clnicas de interao entre o sistema imune e o eixo hipotlamo-hipofisrio-gonodal esto baseadas no dimorfismo sexual que existe na resposta imune, na prevalncia de diversas doenas auto-imunes em mulheres e na alterao desta resposta durante a gravidez. Altos nveis de estrognios causam aumento da secreo de hormnio do crescimento, da liberao de prolactina e de timosina envolvidas no desenvolvimento de linfcitos e estimulam funes T e B. sugerido que o aumento da resposta imune em mulheres permite compensar o aumento de estresse fisiolgico que acompanha a reproduo (revisto por Grossman, 1989). O estradiol provavelmente altera a resposta imune durante a gravidez devido a aes sobre diferentes populaes celulares de rgos linfides (Shinomiya et al., 1991). De um modo geral, fmeas tm resposta imune humoral superior a machos, resultando em altos nveis de imunoglobulinas (Butterworth et al., 1967; Rowe et al., 1968; Buckley & Dorsey, 1971; Eidinger & Garrett, 1972). Tambm a resposta celular maior em fmeas, como pode ser observado pela rejeio mais rpida de enxertos, maior capacidade de regresso e menor incidncia de certos tipos de tumores (Brent & Medawar, 1966). Por outro lado, o mesmo mecanismo que reduz o risco de infeco em mulheres pode tambm trazer maior susceptibilidade a vrias doenas auto-imunes, como lupus eritematoso sistmico, diabetes insulina-dependente e artrite reumatide (Ahmed et al., 1985; Homo-Delarche et al., 1991).
5.2.1 Doena de Chagas e Relatos sobre Diferenas entre Sexos

Devido sua heterogeneidade, a doena de Chagas se apresenta como um bom modelo de estudo para os fenmenos de resistncia natural e influncia do sexo. Variaes na susceptibilidade do hospedeiro ante diferentes cepas do parasita, bem como a influncia da constituio gentica, idade, sexo, gravidade da fase aguda e estado imunolgico do paciente, influenciam no curso da infeco (revisto por Dias, 1992). Existem na literatura vrios relatos de diferenas no curso da infeco chagsica entre homens e mulheres:
Puffer & Griffith (1968), em rea endmica de Braslia, acompanharam a mortalidade especfica por doena de
Chagas em 10.000 indivduos, encontrando os valores de 101,3 para mulheres e 234,0 para homens; Widmer & Azevedo (1972), analisando cortes histolgicos do corao de 346 chagsicos, observaram que em mulheres ninhos de amastigotas so encontrados em menor nmero; Oliveira et al. (1981), estudando populaes selecionadas, verificaram que algumas leses, como, por exemplo, aneurisma apical, associado com doena de Chagas crnica, ocorrem menos freqentemente em mulheres (339 (f) x 739 (m); analisando resultados de eletrocardiogramas anormais de pacientes chagsicos, em Castro Alves (Bahia), Maguire et al. (1983) observaram uma menor freqncia de alteraes em mulheres (15,3%; 29/189) do que em homens (26,1%; 41/157); em trabalho posterior, na mesma rea, Mota et al. (1990), expressando em taxa de 1.000 pessoas/ano, encontraram os valores de 21,1 para mulheres e 32,3 para homens; vrios autores verificaram, em diferentes regies no Brasil, menor freqncia de mega sndromes em mulheres quando comparadas a homens no sendo, porm, a diferena estatisticamente significativa (Barbosa et al., 1970; Rezende, 1975; Mota et al., 1984);
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Brabin (1992) divulgou que patologia cardaca e mortalidade associadas so menos freqentes em mulheres,
apesar do fato de a gravidez poder disparar uma alterao na resposta imune a T. cruzi e exacerbar a doena; estudo radiolgico em Mamba (Gois) mostrou que a progresso da esofagopatia foi observada em 21,7% dos homens, e apenas em 16,6% das mulheres (Castro et al., 1994). De um modo geral, estes relatos sugerem uma maior resistncia das mulheres em relao ao homens no curso da infeco chagsica, porm no so freqentes o suficiente para que se afirme a existncia de tal diferena. Por outro lado, estudos com animais experimentais mostraram mais claramente esta diferena associada ao sexo.
O dimorfismo sexual em animais infectados experimentalmente pelo T. cruzi foi relatado pela primeira vez
por Hauschka (1947) que, realizando estudo quantitativo do sexo do hospedeiro como um fator de influncia na doena, utilizou vrias linhagens de camundongos e cepas de parasita e demonstrou diferenas na parasitemia, no grau de infeco tissular, na perda de peso e na sobrevivncia dos animais, sendo os machos consistentemente mais susceptveis a T. cruzi que as fmeas; Goble (1951), em estudos experimentais com camundongos albinos, fmeas e machos, administrou hormnio caracterstico do sexo oposto e no observou diferena significativa na mortalidade entre controle e tratados, porm o incio da mortalidade foi mais precoce e a mdia do tempo de sobrevida foi menor em animais machos; Kierszenbaum et al. (1974), investigando a interao parasita-macrfago in vivo e in vitro, observaram que a administrao de dietilestilbestrol reduzia a taxa de mortalidade e os nveis de parasitemia e associaram essa reduo da resistncia infeco mediada por macrfagos; a influncia de hormnios esterides foi demonstrada em experimentos de retirada de ovrios de camundongos, sendo observado aumento na susceptibilidade no curso da infeco por T. cruzi (Chapman et al., 1975); Postan et al. (1983), utilizando camundongos da cepa C3H e parasita clone Sylvio-X 10/7, tambm observaram menor percentagem de mortalidade cumulativa em fmeas e aumento no tempo de sobrevida; em ratos infectados com T. cruzi tambm foi observado que fmeas so mais resistentes que machos (RiveraVanderpas et al., 1983); em Balb/c infectado com cepa Tehuantepec, o percentual da mortalidade foi de 15% para fmeas e 88% para machos (Arajo-Jorge et al., 1992); em estudos com Calomys callosus, roedor silvestre descrito como modelo resistente para T. cruzi (Mello et al., 1979, Borges et al., 1982), foi observado que a retirada das gnadas tanto em fmeas quanto em machos, levava a um aumento na parasitemia, revertido com a reposio do hormnio correspondente (Prado Jr. et al., 1998, 1999). Em nosso laboratrio foi recentemente descrito que doses consideradas farmacolgicas de estradiol susceptibilizam os camundongos C57BL/6, tanto fmeas quanto machos, morte na fase aguda da infeco, enquanto doses baixas do hormnio podem aumentar a resistncia dos animais mortalidade na fase aguda (Souza, 1999). Dentro deste estudo tambm no observamos alteraes nos nveis plasmticos de IgG anti T. cruzi e a susceptibilizao induzida por estradiol. Estudos preliminares mostraram uma maior produo de xido ntrico em animais tratados com estradiol, porm tal efeito foi observado tanto com a administrao de doses altas como de doses baixas do hormnio. Realizamos tambm estudos analisando o curso da infeco por T. cruzi em fmeas em diferentes etapas do ciclo ovulatrio que sugeriram que o fato de fmeas serem mais resistentes que machos pode, ao menos em parte, estar associado com nveis baixos de estradiol, compatveis com nveis de anestro ou de fase descendente de estrognio no ciclo estral.
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5.3
Prolactina
Maria Teresa Rivera
A prolactina (PRL) um hormnio polipeptdico, com peso molecular prximo de 23.000 daltons, constituda de uma cadeia linear de 198 aminocidos. A PRL circulante se apresenta em trs formas: monomrica, a prolactina pequena (80% da PRL total circulante), polimrica, com peso molecular elevado, a prolactina grande, grande e polimrica, de peso molecular intermedirio, a prolactina grande. Estas duas ltimas formas tm fraca afinidade pelos receptores de PRL (Niall, 1981). um hormnio lactognico, sintetizado pelas clulas lacttropicas do lbulo anterior da hipfise e que se encontra nos vertebrados; ela secretada de uma maneira pulstil (a cada 20 minutos) e sua vida mdia , aproximadamente, de 20 minutos (Dewailly et al., 1984). A PRL atua diretamente sobre seus receptores presentes em tecidos perifricos, sem a interveno ou ao de outras glndulas endcrinas. Estes receptores encontram-se na glndula mamria, fgado, ovrio, testculo, prstata e rim. Na mulher, as clulas do endomtrio, no final do ciclo menstrual, e as clulas teciduais placentrias, no incio da gravidez, seriam capazes de produzir a PRL extra-hipofisria (Smith, 1980; Talamantes et al., 1980). Os mecanismos reguladores desse hormnio so mltiplos e complexos: ao nvel hipotalmico, dopamina, GABA (cido -amino butrico) e sistemas colinrgicos exercem um efeito inibitrio; a TRH e o VIP (peptdeo intestinal vasoativo), estimulam a sntese e secreo da PRL que pode auto-regular-se e ser controlada por ao de outros hormnios como progesterona, estrognios, glucocorticides, andrgenos, GH, LH-RH e ACTH (Clemens & Shaar 1980; Dewailly et al., 1984). As variaes fisiolgicas da PRL plasmtica esto associadas com a idade e o sexo: (a) no feto, aparece na hipfise fetal a partir a quinta semana e no soro a partir da dcima semana, apresentando uma grande elevao do nvel plasmtico no final da gravidez e ao nascimento (200 ng/ml) (Aubert et al., 1975); (b) na infncia, a PRL plasmtica diminui progressivamente (de 50 a 80 ng/ml) at o incio da puberdade, quando de novo aumenta moderadamente, principalmente na mulher; (c) nos adultos, o nvel srico da PRL mais elevado na mulher que tem atividade genital (2-20 ng/ml) que na mulher em menopausa (2-12 ng/ml) e no homem (2-13 ng/ml) (Jaffe et al., 1973). Durante o dia, os nveis de PRL plasmtica apresentam uma curva oscilatria com poucas variaes, simultnea a de LH e de FSH, mostrando que estas oscilaes so moduladas pelo mesmo mecanismo neuroendcrino (Cetel & Yen, 1983). Como no caso de outros hormnios hipofisrios, a PRL tem um ritmo bem particular nas 24 horas do dia: detecta-se um pico noturno durante o sono que ocorre entre 1 e 5 horas da manh nas pessoas que tm um ritmo de viglia-sono clssico; a seguir os valores plasmticos diminuem, voltando aos nveis basais 1 ou 2 horas aps o despertar (Nokin et al., 1972). A principal funo fisiolgica da PRL a induo e manuteno da lactao na mulher. Durante esta fase, a amamentao mantm uma hiperprolactinemia fisiolgica, que mxima no incio da lactao, depois do parto, e que diminui progressivamente com a evoluo da amamentao; durante este perodo ocorre uma reduo da atividade ovariana acompanhada por amenorria na mulher. Por outro lado, apresenta, tambm, uma ao sobre a
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reproduo, uma vez que vrios resultados experimentais mostram uma ao direta da mesma sobre o ovrio; o lquido folicular tambm contm PRL, j que sua concentrao aumenta durante a maturao folicular e diminui no momento da ovulao (Dewailly et al., 1984; Meites, 1988). Outros fatores exgenos podem provocar a liberao da PRL: estresse, exerccio com esforo prolongado, durante a alimentao, hipoglicemia e estmulo tctil do mamilo do seio (Baker et al., 1982). A PRL pode ser encontrada no lquido amnitico, no lquido cfalo-raqudeo, no lquido seminal e no leite materno humano e de outros vertebrados (Gala et al., 1975; Bartke, 1980). Suas concentraes nestes lquidos biolgicos nem sempre guardam correlao com os valores plasmticos.
5.3.1
Prolactina e Imunidade
A interao entre o sistema neuroendcrino e o sistema imune cada vez mais evidente, sendo objeto de numerosas investigaes (Blalock, 1989). A hipfise secreta hormnios imunoestimulantes (PRL e hormnio de crescimento) e hormnios imunossupressores (ACTH) que esto implicados no controle das funes imunes (Dewailly et al., 1984). Neste contexto, uma srie de estudos indicam que a PRL pode ser considerada como um agente essencial da regulao da resposta imune. Enquanto exerce, principalmente, uma ao sobre a lactao e a reproduo, o que tem sido bem demonstrado na literatura, tem havido tambm investigaes sobre o papel desse hormnio na funo de clulas imunocompetentes (Berczi et al., 1981; Haddock Rusell, 1988; Yu & Lee 1988; Murphy et al., 1995). Foi claramente estabelecido que a PRL pode ativar a proliferao linfocitria e aumentar a atividade das clulas NK e LAK in vitro (Bernton et al.,1988; Yu & Lee, 1988; Haddock Rusell, 1988; Murphy et al., 1995). Este hormnio contribui tambm para a ontogenia do sistema imunitrio tmico e a administrao neonatal de anticorpos anti PRL em camundongos, pode alterar o desenvolvimento e a maturao linfcitos T e B do bao e do timo (Haddock Rusell et al., 1988). Alm disso, receptores de PRL foram identificados em linfcitos T (clulas CD4+ e CD8+), linfcitos B e em clulas NK humanas (Murphy et al., 1995). Os linfcitos apresentam mRNA que pode hibridizar com o cDNA da PRL e assim levam a formao deste hormnio, quando so estimulados por mitognos ou por antgenos (Haddock Rusell, 1988). Macrfagos apresentam tambm receptores de PRL e, como os linfcitos, so capazes de produzir uma substncia semelhante a ela. Estes resultados sugerem um efeito adjuvante da PRL, que pode ser associado estimulao da atividade macrofgica (direta ou indireta por via do IFN- produzido por linfcitos T) (Bernton et al., 1988; Murphy et al., 1995). Por outro lado, a ciclosporina A, agente imunodepressor, se fixa sobre os mesmos receptores que a PRL, impedindo desta maneira a ao da mesma (Hiestand et al., 1986). A PRL tambm foi associada com a auto-imunidade. Dados recentes demostraram que a administrao in vivo de PRL ou transplantes singnicos da parte anterior da hipfise, aceleram fenmenos auto-imunes em cepas de camundongos predispostos a desenvolver processos auto-imunes; a administrao de bromocriptina, um inibidor da sntese de PRL, pode retardar o aparecimento desta patologia. Os camundongos NZB auto-imunes apresentam receptores de PRL, que no esto presentes em linfcitos de camundongos controles normais (Murphy et al., 1995).
5.3.2
Prolactina e a Infeco Experimental por T. cruzi
O papel da PRL sobre a regulao das respostas imunes parasitrias no tem sido estudado. Na infeco experimental por T. cruzi, os mecanismos de proteo e de resistncia dependem, essencialmente, de fenmenos como fagocitose e citotoxicidade celular dependente dos anticorpos (ADCC), principalmente devido a macrfagos e a polimorfonucleares (Okabe et al., 1980; Nogueira, 1986). A funo primordial de clulas NK, clulas CD4+
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e CD8+ tem sido demonstrada no controle da parasitemia e no aparecimento de fenmenos patolgicos de autoimunidade na infeco experimental por T. cruzi (ver Captulo 4). Estes elementos da resposta imunitria podem ser assim um alvo preferencial direto ou indireto da ao da PRL. Por outro lado, alguns resultados obtidos durante a infeco experimental por T. cruzi em camundongos (fmeas grvidas e lactantes) (Rivera et al., 1991) permitem considerar, ainda, a ao modulatria da PRL sobre a infeco. Estes resultados indicam uma ao benfica da lactao, aumentando a resistncia dos animais infectados e confirmando estudos prvios usando outras cepas de camundongos e de T. cruzi (Krampitz & Disko, 1966). A lactao reduz a mortalidade durante a fase aguda da infeco, mas os camundongos infectados foram incapazes de controlar sua parasitemia. Esta incapacidade de reduzir a populao parasitria em uma infeco adquirida durante o perodo de lactao foi tambm observada em outras infeces parasitrias de animais domsticos e de laboratrio e poderia estar relacionada com a imunossupresso das clulas T observada durante a gravidez e a lactao (Lloyd, 1983). Na infeco por T. cruzi, os trabalhos de Trischmann (1983) demonstram que no incio da fase aguda, quando a parasitemia aumenta, o controle da infeco est associado, essencialmente, a linfcitos T, sendo independente dos anticorpos. Os linfcitos CD4 Th1 e Th2 produzem linfocinas capazes de ativar as clulas efetoras, participando, dessa maneira, da eliminao dos parasitas (Golden & Tarleton, 1991; Tarleton, 1991) e contribuindo para a sntese de anticorpos; estes ltimos seriam responsveis pela eliminao dos parasitas e pela manuteno da imunidade durante a fase crnica. A capacidade do camundongo lactante de retardar ou evitar as conseqncias letais de uma parasitemia elevada poderia estar relacionada com as alteraes induzidas pela interao da rede de hormnios e citocinas. Assim, o grande aumento de PRL endgena, observado durante a lactao, poderia estar relacionado com o estmulo das respostas imunes antiparasitrias e participar no controle da infeco de camundongos lactantes. Evidentemente esta hiptese necessita de mais investigaes. Finalmente, uma diferena sexual importante tem sido demostrada na resistncia infeco por T. cruzi entre camundongos machos e fmeas (Hauschka, 1947; Souza, 1999): os primeiros so mais sensveis. Assim, a prolactinemia e os nveis de fixao de PRL sobre seus receptores so menores em machos que em fmeas como assinalado no caso de algumas cepas de camundongos (Kelly et al., 1974). Este nvel baixo poderia contribuir para explicar a diferena sexual observada na resistncia infeco.
AHMED, S.A.; PENHALE, W.J. & TALAL, N. Sex hormones, immune responses, and autoimmune diseases. Mechanism of sex hormone action. American Journal of Pathology, 121:531-551, 1985. ANDRADE, Z. A. Pathology of the autonomic nervous system in Chagas cardiopathy. Chagas disease and the nervous system. PAHO Scientific Publication 5471:212-221, 1994. ANDRADE, Z. & ANDRADE S. Pathological findings in Chagas disease. In: Actualizaciones en la Enfermidad de Chagas, 1993. Crdoba: Congresso Nacional de Medicina, p. 79-94. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G. & SADIGURSKY, M. Damage and healing in the conducting tissue of the heart an experimental study in dogs infected with Trypanosoma cruzi. Journal of Pathology, 143:93-101, 1984. ARAJO-JORGE, T. C.; LAGE, M. J. F.; RIVERA, M. T.; CARLIER, Y. & VAN LEUVEN, F. Trypanosoma cruzi: Enhanced macroglobulin levels correlate to resistance of BALBc/J mice to a cute infection. Parasitology Research, 78:215-221, 1992. AUBERT, M. L.; GRUMBACH, M. M. & KAPLAN, S. L. The ontogenesis on human fetal hormones. III. Prolactin. Journal of Clinical Investigation, 56:155-164, 1975. AYALA, J. & KIERSZENBAUM, F. Regulation of Trypanosoma cruzi infectivity by - and -adrenergic agonists: Desensitization produced by prolonged treatments of increasing agonist concentration. Parasitology, 100:429-434, 1990. BAKER, E. R.; MATHUR, R. S.; LANDGREBE, S. C.; MOODY, L. O. & WILLIAMSON, H. O. Plasma gonadotropins, prolactin and steroid hormone concentrations in female runners immediately after a long-distance run. Sterility, 38:38-41, 1982.
95
BARBEE, R. A.; HICKS, M. J.; GROSSEL D. & SANDO C. The maternal immune response in coccidioidomycosis. Is pregnancy a risk factor for serious infection? Chest, 100:709-715, 1991. BARBOSA, A. J. A.; PITOLA, J. E. H. & TAFURI W. L. Incidncia da cardiopatia chagsica em 15.000 necrpsias consecutivas e sua associao com os megas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 4:219-223, 1970. BARTKE, A. Role of prolactin in reproduction in male mammals. Federation Proceedings, 39:2577-2581, 1980. BENTEN, W. P.; WUNDERLICH F. & MOSSMANN H. Plasmodium chabaudi: Estradiol suppresses acquiring, but not onceacquired immunity. Experimental Parasitology, 75:240-247, 1992. BERCZI, I.; NAGY, E.; KOVACS, K. & HOVATH, E. Regulation of humoral immunity in rats by pituitary hormones. Acta Endocrinologica, 98: 506-513, 1981. BERNTON, E. W., MELTZER, M. S. & HOLADAY, J. Supression of macrophages activation and T-lymphocyte function in hypoprolactinemic mice. Science, 239: 401-404, 1988. BERRIDGE, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature, 361:315-325, 1993. BLALOCK, J. E. A molecular basis for bidirectional communication between the immune and neuroendocrine systems. Physiolgical Reviews, 69:32, 1989. BORDA, E. S.; PASCUAL, J.; COSSIO, P . M.; VEGA, M.; ARANA, R. & STERIN-BORDA, L. A circulating IgG in Chagas disease which binds to - adrenoreceptor of myocardium and modulates its activity. Clinical Experimental Immunology, 57:679-682, 1984. BORGES, M. M.; MOLO D. A. & TEIXEIRA M. L. Infeco experimental do Calomys callosus Rodentia Cricetidae com Trypanosoma cruzi. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 16:233-242, 1982. BRABIN, L. The epidemiological significance of Chagas disease in women. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 87:73-79, 1992. BRENER, Z. & KRETTLI, A. U. Immunology of Chagas disease. In: Modern Parasite Biology: Cellular, Immunological and Molecular Aspects. 1990. Cap. 13, p. 247-361. BRENT, L. & MEDAWAR, P. Quantitative studies on tissue transplantation immunity. VII. The normal lymphocyte transfer reaction. Proceedings of Royal Society London Biological Science 165:281-307, 1966. BUCKLEY, C. E. & DORSEY, F. C. Serum immunoglobulin levels throughout the life-span of healthy man. Annals Internal Medicine, 75:673-682, 1971. BUNDY, D. A. P. Sexual effects on parasite infection. Parasitology Today, 4:186-189, 1988. BUTTERWORTH, M.; MCCLOLAN, B. & ALLANSMITH, M. Influence of sex in immunoglobulin levels. Nature, 214:12241225, 1967. CASTRO, C.; MACEDO, V.; REZENDE, J. M. & PRATA, A. Longitudinal radiologic study of the esophagus, in an endemic area of Chagas disease, in a period of 13 years. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 27:227-233, 1994. CETEL, N. S. & YEN, S. S. Concomitant pulsatile release of prolactin and LH in hypogonadal women. Journal of Clinical and Endocrinologic Metabolism, 56:1313-1315, 1983. CHAGAS, C. & VILLELA, E. Forma cardaca de trypanosomase americana. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 14:5-61, 1922. CHAPADEIRO, E.; BERALDO, P . S. S.; JESUS, P . C.; OLIVEIRA, W. P . & JUNQUEIRA, L. F.. Leses em ratos Wistar inoculados com diferentes cepas de Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 21:95-103, 1988. CHAPMAN JR, W. L.; HANSON, W. L. & WAITS, V. B. The influence of gonadectomy of host on parasitemia and mortality of mice infected with Trypanosoma cruzi. Journal of Parasitology, 61:213-216, 1975. CLEMENS, J. A. & SHAAR, J. Control of prolactin secretion in mammals. Federation Procedings, 39:2588-2592, 1980. COTTREL, B. J.; PLAYFAIR, J. H. L. & DE SOUSA B. The efect nonspecific immunostimulation on murine malaria. Experimental Parasitology, 43:45-53, 1977. DA SILVEIRA, J. F.; ZINGALES, B. & COLLI, W. Characterization of an adenylyl cyclase activity in particulate preparations of epimastigote forms of Trypanosoma cruzi. Biochimica Biophysica Acta, 481:722-733, 1977. DE CASTRO, S. L. & LUZ, M. R. M. P . The second messenger cyclic 3';5'-adenosine monophosphate in pathogenic microorganisms with special reference to protozoa. Canadian Journal of Microbiology, 39:473-479, 1993. DE CASTRO, S. L. & OLIVEIRA, M. M. Radioligand binding characterization of -adrenergic receptors in the protozoa Trypanosoma cruzi. Comparative Biochemistry and Physiology, 87C:5-8, 1987. DE CASTRO, S. L.; MEIRELLES, M. N. L. & OLIVEIRA, M. M. Trypanosoma cruzi: Adrenergic modulation of cyclic AMP role in proliferation and differentiation of amastigotes in vitro. Experimental Parasitology, 64:368-273, 1987. DE CASTRO, S. L.; SOUZA, W. & MEIRELLES, M. N. L. Cytochemical localization of adenylate cyclase in the three developmental forms of Trypanosoma cruzi. Journal of Protozoology, 38:580-583, 1991.
96
DEWAILLY, D.; BUVAT, J. & FOSSATI, P . Physiologie de la prolactine. Encyclopaedia Mdicale et Chirugique. Paris, France: GlandesNutrition, 1984. 10017 M, 1-14 DIAS, J. C. P. The indeterminate form of human chronic Chagas disease. A clinical-epidemiological review. Revista da Sociedade Brasileira Tropical, 22:147-156, 1989. DIAS, J. C. P . Epidemiology of Chagas disease In: Chagas disease (American trypanosomiasis): Its impact on transfusion and clinical medicine, 1992. So Paulo: ISBT, p. 49-80. DRUTZ, D. J. & CATANZARO, A. Coccidioidomycosis. State of the art. American Review of Respiratory Diseases, 117:559-585, 1978. EIDINGER D. & GARRETT T. J. Studies of the regulatory effects of the sex hormones on antibody formation and stem cell differentiation. Journal of Experimental Medicine, 136:1098-1116, 1972. EL-BOULAQI, H. A.; EL-REFAIE, S. A.; BASSIOUNY, G. A. & AMIN, F. M. A. The relation between Trichomonas vaginalis and contraceptive measures. Journal of Egyptian Society of Parasitology, 14:495-499, 1984. ELOI-SANTOS, S.; OLSEN, N. J.; CORREA-OLIVEIRA, R. & COLLEY, D. G. Schistosoma mansoni: Mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Experimental Parasitology, 75:168-175, 1992. FALASCA, C. A.; GILI, M.; GRANA, D.; GMEZ, E.; ZOPPI, J. & MARESO, E. Chronic myocardial damage in experimental Trypanosoma cruzi infection of a new world primate, Cebus sp. monkey. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 32:151-161, 1990. FURR, P . M. & ROBINSON, D., 1989. Oestradiol-induced infection of the genital tract of female mice by Mycoplasma hominis. Journal of General Microbiology, 135: 2743-2749. GALA, R. R.; SINGHAKOWINTA, A. & BRENNAN, M. J. Studies on prolactin in human serum, urine and milk. Hormone Research, 6:310-320, 1975. GOBLE, F. C. Studies on experimental Chagas disease in mice in relation to chemotherapeutic testing. Journal of Parasitology, 37:408414, 1951. GOBLE, F. C. & KNOPKA, K. Sex as a factor in infections disease. Science, 35:325-346, 1973. GOLDEN, J. M. & TARLETON, R. L. Trypanosoma cruzi: Cytokine effects on macrophage trypanocidal activity. Experimental Parasitology, 72:391, 1991. GONALVES, M. F.; ZINGALES, B. & COLLI, W. cAMP phosphodiesterase and activator protein of mammalian cAMP phosphodiesterase from Trypanosoma cruzi. Molecular and Biochemical Parasitology, 1:107-118, 1980. GONZALES-PERDOMO, M.; ROMERO, P . & GOLDENBERG, S. cAMP and adenylate cyclase activators stimulate Trypanosoma cruzi differentiation. Experimental Parasitology, 66:205-212, 1988. GREENBLATT, H. C. & ROSENSTREICH, D. L. Trypanosoma rhodesiense infection in mice: Sex dependence of resistance. Infection & Immunity, 43:337-340,1984. GROSSMAN, C. Possible underlying mechanisms of sexual dimorphism in the immune response, fact and hypothesis. Journal of Steroid Biochemistry, 34: 241-251, 1989. HADDOCK RUSELL, D. Prolactin and immunomodulation. In: Prolactin gene family and its receptor; 1988. Elsevier Sience Publishers BV (Biomedical division), p. 155-165. HADDOCK RUSELL, D.; MILLS, K. D.; TALAMANTES, F. J. & HOWARD, A. B. Neonatal administration of prolactin antiserum alters the developmental pattern of T an B lymphocytes in the thymus and spleen of Balb/C female mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 85:7404-7407, 1988. HAUSCHKA, T. S. Sex of host as a factor in Chagas disease. Journal of Parasitology, 33: 399-404, 1947. HERNNDEZ-HERNNDEZ, F.; LPES-MARTNEZ, R.; MNDEZ-TOVAR, L. J. & MANZANO-GAYOSSO, P . Nocardia brasiliensis: In vitro and in vivo growth response to steroid sex hormones. Mycopatologia, 132: 79-85, 1995. HIESTAND, P . E.; MAKLER, P.; NORDMANN, R.; GRIEDER, A. & PERMMONGKOL, C. Prolactin as a modulator of lymphocyte responsiveness provides a possible mechanism of action for cyclosporin. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 83:2599-2603, 1986. HOMO-DELARCHE, F.; FITZPATRICK, F.; CHRISTEFF, N.; NUNEZ, E. A.; BACH, J. F. & DARDENNE, M. Sex steroids, glucocorticoids, stress and autoimmunity. Journal Steroid Biochemistry Molecular Biology, 40:619-637, 1991. IOSA, D.; DEQUATTRO, V.; LEE, D. D.; ELKAYAM, U. & PALMERO, H. Plasma neropinephrine in Chagas cardioneuromyopathy: A marker of progressive dysautonomia. American Heart Journal, 117:882-887, 1989. IOSA, D.; DEQUATTRO, V.; LEE, D. D.; ELKAYAM, U.; CAEIRO, T. & PALMERO, H. Pathogenesis of cardiac neuromyopathy in Chagas disease and the role of the autonomic nervous system. Journal of Autonomic Nervous System, 30: 583-588, 1990.
97
JAFFE, R. B.; YUEN, B. H.; KEYE Jr, W. R. & MIDGLEY Jr, A. R. Physiologic and pathologic profiles of circulating human prolactin. American Journal of Obstetrics & Gynecology, 117:757-773, 1973. JONES H. E. Superficial fungis infections of skin. In: Infections diseases, 3rd ed., 1983. Philadelphia: Harper & Row Publishers Inc., p. 966-978. KASS, E. H. Bacterium and pyelonephritis of pregnancy. Archives Internal Medicine, 105:196-198, 1960. KELLY, P. A.; POSNER, B. I.; TSUSHIMA, T. & FRIESEN, H. G. Studies of insulin, growth hormone and prolactin binding: Ontogenesis, effects of sex and pregnancy. Endocrinology, 95:532-539, 1974. KIERSZENBAUM, F.; KNECHT, E.; BUDZKO, D. B. & PIZZIMENTI, M. C. Phagocytosis: A defense mechanism against infection with Trypanosoma cruzi. Journal of Immunology, 112:1839-1844, 1974. KITTA, E.; TAKAHASHI, S.; YASUI, K. & KASHIBA, S. Effect of estrogen (17 estradiol) on the susceptibility of mice to disseminated gonococcal infection. Infection & Immunity, 49:238-243, 1985. KITTA, S.; KITTA, C.; PAIZI-BIZA, P . & HENRY, L. A histological and immunohistochemical study of the changes induced in the brains of white mice by infection with Toxoplasma gondii. British Journal of Experimental Patholgy, 65:67-74, 1984. KBERLE, F. Cardiopatia chagsica. Hospital, 53:311-346, 1958. KBERLE, F. Chagas heart disease. Cardiology, 52:82-90, 1968. KBERLE, F. The cause and the importance of nervous lesions in American trypanosomiasis. Bulletin WHO, 42:739-743, 1970. KRAMPITZ, H. E. & DISKO, R. Retardation of parasitemia, prolongation of life or survival of lactating mice in infections with Trypanosoma cruzi. Nature, 209:526, 1966. KRIEGER, M. A.; DESCOFFIER, L. N. & GOLDENBERG, S. Signal transduction and role of G-proteins coupled receptors in Trypanosoma cruzi metacyclogenesis: Use of functional expression in Escherichia coli for the cloning Trypanosoma cruzi-adrenergic receptor. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 90 (Suppl.):109, 1995. LARANJA, F. S.; DIAS, E.; NBREGA, G. & MIRANDA, A. Chagas disease: A clinical, epidemiologic, and pathologic study. Circulation, 14:1035-1060, 1956. LLOYD, S. Effect of pregnancy and lactation upon infection. Veterinary Immunology & Immunopathology, 4:153-176, 1983. LUEBKE, R. W.; LUSTER, M. I.; DEAN, J. H. & HAYES, H. T. Altered host resistance to Trichinella spiralis infection following subchronic exposure to diethylstilbestrol. International Journal of Immunopharmacology, 6:609-617, 1984. LYNCH, N. R.; YARZABAL, L.; VERDE, O.; AVILA, J. L.; MONZON, H. & CONVIT, J. Delayed-type hypersensitivity and immunoglobulin E in American cutaneous leishmaniasis. Infection & Immunity, 38:877-881, 1982. MAGUIRE, J. H.; MOTT, K. E.; LEHMAN, J. S.; HOFF, R.; MUNIZ, M.; GUIMARES, A. C.; SHERLOCK., I. & MOROW, R. H. Relationship of electrocardiograph abnormalities and seropositivity to Trypanosoma cruzi within a rural community in Northeast Brazil. American Heart Journal, 105:287-294, 1983. MAUKAU, S. K. Host sex and sex hormones as a factor affecting Trypanosoma lewisi population in white rats. Japanese Journal of Parasitology, 24:379-385, 1975. MEITES, Y. Biologicals functions of prolactin in mammals. In: Prolactin gene family and its receptor, 1988. Amsterdam: Elsevier Science, p. 123-130. MELLO-AIRES, M. Fisiologia. 1991. Rio de Janeiro: Guanabara/Koogan S.A. MELLO, D. A.; VALIIN, E. & TEIXEIRA, M. L. Alguns aspectos do comportamento de cepas silvestres do Trypanosoma cruzi em camundongos e Calomys callosus callosus Rodentia. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 13:314-332, 1979. MORRIS, S. A.; TANOWITZ, H. B.; FACTOR, S. A.; BILEZIKIAN, J. P . & WITTNER, M. Myocardial adrenergic adenylate cyclase activity in acute murine Chagas disease. Circulation Research, 62:800-810, 1988. MORRIS, S. A.; TANOWITZ, H. B.; MAKMAN, M.; HATCHER, V.; BILEZIKIAN, J. P . & WITTNER, M. Trypanosoma cruzi: Infection of human umbilical vein endothelial cells alters cAMP metabolism. Experimental Parasitology, 74:69-76, 1992. MOTA, E. A.; GUIMARES, A. C.; SANTANA, O.; SHERLOCK, I.; HOFF, R.; WOLER, T. H. A nine-year prospective study of Chagas disease in a well-defined rural population in Northeast Brasil. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 42:429440, 1990. MOTA, E.; TODD, C. W.; MAGUIRE, J. H.; PORTUGAL, S. D.; SANTANA, O.; RIBEIRO FILHO, R. & SHERLOCK, I. A. Megaoesophagus and seroreactivity to Trypanosoma cruzi in a rural community in Northeast Brazil. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 33:8220-8226, 1984. MURPHY, W. J.; HALLGER, R. & LONGO, D. L. Effects of growth hormone and prolactin immune development and function. Life Sciences, 57:1-14, 1995.
98
NIALL, H. D. The chemistry of prolactin. In: Prolactin. 1981. NY: Elsevier p. 1-17. NICOL, T.; BILBEY, D. L. J.; CHARLES, L. M.; CORDINGLEY, J. L. & VERNON-ROBERTS, B. Oestrogen: The natural stimulant of body defence. Journal of Endocrinology, 30:277-291, 1964. NISHIZUKA, Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 258:607-614, 1992. NOGUEIRA, N. American trypanosomiasis, antigens and host parasite interactions. In: Parasite antigens: Toward new strategies for vaccines. 1986. p. 91-110. NOKIN, J.; VEKEMANS, M.; LHERMITE, M. & ROBYN, C. Circadian periodicity of serum prolactin concentration in man. British Medical Journal, 3:561-562, 1972. OKABE, K.; KIPNIS, T. L.; CALICH, V. L. G. & DIAS DA SILVA, W. Cell-mediated cytotoxicity to Trypanosoma cruzi. I. Antibody dependent cell mediated cytotoxicity to trypomastigotes bloodstream forms. Clinical Immunology & Immunopathology, 46:344, 1980. OLIVEIRA, J. S. M. Cardiopatia chagsica experimental. Revista Goiana de Medicina, 15:77-133, 1969. OLIVEIRA, J. S. M.; MELLO DE OLIVEIRA, J. A. & LIMA FILHO, E. C. Apical aneurism of Chagas heart disease. British Heart Journal, 46:432-437, 1981. OLIVEIRA, M. M.; ANTUNES, A. & DE MELLO, F. G. Growth of Trypanosoma cruzi epimastigotes controlled by shifts in cAMP mediated by adrenergic ligands. Molecular and Biochemical Parasitology, 11:283-292, 1984. OLIVEIRA, M. M., ROCHA, E. D., RONDINELLI, E., ARNHOLDT, V. & SCHARFSTEIN, J. Signal transduction in Trypanosoma cruzi: Opposite effects of adenylcyclase and phospholipase C systems in growth control. Molecular Cellular Biochemistry,124:91-99, 1993. PAHO. Chagas disease and the nervous system. Scientific Publication no. 547, 1994. PASCUAL, J.; BORDA, E. & STERIN-BORDA, L. Chagasic IgG modifies the activity of sarcolemmal ATPases through a adrenergic mechanism. Life Science, 40: 313-319, 1987. PELECH, S.L. Networking with protein kinases. Current Biology, 3:513-515, 1993. PETRY, K. & VAN VOORHIS, W. C. Antigens of Trypanosoma cruzi that mimic mammalian nervous tissues: Investigations of their role in the autoimmune pathophysiology of chronic Chagas disease. Research Immunology, 142:151-156, 1991. POSTAN, M.; DVORAK, J. A. & MCDANIO, J. P . Studies of Trypanosoma cruzi clones in inbred mice. I. A comparison of the course of infection of C3H/HEN- mice with two clones isolated from a common source. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 32:497-506, 1983. PRADO JR, J. C.; LEAL, M. P .; ANSOMO-FRANCI, J. A.; DE ANDRADE JR, H. F. & KLOETZEL, J. K. Influence of female gonadal hormones on the parasitemia of female Calomys callosus infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 84:100-105, 1998. PRADO JR, J. C.; LEVY, A. M.; LEAL, M. P.; BERNARD, E. & KLOETZEL, J. K. Influence of male gonadal hormones on the parasitemia and humoral response of male Calomys callosus infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 85:826-829, 1999. PUFFER, R. R. & GRIFFITH, G. H. Caracteristicas de la mortalidad urbana. Washington DC. PAHO Scientific Publication, 151, 1968. PUNG, O.J. & LUSTER, M. I. Toxoplasma gondii: Decreased resistance to infection in mice due to estrogen. Experimental Parasitology, 61:48-56, 1986. PUNG, O. J.; LUSTER, M. I.; HAYES, H. T. & RADER, J. Influence of steroid and nonsteroid sex hormones on host resistance in mice: Increased susceptibility to Listeria monocytogenes after exposure to estrogenic hormones. Infection & Immunity, 46:301-307, 1984. PUNG, O. J.; TUCKER, A. N.; VORE, S. J. & LUSTER, M. I. Influence of estrogen on host resistance: Increased susceptibility of mice to Listeria monocytogenes correlates with depressed production of interleukin 2. Infection & Immunity, 50:91-96, 1985. RANGEL-ALDAO, R.; ALLENDE, O.; TRIANA, F.; PIRAS, R.; HENRIQUEZ, D. & PIRAS, M. Possible role of cAMP in the differentiation of Trypanosoma cruzi. Molecular and Biochemical Parasitology, 22:39-43, 1987. RANGEL-ALDAO, R.; TOVAR, G. & DE RUIZ, M.L., 1983. The cAMP receptor protein of Trypanosoma cruzi. Journal of Biological Chemistry, 258: 6979-6983. RANK, R. G.; WHITE, H. J.; HOUGH, A. J.; PASLEY, J. N. & BARRELA, A. L. Effect of estradiol on chlamydial genital infection in female guinea pigs. Infection & Immunity, 38:699-7051982. RASSI JR, A. Simpsio ABC Doena de Chagas. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, 65: 4, 1995.
99
RESTREPPO, A.; SALAZAR, M. E.; CANO, L. E.; STOVER, E.P.; FELDMAN, D. & STEVENS, D. A. Estrogens inhibit mycelium-to-yeast transformation in the fungus Paracoccidioides brasiliensis: Implications for resistance of females to paracoccidioidomycosis. Infection & Immunity, 46: 346-353, 1984. REZENDE, J. M. Chagasic mega syndromes and regional differences, New Approaches in American Trypanosomiasis Research. PAHO Scientific Publication 318:195-205, 1975. RIBEIRO DOS SANTOS, R. & HUDSON, L. Denervation and the immune response in mice infected with Trypanosoma cruzi. Clinical Experimental Immunology, 44: 349-354, 1981. RIVERA, M. T.; THIBAUT, G. & CARLIER, Y. Lactation reduces mortality but not parasitaemia during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 85:603-604, 1991. RIVERA-VANDERPAS, M. T.; RODRIGUEZ, A. M.; AFCHAIN, D.; BAZIN, H. & CAPRON, A. Trypanosoma cruzi: Variation in susceptibility of inbred strains of rats. Acta tropica, 40:5-10, 1983. ROBERTS, C. W.; CRUICKSHANK, S. M. & ALEXANDER, J. Sex-determined resistance to Toxoplasma gondii is associated with temporal differences in cytokine production. Infection & Immunity, 63:2549-2555, 1995. ROBERTS, C. W.; FERGUSON, D. J.; JEBBARI, H.; SATOSKAR, A.; BLUETHMANN, H. & ALEXANDER, J. Different roles for interleukin-4 during the course of Toxoplasma gondii infection. Infection & Immunity, 64:897-904, 1996. ROWE, D. S. Quantitative estimation of immunoglobulins and other serum proteins by immunological methods. Clinical Chimica Acta, 22:43, 1968. SHINOMIYA, N.; TSURU, S.; TSUGITA, M.; KATSURA, Y.; TAKEMURA, T.; ROKUTANDA, M. & NOMOTO, K. Thymic depletion in pregnancy: Kinetics of thymocytes and immunologic capacities of the hosts. Journal Clinical Laboratory Immunology, 34:11-22, 1991. SMITH, S. M. Role de a prolactin in regulating gonadotropin secretation and gonad function in female rats. Federation Proceedings, 39:2571-2576, 1980. SOUZA, E. M. Modulao induzida por estradiol na fase aguda da infeco por Trypanosoma cruzi em camundongos, 1999. Tese de mestrado, Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz. ST CLAIRE, M. C.; RILEY, L. K.; FRANKLIN, C. L.; BESCH-WILLIFORD, C. L. & HOOK JR, R. R. Experimentally induced intravaginal Tritrichomonas foetus infection in the estrogenized mouse. Laboratory Animal Science, 44:430-435, 1994. STYRT, B. & SUGARMAN, B. Estrogens and infection. Reviews Infectious Diseases, 13:1139-1150, 1991. SUTHERLAND, E. W. Studies on the mechanism of hormone action. Science, 177:401-408, 1972. TAFURI, W. L. Pathogenesis of lesions of the autonomic nervous system of the mouse in experimental acute Chagas disease. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 19:405-417, 1970. TALAMANTES, F.; ELGREN, L.; MARKOFF, E.; WOODARD, S. & MADRID, J. Phylogenetic distribution, regulation of secretion, and prolactin-like effects of placental lactogens. Federation Proceedings, 39:2582-2585, 1980. TARLETON, R. L. The role of T-cell subpopulation in experimental Chagas disease. Research in Immunology, 142:130-133, 1991. TEIXEIRA, A. R. L.; FIGUEIREDO, F.; REZENDE, F. J. & MACEDO, V. Chagas disease: A clinical, parasitological, immunological and pathological study in rabbits. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 32:258-272, 1983. TEIXEIRA, A. R. L.; TEIXEIRA, M. L. & SANTOS-BUCH, C. A. The immunology of experimental Chagas disease. IV. Production of lesions in rabbit similar to those of chronic Chagas disease in man. American Journal of Pathology, 80:163-180, 1975. TOIVANEN, P . Enhancement of staphylococcal infection in mice by estrogens. Annals Medical Experimental Biology, 45:138-146, 1967. TORRUELLA, M.; FLAWI, M. M.; EISENSCHLOS, C.; MOLINA E VEDIA, L.; RUBINSTEIN, C. P . & TORRES, H. N. Trypanosoma cruzi adenylate cyclase activity. Purification and characterization. Biochemical Journal, 234:145-150, 1986. TRISCHMANN, T. M. Non-antibody mediated control of parasitemia in acute experimental Chagas disease. Journal of Immunology, 130:1953-1957, 1983. VAN ANDO, R. A.; FRANKLIN, C. L.; ST CLAIRE, M. C.; RILEY, L. K.; BESCH-WILLIFORD, C. L. & HOOK JR, R. R. Lesions of experimental genital Tritrichomonas foetus infections in estrogenized BALB/C mice. Veterinary Pathology, 33:407-411, 1996. VAUGHAN, J. E. & RAMIREZ, H. Coccidiodomicosis as a complication of pregnancy. Cal. Medicine, 74:121-125, 1951. WANG, R. & BOOSEVIC, M. Estradiol increases susceptibility of goldfish to Trypanosoma danilewskyi. Development Comparative Immunology, 18:377-387, 1994. WIDMER, C. G. & AZEVEDO, E. S. Sexo do hospedeiro humano e o desenvolvimento de formas parasitrias do Trypanosoma cruzi no miocrdio. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 14:109-113, 1972.
100
WIRTH, J. J. & KIERSZENBAUM, F. Inhibitory action of elevated levels of adenosine-3:5 cyclic monophosphate on phagocytosis: Effects of macrophage-Trypanosoma cruzi interaction. Journal of Immunology, 129:2759-2762, 1982. YU LEE, L. Y. Prolactin: Role in T-cell proliferation. Molecular basis of the immune response, Bona (ed). Annals of the New York Academy of Sciences, 546:245-247, 1988.
101
Relao Materno-fetal na Infeco Chagsica Experimental
Captulo 6
Relao Materno-Fetal na Infeco Chagsica Experimental

Maria Teresa Rivera & Silvana Marques de Arajo
A prevalncia da infeco por Trypanosoma cruzi em mulheres grvidas varia de 2% a 51% em centros urbanos e de 23% a 81% em zonas endmicas da Amrica Latina (Bittencourt, 1992). Na primeira parte deste captulo, analisaremos os dados da literatura relacionados s conseqncias da gravidez sobre a infeco da me, a infeco congnita e a transmisso de anticorpos maternos.
6.1
A Relao Materno-fetal e Me-filho

6.1.1 Conseqncias da Gravidez sobre a Infeco da Me
A literatura relata somente sete casos de infeco aguda durante a gestao (Bittencourt, 1988). Quatro destas mulheres tiveram crianas prematuras e as outras trs tiveram crianas a termo, sem complicaes. A maioria dos casos, apresentados pela literatura, tratava de pacientes infectadas mas assintomticas (Howard, 1976; Bittencourt, 1976). Duas publicaes salientam a ausncia de alteraes patolgicas em mulheres grvidas que apresentavam forma cardaca crnica da doena de Chagas (Oliveira et al., 1968) e mais recentemente, outra publicao (Gilson et al., 1995) confirma este dado em uma mulher grvida que apresentava problemas cardacos e gastrointestinais relacionados com a fase crnica da doena de Chagas. Um caso de morte materna no incio da gravidez, diretamente associada com a doena de Chagas, foi relatado por Freitas & Pinto Lima, em 1950. Dois falecimentos fora da gravidez foram observados no estudo de Oliveira et al. (1968), onde foram seguidas 106 mulheres grvidas e infectadas por T. cruzi. At o momento no existem dados precisos com relao exacerbao da parasitemia durante a gravidez, nem foram estudadas as interaes entre a infeco por T. cruzi, a capacidade de reproduo e o controle da infeco durante a gestao (Bittencourt, 1992).
6.1.2
Doena de Chagas Congnita
Como a infeco por T. cruzi pode ser transmitida ao feto por via transplacentria, a relao me-filho na doena de Chagas tem sido estudada sobretudo neste contexto. A transmisso pode acontecer tanto durante a fase aguda, quanto
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durante a fase crnica da infeco materna (Howard, 1976; Bittencourt, 1976; Azogue & Darras, 1991). Em regies endmicas a transmisso congnita do T. cruzi um evento freqente. Sua prevalncia mais elevada na Bolvia, chegando a 14,8% em Santa Cruz de la Sierra (Azogue et al., 1985). Segundo Bittencourt et al. (1985), de 10,5% na Bahia, Brasil, e de 10% na Argentina (Votta et al., 1983). A transmisso para o concepto pode se dar de trs formas distintas:
por via hematognica (pr-natal), que a mais freqente; os tripomastigotas provenientes da me invadem
ativamente o trofoblasto, sem leso prvia ou necrose das clulas trofoblsticas, penetrando, assim, nas diferentes clulas placentrias (Dvorak & Schmunis, 1972; Bittencourt, 1988). Os parasitas transformam-se em amastigotas, multiplicam-se e so liberados na corrente circulatria fetal aps transformarem-se, novamente, em tripomastigotas e romperem as clulas hospedeiras (Bittencourt,1988; Azogue & Darras, 1991); atravs do lquido amnitico os parasitas podem contaminar o feto quando ele o aspira (Bittencourt et al., 1981); por via oral, atravs do leite materno (ps-natal) (Mazza et al., 1936; Medina-Lopez, 1983). Segundo Bittencourt (1992), esta forma de transmisso rara. A doena de Chagas congnita grave e provoca freqentemente aborto, fetos prematuros e morte perinatal (Bittencourt, 1976). Um recm-nascido de me chagsica pode nascer assintomtico e os sintomas de fase aguda aparecerem alguns dias ou meses mais tarde (Howard, 1976; Azogue & Darras, 1991), com mortalidade de 49% durante o primeiro ano de vida (Bittencourt, 1988, 1992). A metodologia utilizada no diagnstico da infeco chagsica em recm-nascidos :
exame parasitolgico direto (mtodo de Strout) em sangue do cordo umbilical e do recm-nascido (Azogue &
Darras, 1991);
estudo patolgico de placentas e seus anexos (Azogue & Darras, 1991; Bittencourt, 1992); xenodiagnstico (Azogue & Darras, 1991; Bittencourt, 1992); estudo sorolgico de anticorpos IgM e IgG do recm-nascido, com especificidade para o antgeno SAPA (Reyes
et al., 1990; Bittencourt, 1992).
6.1.3
Transmisso de Anticorpos da Me ao Feto
No homem, os anticorpos maternos anti T. cruzi foram evidenciados no sangue do cordo umbilical, indicando assim uma clssica transmisso transplacentria (Miles, 1972; Brenire et al., 1983). No entanto, nenhum dado existe sobre os isotipos de imunoglobulinas da classe G (IgG) transmitidos, nem sobre a proteo que eles possam eventualmente exercer. A transmisso de anticorpos maternos e de seus idiotipos pode tambm induzir in utero uma sensibilizao antiidiotpica de linfcitos T do feto. Este fenmeno poderia influenciar o desenvolvimento da futura resposta imune neste feto e a mortalidade de recm-nascidos uma infeco por T. cruzi adquirida aps o nascimento em zona endmica para a doena de Chagas (Eloi-Santos et al., 1989). As transmisses pr-natal e ps-natal de anticorpos maternos tm sido demostradas em camundongos e ratos (Kolodny, 1939; Miles, 1972; Baitner, 1986; Marques de Arajo et al., 1996). A imunidade assim adquirida no impede a infeco, mas diminui a mortalidade e a gravidade de uma infeco adquirida aps o nascimento, se esta acontece at dez dias depois do desmame dos animais (Kolodny 1939; Marques de Arajo & Chiari, 1996). Por outro lado, no se pode deixar de mencionar o papel prejudicial que anticorpos maternos anti T. cruzi podem desenvolver em camundongos descendentes de mes chagsicas (Marques de Arajo et al., 1996) que analisaremos mais adiante. Os isotipos de anticorpos preferencialmente transmitidos pelos animais infectados por T. cruzi no tm sido estudados. De maneira geral sabe-se que as imunoglobulinas IgG2a esto presentes em maior quantidade no leite dos camundongos que em outros isotipos. A passagem de imunoglobulinas por via digestiva limita-se s IgG que se fixam a receptores Fc da superfcie dos entercitos do jejuno (Simister, 1990)
104
6.2
A Relao Materno-Fetal na Infeco Experimental por T. cruzi
Como j comentado, a relao me-filho na doena de Chagas tem sido estudada sobretudo no contexto da transmisso congnita no homem e no animal, dispondo-se de poucos dados sobre outros aspectos importantes desta relao. As conseqncias da infeco da me sobre o crescimento e o desenvolvimento imunitrio do feto e do recm-nascido, alm da avaliao da suscetibilidade da prole infeco pelo T. cruzi sem transmisso congnita do parasito, no haviam sido estudadas. O Laboratrio de Parasitologia da Universidade Livre de Bruxelas dedicou-se ao estudo da relao maternofetal e da relao me-filho, abordando estas perguntas em um modelo experimental sem a transmisso congnita do T. cruzi. Foi escolhido o camundongo Balb/C que, quando infectado pelo parasita, apresenta suscetibilidade intermediria infeco e desenvolve a doena de Chagas crnica de maneira semelhante do homem, permitindo, assim, abordar tambm outros aspectos da interao entre a infeco, a gravidez e a imunidade materna.
6.2.1 Interaes entre a Infeco Crnica por T. cruzi do Camundongo com a Gestao
Estudaram-se as conseqncias da infeco crnica por T. cruzi sobre a capacidade de reproduo de camundongos e sobre o crescimento fetal. Tambm analisaram-se uma eventual transmisso congnita e a influncia da gestao sobre a infeco da me. As principais concluses deste trabalho (Carlier et al., 1987) foram:
a infeco por T. cruzi no modifica nem a fecundidade nem a reproduo no camundongo. Estes resultados
foram evidenciados pela comparao das taxas de acasalamento, gravidez e de implantaes e reabsores fetais nos cornos uterinos, observadas entre fmeas grvidas, infectadas cronicamente, e seus controles, fmeas grvidas no infectadas; a infeco por T. cruzi altera o peso dos camundongos antes da gestao mas no altera o peso das placentas; a infeco crnica da me neste modelo no leva infeco congnita mas provoca um retardo do crescimento fetal. Estes resultados mostraram que a gestao no modifica a infeco da me nem a sua capacidade de reproduo, mas leva a um retardo do crescimento intra-uterino, sem transmisso do parasito.
6.2.2
A Lactao Diminui a Mortalidade mas no a Parasitemia Durante a Fase Aguda da Infeco por T. cruzi em Camundongos
Analisou-se a influncia da lactao sobre o desenvolvimento da infeco aguda por T. cruzi e deste estudo concluiu-se que a mortalidade de fmeas de camundongos em lactao infectadas inferior de fmeas infectadas fora do perodo de lactao (aps um a dez dias de lactao) (Rivera et al., 1991). Por outro lado, fmeas de camundongos infectadas em perodo de lactao suportaram parasitemia superior (4,5 vezes maior) e tiveram o perodo de vida mais longo que seus controles, fmeas infectadas fora do perodo de lactao. Estas observaes indicam claramente o efeito benfico da lactao sobre a fase aguda da infeco por T. cruzi em camundongos, diminuindo as conseqncias letais de uma parasitemia muito elevada.
105
6.2.3 A Resposta Imune Humoral e Celular em Fmea de Camundongo Grvida e Cronicamente Infectada por T. cruzi
De acordo com os dados obtidos anteriormente, que no evidenciaram influncia da gravidez sobre o nvel da infeco de fmeas de camundongos infectados, e sabendo que a gravidez pouco altera o estado imunitrio de um animal no infectado, pretendeu-se com este estudo esclarecer se a resposta imune, profundamente modificada em camundongos infectados por T. cruzi, era ou no modificada pela gravidez. Os resultados obtidos foram os seguintes, considerando a imunidade humoral (Carlier et al., 1987):
a gravidez modifica sensivelmente a hipergamaglobulinemia associada infeco por T. cruzi. Os nveis de IgG,
sobretudo os de IgG2a e de IgG3, so particularmente baixos; os de IgM so pouco afetados e os de IgA no so afetados de forma alguma. Os nveis de complexos imunes circulantes, o fator reumatide e os anticorpos anti DNA esto igualmente reduzidos de maneira significativa. Estes dados indicam uma diminuio sensvel no nvel de ativao policlonal B, que tem lugar durante a infeco crnica pelo parasita; a gravidez diminui a taxa de anticorpos anti T. cruzi (-37%), mas no modifica a de IgM, nem a dos anticorpos lticos; a gravidez no modifica, sensivelmente, o reconhecimento dos antgenos de T. cruzi pelos anticorpos destes camundongos. Estes resultados permitiram afirmar que a gravidez, durante a infeco crnica pelo T. cruzi, est associada a uma diminuio de certos parmetros imunolgicos humorais, os quais, no entanto, so insuficientes para modificar o curso da infeco. O papel da gestao sobre a imunidade celular em camundongos foi estudado utilizando-se o teste de proliferao celular com clulas de bao de camundongo, obtidas no 17o dia de gestao, ante a Con A e ante uma preparao antignica de T. cruzi (Rivera et al., dados no publicados). Estudou-se tambm a produo de duas citocinas multifuncionais importantes, IFN- e TNF-, que podem intervir durante a gestao (Chen et al., 1991; Shirahata et al., 1992) e que tambm esto implicadas durante a infeco pelo T. cruzi (Tarleton & Nabors, 1991; Torrico et al., 1991). A deteco destas citocinas foi feita em sobrenadantes celulares e no soro dos camundongos estudados. Os resultados mostraram claramente que a gravidez no afeta nem a resposta proliferativa especfica nem a inespecfica. No entanto, a infeco por si mesma deprime a resposta celular Con A em fmeas de camundongos grvidas ou no. Isto confirmou, mais uma vez, o efeito imunossupressor da infeco por T. cruzi em camundongos e evidenciou o papel considervel da infeco da me sobre seu estado imunolgico e de suas eventuais repercusses sobre o feto. A produo das citocinas estudadas nos sobrenadantes de clulas esplnicas no se modifica com a gravidez. Ao contrrio, a produo srica de TNF- mostrou-se aumentada em fmeas de camundongos infectadas e grvidas. Este ltimo resultado incentivou o prosseguimento dos estudos desta citocina nas referidas fmeas, como ser visto mais adiante.
6.2.4
Diminuio da Resistncia Infeco por T. cruzi Adquirida na Prole de Fmeas de Camundongos Cronicamente Infectados
Diversos elementos imunolgicos como anticorpos, antgenos circulantes, imunocomplexos, citocinas ou clulas sensibilizadas podem ser transmitidas da me sua prole e assim modular a resposta imune de sua
106
descendncia. No que concerne prole de fmeas de camundongos grvidas infectadas, pretende-se inicialmente verificar a hiptese da existncia de uma possvel modificao na resistncia destas proles infeco pelo T. cruzi adquirida aps seu nascimento. Para tanto, seguiu-se o desenvolvimento de uma infeco pelo T. cruzi em proles com dois meses de idade, descendentes de mes cronicamente infectadas. Os resultados obtidos podem ser assim resumidos (Carlier et al., 1992):
ausncia de infeco congnita na prole de fmeas de camundongos cronicamente infectadas no modelo utilizado; observao de parasitemia e mortalidade mais elevadas na prole descendente de mes infectadas; esta diminuio da resistncia da prole a uma infeco adquirida pelo T. cruzi mxima quando esta prole foi exposta influncia materna no perodo pr-natal (placenta) e ps-natal (leite). Este fato leva a prole a uma incapacidade de controlar a fase aguda da infeco pelo T. cruzi, mas no tem efeito sobre sua fase crnica; este fenmeno especfico para o T. cruzi, e mostrou-se reversvel e transitrio uma vez que no observado em proles infectadas aos cinco meses de idade. Estes resultados sugerem uma depresso da resposta imune infeco adquirida por T. cruzi em proles descendentes de fmeas de camundongos cronicamente infectadas com este mesmo parasito. Sugerem ainda uma influncia materna que pode ser prejudicial e no protetora para a prole.
6.2.5
Produo Elevada do Nvel de Tnf- em Fmeas de Camundongos Grvidas Infectadas Cronicamente por T. cruzi e seu Aumento nos Fetos e na Prole destas Fmeas
Os trabalhos anteriormente realizados mostraram, por um lado, que a infeco crnica por T. cruzi em fmeas de camundongos grvidas levava a um retardo de crescimento fetal intra-uterino. Por outro lado, a prole destas mesma fmeas cronicamente infectadas apresentou nveis elevados de parasitemia e mortalidade, sugerindo uma depresso em sua resposta imune a uma infeco adquirida por T. cruzi. Considerando que o TNF- uma citocina multifuncional implicada no crescimento fetal, na maturao dos tecidos linfides fetais e que pode dar origem a leses fatais em fenmenos inflamatrios agudos (Clark & Chaudri, 1988; De Kossodo et al., 1992; Giroir et al., 1992), investigou-se o seu papel nos fenmenos anteriormente observados nas interaes materno-fetal e me-filho na infeco pelo T. cruzi. Estudou-se assim, a produo dessa citocina em fmeas de camundongos infectadas e grvidas, no timo fetal e na prole destas fmeas, especialmente quando apresentavam uma infeco adquirida pelo T. cruzi. Os resultados obtidos foram os seguintes (Rivera et al., 1995):
a gestao aumenta os nveis sricos de TNF- em fmeas de camundongos cronicamente infectados pelo T.
cruzi; as clulas tmicas de fetos provenientes de mes infectadas por T. cruzi produzem muito mais RNA de TNF-; a prole (machos e fmeas) descendente de fmeas cronicamente infectadas capaz de produzir nveis elevados de TNF- srico circulante, depois de estimulados com LPS. Estes resultados sugerem que descendentes de fmeas de camundongos cronicamente infectadas pelo T. cruzi so estimulados a produzir nveis elevados TNF- antes e aps o nascimento. Isto mostra o papel importante desta citocina nas relaes materno-fetal e me-filho durante a infeco pelo T. cruzi.
107
6.2.5
Os Anticorpos Maternos Anti T. cruzi de Fmeas de Camundongos e sua Influncia no Agravamento da Infeco Aguda por T. cruzi de sua Prole
Outros fatores solveis existentes no soro de fmeas de camundongos cronicamente infectadas com T. cruzi e que podem ser transmitidos sua prole so os anticorpos especficos contra este parasita. Neste estudo analisou-se o possvel papel destes anticorpos maternos no agravamento da infeco adquirida por T. cruzi na prole descrita anteriormente. Para tanto, reproduziu-se a fisiologia da transferncia de anticorpos maternos anti T. cruzi previamente observados no homem e no camundongo, inoculando em fmeas de camundongos grvidas, em perodo de lactao e no infectadas, soro crnico ou anticorpos anti T. cruzi purificados, provenientes de fmeas de camundongos cronicamente infectadas. Foram obtidos os seguintes resultados (Marques de Arajo et al., 1996):
fmeas de camundongos grvidas e lactantes inoculadas com soro crnico ou com anticorpos anti T. cruzi
purificados apresentaram nvel mais baixo de anticorpos circulantes quando comparadas com fmeas infectadas fora da gravidez e do perodo de lactao, sugerindo assim que existe transferncia de anticorpos para o feto e para a prole que est sendo aumentada; a prole descendente destas fmeas inoculadas com soro ou anticorpos anti T. cruzi purificados e que por sua vez foi inoculada com o parasita aos dois meses de idade apresentou parasitemia mais elevada e menor sobrevida que camundongos infectados com T. cruzi e sem transferncia de anticorpos maternos anti T.cruzi. Estes resultados mostraram que a transferncia de anticorpos maternos pode exercer influncia prejudicial sobre sua prole. Isto no exclui a funo de outros fatores maternos transmitidos sua descendncia, como os antgenos parasitrios circulantes ou os fatores envolvidos na induo da transcrio do TNF-, analisada anteriormente. Como perspectivas deste trabalho experimental pode-se considerar os seguintes aspectos: o conjunto dos resultados obtidos leva reflexo sobre a relao da influncia materna da infeco pelo T. cruzi sobre a susceptibilidade de sua prole infeco por este mesmo parasito e deixa claro sua influncia prejudicial em certas etapas da vida pr e ps-natal; leva ao questionamento sobre o papel das relaes materno-fetais e sobre o desenvolvimento das formas clnicas da doena de Chagas na qual existe um gradiente considervel de gravidade. As crianas em reas endmicas so particularmente sensveis infeco aguda pelo T. cruzi durante os cinco primeiros anos de vida e este modelo experimental sugere uma explicao possvel para esta observao. Evidentemente as concluses deste trabalho experimental no podem ser extrapoladas diretamente para o homem, no entanto podem conduzir a investigaes epidemiolgicas sobre a possibilidade de retardo de crescimento fetal em crianas no infectadas, nascidas de mes infectadas e o impacto deste retardo sobre sua sade no futuro. Podem ainda, conduzir suspeita de ocorrncia de infeco adquirida mais grave em filhos de mes chagsicas. Aventadas estas situaes, a dupla me chagsica-filho poder ser vista como um grupo de alto risco, levando a decises de sade pblica que tenham como objetivo limitar os efeitos graves da doena de Chagas em reas endmicas.
AZOGUE, E. & DARRAS, C. Estudio prospectivo de la enfermedad de Chagas en recin nacidos con infeccin placentaria por Trypanosoma cruzi en Santa Cruz-Bolivia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24:105-109, 1991. AZOGUE, E.; FUENTE, L.A. & DARRAS, C. Congenital Chagas disease in Bolivia: Epidemiological aspects and pathological findings. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 79:176-180, 1985. BAITNER, K. Intestinal absorption of macromolecules and immune transmission from mother to young. 1986. CRS press.
108
BITTENCOURT, A. L. Congenital Chagas disease. American Journal of Disease of Children, 130:97-103, 1976. BITTENCOURT, A. L. American trypanosomiasis Chagas disease. In: Parasitic infections in pregnancy and the newborn. 1988. Oxford: Oxford Medical Publications, p. 62-86. BITTENCOURT, A. L. Possible risk factors for vertical transmission of Chagas disease. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 34:403-408, 1992. BITTENCOURT, A. L.; MOTA, E.; RIERO FILHO, R.; FERNANDES, L. G.; CERQUEIRA DE ALMEIDA, P . R.; SHERLOCK, I.; MAGUIRE, J.; PIESMAN, J. & TODD, C. W. Incidence of congenital Chagas disease in Bahia, Brazil. Journal of Tropical Pediatrics, 31:242-248, 1985. BITTENCOURT, A. L.; RODRIGUEZ DE FREITAS, L. A.; GALVO DE ARAUJO, M. O. & JACOMO, K. Pneumonitis in congenital Chagas disease. A study of ten cases. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 30:38-42, 1981. BRENIERE, F. S.; BAILLY, M.; CARRASCO, R. & CARLIER, Y. Transmission transplacentaire des anticorps anti-Trypanosoma cruzi. Cahiers ORSTOM, Srie Entonologie Medicale et Parasitologie Vol XXI:139-140, 1983. CARLIER, Y.; RIVERA, M. T.; TRUYENS, C.; PUISSANT, F. & MILAIRE, J. Interactions between chronic murine Trypanosoma cruzi infection and pregnancy: Fetal growth retardation. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 37:534-540, 1987. CARLIER, Y.; RIVERA, M. T.; TRUYENS, C.; GOLDMAN, M.; LAMBERT, P .; FLAMENT, J.; BAUWENS, D. & VRAY, B. Pregnancy and humoral immune response in mice chronically infected by Trypanosoma cruzi. Infection & Immunity, 55:24962501, 1987. CARLIER, Y.; RIVERA, M. T.; TRUYENS, C.; ONTIVERO, M.; FLAMENT, J.; VAN MARCK, E. & DE MAERTELAER, V. Chagas disease: Decreased resistance to Trypanosoma cruzi acquired infection in offspring of infected mice. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 46:116-122, 1992. CHEN, H. L.; YANG, Y.; HU, X. L.; YELAVARTHI, K. K.; FISHBACK, J. L. & HUNT, J. S. TNF-a mRNA and protein are present in human placental and uterine cells at early and late stages of gestation. American Journal of Pathology, 139:327-335, 1991. CLARK, I. A. & CHAUDHRI, G. Tumor necrosis factor in malaria-induced abortion. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 39:246-249, 1988. DE KOSSODO, S.; GRAU, G. E.; DANEVA, T.; POINTAIRE, P .; FOSSATI, L.; ODY, C.; ZAPF, J.; PIGUET, P . F.; GAILLARD, R. C. & VASSALLI, P. Tumor Necrosis Factor is involved in mouse growth and lymphoid tissue development. Journal of Experimental Medicine, 176:1259-1264, 1992. DVORAK, J. A. & SCHMUNIS, G. A. Trypanosoma cruzi: Interaction with mouse peritoneal macrophages. Experimental Parasitology, 32:289-300, 1972. ELOI-SANTOS, S. M.; NOVATO-SILVA, E.; MASELLI, V. M.; GAZZINELLI, G.; COLLEY, D. G. & CORREA-OLIVEIRA, R. Idiotypic sensitization in utero of children born to mothers with schistosomiasis or Chagas disease. Journal of Clinical Investigation, 84:1028-1031, 1989. FREITAS, J. L. P . & PINTO LIMA, F. X. Sobre a transmisso intrauterina da infeco pelo Trypanosoma cruzi. A propsito de uma observao antomo-clnica. Revista do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina So Paulo, 5:1-8, 1950. GIROIR, B. P.; BROWN, T. & BEUTLER, B. Constitutive synthesis of tumor necrosis factor in the thymus. Proceedings of the National Academy of Science USA, 89:4864-4868, 1992. GILSON, G. J.; HARNER, K. A.; ABRAMS, J.; IZQUIERDO, L. A. & CURET, L. B. Chagas disease in pregnancy. Obstetrics & Gynecology, 86:646-647, 1995. HOWARD, J. E. Clinical aspects of congenital Chagas disease. American Trypanosomiasis research. PAHO Scientific Publication, 318:212-215, 1976. KOLODNY, M. H. The transmission of immunity in experimental trypanosomiasis Trypanosoma cruzi from mothers rats to their offspring. American Journal of Hygiene, 30:19-39, 1939. MARQUES DE ARAJO, S. & CHIARI, E. Trypanosoma cruzi infection in offspring born to chagasic C3H/He mice mothers. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 91:211-216, 1996. MARQUES DE ARAJO, S.; RIVERA, M. T.; ELBOUHDIDI, A.; DE MAERTELAER, V. & CARLIER, Y. Maternal Trypanosoma cruzi-specific antibodies and worsening of acute infection in mouse offspring. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 54:13-17, 1996. MAZZA, S.; MONTANA, A.; BENITEZ, C. Transmisin del Schizotrypanum cruzi al nio por leche de la madre con enfermedad de Chagas. Universidad Buenos Aires. MEPRA, 28:41-46, 1936. MEDINA-LOPEZ, M. D. Transmisso materno-infantil da doena de Chagas. 1983. Tese. Braslia: Universidade do Brasil.
109
MILES, M. A. Trypanosoma cruzi milk transmission of infection and immunity from mother to young. Parasitology, 65:1-9, 1972. OLIVEIRA, F. C.; LOPES, E. R. & ALONSO, M. T. Doena de Chagas e gravidez. Consideraes sobre a conduta obsttrica. Folha Medica, 56:165-177, 1968. REYES, M. B.; LORCA, M.; MUNOZ, P . & FRASCH, A. A. Fetal IgG specificities against Trypanosoma cruzi antigens in infected newborns. Proceedings of the National Academy of Science USA, 87:2846-2850, 1990. RIVERA, M. T.; MARQUES DE ARAJO, S.; LUCAS, R.; DEMAN, J.; TRUYENS, C.; DEFRESNE, M. P .; DE BAETSELIER, P . & CARLIER, Y. High TNF- production in Trypanosoma cruzi-infected pregnant mice increased TNF-gene transcription in their offspring. Infection & Immunity, 63:591-595, 1995. RIVERA, M. T.; THIBAUT, G. & CARLIER, Y. Lactation reduces mortality but not parasitaemia during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 85:603-604, 1991. SHIRAHATA, T.; MUROYA, N.; OHTA, C.; GOTO, H. & NAKANE, A. Correlation between increased susceptibility to primary Toxoplasma gondii infection and depressed production of gamma interferon in pregnant mice. Microbiology & Immunology, 36:81-91, 1992. SIMISTER, N. E. Transport of monomeric antibodies across epithelia. In: Fc receptors and the action of antibodies, 1990. Washington, DC: American Society for Microbiology, p. 57-73. TARLETON, R. L. & NABORS, G. S. Regulation of cytokine production in Chagas disease. In: Molecular and immunological aspects of parasitism, 1991. Washington; DC: American Association for the Advancement of Science, p. 15-30. TORRICO, F.; HEREMANS, H.; RIVERA, M. T.; VAN MARCK, E.; BILLIAU, A. & CARLIER, Y. Endogenous IFN-g is required for resistance to acute Trypanosoma cruzi infection in mice. Journal of Immunology, 146:3626-3632, 1991. VOTTA, R. A.; PARADA, O. H. & WINOGRAD, R. H. Obstetricia. 1983. Buenos Aires: Ed. Lopez Libreros SLL.
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Quimioterapia Experimental
C apt u l o 7
Solange L. de Castro, Ricardo M. Santa-Rita & Marcelo Einicker-Lamas
Praticamente desde a descoberta da doena de Chagas, seu tratamento vem sendo investigado. Na dcada de 60, o desenvolvimento de drogas contra esta doena estava relativamente atrasado em relao quele contra infeces por outros tripanosomatdeos, sendo o Trypanos oma cruzi geralmente resistente a compostos ativos contra leishmanias e outros tripanosomas (Hawking, 1973). Podemos dividir o desenvolvimento da pesquisa destas drogas em duas fases, com o divisor na dcada de 70, quando foram descritoso nifurtimox e o benznidazol.
7. 1 Estudos com Nifurtimox e Benznidazol

Atualmente, o tratamento da doena de Chagas est restrito a duas drogas nitro-heterocclicas: o nitrofurano nifurtimox (Nif, Lampit, Bayer, 3-metil-4-(5'-nitrofurfurilidenoamino) tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dixido) introduzido na clnica em 1965, e que teve sua produo descontinuada no Brasil, e o 2-nitroimidazol benznidazol (Bz, Radanil ou Rochagan, Roche, N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida) introduzido na dcada seguinte (revisto por Luquetti, 1997). Nif e Bz so ativas na fase aguda da doena de Chagas, porm tm efeito limitado sobre a forma crnica da doena (Rassi, 1982) as principais indicaes destas drogas so: fase aguda da infeco, forma congnita, reativao associada com imunossupresso, infeces recentes e em situaes de transfuses ou transplante de rgos. As drogas podem tambm ser indicadas para o tratamento de alguns pacientes nas formas indeterminada e crnica com fraco envolvimento cardaco. A prescrio do tratamento etiolgico na fase crnica controversa devido a dificuldades em monitorar sua eficincia teraputica (Viotti et al., 1994) os e squemas mais utilizados de tratamento so: Nif por 60-90 dias, 8-10 mg/kg/dia em adultos e menos que 15 mg/kg/dia em crianas; Bz por 60 dias, 5 mg/kg/dia em adultos e menos de 10 mg/kg/dia em crianas. Ambas as drogas devem ser divididas em duas a trs fraes aps as refeies. Reaes adversas esto associadas a perturbaes no trato digestivo como inapetncia, nusea, vmito e perda de peso com Nif e dermopatia e polineuropatia com Bz. As principais limitaes das drogas so a necessidade de tempos longos de administrao e efeitos colaterais (Coura, 1996; Canado, 1997). Foram tambm relatadas falhas teraputicas, provavelmente relacionadas com a variao de sensibilidade s drogas nas populaes de parasitas na Amricas Central e do S ul.
O O2N O CH N N H3 C
Nifurtimox
O CH2 CNH CH2
S O
N N
NO2
Benznidazol
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Nif e Bz em estudos em animais experimentais o Nif, testado sobre infeces em diferentes espcies de animais, apresentou atividade dependente da cepa do parasita (Bock et al., 1969; Haberkorn & Gonnert, 1972). A anlise ultra-estrutural dos amastigotas intracelulares mostrou alteraes semelhantes s descritas no estudo em cultura de clulas (Voigt et al., 1972, 1973) bem como a induo de vacuolizao, inchamento da mitocndria e alteraes de membrana parasita, alm de leses nas clulas cardacas ao redor de parasitas danificados (Andrade & Freitas, 1987). A administrao de Bz a camundongos, em dose nica (1 g/kg), sete dias ps-infeco (cepa Y), levou a uma queda progressiva na parasitemia, que se negativou aps dez dias (Richle, 1973; Polak & Richle, 1978). Vrios estudos foram tambm realizados comparando-se a sensibilidade de diferentes cepas frente ao Nif e ao Bz em infeces experimentais:
os percentuais de cura em infeces com a cepa Peru foram superiores queles com a cepa Colombiana,
observando-se desenvolvimento de resistncia ao Nif e ao Bz (Andrade et al., 1975, 1977; Andrade & Figueira, 1977); Brener et al. (1976), comparando as cepas Y e CL, e Andrade et al. (1985), analisando a susceptibilidade de trinta cepas de diferentes regies, observaram uma boa correlao entre as atividades das duas drogas para uma dada cepa, indicando que os diferentes percentuais de cura estariam associados a fatores do parasita; analisando 47 cepas isoladas de diferentes fontes, Filardi & Brener (1987) relataram uma larga faixa de susceptibilidade ao Nif e ao Bz, correlacionada em vrios casos com a regio geogrfica: as provenientes do sul do Brasil e da Argentina eram mais sensveis em relao s de Minas Gerais. Essa diferena poderia estar associada a diferentes percentuais de cura de pacientes relatados na Argentina e no Brasil (Canado & Brener, 1979). Infectando camundongos com parasitas isolados de quatro pacientes agudos (antes do tratamento com Bz), Filardi & Brener (1987) observaram que animaisque receberam parasitasprovenientesdos doispacientestratados, consideradoscurados, responderam bem ao tratamento, enquanto o contrrio ocorreu com aquelesinfectadoscom parasitas dos pacientes no curados, mostrando assim correlao entre os resultados experimentais e clnicos. Andrade et al. (1992) observaram uma correlao de 81,8% entre o resultado do tratamento de paciente s com Nif e o de camundongos recm-natos. No caso desta droga, a correlao entre as dosagens para camundongosfoi baseada em Haberkorn & Gonnert (1972), que estabeleceram a equivalncia entre dosesde 15 ou 10 mg/ kg para homens adultos e doses de 180 ou 120 mg/kg para os animais (Andrade et al., 1992). O mecanismo de ao de Nif foi intensamente estudado pelo grupo de Do Campo (revisto em Do Campo & Moreno, 1986); a reduo metablica do grupo nitro por nitroredutases foi de fundamental importncia, levando gerao de radical nitroanion. S endo o T. cruzi parcialmente deficiente nos mecanismos de detoxicao, ele se torna mais susceptvel a produtos de reduo do oxignio (Do Campo et al., 1976; Boveris et al., 1980; Morello, 1988). 2 ArNO2 + NADPH + H + ---NR---> 2 ArNO2-. + NADP++ 2H + ArNO2-. + O2------> ArNO2 + O2-. O2-. + O2-. + 2H + --SOD--> H 2O2 + O2 O2-. + H 2O2 ----Fe3+--> O2 + OH . + OH Na presena de Nif em T. cruzi foram observados aumentos no consumo de O2, na liberao de H 2O2, e na taxa de produo de ion superxido e de H 2O2. Tambm foi detectado o radical nitroanion na presena de NADPH em concentraes de Nif que causam efeito sobre a proliferao do parasita. A mesma estava na faixa de concentrao srica alcanada em adultos aps dose nica de 15 mg/kg (10 mM ) (Do Campo & Stoppani, 1979).
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O dano oxidativo foi descartado como mecanismo de ao de Bz para T. cruzi , pois em concentraes semelhantes s utilizadas em estudos com Nif, nas quais a droga mostrou atividade tripanocida, no houve estmulo da gerao de ion superxido e de H 2O2. Somente foi detectado radical nitroanion quando o Nif foi usado em concentraes muito superiores (10 mM) quelas necessrias para afetar o parasita. A ao de Bz sobre T. cruzi poderia envolver um efeito direto sobre a sntese de macromolculas por ligao covalente ou outras interaes dos intermedirios de nitroreduo com componentes celulares (Polak & Richle, 1978; Goijman et al., 1985; Do Campo & Moreno, 1986), ou uma ao inibitria direta de Bz sobre a atividade catenante da DNA topoisomerase do parasita (Riou et al., 1984). Foi observada por Diaz de Toranzo et al. (1988) a ligao de Bz DNA, lipdeos e protenas de epimastigotas de T. cruzi . Nif e Bz apresentam efeitos colaterais srios com danos, principalmente, ao sistema nervoso central e ao trato gastrointestinal; em alguns casos o tratamento foi temporariamente suspenso ou mesmo abandonado. Estudos em animaisexperimentais mostraram que potencialmente estas drogaspodem produzir efeitos danosos na fertilidade e no processo reprodutivo (Hoffman, 1972; Lorke, 1972; Navarro & Nagel, 1984; Bernacchi et al., 1986; Vieira et al., 1989). O tratamento de camundongos com Nif levou a um aumento na formao de microncleos na medula ssea, enquanto o Bz no apresentou efeito (Gorla & Castro, 1985). Coelhos tratados com Nif ou Bz (8mg/kg/dia/60 dias) apresentaram alta incidncia de linfomas malignos e, no caso de Bz, em 20% dos animais foi observada atrofia testicular (Teixeira et al., 1990a,b). Por outro lado, em estudos com camundongos tratados com Bz, no foi detectado aumento na incidncia de linfomas (Lima Pereira et al., 1986). No caso de crianas chagsicas tratadas com Bz, Gorla et al. (1988) observaram um aumento nos danos ao nvel de cromossomas em linfcitos perifricos. Em crianas tratadas com Nif o nvel de dano gentico espontneo foi treze vezes superior s chagsicas no tratadas (Gorla et al., 1989).
7.2 Esquemas e Acompanhamento do Efeito de Drogas em Animais Experimentalmente Infectados

Como o T. cruzi infecta um grande nmero de clulas in vitro, o "tratamento" de culturas infectadas permite estudos quantitativos. Com quantidades pequenas de droga, possvel a deteco da atividade sobre formas intra e/ou extracelulares, bem como de sua toxicidade para a clula hospedeira. Este tipo de estudo possibilita o controle das condies experimentais. Devemos estar alertas porm para o fato de que a simplificao introduzida pelo contato direto droga/clula infectada no permite extrapolao dos resultados para situaes in vivo, pois a influncia do metabolismo e da resposta imune no podem ser avaliadas. Entre os sistemas in vitro para o estudo de drogas, diferentes tipos de cultura de tecidos ou clulas foram utilizados (revisto em Brener, 1975, 1979 e De Castro, 1993). A abordagem in vitro facilita a elaborao de ensaios em animais experimentais e testes clnicos para desenvolvimento de quimoterpicos mais eficazes e menos txicos. Naturalmente a simplificao oferecida por esta abordagem no permite a extrapolao dos resultados para situaes in vivo, pois, com o contato direto da droga a ser testada com a clula infectada, a influncia do metabolismo e da resposta imune do hospedeiro no podem ser avaliadas. Em experimentos com animais, a maioria dos tratamentos foi realizada com tempos muitos curtos e os resultados expressos apenas como redues da parasitemia, mortalidade e durao da fase aguda. A introduo de esquemas de longa durao (Brener, 1961a,b) e a padronizao de ensaios de acompanhamento represe ntaram um grande avano nessa rea. No existe at hoje um modelo consensual claro e caracterizado no qual o efeito de um quimioterpico possa ser acompanhado nas fases aguda e crnica da infeco chagsica. No modelo de camundongo infectado por T. cruzi a principal caracterstica a existncia de grandes diferenas no curso da infeco a depender da cepa de camundongo utilizada e da origem (cepa ou clone) dos parasitas (ver Captulo 9).
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O modelo clssico de estudo de quimioterapia experimental o de camundongo albino Swiss, no isognico, infectado com 104 tripomastigotas sangneos da cepa Y . Nesse modelo h alta parasitemia na segunda semana e alta mortalidade em torno da terceira semana ps infeco, claramente revertidas pelo tratamento e specfico. Para estudos das fases indeterminada e crnica, essencial que o par hospedeiro-parasita escolhido apresente as seguintes caractersticas: (a) tenha parasitemia patente, porm baixa mortalidade na fase aguda para acompanhamento nas fases indeterminada e crnica; (b) apresente curvas de parasitemia de intens idade e cintica reprodutveis, uma vez fixados a idade e o sexo do animal, o inculo e a via de inoculao; (c) mantenha, na fase, aguda as caractersticas clssicas bsicas da infeco no camundongo: ativao policlonal, imunossupresso com apoptose, sorologia e resposta linfoproliferativa positiva para antgeno de T. cruzi aps trinta dias de infeco e miocardite detectvel, embora no necessariamente intensa. Os camundongos devem ser acompanhados por quarenta dias (fase aguda), at seis a 48 meses (fases indeterminada e crnica). Como ponto de partida nestes estudos temos principalmente os trabalhos do grupo de Brener (Brener, 1961a,b, 1962; Filardi & Brener, 1987) e de Andrade (Andrade & Figueira, 1977; Andrade et al., 1985, 1987). Brener (1962) observou que a atividade de drogas mais rpida e mais facilmente detectada se administrada no dia da infeco ou no dia posterior. Este autor tambm recomenda, no caso de nova droga, utilizar a dosagem correspondente a cerca de um quinto da LD 50 (dose que mata 50% dos animais) administrada por dez dias consecutivos. De um modo geral o tempo de tratamento depende do modelo escolhido e, assim, da cintica de parasitemia. Estudos preliminares, in vivo, de drogas tripanocidas se concentram na fase aguda e analisam apenas parasitemia e mortalidade, comparando-se animais infectados tratadose no tratadose utilizando-seos mtodos descritos neste manual. No caso de uma pr-seleo dedrogaspotencialmenteativas necessrio analisar maisa fundo esta a tividade, utilizando alm da mortalidade e da parasitemia, diferentes critrios de cura alm dos acima mencionados: subinoculao desangueem recm-nascidos, reinoculao desangueou homogenatosdetecidos, xenodia gnstico, hemocultura, histologia e deteco de anticorpos especficos anti T. cruzi e PCR. S egundo Brener (1962), a subinoculao e o xenodiagnstico apresentam alta eficcia e a reinoculao pode prover resultados importantes na medida que a persistncia da infeco est associada com alta imunidade a superinfeces. Deum modo geral, a maioria dosestudosseapoia na cura deanimaisagudamenteinfectados, com paras itemia patente, como indicador de sucesso. Porm em infeces humanas os perfis parasitolgicos, patolgicos e de sensibilidade a drogasse alteram marcadamente com o progresso da infeco. Desta forma o resultado de estudos apenas com animais de fase aguda pode ser deficiente. Mesmo em trabalhos de quimioterapia experimental utilizando os nitroheterocclicos Nif e Bz, pouca ateno tem sido dada resposta imune. Desta forma seria interessante o desenvolvimento de um conjunto de parmetros indicativos do grau de ativao da resposta inflamatria, de leso tissular, de capacidade funcional cardiovascular, de intensidade da resposta imune humoral e celular especfica e inespecfica, e de expanso de clulas citotxicas e/ou auto-reativas que melhor possam complementar os parmetros parasitolgicos que monitoram a carga parasitria de animais experimentalmente infectados e tratados.
7.3 Desenvolvimento de Novas Drogas

Como etapas cruciais no surgimento de novas drogas temos a descoberta de uma estrutura qumica lder, com a atividade biolgica desejada, e o desenvolvimento dessa estrutura em uma forma segura e terapeuticamente efetiva (transformaes qumicas). Em poucasocasiesdrogasimportantesforam descobertassem um composto lder, sendo talvez a penicilina uma das poucas excees. A descoberta deste composto lder pode ocorrer por vrias vias:
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triagem randmica: procurar atividade biolgica em diferentes compostos, independentemente de sua

estrutura, que invariavelmente est associada a um grande volume de triagens e com o acaso; triagem direcionada: realizar testes de atividade biolgica, aps cuidadosa escolha do composto, baseada em compostos que intuitivamente tm semelhana com um outro que apresente sinais de atividade ou que seja ativo sobre outros organismos, ou sobre enzimas ou receptores especficos; descoberta racional: identificar uma via metablica, chave nica e vital para o parasita; obter estrutura tridimensional do alvo ou, caso a seqncia de aminocidos seja suficientemente semelhante a de uma protena com estrutura conhecida, a modelagem por homologia; obter grandes quantidades de material, geralmente por clonagem; e expresso do gene do alvo. A prxima etapa o desenho ou procura (sntese ou coleo) de inibidores especficos. A identificao de um composto lder por qualquer abordagem leva a uma colaborao entre qumicos e bilogos dentro de um processo contnuo e iterativo envolvendo: (a) isolamento ou sntese de compostos; (b) desenvolvimento de testes in vitro e in vivo adequados para anlise de atividade biolgica; (c) identificao de diferenas entre parasita e hospedeiro; (d) correlao de estrutura/atividade visando boa atividade biolgica, permeabilidade e minimizao da toxicidade para o hospedeiro; (e) expresso de alvos em quantidades que permitam estudos estruturais; (f ) gerao de bibliotecas de compostos com as mais diferentes estruturas. No desenvolvimento de novas drogas, alguns grupos opem abordagem racional ve rs us abordagem emprica (Croft, 1994; Douglas, 1994; Hudson, 1994; Hunter, 1995). Ambas so necessrias mas no suficientes, uma permitindo a definio precisa e expresso de alvos e a outra permitindo a gerao dos mais diversos compostos que do um novo significado "triagem direcionada" e fornecem esperanas para o futuro da quimioterapia parasitria. O desafio usar ambas as abordagens para produzir drogas efetivas, baratas, de baixa (ou sem) toxicidade, alta biodisponibilidade, ativas por via oral, em nmero e variedade suficientes para desenvolver um arsenal que possa combater a resistncia a drogas (combinaes seqenciais ou simultneas) e funcionar tambm em imunossuprimidos.
7.4 Perspectivas da Pesquisa de Drogas Tripanocidas

A quimioterapia da doena de Chagas uma rea de pesquisa muito intensa (revisto em De Castro, 1993; Croft et al., 1997; Urbina, 1999). As indstrias farmacuticas tm pouco interesse no desenvolvimento de quimioterpicos contra esta doena, por serem esses programas muito caros, especulativos e longos, no sendo, assim, justificados em uma base puramente comercial (Gutteridge, 1987). Cabe s instituies de pesquisa e aos governos, principalmente de pases contidos nas reas endmicas, subsidiar este tipo de investigao. Avanos alcanados na rea de bioqumica sinalizam para enzimas glicolticas presentes em glicosomas, bem como para a tripanotiona redutase envolvida no metabolismo antioxidante (Fairlamb & Cerami, 1992) como alvos promissores no desenvolvimento de novas drogas. O composto alopurinol (4-hidroxipirazolo (3,4-d) pirimidina), anlogo da hipoxantina, apresenta um mecanismo de ao relacionado competio com adenosina, nucleotdeo essencial para o parasita, e ao bloqueio da sntese de novo de nucleotdeos purnicos (Hammond & Gutteridge, 1984; Marr, 1991). Este composto apresentou resultados promissores em estudos in vitro (revisto por Marr & Berens, 1983), levando realizao de ensaios clnicos na fase crnica da doena; os percentuais de negativao de xenodiagnstico foram semelhantes aos obtidos com Nif e Bz, porm com menos efeitos colaterais (Sosa & Gallerano, 1988; Gallerano et al., 1990). Estudos recentes do grupo de Apt et al. (1998) demonstraram 44% de cura e 36,5% de normalizao em pacientes cardiopatas tratados com alopurinol. Esta droga foi utilizada em dois casos de reativao da doena de Chagas devido a transplante cardaco, levando regresso de leses cutneas (Tomimori-Yamashita et al., 1997).
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Grandes esforos esto sendo empregados na investigao do efeito de inibidores da biossntese de ergosterol sobre T. cruzi (Urbina et al., 1988a,b,c, 1991, 1993, 1996, 1998). Estes compostos so usados no tratamento de doenas causadas por fungos, com o mecanismo de ao baseado na depleo de esteris endgenos essenciais e/ou no acmulo de intermedirios txicos (revisto por Sheehan et al., 1999). Um dos primeiros compostos deste grupo testado foi o ketoconazol, que se mostrou ativo sobre T. cruzi em estudos in vitro (McCabe et al., 1984; Urbina et al., 1988a). Foram observadas alteraes no metabolismo de esteris com acmulo de produtos intermedirios, em especial de precursores metilados (Urbina et al., 1988b; Goad et al., 1989). Em ensaios in vivo o tratamento na fase aguda levou cura parasitolgica (M cCabe et al., 1983, 1987), porm na fase crnica no foi efetivo (M cCabe, 1988). A combinao de ketoconazol com outros inibidores da sntese de ergosterol, como por exemplo alilamina SF-86327, lovastatina e terbinafina, mostrou um potente efeito sinergstico sobre a infeco por T. cruzi in vitro e in vivo (Urbina et al., 1988c, 1993; Maldonado et al., 1993). Em infeces experimentais, o ketoconazol no foi capaz de erradicar o parasita em animais infectados ou em pacientes chagsicos (Brener et al., 1993). Outro composto que atua no metabolismo de esteris o triazol itraconazol, que se mostrou ativo em experimentos in vitro e in vivo (McCabe et al., 1986; Goad et al., 1989). Recentemente, em estudos clnicos com chagsicos crnicos, foi observada cura parasitolgica em 53% dos casos com 48,2% de normalizao de eletrocardiogramas (Apt et al., 1998). Estudos com o fluconazol (ICI-195.739) mostraram sua atividade em experimentos com animais (Ryley et al., 1988). Estudos bioqumicos e ultra-estruturais sugeriram um mecanismo duplo na ao deste bistriazol sobre T. cruzi , envolvendo inibio da sntese de ergosterol ao nvel da C14--desmetilase dependente de citocromo P450 e bloqueio da citocinese (Lazardi et al., 1991; Maldonado et al., 1993; Urbina et al., 1993). Este composto foi tambm utilizado com sucesso no tratamento de encefalite causada por reativao da doena de Chagas em um caso de paciente com Aids (Solari et al., 1993). Estudo subseqente com o ismero D(+) de fluconazol, D0870, mostrou potente atividade em pesquisas com animais experimentais nas fases aguda e crnica da doena de Chagas, sendo de trinta a cinqenta vezes mais ativo que o ketoconazol e capaz de promover de 60 a 70% de cura parasitolgica (Urbina et al., 1996; Liendo et al., 1998). Esta cura foi monitorada por hemocultura, xenodiagnstico, inoculao de homogenatos de rgos em camundongos, hemoinoculao em camundongos jovens e PCR. Um novo derivado triazlico, o SCH 56592 (Schering-Plouch), desenvolvido como antifngico sistmico, mostrou ser de trinta a cem vezes mais potente in vitro do que o ketoconazol e o D0870 como agente antiproliferativo e inibidor da sntese de ergosterol contra T. cruzi. Em infeces experimentais, este composto protegeu contra a morte, produzindo de 90 a 100% de cura (Urbina et al., 1998). A induo da resistncia de T. cruzi a azis, como fluconazol, e tambm da resistncia cruzada entre ketoconazol, miconazol e itraconazol, observadas em experimentos in vitro, aponta para dificuldades da utilizao destes compostos na clnica (Buckner et al., 1998). Estudos com alquil-lisofosfolipdeos tm revelado uma nova classe de compostos, promissora para o tratamento de doenas causadas por tripanosomatdeos. Na literatura temos vrios relatos recentes sobre o efeito destes compostos sobre T. cruzi , T. brucei e diferentes espcies de Leis hmania (Croft et al., 1987, 1993, 1996; Kuhlencord et al., 1992; Bourass et al., 1996; Konstantinov et al., 1997; Le Fichoux et al., 1998; Santa-Rita, 1999; Santa-Rita et al., 2000). Inclusive, a mitelfosina est sendo ensaiada no tratamento de leishmaniose visceral; 21/30 pacientes apresentaram cura, incluindo casos resistentes a antimnio (Sundar et al., 1998). O desenvolvimento destes compostos como agentes anticncer assegura resultados sobre a farmacologia, a toxicologia e a tolerncia dos mesmos em humanos, reduzindo os custos de desenvolvimento de drogas para o tratamento de doenas tropicais e, em especial, da doena de Chagas.
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7.5 O Tratamento de Sangue Infectado

A pesquisa de drogas tripanocidas est tambm dirigida para compostos que possam substituir o cristal violeta como aditivo em sangue a ser transfundido. A importncia epidemiolgica da transmisso trans fusional importante devido ao processo de urbanizao (Dias, 1992). Devido variao, entre vrios fabricantes, na composio de violeta de genciana, este corante foi substitudo por cristal violeta (seu principal componente) com forma quimicamente definida, portanto mais seguro (125 mg/500 ml sangue). Vrios grupos de compostos foram ensaiados (fenotizinas, AmB, nafotquinonas, anlogos trifenilmetnicos, entre outros) mas no foram capazes de substituir o cristal violeta. Os mais ativos enfrentaram problemas de toxicidade, baixa solubilidade em gua e ligao a protenas plasmticas. Devido dificuldade de se encontrar drogas alternativas, foi recomendado pela OM S dar continuidade utilizao de cristal violeta em servios hemoterpicos em reas endmicas. O cristal violeta no apresenta efeitos colaterais dignos de nota, porm h preocupaes sobre possvel toxicidade/mutagenicidade e relatos de microaglutinao de hemcias. Sua principal desvantagem colorir o sangue, e conseqentemente os tecidos. Seu mecanismo de ao envolve radicais livres, e o alvo principal a mitocndria (revisto em Gadelha et al., 1989; Do Campo, 1990).
N + N
Cl
N
Cristal violeta : cloreto de N-[4-[bis[4-(dimetilamino)-fenilmetileno]2,5cyclohexadien-1-ildeno]-N-methylmetaminio
ANDRADE, S. G. & FIGUEIRA, R. M. Estudo experimental sobre a ao teraputica da droga Ro 7-1051 na infeco por diferentescepasdo Trypanos oma cruzi. Re vis ta doIns tituto deMedicinaTropical deS oPaulo, 19:335-341, 1977. ANDRADE, S. G. & FREITAS, L. A. R. Trypanos oma cruzi : Cardiac myocellsalterationsdue to spontaneousor therapeutically induced intracellular parasitedesintegration. Cellular and Molecular Biology, 33:797-805, 1987. ANDRADE, S . G.; ANDRADE, Z. A. & FIGUEIRA, R. M. Estudo experimental s obrearesis tnciadeumacepado Trypanos oma cruzi ao Bay 2502. Re vis ta do Ins tituto deMedicina Tropical deSoPaulo, 19:124-129, 1977. ANDRADE, S. G.; FIGUEIRA, R. M.; CARVALHO, M. L. & GORINI, D. F . Influncia dacepa do Trypanos oma cruzi na resposta teraputicapelo Bay 2505 (Resultadosde tratamento alongo prazo). Revis ta doIns titutodeMe dicinaTropical de So Paulo, 17:380-389, 1975.
117
ANDRADE, S. G.; MAGALHES, J. B. & PONTES, A. L. Evaluation of chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in miceinfected with Trypanos oma cruzi strainsof different types. Bulletin WHO, 63:721-726, 1985. ANDRADE, S. G.; SILVA, R. C.; SANTIAGO, M. G. & FREITAS, L. A. R. Therapeutic action of MK-436 2,5-nitroimidazole on Trypanos oma cruzi infectionsin mice: aparasitological, serological, histopathological and ultrastructural study. Bulle tin WHO, 65:625-633, 1987. APT, W.; AGUILERA, X.; ARRIBADA, A.; PEREZ, C.; MIRANDA, C.; SANCHEZ, G.; ZULANTAY, I.; CORTES, P .; RODRIGUEZ, J. & JURI, D. Treatment of chronic Chagas' diseasewith itraconazoleand allopurinol. Ame rican J ournal of Tropical Me dicine& Hygiene , 59:133-138, 1998. BERNACCHI, A. S .; DE CAS TRO, C. R.; DIAZ DETORANZO, E. G. & CASTRO, J . A. Effect of nifurtimox and benznidazole administration on rat testes: Ultras tructural and biochemical studies. Expe rime ntal Mole cular Pathology, 45:245-256, 1986. BOCK, M.; GONERT, R. & HABERKORN, A. S tudieswith Bay 2502 on animals . Bole tin Chile nodeP aras itolog ia, 24:13-19, 1969. BOURASS, J.; LOISEAU, P . M. & LETOURNEUX, Y. Antileishmanial activity of rac-1-dodecyl-2-octanamido-2-deoxyglycerophosphocholine, anew dialkylglycero-phosphocholine, in vitro. AnnalsTropical Medicine& Paras itology, 90:559561, 1996. BOVERIS, A.; SIES, H.; MARTINO, E. E.; DO CAMPO, R., TURRENS, J. F . & STOPPANI, A. O. M. Deficient metabolic utilization of hydrogen peroxidein Trypanos oma cruzi . Bioche mical J ournal, 188:643-648, 1980. BRENER, Z. A atividadeteraputicada furaltadone, furazolidoneefuradantina nainfeco experimental do camundongo pelo Trypanos oma cruzi . Hos pital, 60:947-951, 1961a. BRENER, Z. Atividade teraputicado 5-nitro-2-furaldeido- semicarbazona nitrofurazonaem esquemasdedurao prolongada nainfeco experimental do camundongo pelo Trypanos oma cruzi . Revis ta doIns titutodeMedicinaTropical deS oPaulo, 3: 43-49, 1961b. BRENER, Z. Chemotherapy of Trypanos oma cruzi infections. In: Advancesin Pharmacology and Chemotherapy, 1975. NY: Academic Press, vol. 13, p. 1-44. BRENER, Z. Present status of chemotherapy and chemoprofilaxisof human trypanosomiasisin theWestern hemisphere. PharmacologyTherapeutics , 7:71-90, 1979. BRENER, Z. Therapeutic activity and criterion of cure on mice experimentally infected with Trypanos oma cruzi . Revis ta do Ins itutodeMe dicinaTropical deSo Paulo, 4:389-396, 1962. BRENER, Z.; CANADO, J. R.; GALVO, L. M.; DA LUZ, Z. M.; FILARDI, L. S.; PEREIRA, M. E.; SANTOS, L. M. & CANADO, C. B. An experimental and clinical assay with ketoconazolein thetreatment of Chagasdisease. Me mrias do Ins titutoOs waldo Cruz, 88:149-153, 1993. BRENER, Z.; COSTA, C. A. G. & CHIARI, C. A. Differences in the suceptibility of Trypanos oma cruzi strains to active chemotherapeutic agents. Re vis ta do Ins titutodeMedicina Tropical deS oPaulo, 18:450-455, 1976. BUCKNER, F . S.; WILSON, A. J.; WHITE, T. C. & VAN VOORHIS, W. C. Induction of resistance to azole drugs in Trypanos oma cruzi. Antimicrobial Age ntsChe motherapy, 42:3245-3250, 1998. CANADO, J. R. Teraputicaespecfica. In: Clnica ete rap uticada doe na deChagas . Umaabordagem prticaparao clnico geral. 1997. Rio de Janeiro: Fiocruz, p. 323-351. CANADO, J. R. & BRENER, Z. Teraputica. In: Trypanos oma cruzi edoena deChagas . 1979. Rio deJaneiro: Guanabara Koogan, p. 362-424. COURA, J. R. Current prospectsof specific treatment of Chagas' disease. Bolletin Chileno Paras itology, 51:69-75, 1996. CROFT, S. L. A rationale for antiparasitedrug discovery. Paras itologyToday, 10: 385-386, 1994. CROFT, S. L.; NEAL, R. A.; PENDERGAST, W. & CHAN, J. H. The activity of alkyl phosphorylcholines and related derivativesagainst Le s hmania donovani. Bioche mical Pharmacology, 36:2633-2636, 1987. CROFT, S. L.; NEAL, R. A.; THORNTON, E. A. & HERRMANN, D. B. J. Antileishmanial activity of theether phospholipid ilmofosine. Trans actions Royal Societyof Tropical Meidicine& Hygiene , 87:217-219, 1993. CROFT, S. L.; SNOWDOWN, D. & YARDLEY, V. Theactivitiesof four anticancer alkyllysophospholipidsagainst Le is hmania donovani , Trypanos oma cruzi and Trypanos oma bruce i. J ournal of Antimicrobial Che motherapy, 38:1041-1047, 1996. CROFT, S. L.; URBINA, J. A. & BRUN, R. Chemotherapy of human leishmaniasisand trypanosomiasisIn: Trypanos omias isand Le is hmanias is . 1997. Cab International, p. 245-257. DE CASTRO, S. L. The challengeof Chagas' diseasechemotherapy: An updateof drugsassayed against T rypanos oma cruzi. Acta tropica, 53:83-98, 1993.
118
DIAS, J. C. Epidemiology of Chagas' disease. In: Chagas ' dis e as e(Ame ricamTrypanos omias is ): Itsimpact on trans fus ion and clinical me dicine . 1992. So Paulo: ISBT, p. 49-80. DIAZ DE TORANZO, E. G.; CASTRO, J. A.; FRANKE DE CAZZULO, B. M. & CAZZULO, J. J. Interaction of benznidazolereactivemetaboliteswith nuclear and kinetoplastic DNA, proteinsand lipidsfrom Trypanos omac ruzi. Expe rie ntia, 44:880-881, 1988. DO CAMPO, R. Sensitivity of parasitesto freeradical damageby antiparasitic drugs. Che mical Biological Inte ractions , 73:1-27, 1990. DO CAMPO, R. & MORENO, S. N. J. Free radical metabolism of antiparasitic agents. Fe deral Proce edings , 45:2471-2476, 1986. DO CAMPO, R. & STOPPANI, A. O. M. Generation of superoxideanion and hydrogen peroxideinduced by nifurtimox in Trypanos oma cruzi. Archivesof Biochemis try and Biophys ics , 197:317-321, 1979. DO CAMPO, R.; DE BOISO, J. F .; BOVERIS, A. & STOPPANI, A. O. M. Localization of peroxidaseactivity in Trypanos oma cruzi microbodies. Expe rientia, 32:972-975, 1976. DOUGLAS, K. T. Rational drug design in parasitology. Paras itologyToday, 10:389-392, 1994. FAIRLAMB, A. H. & CERAMI, A. Metabolism and functionsof trypanothionein thekinetoplastida. Annual Re vie w Mic robiology, 46:695-729, 1992. FILARDI, L. S. & BRENER, Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanos oma cruzi strainsto drugs used clinically in Chagas' disease. Trans actionsRoyal Socie tyof Tropical Me dicine& Hygiene , 81:755-759, 1987. GADELHA, F . R.; MORENO, S. N. J.; DE SOUZA, W.; CRUZ, F . S. & DO CAMPO, R. Themitochondrion of Trypanos oma cruzi isatarget of crystal violet toxicity. Mole cular Bioche mical Paras itology, 34:117-126, 1989. GALLERANO, R. H.; MARR, J. J. & SOSA, R. R. Therapeutic efficacy of allopurinol in patients with chronic Chagas' disease. American J ournal of Tropical Me dicine& Hygiene , 43:159-166, 1990. GOAD, L. J.; BERENS, R. L.; MARR, J.; BEACH, D. H. & HOLZ, J. R. G. G. The activity of ketoconazole and other azolesagainst Trypanos oma cruzi: Biochemistry and chemotherapeutic action in vitro. Mole cular and Bioche mical Paras itology, 32:179-190, 1989. GOIJMAN, S. G.; FRASCH, A. C. C. & STOPPANI, A. O. M. Damage of Trypanos oma cruzi deoxyribonucleic acid by nitroheterocyclic drugs. Bioche mical Pharmacology, 34:1457-1461, 1985. GORLA, N. B. & CASTRO, J. A. Micronucleusformation in bonemarrow of micetreated with nifurtimox or benznidazole. Toxicological Le tters , 25:259-263, 1985. GORLA, N. B.; LEDESMA, O. S.; BARBIERI, G. & LARRIPA, I. B. Assesment of cytogenetic damage in chagasic children treated with benznidazole. Mutation Res earch, 206:212-220, 1988. GORLA, N. B.; LEDESMA, O. S.; BARBIERI, G. & LARRIPA, I. B. Thirteenfold increase of chromosomal aberrations non-randomly distributed in chagasic children treated with nifurtimox. Mutation Re s earch, 224:263-267, 1989. GUTTERIDGE, W. E. New anti-protozoal agents. Inte rnational J ournal of Paras itology , 17:121-129, 1987. HABERKORN, A. & GONNERT, R. Animal experimental investigation into theactivity of nifurtimox against Trypanos oma cruzi. Arzne inmitte l Fors chung, 22:570-1581, 1972. HAMMOND, D. J. & GUTTERIDGE, W. E. Purineand pyrimidinemetabolism in Trypanosomatidae. Mole cular Bioche mical Paras itology, 13:243-261, 1984. HAWKING, F . Chemotherapy of trypanosomiasis. In: Expe rime ntal chemotherapy, 1973. NY: Acad.Press, Vol. IV, p. 131-256. HOFFMANN, B. K. Toxicological investigationson thetolerability of nifurtimox. Arze ne imitte l-Fors chung , 22:1590-1603, 1972. HUDSON, A. T. Thecontribution of empiricism to antiparasitedrug discovery. Paras itologyToday, 10:387-389, 1994. HUNTER, W. N. Rational drug design: A multidisciplinary approach. Molecular MedicineToday , 1:31-34, 1995. KONSTANTINOV, S. M.; KAMINSKY, R.; BRUN, R.; BERGER, M. R. & ZILLMANN, U. Efficacy of anticancer alkylphosphocholinesin Trypanos oma brucei subspecies. Acta tropica, 64:145-154, 1997. KUHLENCORD, A.; MANIERA, T.; EIBL, H. & UNGER, C. Hexadecylphosphocholine: Oral treatment of vis cera l leis hmaniasis in mice. Antimicrobial Age ntsChemothe rapy, 36:1630-1634, 1992. LAZARDI, K.; URBINA, J . A. & DES OUZA, W. Ultras tructural alterationsinduced byICI 195,739, abis -triazolederivativewith s trong antiproliferativeaction against Trypanos oma(S c hizotrypanum) c ruzi. Antimic robial Ag e ntsChe mothe rapy , 35: 736-740, 1991. LE FICHOUX, Y.; ROUSSEAU, D.; FERRUA, B.; RUETTE, S.; LELIEVRE, A.; GROUSSON, D. & KUBAR, J. S hort- and long-term efficacy of hexadecylphosphocholine against established Leis hmania infantum infection in BALB/C mice. Antimicrobial AgentsChemothe rapy, 42:654-658, 1998.
119
LIENDO, A.; LAZARDI, K. & URBINA, J. A. In vitro antiproliferative effectsand mechanism of action of thebis-triazole D0870 and itsS(-) enantiomer against Trypanos oma cruzi. J ournal of Antimicrobial Che motherapy, 41:197-205, 1998. LIMA PEREIRA, F . E.; FILARDI, L. S. & BRENER, Z. Benznidazoleand nifurtimox do not increasetheincidenceof spontaneous lymphomaand amyloid deposition in micetreated with Trypanos oma cruzi. MemriasIns titutoOs waldoCruz, 81 (S uppl.): 156, 1986. LORKE, D. Embryotoxicity studiesof nifurtimox in ratsand miceand study of fertility and general reproductiveperformance. Arzeneimitte l-Fors chung, 22:1603-1607, 1972. LUQUETTI, A. O. Etiological treatment for Chagasdisease. Technical Report. Fundao Nacional daS ade. Paras itologyToday, 13:127-128, 1997. MALDONADO, R. A.; MOLINA, J .; PAYARES, G. & URBINA, J . A. Experimental chemotherapy with combinationsof ergosterol biosynthesisinhibitorsin murinemodelsof Chagas' disease. Antimicrobial Age ntsChe motherapy, 37:1353-1359, 1993. MARR, J. J. Purine analogsaschemotherapeutic agentsin leishmaniasisand American trypanosomiasis. Journal Laboratory Clinical Medicine , 118:111-119, 1991. MARR, J. J. & BERENS, R. L. Pyrazolopyrimidinemetabolism in the pathogenicTrypanosomatidae. Molecular Bioche mical Paras itology, 7:339-356, 1983. MCCABE, R. E. Failureof ketoconazozleto curechronic murineChagas' disease. J ournal of Infe ctiousDis e s as e s , 158:1408-1409, 1988. MCCABE, R. E.; ARAJO, F . G. & REMINGTON, J. S. Ketoconazole protectsagainst infection with Trypanos oma cruzi in a murinemodel. American J ournal of Tropical Me dicine& Hygiene , 32:960-962, 1983. MCCABE, R.; REMINGTON, J. S. & ARAUJO, F . G. Ketoconazoleinhibition of intracellular multiplication of Trypanos oma cruzi and protection against alethal infection with theorganism. Journal of Infe ctiousDis eas e s , 150:594-601, 1984. MCCABE, R. E.; REMINGTON, J. S. & ARAJO, F . G. In vitroand in vivoeffectsof itraconazoleagainst Trypanos oma cruzi. American J ournal of Tropical Medicine& Hygiene , 35:280-284, 1986. MCCABE, R. E.; REMINGTON, J. S. & ARAJO, F . G. Ketoconazole promotes parasitological cure of mice infected with Trypanos oma cruzi. Trans actionsRoyal Societyof Tropical Me dicine& Hygiene , 81:613-615, 1987. MORELLO, A. The biochemistry of the mode of action of drugs and the detoxication mechanisms in Trypanos oma cruzi. ComparativeBiochemis try and Phys iology, 90 C:1-12, 1988. NAVARRO, M. L. & NAGEL, R. S perm-head abnormalitiesin mice induced by two antichagasic drugs. ComparativeBiology, 3:29-32, 1984. POLAK, A. & RICHLE, R. Modeof action of 2-nitroimidazolederivativebenznidazol. Annalsof Tropical Me dicineand Paras itology, 72:228-232, 1978. RASSI, A. Tratamento etiolgico da doenade Chagas. ArquivosBras ileirosdeCardiologia, 38:277-281, 1982. RICHLE, R. Chemotherapy of experimental acute Chagas' disease in mice: Beneficial effect of Ro-7.1051 on parasitemia and tissueparasitism. LeProgre sMe dical, 101:282, 1973. RIOU, G. F .; GABILLOT, M.; DOUC-RASSY, S. & KAYSER, A. W. DNA topoisomerases of trypanosomes: inhibitory effect of somechemicals. In: Mole cular biologyof hos t-paras iteinteractions . 1984. NY: Alan R. Less, p. 279-289. RYLEY, J. F .; MCGREGOR, S. & WILSON, R. G. Activity of ICI 195,739 - a novel orally active bistriazole - in rodent modelsof fungal and protozoal infection. AnnalsNew York Academy of Science , 310:328, 1988. SANTA-RITA, R. M. Efeito de umanova classe de compostos sobreTrypanos oma cruzi: Alquil-lis ofos folipdeos . 1999. Tesede mestrado, Rio deJaneiro: Instituto Oswaldo Cruz. SANTA-RITA, R. M.; BARBOSA, H. S .; MEIRELLES , M. N. L., & DE CASTRO, S . L. Effect of alkyllysophospholipidson the proliferation and differentiation of Trypanos oma cruzi. Acta tropica, no prelo, 2000. SHEEHAN, D. J .; HITCHCOCK, C. A. & SIBLEY , C. M. Current and emergingazoleantifungal agents. Clinical Mic robiologic al Review, 12:40-79, 1999. SOLARI, A.; SAAVEDRA, H.; SEPULVEDA, C.; ODD, D.; ACUA, G.; LABARCA, J.; MUOZ, S.; CUNY, G.; BRENGUES, C.; VEAS, F . & BRYAN, R. T. Successful treatment of Trypanos oma cruzi encephalitisin a patient with ehmophilia and AIDS. Clinical InfectiousDis e as es , 16:255-259, 1993. SOSA, R. & GALLERANO, R. H. Tratamiento de laenfermedad de Chagascrnica, Efectosdel allopurinol. Re vis ta Fe deracion Arge ntina deCardiologia,17:234-236, 1988. SUNDAR, S.; ROSENKAIMER, F .; MAKHARIA, M. K.; GOYAL, A. K.; MANDAL, A. K.; VOSS, A.; HILGARD, P .& MURRAY, H. W. Trial of oral miltefosinefor visceral leishmaniasis. Lance t, 352:1821-1823, 1998.
120
TAVARES, W. Manual dequimiote rpicosantiinfe ccios os . 1986. Rio deJ aneiro: Ateneu, p.187. TEIXEIRA, A. R.; CORDOBA, J. C.; SOUTO MAIOR, I. C. & SOLORZANO, E. Chagas' disease: Lymphomagrowth in rabbitstreated with benznidazole. Americam J ournal of Tropical Medicine& Hygiene , 43:146-158, 1990b. TEIXEIRA, A. R.; SILVA, R.; CUNHA NETO, E.; SANTANA, J. M. & RIZZO, L. V. Malignant, non-Hodgkin'slymphomas in Trypanos oma cruzi-infected rabbitstreated with nitroarenes. J ournal of ComparaticePathology, 103:37-48, 1990a. TOMIMORI-YAMASHITA, J.; DEPS, P . D.; ALMEIDA, D. R.; ENOKIHARA, M. M.; DE SEIXAS, M. T. & FREYMULLER, E. Cutaneousmanifestation of Chagas' disease after heart transplantation: Successful treatment with allopurinol. Britis h J ournal De rmatology , 37:626-630, 1997. URBINA, J. A. Chemotherapy of Chagas' disease: The how and the why. J ournal Mole cular Medicine , 77:332-338, 1999. URBINA, J. A.; LAZARDI, K.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M. M. & PIRAS, R. Antiproliferativesynergism of theallylamineSF 86327 and ketoconazoleon epimastigotesand amastigotesof Trypanos oma cruzi. Antimicrobial Age ntsChe motherapy , 32:12371242, 1988c. URBINA, J. A.; LAZARDI, K.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M. M. & PIRAS, R. Antiproliferative effects and mechanism of action of ICI 195,739, anovel bis-triazole derivative, on epimastigotesand amastigotesof Trypanos oma (Schizotrypanum) cruzi. Antimicrobial AgentsChe motherapy , 35:730-735, 1991. URBINA, J. A.; LAZARDI, K.; LARRALDE, G.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M. M. & PIRAS, R. Synergistic effects of ketoconazoleand SF-86327 on the proliferation of epimastigotesand amastigotesof Trypanos oma (S chizotrypanum) cruzi. AnnalsNe w York Acade my of Science, 544:357-358, 1988a. URBIN A, J. A.; LAZARDI, K.; M ARCH AN , E.; VISBAL, G.; AGUIRRE, T.; PIRAS, M. M.; PI RAS, R.; MALDONADO, R. A.; PAYARES, G. & DE SOUZA, W. Mevinolin (lovastatin) potentiates the antiproliferative effectsof ketoconazoleand terbinafineagainst Trypanos oma(S chizotrypanum) cruzi: in vitroand in vivostudies. Antimicrobial AgentsChe motherapy, 37:580-591, 1993. URBINA, J. A.; PAYARES, G.; MOLINA, J.; SANOJA, C.; LIENDO, A.; LAZARDI, M. M.; PIRAS, R. & PIRAS, M. Cureof short- and long-term experimental Chagasdisease using D0870. Science , 273: 969-971, 1996. URBINA, J. A.; PAYARES, G.; CONTRERAS, L. M.; LIENDO, A.; SANOJA, C.; MOLINA, J.; PIRAS, M.; PIRAS, R.; PEREZ, N.; WINCKER, P . & LOEBENBERG, D. Antiproliferative effects and mechanism of action of SCH 56592 against Trypanos oma cruzi: In vitro and in vivostudies. Antimicrobial AgentsChe mothe rapy, 42:1771-1777, 1998. URBINA, J. A.; VIVAS, J.; RAMOS, H.; LARRALDE, G.; AGUILAR, Z. & AVILA, L. Alteration of lipid order profile and permeability of plasmamembranesfrom Trypanos oma cruzi epimastigotesgrown in thepresenceof ketoconazole. Mole cular Biochemical Paras itology, 30:185- 196, 1988b. VIEIRA, C. L.; LAMANO-CARVALHO, T. L.; FAVARETTO, A. L.; VALENCA, M. M.; ANTUNES-RODRIGUES, I. & BARREIRA, A. A. Testesalterationsin pubertal benznidazole-treated rats. Brazilian J ournal of Medical Biology, 22:695698, 1989. VIOTTI, R.; VIGLIANO, C.; ARMENTI, H. & SEGURA, E. Treatment of chronic Chagas' disease with benznidazole: clinical and serologic evolution of patientswith long-term follow-up. Ame rican He art Journal, 127:151-162, 1994. VOIGT, V. H.; BOCK, M. & GONERT, R. Ultrastructural observations on the activity of nifurtimox on the causative organism of Chagas' disease. Arzne inmittel Fors chung, 22:1586-1589, 1972. VOIGT, W. H.; HABERKORN, A. & GONERT, R. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen mastitogotes und amastigoter Formen von Trypanos oma cruzi unter dem Einflussvon Lampit. Zeits chrift Paras ite nkunde, 41:255-267, 1973.
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Pr otocolos e Mtodos de T rab alho em Doena de Tr abalho Ch a g as E xpe rimental xperimental Expe
Normas de Segurana para o Trabalho com Trypanosoma cruzi
Captulo 8

Tania C. Arajo-Jorge & Claude Pirmez
Estas normas de segurana foram extradas e revisadas a partir do texto preparado pelo Grupo de Trabalho Cientfico sobre Doena de Chagas, TDR, OMS e do Manual de Biossegurana (CTBio-Fiocruz, 1998). As normas para o trabalho com microorganismos patognicos e geneticamente modificados foram regulamentadas pela Lei 8974, de 5 de janeiro de 1995. A Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio) foi instituda pelo decreto 1752, em 20 de dezembro de 1995. O Trypanosoma cruzi um microorganismo listado na classe de risco 2, definida pelas seguintes caractersticas:
capaz de causar doenas em seres humanos ou animais de laboratrio sem apresentar risco grave aos trabalhadores, comunidade ou ao ambiente;
no transmissvel pelo ar; h tratamento e medidas preventivas disponveis.

Como recomendado, deve-se sempre introduzir as normas de segurana para o trabalho com determinado agente patognico, com informaes sobre a doena e seu agente causal (ver abaixo). Alm disso, essencial:
distribuir uma cpia das normas de segurana a todas as pessoas que trabalhem no laboratrio, mesmo aquelas que
no trabalham diretamente com T. cruzi;
que todos estejam a par dos possveis perigos e evitem uma aproximao casual; que no tenham receio do parasita.
8.1
A Doena de Chagas
O T. cruzi o protozorio causador da doena de Chagas, uma infeco que acomete entre dezesseis e dezoito milhes de pessoas, em reas que vo desde o sul dos Estados Unidos at a Argentina. O protozorio transmitido ao homem por (1) formas tripomastigotas metacclicas contidas nas fezes de insetos conhecidos popularmente como barbeiros (devido ao hbito de picar a face descoberta de pessoas adormecidas) ou chupo no Brasil, ou vinchuca nos demais pases latino-americanos; e (2) por transfuso de sangue contendo formas tripomastigotas. Outras formas de transmisso, menos freqentes, so a congnita, o leite materno ou os transplantes. A infeco laboratorial pode ocorrer acidentalmente quando h leses de pele ou quando o parasita entra em contato com mucosas (olho, nariz ou boca).
125
Uma vez no hospedeiro vertebrado, o parasita pode causar uma forma aguda da doena, que se manifesta por miocardite. a melhor oportunidade para se fazer o tratamento especfico contra o parasita. Mesmo que a fase aguda passe assintomtica, cerca de 30% dos indivduos infectados podem vir a desenvolver a forma crnica, em geral mais de dez anos aps o primeiro contato. Esta forma manifesta-se por miocardite, traduzida por cansao, arritmias e/ou insuficincia cardaca, e ainda pelas formas digestivas, caracterizadas pela m digesto, megaclon e/ou megaesfago. At o momento no h tratamento eficaz para os efeitos da doena nessa fase.
8.2
Biologia Resumida do T. cruzi
O T. cruzi apresenta-se sob trs estgios diferentes: tripomastigota, epimastigota e amastigota, adaptados s necessidades de seu desenvolvimento nos dois hospedeiros que utiliza em seu ciclo evolutivo, o invertebrado (triatomneo hematfago) e o vertebrado (mamferos, incluindo o homem). O triatomneo se alimenta com sangue infectado do hospedeiro vertebrado, ingerindo as formas tripomastigotas sangneas. Algumas horas aps sua ingesto, inicia-se a diferenciao destas formas para epimastigotas, que se desenvolvem na luz do intestino do vetor, multiplicando-se por diviso binria. Na parte posterior do intestino do inseto ocorre novo processo de diferenciao para tripomastigotas metacclicos que, no instante da picada, so transmitidos junto com as fezes. Estas formas penetram em clulas do local de inoculao, transformando-se em amastigotas, que se multiplicam tambm por diviso binria no citoplasma da clula hospedeira. As amastigotas se diferenciam para tripomastigotas e a clula hospedeira se rompe, liberando parasitas que atingem a circulao sangnea, de onde podem ser sugadas pelo inseto triatomneo e iniciar um novo ciclo. Formas amastigotas liberadas por clulas rotas antes da completa diferenciao do parasita tambm so infectantes.
8.3 Normas para o Trabalho com T. cruzi: Regras Gerais

O Nvel de Biossegurana 2 (NB2) precisa ser implementado para o trabalho com T. cruzi e as medidas obrigatrias a serem adotadas so as seguintes:
I. Quanto rea fsica

1. Identificao do NB e do microorganismo nas portas de todas as salas e reas de trabalho com T. cruzi, que devem ser bem demarcadas e adequadamente sinalizadas (ver modelos anexos, Captulo 20); 2. O laboratrio deve ser separado de passagens pblicas; 3. O laboratrio deve funcionar em sala prpria, sem superposio com outras atividades; 4. O laboratrio deve ter acesso restrito s pessoas autorizadas que manipularo o parasita ou os animais infectados. O acesso de crianas estritamente proibido; o acesso de mulheres grvidas deve ser avaliado em razo dos riscos a que estiver exposta no laboratrio; 5. O laboratrio deve ser separado por antecmara, com portas trancveis interdependentes; 6. As janelas devem ser vedadas, inquebrveis, e com telas; as portas devem ter sistema de fechamento automtico; 7. As paredes, teto e cho devem ser lisos, ntegros, de fcil limpeza, sem juntas e resistentes a desinfetantes. Os ralos devem ser vedados. As portas s devem abrir no sentido da rea no contaminada para a contaminada;
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8. Devem existir barreiras seguras para evitar a fuga de animais ou insetos infectados; 9. O laboratrio deve ter um mnimo de mveis e equipamentos, todos de fcil limpeza; 10. Deve existir rea, na antecmara, para aventais de uso exclusivo no laboratrio NB2.
II. Quanto s instalaes

1. 2. 3. 4. 5. 6. O laboratrio deve estar ligado a sistema de emergncia de energia eltrica; Os dutos de fiao eltrica devem estar acessveis para manuteno; O laboratrio deve ter iluminao de emergncia; Deve haver pia no laboratrio ou perto da sada; Na antecmara deve haver pia automtica ou com pedais; Deve haver lava-olhos no laboratrio, que devem ser verificados diariamente, pois comum o entupimento por ferrugem ou desuso.
III. Quanto aos equipamentos

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Trabalhar obrigatoriamente em cmara de fluxo laminar tipo II e, preferencialmente, em fluxo tipo III; Agitaes, homogeneizaes e sonicagens devem ser feitas preferencialmente em cmara de fluxo laminar; A retirada de tubos de suporte de centrfuga deve ser feita, preferencialmente, em cmara de fluxo laminar; Modificar os equipamentos e procedimentos para reduzir os riscos; Usar caixas de conteno para animais infectados; Usar caixas de segurana para homogeneizadores; Usar tampas para suportes e para tubos de centrfuga; Manter material cirrgico separado no laboratrio; Quando esterilizar vidraria sob calor seco, utilizar forno por 2 horas a 210oC.
IV. Quanto manipulao

1. indispensvel treinamento adequado antes do incio do trabalho. Apenas pessoal treinado deve trabalhar com T. cruzi, seja in vivo ou in vitro, ou seja, pessoal bem treinado em procedimentos gerais de laboratrio, que conhea tanto as tcnicas especiais necessrias para o trabalho com o parasita como a sua biologia. O pessoal que estiver comeando a trabalhar com T. cruzi deve faz-lo sob rigorosa superviso. Deve-se evitar o envolvimento de estudantes de iniciao cientfica nas atividades onde a manipulao com T. cruzi ou animais infectados planejada. Estes estudantes so, em geral, muito jovens e encontram-se em fase ainda indeterminada de sua escolha profissional e vocacional, devendo ser poupados do risco de uma infeco acidental; 2. obrigatrio manter no laboratrio cpia de procedimentos de trabalho no laboratrio, bem como de procedimentos para emergncia; 3. essencial no trabalhar sozinho; o trabalho com material patognico deve ser feito sempre em equipe, para evitar que, na eventualidade de um acidente, o indivduo se veja sozinho e no possa tomar as providncias necessrias situao; 4. obrigatrio usar equipamento individual de proteo; este equipamento deve estar acessvel a quem for trabalhar com animais ou com os parasitas: avental longo e de mangas compridas (deve estar disponvel na antecmara); sapatos fechados (nunca sandlias ou sapatos abertos); luvas (se possvel, luva dupla) em todos os procedimentos que envolverem contato direto da pele com culturas, sangue, extratos ou animais infectados. Anis ou outros adereos de mo que interferem com o uso da luva
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devem ser retirados. As luvas devem ser removidas com cuidado, para evitar a formao de aerossis, e descontaminadas antes de ser descartadas; mscara facial (no apenas culos); 5. obrigatrio o preparo adequado do ambiente e da bancada de trabalho: expor o protocolo a ser seguido em caso de acidente; expor o protocolo de descarte de animais e insetos infectados: autoclavagem, incinerao ou tratamento qumico (ver modelo anexo, Captulo 20); expor claramente o protocolo para desinfeco de material reciclvel de vidro ou plstico (ver modelo anexo, Captulo 20); colocar aviso de que se est trabalhando com T. cruzi; o local da bancada onde se est trabalhando com o parasita deve tambm ser claramente marcado com um aviso apropriado (ver modelo anexo, Captulo 20); proteger o local de trabalho com papel absorvente; ter sempre mo frascos lavadores com solues desinfetantes para T. cruzi: lcool 70%, hipoclorito de sdio a 5% (ou 1:3, 1 volume de gua sanitria para 2 volumes de gua) e soluo desinfetante padro (50 ml de extran ou sabo neutro e 30 ml de gua sanitria para 1 litro de gua corrente); observao: o hipoclorito comercial contm cerca de 10% de substncia ativa, e a gua sanitria apenas 2 a 3%; normalmente utiliza-se uma soluo de hipoclorito a 1% para descontaminao, sendo esta soluo preparada no mesmo dia de uso, devido sua instabilidade; ter sobre a bancada recipientes para descarte de: material reciclvel (vidraria) e descartvel (plsticos); capilares e agulhas contaminados (vidros transparentes e com tampa, com soluo desinfetante, para descarte direto no lixo quando ficarem cheios); animais infectados (sacos plsticos e formol a 4%); na sada do laboratrio deve haver lixo para luvas usadas; na sada do laboratrio deve estar disponvel um livro de ocorrncias; 6. Regras gerais de conduta considerar todo material biolgico infeccioso, e todo material humano como infectado; trabalhar com ateno e sem tenso; limpar e desinfetar sempre a rea de trabalho ao iniciar e ao terminar o trabalho, ou no mnimo diariamente; no tocar com as luvas de trabalho no rosto, nos equipamentos ou em maanetas e interruptores; trocar de luvas ao trocar de material. Se for inevitvel guardar luvas usadas e molhadas com desinfetantes, fazlo com as luvas viradas para dentro; desvirar antes de reutilizar; nunca trabalhar sem ter mo os recipientes apropriados para descarte, com as corretas solues desinfetantes; evitar recapear agulhas de seringa. Se isso for necessrio, proceder colocando a capa da agulha sobre a bancada (sem segur-la) e pescando-a com a agulha; nunca usar vidraria quebrada ou trincada; lavar sempre as mos aps manipulao e aps remoo das luvas, do avental ou do jaleco, e antes de sair do laboratrio; no transitar pelos corredores com material patognico e no sair da rea de trabalho sem antes remover e descartar as luvas de trabalho com T. cruzi; no aplicar cosmticos e evitar usar jias, bijuterias e lentes de contato; no retirar canetas ou quaisquer instrumentos do laboratrio sem descontaminar antes; no mastigar lpis ou caneta e no roer as unhas; no fumar, beber ou comer no local de trabalho com T. cruzi e no estocar comida ou bebida no laboratrio; manter o laboratrio limpo e arrumado, evitando o armazenamento de materiais no pertinentes ao trabalho do laboratrio.
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V. Quanto ao trabalho com culturas

Embora as culturas axnicas sejam de menor risco, dado forma predominante no ser infectante (epimastigotas), lembrar que geralmente cerca de 10% dos parasitas so formas tripomastigotas metacclicas e, portanto, altamente infectantes. Por outro lado, as culturas feitas com clulas infectadas oferecem o mesmo risco que um animal infectado, uma vez que contm tanto tripomastigotas quanto amastigotas, ambas infectantes. Por isso: 1. Abrir cuidadosamente os tubos e frascos, evitando sacudi-los; 2. Identificar claramente todos os tubos e frascos; 3. Manipular os tubos, frascos, pipetas ou seringas com as extremidades em direo oposta ao operador; 4. Evitar a formao de aerossis desprezando sobrenadantes, decantando-os sobre material absorvente embebido em desinfetante dentro de um recipiente (becher, por exemplo); esta prtica evita a projeo de gotas; 5. Nunca pipetar suspenses com parasitas com a boca; usar bulbos ou pipetadores automticos; 6. As pipetas devem conter, na extremidade que entra em contato com o pipetador, um tampo de algodo hidrfobo; 7. Os frascos de cultura, descartveis ou no, contendo clulas infectadas pelo T. cruzi devem ser preenchidos com formol 4% antes de serem descartados no lixo comum ou lavados para o reuso.
VI. Quanto ao trabalho com animais

O trabalho com animais o que oferece maior risco, dado que os animais tm comportamento imprevisvel e contm as formas tripomastigotas no sangue, potencialmente infectantes. Assim: 1. Seguir os padres, as leis e os regulamentos para cuidado e manuteno de animais de experimentao; 2. Assegurar-se de que todos os que tm contato com os animais e seus descartes estejam familiarizados com os procedimentos e cuidados necessrios; 3. Verificar se as tampas das gaiolas impedem a fuga dos animais infectados; cuidado com frestas, pois animais de baixo peso podem eventualmente escapar pelas grades da tampa; 4. Todas as gaiolas devem ter uma ficha de identificao que contenha as seguintes informaes: animal: espcie, nmero, cepa, sexo, idade e peso; infeco: data, cepa do parasita, via e dose de inoculao do parasita; pesquisador/tcnico responsvel; 5. Qualquer animal encontrado fora de gaiolas deve ser sacrificado e o fato deve ser anotado num livro de ocorrncias na sala de trabalho. Na eventualidade de um animal inoculado escapar das imediaes do laboratrio, as autoridades devem ser prontamente notificadas. a. Coleta de sangue qualquer sangramento do animal deve ser feito com o animal imobilizado, utilizando-se um frasco de conteno; aps colheita de sangue de animal infectado, NUNCA RETIRAR o ar da seringa sem colocar um chumao de algodo encharcado com soluo desinfetante na ponta da agulha; os materiais utilizados para a sangria devem ser colocados em soluo desinfetante aps o uso. Quando a sangria feita na cauda, cauterizar com fsforos ou com pina aquecida no fogo, ou com instrumento cirrgico adequado cauterizao; quando utilizar sangue para microscopia, usar lamnulas de tamanho inferior lmina. Desprezar lminas em frasco contendo soluo desinfetante, observando se a lamnula se desprendeu da lmina. Essas mesmas regras devem ser aplicadas s cmaras de contagem. Aps o uso, limpar todas as partes do microscpio com soluo desinfetante.
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b. Inculo
ATENO: O acidente de laboratrio mais freqente a auto-inoculao com seringas e agulhas contaminadas por T. cruzi.
cuidado especial deve ser tomado com as inoculaes subcutneas; a pele do animal pode ser transfixada pela agulha que atinge ento a mo do operador; a manipulao de agulhas e seringas deve ser feita, sempre, com uma proteo na ponta da agulha (capa da agulha, algodo ou gase embebida em lcool); as agulhas nunca so recapeadas; desprez-las sempre em recipiente prprio, isto , de plstico firme, com tampa que contenha um orifcio que no permita a sada do material para fora do recipiente. Aps a manipulao, aspirar soluo desinfetante na seringa e manter todo o material utilizado imerso nesta soluo por pelo menos 4 horas. Procure utilizar recipientes prprios para o descarte e a inutilizao de agulhas infectadas, que nunca devem ser reutilizadas.
VII. Quanto ao descarte e retirada de materiais biolgicos

1. Desinfetar a superfcie externa das embalagens antes de retirar os frascos do laboratrio; 2. Descontaminar (em autoclave ou desinfetante) todo o material usado antes de retir-lo do laboratrio, inclusive antes de embalar material descartvel para eliminao; 3. Desinfetar as superfcies de bancadas aps o trmino do trabalho; 4. Desinfetar equipamentos (centrfugas, microscpios, etc.) aps o uso; 5. Desinfetar vidrarias e metais reutilizveis de modo a inativar o T. cruzi antes da lavagem; 6. Condies de autoclavagem: 30 min a 120oC (15 psi); 7. Descarte de animais infectados:
os animais mortos, infectados, NO devem ser descartados no lixo comum; aps o sacrifcio dos animais, coloc-los em sacos plsticos bem vedados e inciner-los; quando a incinerao no for possvel, fazer autoclavagem ou descontaminao qumica: abrir os animais expondo todas as vsceras e mergulh-los em soluo de formol a 4% por pelo menos 12 horas, selar em saco plstico para, somente ento, desprez-los no lixo comum; aps a utilizao, as gaiolas que contiverem animais infectados devem ser mergulhadas em soluo de hipoclorito de sdio a 1% ou soluo desinfetante comercial fenlica, tipo ufenol ou creolina, por cerca de 4 horas antes da limpeza com detergente; a maravalha utilizada deve ser ensacada cuidadosamente para ser autoclavada ou incinerada.
VIII. Quanto ao transporte de T. cruzi

O transporte de microorganismos do grupo 2 regulamentado pela Instruo Normativa no 4 da CTNbio e de responsabilidade do pesquisador principal do laboratrio: 1. O transporte de T. cruzi s pode ocorrer com permisso, emitida pela CTNbio, por pedido da CTbio da instituio, aps solicitao do pesquisador principal, em formulrio apropriado (ver anexo, Captulo 20); 2. Para emisso da permisso de transporte, tanto a entidade remetente como a destinatria devem possuir o certificado de qualidade em biossegurana conferido pela CTNbio; 3. O pesquisador remetente informar CTbio da sua entidade e quela da entidade de destino, sobre o contedo, o volume, o local e as condies de embalagem do material; 4. O pesquisador remetente informar CTbio de sua entidade e ao transportador sobre os cuidados no transporte e sobre os procedimentos de emergncia no caso de escape ou acidente durante o mesmo;
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5. O pesquisador remetente deve assegurar que o T. cruzi a ser transportado estar contido em embalagens firmemente fechadas ou vedadas para prevenir o escape do mesmo. Sero sempre utilizados dois recipientes, ambos claramente identificados: um interno inquebrvel (tubo de ensaio) que conter o parasita a ser transportado, que deve ser firmemente fechado de forma a evitar o escape do material, e que ser colocado dentro de um segundo recipiente. O recipiente externo, inquebrvel e resistente a impactos, deve ser cuidadosamente embalado para a remessa em caixa de papelo, madeira ou outro material que oferea resistncia durante o transporte. Caso sejam enviados vrios tubos com amostras de T. cruzi, com um mesmo ou com diferentes volumes, a embalagem externa dever conter material absorvente, para absoro de lquido que possa escapar do recipiente interno, e protetores de impacto, dispostos entre os tubos com o parasita; 6. Cada recipiente interno no poder conter mais do que 1 litro de material, e o volume total da remessa no poder ser superior a 4 litros; 7. Para transporte de espcime congelado em gelo seco, o recipiente externo contendo, tambm, gelo seco dever permitir escape de gs CO2; 8. Para transporte de espcime congelado em nitrognio lquido, devero ser utilizados recipientes ou botijes apropriados para nitrognio lquido e obedecidas as regras convencionais para seu transporte; 9. Todas as embalagens devem ser claramente identificadas com o smbolo de biossegurana e de frgil com a mensagem: Cuidado: Abertura autorizada apenas no interior de laboratrio por tcnico especializado. A embalagem externa dever conter o nome, endereo completo e telefone, tanto do destinatrio quanto do remetente; 10. No caso de transporte para fora do pas, a CTbio da entidade remetente ser responsvel pelo cumprimento das exigncias destas normas, inclusive o encaminhando CTNbio da solicitao de autorizao para o transporte; 11. Aps a chegada do material o destinatrio dever notificar o remetente sobre o recebimento e sobre as condies do mesmo.
IX. Quanto s medidas de preveno de acidentes

1. Informar o pessoal de manuteno (de equipamentos, de limpeza de salas, brigada de incndio, etc.) da natureza do trabalho que ali realizado; 2. O pessoal de manuteno (instalaes fsicas e equipamentos), dever ser sempre acompanhado de um pesquisador responsvel, e usar equipamentos individuais de proteo; 3. Informar o pessoal mdico da instituio sobre a natureza do trabalho que est sendo realizado, de modo que procedimentos para monitorao e tratamento possam ser estabelecidos; 4. Todo o pessoal envolvido no trabalho com T. cruzi deve ser monitorado sorologicamente a cada seis meses por dosagem de igG anti T. cruzi, nos servios de diagnstico locais; 5. Drogas e doses recomendadas pela FNS/Brasil (*)
Droga Dose total diria Adultos Benznidazol Nifurtimox ** 5 mg/kg 8-10 mg/kg Crianas 5-10 mg/kg 15 mg/kg 2a3 3 60 dias 60 a 90 Doses ao dia Tempo de tratamento
* Luquetti (1997); ** no disponvel no Brasil.
RECOMENDAO DA OMS: quando comprovadamente ocorrer um acidente, iniciar imediatamente o tratamento especfico, mesmo antes de ter evidncia parasitolgica ou sorolgica de infeco
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8.4 Procedimento em Caso de Acidente com Trypanosoma cruzi

1. obrigatrio conter o material contaminado por T. cruzi: Evitar que lquidos se espalhem, cobrindo com material absorvente seco para em seguida colocar o desinfetante e depois descontaminar o material absorvente (autoclave ou desinfetante); evitar que resduos slidos contaminados sejam carregados nas solas de sapato ou roupas; 2. Atender o(s) indivduo(s) exposto(s) aos riscos durante o acidente; 3. Quando aerossis e/ou gotas forem projetados distncia, limpar o local com papel absorvente embebido em lcool a 70%; na roupa ou na pele saturar a rea com lcool a 70%; 4. Limpar a pele imediatamente com lcool ou outro desinfetante; 5. Se o contato for com os olhos ou mucosas, lavar exaustivamente com gua corrente em lava-olhos (se no tiver, lavar com salina ou gua boricada); 6. As feridas superficiais devem ser lavadas, exaustivamente, e cauterizadas com nitrato de prata; 7. As feridas punctuais (agulha) devem ser espremidas para obter o mximo de sangue possvel e cauterizadas; 8. Informar o acidente ao responsvel mdico apropriado para que sejam tomadas as providncias cabveis (teste sorolgico, tratamento, acompanhamento clnico-laboratorial); 9. Colher sangue para teste de parasitemia (pesquisa do parasita em gota espessa e em capilar de microhematcrito, de trs em trs dias, durante os primeiros quinze dias aps o acidente); 10. Colher soro ou plasma para sorologia de fase aguda: IgM anti T. cruzi nos dias zero, quinze e trinta aps o acidente e, se possvel, dosar protenas de fase aguda; 11. Se houver apenas um risco leve (suspeita) de infeco, monitorar o sangue, por alguns meses mais, com sorologia (igG anti T. cruzi); 12. Se o risco de infeco for grande (certeza), tratar imediatamente com benznidazol (rochagan); no aguardar a evidncia de infeco; 13. Informar o acidente autoridade de sade pblica competente, preenchendo o formulrio de notificao de acidentes da instituio; notificar chefia imediata e Coordenao de Sade do Trabalhador.
CTBio-Fiocruz. Procedimentos para manipulao de microorganismos patognicos e/ou recombinantes na Fiocruz. 1998. Ministrio da Sade, p. 166. CTNBio. Instruo Normativa no 4. Dirio Oficial da Unio 20/12/96, p. 27820-27821, 1996. CTNBio. Instruo Normativa no 7. Dirio Oficial 9/6/97, p. 11827-11833, 1997. LUQUETTI, A. O. Etiological treatment for Chagas disease. Parasitology Today, 13:127, 1997. MAHLER J. New issues and future legislation on biosafety. J Biotechnol 68:179-183, 1999. MOREL, C. M. Genes and Antigens of Parasites. A Laboratory Manual. 2nd ed., 1984. Rio de Janeiro: Fundao Oswaldo Cruz. RANGEL-ALDAO, R. Biosafety protocol. Biosafety to assure underdevelopment. Nat Biotechnology 17:515-516, 1999.
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Captulo 9
M odelos Anim ais p ar a o Estudo In Viv a Doena de Animais par ara Vivo da od cos Ch a g as e de seus Aspectos Histop atolgi Histopatolgi atolgicos
O uso de modelos animais para o estudo da infeco por Trypanosoma cruzi foi estabelecido desde o artigo original no qual Carlos Chagas descreveu a doena que leva seu nome (Chagas, 1909). Antes que a infeco fosse verificada nos humanos ou nos animais domsticos, Chagas enviou para Manguinhos os barbeiros infectados coletados na rea endmica de Minas Gerais onde estava trabalhando e, no Rio de Janeiro, Oswaldo Cruz alimentou esses hematfagos em macacos Callitrhrix penicillata, observando parasitemia patente nos animais vinte a trinta dias depois. Escreveu Carlos Chagas em 1922:
a verificao da doena precedeu aqui a descoberta do parasita que a ocasiona, e quando no sangue perifrico de uma criana febril, observamos o flagelado patognico, de sua biologia j possuamos noo completa, adquirida em demorados estudos anteriores.
At as dcadas de 30-40, cobaias, ces, coelhos, outros macacos e tambm o camundongo branco, foram utilizados para o estudo da infeco experimental, tanto pelo prprio Chagas e sua equipe do Instituto Oswaldo Cruz, como por seus discpulos, em especial Emmanuel Dias. Ratos e camundongos foram tambm utilizados por outros grupos como os de E. Brumpt em So Paulo, A. Robertson e C. A. Kofoid nos EUA, e Henri Galliard na Frana. A partir da dcada de 60, provavelmente por influncia do intenso uso do camundongo como modelo bsico em estudos de imunologia geral, bem como pela facilidade e baixo custo da manuteno desses animais em biotrio, os trabalhos com infeco experimental por T. cruzi acumularam-se cada vez mais no modelo do camundongo. A reviso comparativa mais recente sobre modelos animais para a doena de Chagas foi publicada por Cabeza-Meckert & Laguens (1994). Atualmente a maioria das instituies de pesquisa dispe de Comisses de tica especficas para analisar os projetos que envolvem o uso de animais, e aprovar seus procedimentos experimentais, indicando sua adequao ou no, pendncias e substitutos quando necessrio. No Captulo 20 (Anexos) so encontrados os Princpios ticos Bsicos para Pesquisa e Experimentao com Animais, bem como os contatos com instituies que tem contribudo para o aperfeioamento contnuo das normas deles decorrentes.
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9.1
Camundongo
9.1.1 Caractersticas do Mus Domesticus Domesticus (Camundongo) como Modelo para a Infeco por Trypanosoma cruzi
Os parmetros reprodutivos do camundongo so: idade de acasalamento: cinqenta a sessenta dias; perodo de gestao: dezoito a 21 dias; filhotes por parto: trs a dez; idade de desmame: dezoito a 21 dias; peso ao nascimento: 1,5 g; peso ao desmame: 10 g; peso ao acasalamento: 25 g.
Hoje confirmadas e ampliadas por diversos autores, as seguintes caractersticas bsicas da infeco no camundongo foram descritas por Chagas (1909) e por seu discpulo E. Dias (1934):
existem diferenas no curso da infeco (cintica, intensidade e mortalidade) a depender da espcie hospedeira
utilizada e da origem dos parasitas;
animais jovens apresentam maior susceptibilidade infeco experimental que animais adultos; qualquer que seja o material infectante utilizado (sangue de animal ou fezes de barbeiro infectado), a intensidade da infeco depende do nmero de parasitos inoculados; tanto formas tripomastigotas metacclicas como as sangneas so infectivas para o camundongo, deflagrando a forma aguda, e nos casos de sobrevivncia a essa fase, tambm a forma crnica, apresenta as caractersticas histopatolgicas da doena humana, ao menos em sua forma cardaca; durante toda a fase inicial da infeco, seja qual for a via de inoculao utilizada, existe sempre parasitemia, ainda que subpatente, pois com o sangue de animais inoculados por apenas 24 horas pode-se transferir a infeco para outro animal; formas metacclicas do vetor apresentam maior capacidade de penetrao nas clulas do stio de inoculao e no aparecem rapidamente na circulao, precisando de um perodo de proliferao tecidual preliminar maior do que tripomastigotas sangneos para se evidenciar a parasitemia; qualquer via de inoculao deflagra qualitativamente um curso similar de infeco, diferindo somente no tempo necessrio para observao de parasitemia patente e para incio do perodo de mortalidade; o principal local de multiplicao inicial do T. cruzi ao nvel dos tecidos do ponto de inoculao dos parasitas; o homem e os animais experimentais que sofreram infeco pelo T. cruzi adquirem certo grau de imunidade
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Modelos Animais para o Estudo In Vivo da Doena de Chagas e de seus Aspectos Histopatolgicos
contra esse parasita, pois animais infectados reinoculados demonstram grande resistncia infeco. No entanto essa imunidade relativa, pois em certos casos pode haver recidivas. As caractersticas que se seguem foram descritas num vasto nmero de estudos que utilizaram o camundongo como modelo experimental:
heterogeneidade do curso da infeco dependente da especificidade da cepa/clone de T. cruzi e da linhagem exo

ou endocriada do camundongo; alta letalidade na fase aguda ante cepas patognicas, com elevada parasitemia, presena de amastigotas em macrfagos de bao, fgado e tecido adiposo, em cardiomicitos, msculo esqueltico e liso, em neurnios e na neuroglia; pan-infectividade tissular na fase aguda com intensidade elevada em alguns rgos, a depender do par parasitahospedeiro (Lenzi et al., 1996); na fase crnica a pan-infectividade persiste, pois possvel recuperar parasitas de praticamente todos os rgos (McCabe et al., 1989); fase aguda com sinais de imunossupresso transitria, ativao policlonal e apoptose; fase crnica com soropositividade (convencional e ltica) e parasitemia subpatente, miocardite e miosite, fibrose, inflamao em camadas do intestino, alteraes funcionais do corao e eletrocardiogrficas (bloqueios atrioventriculares de primeiro e segundo graus, extra-sstoles, distrbios de conduo intraventricular com aumento do complexo QRS) e encontro eventual de megavsceras; a miocardite induzida por T. cruzi um processo progressivo, e a intensidade das leses inflamatrias est provavelmente relacionada extenso dos danos miocrdicos iniciados durante a fase aguda (Schlemper et al., 1983; Marinho et al., 1999); reverso de leses histopatolgicas pelo tratamento com agentes tripanocidas tanto na fase aguda como na fase crnica; apesar da pan-infectividade, pode ser observado um marcado histotropismo de certas cepas para certos rgos (Melo & Brener, 1978). Recentemente esse tropismo tem sido atribudo a caractersticas das prprias cepas, pois comparando-se quinze isolados dos trs principais clones genotpicos do T. cruzi (Diego et al., 1998), foi observado que todos induzem formao de infiltrados inflamatrios no miocrdio, mas que a formao de pseudocistos (ninhos de amastigotas) varia com a cepa, ocorrendo em 20% dos isolados do genotipo 20, 50% do gentipo 19 e 83% do genotipo 39, caracterizando claramente um potencial replicativo diferente destes genotipos no tecido cardaco. Outro achado interessante nesse sentido foi a descoberta de que animais infectados simultaneamente por dois isolados de T. cruzi (cepa JG e clone Coll.7G2), que podiam ser identificadas por tcnicas moleculares especficas (LSSP-PCR), mostraram distribuio tissular claramente diferente entre elas, indicando uma influncia do polimorfismo gentico das populaes de T. cruzi infectantes na patognese da cardiopatia chagsica crnica (Andrade et al., 1999).
9.1.2
Aplicaes do Modelo Camundongo
As fases aguda e crnica da doena de Chagas, com suas caractersticas parasitolgicas, imunolgicas e histopatolgicas (ver Captulo 4) j foram reproduzidas no modelo camundongo, em diferentes graus de severidade a depender do par parasita-hospedeiro (cepa de T. cruzi-linhagem de camundongo) utilizado (ver a seguir). Tambm a infeco congnita j foi reproduzida, apresentando caractersticas similares doena de Chagas congnita humana (Cabeza-Meckert & Laguens, 1980; Carlier et al., 1987), com uma incidncia de at 4%. Tm sido muito vastas as aplicaes de diferentes cepas de camundongo no estudo da infeco experimental. Em especial destacam-se estudos sobre:
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isolamento de cepas patognicas, quando se utilizam, geralmente, camundongos bastante susceptveis; o curso da infeco em diferentes situaes experimentais: cepas/clones de T. cruzi, inculos, vias de infeco,
constituio gentica do hospedeiro (cepas de camundongo e diferentes tipos de cruzamentos), idade, temperatura, sexo, etc.; quimioterapia; a caracterizao das respostas inflamatria e imune inata; a caracterizao da resposta imune global e especfica ao parasita e de aspectos auto-imunes; a caracterizao da evoluo das leses histopatolgicas e funcionais dos diversos rgos e sistemas afetados no curso da infeco e da doena.
9.1.3
Heterogeneidade no Modelo Camundongo
Uma caracterstica importante do modelo camundongo a heterogeneidade do curso e intensidade da infeco, bem como das leses em diferentes populaes (raas, cepas), que se expressa na distino entre modelos resistentes e susceptveis a condies similares de infeco. Essa caracterstica, j apontada na dcada de 40 (Hauschka, 1947; Pizzi et al., 1948), foi explorada quanto ao mapeamento gentico da resistncia durante as dcadas de 70 e 80 (Trischmann et al., 1978; Trischmann & Bloom, 1982; Wrightsman et al., 1982, 1984; Trischmann, 1983; Juri et al., 1990; Eksi et al., 1996), e at hoje utilizada para facilitar estudos sobre as caractersticas da resposta imune inata e adquirida (Silva J.S. et al., 1995). Os padres de resistncia e susceptibilidade infeco, medidos atravs de taxas de mortalidade, tempo de sobrevida e nveis de parasitemia, dependem da conjuno das cepas do camundongo e do parasita, o que implica em que qualquer estudo tenha que ser interpretado luz do modelo usado (Andrade et al., 1985a). A linhagem CBA foi caracterizada quanto ao curso da infeco por T. cruzi pelo grupo de F. Kierszenbaum (Hayes & Kierszenbaum, 1981; Kierszenbaum & Budzko, 1982), mas no um modelo de uso mais generalizado. Camundongos C3H e C57BL/6 so classicamente referidos, respectivamente, como resistentes e susceptveis infeco por T. cruzi (Trischmann et al., 1978; Starobinas et al., 1991), contudo, eles apresentam respostas inversas s usualmente descritas quando infectados com o clone SylvioX10 (Postan et al., 1983, 1984); os camundongos C57BL/6 so extremamente suscetveis infeco pela cepa Tulahuen de T. cruzi (Silva et al., 1992). Como disse Tarleton (1995) no possvel fazer-se qualquer generalizao de um achado em modelo experimental sem que seja no contexto estrito do par hospedeiro-parasita usado como modelo. No entanto, como a doena humana tambm varia desde formas assintomticas e muito brandas at as muito severas e letais, o fato de o camundongo apresentar fentipos heterogneos quanto resistncia infeco o torna um modelo adequado. As diferentes combinaes de cepa de camundongo com cepa/clone de parasita tendem a se distribuir nesse espectro quando analisados diversos parmetros, sejam eles parasitolgicos, imunolgicos, histopatolgicos, eletrofisiolgicos ou bioqumicos. E para no fugir regra da heterogeneidade no modelo de camundongo, at o dogma de que todos os camundongos j ensaiados se infectam com T. cruzi e contraem a doena foi recentemente contestado, com a descrio de um modelo experimental (Balb/C infectado com clone CL14 de T. cruzi) no qual no se conseguiu observar infeco, mas apenas desenvolvimento de imunidade (Lima et al., 1991). Em funo dessa heterogeneidade, desde os primeiros estudos com animais experimentais, e especialmente com camundongos, uma questo emerge: o que torna um animal susceptvel ou resistente infeco? Essa questo foi explorada tanto sob a tica do parasita como pela tica do hospedeiro. Assim, foi estudado o curso da infeco experimental com formas metacclicas ou sangneas, introduzidas por diferentes vias de inoculao; com isolados (cepas) de diferentes regies geogrficas ou provenientes de diferentes hospedeiros (isolados de vetores, de reservatrios naturais, de pacientes com diferentes formas clnicas da doena, etc.); com parasitas submetidos
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atenuao ou aumento da virulncia por passagens repetidas em cultura ou em animais, ou ainda pr-incubados com diferentes drogas ou com diferentes componentes do soro ou plasma de hospedeiros imunes ou no imunes; entre outras. Hoje sabemos que isso varia com o modelo animal utilizado, com a cepa de T. cruzi inoculada e com o tamanho do inculo, e que so determinadas em grande extenso pelo balano funcional de diferentes citocinas produzidas no curso da infeco (ver Captulo 4). As vias intraperitoneal (IP) e subcutnea (SC) so as mais amplamente utilizadas para inoculao do T. cruzi em camundongos e os animais jovens so mais susceptveis que os adultos. A via conjuntival, utilizada em outros modelos (Ramirez & Brener, 1987), foi menos explorada com camundongos. A via oral foi demonstrada como eficaz apenas em camundongos de at vinte dias de idade, enquanto a IP promove infeco em qualquer faixa etria (Culbertson & Kessler, 1942). Mais recentemente, foi demostrado que a infeco via oral ocorre atravs da mucosa gstrica e no da mucosa de qualquer outra parte superior do tubo digestivo (Hoft et al., 1996). Apenas tripomastigotas metacclicos so competentes para a infeco via oral; com tripomastigotas sangneos a infeco no foi obtida (Hoft, 1996). Diferenas na resistncia entre machos e fmeas so observadas em alguns modelos e no em outros (Hauschka, 1947; Arajo-Jorge et al., 1992). At hoje no esto esclarecidos os mecanismos que interferem na resistncia dos animais com relao idade e ao sexo. A reproduo da fase crnica da infeco por T. cruzi em camundongos j foi obtida por quatro estratgias: (1) infeco de linhagens de camundongos susceptveis com cepas de T. cruzi patognicas numa combinao de inculo, idade dos animais e via de inoculao que permita a sobrevida fase aguda de uma proporo significativa dos animais infectados (Federici et al., 1964; Laguens et al., 1980); (2) infeco de camundongos com uma dose letal de parasitas seguida de tratamento com drogas tripanocidas que assegurem a sobrevida na fase aguda sem cura parasitolgica (Andrade et al., 1970; Marinho et al., 1999); (3) infeco de linhagens de camundongos resistentes ou susceptveis com cepas de parasitas de baixa patogenicidade, especialmente a cepa CA1 e os clones CL-Brener e Dm28c, com inculos subletais (Gonzlez-Cappa et al., 1981; Arajo & Chiari, 1989; Lopes et al., 1995); (4) infeco com cepas patognicas em animais imunizados com cepas atenuadas (Johnson et al., 1963; Hudson, 1984; McCormick & Rowland, 1989; Milei et al., 1991; Gomez et al., 1996).
9.1.4
Modelos mais Amplamente Utilizados
Um dos maiores problemas para o entendimento e sistematizao dos dados existentes sobre a imunobiologia e imunopatologia na doena de Chagas experimental o fato de no haver um modelo comum, de eleio, usado pela maioria dos grupos que trabalham na rea. Certos grupos se concentram num nico modelo e caracterizam-no sob vrios parmetros. Isso til do ponto de vista da biologia geral da infeco, delineando um quadro mais completo da resposta do hospedeiro ao parasita, mas deixa a desejar quanto possibilidade de extrapolao dos dados para outros modelos e mesmo para humanos. Outros laboratrios buscam analisar um mesmo fenmeno em diferentes modelos para firmar conceitos que possam ser generalizados com relao infeco.
9.1.4.1 Camundongos exocriados Swiss, no isognicos

Desde os primeiros experimentos com o camundongo branco, at hoje, o camundongo albino Swiss, no isognico, tem sido um modelo amplamente utilizado. Os animais so extremamente sensveis s diversas cepas do parasita (Andrade et al., 1985a) e no apresentam diferena na resistncia quanto ao sexo (Luz et al., 1995). No entanto, isolados de T. cruzi provenientes de animais silvestres podem apresentar parasitemia baixa e 100% de sobrevivncia (ver Captulo 3). Pelo seu baixo custo, os camundongos Swiss so muito utilizados em estudos de quimioterapia experimental (ver Captulo 7), que implicam no estudo de grande nmero de animais e avaliao de sobrevida (Gutteridge et al., 1978). A reversibilidade de leses musculares em animais crnicos aps
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quimioterapia tripanocida foi demonstrada nesse modelo (Andrade et al., 1991; Segura et al., 1994). Os primeiros estudos eletrocardiogrficos em camundongos infectados tambm foram feitos nesse modelo (Packchanian & Robinson, 1958) e mostraram claramente que existem diferenas significativas nos traados de animais crnicos em relao aos normais. Alteraes eletrocardiogrficas e correlao destas com leses histopatolgicas no sistema de conduo tambm foram descritas em camundongos Swiss (Andrade & Sadigursky, 1987). A descrio das cepas Y e CL como polares em relao a curvas parasitmicas e ao tropismo tissular foi feita nesse modelo (Melo & Brener, 1978), assim como a caracterizao biolgica do clone Dm28c (Contreras et al., 1988). A influncia da cepa de parasita na resistncia do hospedeiro tambm foi confirmada no modelo Swiss (Andrade et al., 1985b). Algumas podem ser extremamente virulentas, como a cepa Y (Silva & Nussensweig, 1953), enquanto outras no, como a Tulahuen (Cardoni et al., 1986). Com inculos baixos de cepas pouco virulentas foram obtidas cronicidade (Laguens et al., 1980) e reproduo da miocardiopatia chagsica humana crnica, com fibrose, poucos parasitas intracelulares, alteraes eletrocardiogrficas, sorologia positiva, parasitemia subpatente evidenciada por xenodiagnstico ou inoculao em camundongos recm-natos, e associao eventual com megavsceras (Laguens et al., 1981; Milei et al., 1984; Molina et al., 1988). Um estudo com setenta animais crnicos demonstrou que mesmo em animais com testes parasitolgicos persistentemente negativos, a infeco ativa pode ser evidenciada quando se submetem os animais imunossupresso com ciclofosfamida (Magalhes & Andrade, 1994).
9.1.4.2 Camundongos endocriados, isognicos

O uso de camundongos isognicos com diferenas no complexo maior de histocompatibilidade (locus H-2) e back-grounds genticos foi revisto por De Titto (1994). Estudos clssicos mostraram, no entanto, que diferente de certos microorganismos como Mycobacterium leprae, Listeria monocitogenes ou Leishmania donovani, cuja resistncia governada por um gene ou grupo de genes relacionados, a resistncia a T. cruzi regulada por controle multignico (Trischmann & Bloom, 1982; Wrightsman et al., 1982, 1984). No existem linhagens polares, resistentes ou susceptveis, mas um gradiente contnuo entre esses dois fentipos. Alm disso, como a resistncia est mais ligada s caractersticas da cepa de T. cruzi infectante (Andrade et al., 1985b), um hospedeiro pode ser resistente e controlar a infeco com algumas cepas, mas no com todas.
9.4.1.3 Camundongo Balb/C

De longe os camundongos Balb/C se configuram na linhagem mais utilizada em estudos experimentais (282 referncias na base de dados MedLine com as palavras-chave Balb e Chagas disease, em julho de 1999). Descrito como um dos modelos mais susceptveis, e portanto bom para a triagem inicial de drogas e de agentes imunomoduladores que aumentem a resistncia, essa cepa muito utilizada por vrios grupos. O modelo Balb/C-cepas Y ou CL foi muito estudado por grupos no Brasil e na Frana (Rossi et al., 1984, 1986; Silva et al., 1985; Minoprio et al., 1986, 1988; DImprio-Lima et al., 1986; Russo et al., 1989). Como controle para o modelo Xid (ver Captulo 4), a imunologia do camundongo Balb/C infectado por T. cruzi tem sido amplamente investigada (Minoprio et al., 1991, 1993). O modelo Balb/C-cepa Colombiana o preferido e largamente caracterizado pelo grupo de Ribeiro dos Santos & Pirmez, no Brasil (Ribeirodos-Santos et al., 1992; Silva-Barbosa et al., 1997). O modelo Balb/C-cepa Tulahuen tem sido intensamente utilizado e caracterizado pelo grupo argentino de Cardoni & De Titto (Cardoni et al., 1986; Rottenberg et al., 1991; Antunes et al., 1997). O modelo Balb/C-cepa Tehuantepec foi o escolhido e amplamente caracterizado por Carlier et al. (1987). Os modelos Balb/C-clone Dm28c (Lopes et al., 1995) e Balb/C-cepa CL e clone CL14 (Lima et al., 1991) vm sendo utilizados e caracterizados no Brasil.
9.4.1.4 Camundongo C3H

O conjunto de trabalhos realizados por Pizzi et al. (1948, 1953) nas dcadas de 40 e 50 introduziram o uso da linhagem C3H nos estudos de infeco experimental com T. cruzi, em conjuno com a cepa Tulahuen, que reticulotrpica e bastante virulenta. Os camundongos C3H so hoje a segunda linhagem mais utilizada (197
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referncias encontradas na base de dados MedLine com as palavras-chave C3H e Chagas disease, em julho de 1999). O modelo C3H-cepa Colombiana (104 IP) cronifica, e mostrou-se interessante quanto reproduo de caractersticas fisiopatolgicas e hemodinmicas observadas em humanos chagsicos crnicos (Federici et al., 1964; Abelman, 1969). Muitos outros grupos tm usado a cepa C3H para estudos da resposta inflamatria e imune, ante diferentes cepas e clones de parasitas (Postan et al., 1983; Minoprio et al., 1989; Russo et al., 1989; Pakianathan & Kuhn, 1994). O modelo C3H-cepa Tulahuen foi caracterizado por Morales et al. (1987), com relao miocardiopatia, comparativamente a outras linhagens de camundongo. Recentemente os camundongos C3H vm sendo utilizados para estudos da infeco e patologia do sistema nervoso central no Instituto Oswaldo Cruz (Silva, A. A. et al., 1995).
9.4.1.5 Camundongos C57BL (6 e 10)

Descrita como uma das cepas de camundongos mais resistentes (Pizzi et al., 1948), as linhagens C57BL/6 e C57BL/10 vm sendo utilizadas ante diferentes cepas e clones do T. cruzi, por muitos grupos (Reed et al., 1984; Silva J.S. et al., 1995; Tarleton, 1995). Exatamente por isso um modelo em que a cronificao pode ser obtida com certa facilidade, especialmente quando se utilizam inculos baixos (Postan et al., 1984, 1987a). Muitas vezes so usados comparativamente com camundongos C3H ou Balb/C. Em todos os casos, no entanto, h que se referir sempre cepa do parasita utilizada, pois algumas so extremamente virulentas, inclusive para esse hospedeiro (Luz et al., 1994).
9.4.1.6 Camundongos geneticamente transformados: mutantes e knock-outs

O interesse no uso de animais geneticamente deficientes em certa funo ou molcula para estudo da implicao direta ou indireta desta na resistncia infeco j antiga. Os primeiros animais usados para essa finalidade foram os camundongos Biozzi selecionados quanto capacidade de produo de anticorpos (alta ou baixa) por cruzamentos e retrocruzamentos (Kierszenbaum & Howard, 1976). Posteriormente animais B10.D2/ old, geneticamente deficientes no componente C5 do sistema complemento, foram usados para demonstrar que a lise mediada por complemento no decisiva na sobrevida nem na parasitemia dos animais na fase aguda (Dalmasso & Jarvinen, 1980). Os animais nude, que no possuem timo, tambm foram usados como instrumentos para a compreenso do papel de clulas T na infeco (Gonalves da Costa et al., 1984; Trischmann, 1984), bem como os animais Xid, que no possuem clulas BCD5 (Minoprio et al., 1991, 1993). Linhagens com fentipos auto-imunes (tais como linhagens com o gene lpr, linhagens NZB e BXSB) tambm tendem a ser mais susceptveis infeco por T. cruzi (Nickell et al., 1985). Mais recentemente uma srie de animais, geneticamente deficientes em certas molculas, tm sido utilizados para estudos experimentais com diversos agentes infecciosos, tais como animais knock-out, para os genes de molculas de histocompatibilidade classe I, sem clulas T CD8 maduras (Tarleton et al., 1992), de classe II, sem clulas T CD4 maduras (Rottenberg et al., 1993), para os genes RAG e de IL-10 (Abrahamsohn & Coffman, 1996; Hunter et al., 1997), para a cadeia d do TCR (Santos-Lima & Minoprio, 1996), entre outros. Do mesmo modo, animais deficientes em receptor de IFN-, bem como em xido ntrico sintetase (Holscher et al., 1998) mostraram um fentipo extremamente susceptvel infeco por T. cruzi e permitiram evidenciar o papel crucial que estes mecanismos exercem na resistncia dos animais, como discutido no Captulo 4. Recentemente foi estudado o curso da infeco por T. cruzi em animais deficientes em vias de citotoxicidade, como a via Fas (animais gld) e a via perforina (Henriques-Pons et al., 1998; Lopes et al., 1999). No primeiro caso os animais apresentaram maior susceptibilidade, associada ao desenvolvimento precoce de uma potente resposta Th2, e no segundo maior mortalidade, associada a um descontrole do grau de inflamao tissular. A perspectiva para os prximos anos que mais modelos com deficincias gnicas naturais ou induzidas por recombinao homloga (knock-outs) venham a ser aplicados para o estudo da imunopatologia da infeco por T. cruzi.
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9.2
Rato
Luis Eduardo Ramrez, Valdo D. Silva, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro
O rato outro modelo animal utilizado no estudo da infeco chagsica. Contudo, tem-se observado que ele oferece certa resistncia ao Trypanosoma cruzi, desenvolvendo uma infeco lenta e pouco evidente, mesmo em animais recentemente desmamados. Na maioria das vezes, torna-se necessria a utilizao de grandes inculos do parasita, para se obter parasitemia patente na fase aguda e uma fase crnica com manifestaes clnico-patolgicas evidentes. Porm alguns estudos histopatolgicos do corao, do trato digestivo e do sistema nervoso central identificaram leses similares s encontradas na doena de Chagas humana, contradizendo, portanto, aqueles que no consideram o rato como um bom modelo experimental para a pesquisa da infeco chagsica. Alm disso, um estudo com ratos isognicos mostrou que, dependendo do background gentico, esse modelo tambm pode apresentar variabilidade no grau de resistncia (Rivera-Vanderpas et al., 1983). Brand et al. (1949) observaram que a infeco nos animais inoculados com diferentes cepas tem evoluo de aproximadamente trs semanas e que, dependendo da sua patogenicidade, os animais podem cronificar ou morrer. Pizzi et al. (1953) estudaram, comparativamente, a infeco em camundongos isognicos C3H e ratos infectados com cepa Tulahuen do T. cruzi e observaram uma menor parasitemia e mortalidade em ratos. Brener (1971) inoculou ratos com 200.000 formas sangneas das cepas Y, Berenice, CL e MR e observou, com as duas primeiras, apenas uma pequena e transitria parasitemia, ao passo que com as outras duas a parasitemia foi elevada e persistente, sugerindo que essas diferenas poderiam estar relacionadas com a morfologia das referidas cepas. Revelli et al. (1980) infectaram ratos de poucos dias de idade e adultos jovens com elevadas doses de tripomastigotas sangneos de T. cruzi, pela via subcutnea, e observaram uma fase aguda onde a parasitemia dos animais recentemente desmamados era maior que a dos animais adultos jovens, no se registrando nenhuma morte. Alm disso, observaram uma resposta imunolgica humoral especfica e uma miocardite crnica focal com alteraes leves do eletrocardiograma. Beraldo (1987) caracterizou a curva de parasitemia em ratos infectados com diferentes inculos de formas sangneas por grama de peso corporal e observou que, independentemente da cepa ou do grau do inculo, havia uma elevao progressiva da parasitemia at a segunda ou terceira semanas aps a infeco. A partir de ento, a parasitemia declinava, tornando-se desprezvel ou desaparecendo por completo na quarta semana. O nvel mximo de parasitemia observado no pareceu guardar qualquer correlao com o grau de inculo administrado. Com base nas curvas de parasitemia e mortalidade espontnea, definiu a fase aguda da infeco como aquela que se inicia aps a inoculao do T. cruzi at a sexta semana subseqente. Segundo esse autor, depois desta fase comea a fase crnica, onde a parasitemia inaparente e a mortalidade espontnea baixa. Postan et al. (1987b) infectaram ratos com quatro clones diferentes de T. cruzi e verificaram padres distintos de parasitemia, mortalidade e comportamento histopatolgico. Um dos clones desenvolveu fibrose cardaca mais acentuada e precoce que os demais, levando-os a discutir a influncia gentica do parasita e do hospedeiro no curso da infeco. De outro lado, Revelli et al. (1990) demonstraram que, quando os ratos eram reinoculados com parasitas da mesma cepa, no reproduziam o quadro agudo inicial e no modificavam o tipo e grau de leso cardaca. Esse modelo tem sido utilizado para estudo da rede de citocinas (Revelli et al., 1998),
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confirmando que tambm no rato a citocina decisiva para a resistncia o IFN-. Estudando as manifestaes viscerais na fase crnica em ratos inoculados com a cepa Y, Alcntara (1964) observou que a cardiopatia era a forma mais freqente, embora tambm tenha encontrado a formao de megas, principalmente no clon, bexiga, vescula seminal e tero. Alcntara & Oliveira (1964) demonstraram, durante a fase crnica da infeco, reduo dos neurnios do plexo de Meissner, principalmente da regio secretora do estmago e nos clons transverso e descendente, assim como tambm no plexo de Auerbach, desde o estmago at o reto. Scorza & Scorza (1972) estudaram o miocrdio de ratos infectados com a cepa Y e verificaram que grande nmero de animais morria entre o dcimo e o 25o dias ps-inoculao, apresentando miocardite, ganglionite e periganglionite intensas. Chapadeiro et al. (1988) estudaram a evoluo da cardiopatia em ratos infectados com diferentes inculos das cepas Y, Colombiana e 12SF de T. cruzi ao longo das fases aguda e crnica, observando que a miocardite progredia com o tempo, associandose fibrose em 15% dos animais. Alcntara (1961) encontrou um reduzido nmero de neurnios ps-ganglionares cardacos em ratos infectados pela cepa Y do T. cruzi, semelhana do observado por Amorim et al. (1973) em pacientes chagsicos crnicos. Entretanto, esses resultados no foram confirmados por Chapadeiro et al. (1991) em animais cronicamente infectados, nos quais a contagem de neurnios cardacos em cortes seriados no apresentou reduo numrica significativa, comparada aos animais controles. Embora as leses encontradas no tenham sido quantitativamente significativas, ganglionite e neurite foram mais intensas nos gnglios intracardacos dos animais infectados, o que pode explicar a alterao da resposta bradicrdica barorreflexa observada nestes mesmos animais, caracterizando, portanto, uma disfuno autonmica parassimptica cardaca no rato chagsico crnico (Chapadeiro et al., 1991; Junqueira Jr. et al., 1992). Bestetti et al. (1987) avaliaram o eletrocardiograma de ratos de seis meses de idade infectados com a cepa Colombiana do T. cruzi e observaram alteraes similares s encontradas em pacientes chagsicos crnicos. Junqueira Jr. (1991), num estudo seqenciado do eletrocardiograma em ratos infectados com as cepas Y, Colombiana e 12SF pareados com animais controles, no encontrou alteraes durante oito meses de infeco, porm verificou que certas arritmias (extrasstoles supraventriculares e ventriculares) eram mais freqentes nos infectados que nos controles, concluindo que este modelo parece ser adequado para o estudo da disfuno cardaca. Em estudo empregando a monitorizao holter do eletrocardiograma em ratos chagsicos crnicos acordados, observamos (dados no publicados) uma alta prevalncia de arritmias cardacas, caracterizadas principalmente por extra-sstoles supraventriculares com ou sem conduo aberrante e com freqncia mdia significativamente maior nos animais chagsicos. Estes dados, aliados aos resultados obtidos nos estudos eletrocardiogrficos convencionais, permitem concluir que o rato parece ser um modelo adequado para o conhecimento da patognese e da teraputica da disfuno eltrica cardaca induzida pela infeco pelo T. cruzi. Entretanto, as possveis causas destas alteraes eletrocardiogrficas e das arritmias na infeco chagsica crnica neste modelo permanecem obscuras e, provavelmente, esto associadas miocardite focal, fibrose miocrdica (Chapadeiro et al., 1988) e/ou disfuno autonmica parassimptica (Chapadeiro et al., 1991; Junqueira Jr. et al., 1992). As Figuras 1 a 8 mostram aspectos da histopatologia de ratos infectados com T. cruzi. A falta de estudos imunolgicos adequados e a ausncia de pesquisas que demonstrem uma progressiva reduo da funo contrtil miocrdica que leve ao desenvolvimento de uma sndrome de insuficincia cardaca congestiva, como acontece na doena de Chagas humana, parecem explicar porque o rato no considerado, ainda, um modelo til no estudo da infeco chagsica experimental.
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Figura 1 Inflamao aguda intensa do epicrdio e miocrdio em rato infectado com cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi (viso panormica) - HE x 100 Figura 2 Detalhe da figura anterior mostrando infiltrado inflamatrio predominantemente mononuclear, no endomsio; fenomenos degenerativos de necrose de grandes nmeros de fibras miocrdicas. Ninhos de amastigotas no interior das fibras - HE x 200 Figura 3 Outro detalhe da mesma figura mostrando formas amastigotas no endomsio, circundadas por mononucleares; intenso edema do interstcio e fenmenos degenerativos com ruptura de fibras miocrdicas - HE x 400 Figura 4 Ganglionite atrial aguda em rato infectado com cepa So Felipe. Observa-se infiltrado inflamatrio mononuclear com intensos fenmenos degenerativos e destrutivos de vrios neurnios - HE x 400 Figura 5 Mesmo caso da figura anterior. Observa-se ninho de amastigota e infiltrado inflamatrio mononuclear no tecido de conduo (feixe trio- ventricular) situado nos 2/3 superiores direita da fotomicrografia - HE x 200 Figura 6 Miocardite crnica focal em rato infectado com a cepa Colombiana. Nota-se pequeno foco de infiltrado inflamatrio mononuclear ao lado de ninho de amastigotas (seta) - HE x 400 Figura 7 Miocardite crnica em rato infectado com a cepa Y. Observa-se intensa fibrose difusa endomisial com discreto infiltrado mononuclear; hipertrofia acentuada da maioria das fibro-clulas; atrofia, degenerao e necrose de outras. HE x 200 Figura 8 Ganglionite atrial crnica em rato infectado com a cepa Colombiana. Observa-se intenso infiltrado inflamatrio e destruio da maioria dos neurnios - HE x 200
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9.3
Calomys Callosus
Sonia G. Andrade
O Calomys callosus callosus (Rodentia, Cricetidae) um reservatrio natural do Trypanosoma cruzi (Ribeiro, 1973; Mello e Teixeira, 1977). A biologia do C. callosus e a sua manuteno em laboratrio foram descritos por Mello (1984) e tm fornecido importantes subsdios para estudos posteriores. Alm disso, diversos trabalhos foram desenvolvidos utilizando este animal como modelo da doena de Chagas experimental (Mello et al., 1979; Mello & Borges, 1981; Borges et al., 1982). Este modelo oferece muito interesse, pois sendo um reservatrio silvestre poder estar albergando cepas do T. cruzi sem desenvolver doena aparente e, deste modo, contribuindo para a manuteno das fontes de contaminao dos vetores nos seus ectopos silvestres. Por outro lado de interesse verificar como se comporta este animal quando infectado por cepas do T. cruzi mantidas em laboratrio, comparando com o comportamento biolgico no camundongo. Com este objetivo, foi feito o estudo da infeco do C. callosus com diferentes cepas do T. cruzi em comparao com o camundongo, no s quanto ao desenvolvimento de leses histopatolgicas, como em relao ativao dos macrfagos peritoneais destes animais ante a infeco (Borges et al., 1992). As cepas do T. cruzi utilizadas neste estudo foram as Y, F, M226 (isolada de C. callosus naturalmente infectado) e Costalimai (isolada de Triatoma costalimai). Os principais resultados obtidos foram (Borges et al., 1992, 1995):
o C. callosus mostrou nveis parasitmicos superponveis aos do camundongo, com as cepas Y e F; porm,
enquanto os camundongos tiveram alta mortalidade, todos os C. callosus sobreviveram infeco, mostrando regresso das leses histopatolgicas entre quarenta e sessenta dias; com as duas cepas do T. cruzi de origem silvestre (M226 e Costalimai) os camundongos no desenvolveram parasitemias patentes, porm apresentaram intensas leses tissulares enquanto os C. callosus desenvolveram baixas parasitemias e ausncia de leses, indicando uma adaptao e maior resistncia s cepas silvestres; a ativao de macrfagos peritoneais foi idntica em camundongos e C. callosus infectados com a cepa Y. Na infeco com a cepa F a liberao de H2O2 foi idntica nas duas espcies porm variou no timing, pois continuava elevada em camundongos aps os sessenta dias quando as leses estavam presentes e era muito baixa nos C. callosus entre quarenta e sessenta dias, correspondendo regresso das leses, observada nesta espcie; as maiores diferenas na liberao de H2O2 de macrfagos peritoneais foram vistas com as duas cepas silvestres (Costalimai e M226). A cepa Costalimai determinou no camundongo altos nveis de ativao dos macrfagos, que corresponderam intensa agresso tissular determinada por esta cepa, enquanto o C. callosus apresentou apenas discreta ativao de macrfagos e ausncia de leses. Os mesmos achados foram obtidos com a cepa M226; o estudo dos nveis de -interferon (IFN-) no C. callosus demonstrou que as diferentes cepas induzem a produo desta interleucina, sendo os nveis mais altos observado no soro dos animais infectados com a cepa F, a qual se caracteriza por determinar no C. callosus leses de grande intensidade no miocrdio e no msculo esqueltico na fase aguda da infeco com regresso total aos sessenta dias;
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o C. callosus infectado pela cepa F se constitui, desta maneira, em um excelente modelo para o estudo da
resistncia nesta espcie e a sua correlao com os aspectos peculiares da sua patologia. De fato, embora considerado resistente devido ausncia de mortalidade e negativao parasitmica, o C. callosus desenvolve intensas leses inflamatrias no msculo esqueltico e no miocrdio, com predominncia de macrfagos (que assumem aspecto epitelide), linfcitos e fibroblastos (Figuras 9 e 10). Simultaneamente se desenvolve intenso processo fibrognico, que se inicia precocemente (26 a 30 dias), com acentuada proliferao fibroblstica e espessamento da matriz intercelular com depsito de colgeno (Figura 11). Dos cinqenta aos sessenta dias de infeco observa-se regresso da inflamao e da fibrose, restando apenas infiltrados focais residuais (Figura 12). Desenvolve-se nestes animais um equilbrio parasito/hospedeiro, uma vez que, embora o exame direto revele parasitemias negativas, os testes parasitolgicos mais acurados (xenodiagnstico, hemocultura e subinoculao do sangue em camundongos) permitem revelar a persistncia da infeco (Andrade et al., 1994). As peculiaridades apresentadas por este modelo o recomendam para pequisas sobre o controle imunolgico da infeco, o processo de fibrognese e de regresso espontnea da fibrose. Alm disso um animal de pequeno porte e de fcil manuseio. A dificuldade est apenas na obteno e manuteno de colnias destes animais para a sua fcil utilizao, como ocorre com o camundongo.
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Figura 9 Miocardite difusa; necrose de fibras cardacas que esto substitudas por infiltrado mononuclear (macrfagos e linfcitos); proliferao de fibroblastos e depsito matricial intersticial (26 dias de infeco) - HE x 400 Figura 10 Msculo esqueltico: acentuada miosite com infiltado intersticial mononuclear de linfcitos e macrfagos. Numerosas formas amastigotas do Trypanosoma cruzi em clula muscular (setas) (26 dias de infeco) - HE x 400 Figura 11 Msculo esqueltico, trinta dias ps-infeco: espessamento da matriz intersticial com depsito de colgeno em torno de micitos e de vasos sangneos, mostrando birrefringncia luz polarizada em seces coradas pelo mtodo do PicroSirius - x 400 Figura 12 Msculo esqueltico, 56 dias de infeco: regresso da fibrose, com depsitos colagnicos intersticiais residuais. Picro-Sirius (luz polarizada) - x 400
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9.4
Hamster
Luis Eduardo Ramrez, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro
Embora a susceptibilidade do hamster ao Trypanosoma cruzi seja conhecida, este animal no tem sido utilizado como modelo no estudo da doena de Chagas. Existem alguns trabalhos mostrando parasitismo em todos os rgos, acompanhado de intensa reao inflamatria, fenmenos degenerativos, elevada hiperplasia do sistema macrofgico e alta mortalidade quando os animais eram inoculados com a cepa Tulahuen (Cariola et al., 1950). A comparao da infeco deste animal com o camundongo, infectado com diferentes cepas e procedncias distintas, mostrou que o camundongo mais susceptvel que o hamster (Ossimani & Gurri 1954). Trabalhos sistematizados, realizados em nossos laboratrios atravs de mtodos parasitolgicos, sorolgicos, clnicos (radiolgicos e eletrocardiogrficos) e histopatolgicos, tanto na fase aguda, como na fase crnica confirmam que o hamster susceptvel infeco pelo T. cruzi quando inoculado com diferentes cepas (Y, Vicentina, Benedito) e pelas vias intraperitoneal, conjuntival, endovenosa e subcutnea (Ramrez et al., 1991, 1993, 1994). Comparativamente com camundongos, infectados por via intraperitoneal com o mesmo inculo da cepa Y, observou-se durante a fase aguda (quinze dias) que o hamster controla mais eficientemente a infeco, apresentando uma parasitemia e parasitismo tissular, respectivamente, 5,9 e 1,9 vezes menor (Ramrez et al., 1996). Nos dois modelos experimentais, o perodo prepatente foi similar, com durao de trs a quatro dias, porm o perfil das curvas de parasitemia mostrou algumas diferenas: nos camundongos foi progressivamente ascendente at o oitavo dia da infeco, a partir do qual comeou a declinar at se tornar subpatente, confirmando as observaes de outros autores (Melo & Brener 1978; Sousa & Alencar 1984). No hamster, a curva de parasitemia foi baixa e irregular com o pico mximo no 15o dia, confirmando os achados de Ossimani & Gurri (1954). O parasitismo tissular no hamster mostrou maior nmero de ninhos de amastigotas nas clulas macrofgicas, quando inoculado com a cepa Y, enquanto no camundongo foi maior nas mioclulas da musculatura lisa, o que parece demonstrar que a cepa Y, durante a fase aguda, mais macrofagotrpica no hamster e mais miotrpica no camundongo. Em relao ao tecido gorduroso, no foi possvel estabelecer, com certeza, a localizao dos parasitas, se nos macrfagos ou nos adipcitos, como demonstrado por Andrade & Rocha Silva (1996). Por outro lado, nossas observaes no confirmam os achados do parasitismo em relao ao tecido gorduroso marrom (Shoemaker & Hoffman, 1974). Quanto fase aguda, no foram observados sinais clnicos importantes. O estudo eletrocardiogrfico mostrou em 60% dos hamsters alteraes sugestivas de miocardite. A necrpsia dos animais revelou aumento e congesto do corao, do bao e do fgado. Leses microscpicas foram comuns e progressivas desde as primeiras 24 horas na maioria dos tecidos e rgos, sendo mais graves no tecido gorduroso e conjuntivo frouxo (celulite) e no msculo liso (miosite). Posteriormente, foi encontrada miocardite, de incio nos trios e, em seguida, nos ventrculos, caracterizada por infiltrado endomisial de mono e polimorfonucleares. Igualmente, este infiltrado foi observado no sistema de conduo: n de Hiss, feixe e ramos. Os gnglios e filetes nervosos do plexo autonmico cardaco revelaram ganglionite, periganglionite, neurite e perineurite, acompanhadas de sinais de destruio neuronal. No trato digestivo, as leses (miosite e ganglionite) mostraram sinais de degenerao e necrose. O bao,
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o timo, os linfonodos e a mdula ssea apresentaram, desde o comeo da infeco, um estado reacional de varivel intensidade com parasitismo nos macrfagos. Leses inflamatrias agudas tambm foram observadas nos rgos e tecidos genitais e perigenitais internos (mioclulas, conjuntivo frouxo e plexo nervoso hipogstrico), acompanhadas de intenso parasitismo. Nas adrenais foi observado parasitismo de intensidade varivel nos macrfagos da parede dos sinusides, mas no na parede da veia central. Nos demais rgos, especialmente na musculatura esqueltica e sistema nervoso central, as leses foram menos freqentes ou ausentes. Na fase crnica, alguns animais apresentaram mau estado geral, caracterizado por apatia, perda de peso e plos, gengivite ulcerada, palidez das mucosas, dispnia e edema generalizado; alguns morreram espontaneamente e de modo sbito. O traado eletrocardiogrfico dos animais nesta fase mostrou, a partir do segundo e terceiro meses, aumento transitrio da freqncia cardaca e, entre o quarto e quinto meses, reduo da mesma. O exame radiolgico do trato digestivo, aps dieta baritada, revelou aumento do volume do estmago e do calibre do intestino grosso, especialmente ceco (dados no publicados). Apesar de no ter sido realizado um estudo da cintica dos anticorpos no transcurso da infeco, foi demonstrado, atravs da tcnica da lise mediada pelo complemento (Krettli & Brener, 1982), que estes animais produzem anticorpos lticos, a partir do terceiro ou quarto ms ps-infeco. A autpsia dos animais mortos espontaneamente e/ou sacrificados, aps anestesia pelo ter, revelou edema do tecido subcutneo e derrame lquido, claro e transparente, nas cavidades pericrdica, pleural e abdominal (ascite). A presena de formas tripomastigotas do T. cruzi foi detectada nesses lquidos, aps concentrao pelo microhematcrito e pela hemocultura. O corao da maioria dos hamsters mostrou-se aumentado de volume e congesto e, aos cortes, as cavidades trio-ventriculares apresentaram-se dilatadas e com ocasionais trombos parietais. Microscopicamente, os coraes exibiram infiltrado inflamatrio predominantemente de mononucleares de intensidade varivel, ora focal, ora zonal, raramente difuso, entre as fibras cardacas dos trios, ventrculos e septos. Fibrose, de extenso tambm varivel, substitua reas de miocrdio destrudo. O tecido especfico de conduo mostrou, fundamentalmente, porm em grau menor, as mesmas leses do miocrdio funcional. Ninhos de amastigotas no miocrdio foram encontrados em 50% dos coraes. Tambm o epicrdio exibiu infiltrados focais de mononucleares (epicardite), assim como os gnglios e filetes nervosos do plexo intracardaco (ganglionite, periganglionite e neurite) com significativa destruio neuronal. Neste modelo, a reduo neuronal, ao contrrio do que ocorre em outros modelos de animais infectados pelo T. cruzi, como ratos (Chapadeiro et al., 1988), camundongos, C. callosus (Ferraz de Carvalho et al., 1993) e ces (Lana et al., 1992) altamente significativa, sendo, portanto, at agora, o nico animal no qual se comprovou, de fato, reduo neuronal significativa (dados no publicados). Dilatao e alongamento do intestino grosso, especialmente do ceco, constituiu achado freqente nesta fase, confirmando os achados radiolgicos. Microscopicamente, o tubo gastrointestinal apresentou infiltrado de mononucleares na muscular prpria (miosite) e nos gnglios (ganglionite) dos plexos misentrico e submucoso com sinais evidentes de destruio neuronal. O fgado, em alguns animais, mostrou macro e microscopicamente as caractersticas do rgo cardaco, isto , congesto e degenerao dos hepatcitos. Alm disso, acmulos nodulares de macrfagos e infiltrados de linfcitos intralobulares podiam ser observados; mais raramente material amilide (vermelho Congo positivo) podia ser evidenciado nas trabculas hepticas. Pancreatite crnica com fibrose e atrofia da parte excrina constituiu achado freqente, entretanto, as ilhotas pareciam ntegras. Os linfonodos, bao e mdula ssea mostraram discreta hiperplasia reacional, enquanto o timo era geralmente atrfico. A musculatura esqueltica exibiu miosite focal, caracterizada por infiltrado mononuclear endomisial e, ocasionalmente, necrose das fibroclulas e raros ninhos parasitrios. Os rgos genitais internos mostraram infiltrado de mononucleares no epiddimo (epididimite), vescula seminal (vesiculite), prstata (prostatite) nos machos, e nos ovrios (ooforite) e tero (metrite) nas fmeas, acompanhadas de atrofia em grau varivel desses rgos; o parnquima testicular, entretanto, mostrou-se preservado em todos os animais. O trato urinrio exibiu o mesmo infiltrado mononuclear focal na musculatura lisa da bexiga
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(cistite), do ureter (ureterite) e uretra (uretrite). Os gnglios e filetes nervosos no plexo hipogstrico exibiam discreta reao inflamatria. No sistema nervoso central observaram-se, ocasionalmente, ndulos gliais esparsos na substncia branca e infiltrados mononucleares na leptomeninge (leptomeningite focal). Nas adrenais no foi encontrado parasitismo e/ou sinais inflamatrios nas veias da medular, como tem sido observado no homem (Teixeira et al., 1991). As Figuras 13 a 24 mostram as caractersticas histopatolgicas encontradas no modelo hamster durante a fase crnica da infeco experimental por T. cruzi. Concluindo, o hamster infectado com T. cruzi pode constituir mais um modelo til para o estudo da doena de Chagas, visto que reproduz muitas das caractersticas observadas na infeco chagsica humana; no entanto, torna-se necessrio o prosseguimento das pesquisas, principalmente em nvel imunolgico, para que este animal seja caracterizado como tal.
Figura 13 Bao (infeco crnica): deposio intensa de material amelide amorfo na polpa vermelha e discreta na polpa branca com depleo de ambas as polpas - HE x 200 Figura 14 Fgado (infeco crnica): congesto sangnea intensa e reas extensas de infarto vermelho (fgado cardaco) HE x 100 Figura 15 Corao (infeco crnica): processo inflamatrio crnico focal em torno de ninho de amastigotas - PAP x 400 Figura 16 Corao: miocardite crnica difusa com intensa destruio de miofibras HE x 200
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Figura 17 Corao: miocardite crnica fibrosante focal -Tricrmico de Masson x 200 Figura 18 Corao: ganglionite e periganglionite moderadas no trio direito - HE x 200 Figura 19 Ceco: miosite e ganglionite discretas com fenmenos degenerativos de alguns neurnios - HE x 400 Figura 20 Estmago: miosite crnica multifocal HE x 200 Figura 21 Intestino delgado: miosite discreta e ganglionite intensa crnicas com destruio neuronal - HE x 400 Figura 22 Msculo esqueltico: miosite multifocal moderada com degenerao e destruio das fibras musculares - HE x 200 Figura 23 Testculo: orquite crnica intensa com extensas reas de destruio dos tbulos seminferos e infiltrado predominantemente mononuclear, azoospermia - HE x 200 Figura 24 Testculo: orquite crnica moderada mostrando abundantes ninhos de amastigotas corados em castanho atravs do mtodo imunohistoqumico peroxidase anti peroxidase - HE x 200
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9.5
Coelho
Luis Eduardo Ramrez, Eliane Lages-Silva & Edmundo Chapadeiro
O coelho vem sendo utilizado para o estudo da infeco chagsica desde a descoberta da doena (Chagas, 1909; Agosin & Badinez, 1949). Entretanto, Teixeira et al. (1975) foram, praticamente, os primeiros a realizar um estudo sistematizado da infeco neste animal, tratando de avali-lo como modelo experimental. Segundo estes autores, o curso natural da infeco chagsica experimental no coelho parece estar associado baixa mortalidade na fase aguda e elevada na fase crnica. Histopatologicamente, na fase crnica observaram no corao e intestinos leses similares s encontradas em humanos, no tendo sido detectado parasitismo tissular em nenhum dos animais inoculados. Alm disso, durante esta fase, observaram diferentes graus de neurlise e perda de clulas ganglionares. Por outro lado, Figueiredo et al. (1979), inoculando coelhos jovens com tripomastigotas da cepa Ernestina, provenientes de cultivos de clulas de corao ou de clulas Vero, observaram parasitemia pelo xenodiagnstico, anticorpos IgM especficos, at o terceiro ms, e IgG pelo resto da vida do animal; foram tambm observados transtornos eletrocardiogrficos na fase aguda manifestados por alteraes da repolarizao ventricular e bloqueio incompleto do ramo direito do feixe de Hiss e, na fase crnica, bloqueio completo do ramo direito, hemibloqueio anterior esquerdo e intervalo PR longo. Macroscopicamente, foram observados aumento do corao com trios e ventrculos dilatados, sinais de insuficincia cardaca, tromboembolismo e megaclon. Esses mesmos animais mostraram, no intestino, infiltrados linfocitrios com destruio das clulas da musculatura prpria e clulas ganglionares parassimpticas, com conseqentes seqelas fibrosas e despopulao neuronal (Rezende Filho et al., 1979). Santos-Buch & Teixeira (1974) demonstraram que linfcitos provenientes de coelhos infectados com T. cruzi, ou imunizados com fraes subcelulares do mesmo parasita, destruam clulas singnicas de coelhos infectados ou no infectados, demonstrando a existncia de determinantes antignicos comuns entre o parasita e as fibras musculares cardacas. Segundo os mesmos autores, isto configuraria um mecanismo de auto-imunidade ou fundamento da patognese da leso cardaca. Por outro lado, Andrade & Andrade (1979) observaram que o coelho oferece elevada resistncia induo da infeco experimental pelo T. cruzi quando infectado com diferentes inculos e cepas (Y, Colombiana e 12SF); durante a fase aguda, a maioria dos animais apresentou parasitemia muito baixa ou negativa, no ocorrendo mortalidade nesta fase. Do ponto de vista histopatolgico apenas alguns animais sacrificados mostraram pequenos focos esparsos de infiltrao mononuclear no miocrdio na ausncia de ninhos de amastigotas. Em animais que morreram entre o quarto e o 24o meses aps inoculao, no foram observados parasitas nem leses difusas no corao, mas somente pequenos e escassos focos de clulas mononucleares e fibrose intersticial. Contudo, Chiari et al. (1980) inoculando coelhos com diferentes doses, vias e cepas (Y, CL e MR), no recuperaram o parasita atravs de hemoculturas (LIT) realizadas entre os quinze e sessenta dias aps inoculao. Alm disso, nenhum dos animais, nas fases aguda e crnica, apresentou leses histopatolgicas significativas e as alteraes encontradas foram muito discretas, as quais, de acordo com os autores, no foram induzidas pelos parasitas. Os autores concluem que esses animais so pouco susceptveis infeco pelo T. cruzi e, por conseguinte, no seriam um bom modelo experimental para o estudo da doena de Chagas.
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A validade do coelho como modelo para o estudo da fase crnica da infeco foi reafirmada por Teixeira et al. (1983), os quais demonstraram que este animal apresentava, com grande freqncia, aumento da rea cardaca, insuficincia cardaca congestiva, fenmenos tromboemblicos, manifestaes eletrocardiogrficas e megaclon. Ramrez & Brener (1987), em pesquisa sistematizada realizada atravs de estudos parasitolgicos, imunolgicos, clnicos e histopatolgicos em coelhos infectados por diferentes cepas (Y, CL e Ernane), inculos (2-4.103 e 107), vias (intraperitoneal e conjuntival) e procedncia de tripomastigotas (fezes de barbeiros, sangue de camundongos e cultura de clulas Vero), constataram alguns achados interessantes: na fase aguda da infeco, 95,6% dos animais inoculados apresentaram parasitemia patente; os demais foram positivos atravs do xenodiagnstico ou da pesquisa de anticorpos pela imunofluorescncia indireta. Algumas das caractersticas desta fase, perodo prepatente e curvas de parasitemia, foram fortemente influenciadas pela cepa e origem do parasita, inculo e via de inoculao. A sorologia realizada pelos mtodos da imunofluorescncia indireta (IFI), hemaglutinao indireta (HAI) e lise mediada pelo complemento (LMC) mostrou a presena de anticorpos especficos desde os primeiros dias da infeco, variando de acordo com a via de inoculao e natureza do inculo. Os ttulos de IgM foram detectados na maioria dos coelhos at a 19 semana, enquanto a IgG foi observada, ao longo de toda a infeco, com ttulos elevados. Os anticorpos hemaglutinantes foram coincidentes com o aparecimento da IgG e atingiram tambm elevados ttulos durante a fase crnica. Estas observaes confirmam as de outros pesquisadores em coelhos (Katzin et al., 1977; Figueiredo et al., 1979; Teixeira et al., 1983), assim como em humanos (Vattuone et al., 1973; Cerisola, 1977; Hanson, 1977). Os anticorpos lticos foram detectados em todos os animais infectados, aparecendo entre a segunda e a oitava semanas ps-inoculao, com elevadas percentagens de lise no transcurso da infeco, independente da cepa utilizada, demonstrando a implantao de um processo ativo de infeco pelo T. cruzi (Ramrez, 1984). O estudo eletrocardiogrfico na fase aguda mostrou que 62,5% dos coelhos infectados apresentavam mutabilidade do traado, sendo as alteraes mais freqentes a bradicardia e o longo intervalo entre as ondas P e R. A mortalidade no foi observada durante a fase aguda, confirmando os achados de outros autores (Andrade & Andrade 1979; Chiari et al., 1980). Nos animais sacrificados durante a fase aguda, a autpsia no revelou alteraes macroscpicas significativas. Microscopicamente, o corao de alguns animais apresentou miocardite aguda de intensidade e extenso variveis, caracterizada por focos de infiltrados endomisiais de clulas mononucleares aderidas ao sarcolema das fibroclulas e, ocasionalmente, polimorfonucleares neutrfilos e eosinfilos. O exsudato estava associado degenerao e destruio de mioclulas, observando-se discreta fibrose intersticial em poucos animais. Ninhos de amastigotas nas clulas musculares cardacas foram encontrados em 35% dos coelhos. No trato digestivo observaram-se infiltrados focais discretos na muscular prpria (miosite) e nos plexos entricos (ganglionite); na musculatura estriada foram encontrados, ocasionalmente, focos de infiltrados mononucleares, na ausncia de parasitas (MoreiraSilva et al., 1996). Na fase crnica, a partir do terceiro ms at o 22o ms, a parasitemia foi detectada em 38% dos animais atravs do xenodiagnstico, em 14,8% atravs da hemocultura (LIT), como demonstraram tambm as pesquisas de Teixeira et al. (1983) e Figueiredo (1984). Durante a mesma fase, 71,7% dos coelhos apresentaram alteraes eletrocardiogrficas, sendo as mais freqentes: bradicardia sinusal, bloqueio trio-ventricular de primeiro grau, fibrilao auricular, extra-sstoles ventriculares e distrbios de conduo intraventricular. Nos coelhos controles no foram observadas alteraes que chamassem a ateno. Entretanto, cumpre observar que a falta de estudos bsicos do traado eletrocardiogrfico no coelho, as dificuldades de obteno do mesmo e a falta de estudos antomo-clnicos, envolvendo inclusive o sistema de conduo, dificultaram a exata interpretao desses achados.
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necropsia, poucos animais apresentaram sinais de insuficincia cardaca congestiva, como presena de hidroperitneo, fgado em noz moscada e hidropericrdio. A morte sbita foi rara, no tendo sido possvel estabelecer uma correlao desta com os achados clnicos. Do ponto de vista histopatolgico, a fase crnica foi subdividida em crnica recente (trs a seis meses) e crnica tardia (depois de seis meses), a fim de detectar possveis leses evolutivas entre as fases aguda e crnica e, desta maneira, estabelecer a morfognese do processo patolgico. Na fase crnica recente, a miocardite foi pouco freqente, porm a fibrose (discreta) mostrou-se mais comum que na fase crnica, levando-nos a supor que no coelho esta fibrose inicial representaria um fenmeno reparativo que se segue destruio miocrdica que ocorre na fase aguda (Moreira-Silva et al., 1996). Segundo nossas observaes, o coelho no reproduziu o megaclon encontrado por outros autores, nem as graves leses microscpicas observadas no trato digestivo humano (Teixeira et al., 1975; Rezende Filho et al., 1979; Figueiredo, 1984). As leses na musculatura esqueltica, especialmente a miosite, foram discretas. As Figuras 25 a 56 mostram aspectos histopatolgicos encontrados no modelo coelho, fases aguda e crnica. Apesar da positividade do xenodiagnstico e da hemocultura, nenhum dos rgos e tecidos examinados na fase crnica apresentou ninhos de amastigotas. Em concluso, embora o coelho infectado pelo T. cruzi no preencha, at o momento, todos os requisitos para um bom modelo experimental, em vista de no reproduzir as leses observadas nos humanos, poder, entretanto, ser bastante til para os estudos imunopatogenticos, como foi sugerido por Teixeira et al. (1983).
Figura 25 Miocrdio (C92 -fase aguda - 25 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada. Focos de infiltrado leucocitrio no endomsio (setas) - HE x 107,5 Figura 26 Miocrdio (C92 - fase aguda - 25 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada. Pormenor da figura anterior, mostrando infiltrado mononuclear (provavelmente consti-tudo por pequenos linfcitos) no endomsio. Os linfcitos acham-se aderidos ao sarcolema das fibroclulas - HE x 430 Figura 27 Miocrdio (C85 - fase aguda - quarenta dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada. Foco de infiltrado inflamatrio (seta) - HE x 107,5 Figura 28 Miocrdio (C85 - fase aguda - quarenta dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada. Pormenor da figura anterior mostrando o infiltrado leucocitrio constitudo por mononucleares (grandes e pequenos), granulcitos, neutrfilos e eosinfilos, associados a fenmenos degenerativos e necrticos de fibroclulas - HE x 430
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Figura 29 Miocrdio (C75 - fase aguda - 23 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite multifocal confluente (zonal). Mltiplos focos confluentes (setas) de infiltrado leucocitrio endomisial - HE x 107,5 Figura 30 Miocrdio (C75 - fase aguda - 23 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite multifocal confluente (zonal). Pormenor da figura anterior mostrando infiltrado mononuclear endomisial, associado destruio de fibroclulas cardacas - HE x 213 Figura 31 Miocrdio (C76 - fase aguda - 23 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada com fibrose inicial levssima. Focos de fibrose inicial endomisial e perimisial (setas) - Tricrmico de Gomori x 107,5 Figura 32 Miocrdio (C76 - fase aguda - 23 dias de infeco pela cepa Ernane): miocardite focal moderada com fibrose inicial levssima, endomisial e perimisial. Pormenor da figura anterior mostrando um foco de miocardite caracterizado por infiltrado mononuclear, destruio de micitos e proliferao de clulas fusiformes compatveis com fibroblastos, com discreta deposio de colgeno (corado levemente em azul) - Tricrmico de Gomori x 430 Figura 33a Miocrdio (C7 - fase aguda - 22 dias de infeco pela cepa CL): ninho de amastigotas do Trypanosoma cruzi, aparentemente ntegro sem reao inflamatria - H&E x 1.075 [ checar com autor se no 107,5] Figura 33b Miocrdio (C2 - fase aguda - 23 dias de infeco pela cepa Y): ninho de amastigotas de Trypanosoma cruzi, aparentemente roto, com reao inflamatria em torno - H&E x 1.075 [idem] Figura 34 Miocrdio (C91 - fase aguda - 25dias de infeco pela cepa Ernane): ninho de amastigotas do Trypanosoma cruzi, aparentemente roto, com reao inflamatria em torno (mononucleares apontados por setas) - PAP x 1.075 [idem]
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Figura 35 Epicrdio (C91 - fase aguda - 25 dias de infeco pela cepa Ernane): epicardite focal. Infiltrado mononuclear, neutroflico e eosinoflico no tecido adiposo epicrdico - HE x215 Figura 36 Endocrdio e miocrdio (C92 - fase aguda - 25 dias de infeco pela cepa Ernane): endocardite focal. Infiltrado mononuclear focal, discreto no endocrdio. No miocarrdio tambm se observam focos de infiltrado mononuclear - HE x 215 Figura 37 Miocrdio (C84 - fase crnica recente - trs meses de infeco pela cepa Y): miocardite focal leve, endomisial e perimisial. Foco de infiltrado leucocitrio no miocrdio (seta) - HE x 107,5 Figura 38 Miocrdio (C84 - fase crnica recente - trs meses de infeco pela cepa Y): miocardite focal leve, endomisial e perimisial. Pormenor da figura anterior, mostrando exsudato de mononucleares (grandes e pequenos) e granulcitos neutrfilos, associado a fenmenos degenerativos e necrose de fibroclulas - HE x 430 Figura 39 Miocrdio (C64 - fase crnica recente - quatro meses de infeco pela cepa Ernane): miocardite multifocal confluente (zonal) predominantemente endomisial. Focos confluentes de infiltrados leucocitrios endomisiais (setas) - HE x 43. Figura 40 Miocrdio (C64 - fase crnica recente - quatro meses de infeco pela cepa Ernane): miocardite multifocal confluente (zonal) predominantemente endomisial. Pormenor da figura anterior mostrando focos de infiltrado mononuclear, endomisiais, com alteraes degenerativas e necrose de fibroclulas - HE x 107,5
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Figura 41 Miocrdio (C52 - fase crnica recente - quatro meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Mltiplos focos confluentes de infiltrado leucocitrio associados destruio de fibroclulas e fibrose inicial, em leve tom azul (setas), de distribuio endomisial e perimisial - Tricrmico de Gomori x 43 Figura 42 Miocrdio (C52 - fase crnica recente - quatro meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Pormenor da figura anterior mostrando reas confluentes de destruio de fibroclulas, substitudas pela fibrose. A hipercelularidade e a discreta deposio de colgeno, indicada pela leve tonalidade azul, caracteriza a fibrose como inicial - Tricrmico de Gomori x 107,5 Figura 43 Miocrdio (C52 - fase crnica recente - quatro meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Pormenor da figura anterior mostrando a proliferao de clulas fusiformes, compatveis com fibroblastos, com discreta deposio de colgeno (colorao azulada), em substituio s fibroclulas destrudas -Tricrmico de Gomori x 430 Figura 44 Tnica muscular de parede gstrica (C81 - fase crnica recente - trs meses de infeco pela cepa Y): miosite focal. Infiltrado inflamatrio mononuclear e neutroflico na tnica muscular do estmago - HE x 430 Figura 45 Miocrdio (C9 - fase crnica tardia - dezesseis meses de infeco pela cepa CL): miocardite focal leve. Focos de infiltrado leucocitrio (setas). Em B, pormenor de um dos focos mostrando o infiltrado constitudo por mononucleares, pequenos e grandes, no endomsio - H&E x107,5 (Figura 45 A), H&E x 430 (Figura 45 B) Figura 46 Miocrdio (C47 - fase crnica tardia - seis meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Foco de miocardite mostrando infiltrado mononuclear, acentuada miocitlise e proliferao de clulas fusiformes compatveis com fibroblastos - H&E x 215
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Figura 47 Miocrdio (C47 - fase crnica tardia - seis meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Mltiplos focos confluentes de infiltrado leucocitrio miocrdico, com destruio de fibroclulas e fibrose inicial (setas) Tricrmico de Gomori x 43 Figura 48 Miocrdio (C47 - fase crnica tardia - seis meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante. Pormenor da figura anterior mostrando reas perimisiais e endomisiais de destruio de micitos e proliferao de clulas fusiformes, compatveis com fibroblatos, com discreta deposio de colgeno (fibrose inicial) -Tricrmico de Gomori x 215 Figura 49 Miocrdio (C25 - fase crnica tardia - treze meses de infeco pela cepa Y): miocardite focal moderada, fibrosante. So vistos trs focos de fibrose miocrdica (setas), predominantemente endomisial, com discreto infiltrado mononuclear. A fibrose caracteriza-se por intensa deposio de colgeno, corado em azul (fibrose avanada) - Tricrmico de Gomori x 215 Figura 50 Miocrdio (C47 - fase crnica tardia - seis meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante, perimisial e endomisial. Pormenor de uma rea de fibrose miocrdica perimisial e endomisial, caracterizada por acentuada deposio de colgeno, corado em azul (fibrose avanada) - Tricrmico de Gomori x 215 Figura 51 Miocrdio (C4 - fase crnica tardia - doze meses de infeco pela cepa Y): miocardite multifocal confluente (zonal), fibrosante, perimisial e endomisial. Mltiplos focos confluentes de destruio de fibroclulas e substituio por fibrose avanada Tricrmico de Gomori x 107,5 Figura 52 Epicrdio (C9 - fase crnica tardia - dezesseis meses de infeco pela cepa CL): epicardite focal. Infiltrado mononuclear no tecido adiposo epicrdico, com presena de clulas epiteliides e de clulas gigantes do tipo Langhans - HE x 215
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Figura 53 Miocrdio da ponta do ventrculo direito, em rea de ruptura (C57 - fase crnica tardia - doze meses de infeco pela cepa Y): hemorragia e intensa miocardite, com exsudato mononuclear e neutroflico, formando microabscessos (setas) - HE x 215 Figura 54 Parede do ceco (C44 - fase crnica tardia - dezoito meses de infeco pela cepa Y): fibrose difusa demonstrada pela colorao azul, da tnica muscular externa - Tricrmico de Gomori x 107,5 Figura 55 Tecido muscular esqueltico (C16 - fase crnica tardia - 22 meses de infeco pela cepa CL): miosite focal. Foco de infiltrado mononuclear perimisial e proliferao de clulas fusiformes compatveis com fibroblastos - HE x 430 Figura 56 Tecido heptico (C47 - fase crnica tardia - seis meses de infeco pela cepa Y): fgado cardaco de segundo grau. Congesto heptica centrolobular com fenmenos degenerativos (degenerao hidrpica e esteatose) e necrose de hepatcitos perivenulares - HE x 215
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9.6
Co
Sonia G. Andrade
O co tem sido utilizado por diversos pesquisadores no estudo experimental da doena de Chagas. Este modelo de grande interesse porque o nico, entre os diversos modelos experimentais, que desenvolve as diversas formas clnico-patolgicas da doena de Chagas, como so vistas no homem. A fase aguda da doena em ces jovens, inoculados com cepas virulentas do Trypanosoma cruzi evolui em um perodo de quinze a 25 dias ps-inculo, cursando em geral como uma forma aguda grave no homem, com envolvimento cardaco proeminente (Andrade & Andrade, 1980). Os animais que sobrevivem a esta fase aguda passam a uma fase latente da infeco, sem sinais de doena, com eletrocardiogramas normais, caracterizando a fase indeterminada (Andrade et al., 1981; Andrade, 1984). Apenas uma pequena percentagem dos casos desenvolve a forma crnica cardaca, com cardiomegalia, arritmias, edema perifrico, ascite e derrame pericrdico e um quadro de miocardite crnica progressiva (Laranja & Andrade, 1980). A fase aguda da infeco facilmente obtida em ces jovens (dois a trs meses de idade). Utilizando as cepas do T. cruzi, classificadas como do Tipo I (Y ou Peruana), a infeco se caracteriza por um curso rpido, levando ao bito em no mximo vinte dias e, a depender do inculo, os ces no sobrevivem fase aguda. Por este motivo as cepas que tm sido usadas, objetivando um acompanhamento mais prolongado, so as cepas 12 SF (Tipo II) proveniente de So Felipe, Bahia, e a cepa Colombiana (Tipo III). Os inculos, constitudos de formas sangucolas obtidas de sangue citratado de camundongos, so injetados intraperitonealmente variando entre 4.105 e 6.105. Os ces jovens desenvolvem parasitemias pouco elevadas a partir do stimo dia ps-infeco, no havendo paralelismo entre o nmero de parasitos no sangue perifrico e o intenso parasitismo cardaco desenvolvido por estes animais. As leses histopatolgicas da fase aguda se caracterizam por intenso parasitismo do miocrdio, com rotura das clulas parasitadas, determinando acentuado infiltrado focal com mononucleares e polimorfonucleares. H tambm necrose de micitos no parasitados e intensa miocardite (Figura 57). As leses na fase aguda podem ser monitorizadas pelo estudo eletrocardiogrfico e comparadas com o quadro antomo-patolgico (Andrade, 1984) pelo estudo do sistema de conduo do corao que mostra leses inflamatrias acentuadas. Em geral as alteraes eletrocardiogrficas aparecem entre quinze e trinta dias psinfeco e se caracterizam por alteraes de onda T e do segmento ST, evoluindo posteriormente para alteraes indicativas do envolvimento dos trios do corao, principalmente a fibrilao atrial. A reverso das alteraes eletrocardiogrficas foi vista em ces tratados com quimioterpico especfico (nifurtimox), principalmente quando associado com corticide (Andrade et al., 1980) e correspondeu regresso das intensas leses histopatolgicas apresentadas pelos animais antes do tratamento. A possibilidade de acompanhamento eletrocardiogrfico permite avaliar a produo e conduo do estmulo eltrico e a instalao das arritmias cardacas, bem como estabelecer a sua correlao com as leses do sistema excito-condutor do corao. O modelo do co, pelas suas caractersticas, permite a investigao dos mecanismos patogenticos envolvidos no estabelecimento das leses atravs de estudos histopatolgico, ultra-estrutural e imunopatolgico.
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O estudo ultra-estrutural do miocrdio na fase aguda mostrou, ao lado de clulas parasitadas, a presena de alteraes degenerativas e necrticas em micitos no parasitados (Andrade et al., 1996). Linfcitos e macrfagos estavam aderentes s clulas cardacas e determinavam alteraes da membrana basal, miocitlise e separao das junes intercelulares. Estas alteraes sugerem um mecanismo citotxico e citoltico mediado por clulas imunes efetoras, na necrose de clulas cardacas no parasitadas, na fase aguda da infeco pelo T. cruzi (Andrade et al., 1996). A forma indeterminada no co, como no homem, cursa sem sintomatologia e sem alteraes eletrocardiogrficas. Os animais acompanhados desde a fase aguda at trs anos aps a infeco tiveram bom desenvolvimento, com sade aparente e ativos. O estudo histopatolgico do corao nestes animais mostrou ausncia de leses ou presena de leses inflamatrias focais discretas constitudas por macrfagos e linfcitos. Diferentemente do que foi observado na fase aguda, no mostram tendncia a aderirem ao micito, no determinam alteraes citotxicas sobre os mesmos quando examinados ao microscpio eletrnico e mostram tendncia ao desaparecimento por apoptose, com condensao citoplasmtica e alteraes caractersticas da cromatina nuclear (Andrade et al., 1996). Este processo visto na forma indeterminada do co pode ser responsvel pela falta de progresso das leses nesta forma, que estariam sujeitas a um mecanismo de controle que levaria apoptose das clulas inflamatrias. Uma acentuao da miocardite da fase indeterminada foi obtida em ces pelo uso de ciclofosfamida em baixas doses (50 mg/m2 rea corporal, trs vezes por semana, durante trs semanas). Estes animais desenvolveram uma miocardite difusa com necrose de fibras cardacas e acentuado infiltrado inflamatrio mononuclear, na ausncia de parasitos. Estes achados vieram a demonstrar que uma interferncia na rede imunolgica de supresso de hipersensibilidade tardia, que mantinha os animais na forma indeterminada, capaz de desencadear uma miocardite evolutiva nos mesmos (Andrade et al., 1987). A forma crnica cardaca raramente se desenvolve no co, pelo menos no intervalo de tempo de trs anos entre a inoculao e o sacrifcio. Tm sido descritos casos com cardiomegalia, arritmia e insuficincia cardaca congestiva, porm sem estudo antomo-patolgico. Esta correlao clnico-patolgica foi observada por Laranja & Andrade (1980), que descreveram a forma crnica cardaca em um co com dezesseis meses de infeco com caractersticas semelhantes s observadas na cardiopatia humana, com miocardite difusa, fibrose focal e intersticial e degenerao focal de fibras cardacas em relao com o processo inflamatrio (Figura 58). Tambm na fase crnica o estudo do sistema excito-condutor do corao permite reconhecer topograficamente as leses fibrtico-inflamatrias nos diversos segmentos do sistema (Figuras 59 e 60), possibilitando a correlao eletrocardiogrfica. Os aspectos apresentados mostram que o co tem como principal vantagem reproduzir as diversas fases da doena de Chagas, permitindo o monitoramento eletrocardiogrfico e correlao com leses do sistema excitocondutor do corao. Alm disto, o co tem sido muito utilizado pelos fisiologistas para o estudo eletrofisiolgico do corao, o que permite uma slida base para interpretao dos achados na doena de Chagas. Como desvantagem, existe o fato de necessitar de um longo perodo de acompanhamento para que possa surpreender a fase crnica cardaca, permanecendo os ces na fase indeterminada em alta percentagem dos casos.
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Figura 57 Miocardite difusa e focal em co no 23o dia de infeco pelo Trypanosoma cruzi: presena de micitos parasitados (setas); necrose focal de clulas miocrdicas com intenso infiltrado inflamatrio; infiltrado intersticial mononuclear difuso HE x 250 Figura 58 Seces do miocrdio em co cronicamente infectado pelo Trypanosona cruzi: miocardite crnica, observando-se septos fibrosos que dissociam as fibras cardacas e difuso infiltrado mononuclear - Tricrmico de Masson x 100 Figura 59 Seco do sistema excito-condutor do corao de um co cronicamente infectado pelo Trypanosoma cruzi, observandose o feixe de His (FH) e sua bifurcao: RD (ramo direito) e RE (ramo esquerdo); infiltrado mononuclear difuso com dissociao das fibras por fino depsito colagnico, predominante no ramo direito - Tricrmico de Masson x 100 Figura 60 Corao de co cronicamente infectado: seco do sistema excito-condutor observando-se substituio dos micitos no feixe de His por adipcitos e presena de infiltrado mononuclear difuso - Tricrmico de Masson x 100
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9.7
Macaco
Maria da Gria Bonecini-Almeida
Vrios animais tm sido utilizados como modelos experimentais com o propsito de se obter um modelo que reproduza satisfatoriamente a doena de Chagas humana, como discutido por outros autores neste captulo. Evidncias acumuladas durante as ltimas dcadas tm indicado que primatas no humanos so modelos experimentais adequados para o estudo de aspectos imunopatognicos da doena de Chagas. Os gneros Callitrix, Saimiri, Cebus e Macaca tm sido estudados empregando-se diferentes cepas de Trypanosoma cruzi, formas evolutivas do parasito, bem como diversas vias de inoculao. Descreveremos brevemente alguns modelos experimentais em primatas no humanos, utilizados na tentativa de reproduo da doena de Chagas humana, e nos deteremos na descrio minuciosa da infeco em macacos rhesus (Macaca mulatta).
Gnero Callitrix
O gnero Callitrix (penicillata) foi a primeira espcie de primatas no humanos utilizada como modelo experimental para a doena de Chagas, por Carlos Chagas em 1909. Estes animais desenvolveram satisfatoriamente a infeco aguda, entre vinte e trinta dias aps o contato com triatomneos infectados.
Gnero Cebus
Entre os primatas mais utilizados, at o momento, como modelo para a doena de Chagas humana, esto os animais do gnero Cebus, pela sua capacidade de reproduzirem as fases aguda e crnica da doena humana, alm da facilidade de domesticao e manuseio. Os primeiros trabalhos a utilizarem estes animais tinham por objetivo avaliar sua susceptibilidade infeco. Assim, Dorland (1943) demonstrou a presena de sinal de Romaa em animais infectados pela conjuntiva ocular por cepas de T. cruzi provenientes de isolados clnicos do Panam, Venezuela e Estados Unidos (Texas e Califrnia), alm da presena de miocardite discreta e difusa. Estudos posteriores realizados por Torres & Tavares (1958) no demonstraram um aumento progressivo nas leses do miocrdio em animais submetidos a repetidas inoculaes por cepas de T. cruzi (Y, Nilma e Jovina). Estudos comparativos foram realizados por Falasca et al. (1986), utilizando um nico inculo ou repetidas inoculaes, com diferentes cepas do parasita CA1, Colombiana e Tulahuen (incluindo duas vias de inoculao, conjuntiva e intraperitoneal, e diferentes cargas parasitrias, 4 x 104 e 1 x 106), na tentativa de determinar a susceptibi160
lidade do macaco Cebus infeco pelo T. cruzi. Estes autores deteminaram assim que sete dos dez animais infectados pela cepa CA1 pela conjuntiva apresentaram parasitemia positiva e, independentemente da carga parasitria a que foram infectados, estes animais apresentaram alteraes eletrocardiogrficas (ECG) e dilatao do colo variveis. Todos os animais infectados pelas cepas Colombiana e Tulahuen apresentaram parasitemia positiva, persistentes alteraes de ECG, mas nenhum animal apresentou dilatao no colo. As alteraes cardacas e histopatolgicas foram detectadas mais precocemente nos animais infectados pela cepa Colombiana. O acompanhamento cintico da infeco chagsica em macacos C. apella foi realizado por Rosner et al. (1988) durante as 26 primeiras semanas de infeco, usando a cepa Y por via subcutnea. Estes autores notaram o aparecimento de sintomatologia compatvel fase aguda, como a presena de febre, perda de peso, parasitemia direta positiva, alteraes eletrocardiogrficas e radiolgicas compatveis com a doena humana. Contudo, nenhum animal apresentou chagoma de inoculao durante a fase aguda da infeco. A caracterizao da miocardite crnica chagsica foi realizada aps um perodo de doze e 48 meses de infeco, onde somente trs animais apresentaram aumento cardaco e a anlise histopatolgica mostrou uma miocardite difusa ou focal com infiltrado linfoplasmoctico (Rosner et al., 1989).
Gnero Saimiri
Estes pequenos primatas (S. sciureus) so encontrados infectados na natureza tanto por Leishmania como por T. cruzi. Na tentativa de caracterizar a evoluo da infeco chagsica nestes animais, Pung et al. (1988a) os infectaram por via subcutnea utilizando formas tripomastigotas metaclclicos da cepa Brasil. O acompanhamento da fase aguda revelou a presena de parasitemia positiva, alteraes prolongadas no eletrocardiograma, anticorpos especficos contra o T. cruzi, alteraes hematolgicas e resposta linfoproliferativa elevada contra antgenos do parasita. Pensando na possvel interao na natureza entre o T. cruzi e Leishmania b. braziliensis, os mesmos autores (Pung et al., 1988b) estudaram o desenvolvimento da dupla infeco nestes animais. A prvia infeco pelo T. cruzi ou L. b. braziliensis no protege os animais contra a infeco heterloga. Os animais desenvolveram quadro clnico semelhante infeco primria.
Gnero Macaca
Quanto sua homologia ao homem, o macaco rhesus (Macaca mulatta) est classificado na escala filogentica abaixo dos grandes primatas: gorilas, orangotangos e chimpanzs (de difcil utilizao como modelo experimental, aquisio pelo alto custo financeiro e dificuldades no manuseio), e acima dos primatas do Novo Mundo (Cebus, Saimiris e Callitrix), como descrito por Martin & Leslie (1977), Finkelman & Scher (1979), Cossini et al. (1981), Neubauer et al. (1982) e Levtin et al. (1983). Por ser animal de mdio porte, o que facilita seu manuseio, e por apresentar quadros clnicos que reproduzem as patologias humanas, o macaco rhesus tem sido considerado o modelo de escolha entre os primatas no humanos para se estudar diversas patologias como leishmaniose (Amaral et al., 1996) e HIV/Aids (Reimann et al., 1996; Dunn et al., 1996), o que facilita a extrapolao dos resultados obtidos nestes animais para molstias humanas (Ostrow et al., 1990; Li et al., 1994). Diversos autores tm estudado a infeco chagsica experimental em macacos rhesus. A fase aguda tem se mostrado semelhante forma humana, relatando-se desenvolvimento de leso de porta de entrada, parasitemia direta positiva, alteraes hematolgicas, sorologia especfica positiva e alteraes de ECG (Marsden et al., 1970, 1976; Seah, 1974; Miles et al., 1979).
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Com os conhecimentos adquiridos pelo acompanhamento longitudinal da infeco em C. apella por Rosner et al. (1988), e pelo resultados obtidos pelos autores acima citados durante a fase aguda da infeco chagsica em macacos rhesus, nos propusemos a estudar a imunopatologia e a cintica da infeco chagsica experimental neste modelo. A proximidade filogentica aos seres humanos nos proporcionaria a utilizao de reagentes contra antgenos celulares de superfcie (CD4, CD8, CD14, CD19) (Reimann et al., 1994) e componentes da imunidade humoral, como fraes do sistema complemento e anticorpos, para caracterizar as fases aguda e crnica da doena de Chagas humana. A fase aguda em macacos rhesus tem se mostrado semelhante forma humana, como mencionado anteriormente; assim, descreveremos brevemente os resultados obtidos por ns em macacos rhesus infectados subcutaneamente com formas tripomastigotas metaciclcas do T. cruzi (cepa Colombiana). A presena de chagomas de inoculao foi observada em nove dos treze animais infectados entre o terceiro e o 13 dia ps-infeco (p.i.). A leso cutnea foi caracterizada como um eritema/ppula. Os linfonodos axilares estavam aumentados (palpveis) em todos os animais infectados, sem a presena de hepatoesplenomegalia (Bonecini-Almeida et al., 1990). Anlises histopatolgicas demonstraram ectasia vascular, edema e infiltrado inflamatrio histio-linfocitrio difuso na derme papilar, enquanto que na derme reticular observou-se intenso infiltrado perivascular e perianexial com a presena de ninhos de amastigotas no msculo eretor do plo (Bonecini-Almeida et al., 1990). Fragmentos da leso cutnea foram estudados por microscopia eletrnica de transmisso e observamos desorganizao nas fibras de mielina e retrao dos axnios nos nervos perifricos (Meirelles et al., 1990). Os moncitos/macrfagos presentes na leso apresentavam grnulos de peroxidase, indicativo de ativao celular. Nas primeiras cinco semanas ps-infeco os animais apresentavam-se apticos, com perda de apetite e discreta perda de peso, sendo mais acentuada na terceira semana p.i. (em mdia 5,5 % de perda do peso corporal), retornando normalidade a partir da nona semana p.i. A parasitemia direta foi detectada em todos os animais entre o 13o e o 22o dia p.i.; os nveis mximos de parasitemia foram detectados entre a quarta e a stima semana, negativando em todos os animais na dcima semana p.i. Os parasitos foram isolados por hemocultura e/ou xenodiagnstico por at quatro anos p.i., contudo em animais infectados com cepas isoladas de pacientes foi possvel detectar parasitas circulantes por at vinte anos p.i. (dados no publicados, Dr. Francisco Laranja). Durante a fase aguda todos os animais apresentaram anemia caracterizada pela diminuio dos valores de hematimetria, hematcrito e hemoglobina entre a quinta e a stima semana p.i., indicativa de anemia normoctica e normocrmica. Os nmeros absolutos de leuccitos e linfcitos encontravam-se elevados (p < 0,05) entre a quinta e a 16a semana p.i. As alteraes eletrocardiogrficas e radiolgicas foram caracterizadas como distrbio de conduo trio-ventricular (7/9), anormalidade de repolarizao da onda T (3/9), baixa voltagem de QRS (3/9) e bloqueio incompleto de ramo direito (2/9). Estes achados foram transitrios e desapareceram aps a 20a semana p.i. Na Figura 61, podemos verificar uma estreita correlao entre os picos de parasitemia direta e a presena das anomalias cardacas nesses animais. O esclarecimento dos mecanismos envolvidos na resposta imune ao T. cruzi tem sido a meta de investigao de diversos autores. Hoje, os resultados acumulados ao longo de vrias dcadas tornam evidente a participao de diferentes mecanismos, quer na defesa, ou na agresso, atuando direta ou indiretamente na interao parasito-hospedeiro. Anticorpos IgM anti T. cruzi atingiram nveis mximos na stima semana p.i., e os anticorpos IgG na 12a semana p.i. Estes ltimos permaneceram presentes at o sexto ano de infeco, enquanto os anticorpos IgM j no eram mais detectveis em quatro dos seis animais infectados na 28a semana, como demonstrado na Figura 62. Observou-se uma elevao na concentrao srica de anticorpos IgG e IgM com nveis mximos atingidos entre a sexta e a oitava semana p.i., o que correspondeu a trs vezes os valores observados nos animais controles no infectados (Figura 62). O desaparecimento de anticorpos especficos IgM e o aparecimento e persistncia daqueles pertencentes classe IgG comportamento idntico ao descrito na doena experimental e humana (Camargo & Amato Neto, 1974; WHO, 1974; Miles et al., 1979; Braun & Titto, 1985; Falasca et al., 1986). De modo interessante, tambm neste modelo experimental, altos nveis de anticorpos anti T. cruzi encontrados esto relacionados ao controle e diminuio do nmero de parasitas circulantes, como observado no modelo murino, sugerindo um papel protetor para estes
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anticorpos (Krettli & Brener, 1982). Contudo, o aumento de IgM e IgG totais no devido somente sntese de anticorpos especficos para o T. cruzi, tendo sido detectados anticorpos antihemceas de carneiro (heterlogos) e anti DNA (auto-anticorpos). Os primeiros mostraram no s cintica de produo similar IgM total, como tambm revelaram sensibilidade ao tratamento pelo -mercapto-etanol. Os auto-anticorpos, por sua vez, mostraram cintica que se assemelhou de IgG total e, uma vez positivos, no se negativaram. A deteco de anticorpos lticos no soro de animais infectados torna-se importante por ser considerada como evidncia da persistncia do parasito no organismo, constituindo evidncia adicional da similaridade com a infeco humana (Krettli et al., 1979). Verificou-se durante a infeco experimental que todos os animais apresentavam anticorpos lticos detectveis por perodos superiores a trs anos de infeco. Um outro dado interessante foi observado durante o pico destes anticorpos (entre a quinta e a oitava semana), e a simultnea diminuio nos nveis de C3 e C4. Assim, parece bastante provvel que os anticorpos lticos estejam colaborando com o consumo de complemento durante este perodo (Figura 63) e posterior eliminao da parasitemia circulante. A acentuada leucocitose evidenciada, descrita tambm em seres humanos (Baruffa, 1975; Baruffa & Alcantara, 1983), correspondeu a aumento tanto de clulas B, T e moncitos (Figura 64); foram observados nveis mximos entre a quinta e a nona semanas p.i., coincidindo com outras alteraes descritas anteriormente, como o aumento do nmero de parasitas circulantes, alteraes no ECG e hipergamaimunoglobulinemia. O aumento no nmero absoluto de moncitos circulantes no apresentou associao significativa com qualquer outra alterao imunolgica durante o curso da infeco chagsica nestes animais. A linfocitose observada nestes animais foi devida tanto ao aumento do nmero de linfcitos T CD4+ quanto T CD8+, elevados at seis e onze vezes, respectivamente, em comparao aos animais no infectados, atingindo os valores mximos entre a segunda e a oitava semana p.i. (Figura 65). Associado hipergamaimunoglobulinemia e ao aumento do nmero total de leuccitos, o aumento do nmero de clulas CD4+ e CD8+ em sangue perifrico de animais infectados pode ser considerado como evidncia da existncia de ativao policlonal de clulas B e T neste modelo experimental como demonstrado no modelo murino (Minoprio et al., 1986) e mais recentemente na doena de Chagas humana (Grauert et al., 1993). O aumento das subpopulaes de linfcitos T CD4+ e CD8+ acompanhou o aumento e o pico de parasitemia circulante em animais sacrificados neste perodo. Foi possvel observar a presena de macio infiltrado mononuclear nas fibras cardacas e a presena de numerosos ninhos de amastigotas, como descrito na fase aguda da doena de Chagas humana. A capacidade dos linfcitos T perifricos de macacos rhesus infectados responderem in vitro a antgenos do T. cruzi foi demonstrada como sendo similar aos estudos realizados por Cetron et al. (1993). Observamos uma intensa imunossupresso tanto aos antgenos especficos como na resposta inespecfica PHA, como pode ser observado na Figura 66. A imunidade mediada por clulas na infeco chagsica experimental est relacionada ativao de linfcitos T CD4+ (Younes-Chennoufi et al., 1988), embora alguns autores citem a participao de clulas T CD8+ na leso cardaca experimental (Tartelon, 1991) e humana (Reis et al., 1993). Podemos ento, concluir que primatas no humanos so susceptveis infeco pelo T. cruzi e desenvolvem a doena diferentemente, dependendo da cepa do parasito, inculo e via de inoculao a que foram submetidos durante a experimentao. Contudo, apresentam grande reprodutividade em relao ao desenvolvimento de alteraes eletrocardiogrficas e radiolgicas, parasitemia patente, alteraes hematolgicas com anemia normoctica e normacrmica e leucocitose, alteraes histopatolgicas decorrente da presena do parasito em fibras cardacas e finalmente imunossupresso. Assim, os primatas no humanos e em especial os macacos rhesus, devido sua proximidade filogentica ao homem, podero nos auxiliar a entender os mecanismos imunopatognicos ocorridos durante a evoluo da doena de Chagas humana, tanto na fase aguda como na fase crnica da infeco.
Agradecimentos A Dra. Joseli Lannes Vieira pela reviso e discusso no preparo deste manuscrito.
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Figura 61 Acompanhamento dos nveis de parasitemia direta (linha) e alteraes eletrocardiogrficas (barras) durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi Figura 62 Acompanhamento dos nveis anticorpos IgM e IgG anti Trypanosoma cruzi (A) e totais (B) durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi Figura 63 Acompanhamento dos nveis de anticorpos lticos e fraes do complemento (C3 e C4) durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi Figura 64 Acompanhamento do nmero de linfcitos T, B e moncitos circulantes durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi Figura 65 Acompanhamento do nmero de linfcitos T CD4+ e T CD8+ circulantes durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi Figura 66 Acompanhamento da resposta linfoproliferativa perante antgenos do Trypanosoma cruzi e mitgeno durante o curso da infeco chagsica aguda em macacos rhesus infectados pela cepa Colombiana do Trypanosoma cruzi
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ABELMAN, W. H. Experimental infection with Trypanosoma cruzi (Chagas disease): A model of acute and chronic myocardiopathy. Annals New York Academy of Sciences,166:137-153,1969. ABRAHAMSOHN, I. A. & COFFMAN, R. L. T. cruzi: IL-10, TNF, IFN- e IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. Experimental Parasitology, 84:231-239, 1996. AGOSIN, M. & BADINEZ, O. Algumas de las caracteristicas de la infeccin experimental en conejos. Boletin de Informaciones Parasitologicas Chilena, 4: 6-7, 1949. ALCNTARA, F. G. Sistema neuro-vegetativo do corao na molstia de Chagas experimental. Revista Goiana de Medicina 7:111-126, 1961. ALCNTARA, F. G. Molstia de Chagas experimental (manifestaes viscerais). O Hospital, 66:625-633, 1964. ALCNTARA, F. G. & OLIVEIRA, J. A. M. Fase crnica da molstia de Chagas em rato Wistar. Pesquisas quantitativas dos neurnios no plexo de Meissner. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 6:204-206, 1964. AMARAL, V. F.; RANSATTO, V. A. O.; CONCEIO-SILVA, F.; MOLINARO, E.; FERREIRA, F.; COUTINHO, S. G.; MCMAHON-PRATT, D. & GRIMALDI, G. Leihmania amazonensis: The Asian rhesus macaques (Macaca mulatta) as an experimental model for study of cutaneous leishmaniasis. Experimental Parasitology, 82:34-44, 1996. AMORIM, D. S.; MELO DE OLIVEIRA, J. A.; MANO, J. C.; GALLO JR., L. & OLIVEIRA, J. S. M. Chagas heart disease: First demostrable correlation between neuronal degeneration and autonomic impairment. Acta Cardiologica, 28:431-437, 1973. ANDRADE, L. O.; MACHADO, C. R.; CHIARI, E., PENA, S. D. & MACEDO, A. M. Differential tissue distribution of diverse clones of Trypanosoma cruzi in infected mice. Molecular and Biochemical Parasitology, 100:163-172, 1999. ANDRADE, S. G. & SADIGURSKY, M. The conduction system of the heart in mice chronically infected with Trypanosoma cruzi: histopathological lesions and electrocardiographic correlations. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 82:59-66, 1987. ANDRADE, S. G.; ANDRADE, V.; BRODSKYN, C.; MAGALHES, J. B. & BARRAL-NETO, M. Immunological response of Swiss mice to infection with different strains of Trypanosoma cruzi. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 79: 397-407, 1985a. ANDRADE, S. G.; ANDRADE, Z. A. & SADIGURSKY, M. Combined treatment with a nitrofuranic and a corticoid in experimental Chagas disease in the dog. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 29:773, 1980. ANDRADE, S. G.; CARVALHO, M. L.; FIGUEIRA, R. M. & ANDRADE, Z. A. Recuperao e caracterizao dos tripanosomas inoculados em animais imunes. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 12:395-399, 1970. ANDRADE, S. G.; KLOETZEL, J. K.; BORGES, M. M. & FERRANS, V. J. Morphological aspects of the myocarditis and myositis in C. callosus callosus experimentally infected with Trypanosoma cruzi: Fibrogenesis and spontaneous regression of fibrosis. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 89: 379-393, 1994. ANDRADE, S. G.; STOCKER-GUERRET, S.; PIMENTEL, A. S. & GRIMAUD, J. A. Reversibility of cardiac fibrosis in mice chronically infected with Trypanosoma cruzi, under specific chemotherapy. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 86:187-200, 1991. ANDRADE, V.; BARRAL-NETO, M. & ANDRADE, S. G. Patterns of resistance of inbred mice to Trypanosoma cruzi are determined by parasite strain. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 18: 499-506, 1985b. ANDRADE, Z. A. The canine model of Chagas disease. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 79 (Suppl.):77-83, 1984. ANDRADE, Z. A. & ROCHA SILVA, H. R. Parasitism of adipocytes by Trypanosoma cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 90:521-522, 1996. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G.; CORREA, R. & SADIGURSKY, M. Myocardial changes in acute Trypanosoma cruzi infection. Ultrastructural evidence of immune damage and the role of microangiopathy. American Journal of Pathology, 144:1403-1411, 1994. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G. & SADIGURSKY, M. Enhancement of chronic Trypanosoma cruzi myocarditis in dogs treated with low doses of cyclophosphamide. American Journal of Pathology, 127:467-473, 1987. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G.; SADIGURSKY, M. & MAGUIRE, J. H. Experimental Chagas disease in dogs: A pathologic and ECG study of the chronic indeterminate phase of the infection. Archives Pathology Laboratory Med, 105:450464, 1981. ANDRADE, Z. A.; ANDRADE, S. G.; SADIGURSKY, M. WENTHOLD, J. R.; HILBERT, S. L. & FERRANS, V. J. The indeterminate phase of Chagas disease. Ultrastructural characterization of cardiac changes in the canine model. American
165
Journal of Pathology, 57:328-336, 1996. ANTUNEZ, M. I.; FEINSTEIN, R. E.; CARDONI, R. L. & GRONVIK, K. O. Trypanosoma cruzi: T cell populations in the Peyers patches of BALB/C infected mice. Experimental Parasitology, 87:58-64, 1997. ARAJO, S. M. & CHIARI, E. Biological characterization of clones of the Y, CL and MR strains of Trypanosoma cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 83:175-181, 1989. ARAJO-JORGE, T. C.; LAGE, M. J. F.; RIVERA, M.;T.; CARLIER, Y. & VAN LEUVEN, F. Trypanosoma cruzi: Enhanced amacroglobulin levels correlate to resistance of Balb/CJ mice to acute infection. Parasitology Research, 78:215-221, 1992. BARUFFA, G. Diagnstico da doena de Chagas. 1975. Porto Alegre: AMRIGS, p. 127-137. BARUFFA, G. & ALCANTARA FILHO, A. Forma aguda da doena de Chagas no Rio Grande do Sul. Aspectos laboratoriais. Revista Goiana de Medicina, 29:9-15, 1983. BERALDO, P. S. S. Sobre a infeco chagsica experimental no rato: estudo eletrocardiogrfico seriado e funcional autonmico do corao, correlacionado histopatologia. 1987. Tese de Mestrado, Braslia: Universidade de Braslia. BESTETTI, R. B.; SOARES, E. G.; SALES-NETO, V. N.; ARAUJO, R. C. & OLIVEIRA, J. S. M. The resting eletrocardiogram of Trypanosoma cruzi -infected rats. Revista do Instituto de. Medicina Tropical de So Paulo, 29:224-229, 1987. BONECINI-ALMEIDA, M. G.; GALVO-CASTRO, B.; PESSOA, M. H. R.; PIRMEZ, C. & LARANJA. F. Experimental Chagas disease in rhesus monkeys. I - Clinical, parasitological, hematological and anatomo-pathological studies in the acute and indeterminate phase of the disease. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 85:163-171, 1990. BORGES, M. M.; ANDRADE, S. G.; PILATTI, C. G.; PRADO JR. J. C. & KLOETZEL, J. K. Macrophage activation and histopathological findings in Calomys callosus callosus and Swiss mice infected with several strains of Trypanosoma cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 87:493-502, 1992. BORGES, M. M.; MELLO, D. A. & TEIXEIRA, M. L. Infeco experimental do Calomys callosus Rodentia Cricetidae com Trypanosoma cruzi. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 16:233-242, 1982. BORGES, M. M.; VASSAO, R.; ANDRADE, S. G.; PEREIRA, C. A. & KLOETZEL, J. K. Interferon- levels during the course of Trypanosoma cruzi infection of Calomys callosus callosus Rodentia Cricetidae and Swiss mice. Parasitology Research, 81:498-504, 1995. BRAND, T.; TOBIE, E. J.; KISSLING, R. E. & ADAMS, G. Physiological and pathological observations on four strains of Trypanosoma cruzi. Journal of Infectious Diseases, 85:5-16, 1949. BRAUN, M. & TITTO, E. Respuesta inmune al Trypanosoma cruzi. Un enfoque de patogenia en la enfermedad de Chagas. Acta Physiologica Pharmacologica Latinoamericana, 35:1-47, 1985. BRENER, Z. Life cycle of Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo 13:171-178, 1971. CABEZA-MECKERT, P. & LAGUENS, R. Modelos experimentales. In: Enfermidad de Chagas. 1994. Buenos Aires: Doyma, Cap. 9, p. 129-140. CABEZA-MECKERT, P. M. & LAGUENS, R. P. Enfermidad congnita a la infeccin crnica del ratn con Trypanosoma cruzi. Modelo experimental de la enfermidad de Chagas congnita. Medicina (Buenos Aires), 40:40-45, 1980. CAMARGO, M. E. & AMATO-NETO, V. Trypanosoma cruzi IgM antibodies as serological evidence of recent infection. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 16:200-202, 1974. CARDONI, R. L.; RIMOLDI, M. T.; ESTEVA,M. & BRACCO, M. M. E. Humoral antibody response in BALB/C and Swiss mice infected with Trypanosoma cruzi. Medicina (Buenos Aires), 46:435-439, 1986. CARIOLA, J.; PRADO, R.; AGOSIN, M. & CHRISTEN, R. Susceptibilidad del hamster Crycetus auratus, Peromyscus Peromyscus maniculatus gambeli, a la infeccin experimental por Trypanosoma cruzi, cepa Tulahun. Boletin de Informationes Parasitologicas Chilena, V:44-45, 1950. CARLIER, Y.; RIVERA, M. T.; TRUYENS, C.; GOLDMAN, M.; LAMBERT, P.; FLAMENT, J.; BAUWENS, D. & VRAY, B. Pregnancy and humoral immune response in mice chronically infected by Trypanosoma cruzi. Infection & Immunity, 55:24962501, 1987. CERISOLA, J. A. Chemotherapy of Chagas disease infection in man. PAHO Scientific Publication, 347:34-47, 1977. CETRON, M. S.; BASILIO, F. P.; MORAES, A. P.; SOUSA, A. Q.; PAES, J. N.; KAHN, S.; WENER, M. & VOORHIS, V. Humoral and cellular immune respomse of adults from mortheastern Brazil with chronic Trypanosoma cruzi infection: Depressed cellular immune response to Trypanosoma cruzi antigen among Chagas disease patients with symptomatic versus indeterminate infection. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 49:370-382, 1993. CHAGAS, C. Nova tripanosomiase humana: estudos sobre a morfologia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi, n.gen., n.sp.,
166
agente etiolgico de nova entidade mrbida do homem. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 1:159-218, 1909. CHAGAS, C. Descoberta do Trypanosoma cruzi e verificao da tripanozomiase americana. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 15:6776, 1922. CHAPADEIRO, E.; BERALDO, P. S. S.; JESUS, P. C.; OLIVEIRA JR., W. P. & JUNQUEIRA JR., L. F. Leses cardacas em ratos Winstar inoculadas com diferentes cepas do Trypanosoma cruzi. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 21:95-103, 1988. CHAPADEIRO, E.; FLORNCIO, R. F. C.; AFONSO, P. C.; BERALDO, P. S. S.; JESUS, P. C. & JUNQUEIRA JR., L. F. Neuronal counting and parassympathetic dysfunction in the hearts of chronically Trypanosoma cruzi-infected rats. Revista do Instituto de. Medicina Tropical de So Paulo, 35:337-341, 1991. CHIARI, E.; TAFURI, W. L.; BAMBIRRA, E. A.; REZENDE, M. M.; RIBEIRO, T. D.; CASTRO, L. P.; SALGADO, J. A. & AMARAL DE PDUA, R. A. The rabbit as a laboratory animal for studies on chagasic disease. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 22:207-208, 1980. CONTRERAS, V. T.; ARAJO-JORGE, T. C.; BONALDO, M. C;, THOMAZ, N.; BARBOSA, H. S.; MEIRELLES, M. N. L. & GOLDENBERG, S. Biological aspects of the Dm28c clone of Trypanosoma cruzi after metacyclogenesis in chemically defined media. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 83:123-133, 1988. COSSINI, A. B.; BURTON, R. C.; KUNG, P. C.; COLVIN, R.; GOLDSTEIN, G.; LIFTER, J.; RHODES, W. & RUSSEL, P. S. Evaluation in primate renal allograft recipients of monoclonal antibody to human T-cell subclasses. Transplantation Proceedings, XIII:499-503, 1981. CULBERTSON, H. O. J. & KESSLER, W. R. Age resistance of mice to Trypanosoma cruzi. Journal of Parasitology, 28:155-158, 1942. DALMASSO A. P. & JARVINEN J. A. Experimental Chagas disease in complement-deficient mice and guinea pigs. Infection & Immunity, 28:434-440, 1980. DE TITTO, E. Bases genticas. In: Enfermidad de Chagas. 1994. Buenos Aires: Doyma. Cap. 6, p. 75-86. DIAS, E. Estudos sobre o Schizotrypanum cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 27:1-110, 1934. DIEGO, J. A.; PALAU, M. T.; GAMALLO, C. & PENIN, P. Are genotypes of Trypanosoma cruzi involved in the challenge of chagasic cardiomyopathy? Parasitology Research 84:147-152, 1998. DIMPERIO-LIMA, M. R.; EISEN, H.; MINOPRIO, P.; JOSKOWICZ, M. & COUTINHO, A. Persistance of polyclonal B cell activation with undetectable parasitemia in late stages of experimental Chagas disease. Journal of Immunology, 137:353-356, 1986. DORLAND, J. D. Infection in monkeys with strains of Trypanosoma cruzi isolated in United States. US Public Health Report, 58:10061010, 1943. DUNN, C. S.; BEYER, C. & AUBERTIN, A. M. High viral load and CD4 lymphopenia in rhesus and cynomolgus macaques infected by a chimeric primate lentivirus constructed using the env, rev, tat, and vpu genes from HIV-1 Lai. Virology, 223:351361, 1996. EKSI, S.; WASSOM, D. L. & POWELL, M. R. Host genetics and resistance to acute Trypanosoma cruzi infection in mice:profiles and compartmentalization of IL-2, -4, -5, -10, and IFN--producing cells. Journal of Parasitology, 82:59-65, 1996. FALASCA, A.; GRANA, D.; BUCCOLO, J.; GILLI, M.; MERLO, A.; ZOPPI, J. & MARESO, E. Susceptibility of Cebus apella monkey to different strains of Trypanosoma cruzi after single or repeated inoculations. PAHO Bulletin, 20: 117-237, 1986. FEDERICI, E. E.; ABELMAN, W. H. & NEVA, F. A. Chronic and progressive myocarditis and myosite in C3H mice infected with Trypanosoma cruzi. American Journal of Tropical Medicine Hygiene, 13:272-280, 1964. FERRAZ DE CARVALHO, C. A.; MAIFRINO, L. B. M.; BORGES, N.; MARTINS, Z. O. & DE SOUZA, R. R. Comparative study on cardiac ganglia of chronic chagasic C. callosus and mice. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 88 (Suppl.): 108, 1993. FIGUEIREDO, F. Infeco experimental de coelhos com Trypanosoma cruzi: Aspectos de parasitologia, imunologia e patologia. 1984. Tese de Mestrado. Ribeiro Preto: Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo. FIGUEIREDO, F.; MACEDO, V. & TEIXEIRA, A. R. L. Experimental model for chronic Chagas disease, 1979. Anais do International Congress on Chagas disease, Rio de Janeiro, Instituto Oswaldo Cruz, p. 18. FINKELMAN, F. D. & SCHER, I. Rhesus monkeys B lymphocyte surface immunoglobulin: analysis with a fluorescence-activated cell sorter. Journal of Immunology, 122:1757-1762, 1979. GOMEZ L. E.; NASSER J. R. & BASOMBRIO M. A. Complete immunization against Trypanosoma cruzi verified in individual mice by complement-mediated lysis. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 91:55-61, 1996. GONALVES DA COSTA, S. C.; LAGRANGE, P. H.; HURTREL, B.; KERR, I. & ALENCAR, A. Role of T lymphocytes in the resistance and immunopathology of experimental Chagas disease. I. Histopathological studies. Annales d Immunologie (Inst. Pasteur), 135:317-332, 1984.
167
GONZLES-CAPPA, S. M.; KATZIN, A. M.; AASCO, N. & LAJMANOVICH, S. Comparative studies on infectivity and surface carbohydrates of several strains of Trypanosoma cruzi. Medicina (Buenos Aires), 41:549-552, 1981. GRAUERT, M. R.; HOUDAYER, M. & HONTEBEYRIE-JOSKOWCIZ, M. Trypanosoma cruzi infection enhances polyreactive antibody response in an acute case of human Chagas disease. Clinical and Experimental Immunology, 93:85-92,1993. GUTTERIDGE, W. E.; COVER, B. & DVABORAK, M. A. Jax inbred mice in chemotherapeutic investigatioins of experimental Chagas disease. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 72:329-335, 1978. HANSON, W. L. Immune response and mechanisms of resistance in Trypanosoma cruzi. PAHO Scientific Publication, 347:22-34, 1977. HAUSCHKA, T. S. Sex of host as a factor in Chagas disease. Journal of Parasitology, 33:399-405, 1947. HAYES, M. M. & KIERSZENBAUM, F. Experimental Chagas disease: Kinetics of lymphocyte responses and immunological control of the transition from acute to chronic T. cruzi infection. Infection & Immunity, 31:1117-1124, 1981. HENRIQUES-PONS, A.; CORREA A. F. S.; BATISTA M. M.; MARQUES C. S.; COTTA-DE-ALMEIDA V.; PERSECHINI P. M.; BISAGGIO R. C.; LIU, C. C.; COUTINHO, C. M. L. M. & ARAJO-JORGE T. C. Perforin knock-out mice infected with a highly virulent strain of Trypanosoma cruzi have normal patterns of parasitaemia but higher mortality rates and myocarditis. 1998. New Delhi: Proc. 10th Int. Cong. Immunology, p. 1007-1010. HOFT, D. F. Differential mucosal infectivity of different life stages of Trypanosoma cruzi. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 55:360-364, 1996. HOFT, D. F.; FARRAR, P. L.; KRATZ-OWENS, K. & SHAFFER, D. Gastric invasion by Trypanosoma cruzi and induction of protective mucosal immune responses. Infection & Immunity, 64:3800-3810, 1996. HOLSCHER, C.; KOHLER, G.; MULLER, U.; MOSSMANN, H.; SCHAUB, G. A. & BROMBACHER, F. Defective nitric oxide effector functions lead to extreme susceptibility of Trypanosoma cruzi-infected mice deficient in gamma interferon receptor or inducible nitric oxide synthase. Infection & Immunity, 66:1208-1215, 1998. HUDSON, L. Immunological consequences of infection and vaccination in South American trypanosomiasis. Phil. Transaction Royal Society of London, 307:51-54,1984. HUNTER, C. A.; ELLIS-NEYES, L. A.; SLIFER, T.; KANALY, S.; GRUNIG, G.; FORT, M.; RENNICK, D. & ARAUJO, F. IL10 is required to prevent immune hyperactivity during infection with Trypanosoma cruzi. Journal of Immunology, 158:3311-3319, 1997. JOHNSON, P.; NEAL, R.A. & GALL, D. Protective effect of killed trypanosoma vaccine with incorporated adjuvant. Nature, 200:83-85, 1963. JUNQUEIRA JR, L. F. Modelos experimentais da doena de Chagas: Consideraes crticas, dados obtidos e contribuies. O modelo representado pelo rato. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24 (Supl. 1):53-54, 1991. JUNQUEIRA JR, L. F.; BERALDO, P. S. S.; CHAPADEIRO, E. & JESUS, P. C. Cardiac autonomic dysfunction and neuroganglionitis in a rat model of chronic Chagas disease. Cardiovascular Research 26: 324-329, 1992. JURI, M. A.; FEREEIRA, A.; RAMOS, A. & HOECKER, G. Non-lytic antibodies in H-2 controlled resistance to acute infection with Trypanosoma cruzi. Brazilian Journal of Medical Biology, 23:685-695, 1990. KATZIN, A. M.; BRONZINA, A.; CASANOVA, M.; COSSIO, P. M.; SEGURA, E. L.; ARANA, R. M.; DEL PRADO, C. E. & GONZALEZ-CAPPA, S. M. Infeccin experimental del conejo con Trypanosoma cruzi. I. Estudios parasitologicos y serologicos. Medicina (Buenos Aires), 37:507-508, 1977. KIERSZENBAUM, F. & BUDZKO, D. B. Trypanosoma cruzi: deficient lymphocyte reactivity during experimental acute Chagas disease in the absence of suppressor T cells. Parasite Immunology, 4:441-451, 1982. KIERSZENBAUM, F. & HOWARD, J. G. Mechanism of resistance against experimental Trypanosoma cruzi infection: The importance of antibodies and antibody-forming capacity in the Biozzi high and low responder mice. Journal of Immunology, 116:1208-1215, 1976. KRETTLI, A. U. & BRENER, Z. Resistance against Trypanosoma cruzi associated to anti-living tripomastigote antibodies. Journal of Immunology, 128:2009-2012, 1982. KRETTLI, A. U.; WEISZ-CARRINGTON, R. S. & NUSSENZWEIG, R. S. Membrane bound antibodies of bloodstream Trypanosoma cruzi in mice: strain differences in susceptibility to complement mediated lysis. Clinical Experimental Immunology, 37:416-423, 1979. LAGUENS, R. P.; CABEZA-MECKERT, P.M. & GELPI, R. Chronic Chagas disease in the mouse: I Electrocardiographic and morphological patterns of the cardiopathy. Medicina (Buenos Aires), 41:35-38, 1981.
168
LAGUENS, R. P.; CABEZA-MECKERT, P. M.; BASOMBRIO, M. A.; CHAMB, J. G.; COSSSIO, P. M.; ARANA, R. M. & GELPI, R. Infeccin crnica del ratn com Trypanosoma cruzi. Modelo experimental de doena de Chagas. Medicina (Buenos Aires), 40:33-40, 1980. LANA, M.; CHIARI, E. & TAFURI, W. L. Experimental Chagas disease in dogs. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 87:59-71, 1992. LARANJA, F. S. & ANDRADE, Z. A. Forma crnica da doena de Chagas no co. Arqivos Brasileiros de Cardiologia, 35:377-380, 1980. LENZI, H. L.; OLIVEIRA, D. N.; LIMA, M. T. & GATASS, C. R. Trypanosoma cruzi: Pan infectivity of CL strain during murine acute infection. Experimental Parasitolog, 84:16-27, 1996. LEVTIN, N. L.; KING, N. W.; REINHERZ, E. L.; HUNT, R. D.; LANE, H. & SCHLOSSMAN, S. F. T lymphocyte surface antigens in primates. European Journal of Immunology, 13:345-347, 1983. LI, K.; NAGALLA, S. R. & SPINDEL, E. R. A rhesus monkey model to characterize the role of gastrin-releasing peptide (GRP) in lung development. Evidence for stimulation of airway growth. Journal of Clinical Investigation, 94:1605-1615, 1994. LIMA, M. T., LENZI, H. L. & GATTASS, C. R. Negative tissue parasitism in mice injected with a non infective clone of Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 81:6-12, 1991. LOPES, M. F.; CUNHA, J. M. T.; BEZERRA, F. L.; GONZALEZ, M. S.; GOMES, J. E. L.; SILVA, J. R. L.; GARCIA, E. S. & DOS REIS, G. A. Both chemically induced and triatomine-derived, metacyclic trypomastigotes cause the same immunological disturbances in the infected mammalian host. Experimental Parasitology, 80:194-204, 1995. LOPES, M. F.; NUNES, M. P.; HENRIQUES-PONS, A.; GIESE, N.; MORSE III, H. C.; DAVIDSON, W. F.; ARAJOJORGE, T. C. & DOS REIS, G. Increased susceptibility of Fas ligand-deficient gld mice to Trypanosoma cruzi infection due to a Th2-biased host immune response. European Journal of Immunology, 29:81-89, 1999. LUZ, M. R. P.; VAN LEUVEN, F. & ARAJO-JORGE, T. C. Heterogenity on the plasma levels of two acute phase proteins in mice from inbred strains during Trypanosoma cruzi-infection. Parasitology Research, 80:439- 441, 1994. LUZ, M. R. M. P.; VAN LEUVEN, F. & ARAJO-JORGE, T. C. Heterogeneity on the synthesis of -macroglobulins in outbred Swiss albino mice acutely infected with Trypanosoma cruzi. Parasitology Research, 81:662-667, 1995. MAGALHES J. B. & ANDRADE S. G. Investigation on the possibility of spontaneous cure of mice infected with different strains of Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 36:481-484, 1994. MARINHO, C. R.; DIMPERIO LIMA, M. R.; GRISOTTO, M. G. & ALVAREZ, J. M. Influence of acute-phase parasite load on pathology, parasitism, and activation of the immune system at the late chronic phase of Chagas disease. Infection & Immunity, 67:308-318, 1999. MARSDEN, P. D.; SEAH, S. K. K.; DRAPER, C. C.; PETTITT, L. E.; MILES, M. A. & VOLLER, A. Experimental Trypanosoma cruzi infections in rhesus monkeys. II. The early chronic phase. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 70:247251, 1976. MARSDEN, P. D.; VOLLER, A.; SEAH, S. K. K.; HAWKEY, C. & GREEN, D. Behavior of a Peru strain of Trypanosoma cruzi in rhesus monkeys. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 4:178-182, 1970. MARTIN, L. N. & LESLIE, G. A. Lymphocyte surface IgD and IgM in Macaca monkeys: Ontogeny, tissue distribution and occurence on individual lymphocytes. Immunology, 33:865-872, 1977. MCCABE, R. E.; MEAGHER, S. & MULLINS, B. Trypanosoma cruzi: Explant organ cultures from mice with chronic Chagas disease. Experimental Parasitology, 68: 462-467, 1989. MCCORMICK, T. S. & ROWLAND, E. C. Trypanosoma cruzi: Cross-reactive anti-heart autoantibodies produced during infection in mice. Experimental Parasitology, 69:393-401, 1989. MEIRELLES, M. N. L.; BONECINI-ALMEIDA, M. G.; PESSOA, M. H. R. & GALVO-CASTRO, B. Trypanosoma cruzi: Experimental Chagas disease in rhesus monkeys. II. Ultrastructural and cytochemical studies of peroxidase and acid phosphatase activities. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 85:173-181, 1990. MELLO, D. A. C. callosus callosus, Renger, 1930 Rodentia-Cricetidae: Sua caracterizao, distribuio, biologia, criao e manejo de uma cepa em laboratrio. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 76:611-69, 1984. MELLO, D. A. & BORGES, M. M. Primeiro encontro do Triatoma costalimai naturalmente infectado pelo Trypanosoma cruzi: Estudo de aspctos biolgicos da amostra isolada. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 76:61-69, 1981. MELLO, D. A. & TEIXEIRA, M. L. Nota sobre a infeco natural do C. callosus expulsus Lund, 1841, Cricetidae-Rodentia, pelo Trypanosoma cruzi. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 11:561-564, 1977. MELLO, D. A.; VALIIN, E. & TEIXEIRA, M. L. Alguns aspectos do comportamento de cepas silvestres do Trypanosoma cruzi em camundongos e Calomys callosus callosus Rodentia. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 13:314-332, 1979. MELO, R. C. & BRENER, Z. Tissue tropism of different Trypanosoma cruzi strains. Journal of Parasitology, 64:475-482, 1978.
169
MILEI, J.; MORALES, M. C.; BOLOMO, N. J.; BASOMBRIO, M. A. & COSSIO, P. M. Electrocardiographic and pathological correlation in chronic chagasic myocardiopathy in mice. Medicina (Buenos Aires), 44:483-486, 1984. MILEI, J.; STORINO, R. A.; BEIGELMAN, R.; GRANA, D. & BASOMBRIO, M. A. Morphometry of skeletal muscle involvement in mice infected or preimmunized with live attenuated Trypanosoma cruzi. Medicina (Buenos Aires), 51(6):529-532, 1991. MILES, M. A.; MARSDEN, P. D.; PETIT, L. E.; DRAPER, C. C.; WATSON, S.; SEACH, S. K. K.; HUTT, M. S. R. & FOWLER, J. M. Experimental Trypanosoma cruzi infection in rhesus monkeys. III. Electrocardiographic and histopathological findings. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 73:528-532, 1979. MINOPRIO, P.; BANDEIRA, A.; PEREIRA, P.; MOTA-SANTOS, T. A. & COUTINHO, A. Preferential expansion of Ly1-B and CD4- CD8- T cells in the polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma cruzi infection. International Immunology, 1:176-184, 1989. MINOPRIO, P.; BURLEN, O.; PEREIRA, P.; GUILBERT, B.; ANDRADE L.; HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ M. & COUTINHO, A. Most B cells in acute Trypanosoma cruzi infection lacks parasite specificity. Scandinavian Journal of Immunology 28:553-561, 1988. MINOPRIO, P.; COUTINHO, A.; SPINELLA, S. & HOSTEBERYE-JOSKOWICS, M. Xid immunodeficiency imparts increased parasite clearance and resistance to pathology in experimental Chagas disease. International Immunology, 3:427- 436,1991. MINOPRIO, P.; CURY-EL-CHEIKH, M.; MURPHY, E.; HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M.; COFFMAN, R.; COUTINHO, A. & OGARRA. A. Xid-associated resistance to experimental Chagas disease is IFN--dependent. Journal of Immunology, 151:4200-4208, 1993. MINOPRIO, P.; EISEN, H.; FORNI, L.; DIMPERIO-LIMA, M. R.; JOSKOWICZ, M. & COUTINHO, A. Polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma cruzi infection. I. Quantitation of both T and B cell responses. Scandinavian Journal of Immunology, 24:661-668, 1986. MINOPRIO, P.; ITOHARA, S.; HEISSER, C.; TONEGAWA, S. & COUTINHO, A. Immunobiology of murine Trypanosoma cruzi infection: The predominance of parasite-non-specific responses and the activation of TcR1 T cells. Immunology Reviews, 112:183-207, 1989. MOLINA, H. A.; MILEI, J.; RIMOLDI, M.T.; GONZLEZ-CAPPA, S.M. & STORINO, R.A. Histopathology of the heart conducting system in experimental Chagas disease in the mice. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 82:241-245, 1988. MORALES, M. C.; CARDONI, R. L.; RIMOLDI, M. T.; ESTEVA, M. & MILEI, J. Heart damage comparing three strains of mice chronically infected with Trypanosoma cruzi. Medicina (Buenos Aires), 47:493-496,1987. MOREIRA-SILVA, A.; RAMREZ, LE.; VARGAS, M.; CHAPADEIRO, E. & BRENER, Z. Evaluation of the rabbit as a model for Chagas disease. II. Histopathological studies of the heart, digestive tract and skeletal muscle. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 91:199-202,1996. NEUBAUER, R. H.; MARXHALONIS, J. J.; STRAND, B. C. & RABIN, H. Surface markers of B and T lymphoid cell lines identified by antibodies to human and simian lymphocyte antigen. Journal of Immunogenetics, 9:209-211, 1982. NICKELL, S. P.; HOFF, R. & BOYER, M. H. Susceptibility to acute Trypanosoma cruzi infection in autoimmune strains of mice. Parasite Immunology, 7:377-386, 1985. OSSIMANI, J. J. & GURRI, J. Infeccin experimental del hamster dorado Mesocricetus auratus. con algunas cepas uruguayas de Trypanosoma cruzi. Archivos de la Sociedad Biologia de Montevideo, XVIII:73-78, 1954. OSTROW R. S.; MCGLENNEN R. C.; SHAVER, M. K. & FARAS, A. J. A rhesus monkey model for sexual transmission of a papillomavirus isolated from a squamous cell carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science (USA), 87:8170-8174, 1990. PACKCHANIAN, A. & ROBINSON, A. Electrocardiographic studies in experimental Chagas disease in mice (Mus musculus). Texas Reproductive Biological Medicine, 16:363-379, 1958. PAKIANATHAN, D. R. & KUHN, R. E. Trypanosoma cruzi affects nitric oxide production by murine peritoneal macrophages. Journal of Parasitology, 80: 432-437, 1994. PIZZI, T.; AGOSN, M.; CHRISTEN, R.; HOECKER, G. & NEGHME, A. Influencia de la constitucion genetica en la resistencia de la laucha a la infeccion experimental por Trypanosoma cruzi. Biologica, 8-11:43-53, 1948. PIZZI, T.; RUBIO, M. D. & KNIERIN, F. T. Contribucin al conocimiento de los mecanismos inmunitarios en la enfermedad de Chagas experimental de la rata. Boletin Informaciones Parasitarias Chilenas, 8:66-72, 1953. POSTAN, M.; BAILEY, J. J.; DVORAK, J. A.; MCDANIEL, J. P. & POTTALA, E. W. Studies of Trypanosoma cruzi clones in
170
inbred mice. III. Histopathological and electrocardiographical responses to chronic infection. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 37:541-549, 1987a. POSTAN, M.; DVORAK, J. A. & MCDANIEL, J. P. Studies of Trypanosoma cruzi clones in inbred mice. I. A comparison of the course of infection of C3H/HEN- mice with two clones isolated from a common source. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 32:497-506, 1983. POSTAN, M.; MCDANIEL, J. P. & DVORAK, J. A. Studies of Trypanosoma cruzi clones in inbred mice. II. Course of infection of C57BL/6 mice with single-cell-isolated stocks. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 33:236-238, 1984. POSTAN, M.; MCDANIEL, J. P. & DVORAK, J. A. Comparative studies of the infection of Lewis rats with four Trypanosoma cruzi clones. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 81:415-419, 1987b. PUNG, O. J.; HULSEBOS, L. H. & KUHN, R. E. Experimental Chagasdisease (Trypanosoma cruzi) in the Brazilian squirrel monkey (Saimiri sciureus): Hematological, cardiology, cellular and humoral immune response. International Journal of Parasitology, 18:115120, 1988a. PUNG, O. J.; HULSEBOS, L. H. & KUHN, E. Experimental American leishmaniasis and Chagas disease in the Brazilian squirrel monkey: Cross immunity and eletrocardiographic studies of monkeys infected with Leishmania braziliensis and Trypanosoma cruzi. International Journal of Parasitology, 18:1053-1059, 1988b. RAMIREZ, L. E. O coelho como modelo experimental no estudo da doena de Chagas crnica. 1984. Tese de Doutorado. Belo Horizonte: Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais. RAMREZ, L. E. & BRENER, Z. Evaluation of the rabbit as a model for Chagas disease. I. Parasitological studies. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 82:531-536, 1987. RAMREZ, L. E.; LAGES-SILVA, E. & CHAPADEIRO, E. Infeco do hamster pelo Trypanosoma cruzi. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24:119-120, 1991. RAMREZ, L. E.; LAGES-SILVA, E. & CHAPADEIRO, E. Trypanosoma cruzi infection in hamsters. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24:119-120, 1996. RAMREZ, L. E.; LAGES-SILVA, E.; SOARES JR, J. M. & CHAPADEIRO, E. The hamster Mesocricetus auratus as experimental model in Chagas disease. Parasitological and histopathological studies in acute and chronic phases of Trypanosoma cruzi infection. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 27:163-169, 1994. RAMREZ, L. E.; LAGES-SILVA, E.; SOARES JR, J. M. & CHAPADEIRO, E. Infeco experimental do hamster pelo Trypanosoma cruzi: Fase crnica. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 26:253-254, 1993. REED, S. G.; INVERSO, J. A. & ROTERS, S. B. Suppressed antibody responses to sheep erythrocytes in mice with chronic Trypanosoma cruzi infections are restaured with interleukin 2. Journal of Immunology, 133:3333-3337, 1984. REIMANN, K. A.; LI, J. T.; VOSS, G. & LETVIN, N. L. An env gene derived from a primary human immunodeficiency virus tupe 1 isolates confers high in vivo replicative capacity to a chimeric simian/human immunodeficiency virus in rhesus monkeys. Journal of Virology, 70:3198-3206, 1996. REIMANN, K. A.; WAITE, B. A.; LEE-PARRITZ, D. E. & LETVIN, N. L. Use of human leukocyte-specific monoclonal antibodies for clinically immunophenotyping lymphocytes of rhesus monkeys. Cytometry, 17:102-108, 1994. REIS, D. D.; JONES, E. M.; TOSTES, S. J.; LOPES, E. R.; GAZZINELLI, D. G.; COLLEY, D.G. & MCCURLEY, T. L. Characterization of inflammatory infiltrates in chronic chagasic myocardial lesions: Presence of tumor necrosis factor-a+ cells and dominance of CD8+ lymphocytes. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 48:637-644, 1993. REVELLI, S. S.; AMERIO, N.; MORENO, H. S.; VALENTI, J. L.; BALBARRY, H. & MORINI, J. C. Enfermedad de Chagas crnica en la rata. Caracteristicas serologicas, electrocardiogrficas e histopatolgicas. Medicina (Buenos Aires), 40 (Sup.1):69-76, 1980. REVELLI, S. S.; BERRA, H.; VALENTI, J. L.; MORENO, H. S.; BERNASCARI, M.; POLI, H. & MORINI, J. C. Effect of reinfection the development of rats infected Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 32: 260-268, 1990. REVELLI, S.; DIDOLI, G.; ROGGERO, E.; MORENO, H.; BERNABO, J,; WIETZERBIN, J. & BOTTASSO, O. Macrophage activity, IL-6 levels, antibody response and heart histology in rats undergoing an attenuated Trypanosoma cruzi acute infection upon treatment with recombinant interferon gamma. Cytokines in Cellular and Molecular Therapy, 4:153-159, 1998. REZENDE FILHO, J.; FIGUEIREDO, F. & TEIXEIRA, A. R. L. Megacolon syndrome in rabbits with chronic Chagas disease. Anais International Congress on Chagas disease, 1979. Rio de Janeiro, Instituto Oswaldo Cruz, p. 20. RIBEIRO, R. D. Novos reservatrios silvestres do Trypanosoma cruzi. Revista Brasileira de Biologia, 3: 429-537, 1973. RIBEIRO-DOS-SANTOS, R.; ROSSI, M. A.; LAUS, J. L.; SILVA, J. S.; SAVINO, W. & MENGEL, J. Anti-CD4 abrogates rejection and restablishes long-term tolerance to syngeneic newborn hearts grafted in mice chronically infected with Trypanosoma cruzi.
171
Journal of Experimental Medicine, 175:29-39, 1992. RIVERA-VANDERPAS, M. T.; RODRIGUEZ, A. M.; AFCHAIN, D.; BAZIN, H. & CAPRON, A. Trypanosoma cruzi: Variation in susceptibility of inbred strains of rats. Acta Tropica 40:5-10, 1983. ROSNER, I. M.; SCHININI, A.; ROVIRA, T.; DE ARIAS, A.; VELSQUEZ G., MONZN, M. I.; MALDONADO, M.; FERRO, E. A. & GATEANO, R. Acute Chagas disease in non-human primates. I. Chronology of clinical events, clinical chemistry, ECG, radiology, parasitemia and immunological parameters in Cebus apella monkey. Tropical Medicine Parasitology, 39:51-55, 1988. ROSNER, I. M.; BELLASAI, J.; SCHININI, A.; ROVIRA, T.; DE ARIAS, A. R.; VELSQUEZ G., MONZN, M.; MALDONADO, M.; GATEANO, R. & FRESCO, M. A. Cardiophaty in Cebus apella monkeys experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Tropical Medicine Parasitology, 40:24-31, 1989. ROSSI, M. A.; GONCALVES, S. & RIBEIRO-DOS-SANTOS, R. Experimental Trypanosoma cruzi cardiomyopathy in BALB/C mice. The potential role of intravascular platelet aggregation in its genesis. American Journal of Pathology,114:209-216, 1984. ROSSI, M. A.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, R. & GONALVES, S. Pathogenesis of the apical aneurysm in experimental Trypanosoma cruzi cardiomyopathy in BALB/C mice. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 80:990-991, 1986. ROTTENBERG, M. E.; BAKHIET, M.; OLSSON, T.; KRISTENSSON, K.; MAK, T.; WIGZELL, H. & ORN, A. Differential susceptibilities of mice genomically deleted of CD4 and CD8 to infections with Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei. Infection & lmmunity, 61:5129-5133, 1993. ROTTENBERG, M. E.; CARDONI, R. L.; SINAGRA, A.; RIARTE, A.; RODRIGUEZ-NANTES, I.; LAURICELLA, M. & SEGURA E. L. Trypanosoma cruzi: T-cell-dependent mechanisms of resistance during chronic infection. Experimental Parasitology, 73:127-136, 1991. RUSSO,M.; STAROBINAS, N.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, R.; MINOPRIO, P.; EISEN, H. & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Susceptible mice present higher macrophage activation than resistant mice during infections with myotropic strains Trypanosoma cruzi. Parasite Immunology, 11:385-395, 1989. SANTOS-BUCH, C. A. & TEIXEIRA, A. R. L. The immunology of experimental Chagas disease. III. Rejection allogeneic heart cells in vitro. Journal of Experimental Medicine, 140:38-53, 1974. SANTOS-LIMA, E. C. & MINOPRIO, P. Chagas disease is attenuated in mice lacking gd T cells. Infection & Immunity, 64:215-221, 1996. SCHLEMPER JR, B. R.; AVILA, C. M.; COURA, J. R. & BRENER, Z. Course of infection and histopathological lesions in mice infected with seventeen Trypanosoma cruzi strains isolated from chronic patients. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 16:23-28, 1983. SCORZA, C. & SCORZA, J. V. Acute myocarditis in rats inoculated with Trypanosoma cruzi: Study of animals sacrificed between the fourth and twenty ninth day after infection. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 14:171-177, 1972. SEAH, S. K.; MARSDEN, P. D.; VOLLER, A. & PETTITT, L. E. Experimental Trypanosoma cruzi infection in rhesus monkeys: The acute phase. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 68:63-69, 1974. SEGURA, M. A.; MOLINA-DE-RASPI, E. & BASOMBRIO, M. A. Reversibility of muscle and heart lesions in chronic, Trypanosoma cruzi infected mice after late trypanomicidal treatment. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 89:213-216, 1994. SHOEMAKER, J. P. & HOFFMAN JR., R. V. Possible stimulatory factors in brown adipose tissue in mice. Experimental Parasitology, 35:272-274, 1974. SILVA, A. A.; MARINO, A. P. M. P.; CABRAL, F. A.; SILVA, S. H.; SANTOS, T. F. Q.; SAVINO, W. & LANNES-VIEIRA, J. Acute and chronic experimental chagasic infection: Genesis of immunopatological alterations in central nervous system. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 90 (Suppl. I): 168, 1995. SILVA-BARBOSA, S. D.; COTTA-DE-ALMEIDA, V.; RIEDERER, I.; DE MEIS, J.; DARDENNE, M.; BONOMO, A. & SAVINO W. Involvement of laminin and its receptor in abrogation of heart graft rejection by autoreactive T cells from Trypanosoma cruzi-infected mice. Journal of Immunology, 159:997-1003, 1997. SILVA, J. C.; PIRMEZ, C.; MORGADO, M. G. & GALVO-CASTRO, B. Immunopathological aspects of experimental Trypanosoma cruzi infection: Correlation of immune complexes and other serological features with muscle lesions during the infection. Parasite Immunology, 7:457-466, 1985. SILVA, J. S.; MORRISSEY, P. J.; BRABSTEIN, K. H.; MOHLER, K. M.; ANDERSON, D. & REED, S. G. Interleukin 10 and interferon gamma regulation of experimental Trypanosoma cruzi infection. Journal of Experimental Medicine, 175:169-174, 1992. SILVA, J. S.; VESPA, G. N. R.; CARDOSO, M. A. G.; ALIBERTI, J. C. S. & CUNHA, F. Q. TNF- mediates resistance to Trypanosoma cruzi infection in mice by inducing nitric oxide production in infected -interferon-activated macrophages. Infection
172
& Immunity, 63:4862-4867, 1995. SILVA, L. H. P. & NUSSENWEIG, V. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o camundongo branco. Folha Clinica Biologica, 20: 191-207, 1953. SOUSA, M. A. & ALENCAR, A. A. On the tissular parasitism of Trypanosoma cruzi and strain in Swiss mice. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 26:316-321, 1984. STAROBINAS, N.; RUSSO, M.; MINOPRIO, P. & HONTEBEREY-JOSKOWICZ, M. Is TNF- involved in early susceptibility of Trypanosoma cruzi-infected C3H/He mice ? Research on Immunology, 142:117-122, 1991. TARTELON, R. L. The role of T cell population in experimental Chagas disease. Research Immunology, 142:130-133, 1991. TARLETON, R. L. The role of T cells in Trypanosoma cruzi infection. Parasitology Today, 1:7-9, 1995. TARLETON, R. L; KOHLER, B. H.; LATOUR, A. & POSTAN, M. Susceptibility of 2-microglobulin-deficient mice to Trypanosoma cruzi infection. Nature, 356:338-340, 1992. TEIXEIRA, A. R. L.; FIGUEIREDO, F.; REZENDE FILHO, J. & MACEDO, V. Chagas disease; a clinical, parasitological, immunological, and pathological study in rabbits. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 32:258-272, 1983. TEIXEIRA, A. R. L.; TEIXEIRA, M. L. & SANTOS-BUCH, C. A. The immunology of experimental Chagas disease - IV. Production of lesions in rabbits simular to those of chronic Chagas disease in man. American Journal of Pathology, 80: 163-180, 1975. TEIXEIRA, V. P. A.; REIS, M. A.; ARAJO, M. B. M.; SILVEIRA, S. A.; REIS, L. & ALMEIDA, H. O. Comparao do parasitismo da veia central da supra-renal com o de outros tecidos em chagsicos crnicos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 24:73-78, 1991. TORRES, C. M. & TAVARES, B. M. Miocardite no macaco Cebus aps inoculaes repetidas com Schizotrypanum cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 56: 55-119, 1958. TRISCHMANN, T. M. Natural and acquired resistance to Trypanosoma cruzi. Advances in Experimental Medicine and Biology, 62:365382, 1983. TRISCHMANN, T. M. Single locus in BXH-2 mice responsible for inability to control early proliferation of Trypanosoma cruzi. Infection & Immunity, 46:658-662, 1984. TRISCHMANN, T. M. & BLOOM, B. Genetics of murine resistance to Trypanosoma cruzi. Infection & Immunity, 35:546, 1982. TRISCHMANN, T. M.; TANOWITZ, H.; WITTNER, M. & BLOOM, B. Trypanosoma cruzi: role of the immune response in the natural resistance of inbred strains of mice. Experimental Parasitology, 45:160-168, 1978. VATTUONE, M. H.; SZARFMAN, A. & GONZALEZ-CAPPA, S. M. Antibody response and immunoglobulin levels in humans with acute or chronic Trypanosoma cruzi infections (Chagas disease). American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 76:45-47, 1973. WHO. Immunology of Chagas disease. Bulletin World Health Organization, 50:459-472, 1974. WRIGHTSMAN, R.; KRASSNER, S. & WATSON, J. Genetic control of responses to Trypanosoma cruzi in mice: Multiple genes influencing parasitemia and survival. Infection and Immunity, 36:637-644, 1982. WRIGHTSMAN, R.; KRASSNER, S., WATSON, J. & MANNING, J. E. Role of the H-2 haplotype in survival of mice after infection with Trypanosoma cruzi. Infection & Immunity, 44:351-354, 1984. YOUNES-CHENNOUFI, A.; SAID, G.; & HONTEBEYRIE-JOSKOWICZ, M. Cellular immunity to Trypanosoma cruzi is mediated by helper T cell CD4+. Transactions Royal Society of Tropical Medicine & Hygiene, 82:84-89, 1988.
173
Captulo 10
P lan ejamento de E xpe rimentos e Escolh a dos M odelos lane Expe xperimentos Escolha Modelos
10.1
Critrio de Escolha para o Modelo de Hospedeiro Animal e da Cepa do Parasita

Solange L. de Castro & Tania C. Arajo-Jorge
A existncia de vrios modelos experimentais aplicados ao estudo do curso da infeco por Trypanosoma cruzi nos indica, claramente, que no h um nico modelo de escolha, nem um modelo consensual e nem mesmo um modelo que possa ser definido como o mais vantajoso (ver Captulo 9). A escolha do modelo a ser utilizado deve ser feita aps anlise de vrios pontos, em especial a pergunta que se quer abordar no estudo. A depender do fenmeno em foco, existem modelos animais que o reproduzem de modo melhor ou pior. Alm disso, a identificao de grupos de cepas de parasita circulantes exclusivamente no ciclo de transmisso silvestre e no ciclo domiciliar/peridomiciliar humano (Tibayrenc, 1995; Zingales et al., 1998) levanta a questo da relevncia de se proceder a estudos de processos fisiopatolgicos representativos da doena de Chagas humana, predominantemente com cepas circulantes no ciclo domstico de contaminao humana, correlacionando, sob um ponto de vista antropocntrico, a utilizao de cepas do ciclo silvestre. Em todos os casos, as vantagens ou desvantagens do uso de determinado modelo referem-se morbidade (gnese de doena) e mortalidade (grau de virulncia apresentado pelo parasita naquele modelo), comparativamente infeco humana. Nesse sentido, a principal desvantagem do modelo camundongo, que a alta taxa de mortalidade na fase aguda, com leses que so incomuns na infeco humana aguda, pode ser contornada com a combinao de uma linhagem mais resistente, um menor inculo, uma cepa de parasita caracterstica do ciclo domstico isolada de paciente, ou de triatomneo/reservatrio no peridomiclio. Na realidade este raciocnio, que est bem comprovado no modelo do camundongo, vlido para qualquer espcie de mamfero que venha a ser utilizada. Foi o extenso estudo no modelo do camundongo, por um grande nmero de grupos de pesquisa e utilizando as mais variadas combinaes de cepas de parasita e de linhagens hospedeiras, que permitiu a concluso consensual de que cada par um par (Tarleton, 1995), confirmado tambm no modelo do rato (Rivera-Vanderpas et al., 1983). Pontos de controvrsia quanto validade de certo modelo para reproduzir determinados aspectos da doena humana devem ser analisados sob a mesma tica que permitiu esse consenso para o caso do camundongo. Assim, o fato de alguns autores
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reportarem o encontro, ou no, de megaclon ou de freqncia maior ou menor de miocardite em coelhos infectados estudados por diversos grupos pode se relacionar com o uso de diferentes cepas do T. cruzi (ver Captulo 9), ou de coelhos com diferentes back-grounds genticos. Dois pontos importantes a ressaltar so a existncia de determinado fenmeno na espcie que se quer ter como modelo e a fase da doena que se quer reproduzir. Alguns aspectos da doena humana, como por exemplo, a presena de anticorpos naturais antigalactose e sua associao com a forma clnica indeterminada da doena de Chagas, s ocorrem em primatas, e no podem, portanto, ser estudados em nenhum outro modelo (ver Captulo 4). Quanto fase da infeco, a grande maioria dos estudos com experimentao animal se deteve apenas na fase aguda, mas muito pequeno o nmero de trabalhos sobre esta fase na infeco humana, at mesmo pelo processo de controle da transmisso vetorial. O desafio de encontrar modelos animais adequados para o estudo da fase crnica, incluindo a forma indeterminada, permanece atual. Nesse sentido, o trabalho com animais de pequeno porte, especialmente roedores com vida curta (camundongo e rato), traz um facilitador, pois a freqncia de obteno de animais em fase crnica pode ser maior. Recentemente demonstrou-se que o hamster reproduz, do ponto de vista histopatolgico, algumas das caractersticas mais importantes da doena de Chagas crnica, como miocardite com despopulao neuronal acompanhada de transtornos eletrocardiogrficos, miosite, ganglionite e dilatao ou alongamento do cecum com distrbios de motilidade. Por outro lado, a forma indeterminada parece ser a mais freqentemente observada no coelho infectado experimentalmente com T. cruzi. importante mencionar que aspectos da infeco por T. cruzi em mamferos silvestres, como Calomys callosus, gambs e cucas (ver Captulos 3 e 9), podem ser de grande valia para a compreenso de mecanismos fisiolgicos da manuteno do parasita em reservatrios silvestres, da evoluo do equilbrio parasita-hospedeiro, bem como de aspectos comparativos da patognese e da susceptibilidade a quimioterpicos de cepas circulantes nos ciclos silvestre e domstico. A Tabela 1 busca traar um quadro comparativo dos diferentes modelos descritos neste manual, indicando se o parmetro j foi (+) ou no foi (-) descrito no modelo em questo. Na maioria dos casos todos os resultados podem ser correlacionados, com variaes de freqncia e de intensidade de ocorrncia do fenmeno, a depender da cepa de parasita utilizada, da via e intensidade do inculo. A mensagem final que nos parece essencial a destacar a de que ao iniciar o estudo da infeco por T. cruzi em um determinado modelo experimental, independente dos fatores que concorreram para a escolha daquele modelo, deve ser feita uma profunda reviso bibliogrfica com a identificao de todos os trabalhos que j utilizaram aquela espcie e o levantamento dos resultados obtidos com diferentes cepas do parasita. importante tambm o conhecimento mais completo possvel do comportamento biolgico e dos marcadores moleculares da cepa de parasita escolhida (ver Captulo 10.2, cepas de eleio), saber em qual biodema e zimodema a cepa se insere (Andrade & Magalhes, 1996), qual a linhagem, e se est agrupada em T. cruzi I ou T. cruzi II (ver Captulo 10.2, e Anexo referente nomina de T. cruzi). Na tentativa de aumentar a massa de conhecimentos produzidos por diversos grupos de pesquisa com uma mesma cepa, a OMS escolheu o clone CL-Brener como clone de referncia para o Projeto Genoma de T. cruzi. Provavelmente essa escolha vai gerar um certo volume de trabalho com este clone, mas a investigao sobre a heterogeneidade intra-especfica que caracterstica deste microorganismo, certamente exigir a confirmao de dados com cepas de caractersticas diferentes.
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Tabela 1 Quadro comparativo da reprodutibilidade de aspectos da doena de Chagas humana em diferentes modelos experimentais e de suas condies operacionais
Modelo animal Aspecto da doena humana reproduzida Fase aguda Chagoma de inoculao Parasitemia (v) Sorologia anti T. cruzi positiva Tendncia mortalidade (v) Alteraes eletrocardiogrficas (v) Miocardite histopatologia (v) Miosite histopatologia (v) Pan-infectividade Fibrose Esplenomegalia e linfoadenomegalia Fase crnica - forma indeterminada Durao Fase crnica cardaca e/ou digestiva Cintica de desenvolvimento da fase crnica Encontro de ninhos de amastigotas (v) Alteraes eletrocardiogrficas (v) Cardiopatia (v) Formao de megas (v) Megaesfago Alteraes neurolgicas Fibrose miocrdica Facilidade de manuseio Facilidade de manuteno de colnias Custo operacional + + + a + + + + + + + + + b + + + + + + + + b + + + + + + + + b + + + + + + + + + b ? + + + + + + B + + + + + b + + cdg rat coe ham cal co mac
+ +
r + + + + + + + a a b
r + + + + + ? + a a b
d + + + + m a m
d + + + + + m a b
? m m ?
d + + + ? ? m n a
d ? + + ? ? b n a
+: ocorre em algum par parasita-hospedeiro; -: negativo; v: varivel com a cepa de Trypanosoma cruzi e/ou com a linhagem gentica do animal e/ou com a intensidade do inculo; r: rpida (seis a doze meses); d: demorada (> dois anos); s: sim; n: no; a: alta; b: baixa; m: mdia; c: curta (dois a seis meses); l: longa (anos).
Finalmente, fatores que podem no ser decisivos, mas que certamente so importantes, referem-se s condies operacionais. Estas vo desde a experincia prvia do grupo no uso de determinado modelo e a necessidade de incorporao de pessoal com experincia de manejo do animal a ser usado, at o custo, a disponibilidade de fornecimento e as condies laboratoriais e de infectrio para manejo dos animais normais e infectados que comporo os grupos experimentais. As condies ambientais para a experimentao tambm podem ser limitantes ou decisivas para a escolha do modelo a ser empregado. Por exemplo, o trabalho com fmeas requer a existncia de salas especiais isoladas apenas para este gnero, pois a presena de machos na sala pode gerar sensaes olfatrias que levem a alteraes no ciclo estral das fmeas, que por sua vez podem potencialmente interferir na sua imunidade inata. J o trabalho com ces ou macacos implica condies laboratoriais e de infectrio especficas para estes casos. As condies psicolgicas da equipe para lidar com os animais tambm so fatores importantes, pois podem influir quando o pesquisador ou tcnico precisar sacrificar fmeas grvidas, ces ou macacos submetidos a longos perodos de observao.
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10.2
Trypanosoma cruzi: Cepas de Eleio

Octavio Fernandes & David A. Campbell
Tradicionalmente o Trypanosoma cruzi apresenta como caracterstica uma grande diversidade gentica intraespecfica, demonstrada por diferentes tcnicas bioqumicas e moleculares, se tratando na realidade de um complexo heterogneo de subpopulaes. As anlises realizadas por distintos mtodos sempre procuraram correlacionar caractersticas genticas com propriedades biomdicas do parasito. Uma das primeiras metodologias aplicadas em diversos isolados, clones e cepas de T. cruzi foi o perfil de restrio do kDNA. Esta tcnica agrupou determinadas populaes dos parasitos atravs dos padres apresentados pelos fragmentos de restrio do DNA mitocondrial, em grupos denominados esquizodemas (Morel et al., 1980; Morel & Simpson, 1980). O potencial desta metodologia foi explorado em diferentes contextos e conseguiu atestar que o hospedeiro vertebrado se encontra parasitado por uma populao de T. cruzi, que pode ser selecionada por distintos filtros como hemocultura, xenodiagnstico, cultura in vitro e mesmo a prpria interao parasito-hospedeiro (Deane et al., 1984; Morel et al., 1986). De forma consistente com os achados de heterogeneidade obtidos com os padres de restrio do kDNA, Morel et al. (1984), Macina et al. (1987) e Solari et al. (1991), ao utilizarem a rede de DNA mitocondrial como sonda para tipagem, obtiveram resultados que discriminavam distintos grupos de isolados. Com o desenvolvimento das tcnicas de DNA recombinante, regies de hipervariabilidade puderam ser clonadas e utilizadas como sondas moleculares. Assim, as regies variveis dos minicrculos mostraram o seu relgio molecular veloz e conseqente poder discriminatrio (Macina et al., 1987). A tcnica de PCR veio contribuir para o estudo da heterogeneidade populacional de T. cruzi, principalmente por dispensar o cultivo prvio do parasito, que seleciona in vitro subpopulaes do protozorio (Morel et al., 1986). Dessa forma, Sturm et al. (1989) amplificaram a regio varivel dos minicrculos (330 pb) e utilizaram os amplicons como substrato para digesto com endonucleases de restrio, produzindo um experimento esquizodemalike e obtendo padres de bandas complexo. Avila et al. (1990), Brenire et al. (1992) e Britto et al. (1995), aps amplificarem regies variveis de isolados de T. cruzi, realizaram experimentos de hibridizao cruzada entre os amplicons, demonstrando que este segmento da molcula de minicrculo possui alta especificidade, revelando uma grande heterogeneidade entre os distintos isolados utilizados. Macedo et al. (1992) descreveram o uso da tcnica de fingerprint do DNA total do parasito, mostrando a sua capacidade de desvendar tambm a heterogeneidade presente dentro do taxon, possuindo uma boa correlao com a anlise por esquizodemas. Um dos alvos sempre procurados foi a tentativa de se correlacionar marcadores genticos com propriedades biolgicas e ou determinantes de patogenicidade ou formas clnicas. Algumas destas abordagens de tipagem e agrupamento apresentam resultados to heterogneos que a sua aplicabilidade passou a ser questionada. Por exemplo, podemos citar a plasticidade existente entre os caritipos moleculares de T. cruzi. Os resultados destes experimentos so variveis e muitos fatores podem determinar diferentes padres de migrao de cromossomos ou localizao de genes especficos. Relatos de amplificao gnica, expanso e contrao telomricas, elementos transponveis (transposons) e aneuploidias poderiam eventualmente
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justificar a extensa heterogeneidade encontrada ao utilizar-se esta metodologia, mesmo entre subclones de um mesmo ancestral clonal ou cepas isoladas de um nico paciente (Gibson & Miles, 1986; Engman et al., 1987; Iovannisci & Beverley, 1989; Wagner & So, 1990; McDaniel & Dvorak, 1993). Em estudos iniciais, a anlise dos padres eletroforticos de enzimas pareceu ser muito promissora, no que diz respeito a associar distintos zimodemas com padres de transmisso domstico e silvestre. Assim, Miles et al. (1977), ao investigarem dezessete isolados do protozorio provenientes do municpio de So Felipe, Bahia, determinaram dois grupos distintos de zimodemas: o primeiro, composto por isolados de gamb e triatomneos silvestres e o segundo formado pelos isolados humanos e de animais domsticos, como gatos, ratos e camundongos. Este mesmo grupo de autores ampliou a classificao dos grupos isoenzimticos, aps estudar seis isolados humanos da regio amaznica (Miles et al., 1978) e cerca de 250 isolados de diversas localidades brasileiras (Miles et al., 1980), definindo trs grupos caractersticos: o primeiro e o segundo, como descrito em So Felipe, que passaram a denominar de Z1 e Z2, e o terceiro (Z3) tambm relacionado ao ciclo silvestre. Confirmando as correlaes biolgicas dos zimodemas com os padres de transmisso, Ready & Miles (1979) mostraram, atravs de anlise de taxonomia numrica, que Z1 mais relacionado com Z3 que com Z2. Ainda respeitando esta tripla classificao, Flint et al. (1984) conseguiram definir anticorpos monoclonais que reagiam especificamente com Z1, Z2 ou Z3. Acostumados com a tradicional polaridade de T. cruzi, formas finas ou grossas, fase aguda ou crnica, forma cardaca ou digestiva, cepa Y ou CL, ciclo silvestre ou domstico, era de se esperar que ficssemos com a classificao isoenzimtica e imunolgica de Z1+Z3 e Z2 (Brener & Andrade, 1979; Miles & Cibulski, 1986). Entretanto, poucos anos depois de estabelecido este padro, alguns pontos discordantes comearam a aparecer. Tibayrenc et al. (1986) analisaram o padro eletrofortico de quinze enzimas em 121 isolados provenientes dos mais diferentes stios, englobando as Amricas do Norte, Central e do Sul. Neste estudo, os autores estabeleceram 43 zimodemas diferentes, e apesar de atestarem uma grande heterogeneidade intragrupo, se aventuram em aglutinar os isolados em dois clusters distintos, exibindo um alto grau de polimorfismo gentico interno. O uso da tcnica de PCR com iniciadores randmicos para gerar RAPDs (random amplified polymorphic DNAs), trouxe a possibilidade de se estudar vrios loci em um nico experimento. Assim, Tibayrenc et al. (1993) demonstraram uma grande correlao entre os ensaios de RAPD e os perfis eletroforticos das enzimas, definindo igualmente os dois clusters supracitados. Henriksson et al. (1996) relatam tambm uma certa correlao entre os padres de caritipo molecular e localizao de distintos genes e os zimodemas de T. cruzi: Z1 e Z2. Pontuam que os isolados Z2 apresentam cromossomos maiores que cepas Z1 e afirmam que esta caracterstica suporta a distncia gentica entre os dois grupos isoenzimticos, podendo refletir um fenmeno de especiao dentro do taxon T. cruzi. Fugindo um pouco do tradicional polimorfismo, Souto & Zingales (1993) estudaram o gene codificante para o rRNA 24Sa (subunidade maior) em vrios isolados de T. cruzi. Utilizando a tcnica de PCR como abordagem experimental, clonaram e seqenciaram dois produtos distintos provenientes de diferentes isolados, conseguindo definir dois grupos dentro da espcie T. cruzi: grupo 1 (rDNA1) e grupo 2 (rDNA2). Aps um estudo pormenorizado das seqncias dos genes de miniexon de diferentes isolados de T. cruzi (Fernandes et al., 1998), constataram-se dois grupos distintos que possuam concordncia com os grupos descritos por Souto & Zingales (1993). Anlise por RAPD dos distintos isolados tipados, tanto atravs da seqncia codificante para o rRNA 24Sa como para o gene de miniexon, definiu duas linhagens principais em T. cruzi, ambas polimrficas e subdivididas em pequenos grupos: linhagem 1 e linhagem 2 (Souto et al., 1996), como mostrado na Tabela 2.
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Tabela 2 Tipagem de diversos estoques de Trypanosoma cruzi atravs da dicotomia presente nos genes de miniexon e rRNA
Isolado (pas) Ana /BR Basileu /BR C1 /BR Esmeraldo cl3 BR JM /BR MAS cl1 /BR MC /BR Tatiana /BR Sylvio X10 /BR Y /BR CBB cl3 /CH MN cl2/CH NR cl3 /CH CA 1 /ARG Origem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Homem Linhagem 1 1 2 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 Isolado (pas) Cuca cl1 /BR Cutia cl1 /BR Esquilo cl1 /BR F /BR M226 /BR G /BR Gamb cl1 /BR Dm28 /VEN CL /BR CL Brener /BR YuYu /BR Tulahuen /CH OPS 22 /VEN Origem Roedor Roedor Roedor Roedor Roedor Gamb Gamb Gamb Triatom. Triatom. Triatom. Triatom. Triatom. Linhagem 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 2 2 2
Ao tiparmos amostras de T. cruzi recm-isoladas de hospedeiros humanos e de triatomneos de distintas localidades brasileiras (Amazonas, Minas Gerais, Paraba e Piau), observarmos que os isolados da Amaznia correspondem linhagem 2, condizentes com o ciclo de transmisso silvestre, enquanto todos os outros isolados humanos do restante do pas so linhagem 1 (ciclo domstico). A nossa impresso de estarmos tendo a oportunidade de presenciar um fenmeno mpar, que seria a interao do hospedeiro humano com o ciclo silvestre, peculiar da Amaznia (Fernandes et al., 1998). Partindo-se do conceito de heterogeneidade populacional de T. cruzi, at atingirmos, pelo conceito dicotmico trazido pela caracterizao pelo gene ribossmico 24Sa ou de miniexon, quais sero as cepas de eleio para se estudar T. cruzi? A resposta desta questo permear o ponto especfico de futuras investigaes. O que pode ficar estabelecido que a atual viso de dicotomia das distintas populaes de T. cruzi nos indica a existncia de duas unidades taxonmicas distintas dentro do taxon. Somente futuras correlaes biomdicas e epidemiolgicas podero dar o aval a uma eventual separao de T. cruzi em mais de uma espcie. Em simpsio internacional recente (ver Anexos, Captulo 20) foram adotadas recomendaes para padronizar e uniformizar a denominao do isolado de T. cruzi, de modo a facilitar informaes sobre sua origem (hospedeiro do qual foi isolado, ano de isolamento), a designao e numerao dada pelo laboratrio que o isolou e o grupo de T. cruzi ao qual pertence. Assim, foi proposta a designao operacional, T. cruzi I e T. cruzi II, para isolados de parasitas com as caractersticas da Tabela 3. T. cruzi # est recomendado para a designao de qualquer isolado que no puder ser enquadrado completamente em I ou II, por ausncia de uma caracterizao completa, ou por se enquadrar em cepas aparentemente hbridas, como Zimodema 2b ou 3 (Miles et al., 1980, 1981), Zimodema B (Romanha et al., 1979), Tipo I (Andrade, 1974), Locus 1/2 (tipadas por rDNA 24Sa (Souto et al., 1996), clonadas como 39 (Tibayrenc et al., 1993), que aguardam estudos mais aprofundados. De um modo geral o T. cruzi I circula no ciclo silvestre e o T. cruzi II no ciclo domstico de transmisso do T. cruzi. Tabela 3 Nomenclatura operacional para os isolados de Trypanosoma cruzi em dois grandes grupos proposta em abril de 1999 (ver Anexo, Captulo 20)
Parmetro Zimodema 1 ou 2 Zimodema A (2) Biodema II ou III (3) Ribodema I, II ou III (4) Grupo 1 ou 2 (5) Linhagem 1 ou 2 (6)
(1)
T. cruzi I
1 III II/III 1 2
T. cruzi II
2 A II I 2 1
1. Miles et al., 1978; 2. Romanha et al., 1979; 3. Andrade, 1974; 4. Clark & Pung, 1994; 5. Tibayrenc et al.,1993; 6. Souto et al.,1996
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Tabela 4 Exemplo de nomenclatura dos isolados de Trypanosoma cruzi usados muito freqentemente em estudos de infeco experimental
Isolado (designao corrente) Y Tulahuen Colombiana Sylvio X10 Dm28c Peru 21-SF Esmeraldo Berenice Designao proposta (1999) MHOM/BR/00/Y (T.cruzi II) TINF/CH/00/Tulahen (T.cruzi I) MHOM/CO/00/Colombia (T.cruzi I) MHOM/BR/78/Sylvio - X10 (T.cruzi I) MDID/BR/82/Dm-28c (T.cruzi I) MHOM/PE/00/Peru (T.cruzi #) MHOM/BR/00/12-SF (T.cruzi #) MHOM/BR/77/Esmeraldo (T.cruzi II) MHOM/BR/62/Berenice (T.cruzi II)
No Projeto Genoma de T. cruzi foi escolhido o clone CL-Brener, tipado como linhagem 1, representativo do parasita circulante no ciclo domstico, e capaz de reproduzir em animais experimentais o comportamento biolgico majoritrio do T. cruzi em pacientes chagsicos. Na Tabela 5 esto sumarizados dados bsicos sobre a cepa CL e o clone CL-Brener, tal como descrito na referncia do Projeto Genoma. Os experimentos comparativos entre a cepa parental e o clone CL-Brener conduziram a resultados semelhantes, exceto quanto s curvas de parasitemia de camundongos Balb/C com formas tripomastigotas metacclicas, quando a parasitemia com a cepa parental indica nveis significativamente mais altos que o clone. Tabela 5 Caractersticas do clone CL Brener, adotado no Projeto Genoma
Parmetro
Nome Depsito Cepa original Circulao Clonagem Morfologia Infectividade in vivo Histotropismo Resistncia do hospedeiro Sensibilidade a complemento Infeco e ciclo celular in vitro Sensibilidade temperatura Crescimento em meio de cultivo Sensibilidade quimioterapia Perfil de ligao de lectinas Zimodema Esquizodema Perfil protico (extratos solveis) Perfil de PCR
Caracterstica/Referncia
CLONE F11F5, denominado CL-BRENER em homenagem ao Dr. Zigman Brener, na reunio deabril de 1994 para planejamento do Projeto Genoma de Trypanosoma cruzi (WHO/TDR, Rio de Janeiro, Brazil, 1994) (Zingales et al., 1997) Formas sangneas criopreservadas e depositadas no criobanco do Lab. de Doena de Chagas, C.Pq. Ren Rachou, Fiocruz CL, isolada de Triatoma infestans coletado no Rio Grande do Sul, Encruzilhada, 1963 (Brener & Chiari,1963 a,b) Ciclo domstico natural O clone CL-Brener foi isolado de um camundongo cronicamente infectado com a cepa CL, em 3/07/1987, e reclonado em 14/09/1987 Predomnio de formas largas aps duas semanas de infeco, com formas finas na primeira semana (Brener, 1965) Aumento gradual e constante da parasitemia na fase aguda, persistncia de parasitemia baixa mas positiva na fase crnica (Brener, 1965, 1977; Araujo & Chiari, 1989) Pan-infectivitdade (Lenzi et al., 1996) com parasitismo preferencial por clulas musculares cardacas e esquelticas (Melo & Brener, 1978) Agentes imunossupressores (irradiao, ciclofosfamida) induzem a reagudizao em animais crnicos (Brener & Chiari, 1971) Formas sangneas resistentes lise direta, exceto quando opsonizadas por anticorpo especfico 1976; Schotellius, 1926; Umekita e al., 1997) (Krettli & Brener,
Baixo nvel de invaso em macrfagos; cintica lenta de invaso em clulas musculares cardacas e esquelticas (Alcantara & Brener, 1978; Meirelles et al., 1980, 1982, 1986; Bertelli & Brener, 1980, Arajo-Jorge & De Souza, 1984) Diferenciao intracelular de amastigotas para tripomastigotas ocorre a 33oC e inibida a 37oC (Brener et al., 1976) Crescimento fcil e rpido em meios monofsicos ou bifsicos, com diferenciao epimastigota-tripomastigota ocorrendo nos dois meios, tanto para a cepa quanto para o clone (Brener & Chiari, 1965) Muito susceptvel a drogas usadas clinicamente na doena de Chagas (Filardi & Brener, 1987) Sobretudo ConA e RCA (Arajo et al., 1980) B (Romanha et al., 1979; Goldberg & Silva Pereira, 1983) Determinados tanto para a cepa quanto para o clone (Morel, 1980; Morel & Simpson, 1980) Eletroforese e Western blot indicaram perfil semelhante entre a cepa e o clone (Teixeira & Yoshida 1986; Zingales et al., 1997) Semelhana entre cepa e clone (Macedo et al., 1992; Vago et al., 1996; Brisse et al., 1998)
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10.3
Planejamento de um Experimento com Infeco In Vivo pelo Trypanosoma cruzi

Um experimento in vivo, no qual vo ser sacrificados animais, est sujeito aos princpios ticos preconizados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal, Cobea (ver Anexo, Captulo 20), precisa ser muito bem planejado. Para isso, sugerimos que seja seguido o roteiro de questes abaixo.
Qual o objetivo do experimento? A definio clara da pergunta que o experimento visa responder, e o que se quer
testar, vai definir os grupos a serem comparados. Quantos grupos experimentais sero formados? Qual o modelo experimental (animal e parasita) que melhor permite responder pergunta formulada? Animal susceptvel ou resistente? De que linhagem gentica? Macho ou fmea? Recm-nato, jovem ou adulto? Agrupados por idade, peso ou ambos? Que cepa de parasita se adequa pergunta experimental? De baixa ou alta virulncia? Com mortalidade na fase aguda ou crnica? Que estgio do T. cruzi ser utilizado para o inculo: epimastigota, tripomastigota metacclico, tripomastigota sangneo, de cultura de clulas, ou amastigota? Que inculo ser utilizado? Por que via ser administrado? Recomendamos a leitura do Captulo 9 como subsdio para a escolha do modelo experimental. Qual o nmero de animais necessrios? Quantos animais sero analisados por grupo? Os animais sero estudados individualmente durante todo o experimento ou sero sacrificados num certo nmero por dia ps-infeco? Sangue ou clulas sero obtidos e agrupados, ou no, em um pool? Nesse caso, qual o nmero ideal para compor o pool? Em que dia ser coletado o material? Quantos animais por dia? Se forem utilizados animais isognicos, para anlises individuais cujos resultados sero avaliados em mdias ou medianas, recomendamos no mnimo quatro animais por ponto. Para anlises em pool, recomendamos no mnimo trs animais por ponto. Para anlise de animais no isognicos, onde se espera maior variao individual, so necessrios de oito a dez animais por ponto. H espao e gaiolas no biotrio? Quantas gaiolas precisaro ser utilizadas? H espao no biotrio para essas gaiolas? Por quanto tempo est previsto o acompanhamento desses animais e a conseqente ocupao do espao? Algum tratamento experimental ser feito? Para o estudo da administrao de drogas ou de anticorpos precisam ser feitos controles especficos referentes ao veculo de dissoluo da droga, ou ao isotipo do anticorpo, respectivamente. As datas e as vias de administrao do tratamento experimental precisam ser previamente definidas, em funo de critrios objetivos como a farmacocintica do produto (velocidade de absoro, concentrao ativa, velocidade de inativao ou remoo do produto da circulao e do rgo alvo, etc.). Todos esses detalhes devem ser previamente conhecidos, seja por reviso bibliogrfica ou por ensaios experimentais preliminares ao experimento propriamente dito. No caso do teste de efeito de nifurtimox, Haberkorn & Gonnert (1972) estabeleceram que doses de 15 ou 10 mg/kg para homens adultos equivalem a doses de 180 or 120 mg/kg para camundongos ou ratos.
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Quais as caractersticas detalhadas do pedido de animais? Em razo da data prevista para a infeco e da idade ideal
do animal quando da infeco, preciso calcular a data ideal de nascimento, a data para chegada ao biotrio de experimentao (pelo menos dez dias antes do incio do experimento), e especificar no pedido a linhagem, o nmero, o sexo e a data de nascimento dos animais. Quais as providncias necessrias para a obteno do inculo na data prevista para a infeco? Se for ser utilizado tripomastigota sangneo, h que se prever o nmero de animais a ser sacrificados no dia do inculo, para que estejam no dia de pico da parasitemia. Se o inculo ser feito com tripomastigota metacclico ou de cultura de clulas, os procedimentos de cultura devero ser tomados com a antecedncia correta para a obteno dos parasitas no nmero e no estgio desejado. Qual o cdigo do experimento? Sugerimos que seja dado um cdigo global do projeto (de at quatro dgitos) e que os experimentos sejam numerados seqencialmente. Desse modo pode-se montar um diretrio do projeto e arquivos ou planilhas que levem o nome dos diferentes experimentos para digitao dos dados obtidos (ver Anexo, Captulo 20). Na Tabela 6 esto listadas algumas das linhagens de camundongos mais utilizadas para estudos da doena de Chagas experimental e suas principais caractersticas genticas. Na Tabela 2 so apresentados alguns dos isolados de T. cruzi mais utilizados, com sua origem e padro de linhagem, segundo tipagem dos genes de miniexon e rRNA. Tabela 6 Algumas linhagens de camundongos utilizadas para estudos da doena de Chagas experimental
Linhagem Haplotipo Complexo H-2 Outros loci genticos
K
Linhagens comuns C57BL/6 C56BL/10 BALB/c C3H/HeJ CBA/J DBA/2 AKR/J ASW/Sn C57BR Linhagens congnicas BALB.B BALB.K B10.BR B10.D2 B10.Q B10.S C3H.SW
Ab
Aa
Eb
Ea
Thy-1
CD5
CD8 CD45
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2 2 2 2 2 2 1
nd nd nd nd nd nd nd
Adaptado de Klein (1986) e de Klein et al. (1990)
183
10.4
Manuteno e Obteno dos Diferentes Estgios Evolutivos em Laboratrio

Helene Santos Barbosa
O Trypanosoma cruzi um flagelado da Ordem Kinetoplastida, Famlia Trypanosomatidae, caracterizado por ter um nico flagelo e uma nica mitocndria, na qual se situa o cinetoplasto, uma organela especializada que contm DNA. de fcil identificao e deve ser apenas diferenciado de Trypanosoma rangeli, um flagelado nopatognico que circula em humanos nas Amricas Central e do Sul, transmitido por alguns vetores que tambm transmitem T. cruzi. Para uma reviso detalhada da biologia celular do parasita, que foge ao perfil desta publicao, referimos De Souza (1984, 1989). Como discutido acima, T. cruzi no uma populao homognea mas composta de um pool de cepas que circulam nos ciclos domstico e silvestre. Essa variao se reflete na morfologia, na virulncia, nas curvas de parasitemia e mortalidade e na sensibilidade a drogas. A composio antignica j foi bem estudada para vrias cepas por abordagens bioqumicas e imunoqumicas. Reaes cruzadas e antgenos cepa-especficos j foram detectados. Sondas moleculares para seqncias conservadas tanto do DNA do cinetoplasto como do nuclear so usadas para a deteco do parasita por PCR e tambm vm sendo aplicadas para a tipagem de cepas. Todo o ciclo do T. cruzi pode ser estudado in vitro, pois , entre os tripanosomas patognicos, um dos mais fceis de ser mantido em laboratrio. J foram descritos diversos mtodos para a obteno dos diferentes estgios do parasita e estes podem ser cultivados em meios artificiais acelulares no definidos, meios acelulares definidos e em vrios tipos celulares. O estudo da ultra-estrutural entre as vrias formas ou estgios evolutivos do parasita, aponta diferenas morfolgicas semelhana das observaes em microscopia ptica (para reviso De Souza, 1984). A Figura 1 mostra aspectos morfolgicos das diferentes formas do ciclo evolutivo do T. cruzi ao nvel de microscopia ptica e eletrnica. Estas formas so identificadas pela posio relativa do cinetoplasto em relao ao ncleo.
Epimastigotas: apresentam um longo e grande corpo, ncleo esfrico, cinetoplasto (em forma de basto) anterior
ao ncleo, bolsa flagelar em posio anterior ao ncleo, com flagelo livre e presena de citstoma. Podem ser cultivados em meio de cultura, sendo o meio LIT o mais utilizado. Tripomastigotas metacclicos: apresentam corpo fino, ncleo fusiforme, flagelo ao longo de todo o corpo do parasita, cinetoplasto (em forma esfrica) na extremidade posterior do parasita, conseqentemente posterior ao ncleo. A metaciclognese, processo de transformao de formas epimastigotas em tripomastigotas metacclicas, deve-se a um estresse nutricional imposto pelas condies fsico-qumicas da parte posterior do trato digestivo do inseto, e um passo crucial durante o ciclo de vida do T. cruzi. Esse processo pode ser simulado em cultivo in vitro do parasita a 27C, utilizando-se tanto meio complexo como meio quimicamente definido. A possibilidade de se obter grandes quantidades de tripomastigotas metacclicos in vitro com propriedades biolgicas similares s das formas derivadas do inseto facilita o estudo com T. cruzi quanto a antgenos, receptores de superfcie estgio-especficas, expresso diferencial dos genes, mecanismos moleculares de regulao morfogentica, entre outros. Tripomastigotas derivados de metaciclognese natural tambm podem ser obtidos em laboratrio, a partir da infeco de triatomneos e da coleta da urina contaminada.
184
Amastigotas: apresentam forma arredondada, com cinetoplasto em forma de basto, um flagelo curto visvel
apenas microscopia eletrnica e presena de citstoma. Podem ser obtidas quando da ruptura de clulas infectadas ou da diferenciao in vitro em meio definido. Tripomastigotas: originrios do sangue ou recm-liberados de clulas tambm podem ser obtidos em laboratrio.
N C
N C C
D N
BF E F
Figura 1 Aspectos morfolgicos das diferentes formas evolutivas do Trypanosoma cruzi ao nvel de microscopia ptica (A, C, E) e eletrnica (B, D, F). A: epimastigotas (setas) cultivadas em meio LIT apresentam forma alongada com cinetoplasto anterior ao ncleo. Algumas formas tripomastigotas podem ser vistas (*) tendo como carter diferencial a presena de um cinetoplasto terminal ou subterminal, com ncleo alongado. B: epimastigotas apresentando ncleo (N), cinetoplasto (C) em forma de barra contido na matriz de uma mitocndria (*), microtbulos subpeliculares (setas), flagelo emergindo da bolsa flagelar, associado com o corpo basal (cabea de seta). C: amastigotas, obtidas de cultura de clulas da linhagem J774G8 apresentam forma arredondada ou ovides (setas) com cinetoplasto prximo ao ncleo. D: amastigotas apresentam forma arredondada ou oval com cinetoplasto em forma de barra e flagelo curto (no mostrado). E: tripomastigotas isoladas do sangue de camundongo infectado. Os parasitas tm a forma de C ou U, com extremidade afilada, o cinetoplasto grande e redondo com posio terminal ou subterminal, ncleo alongado e flagelo que corre ao longo do corpo do parasita sendo livre na extremidade. F: tripomastigotas apresentando cinetoplasto esfrico (C) em forma de cesta com estrutura especial semelhante a cristas ordenadas horizontalmente dentro de uma mitocndria, bolsa flagelar (BF) de onde emerge o flagelo (F) aderido ao corpo do parasita.
185
Todas as formas tripomastigotas, bem como as amastigotas, provenientes de diversas origens, mantm sua capacidade de invaso em culturas de clulas de mamferos, o que pode ser facilmente reproduzido in vitro em laboratrio, tanto para fins de obteno de parasitas e seus produtos metablicos, como para fins de experimentao da interao parasito-clula. A penetrao do T. cruzi pode levar de 5 minutos at 48 horas, a depender da origem do tripomastigota, da cepa do parasita e do tipo e da espcie da clula hospedeira. Durante a penetrao h a formao de um vacolo em torno do parasita, cuja membrana lisada em at 20 horas. Livres no citoplasma da clula hospedeira, os tripomastigotas se diferenciam em amastigotas, iniciando-se a fase de diviso celular, em ciclos reprodutivos consecutivos, at tomar todo o espao disponvel na clula, quando provavelmente, tambm por estresse nutricional, induzida nova diferenciao para formas tripomastigotas que so liberadas quando a clula hospedeira por fim lisada pelos parasitas. Descreveremos a seguir os protocolos utilizados para a obteno dos diversos estgios evolutivos do T. cruzi.
10.4.1
Cultivo de epimastigotas em meio LIT

Meio LIT (liver infusion tryptose)* NaHPO4.7H2O NaCl KCl Glicose Triptose Caldo de infuso de fgado Extrato de levedura Hemina Soro fetal bovino Penicilina Estreptomicina/gentamicina H2O qsp 11,6 g 4 g 0,4 g 2,2 g 5 g 5 g 15 g 25 mg/20 ml Tris Base 0,1 N 100 ml 200.000 U 50 mg 1.000 ml
*Camargo (1964)
dissolver as substncias, sob agitao, em aproximadamente 850 ml de H2O destilada. Ajustar o pH para 7,27,5 com HCl. Adicionar o soro fetal bovino, completar o volume para 1.000 ml e inativar todo o meio a 68C por 60 minutos. Filtrar sucessivamente, com membranas de 1,2 mm, 0,45 mm e 0,2 mm (no estreis) e filtrar estril com membrana de 0,2 mm; o meio deve ser distribudo em garrafas estreis e mantido a 4C (caso seja usado dentro de duas semanas) ou congelados a -20C por vrios meses. Para controle da esterilidade do meio, recolher duas alquotas em tubos com roscas, deixando um a temperatura ambiente e outro na geladeira.
Inculo e manuteno do parasita

Material estufa com controle de temperatura na faixa de 26-28C erlenmeyer de 250 ml
Inoculao e crescimento
o inculo inicial em meio LIT deve ser de 7,5 x 106 parasitas/ml em erlenmeyer com 50 ml de meio. As
culturas de T. cruzi so mantidas de 26-28C. Ateno especial deve ser dada aerao da superfcie/volume de meio. Sob estas circunstncias no necessria a agitao durante o cultivo;
186
durante os primeiros quatro dias de cultivo ocorre a fase de multiplicao ou crescimento celular, emergindo
ento para a fase estacionria, quando a populao alcana 15 x 108 parasitas/ml. Durante a fase logartmica de multiplicao h predominncia macia de formas epimastigotas, sendo muito rara a presena de formas metacclicas. O nmero de formas metacclicas eventualmente introduzidas com o inculo inicial permanece constante; quando a cultura atinge sua fase final de crescimento exponencial, em torno de 72-96 horas, o nmero de tripomastigotas metacclicos aumenta alcanando seu nvel mais alto, com 3-4 x 107 parasitas/ml; se as culturas forem mantidas permanentemente em fase logartmica de crescimento pelo subcultivo dirio, o pico de formas metacclicas no ocorre e sua quantidade insignificante. Se, por outro lado, os epimastigotas forem transferidos para um meio de cultura fresco no final da fase exponencial, mas antes de ocorrer evoluo para formas metacclicas, um pequeno nmero de metacclicos pode ser encontrado no meio. Aps a segunda passagem nestas condies, a proporo de metacclicos decai; epimastigotas na fase logartmica de crescimento ou no incio do plateau podem ser usadas como inculo para cultivar novas culturas.
10.4.2
Obteno de tripomastigotas sangneos
Utilizam-se camundongos infectados e no dia em que a parasitemia mxima para a cepa de T. cruzi em estudo, faz-se o sacrifcio dos animais, sangria por puno cardaca e separao dos tripomastigotas por centrifugao diferencial. Para se saber o dia em que os animais devem ser sacrificados necessrio o acompanhamento da parasitemia, feito atravs da sangria dos animais pela cauda (ver Captulo 13). Uma vez estabelecidos os inculos e o modelo experimental, a cintica de parasitemia extremamente reprodutvel, permitindo o conhecimento prvio do dia em que a parasitemia alcana seu pico. Para camundongos Swiss infectados com 105 tripomastigotas sangneos da cepa Y no stimo dia ps-infeco. Para cada par de linhagens de camundongo e de parasita esse dia precisa ser pr-estabelecido. O procedimento para inoculao e puno cardaca dos animais no pico da parasitemia est no Captulo 13. Descreveremos ento o procedimento para separao e purificao dos tripomastigotas sangneos aps a obteno do sangue infectado.
Separao de tripomastigotas sangneos por centrifugao diferencial

Material
cmara anestsica com ter placa de cortia e agulhas citrato de sdio a 3.8% meio DME com 10% de soro fetal bovino seringas de 1 ml algodo ou gaze lcool a 70% isopor com gelo centrfuga clnica (de preferncia refrigerada) banho-maria microscpio ptico cmara de Neubauer pipeta Pasteur micropipeta para 5-10 l
187
Mtodo
anestesiar os camundongos em cmara de ter e fix-los com alfinetes em uma placa de cortia; retirar, por puno cardaca, com auxlio de uma seringa, o sangue com citrato de sdio a 3,8% (cerca de 0,4
ml)/camundongo; colocar o sangue infectado em tubos com rosca, conservando-os em gelo (4C) durante a sangria; manter a seringa e a agulha com resduos de sangue protegidos por algodo ou gaze embebidos em lcool a 70% no intervalo entre uma sangria e outra. Os animais devero ser imediatamente armazenados em um saco plstico para posterior descarte, segundo as normas descritas no Captulo 8; aps a sangria de todos os animais, centrifugar a 1.200 rpm de 10-15 min e deixar em repouso na estufa a 37C, por 15 min; retirar o sobrenadante e centrifugar a 3.500 rpm por 10-15 min; desprezar o sobrenadante e acrescentar cerca de 6 ml de meio DME contendo 10% de soro fetal bovino; colocar em banho-Maria a 37C, para induzir a formao de grumo de plaquetas; retirar o grumo e centrifugar a 3.500 rpm de 10-15 min;
Obs: se no houver formao de grumo, centrifugar baixa rotao (2.000 rpm/10 min).
desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento contendo os parasitas em 1 ou 2 ml de meio DME, fazer

diluio de 1/100 e contar em cmara de Neubauer.
Obs: todo o material com sangue infectado dever ser desprezado em um recipiente contendo soluo desinfetante e nesta soluo permanecer no mnimo por 24 h, para posterior lavagem.
10.4.3
Metaciclognese in vitro
Composio e preparo dos meios TAU e TAU-3AAG

Meio TAU* NaCl KCl MgCl2 CaCl2 Tampo fosfato pH 6,0 NaHCO3 mM 190 17 2 2 8 0,6 g/l de meio 11,10 1,26 0,407 0,294 0,294 0,005
*Contreras et al. (1985)
Para preparo do meio TAU3AAG, acrescentar

mM Glicose I-Prolina Glutamato de sdio Aspartato de sdio 10 10 50 2 g/l de meio 1,80 1,17 8,45 0,31
Mtodo
manter epimastigotas em meio LIT com passagens semanais; ressuspender parasitas provenientes de meio LIT aps seis a oito dias de cultivo, (percentual de tripomastigotas
inferior a 5%) numa concentrao de 5 x 108 parasitas/ml em um volume total de 10 ml de meio TAU; incubar por 2 h a 28C; proceder a contagem dos parasitas (em meio TAU) para o inculo em meio TAU3AAG, cuja concentrao no
188
dever ultrapassar 3-5 x 106 parasitas/ml; incubar os parasitas em 10 ml de TAU3AAG em garrafas de cultura (25 cm2); homogeneizar e deit-las rapidamente; manter as garrafas sem agitao por trs a quatro dias a 28C, observando diariamente as garrafas em microscpio invertido; no quarto dia de incubao os parasitas so coletados virando-se a garrafa lentamente e evitando a contaminao com os epimastigotas presentes na nata que se forma principalmente na superfcie do meio. Invertendo-se a garrafa, a nata, por tenso superficial, fica retida na parte inferior da mesma. Os tripomastigotas so recolhidos, centrifugados a 10.000 rpm a 5C por 15 min e o sedimento contendo os parasitas ressuspenso em 1 ml de meio de cultura (Contreras et al., 1985). Avaliao da eficincia da metaciclognese
aps 6 horas em meio TAU3AAG, uma drstica reduo no nmero de parasitas pode ser observada em
decorrncia da adeso dos epimastigotas ao fundo (substrato) da garrafa. Aps 24 horas (sem agitao) a cultura j apresenta trs fases distintas: na parte inferior encontram-se vrias formas epimastigotas aderidas ao substrato, meia altura alguns tripomastigotas metacclicos e na parte superior encontra-se uma nata onde vrios epimastigotas esto fixados formando rosetas ou mesmo isolados. A percentagem de tripomastigotas vai aumentando meia altura do meio at o quarto dia, proveniente da transformao de epimastigotas em tripomastigotas que resulta na sua liberao do substrato. Como nem todos os epimastigotas iro se aderir ao substrato, haver sempre um percentual de epimastigotas ao final do ensaio; no quarto dia de incubao, a percentagem de formas tripomastigotas dever estar na faixa de 80%. Alguns fatores podem interferir na metaciclognese: (a) a idade das culturas em meio LIT; (b) o percentual de formas tripomastigotas e esferomastigotas em meio LIT (dever ser inferior a 5%); (c) o inculo de parasitas em meio TAU3AAG (concentrao mxima de 5 x 106/ml); (d) a altura do meio nas garrafas durante a metaciclognese (no deve ultrapassar 10mm); (e) ausncia de agitao das garrafas ( importante permitir a adeso dos epimastigotas superfcie do frasco, semelhana do que ocorre no intestino do barbeiro, para que ocorra a metaciclognese).
10.4.4
Obteno de tripomastigotas e amastigotas a partir de cultura de clulas

10.4.4.1 Preparo de meios
Meio DMEM* Meio liofilizado Nitrato frrico Estreptomicina Penicilina Soro fetal bovino H2O DDD qsp 1 L
*
10,15 g 0,0001 % 100 U/ml 100 mg/ml 10 mL
Dulbeccos modified Eagles medium
Preparo do meio
trabalhar com 90% do volume de gua destilada, que corresponde ao volume final do meio. Usar agitador
magntico durante a mistura dos componentes; adicionar o contedo do frasco gua destilada, misturando na temperatura de 15 a 30C; completar o volume com gua destilada e adicionar aos poucos NaHCO3 (em p), ajustando o pH do meio, para 0,2-0,3 abaixo do valor final desejado (7,2). Aps ajuste do pH, manter o recipiente fechado at a filtragem
189
do meio;
adicionar o nitrato frrico, os antibiticos e o soro fetal bovino; filtrar o meio com membrana de 0,2 mm de poro; distribuir em garrafas, podendo o meio estril ser congelado;
Obs: o pH geralmente aumenta 0,1-0,3 aps a filtrao.
Meio 199 Meio liofilizado Estreptomicina Penicilina Soro fetal bovino H2O DDD qsp 1 l 10,15 g 100 U/ml 100 mg/ml 10 ml
Preparo do meio
mesmo procedimento utilizado para o meio DMEM.

10.4.4.2 Linhagens celulares
para obteno de formas tripomastigotas ser descrito o procedimento utilizado para clulas L-A9, uma linhagem celular de fibroblastos transformados; para obteno de formas amastigotas ser descrito o procedimento utilizado para clulas J774G8, uma linhagem celular semelhante a macrfago derivada de um clula reticular de sarcoma de camundongos Balb/C. Manuteno de linhagens
as clulas so cultivadas em frascos de vidro ou de plstico de 250 ml (inculo 5x106 clulas por garrafa) a 37C
em meio DMEM ou 199 suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) a pH 7,2, sendo este trocado a cada dois dias; aps seu crescimento, as clulas da linhagem L-A9 devem ser tripsinizadas por incubao por 1-3 min/37C com soluo contendo 0,1% tripsina, 0,02% verseno e PBS na razo 1:1:3. Esta incubao interrompida pela adio de DMEM+5% SFB mantendo-se o tubo em banho de gelo. As clulas so ento centrifugadas (1.000 g/5 min) e o sedimento ressuspenso em novo meio. Aps contagem desta suspenso as clulas so plaqueadas; durante o crescimento da linhagem J774G8, algumas das clulas se destacam da superfcie da garrafa. Essas clulas na fase lquida da cultura so usadas para iniciar as subculturas e como fonte para culturas novas.
10.4.4.3 Obteno de tripomastigotas

Infeco das clulas L-A9 para obteno de tripomastigotas (Carvalho & De Souza, 1983)
a infeco feita com tripomastigotas sangneas (ver item 13.3.2) ressuspensos em soluo salina ou meio de
cultura em razo parasita/clula hospedeira entre 3-5;
os parasitas que no entram nas clulas hospedeiras nas primeiras 24 h de interao (37C), so removidos por
troca de meio;
a depender da cepa de parasita utilizada, dever previamente ser realizado um estudo cintico no perodo de
dois a doze dias, para acompanhamento do ciclo do parasita, visando determinar o dia de liberao mxima de tripomastigotas no sobrenadante. Este monitoramento deve ser feito, diariamente, por plaqueamento das clulas, fixando-se as lamnulas em soluo de Bouin e corando com soluo de Giemsa utilizando-se a cepa Y, o isolamento de tripomastigotas feito a partir da coleta do sobrenadante de clulas LA9 aps seis a sete dias de infeco; o sobrenadante centrifugado a 500 g por 10 min e deixado a 37C por 30 min; o sedimento que contm
190
clulas hospedeiras desprezado. O sobrenandante , a seguir, centrifugado a 1.000g por 10 min, para obteno dos parasitas que devem ser ressuspensos em meio de cultura, e sua concentrao ajustada para 1,5 x 108 clulas/ml; para manuteno da produo de tripomastigotas em cultura de clulas, os repiques so realizados com parasitas provenientes das prprias culturas. Purificao de tripomastigotas com gradiente de metrizamida
o sedimento final contendo parasitas e clulas hospedeiras ressuspenso em 2 ml de meio 199 e colocado no
topo do gradiente de metrizamida (0,01M tampo fosfato, pH 7,2 com 2% SFB) preparado em duas concentraes: 10 e 15%; o material centrifugado a 1.000 g por 20 min em um rotor horizontal; os tripomastigotas puros so encontrados na interface de 10 e 15% do gradiente de metrizamida. Avaliao de rendimento
a linhagem LA-9 libera grande quantidade de tripomastigotas no sobrenadante aps seis a sete dias de cultivo.
Poucos amastigotas so vistos no sobrenadante dessas culturas. Com a utilizao dessas clulas possvel se obter cerca de 6.5 x 107 parasitas por garrafa (250 ml). A purificao de amastigotas com metrizamida no interfere com a infectividade desses parasitas.
10.4.4.4 Obteno de amastigotas

Infeco das clulas J774G8 para obteno de amastigotas (Carvalho & De Souza, 1983) a infeco feita com tripomastigotas sangneas (ver item 13.3.2) ressuspensos em soluo salina ou meio de cultura na razo parasita/clula hospedeira entre 3-5; para o isolamento de amastigotas, o sobrenadante de clulas J774G8 est, seis a oito dias aps a infeco, com formas tripomastigotas sangneas ou provenientes de cultura de clulas. O sobrenadante nesta fase contm aproximadamente >70% de amastigotas; procede-se centrifugao do sobrenadante a 1.000 g por 5 min e ressuspende-se em meio 199 para a concentrao de 1,5 x 108 parasitas/ml. Purificao de amastigotas com gradiente de metrizamida
o sedimento final contendo parasitas e clulas hospedeiras purificado resusspendendo-se este em 2 ml de meio
199; colocado no topo do gradiente de metrizamida (0,01M tampo fosfato, pH 7,2 com 2% SFB) preparado em trs concentraes: 15, 17 e 21%; o material centrifugado a 1.000 g por 20 min em uma centrfuga clnica com rotor horizontal. Os amastigotas puros, aps a centrifugao, so encontrados na interface de 15 e 17% do gradiente de metrizamida. Avaliao de rendimento
clulas J774G8 infectadas com tripomastigotas sangneos da cepa Y apresentam tendncia de se romperem
antes de comear a diferenciao de amastigotas para tripomastigotas. Aps seis a sete dias de cultivo, grande quantidade de amastigotas liberada no meio de cultura. Em algumas clulas o ciclo intracelular completado e formas tripomastigotas so liberadas no meio. As clulas hospedeiras que permanecem intactas contm muitos parasitas intracelulares com formas em diviso, que podem ser liberadas pela passagem em seringas com agulha. Esse mtodo permite a obteno de 2 x 107 parasitas/ml de meio de cultura. A purificao de amastigotas com metrizamida no interfere com a infectividade desses parasitas.
191
ALCNTARA, A. & BRENER, Z. The in vitro interaction of Trypanosoma cruzi bloodstream forms and mouse peritoneal macrophages. Acta Tropica, 35: 209-219, 1978. ANDRADE, S. G. Caracterizaao de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas do Recncavo Baiano. Revista de Patologia Tropical, 3:65-121, 1974. ANDRADE, S. G. & MAGALHES, J. B. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma cruzi strains: Correlations with clinical data and experimental. Pathology, 30: 27-35, 1996. ARAJO, F. G.; HANDMAN, E. & REMINGTON, J. S. Binding of lectins to the cell surface of Trypanosoma cruzi. Journal of Protozoology, 27:397-400,1980. ARAJO, S. M. & CHIARI, E. Biological characterization of clones of the Y, CL and MR strains of Trypanosoma cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 83:175-181,1989. ARAJO-JORGE, T. C. & DE SOUZA, W. Effect of carbohydrates, periodate and enzymes in the process of endocytosis of Trypanosoma cruzi by macrophages. Acta Tropica, 41:17-28, 1984. AVILA, H.; GONALVES, A. M.; NEHME, N. S.; MOREL, C. M. & SIMPSON, L. Schizodeme analysis of Trypanosoma cruzi stocks from South and Central America by analysis of PCR-amplified minicircle variable region sequences. Molecular Biochemistry Parasitology, 12:175-188, 1990. BERTELLI, M. S. & BRENER, Z. Infection of tissue culture cells with bloodstream trypomastigotes of Trypanosoma cruzi. Journal of Parasitology, 66:992-997, 1982. BRENER, Z. Comparative studies of different strains of Trypanosoma cruzi. Annals Tropical Medicine Parasitology, 59:19-26, 1965. BRENER, Z. Intraspecific variations in Trypanosoma cruzi: Two types of parasite populations presenting distinct characteristics. Chagas Disease. Pan American Health Organization, Scientific Publications, 347:11-21, 1977. BRENER, Z. & ANDRADE, Z. Trypanosoma cruzi e doena de Chagas. 1979. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. BRENER, Z. & CHIARI, E. Variaes morfolgicas observadas em diferentes amostras de Trypanosoma cruzi. Revista Instituto Medicina Tropical So Paulo, 5:220-224, 1963a. BRENER, Z. & CHIARI, E. Observations on the chronic phase of experimental Chagasdisease in mice. Revista Instituto Medicina Tropical So Paulo 5:128-132, 1963b. BRENER, Z. & CHIARI, E. Aspects of early growth of different Trypanosoma cruzi strains in culture medium. Journal Parasitology, 51:922-926, 1965. BRENER, Z. & CHIARI, E. The effects of some immunosuppressive agents in experimental chronic Chagas disease. Transactions Royal Society Tropical Medicine & Hygiene, 65:629-636, 1971. BRENER, Z.; GOLGHER, R. R.; BERTELLI, M. S. & TEIXEIRA, J. A. Strain-dependent thermosensitivity influencing intracellular differentiation of Trypanosoma cruzi in cell culture. Journal of Protozoology, 23:147-150, 1976. BRENIRE, S. F.; BOSSENO, M. F.; REVOLLO, S.; RIVERA, M. T.; CARLIER, Y. & TIBAYRENC, M. Direct identification of Trypanosoma cruzi natural clones in vectors and mammalian hosts by polymerase chain reaction amplification. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 46:335-341, 1992. BRISSE S.; BARNABE C.; BANULS A. L.; SIDIBE I.; NOEL S. & TIBAYRENC, M. A phylogenetic analysis of the Trypanosoma cruzi genome project CL Brener reference strain by multilocus enzyme electrophoresis and multiprimer random amplified polymorphic DNA fingerprinting. Molecular Biochemical Parasitology, 92:253-263, 1998. BRITTO, C.; CARDOSO, M.A.; MONTEIRO VANNI, C. M.; HASSLOCHER-MORENO, A.; XAVIER, S. S.; OELEMANN, W.; SANTORO, A.; PIRMEZ, C.; MOREL, C. M. & WINCKER, P . Polymerase chain reaction detection of Trypanosoma cruzi in human blood samples as a tool for diagnosis and treatment evaluation. Parasitology, 110:241-247, 1995. CAMARGO, E P . Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. 1. Origin of metacyclic trypanosomes in liquid media. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 6:93-100, 1964. CARVALHO, T. U. & DE SOUZA, W. Separation of amastigotes and trypomastigotes of Trypanosoma cruzi from cultured cells. Zeitschrift fr Parasitenkunde, 69: 571-575, 1983. CLARK, C. G. & PUNG O. J. Host specificity of ribosomal DNA variation in sylvatic Trypanosoma cruzi from North America. Molecular Biochemical Parasitology, 66:175-179, 1994. CONTRERAS, V. T.; MOREL, C. M. & GOLDENBERG, S. Stage specific gene expression precedes morphological changes during Trypanosoma cruzi metacyclogenesis. Molecular Biochemical Parasitology, 14:83-96, 1985.
192
DE SOUZA, W. Cell biology of Trypanosoma cruzi. International Review of Cytology, 86:197-283, 1984. DE SOUZA, W. Components of the cell surface of trypanosomatids. Progress on Protozoology, 3:87-184, 1989. DEANE, M. P.; SOUSA, M. A.; PEREIRA, N. M.; GONALVES, A. M.; MOMEN, H. & MOREL, C. M. Trypanosoma cruzi: Inoculation schedules and re-isolation methods select individual strains from doubly infected mice, as demonstrated by schizodeme and zymodeme analyses. Journal of Protozoology, 31:276-280, 1984. ENGMAN, D. M.; REDDY, L. V.; DONELSON, J. E. & KIRCHHOF, L. V. Trypanosoma cruzi exhibits inter- and intra-strain heterogeneity in molecular karyotype and chromosomal gene location. Molecular Biochemical Parasitology, 22:115-123, 1987. FERNANDES, O.; SOUTO, R. P .; CASTRO, J. A.; PEREIRA, J. B.; FERNANDES, N. C.; JUNQUEIRA, A. C. V.; NAIFF, R. D.; BARRET, T. B.; DEGRAVE, W.; ZINGALES, B., CAMPBELL, D. A. & COURA, J. R. Brazilian isolates of Trypanosoma cruzi from humans and triatomines classified into two lineages using mini-exon and ribosomal RNA sequences. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 58:807-811, 1998. FILARDI, L. S. & BRENER, Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma cruzi strains to drug used clinically in Chagas disease. Transactions of the Royal Society for Tropical Medicine & Hygiene, 81:755-759, 1987. FLINT, J. E.; SCHECHTER, M.; CHAPMAN, M. D. & MILES, M. A. Zymodeme and species specificities of monoclonal antibodies raised against Trypanosoma cruzi. Transactions Royal Society Tropical Medicine & Hygiene, 78:193-202, 1984. GIBSON, W. C. & MILES, M. A. The karyotype and ploidy of Trypanosoma cruzi. EMBO Journal, 5:1299-1305, 1986. GOLDBERG, S. S. & SILVA PEREIRA, A. A. Enzyme variation among clones of Trypanosoma cruzi. Journal of Parasitology, 69:9196, 1983. HABERKORN, A. & GONNERT, R. Animal experimental investigation into the activity of nifurtimox against Trypanosoma cruzi. Arzneinmittel Forschung, 22:1570-1581, 1972. HENRIKSSON, J.; ASLUND, L. & PETTERSSON, U. Karyotype variability in Trypanosoma cruzi. Parasitology Today, 12: 108-114, 1996. IOVANNISCI, D. M. & BEVERLEY, S. M. Structural alterations of chromosome 2 in Leishmania major as evidence for diploidy, including spontaneous amplification of the mini-exon array. Molecular and Biochemical Parasitology, 34:177-188, 1989. KLEIN, J. Immunology: The science of self-nonself discrimination. 1986. New York: John Wiley & Sons. KLEIN, J.; BONTROP , R. E.; DAWKINS, R. L.; ERLICH, H. A.; GYLLENSTEN, U. B.; HEISE, E. R.; JONES, P .P .; PARHAM, P .; WAKELAND, E. K. & WATKINS, D. I. Nomenclature for the major histocompatibility complexes of different species: A proposal. Immunogenetics, 31:217-219, 1990. KRETTLI, A. U. & BRENER, Z. Protective effects of specific antibodies to Trypanosoma cruzi infections. Journal Immunology, 116:755-760, 1976. LENZI, H. L.; OLIVEIRA, D. N.; LIMA, M. T. & GATASS, C. R. Pan infectivity of CL strain during murine acute infection. Experimental Parasitology, 84:16-27, 1996. MACEDO, A. M.; MARTINS, M. S.; CHIARI, E. & PENA, S. D. J. DNA fingerprinting of Trypanosoma cruzi: A new tool for characterization of strains and clones. Molecular Biochemical Parasitology, 55:147-154, 1992. MACINA, R. A.; ARAUZO, S.; REYES, M. B.; SANCHEZ, D. O.; BASOMBRIO, M. A.; MONTAMAT, E. E.; SOLARI, A. & FRASCH, A. C. C. Trypanosoma cruzi isolates from Argentina and Chile grouped with the aid of DNA probes. Molecular Biochemical Parasitology, 25:45-53, 1987. MCDANIEL, J. P . & DVORAK, J. A. Identification, isolation, and characterization of naturally-occurring Trypanosoma cruzi variants. Molecular Biochemical Parasitology, 57:213-222, 1993. MEIRELLES, M. N. L.; ARAJO-JORGE, T. C. & DE SOUZA, W. Interaction of epimastigote and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi with chicken macrophages in vitro. Parasitology, 81:373-381, 1980. MEIRELLES, M. N. L.; ARAJO-JORGE, T. C.; MIRANDA, C. F.; DE SOUZA, W. & BARBOSA, H. S. Interaction of Trypanosoma cruzi with heart muscle cells: Ultrastructural and cytochemical analysis of endocytic vacuole formation and effect upon myogenesis in vitro. European Journal of Cell Biology, 41:198-206, 1986. MEIRELLES, M. N.; CHIARI, E. & DE SOUZA, W. Interaction of bloodstream, tissue culture-derived and axenic culture-derived trypomastigotes of Trypanosoma cruzi with macrophages. Acta Tropica, 39:195-203, 1982. MELO, R. C. & BRENER, Z. Tissue tropism of different Trypanosoma cruzi strains. Journal Parasitology, 64:475-482, 1978. MILES, M. A. & CIBULSKI, R. E. Zymodeme characterization of Trypanosoma cruzi. Parasitology Today, 4:94-97, 1986. MILES, M. A.; TOYE, P . J.; OSWALD, S. C. & GODFREY, D. G. The identification by isoenzyme patterns of two distinct staingroups of Trypanosoma cruzi, circulating independently in a rural area of Brazil. Transactions Royal Society Tropical. Medicine & Hygiene, 71:217-225, 1977.
193
MILES, M. A.; SOUZA, A.; POVOA, M.; SHAW, J. J.; LAINSON, R. & TOYE, P . J. Isozymic heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first autochtonus patients with Chagas disease in Amazonian Brazil. Nature, 272:819-821, 1978. MILES, M. A.; LANHAM, S. M.; SOUZA, A. A. & PVOA, M. Further enzymic character of Trypanosoma cruzi and their evaluation for strain identification. Transactions Royal Society Tropical Medicine & Hygiene, 74:221-237, 1980. MILES, M. A.; CEDILLOS, R. A.; POVOA, M. M.; DE SOUZA, A. A.; PRATA, A. & MACEDO, V. Do radically dissimilar Trypanosoma cruzi strains (zymodemes) cause Venezuelan and Brazilian forms of Chagas disease? Lancet, 1:1338-1340, 1981. MOREL, C.M. Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by restriction endonuclease fingerprinting of kinetoplast DNA minicircles. Proceedings National Academy of Science USA, 77:6810-6814, 1980. MOREL, C. & SIMPSON, L. Characterization of pathogenic Trypanosomatidae by restriction endonuclease fingerprint of kinetoplast DNA minicircle. American Journal Tropical Medicine & Hygiene, 29 (Suppl.):1070-1074, 1980. MOREL, C.; CHIARI, E.; CAMARGO, E. P.; MATTEI, D. M.; ROMANHA, A. J. & SIMPSON, L. Strains and clones of Trypanosoma cruzi can be characterized by pattern of restricition endonuclease products of Kineoplast DNA mincircles. Proceedings National Academy of Science USA, 77:6810-6814, 1980. MOREL, C. M.; DEANE, M. P . & GONALVES, A. M. The complexity of Trypanosoma cruzi populations revealed by schizodeme analysis. Parasitology Today, 4:97-101, 1986. MOREL, C. M.; GONALVES, A. M.; SIMPSON, L. & SIMPSON, A. Recent advances in the development of DNA hybridization probes for the detection and characterization of Trypanosoma cruzi. Memrias Instituto Oswaldo Cruz, 79:51-53, 1984. READY, P. D. & MILES, M. A. Delimitation of Trypanosoma cruzi zymodemes by numerical taxonomy. Transactions of the Royal Society for Tropical Medicine & Hygiene 74:238-242, 1979. RIVERA-VANDERPLAS, M. T.; RODRIGUEZ, A. M.; AFCHAN, D.; BAZIN, H & CAPRON, A. Trypanosoma cruzi: Variation in susceptibility of inbred strains of rats. Acta Tropica, 40:5-120, 1983. ROMANHA, A. J., SILVA PEREIRA, A. A., CHIARI E. & KILGOUR, V. Isoenzyme patterns of cultured Trypanosoma cruzi: Changes after prolonged subculture. Comparative Biochemistry Physiology, 62:139-142, 1979. SCHOTTELIUS J. Differentiation between Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli by their different complement sensitivity. Tropenmedicine und Parasitologie, 33:147-150, 1986. SOLARI, A.; VENEGAS, J.; GONZALEZ, E. & VASQUEZ, C. Detection and classification of Trypanosoma cruzi by DNA hybridization with nonradioactive probes. Journal of Protozoology, 38:559-565, 1991. SOUTO, R. & ZINGALES, B. Sensitive detection and strain classification of Trypanosoma cruzi by amplification of a ribosomal RNA sequence. Molecular Biochemical Parasitology, 62: 45-52, 1993. SOUTO, R. P .; FERNANDES, O.; MACEDO, A. M.; CAMPBELL, D. A. & ZINGALES, B. DNA markers define two major phylogenetic lineages of Trypanosoma cruzi. Molecular Biochemical Parasitology, 83:141-152, 1996. STURM, N. R.; DEGRAVE, W.; MOREL, C.M. & SIMPSON, L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: Use in diagnosis of Chagas disease. Molecular Biochemistry Parasitology, 33:205-214, 1989. TARLETON, R. L. The role of T cells in Trypanosoma cruzi infection. Parasitology Today, 17:7-9, 1995. TEIXEIRA, M. M. & YOSHIDA, N. Stage-specific surface antigens of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi identified by monoclonal antibodies. Molecular Biochemical Parasitology, 18:271-282, 1986. TIBAYRENC M. Population genetics of parasitic protozoa and other microorganisms Advances in Parasitology, 36:47-115, 1995. TIBAYRENC, M.; NEUBAUER, K.; BARNAB, C.; GUERRINI, F.; SKARECKY, D. & AYALA, F. J., 1993. Genetic characterization of six parasitic protozoa: Parity between random-primer DNA typing and multilocus enzyme electrophoresis. Proceedings National Academy of Science USA, 90: 1335-1339. TIBAYRENC, M.; WARD, P.; MOYA, A. & AYALA, F. J., 1986. Natural populations of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal structure. Proceedings National Academy of Science USA, 83: 115-119. TIBAYRENC, M.; WARD, P.; MOYA, A. & AYALA, F. J., 1986. Natural populations of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas disease, have a complex multiclonal structure. Proceedings National Academy of Science USA, 83: 115-119. UMEKITA, L. F.; RAMOS, D. P . & MOTA, I. Clearance-inducing antibodies are responsible for protection against the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Brazilian Journal of Medical and Biological Research 30:1191-1197, 1997. VAGO, A. R.; MACEDO, A. M.; OLIVEIRA, R. P .; ANDRADE, L. O.; CHIARI, E.; GALVO, L. M. C.; REIS, D. D.; PEREIRA, M. E. S.; SIMPSON, A. J. G.; TOSTES, S. & PENA, S. D. J. Kinetoplast DNA signatures of trypanosoma cruzi strains obtained directly from infected tissues. American Journal of Pathology, 149:2153-2159, 996.
194
WAGNER, W. & SO, M. Genomic variation of Trypanosoma cruzi: Involvement of multicopy genes. Infection & Immunity, 58: 3217-3224, 1990. ZINGALES, B.; PEREIRA, M. E.; OLIVEIRA, R. P .; ALMEIDA, K. A.; UMEZAWA, E. S.; SOUTO, R. P .; VARGAS, N.; CANO, M. I.; DA SILVEIRA, J. F.; NEHME, N. S.; MOREL, C. M.; BRENER, Z. & MACEDO, A. Trypanosoma cruzi genome project: Biological characteristics and molecular typing of clone CL Brener. Acta Tropica, 68:159-173, 1997. ZINGALES, B.; SOUTO, R. P .; MANGIA, R. H.; LISBOA, C. V.; CAMPBELL, D. A.; COURA, J. R.; JANSEN, A. M. & FERNANDES, O. Molecular epidemiology of American trypanosomiasis in Brazil based on dimorphisms of rRNA and miniexon gene sequences. International Journal of Parasitology, 28:105-112, 1998.
195
Captulo 11
Cuidados Especiais com Animais no Biotrio de Experimentao

Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera, Celia V. P. Cardoso & Sebastio E. R. Couto
11.1 A tica na Experimentao Animal

O animal no um tubo de ensaio. um ser vivo que sente e sofre. Precisa, acima de tudo, ser tratado com respeito quando vai dar a vida e a sade para fins de experimentao cientfica. E apenas o estritamente necessrio deve ser feito com os animais. Esses princpios gerais nem sempre so seguidos e por isso, no Brasil e internacionalmente, existe um movimento crescente pela tica na experimentao animal, que procura definir uma legislao para normatizar e regular esse uso, bem como criar comits de tica apropriados para o acompanhamento, superviso e controle do cumprimento dessas regras (ver legislao no Captulo 20, Anexos). O bem-estar dos animais de laboratrio essencial, tanto para os prprios animais quanto para a validade das pesquisas, j que animais cujos estados fisiolgicos e psicolgicos so desconhecidos, ou submetidos a estresse, tornam os resultados das pesquisas no confiveis e as aplicaes mdicas deficientes. E qual o primeiro passo para conseguirmos proporcionar este ambiente de bem-estar aos animais de experimentao? , sem dvida, a educao. A falta de conhecimento, muito mais que a crueldade deliberada, a principal causa do sofrimento animal. O conhecimento da biologia, fisiologia, hbitos e necessidades da espcie que estivermos criando e/ ou experimentando faz com que saibamos como trat-los e que tenhamos uma atitude de respeito e considerao para com os animais. Assim conseguimos evitar a apreenso e o medo proveniente de um mau manejo. Devemos refletir sempre que estamos trabalhando com seres sensveis. A rotina no deve nos fazer perder a sensibilidade. Pressupe-se que qualquer pessoa que trabalhe com esses animais (desde o encarregado da higienizao at o mais prestigiado pesquisador) tenha treinamento adequado. Essa postura inicial norteia nossa perspectiva no uso de camundongos, que so o modelo mais comumente eleito para fins de infeco experimental com Trypanosoma cruzi. No Anexo (Captulo 20) inclumos os Princpios ticos na Experimentao Animal, elaborados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (Cobea), bem como verso do Anteprojeto de Lei que dispe sobre a criao e o uso de animais para atividades de ensino e pesquisa e que est tramitando no Congresso Nacional. Cada vez mais as revistas especializadas exigem dos autores o compromisso moral e formal com essas normas ticas.
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11.2
O Biotrio de Experimentao
11.2.1 O ambiente
O animal de laboratrio deve ser encarado para o experimento como um reagente biolgico. Isso significa que tudo o que o circunda pode exercer influncias diretas ou indiretas em suas caractersticas. A manuteno de condies ambientais estveis est diretamente ligada reprodutibilidade dos resultados obtidos no experimento. O local de acondicionamento dos camundongos, classificados com padro sanitrio convencional, durante a experimentao deve ser isolado (sala ou biotrio de experimentao). Nele devem ser mantidas constantes a temperatura (18 a 22C) e a umidade (45 a 55%). So precisos, no mnimo, dois aparelhos de ar refrigerado, para serem ligados alternadamente dia e noite, sempre com o sistema de exausto ligado para permitir troca de ar com o exterior. A ventilao (10 a 15 vezes/hora) deve ser adequada para a renovao regular do ar, trocas de calor e de produtos da respirao dos animais, remoo de poluentes, diluio de odores (principalmente a amnia) e disperso das partculas bacterianas. Se possvel o ar deve penetrar e sair por filtros, para que seja limpo, sem impurezas, poeiras e contaminantes. Deve haver um ciclo regular de luz (claro/escuro), de preferncia controlado por timer automtico para 12/12 horas. Os camundongos tm hbitos noturnos (alimentao, acasalamento) e ficam em estado de sono, letargia e pouca atividade nos perodos de luz. Janelas ou vidraas devem ser evitadas na sala de experimentao porque dificultam o controle de claro/escuro e apresentam um espectro mais vermelho e menos violeta que eleva a carga trmica do ambiente. Todos os tipos de estresse devem ser evitados. O ambiente deve ser calmo, sem barulho principal causa de estresse dos animais. O maior perigo representado pelos grandes rudos, estampidos, ou barulhos cadenciados (ex.: martelar de pregos, rudo de centrfugas, impressoras, etc.). O ouvido humano no um bom indicador para as condies de rudo dos animais, pois suas faixas de sensibilidade so muito diferentes. Sons agudos ou estridentes, de alta freqncia, podem ser irritantes para os animais mas no para o experimentador. J rudos graves ou de baixa freqncia podem passar desapercebidos para os animais. As atividades de rotina da sala devem ser conduzidas com o mnimo de rudo possvel. Outro fator importante de estresse a manipulao dos animais por pessoas diferentes a cada dia, pois eles reconhecem e se acostumam com os indivduos que se ocupam dos procedimentos de troca e manipulao regular. Alm disso, quem lida com os animais de experimentao deve faz-lo com cuidado e respeito. As pessoas tm odores prprios, que se somam aos odores de perfumes e desodorantes, que so reconhecidos pelos animais. Por isso, recomenda-se que toda manipulao com os animais seja feita sempre com o operador devidamente paramentado com guarda-p, luvas, mscara e gorro para promover a sua proteo e segurana, alm de diminuir o estresse dos animais com odores diversos. O biotrio de experimentao deve ter salas separadas por espcie hospedeira (camundongos, ratos, hamsters, etc.) e por agente patognico (T. cruzi, Leishmania, Toxoplasma, etc.).
11.2.2 A construo fsica

O biotrio de experimentao dever ser projetado em um ambiente mais isolado, dotado de barreiras sanitrias, impedindo a contaminao para os laboratrios, ou para o exterior. Devem existir outras barreiras seguras na sala, para evitar a fuga de animais, ausncia de ralos, piso, teto e paredes ntegras e protetores nas frestas das portas, que s devem abrir no sentido da rea no contaminada para a contaminada (ver Captulo 8).
198
11.2.3 Higienizao
a cada novo experimento toda a sala de experimentao deve ser esterilizada com vapores de formol, pelo menos
por 48 horas, com o ambiente todo vedado ou limpo com soluo desinfetante; pelo menos a cada quinze dias toda a sala (piso, paredes e estantes) deve ser limpa com soluo desinfetante base de amnia quaternria ou iodo (de acordo com a recomendao do fabricante, considerando-se ainda o agente patognico).
11.2.4 Cuidados especiais
deve haver uma sinalizao da sala, ou demarcao da rea de trabalho com T. cruzi, com aviso de ACESSO
RESTRITO (ver Captulo 8);
o equipamento de proteo (cujo uso obrigatrio) deve estar acessvel a quem for trabalhar com os animais (ver
Captulo 8);
na parte anterior porta de entrada da sala deve haver capacho para limpeza de sapatos; deve-se entrar no biotrio sempre paramentado, inclusive usando calados prprios ou sapatilhas descartveis,
para no introduzir no ambiente dos animais em experimentao microorganismos que circulam no laboratrio e na rua; todos os materiais de trabalho devem estar bem guardados para evitar que acumulem poeira.
11.3
Solicitao e Acondicionamento dos Camundongos nas Gaiolas

11.3.1 Previso da solicitao dos animais
O nmero de animais a ser utilizado no experimento dever obedecer ao planejamento experimental (ver Captulo 10), e sempre prever um percentual de mortalidade que seja o comum no modelo de trabalho escolhido. Para infectar camundongos adultos, eles devem ter no mnimo oito semanas. Seu peso nessa idade variar segundo a linhagem de camundongo escolhida para o experimento. Animais isognicos de oito semanas costumam corresponder a um peso de 18 a 20 g. J para animais no isognicos esse peso costuma ser de 22 a 24 g. O pesquisador deve enviar uma previso ao biotrio de criao e produo, relacionando espcie, cepa, sexo, idade, quantidade e o perodo de uso dos animais. Os animais devem ser solicitados ao biotrio duas semanas antes do incio do experimento (portanto duas semanas mais novos do que a idade planejada para a infeco), para serem acondicionados ao ambiente de experimentao. Ao fazer o clculo para solicitao de camundongos para o experimento deve-se levar em conta os seguintes dados: Linhagem e sexo do camundongo a ser utilizado: ________________
Grupos experimentais sexo nmero de animais/grupo data ideal de nascimento peso (g) data para chegada ao biotrio de experimentao data prevista para a infeco G1 G2 G3 Gn Total
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11.3.2 Preparo das gaiolas para os camundongos

Sempre que possvel deve-se autoclavar as gaiolas a 121C por 30 min. Quando esse procedimento no for possvel, as gaiolas devem ser limpas com detergente neutro e imersas em soluo desinfetante base de amnia quaternria ou iodo. Os bebedouros e bicos devem passar pelo mesmo procedimento que as gaiolas, podendo-se usar um sonicador no caso dos bicos.
CUIDADO: verificar se a tampa veda bem a gaiola e se no existem espaos de fuga para os camundongos. Manter todo o material limpo, bem acondicionado e separado de acordo com a espcie.
11.3.3 Rao, gua e maravalha
rao: deve ser distribuda nos comedouros na quantidade necessria para uma semana, evitando-se assim a
contaminao ambiental, sobretudo por fungos. Comumente colocado um recipiente com tampa com o volume adequado para a demanda semanal de rao que ser consumida pelo biotrio de experimentao. A rao deve ser balanceada, sem p e com prazo de validade para consumo. Um camundongo consome 10 g de rao e ingere aproximadamente de 4 a 5 g, por dia;
Obs: existem raes apropriadas para serem autoclavadas sem perda nutricional, especialmente vitaminas; se a rao comum for autoclavada, deve ser adicionado complemento vitamnico na gua. Pode-se tambm esterilizar a rao por aquecimento em forno de microondas em recipiente compatvel com esse procedimento.
gua: filtrada, clorada e acidulada (HCl, pH 3,0). Um camundongo bebe cerca de 5 ml de gua por dia (3 a 7 ml) e
excreta 1 a 3 ml de urina por dia. Os bebedouros devem ser trocados, pelo menos, uma vez por semana. imprescindvel verificar se os bicos permitem a sada da gua, se no esto entupidos ou vazando; maravalha: deve ser de boa qualidade, sem p ou pedaos de madeira, e acondicionada em saco plstico autoclavvel (tipo steril-pack), saco de papel kraft ou saco de tecido de algodo para ser autoclavada em pores suficientes para as trocas peridicas (semanais ou a cada dois ou trs dias, a depender do nmero de animais por gaiola).
Obs: toda e qualquer substncia ou material envolvido no microambiente ou na alimentao dos animais deve ser submetido ao mais rigoroso controle de qualidade (fsico, qumico e microbiolgico) de que se possa dispor.
11.3.4 Acondicionamento dos camundongos nas gaiolas

A separao dos animais nas gaiolas deve ser aleatria, colocando-se um animal de cada vez em cada uma das gaiolas previstas para o experimento. Nas gaiolas pequenas (20 x 30 x 12 cm) pode-se acondicionar at dez animais e nas grandes (30 x 45 x 12 cm) at vinte, nesse caso com mais de um bebedouro. Os camundongos devem ser pesados, individualmente, para se obter grupos de animais com peso homogneo.
11.3.5 Ficha de identificao da gaiola

As fichas de identificao das gaiolas devem ser preparadas antes do experimento (sobretudo antes da infeco) e devem conter: o nmero da gaiola, o experimento e seu responsvel, dados acerca dos animais como cepa, sexo, idade, peso, nmero de animais e acompanhamento da mortalidade, e dados sobre a inoculao como parasito, cepa, via, nmero de parasitas. Cuidados especiais devem ser tomados quanto manuteno dessas fichas nas gaiolas, evitando-se eventuais trocas ou extravio das mesmas. Recomenda-se o uso de um envelope plstico para proteo das fichas dos respingos de gua e da penetrao de poeira para permitir plena legibilidade. O Anexo (Captulo 20) traz modelos para a confeco de fichas.
200
11.3.6 Esquema de troca das gaiolas

Deve-se trocar uma gaiola de cada vez, para se evitar a mistura das fichas de identificao. A troca deve ser regular e normalmente ocorre duas ou trs vezes por semana. Procedimentos
preparo de gaiola limpa com maravalha autoclavada; transferncia e contagem dos animais; conferncia do nmero de animais da gaiola, com o nmero marcado na
ficha de identificao;
transferncia da ficha de identificao da gaiola; transferncia da tampa com comida e gua (completar a rao e a gua quando necessrio); autoclavao das gaiolas sujas no estado em que se encontram; remoo completa da maravalha suja da gaiola, j autoclavada, para um saco de lixo apropriado; quando no for possvel a autoclavagem das gaiolas sujas, todo o material sujo deve passar pelo procedimento de
desinfeco qumica (ver Captulo 8).
11.3.7 Identificao do camundongo: vista dorsal

A identificao individual dos animais permite que os dados obtidos possam ser correlacionados. Nos animais albinos, de pelagem branca, o mais simples a marcao por pintura com soluo aquosa de cido pcrico saturada. Nos animais de pelagem colorida necessria a marcao por cortes ou perfuraes nas orelhas. No Anexo (Captulo 20) h um exemplo de marcao dos animais com o esquema proposto pela OPAS. Na Tabela 1 indicamos o esquema por ns utilizado. No Anexo temos outros esquemas de identificao individual dos animais.
Tabela 1 Esquema sugerido de marcao de animais

Nmero do animal Pintura com cido pcrico (camundongos brancos) Linha crnio-dorsal Orelha direita (OD) Orelha esquerda (OE) Pata dianteira direita (PDD) Pata dianteira esquerda (PDE) Pata traseira direita (PTD) Pata traseira esquerda (PTE) Dorso Cauda, base Todo branco Perfuraes ou chanfraduras das orelhas (camundongos brancos, pretos ou cinzas) 1 pique na orelha direita (OD) 1 pique na orelha esquerda (OE) 2 piques OD 2 piques OE 3 piques OD 3 piques OE 1+2 1+4 1+6 sem corte
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Outros nmeros: combinaes dos nove primeiros, dois a dois ou trs a trs
11.3.8. Anlise dos animais antes da infeco

No basta apenas a solicitao dos animais. Outros detalhes so importantes antes do dia da infeco: pesagem e marcao prvia dos animais, coleta de sangue para anlise do perfil hematolgico e para a separao de plasma anterior data da infeco, entre outros, que esto descritos com detalhes nos Captulos 12 e 13, pois so procedimentos que garantem tanto o agrupamento de animais com caractersticas semelhantes como a obteno de dados prvios infeco, para posterior comparao.
201
11.4
Cuidados com a Biossegurana no Descarte de Carcaas
As normas de biossegurana referentes ao descarte das carcaas de animais infectados devem ser de conhecimento de todos os que circulam pelo biotrio de experimentao (ver Captulo 8). Destacamos: os animais mortos, infectados, NO devem ser descartados no lixo comum; aps o sacrifcio dos animais, coloc-los em sacos plsticos bem vedados e inciner-los; se o incinerador localizar-se longe do biotrio, ou da sala de experimentao, as carcaas devem ser autoclavadas, ou sofrer outro processo de esterilizao, antes de serem levadas ao incinerador, para evitar qualquer contaminao no percurso; quando a incinerao no for possvel, proceder autoclavao das carcaas ou abrir os animais, expondo todas as vsceras, e mergulh-los em soluo de formalina a 4% por, pelo menos, 12 horas. Selar em saco plstico para, somente ento, desprez-los no lixo comum; as gaiolas sujas dos animais devem ser autoclavadas ou imersas em soluo desinfetante, por pelo menos 4 horas, e depois lavadas com detergente neutro e novamente esterilizadas ou desinfetadas. A maravalha usada deve ser ensacada e incinerada ou autoclavada, antes do descarte. Atualmente utilizamos o seguinte o protocolo de descarte de carcaas de camundongos infectados:
Os animais, aps sangria ou disseco, so formalizados (tratamento qumico para desinfeco), colocados em sacos plsticos pretos (de lixo) e recobertos com formalina a 4%. O saco vedado e levado ao recipiente de descarte de animais, localizado na capela de exausto da sala central do departamento. Aps 24 horas de contato com o formol, o saco com os animais pode ser descartado no lixo comum do prdio.
LUCA, R. R.; ALEXANDRE, S. R.; MARQUES, T.; SOUZA, N.L.; MERUSSE, J. L. B. & NEVES, S. P . Manual para tcnicos em bioterismo. 1996. So PauIo: CB/USP . FUNDAO OSWALDO CRUZ Manual para tcnicos em animais de laboratrio. 1994. Rio de Janeiro: CPNEMB/DEBI/BM. POOLE, T. B. The UFAW handbook on the care and management of laboratory animal. 1986. Harlow, Essex: Longman, 6th edition. LANE-PETTER, W. & PEARSON, A. E. G. The laboratory animal - principles and practice. 1971. London, New York: Academic Press.
202
Captulo 12
Controle da Qualidade dos Animais antes da Infeco Experimental

Celia V. P. Cardoso, Marcos Antonio P. Marques, Tania C. Arajo-Jorge, Solange L. de Castro & Maria Teresa Rivera
12.1
Padres de Qualidade
Quanto mais eficientes forem as barreiras sanitrias do biotrio, menores as chances de contaminao dos animais. Em funo das barreiras disponveis, podemos classific-los em trs grupos, de acordo com seu padro sanitrio, ou seja, quanto microbiota (conjunto de formas de vida associadas, ou seja, vrus, bactrias, fungos e parasitos).
Convencionais ou holoxnicos: animais que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente
desprovido de barreiras sanitrias rigorosas.
Livres de patgenos especficos (specific pathogen free/SPF): animais que no apresentam microbiota capaz de lhes
determinar doenas, ou seja, albergam somente microorganismos no patognicos. Sua criao e/ou manuteno realizada em ambientes protegidos por barreiras sanitrias rigorosas e tambm em isoladores. Gnotobiticos: animais que possuem microbiota associada definida e devem ser criados e/ou mantidos em ambientes dotados de barreiras sanitrias absolutas (isoladores). Em funo da quantidade de microbiotas associadas ao animal, este pode ser classificado em Axnico ou germ free: totalmente livre de microbiota Monoxnico: contaminado deliberadamente com um tipo de microbiota Dixnico: contaminado deliberadamente com dois tipos de microbiota Polixnico: contaminado deliberadamente com vrios tipos de microbiota. A maioria dos biotrios de criao e produo faz controle sanitrio dos animais e fornece o resultado de seus exames. Ao final deste captulo, encontra-se, em anexo, a traduo de um certificado de sade animal usado pelo biotrio da Rockfeller University, para uma doao de animais trangnicos em 1996 (Anexo 12.1). Mesmo que eles indiquem que os animais so livres de patgenos especficos, recomendado que se faa uma rechecagem em uma amostra dos animais recebidos para confirmao dos dados e para se evitar qualquer risco de contaminao. Animais com padro microbiolgico desconhecido devem ser considerados como infectados e devem ficar em quarentena, buscando-se identificar a presena ou no de algum microorganismo indesejvel no biotrio de experimentao. O Ministrio da Agricultura controla toda a entrada de animais no pas; no Anexo 12.2 est um formulrio padro de requerimento para autorizao de importao de animais. Quanto mais padronizado o animal for, melhor a reproduo do experimento nele realizado. A monitorizao desses padres necessria no somente em biotrios de criao e produo, como tambm nos biotrios de experimentao. O estado de sade dos animais tem que ser redefinido nas instalaes de uso dos mesmos, em intervalos regulares, depois de recebidos do biotrio de origem. Durante a experimentao ani203
mal s sero obtidas informaes seguras se houver um controle sanitrio sistemtico e cuidadoso nos biotrios de experimentao com controle de qualidade dos animais. Esse controle sanitrio vai depender do objetivo da pesquisa, das condies de alojamento (convencional, sob barreiras, isoladores ou microisoladores), do tempo de durao do experimento, da freqncia de introduo de animais e outros materiais biolgicos, da importncia do patgeno especfico, ou mesmo da probabilidade de interferncia com a pesquisa. Alm das consideraes relativas ao bem-estar dos animais, o principal alvo da monitorao sanitria antes e durante os experimentos definir as condies de sade dos animais para se avaliar a presena ou ausncia de certos microorganismos, leses e outras alteraes como variveis experimentais. Convm lembrar que a maioria das infeces em roedores subclnica, podendo ocorrer modificaes nos resultados dos experimentos devido a infeces naturais com ausncia de doena clnica. Da ser essencial a preveno de infeces e no apenas a preveno da doena. Outros fatores exgenos, como por exemplo o meio ambiente, podem influenciar na susceptibilidade dos animais pesquisa (ver Captulo 11). A introduo de animais e outros materiais biolgicos, particularmente quando de origem externa, exige a monitorao do ambiente para prevenir a introduo de agentes transmissveis que possam influenciar na sade do homem (agentes zoonticos), ou de outros animais, ou nos resultados dos experimentos. comum que mais pessoas tenham acesso aos biotrios de experimentao do que aos de criao, o que aumenta o risco de introduo de infeces por pessoal. A adoo de sistemas adequados de entrada, atravs de barreiras sanitrias, deve ser enfatizada para se manter o risco mnimo aceitvel. O emprego de um programa de animais sentinelas pode garantir a monitorao dos animais durante os experimentos de longa durao, como por exemplo, a avaliao da fase crnica da infeco por Trypanosoma cruzi. Os animais sentinelas so aqueles obtidos de colnias de criao de padro microbiolgico conhecido, introduzidos numa populao de animais em experimentao, onde atuaro como vigilantes substitutos daquela populao. Como regra geral, o controle sanitrio mais eficaz usando-se animais da mesma espcie e cepa da populao residente. Devem ser submetidos a um minucioso exame antes de serem introduzidos nas salas dos animais em experimentao. E devem ter pelo menos dez semanas de idade, e mantidos dentro da sala por, no mnimo, quatro semanas. Os exames realizados nos sentinelas so os mesmos adotados no controle sanitrio dos biotrios de criao e produo.
12.2
Avaliao Geral dos Animais antes da Infeco
Genericamente um animal saudvel aquele que no apresenta sinais ou sintomas de quaisquer doenas genticas, neoplsicas, degenerativas, associadas ao desenvolvimento, nutricionais, txicas ou infectocontagiosas, de forma aguda ou crnica. O animal sadio tem funes normais, se alimenta, procria, ativo e no estressado. Espera-se sempre obter um animal nestas condies. Nas duas semanas de adaptao dos animais s condies ambientais da sala de experimentao, devem ser adotados outros procedimentos para garantir a sua higidez.
12.2.1 Inspeo geral

Para avaliao de leses de pele, anotar as anormalidades e descartar os animais que apresentarem sinais de ferimentos ou leses. Prolapso de reto evidente pode indicar infeces intestinais por diferentes agentes. Prurido excessivo pode indicar presena de infestaes por ectoparasitas, especialmente sarna.
204
12.2.2 Pesagem e avaliao de idade

O cuidado de pesar todos os animais antes do experimento, alm de permitir maior homogeneidade na populao a ser utilizada, possibilita tambm a avaliao indireta de sua idade. aconselhvel que ao se escolher certa linhagem gentica de camundongos, proceda-se ao estudo da curva de evoluo ponderal dos dois sexos naquela cepa nas condies locais do experimento. Um exemplo pode ser observado para camundongos Swiss e C57BL/6 na Tabela 1 e na Figura 1. Tabela 1 Evoluo ponderal em camundongos Swiss e C57BL/6 *
Idade semanas Machos Mdia 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 13,0 18,0 21,0 23,1 25,6 26,0 27,4 28,1 28,7 29,3 nd nd nd nd 2sd 2,0 3,0 3,2 3,2 3,6 3,8 3,4 3,0 3,6 3,8 nd nd nd nd Swiss Fmeas Mdia 12,9 16,0 18,0 19,1 19,5 20,0 20,8 22,0 22,3 22,6 nd nd nd nd 2sd 2,0 2,2 2,2 2,0 2,0 1,8 2,0 2,0 2,2 2,2 nd nd nd nd Machos Mdia 12,1 14,4 18,9 19,4 20,2 21,8 22,7 23,6 24,2 24,7 25,5 25,7 25,7 25,6 2sd 2,8 2,2 3,2 4,0 4,4 4,8 4,8 5,4 5,4 5,2 5,2 5,0 5,2 5,4 C57BL/6 Fmeas Mdia 9,3 10,4 14,4 16,3 17,3 18,0 18,8 19,9 20,9 21,6 22,4 22,6 22,6 22,3 2sd 2,6 4,2 4,6 3,8 3,0 3,0 2,4 2,2 2,2 2,4 3,2 3,0 3,2 2,8
* Resultados obtidos no Depto. de Ultra-estrutura e Biologia Celular, IOC
Evoluo Ponderal - Cam undongos Sw iss 35 30 25 peso (g) 20 15 machos 10 5 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 idade em sem anas fmeas
10 5 2 35 30 25 peso (g) 20 15
Evoluo Ponderal - Cam undongos C57BL/6
machos fmeas 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 idade em sem anas
Figura 1 Evoluo ponderal de camundongos Swiss e C57BL/6. As barras representam dois desvios-padro (correspondem a 95% da populao)
205
12.3
Dados Hematolgicos e Sorolgicos
A coleta de sangue por um dos mtodos que no impliquem sacrifcio do animal (ver Captulo 13), ou seja, sangria pela cauda ou por puno do plexo orbital, possibilita a anlise de dados hematolgicos (leucometria e hematcrito) que podem ser bastante teis para a avaliao do grau de higidez da populao a ser ensaiada, e a excluso de animais que apresentem algum tipo de anormalidade no momento da infeco. De rotina, deve-se preparar um esfregao sangneo (para avaliao da distribuio do percentual leucocitrio). Colhem-se 5 ml de sangue total heparinizado para hematimetria e leucometria (contagem de hemcias na diluio de 1/50.000, e para contagem de leuccitos na diluio de 1/500), e ainda um capilar com cerca de 60 l de sangue que ser centrifugado para medida do hematcrito e obteno de plasma. O plasma pode ser congelado para dosagem posterior de todos os parmetros bioqumicos (por exemplo protenas de fase aguda, citocinas ou enzimas indicadoras de leso tissular) e sorolgicos (por exemplo, dosagem de diversos isotipos de imunoglobulinas totais e especficas) de interesse ao experimento.
12.3.2 Contagem diferencial de leuccitos

A contagem diferencial dos leuccitos tem por finalidade estabelecer o valor percentual de cada tipo de leuccito no sangue circulante, para depois, conhecendo-se o total de leuccitos circulantes, conhecer-se o total de cada tipo de leuccito. Para isso, utiliza-se um esfregao de sangue perifrico feito da amostra colhida para o hemograma. O esfregao corado (ver adiante) e examinado ao microscpio com objetiva de imerso a leo (100 X). A melhor regio do esfregao para contagem aquela mais prxima de seu final, chamada de cauda. O examinador deve estabelecer um padro para correr a lmina, em movimentos verticais ou horizontais, mas tomando o cuidado de no passar mais de uma vez sobre a mesma rea. Conta-se cem clulas, anotando-se o tipo de cada uma, utilizado-se contadores mecnicos ou eltricos. Procedimento
preparar o esfregao; corar pelo mtodo Panptico de Pappeinheim (May-Grunwald-Giemsa), com kit comercial Pantico Rpido
LB (Laborclin) cinco imerses (1 segundo cada) seqenciais nas trs solues do kit; lavar com gua deionizada; secar ao ar; soluo no 1: triarilmetano 0,1% (nocivo ao organismo); soluo no 2: xantenos 0,1%; soluo no 3: tiazinas 0,1%; contar cem leuccitos ao longo de toda a lmina.
12.3.3 Leucometria (contagem do nmero de leuccitos)

A identificao de leucocitose um parmetro essencial para a avaliao das condies de sade do animal antes e durante a infeco experimental. A contagem facilmente feita e deve ser um procedimento de rotina. O sangue diludo na proporo de 1:20 com lquido diluidor de Turk, que hemolisa as hemcias e cora o ncleo dos leuccitos pelo azul de metileno. Material
pipeta de 1 ml graduada a 0,01 ml frasco tipo penicilina com tampa de borracha papel de filtro ou algodo
206
cmara de Neubauer conta-gotas ou tubo capilar microscpio

Procedimento
pipetar 0,4 ml do lquido diluidor no frasco de penicilina; adicionar ao frasco 20 l de sangue. A diluio de 1:20; agitar suavemente por 1 min; encher o retculo da cmara de Neubauer com conta-gotas ou tubo capilar, deixando repousar por 1 min para
sedimentao das clulas; focalizar a preparao com pequeno aumento no microscpio para observar a distribuio uniforme dos leuccitos; fazer a contagem de todos os leuccitos encontrados nos quadrados laterais da cmara de Neubauer, ou seja, 0,4 mm2; aps a soma das contagens dos leuccitos, multiplicar o resultado obtido por 50.
12.3.4 Hematimetria (contagem do nmero de hemcias)

A contagem de hemcias pode ser dispensada, pois o valor do hematcrito j fornece um bom indicador da presena ou no de anemia nos animais, dado mais importante para o descarte ou no de animais antes do experimento.
12.3.5 Hematcrito
Tambm conhecido como volume globular, o hematcrito mede a relao entre os glbulos vermelhos e o plasma. Em outras palavras, mede a percentagem do sangue ocupada por eritrcitos. Valores abaixo do normal indicam anemia; acima, indicam poliglobulia. Descreveremos abaixo a tcnica do microhematcrito por ser de maior rapidez e utilizar uma pequena quantidade de sangue. Procedimento
homogeneizar a amostra, e em seguida encher de sangue aproximadamente do tubo capilar; fechar uma das extremidades. Para isso, h duas maneiras: coloca-se o dedo indicador sobre a extremidade sem
sangue, para evitar vazamento e introduz-se o tubo alguns milmetros em massa de modelar; ou encosta-se a extremidade sem sangue numa chama, fechando o tubo a fogo; colocar o tubo na centrfuga apropriada e rodar conforme indicado pelo fabricante do aparelho (geralmente, 5 min); fazer a leitura na tabela de leitura de microhematcrito.
12.3.6 Parmetros hematolgicos normais obtidos para camundongos Swiss

Os dados da Tabela 2 podem ser utilizados como indicativos para camundongos, mas devem ser repetidos com a cepa a ser utilizada como modelo experimental. Referem-se a camundongos Swiss utilizados em um trabalho desenvolvido no INCQS/Fiocruz, em 1988.
207
Tabela 2 Hemograma completo

Srie branca parmetro Leuccitos totais/mm3 Linfcitos (%) Neutrofilos (%) Moncitos (%) Basfilos (%) Eosinfilos (%) Basto (%) Srie vermelha parmetro Peso (g) Hematcrito (%) Hemceas/mm3 Hemoglobina (g%) VGM (m3) HGM (mmg) CHGM (%) Machos (n = 40) Intervalos normais1 3500 a 9500 76,1 a 81,0 18,1 a 23,0 3a4 0 0a1 0a1 Machos Intervalos normais 1 32,1 a 36,0 46,0 a 51,0 5.106 a 7.106 12,0 a 13,9 48,0 a 53,0 16,0 a 20,0 29,0 a 34,0 Fmeas (n = 48) Intervalos normais 5.000 a 8.000 72,0 a 77,0 16,0 a 21,0 3a4 0 0a1 0a1 Fmeas Intervalos normais 26,1 a 30,0 44,1 a 51,0 5.106 a 7. 106 12,1 a 15,0 57,1 a 68,5 18,1 a 22,0 35,1 a 39,0
n=11 e 39 n=11 e 16 n=11 e 16 n=11 e 16 n=11 e 16
n: nmero de animais analisados; 1 intervalo de maior freqncia
FEDERATION OF EUROPEAN LABORATORY ANIMAL SCIENCE ASSOCIATIONS (FELASA). FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig and habbit breeding colonies. Laboratory Animals 28:1-12, 1994. FEDERATION OF EUROPEAN LABORATORY ANIMAL SCIENCE ASSOCIATIONS (FELASA). FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, gerbil, guinea pig and rabbit experimental units. Laboratory Animals 30:193208, 1996. INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES. Committee on Infectious Diseases of Mice and Rats. Infectious Diseases of Mice and Rats. 1991. Washington DC: National Academy Press. LUCA, R. R.; ALEXANDRE, S. R.; MARQUES, T.; SOUZA, N. L.; MERUSSE, J. L. B. & NEVES, S. P . Manual para tcnicos em bioterismo. 1996. So Paulo:ICB/USP .
208
Anexo 12.1
Exemplo de certificado de sade usado por biotrio na Rockfeller University, USA

Traduo: Relatrio de Vigilncia de Sade de Roedores Centro de Pesquisa em Animais de Laboratrio, Box 2 Av. York 1230 (64a. e York), New York, New York, 10021-6399 (212) 327-8534
PAINEL DE SADE: (realizado a cada dois meses para cada sala de roedores) inclui: Virologia: (Sorologia - ELISA); vrus sendai, vrus de hepatite de camundongos (MHV), vrus minuto de camundongos (MVM) e coriomeningite linfoctica de camundongo (LCM), GD V11, diarria epizotica de camundongos infantis (EDIM), vrus de pneumonia de camundongo (PVM), ectromelia, vrus polioma, vrus K, adenovrus de camundongo (Maden), Reo 3 Parasitologia: ectoparasitas artrpodes, endoparasitas helmnticos Microbiologia: Mycoplasma pulmonis (Sorologia - ELISA)
Resultados - Sala 302 Painel principal (oito vrus) (out./dez.) / Painel estendido (12 vrus) (fev.)
Ms Out 1995 Dez 1995 Fev 1996 Sorologia Negativo Negativo Negativo Parasitologia Negativo Negativo Negativo
Sala: 302 Ms: outubro, dezembro 1995, fevereiro 1996 Cepa sentinela: CD-1 (Charles Rivers) Sexo: fmea Seis camundongos sentinelas so colocados em gaiolas sem tampa e disseminados em cada sala nas diferentes estantes e expostos rao de diferentes gaiolas contendo animais agrupados por idade, cada qual numa gaiola. Trs camundongos so sacrificados para avaliao sentinela. Comentrios Estes camundongos (Chau-Ching Liu) foram recentemente transferidos da sala 302 para as alas 228 A e B, que foram positivas para PVM em junho de 1995. Os camundongos originalmente vieram da Universidade do Sudeste da Califrnia e tinham uma histria de positividade sorolgica para MVM. Desde junho de 1995 estes animais estiveram SPF para os patgenos mencionados. Foi feito um teste direto dos camundongos desta colnia que foram enviados a outras instituies e foi tambm demonstrado o estado SPF. Durante o ltimo ano houve uma tentativa audaciosa de tornar as instalaes centralizadas do biotrio inteiramente SPF, pela implementao de procedimentos SPF estritos atravs de todas as salas de roedores com gaiolas de microisolamento e cmaras de fluxo laminar utilizadas, bem como seguindo os movimentos dos animais de acordo com seu estado de sade. Alm disso, todas as instalaes foram tratadas por vrios meses com ivermectina para traas e cupins e nossos sentinelas foram basicamente negativos no ltimo ano. Todas as salas de camundongos na colnia primria em todo o prdio no presente momento tiveram pelo menos trs avaliaes de sade negativas consecutivas (num perodo de seis meses). Uma vez que os resultados destes testes so de animais sentinelas e no de testes diretos nos animais que sero embarcados, sempre aconselhvel uma quarentena nos animais quando do recebimento e um teste diagnstico nas suas prprias instalaes antes de introduzi-los numa colnia SPF. Assinado: Patologista Responsvel
209
Anexo 12.2
Formulrio padro para requerimento de importao de animais

Ao Ministrio da Agricultura Secretaria de Produo Animal (SPA) Secretaria de Defesa Sanitria (SDSA) REQUERIMENTO DE AUTORIZAO DE IMPORTAO DE ANIMAL VIVO, SMEM, EMBRIES E OVOS FRTEIS (exceto para eqdeos)
Senhor secretrio da SDSA/Senhor secretrio da SPA Solicito autorizao para importao da mercadoria adiante caracterizada, de acordo com o disposto na Resoluo Concex no 149/87 e na Portaria no 49/87 do Sr. ministro da Agricultura, para o que prestamos as informaes que se seguem: 1. IMPORTADOR Nome: ______________________________________________ (instituio) Endereo: ___________________________________________ Cidade: _____________Estado: _______ CEP: _________ Telefones: _______________ (Dr. __________________, pesquisador responsvel ) (Dr. __________________, veterinrio responsvel) (Sr. ___________________, funcionrio do servio de importao) 2. CARACTERIZAO DA MERCADORIA A SER IMPORTADA Espcie: __________ (camundongos) Quantidade: ______ Finalidade: [ ] Reproduo [ ] Abate [ ] ______________ No caso de smen ou embrio: [ ] Comercializao [ ] Uso em rebanho prprio Pas de procedncia: ________ Pas de trnsito: _________ Exportador: _______________________________________________________ (nome do estabelecimento e localizao) 3. TRANSPORTE Meio de transporte: _________ Local de embarque: _________ No caso de transporte areo: [ x ] vo de linha regular, misto ou carga [ ] vo fretado (charter) Local de preferncia para desembarque: Rio de Janeiro, RJ 4 . DESTINO DOS ANIMAIS Estabelecimento: ______________________ - _____________________ (instituio) (laboratrio) _____________________________________________ (setor) Endereo: _________________________________________________ Municpio: ________________ Estado: _______ 5. LOCAL PARA REALIZAO DE QUARENTENA OU ISOLAMENTO E PREMUNIO (quando requerida) Estabelecimento: ______________________ - _____________________ (instituio) (laboratrio) ______________________________________________ (setor)
210
Endereo: _____________________________________________ Municpio: ________________ Estado: _________ Veterinrio responsvel: ___________________ Endereo: ______________________________ Telefone: _______________ Fax: ____________ 6. DOCUMENTOS ANEXOS ( ) Fatura proforma ( x ) Certificado de registro genealgico e/ou genealogia, com dados oficiais de desempenho zootcnico dos genitores, de performance individual e/ou da prognie ( x ) Relao dos animais ( ) Licena de importao do IBDF (original + quatro cpias) ( ) Licena de importao da Sudepe (original + quatro cpias) 7. CONTATO PARA ESCLARECIMENTOS E OUTROS FINS ( x ) O importador ( x ) Outro - Nome: ___________________________ Endereo: _____________________________________________ Cidade: _____________ Estado: ___ CEP: _________ Telefone: ____________ Fax: ___________ E-mail: ________
__________________________________ (Local e data)

Assinatura do importador ou seu representante autorizado
211
DECLARAO INSTITUCIONAL Declaramos que a _________________(Instituio) est importando matrizes das linhagens isognicas de camundongos (Mus musculus) abaixo relacionadas, que se destinam a reproduo para expanso de uma colnia dessa cepa, de modo a produzir o nmero de animais necessrios para a realizao de experimentos de _____________________(natureza dos experimentos), no laboratrio _____________________(identificao do setor usurio). Esses animais se caracterizam por ______________________(descrever o tipo de animal, deficincias genticas, etc.) e sero utilizados para_____________________ (objetivo do trabalho). Sero portanto usados exclusivamente em atividades de pesquisa bsica, em experimentos que visam a elucidar ______________________________. Informamos que os animais so certificadamente isentos de doenas especficas de roedores, portanto em perfeito estado de higidez, e que o Laboratrio ___________________ (local de destino dos animais), onde sero mantidos os animais, possui instalaes adequadas para o desenvolvimento de trabalhos com animais de laboratrio, propiciando a obteno de resultados confiveis na pesquisa biomdica. Especificao dos animais Linhagem Quantidade Sexo Obs.
______________________________ Local e data _______________________________________ Assinatura do responsvel na instituio
212
Traduo CENTRO DE PESQUISA DE ANIMAIS DE LABORATRIO UNIVERSIDADE _____________ Endereo: _______________________________________________________
Certificado de Sade Animal Embarque de animais Data: ____________ De: Pesquisador cedente : _______________________ Universidade/Instituio : ________________________ Endereo : ___________________________________ Para: ________________ ________________ ________________ Contedo embarcado: Nmero 3 3 Espcie camundongo camundongo Cepa C57BL6 C57BL6 Sexo fmeas machos Cor preta preta
Declarao de sude dada pelo veterinrio: os animais descritos acima foram examinados e encontram-se em aparente boa sade e visualmente livres de evidncia de doenas transmissveis de significado de sade pblica. Estes animais so destinados a uso somente em pesquisa. Estes animais ou seus produtos no podem ser usados para fins comerciais.
Assinado: Diretor do Biotrio cedente Problemas com o embarque? Por favor, chame o Departamento de Servios Veterinrios pelos tels. __________
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Captulo 13
Sangria de Animais e Preparo de Inculos para Infeco Experimental

Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera, Solange L. de Castro & Marcos Antnio P . Marques
13.1
Mtodos de Sangria
Tanto para a anlise hematolgica dos animais antes da infeco (ver Captulo 12) como para se obter o sangue que ser usado no preparo do inculo, pode-se proceder tanto por sangria total do animal infectado, por puno cardaca, como por sangria parcial, pela cauda ou plexo orbital. O sangue dever ser colhido em anticoagulante e diludo em soluo salina fisiolgica. USAR LUVAS, MSCARA E GUARDA-P DE MANGAS COMPRIDAS
13.1.1 Sangria pela cauda

Objetiva preparar lmina para contagem de parasitemia, esfregao para contagem leucocitria, medida do hematcrito e coleta de plasma. Material
caixa de conteno do animal tesoura de ponta fina e afiada algodo capilares heparinizados para microhematcrito e borracha de suco do capilar massa plstica para vedao do capilar suporte plstico para capilar com marcao milimetrada lminas de vidro para esfregao sangneo fsforos tubos de microcentrfuga caneta de diamante centrfuga de microhematcrito caixas de descarte de material com as solues desinfetantes apropriadas.
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Procedimento
identificar os capilares, as lminas e os tubos que sero utilizados para o recolhimento de sangue dos diferentes
camundongos;
colocar o camundongo na caixa de conteno, com a cauda para fora; com uma das mos, massagear a cauda no sentido da base para a ponta e segurar na ponta; com a tesoura na outra mo, cortar 1 mm ou menos da ponta da cauda; recolher uma gota para o preparo de esfregao, que deve ser feito imediatamente por uma segunda pessoa. Caso
seja feita a contagem de hemceas ou leuccitos basta recolher uma gota do sangue sobre placa de Petri que ser ento utilizada para o procedimento de diluio e contagem; segurar a cauda do animal com as duas mos e tornar a repetir o massageamento da base para a ponta, at aparecer nova gota, que ser recolhida no capilar heparinizado (ateno: a ponta do capilar que contm a heparina geralmente marcada com vermelho). Basta encostar a ponta heparinizada do capilar na cauda do animal e o sangue transferido naturalmente para o seu interior; colocar o capilar horizontalmente sobre o suporte milimetrado e repetir o procedimento do item quinto acima (recolher uma gota para o preparo do esfregao...) at encher o capilar do volume necessrio (cada mm de capilar corresponde a 1 l de sangue); ao final, colocar verticalmente o capilar sobre a massa plstica para ved-lo; cauterizar a cauda do camundongo com fsforo; centrifugar o capilar em centrfuga de microhematcrito; ler o hematcrito contra rgua prpria ou rgua simples de marcao milimetrada, caso o volume retirado seja menor que 70 l de sangue; colocar o capilar sobre um suporte e riscar com a caneta diamante logo acima do creme leucocitrio; quebrar o capilar em suas partes de plasma e clulas e transferir o plasma para um tubo de microcentrfuga, com o bulbo apropriado; congelar o plasma para anlises posteriores. No caso de trabalho com animais infectados, ao invs de vedar o capilar verte-se o sangue diretamente num tubo de microcentrfuga para a contagem de parasitas e o preparo da diluio do inculo. Pode-se colher tambm diretamente o sangue no tubo de microcentrfuga, mas para que no coagule necessrio molhar a ponta da cauda com anticoagulante (heparina).
13.1.2 Sangria por puno do plexo orbital

Nos pequenos animais de laboratrio a puno de uma veia delicada, no permitindo a retirada de uma quantidade considervel de sangue e difcil a sobrevida do animal quando obtemos uma quantidade significativa de sangue. prefervel recorrer tcnica preconizada por Hoffmann, que consiste em puncionar o plexo orbital existente nos mamferos, entre o glbulo ocular e o fundo da cavidade orbitria. Material
tubos capilares heparinizados tubos de microcentrfuga colrio anestsico (cloridrato de proximetacana 0,5%)
Procedimento
a conteno do animal realizada pela regio cervical, de modo que automaticamente provoque uma estase
venosa na regio ceflica, provocando a exteriorizao do glbulo ocular;
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Sangria de Animais e Preparo de Inculos para Infeco Experimental
aps a exteriorizao do glbulo ocular deve-se instilar uma pequena gota do colrio anestsico; introduzir o tubo capilar verticalmente entre o glbulo ocular exposto e o fundo da cavidade orbitria; realizar uma ligeira presso acompanhada de movimentos de rotao do tubo capilar;
Obs: assim que o plexo orbital puncionado, o sangue preenche espontaneamente o tubo capilar. O relaxamento da presso exercida sobre a regio cervical, utilizada para conter o animal, faz cessar consideravelmente o fluxo sangneo.
transferir o sangue recolhido para um tubo de microcentrfuga, previamente identificado.

Obs: a tcnica de puno do plexo orbital pode ser novamente realizada 72 h aps a primeira puno.
13.1.3 Sangria por puno cardaca

Material
placa de cortia com quatro agulhas para fixao do animal cmara de anestesia (vidro de boca larga, com tampa, e algodo no fundo) ter etlico para anestesia tubos de microcentrfuga pissete com lcool seringas de 1 ml com agulhas de ponta fina e curta (13X4,5) anticoagulante (heparina ou citrato de sdio 3,8%) caixas de descarte de material com as solues desinfetantes apropriadas
Procedimento
colocar o camundongo infectado na cmara anestsica; preparar a seringa com anticoagulante enquanto o animal est sendo anestesiado: 0,1 ml de citrato de sdio
3,8% para cada 3 ml de sangue ou molhar a seringa com heparina; fixar o camundongo na placa, em posio de cruz; segurar a seringa com a mo direita (para dextros) e puncionar sobre o terceiro espao intercostal (esquerdo) do camundongo; inserir a agulha de modo a perceber a perfurao da pele e do pericrdio;
Obs: o sangue jorrar assim que a agulha estiver dentro do ventrculo esquerdo do corao.
aspirar lentamente com o embolo at completar 1 ml; retirar a seringa, descartar a agulha no recipiente apropriado e colocar o sangue no tubo de microcentrfuga; sacrificar o animal, caso no tenha ocorrido sua morte, atravs de overdose do anestsico ou por deslocamento
cervical;
descartar o animal em saco plstico mergulhando-o em formol 4%.
13.2
Inoculao
13.2.1 Escolha da via de inoculao
Diversas vias de inoculao podem ser usadas para a infeco por Trypanosoma cruzi, sendo mais comuns a subcutnea (SC) e a intraperitoneal (IP). Todas do o mesmo resultado, com alguma diferena na cintica da parasitemia. A infeco tambm se transmite por inculo via oral, mas no h muitos estudos comparando a resposta usando diferentes vias com diferentes modelos experimentais.
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13.2.2 Clculo e preparo do inculo

Inculo/animal
mnimo: 102 (prximo ao fisiolgico) mdio: 103 a 104 alto: 105 a 108
Material
soluo estoque de parasitas diluente: soluo salina fisiolgica (NaCl 0.85%), Alsever, etc. seringa de 1 ml
Preparo do inculo intraperitoneal
Obs: recomenda-se dobrar o volume necessrio para se trabalhar com folga.
Exemplo: para infeco de vinte animais com 104/animal em 200 ml, necessita-se de 4 ml (vinte animais x 200 ml) (utilizar o dobro, 8 ml, como dito acima) de um inculo na concentrao de 5.104/ml
sendo, por exemplo, a soluo estoque de parasitas = 40.105 parasitas/ml, deve-se diluir esta suspenso frmula para diluio V1N1 = V2N2 vol x 400.104 = 8 x 5.104 vol = 0,1 ml preparo da diluio = 0,1 ml da sol. estoque de parasitas + 7,9 ml diluente
Obs: no caso de inoculao SC, os clculos devem ser feitos para um volume de 100 ml, ou seja, 104/animal em 100 ml, necessitandose de 4 ml (utilizar o dobro 8 ml, como dito acima) de um inculo na concentraao de 10 x 104/ml.
CARVALHO, W. F. Tcnicas Mdicas de Hematologia e Imunohematologia. 1983. Cooperativa Editora e de Cultura Mdica, Ltda. GARCIA-NAVARRO, C. E. K. & PACHALY, J. R. Manual de Hematologia Veterinria. 1994. Editora Vanela. HOFFMANN, G. Les animaux de laboratoire. 1963. Paris: Vigot Frres. RULIER, J. & PARODI, A. Laboratoire et diagnostic en Mdicine Vterinaire. 1968. Paris: Vigot Frres.
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Captulo 14
Avaliao de Parmetros Parasitolgicos e de Mortalidade

Solange L. de Castro, Tania C. Arajo-Jorge, Maria Teresa Rivera & Angela C. V. Junqueira
A deteco de parasitas no sangue perifrico a prova definitiva da infeco pelo Trypanosoma cruzi. A identificao individual da parasitemia, positiva ou negativa, patente ou subpatente, bem como sua quantificao, alm de consistirem na prova parasitolgica diagnstica concreta da infeco, podem indicar o grau de equilbrio em que se encontra a relao parasita-hospedeiro, refletindo a infectividade da cepa de parasita, o grau de parasitismo tissular e a intensidade do efeito da resposta imune especfica articulada contra o parasita. No estudo experimental, alm da anlise individual, os parmetros de percentual de mortalidade ou sobrevida cumulativa, tempo de sobrevida e tempo para mortalidade de metade dos animais, permitem uma medida do grau de resistncia de uma dada populao de hospedeiros a uma dada cepa de parasitas, ou o efeito de uma terapia ou imunoterapia.
14.1
Parasitemia Direta em Camundongos Infectados com T. cruzi
O acompanhamento da parasitemia dos camundongos infectados indispensvel tanto para se fazer a passagem da cepa do T. cruzi para sua manuteno em animais no laboratrio, como para inferir a modulao da infeco por diferentes tratamentos. Vem sendo utilizada desde os primeiros trabalhos experimentais em doena de Chagas. Inicialmente qualitativa (positividade ou negatividade de encontro do parasita em gota espessa ou esfregao sangneo, tal como feito para humanos at hoje), passou a parmetro semiquantitativo, expresso em cruzes ou em parasitas por campo microscpico, e foi posteriormente padronizada para expresso em nmero de parasitas por ml de sangue (Pizzi et al., 1998). A parasitemia um parmetro individual, colhido a partir da anlise de cada um dos animais do grupo experimental, e que pode ser expressa em razo do tempo (curva de cintica de parasitemia) ou em razo de seu nvel mximo (parasitemia mxima). Com um mnimo de seis animais pode-se trabalhar com as mdias ou medianas obtidas em cada grupo. Como os valores de parasitemia comumente no apresentam distribuio normal, o tratamento estatstico dos dados obtidos , em geral, feito atravs de mtodos no paramtricos, ou ento por mtodos paramtricos (teste t, qui-quadrado ou anlise de varincia) sobre o logaritmo calculado com os dados originais (ver Captulo 19). No Captulo 20 temos um modelo de coleta de dados de parasitemia e no Captulo 19 um exemplo de elaborao de planilha para clculo de parasitemia pelo mtodo de Pizzi-Brener e tambm por contagem em cmara de Neubauer.
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USAR LUVAS, MSCARA E GUARDA-P DE MANGAS COMPRIDAS Material
caixa de reteno do animal ponteiras descartveis em suporte apropriado tesoura de ponta fina e afiada micropipeta para 5 l placa de Petri com tampa fsforos algodo lminas (ou cmaras de Neubauer) soluo de lise de hemceas: cloreto de amnia a 0.85% em gua lamnulas de 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm frasco lavador com lcool microscpio ptico tubos de microcentrfuga (ou microplaca com tampa) com soluo de lise caixas de descarte de material com as solues desinfetantes apropriadas
Mtodo de Pizzi-Brener
colocar o camundongo infectado na caixa de reteno, com a cauda para fora; com uma das mos, massagear a cauda no sentido da base para a ponta e segurar na ponta; com a tesoura na outra mo, cortar 1 mm ou menos da ponta da cauda deixando o sangue correr formando uma
gota. Sobre a placa de Petri, colocar a primeira gota, que ser desprezada (ou utilizada para fazer uma lmina de esfregao sangneo), e colocar a seu lado a segunda gota. Manter a cauda do camundongo segura at que seja cauterizada; deixar a tesoura sobre algodo embebido em lcool e pegar a micropipeta com ponteira para 5 l; tomar 5 l da segunda gota que est sobre a placa de Petri e deposit-la sobre a lmina e desprezar a ponteira na cuba apropriada. Imediatamente recobrir com a lamnula, deixando espalhar naturalmente o sangue sem qualquer presso. Se o espalhamento no ficar bom, repetir o procedimento em outra lmina; acender um fsforo e tocar com a base da chama (no com a ponta) no ponto de corte da cauda do animal at cauterizar. Soltar ento o camundongo; desprezar o fsforo num vidro apropriado, com cuidado para no encostar em nada que contenha lcool; levar ao microscpio, sob objetiva de 40x, e contar o nmero de parasitas mveis em cinqenta campos aleatoriamente observados, cobrindo toda a rea da lamnula; calcular o nmero de parasitas por ml de sangue de acordo com o procedimento descrito no item 14.2; no caso de parasitemias muito altas (maior que trinta) parasitas por campo), pode ser feita uma diluio inicial em soluo de lise. Nesse caso, deve-se preparar o tubo eppendorf com o volume apropriado de soluo de lise: 20 l ou 45 l, respectivamente para uma diluio de 1/5 ou 1/10 (p/5 l de sangue). Em todos os casos fundamental definir qual a diluio utilizada, para correo posterior do nmero de parasitas.
Obs: pode-se utilizar cmaras de Neubauer para a contagem. Nesse caso encher a cmara com o sangue diludo e hemolisado, contar os quatro quadrantes, calcular a mdia do nmero de parasitas por quadrante e multiplicar pela diluio e pelo fator da cmara (104).
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Clculo do nmero de parasitas/ml

Os parasitas sero quantificados em nmero de parasitas/campo microscpico, observados por toda a rea da lamnula. Portanto, essa rea vai diferir com lamnulas de dimenses diferentes. Alm disso, o aumento com que o material ser observado depender do jogo de lentes, assim, a rea do campo dever ser calculada para cada microscpio. Ao final, ser preciso aplicar um fator de multiplicao para que aquele nmero mdio observado por campo seja extrapolado para toda a rea da lamnula (que corresponde ao volume de 5 l de sangue adicionado), corrigido pela diluio e extrapolado para 1 ml (200 x).
Clculo do fator de correo

Procedimento 1. Medir o dimetro (d) do campo microscpico com o qual se vai fazer as contagens. Utilizar para isso uma lmina micromtrica colocada na platina do microscpio ou ento uma objetiva micromtrica. 2. Calcular a rea de um campo microscpico observado
rea do campo observado Ac = r2 mm2 exemplo d= X mm r= d/2 mm = 3,14 0,42 mm 0,21 mm Ac= 0,138474 mm2 rea da lamnula Al = lado2 mm2 tamanhos de lamnula 18 x 18 mm Al = 324 mm2 20 x 20 mm Al = 400 mm2
3. Calcular a concentrao de parasitas no sangue (usar fator de correo): por exemplo para a lamnula de 20 x 20 mm sob objetiva cujo campo microscpico mede 0,42 mm de dimetro Sendo n = no de parasitas contados em cinqenta campos, calcular sucessivamente: n = no de parasitas em 1 campo (corresponde a rea Ac = 0,138474 mm2) (n = n /50) n = no de parasitas em toda a lamnula (corresponde a rea Al = 400 mm2) n parasitas = n x 400 = n x 2888,6289 = n x 2,89 x 103 0,138474 Obs: n corresponde ao nmero de parasitas totais na lamnula em um volume de 5 l
n = concentrao de parasitas, i.e., no de parasitas em 1.000 l (como temos o nmero em 5 l, para calcular
parasitas no volume de 1.000 ml 200 x maior (temos que multiplicar por 200) n = n x 200 = n x 2,89 x 103 x 200 n = n x 578 x 103 = n x 57,8 x 104
assim, o fator = 57,8 x 104 (s vlido para aquele microscpio onde foi contada a lmina), com a mesma
objetiva mesmo aumento no qual foi medida a rea do campo, para lamnula 20 x 20 e para um volume de sangue 5 l) desta forma, basta multiplicar o nmero de parasitas/campo por 57,8 e teremos a concentrao de parasitas no sangue expressa em 104 parasitas/ml uma vez calculado o fator de multiplicao a ser usado, pode-se construir uma tabela para anotao direta do valor absoluto na planilha de coleta de dados (ver Captulo 20).
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Se a amostra de sangue tiver sido diluda, multiplicar ainda pela diluio: Exemplo: contagem de duzentas parasitas em cem campos, amostra diluda 1:20
Parasitas em 50 campos 200 Parasita/campo 4 Parasita/ml (104 p/ml) 4 x 57,8 x 20 = 46,24
(fator = 57,8.104)
Parasita/ml (106 p/ml) 46,2
4. Expressar em logaritmo de base 10 Exemplo: log10 46,2.106 = 6 + log10 46.1 = 6 + 1,664 = 7,664
14.2
Parasitemia por Amplificao Parasitria: Hemocultura, Xenodiagnstico e PCR
Mtodos indiretos como a hemocultura e o xenodiagnstico so os procedimentos mais utilizados para a avaliao parasitolgica em situaes de baixos nveis de parasitemia, especialmente em humanos ou em animais experimentais submetidos quimioterapia ou imunoterapia. Como a evidenciao do parasita, atravs de testes parasitolgicos, a forma definitiva de caracterizao da infeco ativa, devido escassez de tripomastigotas circulantes, estes mtodos indiretos so necessrios tanto na fase aguda assintomtica como nas fases indeterminada e crnica. Na fase aguda da doena, quando sintomtica, a deteco do parasita relativamente fcil e pode ser realizada pelo exame direto do sangue. praticamente consenso que se adote mais de um procedimento tcnico no isolamento e/ou deteco do T. cruzi tanto em indivduos nos quais se suspeita a infeco, bem como em animais experimentalmente infectados e reservatrios. Os parmetros parasitolgicos indiretos mais empregados so o xenodiagnstico (Brumpt, 1914) e a hemocultura (Freitas, 1947). Mais recentemente introduziu-se a denominada reao em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction - PCR), que consiste na sntese enzimtica, in vitro, de milhes de cpias a partir de um segmento especfico de DNA do parasita (Saiki et al., 1985; Mullis & Faloona, 1987). A seguir sero descritas essas trs tcnicas empregadas com mais freqncia no diagnstico e isolamento do T. cruzi em amostras biolgicas. Para a realizao da tcnica de hemocultura, devido aos excelentes resultados obtidos por Chiari et al. (1979) e de Luz et al. (1994a,b), tem-se adotado o procedimento bsico destes autores.
14.2.1 Hemocultura
Material
frasco de meio LIT para lavagem micropipeta para 10 l tubos com meio LIT (5, 15 ou 50 ml) ponteiras descartveis em suporte apropriado sangue heparinizado do animal ou paciente recolhido em tubo de centrfuga lminas centrfuga clnica lamnulas de 20 x 20 mm ou 18 x 18 mm cmara de fluxo laminar caixas de descarte de material com as solues desinfetantes apropriadas
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estufa incubadora B.O.D. (biochemical oxygen demand) a 28oC frasco lavador com lcool pipetas Pasteur estreis microscpio ptico
Meio de cultivo Utilizar o meio liver infusion tryptose (LIT) formulado por R. Yaeger e introduzido por E. P. Camargo (Camargo, 1964). Este meio rico em componentes e tem apresentado bons resultados no cultivo de formas sangneas de T. cruzi (ver Captulo 10)(Chiari et al., 1979; Luz et al., 1994a,b). Aps a filtrao, o meio aliquotado em tubos de vidro refratrio com tampa de rosca ou em frascos plsticos estreis; sendo dois frascos submetidos prova de esterilizao, um lote fica no laboratrio para ser empregado na rotina de cultivo de amostras do T. cruzi e o restante estocado a 4C at o momento do uso. Para cada amostra a ser testada deve-se prever seis tubos de cultura. Obteno do sangue
no caso de camundongo, promover a sangria por puno do seio orbitrio (Kimura, 1993). No caso de pacientes, coletar em condies asspticas 30 ml de sangue venoso de cada indivduo, atravs de tubo vacutainer contendo heparina sdica ou outro anticoagulante; no mesmo dia da coleta, o volume obtido de sangue dever ser centrifugado em uma centrfuga clnica a 2.500 rpm por 15 min. Processo de cultivo Todo o procedimento deve ser realizado dentro de uma capela de fluxo laminar ou em uma sala assptica que contenha bico de Bunsen, para evitar contaminao no momento da retirada do plasma e da lavagem da papa de hemceas com o meio de cultura. aps a centrifugao do sangue, retirar o plasma, que aproveitado para sorologia, e adicionar camada de hemceas e leuccitos igual quantidade de meio LIT; promover-se uma nova centrfugao a 2.500 rpm por 20 min; a seguir, remover o sobrenadante, e distribuir o sedimento (hemcea e leuccitos) em seis tubos, contendo 2 ml de LIT, ou em dois tubos de plstico (50 ml) com 6 ml de meio; transferir os tubos semeados para uma estufa incubadora B.O.D. regulada a 28C; os tubos devem ser homogeneizados uma vez por semana. Perodo e forma de leitura
realizar a leitura retirando-se alquotas de 10 l da suspenso de cada tubo e examinando-as aos 45, 60, 90 e 120
dias aps o cultivo, entre lmina e lamnula, ao microscpio tico binocular com aumento de 400x;
aps a ltima leitura, os tubos que permanecerem negativos devem ser centrfugados a 2.500 rpm por 15 min para
que o sedimento seja reexaminado (Bronfen et al., 1989);
independente da comprovao de T. cruzi em um tubo, a pesquisa do parasita deve continuar sendo efetuada
nos outros tubos provenientes do mesmo sangue, com objetivo de avaliar indiretamente a parasitemia no animal.
14.2.2 Xenodiagnstico
Este teste parasitolgico ainda muito empregado em humanos e animais sob suspeita de atuarem como
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reservatrios. Material
ninfas de III ou IV estgio do triatomneo escolhido (cinco ou dez para cada caixa, a depender do uso em
animais ou humanos, respectivamente) caixas de madeira para os triatomneos se alimentarem frascos para manuteno das ninfas aps a alimentao soluo anestsica para o animal em estudo galinha para alimentao dos insetos aos 23 dias aps o teste material de disseco (duas pinas, tesoura e basto de vidro, lminas escavadas) lminas lamnulas de 22 x 22 mm soluo de PBS 0,01M micropipeta de 5 ml ponteiras descartveis em suporte apropriado caixas de descarte de material com as solues desinfetantes apropriadas frasco lavador com lcool microscpio ptico Espcie de triatomneo empregada No existe um consenso sobre qual ou quais espcie(s) vetora(s) devam ser empregadas no xenodiagnstico. Nossa experincia tem demonstrado bons resultados na utilizao da espcie Panstrongylus megistus, como tambm a importncia na aplicao de uma segunda espcie, devido diferena de susceptibilidade ao parasita entre os diferentes vetores, bem como aumento da sensibilidade (CNPq, 1974; Junqueira et al., 1989a,b; Pereira et al., 1996). Aplicao de ninfas
escolhida a espcie, separar quarenta ninfas de III ou IV estgio, deixar as mesmas em jejum de duas a
trs semanas, e acondicion-las em quatro recipientes de madeira cobertos com fil na parte superior, conforme proposto por Schenone et al. (1968), e colocar sobre a face interna do antebrao de cada indivduo durante 30 min (Schenone et al., 1968; Salgado, 1969; Cerisola et al., 1974; CNPq, 1974); no caso de animais de pequeno porte, como por exemplo camundongo e cobaia, este nmero deve ser reduzido para cinco exemplares; aconselha-se tambm imobilizar os mesmos atravs de uso de mesa de conteno apropriada ou anestesi-los com ketamina ou cloridrato de tiletamina associada com cloridrato de zolazepam. Aconselha-se a mesma conduta para macacos; verificar o nmero de ninfas que se alimentaram em cada recipiente, antes de transferi-las para frascos maiores, desprezando aquelas que no ingerirem sangue. Considerar como ninfas alimentadas somente aquelas que, atravs da observao, apresentarem abdome distendido, independente da intensidade. Conforme Freitas (1947), deve-se conservar para o exame apenas os exemplares que sugaram sangue, independente da quantidade sugada; at o momento da leitura do xenodiagnstico, manter os triatomneos a temperatura e umidade ambientes. Aos 23 dias, contados a partir da aplicao, submet-los a uma nica alimentao em Gallus gallus (galinha). Segundo Dias (1933, 1940b), essa alimentao importante para a manuteno do T. cruzi no vetor. Tambm Perlowagora-Szumlewicz & Muller (1982, 1987,1988, 1990) demonstraram que a alimentao adicional com sangue de ave domstica, aps a infeco inicial, foi capaz de aumentar a densidade parasitria em cinco das oito espcies de triatomneos testadas.
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Leitura
do xenodiagnstico
o exame das ninfas (Figura 1) deve ser realizado aos 30 e 60 dias ou apenas uma leitura aos 45 dias aps a
aplicao dos exemplares (Salgado, 1969; Perlowagora-Szumlewicz & Muller, 1987);
obter fezes dos triatomneos por compresso abdominal. Observar inicialmente o pool de fezes obtidas de duas a trs
espcimes e, em caso positivo, verificar atravs de um novo exame individual, o nmero de exemplares positivos
as ninfas do pool de fezes em que no se detectar formas de T. cruzi devem ser reexaminadas individualmente,
dessa vez por disseco total de seu trato digestivo. O procedimento de disseco consiste na retirada de todo o trato digestivo, com auxlio de duas pinas e uma tesoura, e no seu maceramento, empregando-se um basto de vidro; cada contedo biolgico (fezes e trato digestivo) obtido depositado sobre uma lmina, qual acrescenta-se 5 l de salina tamponada, pH 7,2, e cobre-se com lamnula 22 x 22 mm (Figura 1); essa leitura em duas fases permite que se preserve para estudos posteriores os triatomneos que apresentem de incio o contedo fecal positivo e, por sua vez, a disseco torna possvel detectar formas de T. cruzi que no estejam sendo eliminadas nas fezes (Salgado, 1969; Fuente et al., 1985). Em reas endmicas onde ocorra concomitantemente a espcie T. rangeli recomenda-se o exame da hemolinfa para diagnstico diferencial; proceder a leitura ao microscpio ptico binocular com um aumento de 400x, percorrendo todos os campos em busca de formas evolutivas do T. cruzi.
1
Figura 1 Exame individual pela tcnica de disseco de um triatomneo
14.2.3 PCR (diagnstico molecular)

Devido sua alta sensibilidade dentre as tcnicas propostas, a PCR contribui de forma importante na deteco desse protozorio na fase crnica da doena de Chagas. A reao de PCR tem sido empregada com sucesso na deteco do T. cruzi em triatomneos e camundongos (Moser et al., 1989), em sangue (Sturm et al.,
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1989) e soro (Russomando et al., 1992) de pacientes chagsicos. O segmento alvo de DNA do parasita tem sido o DNA genmico ou o DNA cinetoplstico. Em ambas as circunstncias, enfocam-se os segmentos altamente repetidos no DNA do parasita, o que amplia muito as chances de deteco do T. cruzi, ou parte de seu DNA nos materiais biolgicos.
Mtodo 1: Iniciadores para amplificar um segmento de kDNA
Na Fiocruz, vrios laboratrios tm trabalhado em epidemiologia da doena de Chagas em diversas regies do Brasil como Minas Gerais, Paraba, Piau e Amazonas. Em todas essas regies, dados de diagnstico molecular foram obtidos atravs da tcnica de PCR, amplificando-se a regio varivel da molcula de minicrculo, um dos componentes da rede de DNA mitocondrial deste protozorio (Figura 2). A escolha deste alvo foi proposital, uma vez que essa regio se encontra repetida quatro vezes por molcula circular e estas esto presentes em cerca de 10.000 cpias por clula (Degrave et al., 1988; Sturm et al., 1989).
Figura 2 Representao esquemtica do minicrculo de Trypanosoma cruzi, mostrando a disposio simtrica das quatro regies constantes (retngulos sombreados) e as duplas de oligonucleotdeos iniciadores especficos para PCR
O protocolo que se segue foi introduzido por Britto et al. (1993, 1995a,b) e Wincker et al. (1994a,b, 1997) e empregado para amplificao do DNA de T. cruzi em amostras de sangue e material fecal de triatomneo; fezse uso tambm do procedimento em amostras de lquor, cultura e fragmento mumificado de tecido. o protocolo em uso atualmente no Depto. de Medicina Tropical do IOC. Material
tubos de polipropileno para coleta de sangue com soluo de guanidina-EDTA placa de aquecimento a 70oC frasco com gua deionizada banho-maria a 100oC com gua fervente aparelho de PCR DNA Thermal Cycler 480 (para os ciclos trmicos) soluo de fenol-clorofrmio 1:1 (v/v) tampo Taq Polymerase 10x soulo de clorofrmio saturado Mg Cl2 25 mM soluo de acetato de sdio a 3M nucleotdeo dATP 10 mM
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etanol absoluto nucleotdeo dCTP 10mM recipiente de isopor com gelo modo para banho de gelo nucleotdeo dGTP 10mM nucleotdeo dTTP 10 mM congelador a -20oC oligonucleotdeos121 100 ng/l micropipeta para 100, 10 e 5 l oligonucleotdeos 122 100 ng/l ponteiras descartveis em suporte apropriado prolas de parafina purificada microcentrfuga tubos para microcentrfuga cuba de eletroforese pequena enzima Taq Polymerase 2,5 U marcador de peso molecular x174 DNA Hae III agarose NUSieve GTG solues tampo para eletroforese agarose SeaKem GTG FMC fonte de eletroforese Tris azul de bromofenol cido brico glicerol EDTA brometo de etdeo transiluminador UV com sistema fotogrfico
Coleta da amostra a ser amplificada
a amostra transferida para um frasco de polipropileno contendo igual volume da soluo de 6 M guanidina
HCl + 200 mM EDTA (cido etilenodiaminotetractico) pH 8,0. No caso da mostra ser sangue de indivduo suspeito, retirar 10 ml por puno venosa, com auxlio de vacutainer sem anticoagulante e homogeneizar em um tubo contendo 10 ml de guanidina-EDTA. Este volume dever ser reduzido no caso de animais de pequeno porte; a soluo guanidina-EDTA permite que o sangue possa ser estocado por um prazo de trinta dias em temperatura ambiente, at o momento de ser transferido para o laboratrio onde ser processado (Avila et al., 1991). Estocar o material a 4C at a etapa seguinte. Isolamento do DNA do sangue coletado Tem-se utilizado como alvo vrias seqncias de DNA do parasita para a PCR. Neste protocolo a estratgia de amplificao so os minicrculos da rede de kDNA, que existem em grande quantidade, cerca de 5-20 x 103 minicrculos de 1,42 Kb (kilobases) por T. cruzi (Degrave et al., 1988; Sturm et al., 1989). Esse elevado nmero e a presena nas seqncias de nucleotdeos de regies conservadas minirrepetidas permitem que apenas 0,1% dos minicrculos contidos em um nico parasita seja suficiente para a visualizao aps a PCR (Sturm et al., 1989).
227
Clivagem fsica Com objetivo de promover a linearizao e conseqente liberao dos minicrculos concatenados na rede de kDNA (Britto et al., 1993), os tubos contendo sangue + guanidina-EDTA devero ser parcialmente imersos em gua e fervidos por 15 minutos. Extrao
realizar em duplicata, a partir dessa etapa, todos os procedimentos, e a cada srie de cinco amostras extradas, incluir um
sangue de indivduo comprovadamente negativo. Isso permite um monitoramento da presena de contaminantes durante as etapas da PCR (Wright & Wynford-Thomas, 1990; Kitchin & Bootman, 1993); para a extrao do DNA de cada amostra de sangue fervido, retirar duas alquotas de 100 l. Cada alquota dever ser submetida a um processo de desproteinizao empregando fenol-clorofrmio na proporo de 1:1 (v/v); clorofrmio saturado; precipitar a fase aquosa obtida, acrescentando-se 10% de acetato de sdio a 3 M (300 mM de concentrao final), mais dois volumes de etanol e deixar 15 min em banho de gelo; passado esse tempo, centrifugar (centrfuga modelo 5415C, Eppendorf ou similar) o volume total a 12.000 rpm por 15 min; desprezar o sobrenadante e colocar o tubo contendo o sedimento sobre uma placa de aquecimento, regulada para 70C, por um perodo suficiente para que evapore toda a parte lquida (gotculas de etanol) (normalmente 5 min so suficientes); ressuspender o sedimento em 50 l de gua deionizada (Sambrook et al., 1989) e estocar a -20C at o momento da amplificao. Amplificao do DNA extrado No caso de se utilizar o procedimento hot start, reao de amplificao in vitro, os componentes qumicos empregados devero ser adicionados em duas fases, com uma separao fsica entre elas promovida por uma prola de parafina especialmente formulada pela Perkin-Elmer Cetus Instruments (USA). A qualidade desse procedimento est em promover uma melhor especificidade e preciso das amplificaes realizadas em amostras com baixas concentraes de seqncias-alvos, evitando a hibridizao de iniciadores (primers) e as seqncias no-alvo (mis-priming), bem como a extenso de primers complementares que tendem a se hibridizar um ao outro (primer dimerization), gerando um produto amplificado inespecfico (Chou et al., 1992). Pr-amplificao Antes dos ciclos trmicos, os reagentes da reao so adicionados em duas fases:
1 fase ou fase inferior
As quantidades fornecidas a seguir e na prxima fase correspondem a valores empregados em apenas uma reao de amplificao, ou seja, 7,5 l de DNA ressuspendido. em um tubo de microcentrfuga, acrescentam-se os seguintes produtos
l H2O deionizada Tampo Taq Polymerase 10x Mg Cl2 25 mM Nucleotdeo dATP 10 mM Nucleotdeo dCTP 10mM Nucleotdeo dGTP 10mM Nucleotdeo dTTP 10 mM Oligonucleotdeos 121 100 ng/l Oligonucleotdeos 122 100 ng/l Total 11,3 4,0 13,5 1,8 1,8 1,8 1,8 2,0 2,0 40,0
228
aps homogeneizao, transferir os 40l da mistura anterior para um tubo apropriado, que possibilita a troca
rpida de temperatura, e introduzir uma prola de parafina purificada (Ampliwax PCR Gem 100 - PerkinElmer); a seguir, com a finalidade de liqefazer a parafina, incubar o tubo a 80C durante 5 min com auxlio de uma placa de aquecimento; deixar o tubo esfriar a temperatura ambiente at a parafina se solidificar. Utilizar os oligonucleotdeos 121 (5'-AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA-3') e 122 (5'GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA-3') que apresentam a caracterstica de se ligarem em um trecho das quatro regies constantes dos minicrculos de T. cruzi e promoverem a amplificao em direo regio varivel (Sturm et al., 1989) (Figura 3). Desta forma, a variabilidade gentica das seqncias de minicrculos das populaes de T. cruzi no interfere na hibridizao dos oligonucleotdeos.
2 fase ou fase superior
em outro tubo de microcentrfuga adicionar os trs ltimos componentes da reao

l H2O deionizada Tampo Taq Polymerase 10x Enzima Taq Polymerase 2,5 U Total 23,5 3,5 0,5 27,5
promover a mistura dos elementos e a seguir transferir os 27,5 l totais para o tubo que j contenha a fase
inferior e a camada de ampliwax. A este acrescentar 7,5 l de DNA ressuspendido.
Figura 3 Deteco de DNA por gel de agarose. O DNA foi extrado de amostras de sangue de indivduos de rea endmica para doena de Chagas com sorologia positiva (linhas 7 a 11). M = marcadores de peso molecular; NO DNA e (-) so controles negativos; (+) weak, strong so controles positivos fraco e forte reatores
3
Ciclos trmicos
introduzir os tubos, contendo os componentes das fases 1 e 2, no aparelho modelo DNA Thermal Cycler 480 (PerkinElmer Cetus Instruments ou similar), programado para seguir os seguintes ciclos de temperatura e tempo
Dois ciclos iniciais 33 ciclos intermedirios Um ciclo final 98C 64C 94C 64C 72C 1' 2' 1' 1' 10'
229
Nestas condies de amplificao, a hibridizao dos oligonucleotdeos iniciadores e a extenso da fita de DNA se processam entre as temperaturas de 64 e 94C e no mesmo espao de tempo, encurtando, com isso, a reao de amplificao para o tempo de 2h10m. A temperatura mnima de 64C cria uma situao de alta estringncia, permitindo que os primers se liguem a seqncias totalmente complementares. Isso conduz a uma alta especificidade da reao. O ltimo ciclo, de 10 minutos de durao, tem como objetivo complementar produtos de parcial extenso (Rofls et al., 1992). Controle A cada srie de cinco amplificaes em duplicata, inclumos duas alquotas de amostras comprovadamente negativas (previamente relatado no item Extrao) e mais duas positivas. A incluso dessas amostras de sangue ou de outro material biolgico, comprovadamente negativas, possibilita um controle rigoroso da contaminao, uma das maiores limitaes do emprego da PCR como mtodo de diagnstico. Por outro lado, os controles positivos servem para avaliar a qualidade dos reagentes (Wright & Wynford-Thomas, 1990) e do prprio processo de extrao, como tambm estimar a qualidade da reao pela intensidade relativa das bandas. Para detectar a presena de contaminantes nos componentes da reao, introduziu-se no protocolo um tubo contendo a fase inferior e superior, mas sem produto extrado (Wright & Wynford-Thomas, 1990; Erlich et al., 1991). Visualizao do produto de reao Para a separao e posterior identificao dos fragmentos de base resultantes da amplificao, empregar a tcnica de eletroforese em gel de agarose NUSieve, por ser mais prtica do que em gel de poliacrilamida alm de apresentar uma resoluo na faixa de peso molecular a ser visualizada (Moser et al., 1989; Avila et al., 1991, 1993). Eletroforese
em uma pequena cuba de eletroforese (modelo Submarine mini-gel - Sigma ou similar), adicionar 200 ml de
agarose (uma parte de agarose NUSieve GTG, e outra parte de agarose SeaKem GTG - FMC BioProducts) a 2% (Mullis et al., 1986); aps solidificao da agarose, banhar a mesma em tampo TBE 1x (tris-cido brico, EDTA) pH 8,3 e a seguir introduzir as alquotas a serem corridas; a ordem de aplicao dever ser a seguinte; na primeira canaleta: 15 l do marcador de peso molecular x174 DNA Hae III (Sigma) nas canaletas seguintes: 15 l de cada amostra + 2 l do corante azul de bromofenol; aps ocupar todas as canaletas, promover uma corrida de aproximadamente 1h30min a 70V (volts), utilizando uma fonte com duas entradas e duas sadas.
Obs: tampo de aplicao: 0,25% azul de bromofenol + 0,25% xileno-cianol FF + 30% glicerol em gua.
Revelao
corar o gel por 15 min sob um misturador (Rocker Platform RP-50 Elmeco ou similar) temperatura ambiente
em 5 g/ml de brometo de etdeo diludo em tampo TBE 1x e descorar por mais 15 min em gua destilada; passado esse tempo, transferir o gel para um transiluminador de luz ultravioleta e o fotografar para futura anlise (sistema fotogrfico marca Polaroide).
Obs: a visualizao de uma nica banda de peso molecular 330 pb indicar a presena de kDNA de T. cruzi amplificado, PCR positiva (Sturm et al., 1989).
230
Amplificao do DNA da -globina Nos casos em que a amostra biolgica apresentar PCR negativa, realizar uma nova amplificao, empregando iniciadores especficos para o gene da -globina humana. Essa nova amplificao permite controlar a qualidade da extrao do DNA e saber se o resultado negativo no devido a fatores inibitrios presentes no sangue (Rolfs et al., 1992). Utilizar o mesmo protocolo citado nas etapas anteriores, exceto os oligonucleotdeos que sero substitudos por PCO3 (5'-ACACAAACTGTGTTCACTAGC-3') e PCO4 (5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3') (Saiki et al., 1985). O nmero de ciclos trmicos tambm dever ser alterado para 25. Cuidados a serem tomados durante a execuo da tcnica de PCR Vrios procedimentos devero ser seguidos para evitar a contaminao das amostras submetidas a PCR (Wright & Wynford-Thomas, 1990; Sarkar & Sommer, 1990; Kitchin & Bootman, 1993):
executar o isolamento e a amplificao do DNA em capela (Tamer Template Tm 14500 - Coy Corporation ou
similar) e cmara de fluxo laminar (modelo 10557 - EACI ENVIRCO - Environmental Air Control Inc. ou similar) individualizadas; empregar materiais de consumo novos (no reciclados); distribuir os reagentes em pequenas alquotas, includo o kit com a enzima; utilizar apenas ponteiras protegidas com uma barreira de filtro; empregar tubos de microcentrfuga (modelo Safe-lock de 1,5 ml e 0,5 ml - Eppendorf ou similar) que apresentem um sistema de lacre para evitar extravasamento das amostras durante a homogeneizao; todo o material permanente, incluindo os aparelhos, devero ser limpos com hipoclorito de sdio e submetidos luz ultravioleta. Utilizar as lmpadas ultravioletas (UV) do aparelho Stratalinker (modelo 1800 Stratagene) para degradao de DNA exgeno. De preferncia processar todas as etapas em salas com sistema de UV no teto; durante toda a execuo da tcnica, usar luvas, que devero ser trocadas e descartadas a cada amostra processada realizar o manuseio do produto amplificado em uma sala em separado, com equipamentos tambm individualizados e geralmente por um profissional que no tenha trabalhado na extrao e preparao dos reagentes; na etapa da pr-amplificao, todos os tubos com os reagentes devero ser deixados em banho de gelo at o momento de serem introduzidos na mquina de amplificao.
Mtodo 2: Amplificao de fragmento de DNA nuclear
Extrao de DNA
isolamento de DNA de sangue total ou de soro de paciente chagsico; a 100 l de soro adicionar 200 ml de gua destilada, 50 ml de sarkosyl a 30% e 1,5 l de protenase K a 20 mg/
ml. Incubar este homogenato a 60C por 1 h; adicionar 30 ml de dodecil sulfato de sdio a 10% e homogeneizar; extrair o DNA das amostras com fenol/clorofrmio, adicionar 20 g de glicognio e precipitar com etanol; suspender o sedimento de DNA em 50 l de gua e submet-lo a PCR; alternativamente, para obteno de DNA de soro de pacientes chagsicos poder ser utilizada a precipitao trmica das protenas do soro; centrifugar e pesquisar o DNA do parasita no sobrenadante, via PCR.
231
Reao de PCR
a reao realizada em 10 l, contendo 1/100 do DNA total isolado dos 100 l do soro ou sangue total, 250
M de cada um dos desoxinucleosdeos trifosfatos, 10 pmoles de cada um dos primers e 0,2 U de Taq DNA polimerase. Os primers utilizados so os descritos por Diaz et al. (1992); a mistura de reao deve ser protegida contra evaporao por uma camada de leo mineral (20 ml) e submetida a 25 ciclos de amplificao num termociclador; o perfil de temperatura para a desnaturao do DNA, anelamento dos primers e cpia e extenso do segmento so os seguintes, respectivamente: 95C por 60 segundos (com um tempo inicial de 300 s a 95C), 53C por 90 s e 73C por 120 s (com uma incubao final a 73C por 300 s); 1-2 l dos produtos de amplificao so separados por eletroforese em gel de agarose ou acrilamida e corados por brometo de etdeo ou nitrato de prata, respectivamente; o produto de amplificao esperado um segmento de DNA de 188 pares de base; para se precaver de possveis contaminaes, controles internos devem sempre corridos em cada passo e amostras de soro de indivduos normais sempre includas em cada partida de preparao de DNA este DNA obtido e estocado usado como controle na amplificao por PCR um controle com todos os reagentes exceo do DNA, tambm deve ser includo em todas as partidas de amplificao. Devem tambm ser includos soros ou sangue total de pacientes com leishmaniose.
14.3
ndice de Infectividade
Esse parmetro calculado para a avaliao do grau de virulncia e infectividade de um certo isolado de T. cruzi, num determinado inculo. Com infeco de um grupo mnimo de dez animais, calcula-se o percentual de camundongos que apresentaram parasitemia positiva em qualquer dia aps infeco (nmero de animais que apresentaram parasitemia positiva/nmero total de animais inoculados, multiplicado por cem).
14.4. Parasitismo Tissular

O estudo do parasitismo tissular implica, necessariamente, no sacrifcio do animal experimental; portanto, no uma rotina a ser seguida. Quando necessrio feito pela anlise de cortes histolgicos de tecidos fixados ou criopreservados, nos quais os parasitas so identificados por colorao ou por reao imunocitoqumica. Quantifica-se ento (a) o percentual de campos microscpicos contendo ninhos de amastigotas e/ou (b) o nmero de ninhos de amastigotas por rea (mm2) de corte estudado. Neste caso, conta-se o nmero de ninhos em dez a cinqenta campos e aps realizar o mesmo procedimento para quantificar a rea do campo microscpico (ver item 14.1), expressa-se o resultado em ninhos/mm2. Pela tcnica de imunofluorescncia (Captulo 15) esse procedimento fica facilitado. Um detalhado estudo de Hanson & Robertson (1974) mostrou que durante a fase aguda da infeco por T. cruzi a densidade de parasitas nos vrios rgos correlaciona-se perfeitamente com a curva de parasitemia, especialmente no corao.
232
14.5
Parmetros Populacionais de Mortalidade

14.5.1 Mortalidade cumulativa
Esse parmetro calculado a partir da observao diria de quantos animais morrem aps a infeco, indicando a cintica dessa mortalidade. expresso sempre em percentual do nmero total de animais com os quais o experimento foi iniciado, excluindo-se aqueles que tiverem apresentado alguma alterao nos parmetros de higidez (hematcrito e/ou contagem leucocitria diferencial anormais, ou problemas dermatolgicos detectveis). Pode ser expresso como percentual de mortalidade (a curva sobe) ou de sobrevida (a cura desce). O Captulo 20 mostra um modelo de coleta de dados para clculo de taxas de sobrevida. A Figura 7 do Captulo 19 mostra uma curva de mortalidade tpica.
14.5.2 M 50
Este parmetro M50 representa o dia em que morreram 50% dos animais de experimentao. calculado a partir da planilha de mortalidade, tal como a mostrada no Captulo 20. comumente utilizado ao se comparar resultados de grupos de animais submetidos a diferentes gradaes de um mesmo procedimento, tal como diferentes inculos, diferentes concentraes de drogas, etc.
14.6
Parmetros Individuais de Mortalidade e Sobrevida

14.6.1 Tempo de sobrevida
O tempo de sobrevida tambm um parmetro individual. Refere-se ao dia anterior ao da verificao da morte do animal. A anlise deste parmetro feita apenas com o conjunto dos animais que morrem durante o curso do experimento. Geralmente expresso como tempo mdia de sobrevida 1 desvio padro ou como intervalo mnimo e mximo. Alguns autores preferem expressar variaes no tempo de sobrevida como freqncia (%) em relao a intervalos de tempo definidos (por exemplo semanas). Isso implica correlacionar cineticamente quando a maioria dos animais morre frente a um determinado inculo de uma determinada cepa, exprimindo tambm qual a taxa de sobrevida aps o tempo de estudo. Consideram-se sessenta dias como um prazo razovel para se assumir que o animal entrou na fase crnica da infeco, podendo ou no desenvolver a sintomatologia da fase crnica.
AVILA, H. A.; PEREIRA, J. B.; THIEMANN, O.; PAIVA, E.; DEGRAVE, W.; MOREL, C. M. & SIMPSON, L. Detection of Trypanosoma cruzi in blood specimens of chronic chagasic patients by polymerase chain reaction amplification of kinetoplast minicircle DNA: Comparison with serology and xenodiagnosis. Journal of Clinical Microbiology, 31:2421-2426, 1993. AVILA, H. A.; SIGMAN, D. S.; COHEN, L. M.; MILLIKAN, R. C. & SIMPSON, L. Polymerase chain reaction amplification of Trypanosoma cruzi kinetoplast minicircle DNA isolated from whole blood lysates: Diagnosis of chronic Chagas disease. Molecular and Biochemical Parasitology, 48:211-222, 1991.
233
BIRCH, D.E.; KOLMODIN, L.; LAIRD, W. J.; McKINNEY, N.; WONG, J.; YOUNG, K.K.Y.; ZANGENBERG, G.A. & ZOCCOLI, M. A. Simplified hot start PCR. Nature. 381:445-446, 1996. BRITTO, C.; CARDOSO, M. A.; MONTEIRO-VANNI, C. M.; HASSLOCHER-MORENO, A.; XAVIER, S. S.; OELEMANN, W.; SANTORO, A.; PIRMEZ, C.; MOREL, C. M. & WINCKER, P . Polymerase chain reaction detection of Trypanosoma cruzi in human blood samples as a tool for diagnosis and treatment evaluation. Parasitology, 10:241-247, 1995a. BRITTO, C.; CARDOSO, M. A.; RAVEL, C.; SANTORO, A.; BORGES-PEREIRA, J.; COURA, J. R.; MOREL, C. M. & WINCKER, P. Trypanosoma cruzi: parasite detection and strain discrimination in chronic chagasic patients from northeastern Brazil using PCR amplification of kinetoplast DNA and nonradioactive hybridization. Experimental Parasitology, 81:462-471, 1995b. BRITTO, C.; CARDOSO, M. A.; WINCKER, P . & MOREL, C. M. A simple protocol for the physical cleavage of Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA present in blood samples and its use in polymerase chain reaction (PCR)-based diagnosis of chronic Chagas disease. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 88:171-172, 1993. BRONFEN, E.; ROCHA, F. S. A.; MACHADO, G. B. N.; PERILLO, M. M.; ROMANHA, A. & CHIARI, E. Isolamento de amostras do Trypanosoma cruzi por xenodiagnstico e hemocultura de pacientes na fase crnica da doena de Chagas. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 84:237-240, 1989. BRUMPT, E. O xenodiagnstico. applicao ao diagnostico de algumas infeces parasitarias e em particular trypanosomose de Chagas. Anais Paulista de Medicina e Cirurgia, 3:97-102, 1914. CAMARGO, E. P . Growth and differentiation in Trypanosoma cruzi. I. Origin of metacyclic trypanosomes in liquid media. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, 6:93-100, 1964. CERISOLA, J. A.; ROHWEDDER, R. W.; SEGURA, E. L.; DEL PRADO, C. E.; ALVAREZ, M. & MARTINI, G. J. W. El Xenodiagnstico. 1974. Buenos Aires: Instituto Nacional de Diagnstico e Investigacin de la Enfermedad de Chagas Dr. Mario Fatala Chaben, 111 p. (Monografia). CHIARI, E.; DIAS, J. C. P .; LANA, M. & CHIARI, C. A. Hemocultures for the parasitological diagnosis of human Chagas disease in the chronic phase. In: Anais Congresso Internacional sobre Doena de Chagas. 1979. Rio de Janeiro, 1979. Abstracts N1-N5. CHOU, Q.; RUSSELL, M.; BIRCH, D. E.; RAYMOND, J. & BLOCH, W. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Research, 20:1717-1723, 1992. CNPq - CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTFICO e TECNOLGIO. Epidemiologia da Doena de Chagas. Objetivos e Metodologia dos Estudos Longitudinais. Relatrio Tcnico n 1, 1974. DEGRAVE, W.; FRAGOSO, S. P .; BRITTO, C.; VAN HEUVERSWYN, H.; KIDANE, G. Z.; CARDOSO, M. A. B.; MUELLER, R. U.; SIMPSON, L. & MOREL, C. M. Peculiar sequence organization of kinetoplast DNA minicircles from Trypanosoma cruzi. Molecular and Biochemical Parasitology, 27: 63-70, 1988. DIAS, E. 1940. Chagas disease: a comparative study of the susceptibility of four natural vectors to the experimental development of Schizotrypanum cruzi. In: Third International Congress for Microbiology. New York, Abstracts of Communications, p.164, 1939. Report of Proceedings, p. 421. 1940a apud DIAS, E., 1940c. Xenodiagnosticos Seriados em Caes Infectados com Amostras Venezuelanas de Schizotrypanum cruzi. Brasil-Medico, 52: 859-861. DIAS, E. Estudos sobre o Schizotrypanum cruzi. Tese, Doutorado em Medicina. 1933. Rio de Janeiro: Faculdade de Medicina da Universidade do Rio de Janeiro DIAS, E. Tcnica do xenodiagnstico na molstia de Chagas. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 35:335-342, 1940b. DIAZ, C.; NUSSENSZWEIG, V. & GONZALEZ, A. An improved polymerase chain reaction assay to detect Trypanosoma cruzi in blood. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 46:616-623, 1992. ERLICH, H. A.; GELFAND, D. & SNINSKY, J. J. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science, 252:1643-1651, 1991. FREITAS, J. L. P . Contribuio para o Estudo do Diagnstico da Molstia de Chagas por Processos de Laboratrio. 1947. Tese, Doutorado em Parasitologia. So Paulo: Faculdade de Medicina da USP . FUENTE, C. L. A.; URJEL, R. & CORDOVA, F. Estudio comparativo entre el examen parasitologico directo y la diseccion de triatominos para la investigacion de Trypanosoma cruzi. Annales de la Socit Belge de Mdicine Tropicale, 65 (Suppl.1):101-102, 1985. HANSON, W. L. & ROBERTSON, E. L. Density of parasites in various organs and the relation to numbers of trypomastigotes in the blood during acute infections of Trypanosoma cruzi in mice. Journal of Protozoology, 21:512-517, 1974. JUNQUEIRA, A. C. V.; FIGUEIREDO, A. R. & COURA, J. R. Sensibilidade do xenodiagnstico com Panstrongylus megistus e Triatoma infestans na fase crnica da doena de Chagas. Estudo preliminar. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 84 (Suppl. II):115, 1989a.
234
JUNQUEIRA, A. C. V.; VELAZQUEZ, C. R. D. B. & COURA, J. R. Avaliao do rendimento do xenodiagnstico com diferentes espcies de triatomneos. I. Utilizao de uma espcie vetora local (Panstrongylus megistus) em relao ao Triatoma infestans. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 22 (Suppl. II):136, 1989b. KIMURA, L. M. S. Manipulao Animal. In: Manual para tcnicos em animais de laboratrio, Departamento de Biotrios/Bm, 1993. Rio de Janeiro: Servio de Multimeios do CICT/Fiocruz, p. 99-113. KITCHIN, P . A. & BOOTMAN, J. S. Quality control of the polymerase chain reaction. Medical Virology, 3:107-114, 1993. LUZ, Z. M. P.; COUTINHO, M. G.; CANADO, J. R. & KRETTLI, A. U. Hemocultura: tcnica sensvel na deteco do Trypanosoma cruzi em pacientes chagsicos na fase crnica da doena de Chagas. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 27:143-148, 1994a. LUZ, Z. M. P.; GALVO, L. M. C.; COUTINHO, M. G.; CANADO, J. R. & KRETTLI, A. U. Changes in the hemoculture methodology improve the test positivity. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 89 (Suppl.I):53, 1994b. MOSER, D. R.; KIRCHHOFF, L. V. & DONELSON, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology, 27:1477-1482, 1989. MULLIS, K. B. & FALOONA, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350, 1987. MULLIS, K.; FALOONA, F.; SCHARF, S.; SAIKI, R.; HORN, G. & ERLICH, H. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Simp. Quant. Biol., 1:263-273, 1986.. PEREIRA, J. B.; JUNQUEIRA, A. C. V.; SANTOS, L. C.; CASTRO, A. F.; ARAJO, I. B. & COURA J. R. Xenodiagnstico na doena de Chagas crnica. I - Sensibilidade de Panstrongylus megistus e Triatoma infestans. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 29:341-347, 1996. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A. & MULLER, C. A. Studies in search of a suitable experimental insect model for xenodiagnosis of hosts with Chagas disease. 1-Comparative xenodiagnosis with nine triatomine species of animals with acute infections by Trypanosoma cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 77:37-53, 1982. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A. & MULLER, C. A. Studies in search of a suitable experimental insect model for xenodiagnosis of hosts with Chagas disease. 2-Attempts to upgrade the reliability and the efficacy of xenodiagnosis in chronic Chagas disease. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 82:259-272, 1987. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A.; MULLER, C. A. & MOREIRA, C. J. C. Studies in search of a suitable experimental insect model for xenodiagnosis of hosts with Chagas disease. 3-On the interaction of vector species and parasite strain in the reaction of bugs to infection by Trypanosoma cruzi. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 22:90-400, 1988. PERLOWAGORA-SZUMLEWICZ, A.; MULLER, C. A. & MOREIRA, C. J. C. Studies in search of a suitable experimental insect model for xenodiagnosis of hosts with Chagas disease. 4-The reflection of parasite stock in the responsiveness of different vector species to chronic infection with different Trypanosoma cruzi stocks. Revista de Sade Pblica de So Paulo, 24: 65-177, 1990. PIZZI, T.; AGOSIN, M.; CHRISTEN, R.; HOECKER, G. & NEGME, A. Influencia de la constituicion genetica en la resistencia de la laucha a la infeccion experimental por Trypanosoma cruzi. Biologica, 8-11:43-53, 1998. ROLFS, A.; SCHULLER, I.; FINCKH, U. & WEBER-ROLFS, I. PCR: Clinical Diagnostics and Research. 1992. Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. RUSSOMANDO, G.; FIGUEREDO, A.; ALMIRN, M.; SAKAMOTO, M. & MORITA, K. Polymerase chain reaction-based detection of Trypanosoma cruzi DNA in serum. Journal of Clinical Microbiology, 30:2864-2868, 1992. SAIKI, R. K.; SCHARF, S.; FALOONA, F.; MULLIS, K. B.; HORN, G. T.; ERLICH, H. A. & ARNHEIM, N. Enzymatic amplification of -globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:13501354, 1985. SALGADO, A. A. Consideraciones sobre metodologia y sensibilidad del xenodiagnstico. Boletino Chileno de Parasitologia, 24:9-13, 1969. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F. & MANIATIS, T. Molecular Cloning: Laboratory Manual. 1989, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed., Book 01. SANTOS, A. H.; SILVA, I. G. & RASSI, A. Estudo comparativo entre o xenodiagnstico natural e o artificial, em chagsicos crnicos. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 28:367-373, 1995. SARKAR, G. & SOMMER, S. S. Shedding light on PCR contamination. Nature, 343:27, 1990. SCHENONE, H.; ALFARO, E.; REYES, H. & TAUCHER, E. Valor del xenodiagnstico en la infeccin chagsica crnica. Boletino Chileno de Parasitologia, 23:149-154, 1968.
235
STURM, N. R.; DEGRAVE, W.; MOREL, C. M. & SIMPSON, L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: Use in diagnosis of Chagas disease. Molecular and Biochemical Parasitology, 33:205-214, 1989. WINCKER, P .; BOSSENO, M. F.; BRITTO, C.; YAKSIC, N.; CARDOSO, M. A.; MOREL, C. M. & BRENIRE, S. F. High correlation between Chagas disease serology and PCR-based detection of Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA in Bolivian children living in an endemic area. FEMS Microbiology Letters, 124:419-424, 1994a. WINCKER, P .; BRITTO, C.; PEREIRA, J. B.; CARDOSO, M. A.; OELEMANN, W. & MOREL, C. M. Use of a simplified polymerase chain reaction procedure to detect Trypanosoma cruzi in blood samples from chronic chagasic patients in a rural endemic area. American Journal of Tropical Medicine & Hygiene, 51:771-777, 1994b. WINCKER, P .; TELLERIA, J.; BOSSENO, M. F.; CARDOSO, M. A.; MARQUES, P .; YAKSIC, M.; AZNA, C.; LIEGEARD, P .; HONTEPEYRIE, M.; NOIREAU, F.; MOREL, C. M. & BRENIERE, S. F. PCR-based diagnosis for Chagas disease in Bolivian children living in an active transmission area: Comparison with conventional serological and parasitogical diagnosis. Parasitology, 114:367-373, 1997. WRIGHT, P . A. & WYNFORD-THOMAS, D. The polymerase chain reaction: Miracle or mirage? A critical review of its uses and limitations in diagnosis and research. Journal of Pathology, 162:99-117, 1990.
236
Captulo 15
Quantificao de Marcadores Humorais de Inflamao, de Resposta Imune e de Leso Tissular nos Animais Infectados
Tania C. Arajo-Jorge, Paulo R. Z. Antas & Solange Lisboa de Castro
Devido heterogeneidade da doena tanto em camundongos como em humanos, os parmetros parasitolgicos (parasitemia, tempo de sobrevida, mortalidade) e imunolgicos especficos (ativao de clulas T por antgeno de Trypanosoma cruzi e anticorpos antiparasita) podem no se correlacionar diretamente com o grau de leso. O acompanhamento de parmetros inflamatrios e do desenvolvimento de leses tissulares durante o curso da infeco por T. cruzi pode ser bastante informativo. Como foi discutido nos Captulos 4 e 9, diferentes aspectos da resposta inflamatria e imune podem ser estudados experimentalmente em camundongos infectados pelo T. cruzi. A avaliao dos nveis ou da atividade de diferentes componentes destas respostas feita em material colhido dos animais em diferentes tempos aps a infeco, seja por acompanhamento individual de um mesmo animal por longo tempo, quando apenas sangue, fezes e urina podem ser colhidos, seja por sacrifcio do animal, quando ento clulas provenientes de diferentes tecidos podem ser analisadas, bem como seus produtos de secreo. O sangue um material valioso, especialmente para a anlise dos componentes humorais das respostas inflamatria e imune. Plasma ou soro podem ser obtidos, a depender do uso ou no de anticoagulantes, respectivamente. Dosagens de imunoglobulinas totais e especficas, em seus diversos tipos e isotipos, de complexos imunes, de citocinas, de protenas de fase aguda, de molculas de adeso solveis, de enzimas, de metablitos de nitrognio (por exemplo, xido ntrico), sais e outros oligoelementos, so parmetros que podem ser pesquisados e acompanhados no plasma ou no soro, tanto individualmente como em agrupamentos de pool. Os procedimentos para coleta de sangue, plasma ou soro j foram descritos no Captulo 13. No presente captulo vamos nos concentrar nos procedimentos para anlise de marcadores humorais de inflamao e de resposta imune ativas, bem como de leso muscular e miocrdica. Partimos ento do pressuposto que o experimento foi realizado e foi colhido sangue de animais individuais, que rendeu, por animal, at 30 l de plasma ou soro por sangria na cauda ou no plexo orbitrio, ou at 500 l por sangria com puno cardaca. O material pode ser analisado individualmente ou em pool. Vamos nos deter em ensaios que utilizam espectrofotmetro de microplacas (leitor ELISA) por consider-los extremamente prticos e confiveis, e disponveis na maioria dos laboratrios de pesquisa em imunoparasitologia. Sero descritos protocolos para:
237
ELISA
sorologia especfica (convencional) e no especfica (resposta humoral) dosagem de protenas de fase aguda: SAP (resposta inflamatria) dosagem de citocinas: IFN- e TNF- (respostas inflamatria e humoral)
Ensaios em microplaca
dosagem de CK e CKMB (leso tissular)
15.1
ELISA: Sorologia Especfica (Convencional), No Especfica e Protenas Sricas Diversas
O mtodo de ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) um ensaio imunoenzimtico, onde se aproveita, entre outras coisas, o princpio de interao antgeno-anticorpo (Ag-Ac). Este princpio tem como fundamentos:
todo Ag tem a propriedade de gerar, in vivo, um Ac, dado por sua prpria nomenclatura (antigen = antibody
generator);
todo Ag tem uma alta constante de afinidade (Kd) por seu Ac; epitopos antignicos de uma molcula geram distintos anticorpos (Acs) para si; uma vez ligados, Ags e Acs dificilmente podem ser separados, graas s interaes que ocorrem; dado o princpio de maturao da afinidade, certos Acs sero o espelho dos Ags que os geraram.
O mtodo de ELISA se constitui essencialmente de uma hierarquia de interaes Ag=Ac, onde em cada etapa temos atuando os mesmos fundamentos. Esta hierarquia (ou pirmide) est calada em um suporte, ou matriz, que geralmente uma placa de poliestireno, material ideal para a primeira ligao (revestimento). Uma vez ligado placa, dificilmente se consegue reverter a interao, da as placas para ELISA serem descartveis. Aps sucessivas etapas, onde se varia grandemente o pH, o ltimo procedimento tambm se baseia em outra propriedade, esta agora um fundamento bioqumico:
toda enzima possui o seu substrato e com ele poder interagir, respeitando-se o pH, a temperatura, o tampo e
os co-fatores necessrios reao. No final do experimento, pode-se observar uma cor intensa nas cavidades da placa, o que se considera um padro de positividade. Porm nuances de cor tambm ocorrem, at se chegar ao transparente, ou branco. Para se quantificar essas diferenas, usa-se um aparelho do tipo espectrofotmetro para microplaca (ELISA reader), para se distinguir o gradiente de cor, que quantificar a densidade ptica (DO) de cada poo da placa, comparando esta a do ar ou a de outro poo que seja definido como padro negativo de reao. Os aparelhos mais modernos acoplam-se a programas computadorizados para clculos diversos, que podem definir limiares, tirar mdias, fazer regresses lineares e logartmicas e calcular automaticamente a concentrao de um poo-teste quando fornecida a de uma curva-padro referncia. Destacaremos os protocolos para a obteno dos dados e trataremos apenas brevemente da anlise dos dados gerados. As etapas gerais de um ELISA so:
revestimento das placas com o Ag ou o Ac de captura; bloqueio de stios inespecficos de ligao na placa; incubao com o material para teste e padres para serem capturados; incubao com o Ac para revelao da ligao do antgeno ou anticorpo capturado;
238
revelao desse Ac (direta, se estiver diretamente conjugado enzima traadora, ou indireta, se depender de
outra etapa de revelao ou amplificao), atravs de um ensaio de atividade enzimtica com o substrato apropriado para a enzima usada como marcadora do Ac; leitura no espectrofotmetro e anlise dos resultados. Em qualquer ELISA os tampes utilizados nas diferentes etapas visam variar o pH.
pH 9,6: o pH alcalino o ideal para a sensibilizao e o bloqueio da placa, uma vez que a ligao de protenas
placa de poliestireno facilitada neste pH. Pode-se adicionar azida sdica (NaN3) como agente preservativo no tampo nestas etapas, pois ainda haver muitas lavagens antes da incubao com o anticorpo conjugado enzima; pH 7,0 - 7,4: o pH neutro empregado a partir da lavagem da placa, at a incubao com o substrato; pH 4,0 - 4,2: o pH cido o ideal para que a peroxidase clive a H2O2. Deve ser ajustado de acordo com a enzima utilizada como traador. Utilizam-se trs tipos bsicos de ELISA, cujos princpios so:
captura: baseia-se no uso de um Ag aderido placa, para a captura dos Acs por ele gerados. o ELISA empregado
em sorologias de rotina.
sanduche: baseia-se na formao seqencial de um sanduche de Ac-Ag-Ac, quando as placas so revestidas

com um anticorpo muito especfico para a captura de um Ag especfico. Necessita um par de Acs bem especficos para o Ag que se quer detectar, gerados em animais de espcies diferentes. o ELISA usado para a dosagem de Ags circulantes, imunocomplexos, citocinas, protenas sricas, anticorpos idiotpicos e antiidiotpicos. etc. competitivo: este ELISA se fundamenta na competio entre um Ag solvel, que se quer quantificar, e outro com as mesmas caractersticas e especificidades, com o qual se revestiu a placa, por um Ac especfico para esse Ag. Substitui o ELISA sanduche quando no se dispe de um par de Acs, mas sim de um Ac especfico e do Ag purificado. Muitos sistemas j so comercializados em forma de kits para a dosagem de diversas protenas, bem como para o sorodiagnstico de certas infeces. Na maioria dos kits a placa j vem sensibilizada e bloqueada, iniciandose as reaes na terceira etapa. As enzimas mais utilizadas em ensaios ELISA so peroxidase e fosfatase alcalina. Descreveremos protocolos com o uso de peroxidase, mas que podem ser adaptados para o uso de conjugados marcados com outras enzimas. O substrato para peroxidase tetra-metil-benzidina (TMB), que d um produto de reao azul, lido a 450 nm. O substrato para fosfatase alcalina o nitro-fenil-fosfato (NPP), que d um produto amarelo, lido a 405 nm. Um cuidado importante no utilizar azida nestas ltimas etapas, pois ela inibe a ao da peroxidase. Descrevemos a seguir o material de uso geral para ELISA, seguido de protocolos de preparo de Ag para sorologia especfica anti T. cruzi ou ento de sistemas de ELISA para quantificao de imunoglobulinas ou isotipos totais, protenas de fase aguda e citocinas que podem indicar a evoluo da resposta inflamatria e imune. Material
protocolo de distribuio das amostras na placa (sempre em triplicata, e sem esquecer poos controles para PBS
-branco)
placas de polistireno ELISA fundo chato (existem placas apropriadas para melhor adsoro do Ag) tubos de microcentrfuga placas de microtitulao para diluio, fundo em U micropipetas monocanal e multicanal de 20 a 200 l ponteiras para as micropipetas, em suportes adequados cubas para as solues de Ac recipiente para tampo de lavagem
239
filme plstico de PVC papel ou tecido absorvente cuba para descarte de lquidos cuba para neutralizao de placas acidificadas estufa ou banho-maria para incubao a 37C leitor espectrofotomtrico de microplacas um sistema de aspirao/lavagem de placas recomendvel, composto por bomba de vcuo, recipiente para
tampo de lavagem e sistema para distribuio para lavadora automtica todos os Acs conjugados a enzimas ou outros traadores precisam ser prvia e periodicamente titulados e aliquotados, alm de ter sua especificidade previamente testada. A Tabela 1 mostra as solues utilizadas no ELISA. Quando se prepara um ELISA com 50 l de Ag/poo, calcula-se um consumo de 6 ml/placa. Para 100 l/poo, calcula-se um consumo de 12 ml/placa Tabela 1 Solues usadas para ELISA
Solues Sigla pH Concentrao Estoque Tampo carbonato de sdio BSA - albumina bovina Leite desnatado (comercial) Tampo fosfato Tampo fosfato-salina1 +0,05 % Tween 20 Tampo citrato-fosfato TMB em DMSO H2O2 em gua cido sulfrico (H2SO4) Hidrxido de sdio (NaOH)
1
Funo
Uso 0,1 M 1% 4% Sensibilizao Bloqueio Bloqueio Incubao Lavagens/ diluio Revelao Revelao 0,006 % 6,6 M 0,1 M Revelao Interrupo Neutralizao
TCO4 BSA LDN TPO4 PBS-T TCP TMB H2O2 STOP Soda
9,6 9,6 9,6 7,2-7,4 7,2-7,4 4,0
1 M (10x)
1 M (10x)
0,1 M 0,1 M
1 M (10x) 10 mg/ml 3%
0,1 M
1,0 12
6,6 M 0,1 M
soluo NaCl 0,85% (154 mM)
15.1.1 Sorologia especfica anti T. cruzi por ELISA

Preparo de Antgeno
a. Parasita fixado em paraformaldedo
Pode-se usar quaisquer dos estgios do T. cruzi como Ag particulado para captura de imunoglobulinas anti T. cruzi. Os mtodos que do maior rendimento de parasitas so os mais comumente empregados (ver Captulo 10): cultura de epimastigotas em meio LIT, metaciclognese para obteno de tripomastigotas metacclicos em meio definido, cultura de clulas para obteno de amastigotas ou tripomastigotas. Podem ser utilizados em reaes de imunofluorescncia (103 a 105/poo) ou ELISA (2 x 103 a 2 x 105 clulas/poo). Os antgenos particulados favorecem especialmente a captura de IgM, pois os epitopos de carboidratos, muito reativos a IgM, so preservados. Com qualquer dos procedimentos para obteno dos parasitas, para serem utilizados como Ag, aps sua obteno eles devero passar pelas seguintes etapas:
240
lavar 2x em tampo; fixar em paraformaldedo 1% por 15 min ou 0,1 % por 24 h; lavar 2x em tampo; contar o nmero de parasitas em cmara de Neubauer; ajustar a concentrao para 108 parasitas/ml (100X concentrado); preparar alquotas para uso (5 x 104 parasitas/poo, em 50 l): 6 ml de suspenso a 106 parasitas/ml para cada
placa de ELISA ou 5 ml de suspenso a 5x 106 parasitas/ml para dez lminas de imunofluorescncia (5 l/poo nas lminas).
Obs: um cuidado adicional pode ser tomado, com o tratamento inicial das placas com etanol 70% por 10 minutos, seguido de descarte do etanol e secagem com vento (secador de cabelos). b. Ags solveis de T. cruzi (congelamento e descongelamento)
Para a quantificao de IgG e outros isotipos de Ig, costuma-se dar preferncia ao uso de fraes antignicas solveis dos parasitas, epi-, ama- ou tripomastigotas. So preparados como se segue:
obter os parasitas (2 x 109 clulas/ml); lavar 3x em soluo salina com centrifugao a 2.000g; ressuspender 1:3 em gua destilada; realizar trs a cinco ciclos de congelamento e descongelamento, utilizando-se banhos de nitrognio lquido ou
gelo seco alternado com banho-maria a 37oC; centrifugar a 26.000 g por 1 h a 4oC; recuperar o sobrenadante; dialisar o sobrenadante contra PBS pH 7,4; quantificar o teor de protena (medida da DO a 280 nm); liofilizar (optativo) ou aliquotar a 10-100 g/ml em PBS com 0,1% de azida sdica, mas sem detergente nem protena extra.
Obs: o Ag utilizado a 1 a 10 g/ml, num volume de 50 l para os poos nas placas ELISA.
Existem outros protocolos para preparo de Ags de T. cruzi, por processos variveis de extrao qumica e, mais recentemente por produo de Ags recombinantes. Os mtodos acima citados so os que fornecem Ags brutos para captura de Acs, o que pode levar reaes cruzadas com infeces por outros tripanosomatdeos, mas que so absolutamente teis e suficientes para a avaliao da resposta imune humoral de animais experimentalmente infectados. Anticorpos anti-isotipos conjugados a enzimas O Ag de T. cruzi usado vai capturar Igs dos diversos isotipos, e a sorologia determinar Ig total, IgG, IgM ou qualquer outro isotipo que se pretenda investigar, a depender do Ac utilizado na etapa de deteco e revelao da imunoglobulina capturada. Muitos fabricantes comercializam Acs (simples e conjugados a enzimas) para esta finalidade. Para um ELISA mais rpido, recomenda-se que este Ac anti Ig ou isotipo de camundongo j seja conjugado com peroxidase. importante o teste prvio de reatividade do conjugado enzimtico tanto ao Ag usado para sensibilizar a placa, como ao agente usado para bloqueio. s vezes, em funo dessa reatividade cruzada, que leva a altas leituras nos poos controles sem o soro teste, necessria a mudana do bloqueador, de BSA para leite desnatado, ou para soro normal da espcie em que foi obtido o conjugado. importante tambm que o conjugado seja previamente titulado com diluies seriadas sobre placas revestidas com soro normal de camundongo 10%.
241
Procedimento para sorologia anti T. cruzi A Tabela 2 resume a seqncia de etapas do ELISA para a sorologia anti T. cruzi. Para esse procedimento seqencial, ressaltamos as seguintes observaes:
as solues estoque dos Ags devem ser aliquotadas em volumes suficientes para at cinco placas, em PBS. Evitar
congelar e descongelar repetidamente as mesmas alquotas. Pode-se adicionar 0,1% de azida sdica (NaN3) como preservativo para evitar contaminao (concentrao final de uso: 0,01%); a etapa de sensibilizao pode ser feita no dia anterior, com a incubao das placas com o Ag na geladeira. No necessria lavagem da placa antes do bloqueio; a soluo de bloqueio pode variar e deve ser testada para cada ELISA durante sua padronizao. Pode-se usar BSA 1%, leite desnatado 4%, ou glicina 1%. Verter a placa com o Ag, bater sobre tecido absorvente e colocar a soluo de bloqueio; as placas sensibilizadas e bloqueadas podem ser estocadas na geladeira, mas sua eficcia para capturar o Ag deve ser testada para determinao do prazo de validade; para todas as etapas de lavagem (trs vezes) preciso verter a soluo final de tampo, bater bem a placa em tecido absorvente para retirar o excesso; opcionalmente, pode-se proceder nas etapas de incubao com PBS-T, obtendo-se a mesma eficcia. Tabela 2 Etapas seqenciais na realizao do ELISA de captura
Etapa Sensibilizao (Ag) Bloqueio Lavagem Soros Lavagem Antiisotipo peroxidase Lavagem Substrato Final
1
Tampo TCO4 TCO4 PBS-T PBS PBS-T PBS PBS-T TCP STOP
Volume (l/poo) 50 100 encher 50 encher 50 encher 50 50
Tempo 18 h 2h 2h
IgM 1:500 BSA

1
IgG 1:10002 BSA 1:100 3 1:500 4 titulvel
1: 50 3 1: 250 4 titulvel
1h varivel instantneo
Ag Epi fixado; 2Ag solvel; 3para soro de camundongo; 4para soro humano
15.1.2 Captura de Igs totais e isotipos para sorologia no especfica (ELISA sanduche)
Uma das caractersticas clssicas da infeco experimental por T. cruzi a ativao policlonal e a hipergamaglobulinemia poliisotpica (ver Captulo 4), com destaque para os isotipos IgG2a e IgG2b. O sistema mais simples de monitoramento deste processo o ELISA sanduche, como descrito no item 15.1. Material
os mesmos reagentes usados para ELISA (Tabela 1) imunoglobulina purificada para construo de curva padro (opcional); a opo simples para clculo das variaes nos nveis de Igs observadas a diferentes dias ps-infeco o clculo da razo entre a DO obtida com as amostras infectadas em relao DO mdia de amostras colhidas dos animais antes da infeco, ou de controles no infectados com a mesmo tempo de cativeiro e experimentao que os infectados pares de anticorpos para o sanduche (Tabela 3)
242
Tabela 3 Pares de anticorpos para a sorologia no especfica

Ig a ser dosada Ig total 1o anticorpo (placa) Policlonal de coelho anti Ig total de camundongo Policlonal de coelho anti Ig G de camundongo Monoclonal de rato antiisotipo de camundongo 2o anticorpo1 Policlonal de cabra anti Ig total de camundongo adsorvido para Ig de coelho Policlonal de cabra anti Ig total de camundongo adsorvido para Ig de coelho Policlonal de coelho ou cabra anti Ig total de camundongo pr adsorvido para IgG ou IgM de rato, segundo o isotipo do monoclonal usado como 1o Ac Conjugado-enzima 2 Coelho anti IgG de cabra PO
IgG
Coelho anti IgG de cabra PO
Isotipos: IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgD, IgE, IgA
Rato anti IgG de coelho PO ou rato anti IgG de cabra PO adsorvido para Ig de camundongo
PO: peroxidase 1 deve ser especfico para Ig de camundongo, com um mnimo de reao cruzada para o 1o Ac 2 deve ser especfico para o 2o Ac, com um mnimo de reao cruzada para o 1o Ac e para Ig de camundongo
Procedimento De um modo geral necessrio primeiro um ajuste do protocolo aos ttulos dos Acs disponveis, cumprindose sempre o seguinte conjunto de experimentos preliminares (padronizao dos ensaios):
curva de titulao do Ac conjugado peroxidase frente a soro normal das vrias espcies que sero usadas no
ensaio (o 1o e o 2o Acs e o soro de camundongo). A melhor diluio a que fornece menor leitura sobre o 1o Ac e sobre o soro de camundongo, e maior sobre o 2o Ac curva de sensibilizao: diluies seriadas do 1o Ac com concentraes fixas dos demais reagentes nas etapas posteriores curva de deteco: diluies seriadas do 2o Ac com concentraes fixas dos demais reagentes nas etapas anteriores e posteriores curva de titulao das amostras de camundongo, com uma amostra sabidamente positiva e outra sabidamente negativa, para a escolha das melhores trs diluies onde as diferenas de leitura de DO entre positivos e negativos possam ser mximas. Uma vez estabelecidas as concentraes ideais para cada etapa, procede-se ao ELISA com a seqncia de etapas enumeradas na Tabela 4. Tabela 4 Etapas seqenciais no ELISA sanduche
Etapa Sensibilizao (1 Ac) Bloqueio Lavagem Soros Lavagem Sanduche (2 Ac) Lavagem Conjugado-PO
o o
Tampo TCO4 TCO4 PBS-T PBS PBS-T PBS PBS-T PBS
Volume ( l/poo) 50 100 Encher 50 Encher 50 Encher 50
Tempo 1-18 h 1- 2 h
Reagente/diluio 1/10.000 a 1/1.000.000 BSA
2h
1/1.000 a 1/40.000 dependendo do isotipo
1h
Titulvel (comumente 1/1000)
1h
As demais etapas de revelao da peroxidase (PO) seguem como na Tabela 2.
243
15.1.3 Dosagem de protenas de fase aguda: SAP (ELISA de captura)

A deteco de protenas de fase aguda no plasma de animais infectados indicativa do incio da resposta imune inata (ver Captulo 4), e indicativas da ao de IL-6, IL-1 e TNF-. Como no existem reagentes comerciais disponveis para a maioria destas protenas no modelo murino, descreveremos apenas um ELISA simples para a quantificao dos ndices de variao de SAP (protena amilide P srica), o principal reagente de fase aguda no camundongo, com a ressalva de que nem todas as linhagens de camundongos desenvolvem nveis semelhantes de aumento de SAP (ex.: C3H, Balb/C). A SAP apresenta-se em nveis indetectveis nos animais normais e aumenta de 10 a 1.000 vezes aps a primeira semana de infeco na linhagem C57BL/6, que tipicamente boa respondedora para SAP. bastante comum pesquisadores que trabalham com esta e outras protenas de fase aguda cederem, de bom grado, soros produzido experimentalmente em seus laboratrios para a montagem de sistemas de deteco e quantificao. Material
os mesmos reagentes usados para ELISA (Tabela 1) soro ou Ac purificado anti SAP (fonte comercial: Calbiochem; IgG de coelho anti SAP): titular previamente ante
SAP purificada ou a plasma de camundongo C57BL/6 aps sete a dez dias de infeco conjugado especfico para revelar o anti SAP (cabra anti IgG de coelho) e com mnima reao cruzada com soro de camundongo Procedimento Nesse ELISA revestimos as placas com diferentes diluies do soro de camundongo a ser testado (em uma analogia com Western blot) e detectamos a presena da protena. Tabela 5 Etapas para dosagem de SAP
Etapa Sensibilizao (SAP no plasma em conc. desconhecida) Bloqueio Lavagem Revelao (Ac anti SAP) Lavagem Conjugado-PO Tampo TCO4 Volume (l/poo) 50 Tempo 1-18 h Diluio 1/25, 1/50, 1/100, 1/200, 1/400
TCO4 PBS-T PBS PBS-T PBS
100 Encher 50 Encher 50
1-2 h
Leite desnatado a 4%
2h
1h
PO: peroxidase
15.1.4 Dosagem de citocinas: INF- e TNF-

A dosagem de citocinas no plasma ou soro pode ser hoje feita de rotina com kits comerciais para ELISA que fornecem resultados confiveis e reprodutveis, com base no princpio do ELISA de captura descrito no item 15.2.2. A diferena que estes kits geralmente utilizam Acs monoclonais contra as citocinas-alvo (e portanto extremamente especficos) como 1o e 2o Acs, e constroem sempre uma curva padro com a citocina recombinante em concentraes conhecidas. Alm disso, se o 2o Ac for biotinilado ele pode ser obtido da mesma espcie do 1o Ac, e a revelao pode ser feita pela incubao com estreptoavidina(EA)-peroxidase, o que minimiza muito a reao cruzada de fundo, posto que a EA no reage (ou apenas minimamente) com as imunoglobulinas usadas
244
para o sanduche, nem com possveis contaminantes no plasma testado. O uso de Acs monoclonais dos kits comerciais pode ser substitudo pelos mesmos Acs, pois pode-se obter os respectivos hibridomas produtores seja comercialmente (ATCC ou outro banco comercial de clulas) ou por intermdio de cesso por pesquisadores da rea, e us-los para padronizar ensaios sob a forma de sobrenadantes ou de ascites. As citocinas mais comumente monitoradas, que apresentam aumento na fase aguda em todos os modelos experimentais j testados so IFN- e TNF-. Alguns ensaios de atividade funcional das citocinas tambm podem ser de interesse, mas no sero objeto desse manual, e recomenda-se a procura de literatura especfica (Current Protocols in Immunology, 1991, ou Immunology Methods Manual - A Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1997, ou Methods in Cell Biology vol. 49, 1995). Os mesmos materiais e procedimentos descritos no item 15.2.2 so utilizados para a dosagem de IFN- e TNF- com as diferenas dos Acs. A Tabela 6 sumariza alguns dos Acs usados para essa finalidade. Tabela 6 Anticorpos usados
Citocina IFN- TNF- 1o Anticorpo R4-6A2 (rato anti IFN- de camundongos) MP6-XT22 (rato anti TNF- de camundongos) 2o Anticorpo Curva padro Dil. do plasma 1/2-1/10 1/2-1/10
17.17.24 IFN- recombinante (rato anti IFN- de camundongos) (0-20ng/ml) MP6-XT3 TNF- recombinante (rato anti TNF- de camundongos) (0-20ng/ml)
15.2
Ensaios em Microplaca: Dosagem CK e CKMB
bem conhecido que, em processos patolgicos, danos tissulares so acompanhados por liberao de enzimas na corrente sangnea e que a identificao de isoenzimas correspondentes revela a fonte de tecido especfico que foi danificado, e portanto no qual o processo patolgico est em curso. Uma srie de estudos feitos por Teresa Mercado analisando bioquimicamente a expresso de diversas isoenzimas nos tecidos de camundongos infectados indicaram que aumentos substanciais de creatino fosfokinase total (CK), bem como de suas isoformas tpicas de msculo esqueltico (CK-MM) e cardaco (CK-MB) podem ser observadas. Adaptamos o mtodo de dosagem laboratorial de CK e CKMB humanas para volumes menores disponveis em anlises individuais de camundongos e confirmamos que seu aumento pode ser indicativo de leso tissular ativa. O protocolo que usamos atualmente o seguinte: Material
amostras de plasma ou soro, mantidas congeladas a -20oC kit comercial para dosagem de CK-MB humana srica (Merck) placas de microtitulao para diluio, fundo em U protocolo de distribuio das amostras na placa (em duplicata, e sem esquecer poos controles para PBS branco) micropipetas monocanal e multicanal de 20 a 200 l papel de filtro no tamanho das placas embebido em gua ponteiras para as micropipetas, em suportes adequados cubas para as solues leitor espectrofotomtrico de microplacas com filtro a 340 nm
Obs1: recomendvel um sistema de leitura cintica das placas no leitor Obs 2: os ensaios devem ser feitos em duplicatas
245
Procedimento
preparar protocolo de aplicao dos plasmas na placa, com a cintica a ser estudada sempre em colunas verticais
(no infectado/ dia x, dia 2x, dia 3x, etc.);
preparar meio de incubao para revelao da enzima segundo as instrues do fabricante (mistura do tampo
com os reagentes especficos);
preparar programa de leitura seqencial das placas no espectrofotmetro, a 340 nm a cada minuto, por 5 min; colocar 5 l de plasma de cada amostra nos respectivos poos cobertura da placa com papel de filtro embebido
em gua para evitar o ressecamento at a aplicao do meio de incubao; aplicar 125 l do meio de incubao com pipeta multicanal em uma nica placa (no aplicar vrias placas ao mesmo tempo); aguardar 3 min e ler seqencialmente a DO a cada minuto, por 5 min; repetir a operao de aplicao do meio de incubao/leitura cintica para cada uma das outras placas previamente preparadas com os plasmas a serem testados; calcular em planilha apropriada a diferena de DO medida entre cada um dos sucessivos minutos ([5-4] , [43], [3-2], [2-1]) de modo a ter quatro valores de diferena (E) e poder calcular a mdia (E/min); calcular como padro negativo a mdia de E/min de diferentes amostras no infectadas; calcular um ndice de variao entre os valores obtidos nas amostras infectadas, seja em relao ao nvel individual do animal pr-infeco, ou ento em relao ao valor mdio obtido como padro negativo.
15.3
Protocolos para Microplaca e Obteno de Resultados
Todos os testes com microplacas precisam ser bem acompanhados com protocolos indicativos da localizao de cada amostra na placa, bem como do protocolo usado no ensaio. Anexamos a seguir alguns exemplos de protocolos que podem ser copiados e adaptados. A cada protocolo de trabalho corresponde uma leitura de DO ao espectrofotmetro, ou at a mais de uma, no caso de leituras a diferentes intervalos de tempo (ex. CK). extremamente importante que planilhas de anlises destes dados sejam bem preparadas, para que a mdia de triplicatas possa ser obtida, o clculo de valor cut-off possa ser feito, bem como o clculo dos ndices de variao em relao ao valor padro que se tomou. Este pode ser a mdia de valores normais, ou ento o valor individual do animal antes da infeco. Essa escolha do pesquisador e das condies de experimentao. Alguns cuidados devem ser tomados:
as amostras a serem estudadas em uma diluio pr-fixada (sem diluio seriada) devem ser avaliadas sempre em
triplicatas (no mnimo em duplicatas); quando os soros forem analisados em diluio seriada, as duplicatas constituem um bom cuidado a tomar, mas podem ser dispensadas; o estudo cintico de amostras de um mesmo animal deve, sempre que possvel, ser colocado na mesma coluna, ou em colunas colaterais; nunca deve-se esquecer de reservar numa placa espao para o branco (PBS ao invs de soro), para um soro controle sabidamente positivo, e para trs soros sabidamente negativos. Estes ltimos permitiro calcular um limite de excluso (cut-off) com seis a nove amostras no mnimo. Apresentamos, a seguir, um exemplo de organizao de planilha de clculo e de anlise dos nveis de IgG anti T. cruzi em animais infectados, no qual foram ensaiadas duas placas com cinco soros cada, numa cintica dos dias 0, 1, 8, 20 e 41 ps-infeco (dpi) para os grupos controle (no infectado) e infectado. Neste experimento o interesse era comparar a variao de IgG a cada dia com o valor obtido individualmente nos animais antes da
246
infeco. Por isso foi calculada a mdia e somados dois desvios aos resultados de cada animal no dia 0, e calculado o ndice de variao de cada animal ao longo da infeco. Os animais no infectados foram analisados de modo semelhante, como controle interno do experimento. Protocolos das placas
Placa 1 1-2-3 A B C D E F G H cdg-1 cdg-1 cdg-1 cdg-1 cdg-1 cdg-5 cdg-5 cdg-5 0 dpi 1 dpi 8 dpi 20 dpi 41 dpi 0 dpi 1 dpi 8 dpi 4-5-6 cdg-2 0 dpi cdg-2 1 dpi cdg-2 8 dpi cdg-2 20 dpi cdg-2 41 dpi cdg-5 20 dpi cdg-5 41 dpi Grupo controle 7-8-9 cdg-3 0 dpi cdg-3 1 dpi cdg-3 8 dpi cdg-3 20 dpi cdg-3 41 dpi 10-11-12 cdg-4 0 dpi cdg-4 1 dpi cdg-4 8 dpi cdg-4 20 dpi cdg-4 41 dpi soro + cont. placa soro + cont. placa PBS (branco)
Placa 2 1-2-3 A B C D E F G H cdg-1 0 dpi cdg-1 1 dpi cdg-1 8 dpi cdg-1 20 dpi cdg-1 41 dpi cdg-5 0 dpi cdg-5 1 dpi cdg-5 8 dpi 4-5-6
Grupo infectado 7-8-9 cdg-3 0 dpi cdg-3 1 dpi cdg-3 8 dpi cdg-3 20 dpi cdg-3 41 dpi 10-11-12 cdg-4 0 dpi cdg-4 1 dpi cdg-4 8 dpi cdg-4 20 dpi cdg-4 41 dpi soro + cont. placa soro + cont. placa PBS (branco) cdg-2 0 dpi cdg-2 1 dpi cdg-2 8 dpi cdg-2 20 dpi cdg-2 41 dpi cdg-5 20 dpi cdg-5 41 dpi -
Leituras obtidas no espectrofotmetro

Valor da densidade ptica (DO) Placa 1 1 0,166 0,248 0,182 0,180 0,150 0,072 0,081 0,110 Placa 2 1 0,148 0,222 0,255 0,779 0,238 0,222 0,129 0,220 2 0,160 0,220 0,260 0,802 0,262 0,204 0,114 0,203 3 0,170 0,247 0,296 0,838 0,313 0,208 0,143 0,185 4 0,224 0,276 0,299 0,508 0,205 0,555 0,279 5 0,195 0,287 0,280 0,523 0,220 0,644 0,284 2 0,158 0,239 0,163 0,175 0,112 0,066 0,074 0,107 3 0,137 0,243 0,148 0,188 0,119 0,078 0,073 0,101 4 0,180 0,205 0,168 0,229 0,202 0,117 0,061 5 0,156 0,195 0,161 0,191 0,232 0,109 0,060 Grupo controle 6 0,174 0,200 0,171 0,214 0,284 0,095 0,063 7 0,168 0,147 0,199 0,143 8 0,140 0,151 0,189 0,131 9 0,134 0,137 0,168 0,123 10 0,112 0,149 0,155 0,145 0,056 11 0,121 0,141 0,168 0,177 0,071 12 0,151 0,205 0,181 0,147 0,053
Grupo infectado 6 0,197 0,266 0,270 0,517 0,212 0,587 0,276 7 0,228 0,094 0,152 0,769 8 0,247 0,086 0,139 0,662 9 0,199 0,088 0,135 0,737 10 0,149 0,105 0,157 0,640 0,413 11 0,149 0,095 0,146 0,528 0,418 12 0,172 0,105 0,154 0,595 0,456
247
Clculo do cut-off = 2x desvio padro da mdia da DO de cada animal em 0 dpi Grupo controle med 0,154 0,243 0,164 0,181 0,127 0,072 0,076 0,106 dpd 0,012 0,004 0,014 0,005 0,017 0,005 0,004 0,004 coff 0,178 med 0,170 0,200 0,167 0,211 0,239 0,107 0,061 dpd 0,010 0,004 0,004 0,016 0,034 0,009 0,001 coff 0,190 med 0,147 0,145 0,185 0,132 dpd 0,015 0,006 0,013 0,008 coff 0,177 med 0,128 0,165 0,168 0,156 0,060 dpd 0,017 0,028 0,011 0,015 0,008 coff 0,161
0,082
dpd = desvio padro; coff = cut off Clculo do cut-off = 2x desvio padro da mdia da DO de cada animal em 0 dpi Grupo infectado med 0,154 0,243 0,164 0,181 0,127 0,072 0,076 0,106 dpd 0,012 0,004 0,014 0,005 0,017 0,005 0,004 0,004 coff 0,178 med 0,170 0,200 0,167 0,211 0,239 0,107 0,061 dpd 0,010 0,004 0,004 0,016 0,034 0,009 0,001 coff 0,190 med 0,147 0,145 0,185 0,132 dpd 0,015 0,006 0,013 0,008 coff 0,177 med 0,128 0,165 0,168 0,156 0,060 dpd 0,017 0,028 0,011 0,015 0,008 coff 0,161
0,082
Clculo do ndice de variao (IV): mdia de cada dia/cut off Grupo controle IV 0,863 1,366 0,923 1,016 0,713 0,880 0,929 1,296 Cont-1 t 0 1 8 20 41 0 1 8 IV 0,893 1,050 0,875 1,110 1,257 1,308 0,750 Cont-2 t 0 1 8 20 41 20 41 IV 0,833 0,819 1,047 0,748 Cont-3 t 0 1 8 20 41 IV 0,793 1,023 1,041 0,969 0,372 Cont-4 t 0 1 8 20 41
Cont-5
Grupo infectado IV 0,899 1,295 1,525 4,547 1,528 0,932 0,567 0,894 Inf-1 t 0 1 8 20 41 0 1 8 IV 0,886 1,192 1,221 2,226 0,916 2,625 1,233 Inf-2 t 0 1 8 20 41 20 41 IV 0,851 0,338 0,538 2,736 Inf-3 t 0 1 8 20 41 IV 0,878 0,570 0,854 3,295 2,405 Inf-4 t 0 1 8 20 41
Inf-5
Planilha de resultados: Expresso em IV

Grupo cont cont cont cont cont inf inf inf inf inf Animal cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 1 dpi 1,366 1,050 0,819 1,023 0,929 1,295 1,192 0,338 0,570 0,567 248 8 dpi 0,923 0,875 1,047 1,041 1,296 1,525 1,221 0,538 0,854 0,894 20 dpi 1,016 1,110 0,969 1,308 4,547 2,226 2,736 3,295 2,625 41 dpi 0,713 1,257 0,748 0,372 0,750 1,528 0,916 2,405 1,233
A figura abaixo expressa graficamente estes resultados. A anlise estatstica (ver Captulo 19) foi feita e indicou aumento significativo nos dias 20 e 40 ps-infeco.
Dosagem de IgG anti-T. cruzi

5 4 3 IV 2 1 0 0 10 20 30 40
Controle Infectado
dias diasps-infeco ps infeco
Figura 1 Valores de ndice de variao (IV) para IgG anti Trypanosoma cruzi para animais dos grupos controle e infectado
249
Captulo 16
Preparo de Clulas para Avaliao de Parmetros Inflamatrios e Imunolgicos

Tania C. Arajo-Jorge, Vinicius Cotta-de-Almeida, Bianca P. Olivieri & Andrea Henriques-Pons
No Captulo 15 descrevemos procedimentos para anlise de marcadores humorais de inflamao e de resposta imune. No presente captulo vamos nos concentrar nos procedimentos para anlise de clulas obtidas de tecidos linfides. O sistema imune est distribudo em rgos linfides centrais e perifricos e tambm em vias de fluxo celular entre esses rgos e outros tecidos-alvo, isto , o sangue e a linfa. O estudo das clulas presentes em quaisquer desses compartimentos do sistema imunolgico pode traduzir um estado patolgico deste sistema. Como as clulas efetoras so essencialmente circulantes e migratrias, os rgos linfides funcionam como verdadeiros sacos de clulas, que podem ser fragmentados e homogeneizados de modo a colocar as clulas em suspenso apenas com dissociao mecnica, sem tratamentos enzimticos do tecido. Diversas alteraes so observadas no sistema imunolgico no curso da infeco pelo Trypanosoma cruzi: ativao policlonal de clulas T e B, imunossupresso da resposta proliferativa, citotoxicidade exacerbada, apoptose de linfcitos, atividade auto-reativa, depleo de linfcitos tmicos, entre outras. Por isso a anlise de clulas do sistema imunolgico tem sido objeto de intensos e abrangentes estudos visando aprofundar as investigaes da atividade imunitria na infeco pelo T. cruzi.
16.1 Obteno de Clulas de Sangue, Peritneo, Bao e Linfonodos

O preparo de suspenses celulares com alta viabilidade essencial para ensaios baseados em atividade celular: proliferao e diferenciao de funes efetoras, anlises fenotpicas por citometria de fluxo, ou ensaios de interao entre clulas do sistema imune (por exemplo, apresentao antignica) ou entre elas e clulas-alvo (por exemplo, citotoxicidade). Para qualquer destas abordagens, tendo em vista traduzir um estado operante no momento em que se extrai o rgo ou o fluido do animal em estudo, muito importante que a morte dos animais e a extrao e processamento dos rgos seja feita de forma rpida e cuidadosa para maior preservao das amostras. Alguns cuidados especiais:
usar materiais cirrgicos adequados, principalmente no que tange retirada de linfonodos muito pequenos, ou
timo atrofiado;
251
evitar presena de sangue (hemlise, uso de gradiente de Ficoll); usar homogeneizadores de tecidos de forma apropriada; usar solues salinas adequadas: (1) salina fosfatada tamponada (PBS) com soro bovino fetal 2 a 5% ou (2)
soluo salina balanceada: BSS ou Hanks, com soro bovino fetal 2 a 5%. Material
cmara de anestesia com clorofrmio ou ter (vidro com tampa larga, e algodo no fundo) lcool a 70% placa de cortia (para a fixao do animal) placa de Petri com soluo salina para as lavagens pipetas Pasteur para troca da salina de lavagem recipientes de descarte de lquidos e de carcaas com as devidas solues desinfetantes tesoura de ponta afiada pinas anatmica, dente de rato e de relojoeiro sistema de homogeneizao: (a) mbolos de seringa para maceramento, (b) tela (peneira) de arame ou nilon,
(c) lminas de bordas esmerilhadas, ou (d) homogeneizador de tecido cuba de gelo para os tubos tubos de 15 ml para centrfuga, previamente rotulados com o material a receber soluo salina tamponada sem soro, em banho de gelo (PBS ou BSS) soluo salina com 2 a 5% de soro fetal bovino (PBS-SFB ou BSS-SFB) em banho de gelo cmara de Neubauer para contagem de clulas soluo de azul Tripan 0,2 a 0,4% para avaliao de viabilidade celular tubos de microcentrfuga para diluies micropipetas de 200 e 20 ml seringas de 1, 5 e 10 ml com as respectivas agulhas ponteiras de micropipetas contador heparina Procedimento
anestesiar o animal; fazer puno cardaca para coleta de sangue em seringa heparinizada para obteno de clulas mononucleares
sangneas e plasma (manter no gelo at o processamento);
abrir a pele do abdmen sem ruptura do peritnio; injetar 4 a 6 ml de soluo salina ou meio de cultura sem soro (seringa de 10 ml) na cavidade peritoneal para
lavagem e coleta das clulas (manter no gelo at o processamento); abrir a parte ventral do animal para exposio e retirada dos linfonodos subcutneos (inguinais, braquiais, axilares, etc.), do peritnio para exposio dos rgos de interesse (bao e linfonodos mesentricos), e do trax para retirada do timo e linfonodos dessa regio, caso haja interesse; coletar os rgos e deposit-los em placas de Petri com salina gelada (a pesagem do bao essencial); lavar em salina gelada; homogeneizar para ruptura das cpsulas e liberao das clulas linfides; coletar as clulas com pipetas Pasteur e transferir para tubos cnicos de 15 ml. No caso de clulas do bao, lisar as hemceas; lavar 2-3 x em salina (volume oito a dez vezes maior do que o da suspenso) com centrifugaes sucessivas ressuspender em soluo adequada (meio de cultura ou BSS), contagem de rendimento e viabilidade celular (diluio 1:1 com azul tripan 0,4%).
252
O rendimento de clulas esperado para camundongos normais, variando na dependncia da linhagem de camundongos utilizada, o seguinte: clulas peritoneais = 1 a 3 x 106, timo = 100 a 300 x 106, linfonodos mesentricos = 50 a 100 x 106, bao = 50 a 150 x 106. A determinao da celularidade essencial para uma determinao posterior de nmeros absolutos de subpopulaes fenotpicas (B, T, CD4, CD8).
Obs 1: o procedimentos para timo e linfonodos so os descritos acima. O bao, pela alta quantidade de eritrcitos, deve ser submetido hemlise com solues hemolticas adequadas base de: (1) NH4Cl, devendo por isto passar por extensa lavagem, devido toxicidade deste componente para as outras clulas na suspenso, (2) choque hipotnico por 10 segundos, ou (3) separao celular por gradiente de Ficoll. Obs 2: O sangue deve ser obtido em anticoagulante (heparina, EDTA, etc.) por puno cardaca, retroorbital ou femural, seguida de separao de clulas mononucleares por gradiente de densidade. Obs 3: Aps a remoo dos rgos todo o procedimento deve ser realizado em banho de gelo. Obs 4: As clulas do peritneo devem ser obtidas injetando-se meio de cultura gelado na cavidade peritoneal; aps massageamento do peritnio cheio de lquido proceder retirada com seringa ou pipetas tipo Pasteur. Depois da lavagem da suspenso celular com nova soluo de meio adequado, as clulas ficam em condies de trabalho para imunofenotipagem ou para ensaios funcionais.
16.2
Preparo e Caracterizao de Esfregaos Celulares por Citocentrifugao
A centrfuga de clulas (Cytospin) permite o preparo de esfregaos das suspenses celulares para uma anlise morfolgica ou imunocitoqumica. Ela desenhada para preparar uma monocamada de clulas numa rea definida, para posterior processamento. til para o estudo de suspenses cuja densidade, com nmero insuficiente para anlise por citometria, ou para gerar amostras para anlise microscpica de suspenses utilizadas em outras metodologias. Compe-se de um suporte para lmina com um funil plstico que concentra as clulas ali depositadas num cilindro que drena para uma nica rea da lmina. Entre a lmina e o suporte colocado um molde espesso de papel de filtro perfurado exatamente no local de encontro com o cilindro que depositar as clulas na rea pr-determinada. O nmero ideal de clulas a ser dispersadas no campo circular que forma a base do cilindro de quinhentas clulas. Material
citocentrfuga e seus acessrios lminas com borda esmerilhada, previamente identificadas a lpis; podem ser ou no previamente revestidas
com gelatina, poli-L-lisina ou aminosilane suspenso de clulas a 1 x 106/ml (clulas de 10 a 12 m de dimetro); pode ser numa densidade maior ou menor, a depender do tamanho das clulas para amostras de sangue, lisar as hemceas, ou separar os leuccitos em gradiente de Ficoll. Para o preparo do esfregao, que possa ser utilizado em citoqumica, a contagem de hemceas deve ser menor que 5000/l (<5 x 106/ml) soluo de albumina 30% fixador: etanol 70%+polietileno glicol 2% (fixador de Saccomano) ou paraformaldedo 4% micropipetas e ponteiras cubas de descarte para desinfeco de ponteiras, lminas e filtros, e para desinfeo e lavagem dos suportes e presilhas
253
Procedimento
limpar as lminas com lcool e identific-las; preparar os conjuntos de suporte/filtro/lmina/prendedor; aplicar 25 l de albumina 30% no fundo da cmara de amostra (apenas se no for ser feito processamento de
imunofluorescncia; a albumina interfere com o brilho);
aplicar 25 l da suspenso no cone do suporte (no no funil), sem deixar a pipeta tocar no papel de filtro; fechar corretamente o suporte e colocar na centrfuga; centrifugar por 3-4 min a 1.000 rpm (a velocidade e o tempo devem ser testados antes, pois normalmente podem
ser ajustados ao tipo celular que se quer analisar; para clulas de bao usamos 5 min a 500 rpm);
remover do suporte da centrfuga e submergir a lmina no fixador; processar as clulas atravs do protocolo desejado (colorao por Giemsa ou outra, imunofluorescncia direta ou
indireta).
16.3
Preparo e Marcao (Fenotipagem) de Clulas para Citometria de Fluxo
A anlise por citometria de fluxo convencional permite a aquisio e a anlise de um mnimo de cinco parmetros que podem ter grande valor para a pesquisa de aspectos da imunopatogenia da doena de Chagas. Os dois parmetros morfolgicos, o desvio frontal (forward scatter, FSC, menos de 2) e o desvio lateral (side scatter, SSC, a 90) da luz indicam, respectivamente, o tamanho celular, proporcional rea de corte transversal da clula e granulosidade celular, ou melhor, o grau de diferena entre o ndice de refrao dos grnulos de uma clula em relao ao ndice de refrao do seu citoplasma. Neutrfilos e eosinfilos se distinguem de linfcitos, mas basfilos no, pois os grnulos tm ndice de refrao igual ao do citoplasma. Esses parmetros indicam o percentual relativo dessas populaes celulares, bem como os efeitos da ativao em termos de tamanho e granulosidade celular. Alm desses parmetros, a citometria permite facilmente a marcao com indicadores fenotpicos ou funcionais fluorescentes com at trs cores (verde, laranja e vermelho). Aparelhos especiais, ou adaptaes, podem ainda estender essas anlises para at oito cores diferentes. Entre as aplicaes mais freqentes da citometria destacamos: (1) a anlise de propriedades citoqumicas de clulas imunorrespondedoras (granulcitos, moncitos e linfcitos), tais como contagem diferencial de leuccitos, imunofenotipagem e caracterizao de subpopulaes celulares, quimiotaxia, endocitose, degranulao e catabolismo em resposta a estmulos, graus de maturao e ativao de linfcitos B e T; (2) medidas de DNA para estudo de ciclo celular e deteco de morte, necrose e apoptose; (3) diferenciao celular em diferentes sistemas, com medidas de ciclo celular, de traadores de mRNA, identificao de stios receptores e perfis de glicosilao, antgenos marcadores e mudanas estruturais. A anlise de amostras em citometria de fluxo segue as seguintes etapas:
preparao de uma suspenso aquosa de clulas isoladas do tecido ou cavidade de interesse; colorao especfica do componente celular que se quer estudar com anticorpos conjugados a fluorocromos; medida no citmetro (aquisio de dados); anlise quantitativa dos dados em computador; interpretao dos dados quantitativos em termos de relevncia biolgica ou mdica.
Para a fenotipagem celular, anticorpos monoclonais (mAb) e policlonais desenvolvidos contra diferentes protenas de membrana possibilitam a identificao de subpopulaes celulares. Como cada classe de clulas expressa, at certo ponto, um repertrio particular de molculas de membrana, o uso de um painel de anticorpos mAb e a anlise multiparamtrica por citometria de fluxo pode distinguir cada populao. Por exemplo, usando-se mAb anti CD3, CD4 e CD45RA pode254
se definir o percentual relativo de linfcitos T helper (positivo para os trs marcadores), linfcitos T citotxicos (positivos para CD3 e CD45RA, negativo para CD4), linfcitos B (negativos para CD3 e CD4 e positivos para CD45RA), e moncitos (negativos para CD3 e positivos para CD4 e CD45RA). Material
centrfuga para os tubos ou microplacas soluo de bloqueio anticorpos monoclonais marcados diretamente ou com os respectivos conjugados secundrios fluorescentes
dirigidos contra os marcadores fenotpicos desejados, como por exemplo: anti CD3-e, anti CD8, anti CD4, anti CD5, anti cadeia m, anti TCR, anti CD16/32 (clone 2.4G2) soluo de lavagem (BSS-soro fetal bovino 5%) fixador: PFA 1% soluo de passagem: PBS-FACS = PBS + 5% SBF + NaN3 1 mg/ml (0,1 %). Observaes gerais
a quantidade de clulas por amostra deve ser cinqenta a cem vezes maior do que o nmero de clulas que se
pretende analisar: para 104 clulas analisadas, pode-se prever 106 clulas coradas (por amostra, comumente um estoque de cerca de 5-20 x 106/ml); podem ser usados microtubos, tubos de 13x75 mm ou placas de 96 poos fundo V, a depender da centrfuga disponvel. As centrifugaes em microcentrfuga no devem ultrapassar 1min e em centrfuga de tubos maiores devem ser de 3 a 5 min; para microtubos aspirar o sobrenadante ao invs de verter; marcar as clulas no gelo e no escuro; os anticorpos interagem com as clulas de trs modos: ligao especfica ao epitopo; ligao a receptores Fc (essa ligao especfica e saturvel; imunoglobulinas isoladas se ligam a receptores de alta afinidade e imunoglobulinas agregadas por calor ou sob forma de complexo antigeno-anticorpo se ligam a receptores de baixa afinidade); ligao inespecfica (no saturvel); por isso indispensvel a etapa de bloqueio; importante corar clulas controle com um anticorpo no relacionado, e de mesmo isotipo, para testar a efetividade do bloqueio de receptor Fc; em mdia 1 g de anticorpo por 106 clulas suficiente, mas recomendada uma titulao prvia para se avaliar a concentrao ideal, pois pode haver superconjugao, agregao ou degradao. Neste casos o anticorpo tem baixa qualidade e pode gerar dados artefatuais; o uso de anticorpos secundrios na forma F(ab)2 elimina a ligao via Fc; as amostras devem ser guardadas sempre a 4C e ao abrigo da luz at o momento da leitura; sempre que possvel utilizar controles positivos de marcao. Cuidados especiais Usar os anticorpos na diluio apropriada, fazendo uma titulao prvia, antes de usar em qualquer experimento, com o seguinte procedimento:
incubar clulas com diluies seriadas do anticorpo; obter seus histogramas de fluorescncia superpostos com o histograma do tubo controle (isotipo no relacionado, tubo no marcado ou tubo incubado apenas com o conjugado, segundo o protocolo usado);
ajustar o marcador para o limite de negativos e positivos usando o histograma do tubo controle; criar uma regio correspondente s clulas positivas e outra s negativas; analisar a mdia da intensidade de fluorescncia em cada regio (negativa e positiva) para cada diluio do
anticorpo sob teste;
calcular a razo entre a fluorescncia das clulas positivas e negativas (relao sinal/rudo).
255
A nica concentrao de anticorpo que corresponde diluio apropriada a ser usada aquela na qual a relao sinal/rudo mxima. Nessa concentrao a ligao inespecfica mnima e a especificidade de ligao mxima. Para encontrar essa concentrao, o marcador para clulas positivas deve ser ajustado de modo a que mais de 99% das clulas coradas com o isotipo controle (o tubo controle em questo) estejam na faixa negativa. Fenotipagem em uma cor
I NDIRETA
Anticorpo primrio seguido de um anticorpo secundrio conjugado a fluorocromo colocar a quantidade adequada de clulas nos tubos (106 clulas em 50 l); adicionar 10 l da soluo de bloqueio por 10 min (ver Material); aps centrifugao, adicionar a quantidade apropriada do anticorpo primrio e incubar por 15 min;
Obs: pode-se usar tempos de incubao maiores mas no necesrio porque o processo de ligao do anticorpo ao epitopo rpido; para antgenos intracelulares pode ser necessrio maior tempo.
adicionar PBS, centrifugar as clulas a 400 g, decantar o sobrenadante (retirar o excesso de PBS sobre papel
absorvente) e ressuspender as clulas no volume residual (isso consiste numa lavagem); seguem-se duas a trs lavagens, ou pode ser feita uma nica vez utilizando-se cinqenta a cem vezes o volume de tampo sobre o volume residual das clulas; se a lise de hemceas for desejada, substituir o PBS por soluo de lise na etapa 4, como a primeira lavagem; adicionar a quantidade apropriada do anticorpo secundrio fluorescente, incubar 15 min e lavar; ressuspender as clulas em fixador ou se desejar analisar clulas vivas, no meio desejado; adquirir os dados no citmetro. Anticorpo primrio biotinilado seguido de avidina conjugada a fluorocromo
aliquotar e bloquear (etapas 1e 2 iguais); adicionar a quantidade apropriada de anticorpo primrio biotinilado, incubar 15 min e lavar. Se a lise for
necessria, substituir o PBS por soluo de lise (como descrito no item anterior); adicionar a quantidade apropriada da avidina fluorescente, incubar 15 min e lavar; fixar e analisar (etapas 7 e 8 iguais).
D IRETA
Anticorpo primrio conjugado a fluorocromo aliquotar e bloquear; adicionar o anticorpo fluorescente por 15 min e lavar e/ou lisar; lavar, fixar e analisar (etapas 6, 7 e 8 ).
Nmero mnimo de alquotas para a fenotipagem a uma cor

Tubo 1 2 3 4 Reagente Sem conjugado fluorescente PBS+bloqueio+lise Conjugado fluorescente do pico negativo Isotipo primrio no relacionado + conjugado fluorescente Isotipo primrio especfico + conjugado fluorescente Objetivo FSC/SSC e autofluorescncia Ligao background para definir a posio Ligao especfica do isotipo via Fc - controle negativo Determinao das clulas positivas
256
Regras bsicas para conjugao dos trs procedimentos
se usar o Mtodo 1, ele deve ser sempre realizado primeiro; o anticorpo secundrio deve ser bloqueado por IgG da mesma espcie do primeiro anticorpo, de modo a no se
ligar a nenhum dos anticorpos primrios subseqentes; as etapas de bloqueio e de controle com o isotipo no relacionado so essenciais para garantir a especificidade das ligaes; se o isotipo controle se ligar a quaisquer das clulas coradas por uma combinao entre o primeiro e o segundo anticorpos, o bloqueio no foi efetivo e os dados sero artefatuais. Em caso de utilizao de sistema de relao, proceder a controle semelhante ao anterior e tambm a controle, omitindo-se o anticorpo primrio. H necessidade de controles positivos de marcao com as clulas utilizadas no ensaio para calibrao da fluorescncia no citmetro de fluxo. Estes controles devem sempre ser feitos em paralelo ao ensaio, tomando-se o cuidado de utilizar em tais controles populaes celulares que apresentem subpopulao negativa e positiva para os marcadores celulares utilizados (nunca utilizar populaes completamente positivas nem populaes duplamente positivas em caso de se utilizadar dois marcadores simultneos para controle da fluorescncia).
16.4
Ensaios de Ativao Celular e Citotoxicidade In Vitro
A morte celular um processo fisiolgico fundamental para vrios sistemas biolgicos como seleo negativa de linfcitos no timo, controle da resposta imunolgica estabelecida, e outros. Vrios so os mecanismos indutores de morte celular ou citotoxicidade. Macrfagos induzem morte celular basicamente via liberao de TNF e NO nos stios inflamatrios, enquanto linfcitos T induzem morte celular via mecanismos mais especficos dependentes de interao receptor/ligante. Clulas T CD4+ induzem morte celular principalmente pela via dependente de Fas/Fas-L, enquanto linfcitos T CD8+ usam majoritariamente a via dependente de perforina e granzimas. O desenvolvimento de procedimentos rpidos e eficientes para quantificar morte celular in vitro e estimular clulas do sistema imune, como clulas efetoras citolticas, foi fundamental no estudo das relaes intercelulares e atuao de molculas citolticas.
16.4.1 Purificao de subpopulaes de esplencitos

16.4.1.1. Separao por microesferas (beads) magnticas
a) Coleta de baos
coletar os baos e macer-los em peneira fina ou em duas lminas de vidro com superfcie spera; colocar o material em placa de Petri estril e adicionar 5-10 ml de RPMI gelado sem soro; homogeneizar cuidadosamente com pipeta Pasteur; transferir as clulas para um tubo de 15 ml e deixar no gelo por 5 min; aps decantar os fragmentos, coletar o sobrenadante; centrifugar a 250 g por 10 min, retirar todo o sobrenadante e agitar o sedimento; adicionar 3 ml de RPMI + 3 ml de NH4Cl a 0,85%; centrifugar 1x; retirar o sobrenadante e adicionar 3 ml de NH4Cl (no lisar as hemcias por choque hipotnico); centrifugar mais 1x;
257
ressuspender as clulas em meio completo; contar as clulas viveis em azul de Tripan.

b) Conjugao clulas/anticorpos seleo negativa
separar as clulas em tubos contendo 1-4x107 clulas em 3 ml de meio completo; usar todos os anticorpos na concentrao final de 10 g/ml - na ausncia de azida; adicionar s clulas os anticorpos relativos s populaes a depletar (1 ml volume final); homogeneizar e incubar por 30 min a 4oC.
Anticorpos usados para isolamento das clulas
Clulas T CD4+ -CD8 -CD45R -MAC-1 -Ia Clulas T CD8+ -CD4 -CD45R -MAC-1 -Ia Clulas B -CD8 -CD4 -MAC-1 -
c) Preparao das microesferas magnticas Obs: a preparao das esferas varia de acordo com o fabricante; portanto deve-se consultar o seu manual especfico
tomar o volume recomendado pelo fabricante de acordo com o nmero de clulas; adicionar 40 ml de soluo de Hanks sem soro s microesferas para lav-las; agitar bem e colocar no campo magntico; esperar as microesferas aderirem parede do tubo e desprezar o meio; repetir o processo de lavagem mais duas vezes; ressuspender as microesferas em 3 ml de RPMI.
d) Purificao
lavar 1x as clulas que foram incubadas com os anticorpos na geladeira; ressuspender em 3 ml de meio completo; juntar as clulas e as microesferas magnticas - volume final de 6 ml contendo 5% de SFB; agitar o material e incubar por 30 min a temperatura ambiente; agitar 2x; colocar a mistura no separador magntico; aguardar at o lquido ficar translcido; coletar o mximo de meio e colocar em tubos no gelo; adicionar mais 6 ml de meio e repetir o processo de purificao trs vezes ao todo; centrifugar o material coletado e contar.
16.4.1.2. Separao em coluna de l de nilon
a) Preparao da l
mergulhar a l num becker de 1 litro, contendo salina, por 2 h a 37oC; lavar a l 3x em gua bidestilada a temperatura ambiente; deixar a l por 5 dias em gua destilada a 37oC, mudando a gua todos os dias; deix-la secar por 2-3 dias a 37oC; separar alquotas de 0,7 g de l e desfi-la muito bem at comear a aderir nos dedos; colocar a l em seringas vazias de 12 ml, preenchendo a seringa at pelo menos a metade; vedar e ensacar as colunas e autoclav-las normalmente.
258
b) Preparao da coluna
colocar a coluna na posio vertical com a sada do lquido bloqueada; adicionar 20 ml de RPMI sem soro e apertar as laterais da l com pipeta Pasteur at molh-la totalmente; desbloquear a sada de lquido e desprezar; repetir a adio de meio e desprezar; bloquear a sada de lquido; adicionar 20 ml de RPMI + 5% de SFB; drenar o excesso de meio e deixar a coluna a 37oC por 1 h antes de adicionar as clulas.
c) Adio de clulas
aplicar na coluna um volume total de 2 ml de RPM + 5% de SFB contendo 1-3x108 clulas; embalar a coluna e deix-la por 1 hora a 37oC.
d) Eluio das clulas no aderentes (populao enriquecida em clulas T)
lavar a coluna muito lentamente com meio aquecido contendo soro fetal bovino; coletar os primeiros 25 ml e centrifugar a 250xg por 10 min; contar as clulas viveis por excluso em azul de Tripan.
e) Eluio das clulas aderentes (populao enriquecida em clulas B)
depois de coletar as clulas no aderentes (item d), comprimir a l e coletar o meio restante; adicionar mais meio com soro e comprimi-la de novo; repetir o processo at que sejam coletados 25 ml; centrifugar o material a 250xg por 10 min e contar as clulas viveis em azul de Tripan.
16.4.2 Ativao de linfcitos in vitro
Freqentemente, utilizam-se trs tipos de estmulos para ativao in vitro: lectinas (Con A ou PHA, 5 g/ ml), LPS (5 g/ml), ou anticorpos monoclonais como por exemplo anti CD3 que so cultivados por tempos variados de 3 a 72 h. Ao longo desse perodo vrias anlises podem ser feitas: a medida de proliferao celular, as modificaes morfolgicas de tamanho e granulosidade, ou a expresso de antgenos caractersticos do processo de ativao. 16.4.2.1 Ativao por Con-A
coletar as clulas de bao como descrito anteriormente; ajustar a concentrao de clulas para 5-10x107 clulas por ml de meio completo; adicionar 4 g de Con-A por ml de meio; se a ativao for executada em placa de 96 poos, utilizar 2 x 105 clulas/poo; agitar bem e incubar a 37oC por 12 h; coletar as clulas agitando suavemente com pipeta Pasteur - elas devem estar grumadas; centrifugar a 250xg por 10 min; contar as clulas viveis em azul de Tripan.
259
16.4.2.2 Ativao por anti CD3

a) Imobilizao de anti CD3
colocar por poo (placa de 24 poos) uma concentrao final de 5 g de anti CD3 em um volume de 300 l de
meio, ou suspenso a 25% de sobrenadante do hibridoma 145-2C11; manter a 37oC por 4 h; lavar os pocinhos, muito cuidadosamente, 3x com RPMI sem soro e aquecido; colocar por ltimo RPMI com soro.
b) Aplicao das clulas
coletar as clulas de bao como descrito anteriormente; passar em coluna de l de nilon ou em microesferas magnticas, como descrito anteriormente; plaquear 3x106 clulas por pocinho at completar pelo menos 1 ml final; incubar a 37oC por 12 h.
16.4.2.3 Clulas apresentadoras de Ag - doena de Chagas
Estimulao primria in vivo
infectar camundongos singnicos C57BL/6 com T. cruzi

Estimulao secundria in vitro
Coleta de macrfagos
sacrificar camundongos C57BL/6 normais; expor o peritnio e injetar 5 ml de RPMI gelado sem soro; agitar a cavidade abdominal do camundongo; coletar o meio e manter as seringas no gelo; avaliar a presena de bactrias no material ao microscpio; centrifugar as clulas a 250xg por 10 min; ressuspender o material em RPMI gelado contendo 5-10% de SFB e 1% de L-glutamina; contar a viabilidade em azul de Tripan.
a) Cultura e infeco de macrfagos
plaquear 2-5x106 macrfagos por garrafa de 25 cm2; deix-los aderir por 1 h a 37oC; infectar a cultura com a mesma cepa de parasita que os camundongos foram infectados na proporo de dez
parasitas por clula; incubar a cultura por 12 h a 37oC; lavar as garrafas pelo menos 5x com RPMI aquecido e sem soro, agitando suavemente a cultura; incubar as clulas por 24 h a 37oC em RPMI + 5-10% de SFB e 1% de L-glutamina; lavar as garrafas 2x em RPMI aquecido e sem soro; irradiar a cultura com 15.000 rad.
b) Co-cultura de macrfagos infectados in vitro com linfcitos de camundongos infectados in vivo (apresentao de antigeno)
pelo menos dois meses aps a infeco, sacrificar os camundongos infectados com T. cruzi e coletar os baos; adicionar 3-5x107 esplencitos por garrafa de macrfagos infectados irradiados; manter a co-cultura por cinco dias a 37oC.
260
c) Separao parcial de debris e clulas mortas
coletar as clulas homogeneizando gentilmente com pipeta Pasteur; centrifugar as clulas a 250xg por 10 min; ressuspender o sedimento em 5 ml de RPMI sem soro; colocar 5 ml de SFB concentrado no fundo do tubo usando pipeta Pasteur; perceber a formao da segunda fase; centrifugar a 250xg por 10 min; coletar o sedimento (as clulas mortas e restos celulares ficaro na interface).
16.5.3 Ativao de linfcitos in vivo
16.5.3.1 Reao enxerto x hospedeiro
a) Camundongos
camundongos C3H/He (H-2k) de 3-4 semanas de idade como doadores de timcitos camundongos C57BL/6 (H-2b) de 7-8 meses de idade como animais recipientes
b) Coleta de timos
retirar os timos dos animais C3H/He e coloc-los em RPMI + 10 mM de HEPES gelado sem SFB; macer-los usando duas lminas de microscpio com superfcie spera; coletar as clulas em placa de Petri; homogeneizar cuidadosamente o material com pipeta Pasteur e transferir para tubos de 15ml; deixar os fragmentos de tecido decantarem por 5 min no gelo; coletar o sobrenadante; centrifugar a 250xg por 10 min; contar as clulas viveis em azul de Tripan; ajustar a concentrao para 1x109 clulas viveis/ml.
c) Obteno de linfcitos alognicos ativados
injetar 100 l de timcitos (1 x 108) por via intravenosa em camundongos C57BL/6 irradiados (800 rad); sacrificar os animais recipientes cinco dias aps a injeo (acompanhar a mortalidade dos camundongos nesse
perodo) e usar como clulas efetoras contra alvos de C57BL/6; coletar os esplencitos como descrito anteriormente; os baos devem estar bem pequenos com pontos de proliferao celular. 16.5.3.2 Reao hospedeiro x enxerto
Sensibilizao primria in vivo
a) Injeo de clulas alognicas
tomar uma cultura de EL-4 (C57BL/6 H-2b) com pelo menos 95% de viabilidade; lavar as clulas 3x em RPMI sem soro; incubar a cultura por 4 h a 37oC em RPMI sem soro, trocando 2x o meio, para reduzir a quantidade de
protenas do soro;
centrifugar as clulas a 250xg por 10 min; ressuspender em PBS + 0,02% de EDTA; contar as clulas viveis em azul de Tripan; ajustar a concentrao para 1x108 clulas/ml; injetar 100 l de clulas por via intraperitoneal em camundongos Balb/C (H-2d).
261
Sensiblilizao secundria in vitro
b) Obteno de linfcitos sensibilizados coletar o bao dos animais 10-20 dias aps sensibilizao primria in vivo (ver 16.4.1.1a); ajustar a concentrao para 2,5x106 clulas por ml de meio completo; aplicar 2 ml de clulas por pocinho de placa de 24 poos; deixar as clulas na geladeira por no mximo 1 h. c) Irradiao de clulas sensibilizadoras tomar uma cultura de clulas EL-4 com pelo menos 95% de viabilidade; lavar 3x a cultura em PBS + 0,02% de EDTA; contar as clulas viveis em azul de Tripan; ajustar a concentrao para 3x107 clulas/ml; irradiar a cultura com 5.000 rad; adicionar 100 l de clulas EL-4 metade dos pocinhos contendo linfcitos (item a) clulas efetoras e clulas efetoras controle; manter a co-cultura a 37oC por 4-5 dias; verificar a viabilidade diariamente.
51
16.5.4 Marcao de clulas alvo com

Mtodo
Cr
tomar uma cultura de clulas-alvo com pelo menos 95% de viabilidade; centrifugar as clulas a 250xg por 10 min; ressuspend-las em 5 ml de RPMI + 5 % de SFB; contar as clulas viveis em azul de Tripan; ajustar a concentrao para 1x106 clulas/ml de meio de marcao; incubar as por 1h a 37oC; lavar 2x em RPMI + 5% de SFB; incubar por 30 min a 37oC; lavar 2x em RPMI + 5% de SFB; tomar uma alquota de 1x104 clulas para leitura em contador gama - a contagem deve ser de pelo menos
10.000 cpm; ajustar o nmero de clulas-alvo para mais ou menos este nvel de contagem.
16.5.5 LDCC (Lectin Dependent Cell Cytotoxicity)

Mtodo
plaquear as clulas-alvo marcadas em placa de 96 poos com fundo em U ou V; adicionar as clulas efetoras nas propores desejadas em triplicata;
Obs: as clulas-alvo e efetoras no precisam ser singnicas
adicionar Con-A na concentrao final de 5 g/poo; o volume final por poo deve ser de 200 l; agitar gentilmente com micropipeta; incubar a placa por 15 min temperatura ambiente; centrifugar a 130 x por 5 min; incubar a placa do ensaio de citotoxicidade por 5 h a 37oC; centrifugar a placa a 250xg por 10 min; coletar 100 l de cada poo; fazer a leitura em contador gama.
262
Clculo de citotoxicidade especfica porcentagem de liberao especfica = lib. experimental - lib. espontnea lib. mx. (100%) - lib. espontnea
GOODING, L. R. & EDWARDS, C. B. H-2 antigen requirements in the in vitro induction of SV40-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Immunolgy, 124:1258-1262, 1980. GOODING, L. R. Specificities of killing by cytotoxic lymphocytes genetated in vivo and in vitro to syngeneic SV40 transformed cells. Journal of Immunolgy, 118:920-927, 1977. JULIUS, M. H.; SIMPSON. E. & HERZENBERG, L. A. A rapid method for isolation of functional thymus-derived murine lynphocytes. European Journal of Immunology, 3:645-649, 1973. LECLARE, J. C.; PLATER, C. & FRIDMAN, W. H. role of the Fc receptors (FcR) of thymus-derived lymphocytes. European Journal of Immunology, 8:543-554, 1977. PINCUS, J. H.; LINCOLN, P . & REISFELD, R. A. Separation of murine lymphoid cells using nylon wool columns. Transplantation, 18:544-549, 1974. STEWART, C. C. & STEWART, S. J. The use of directly and indirectly labeled monoclonal antibodies in flow cytometry. In: Methods in Molecular Biology, vol 45: Monoclonal antibody protocols, ch. 15. 1996. Totowa, NJ: W.C. Davis Humana Press Inc.
263
Anexo 16.1
Preparo de solues especiais e tampes

PBS (Phosphate-buffered saline) NaCl Na2HPO4.12H2O KH2PO4 KCl Ajustar para pH 7,4 mM 150 10 1 2 Soluo de Alsever Glicose NaCl Citrato de sdio mM 115 72 30
BSS (Balanced Salt Solution)1 Componente Glicose NaCl KH2PO4 Na2HPO4.12H2O CaCl2. 2H2O KCl MgCl2.6H2O MgSO4.7H2O Vermelho de fenol
1
Concentrao final 5,5 mM 140 mM 0,4 mM 1,5 mM 1 mM 5 mM 0,9 mM 0,8 mM 0,001%
Soluo A (10x) para 1.000 ml 10,0 g
Soluo B (10x) para 1.000 ml 80,0 g
0,6 g 5,37 g 1,86 g 4,0 g 2,0 g 2,0 g 0,1 g
Mishell & Duton (1967), Journal of Experimental Medicine 126: 423
preparar separadamente as solues estoques A e B (10 X concentradas), mistur-las 1:1 e dilu-las 5-10x, para ter BSS 2x ou 1x; filtrar atravs de membrana de 0,22 m e estocar a temperatura ambiente ou a 2-6oC testar a esterilidade incubando por sete dias a 37oC. O pH da soluo BSS 1x deve estar em torno de 7,2-7,4.
Meio de cultivo de linfcito Meio RPMI Tampo HEPES 2-mercaptoetanol Piruvato de sdio Amino cidos no essenciais L-glutamina Soro fetal bovino Penicilina/estreptomicina Soluo para Citometria de Fluxo1 Lavagens e diluies Fixadora Bloqueio PBS s/clcio s/magnsio, c/ 0,1% azida sdica pH 7,2-7,4 paraformaldedo ou formaldedo ultrapuro2 1 a 2% BSA 1% soro normal da espcie do Ac secundrio (5 a 10%) frao IgG (melhor) desse soro (2 mg/ml) 85 ml 10 mM 5x10-5 M 1% 1% 1% 10% 1%
1 2
osmolaridade ajustada ao animal no usar formaldedo impuro ou glutaraldedo, pois aumentam a autofluorescncia
1,652 g 0,2 g 0,0074g
Soluo de lise de hemceas Cloreto de amnio Bicarbonato de potssio EDTA Completar para 200 ml com H2O destilada
((NH4)2CO3), que no lisa as hemceas; pr-pesar os reagentes e estoc-los em pacotes para dissolver quando preciso.
264
preparar no dia de uso para evitar que o CO2 dissolvido na gua combine para formar o carbonato de amnio
Captulo 17
Coleta e Processamento de rgos e Tecidos para Avaliao da Infeco

Andra Pereira de Souza, Suzana Crte-Real Faria, Claudia M. L. M. Coutinho, Maria de Nazar C. Soeiro & Claude Pirmez
O estudo dos tecidos dos animais infectados um campo extremamente amplo e passvel de diferentes aplicaes. As primeiras grandes descobertas a respeito da doena de Chagas aguardaram as anlises histopatolgicas meticulosas dos dez primeiros casos letais que Carlos Chagas diagnosticou e enviou a Gaspar Vianna, publicadas em 1911; desde ento leses em modelos experimentais correspondentes s leses humanas tm sido muito estudadas (ver Captulo 9). As principais aplicaes so no estudo histopatolgico clssico de cortes parafinados corados para observao em microscopia ptica, no estudo citopatolgico por microscopia eletrnica e no estudo imunopatolgico por tcnicas especiais de imunocitoqumica. Descreveremos aqui os protocolos mais comumente utilizados. O cuidado especial que se deve ter quanto ao manuseio do animal infectado pois, alm do sangue ser potencialmente infectivo para o pesquisador e o tcnico, os demais lquidos corporais e os tecidos tambm podem conter parasitas viveis que contaminam as solues de lavagem nas quais se processam os tecidos at sua fixao. Portanto, todas as normas de segurana devem ser seguidas risca (ver Captulo 8). A anlise macroscpica do animal e dos rgos coletados deve ser cuidadosa. O mau estado geral do animal caracteriza-se por apatia, perda de peso e plos, gengivite ulcerada, palidez das mucosas, dispnia e edema generalizado. A autpsia revela edema do tecido subcutneo e derrame lquido, claro e transparente, nas cavidades pericrdica, pleural e abdominal (ascite). Pode-se analisar estes lquidos quanto presena de formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi, aps concentrao por microhematcrito ou por hemocultura. A pesagem e observao do volume dos rgos, sobretudo bao e corao, revelam sua congesto e, ao corte, as cavidades trio-ventriculares podem apresentar ntidos sinais de dilatao e presena ocasional de trombos.
265
17.1 Coleta e Processamento de rgos para Microscopia ptica

17.1.1 Coleta para histologia convencional em parafina
Material
equipamento de proteo para o trabalho com T. cruzi (ver Captulo 8) cmara de anestesia com clorofrmio ou ter (vidro com tampa larga e algodo no fundo) placa de cortia (para a fixao do animal) soluo salina fisiolgica para lavagem dos rgos lcool a 70% placa de Petri com soluo salina para a lavagem pipetas Pasteur para troca da salina de lavagem recipientes de descarte de lquidos e de carcaas com as devidas solues desinfectantes soluo fixadora (formalina 10% ou fixador de Millonig-Rosman) tesoura de ponta afiada pinas anatmica e dente de rato pina de relojoeiro recipiente para a fixao do material
Procedimento
colocar o camundongo na cmara de anestesia;

Obs: para o sacrifcio dos animais existe uma tendncia crescente substituio da anestesia por ter ou clorofrmio pela decaptao ou asfixia com CO2, que parecem ser mais indolores.
fix-lo na placa de cortia, em cruz (cuidado com as agulhas usadas para fixar os animais: os acidentes de
laboratrio mais freqentes ocorrem pela manipulao inadequada de agulhas); aplicar jatos de lcool a 70% no corpo do animal antes de dissec-lo; abrir primeiramente a pele do animal e em seguida o peritnio (uma pina para cada revestimento); retirar os rgos evitando seu pinamento ou esmagamento; lavar os rgos com soluo salina, pois excesso de sangue e de muco na sua superfcie formam um filme protetor, impedindo uma penetrao adequada do fixador; recortar o rgo em fatias delgadas para que o fixador penetre rpida e homogeneamente. A espessura depende muito do material a ser processado, bem como do fixador de escolha (poder de penetrao e velocidade de difuso deste);
Obs: o crebro deve ser fixado por inteiro e somente depois clivado. Por outro lado, as peas devem ser pequenas (1 a 2 mm de espessura) sempre que se empregue um fixador pouco penetrante (ex. cido smico), mas podem ter de 0,5 a 1 cm quando se utilizam fixadores com maior poder penetrao (ex. formol, Bouin, Zenker). O importante assegurar-se que o fixador atue de maneira uniforme sobre toda a pea, sendo aconselhvel evitar-se que a pea fique apoiada no fundo do frasco (colocar uma camada de cerca de 1 cm de algodo no fundo do frasco, ou mant-la suspensa no frasco amarrando com um fio). O tempo mnimo de fixao varia muito conforme a pea e o tipo de fixador, e no h limite mximo para fixao; o tecido pode permanecer por tempo indeterminado at seu processamento. O material deve ser colocado em um recipiente que permita que o volume do lquido fixador seja de dez a vinte vezes maior que o do espcime.
para se calcular o ndice cardaco, o corao deve ser pesado e fixado in totum. O ndice pode ser calculado a partir da
relao percentual entre o peso do corao e o peso do animal [(peso do corao/peso corporal) x 100].
266
17.1.2
Coleta para histoqumica em cortes congelados obtidos em criostato
Material
tubos de criopreservao ou formas para congelamento

Obs: existem no mercado formas de vrios tamanhos, descartveis; pode-se tambm preparar forminhas cilndricas de papel laminado usando como forma a extremidade arredondada de uma pipeta ou de um tubo de ensaio, a depender do dimetro do rgo ou tecido a ser congelado, e adapt-las dentro de tubos de congelamento; outra opo a embalagem plstica de comprimidos.
material de disseco idntico ao usado para coleta para histopatologia convencional; todo o material que
receber os rgos a ser congelados (placas de Petri, salina, etc.) dever estar em banho de gelo
crioprotetor (optimal cutting temperature compound - OCT) cuba (garrafa trmica) com nitrognio (N2) lquido ou com gelo seco
Procedimento
remover o rgo inteiro como descrito no item 17.1.1 e lavar em salina gelada, drenar o excesso de salina e clivar
o rgo em fragmentos de 2 a 3 mm de espessura (a largura vai depender da forma);
Obs: rgos pequenos como timo no precisam ser clivados; emblocar em posio anatmica com a face externa para baixo; rgos maiores como bao e fgado devem ser cortados transversalmente e emblocados com a face do corte voltada para baixo; rgos de tamanho mdio como corao ou rim devem ser cortados longitudinalmente (partir em duas metades) e emblocados em posio anatmica, com a face externa voltada para baixo.
colocar o pedao do tecido no molde apropriado com a face de corte voltada para baixo e cobrir com crioprotetor
(OCT, Ames Co., Elkhart, Indiana);
tampar o tubo e congelar em N2 lquido; cortar em criostato. Para iniciar os cortes deve-se esperar que a temperatura do tecido equilibre com a temperatura do criostato (-25 a -30oC), caso contrrio, ser difcil a obteno de cortes finos;
Obs: o tecido pode ser estocado a longo prazo em freezer a -70oC ou em N2 lquido, ou a curto prazo em freezer a -20oC. Usar gelo seco ou N2 lquido para transportar o tecido do freezer para o criostato, para evitar descongelamento. Terminados os cortes, cobrir a face exposta do tecido emblocado com uma gota de OCT, congelar, e guardar. Esse procedimento evita o ressecamento do tecido no freezer ou N2 lquido.
17.1.3. Processamento dos tecidos para microscopia ptica

17.1.3.1. Processamento de tecidos para histopatologia convencional por microscopia ptica
a. Desidratao e diafanizao
Material
tecidos fixados em formalina ou fixador de Millonig cestinhas para conter o material identificado lcool em concentraes crescentes (70, 80, 90% e absoluto) agente diafanizador: xilol e benzeno so mais freqentemente utilizados
Procedimento
aps a fixao, remover o excesso de lquido fixador; para isso necessrio lavar em gua corrente por um
perodo de 30 min a 1h;
267
passar os tecidos em solues alcolicas de concentraes crescentes, at o lcool absoluto, onde a gua
totalmente removida. So seis banhos sucessivos de 1h cada, nas seguintes solues: lcool 70, 80, 90%, lcool absoluto I, II e III; para diafanizao, passar o material na soluo diafanizadora absoluta (xilol), pois o lcool, como a gua, no miscvel com a parafina, havendo assim, a necessidade de ser substitudo por um reagente solvente da parafina. So mais trs banhos sucessivos de 1h cada nas seguintes solues: xilol I, II e III. b. Infiltrao e incluso em parafina
Material
parafina filtrada formas para a incluso bico de Bunsen freezer para colocar o material includo na forma estufa na faixa de 56 a 58oC para derreter a parafina pina
Procedimento
transferir o material do agente diafanizador para a parafina derretida, mantida suficientemente aquecida. A
parafina com o ponto de fuso entre 56 e 58 a desejada para os trabalhos de rotina. A parafina de incluso deve ser nova e aquecida em torno de 5 acima do seu ponto de fuso. Para infiltrao do material por parafina usamse dois banhos sucessivos de 1h cada nas solues parafina I e parafina II; a incluso consiste em colocar, atravs de pina aquecida, os tecidos previamente infiltrados, com a superfcie clivada no fundo da forma preenchida com parafina derretida (soluo de parafina III);
Obs: se a parafina de incluso no for da marca Reagen, deve ser adicionada cera de abelha (aditivo). Outra opo o uso de pastilhas da Merck; neste caso no h necessidade de adio de cera.
depois da incluso, as formas devem ser resfriadas no freezer ou chapa refrigerada; logo aps so obtidos blocos
com algumas presses na forma. c. Microtomia e montagem dos cortes na lmina
Material
micrtomo porta-bloco navalha bem amolada ou descartvel banho-maria a 45oC pina cubas de gelo lminas bem limpas e desengorduradas albumina 30% pincel com cerdas macias
Procedimento
montar o bloco no porta-bloco antes de seccion-lo. A face do bloco a ser cortada dever ser plana e conter
bastante parafina para que se possa desbast-la at chegar o tecido;
regular o micrtomo em 5 mm, pois as seces com essa rotina so em geral satisfatrias; resfriar bem a superfcie do bloco com um cubo de gelo antes de ser cortado, para evitar cortes ressecados; operar o micrtomo com movimentos delicados, contnuos e relativamente lentos, para se obter fitas de cortes
uniformes;
268
estender ou espalhar os cortes que se apresentam ligeiramente enrugados em uma cuba em banho-maria.
Para espalhar os cortes na lmina faz-se o seguinte procedimento:
colocar um segmento da fita de cortes, com auxlio de um pincel de cerdas macias, para flutuar na superfcie da
gua aquecida (10C abaixo do ponto de fuso da parafina);
transferir ou pescar os cortes para as lminas revestidas com albumina, que tem propriedades adesivas e
propicia uma melhor fixao do corte na lmina;
colocar as lminas em uma placa aquecida ou em estufa a 55C , para a secagem da gua e coagulao do filmeadesivo;
manter o material temperatura ambiente, protegido da poeira at a desparafinizao.

d. Desparafinizao e rehidratao
Material
xilol absoluto lcool em diferentes concentraes (70, 80, 90% e absoluto) gua destilada
Procedimento
antes de corar os cortes, remover a parafina residual. Para isso, usualmente se emprega-se o xilol como solvente.
As lminas passam por banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes solues: xilol I, II e III;
se a soluo corante a ser usada for aquosa, os cortes so hidratados por passagem seriada em solues alcolicas
de concentraes decrescentes. Durante a reidratao dos cortes as lminas no devem ser deixadas secas por completo. As lminas passam por banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes solues: lcool absoluto I, II e III, lcool 90% , 80%, 70% e gua destilada. e. Colorao por hematoxilina e eosina
Material
hematoxilina de Harris eosina Y lcool clordrico 1% gua actica 1% lcool em diferentes concentraes (70, 80, 90% e absoluto) xilol absoluto
Procedimento
a hematoxilina aquosa, por isso deve-se mergulhar o material na gua para que ocorra a oxidao. A hematoxilina
de Harris cora regressivamente. O lcool clordrico 1% serve para diferenciar o corte, pois a hematoxilina de Harris supercora o tecido. A gua actica 1% serve para segurar a eosina no tecido. A seqncia de colorao a seguinte: hematoxilina (15 min) lcool clordrico 1% (trs mergulhos) gua corrente (at ficar violeta) eosina (2,5 min) gua actica 1% (trs mergulhos); o material deve ser desidratado em lcool, pois este remove a gua e atua como um agente diferenciador em caso de excesso de corante. So banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes solues: lcool 70, 80, 90%, lcool absoluto I, II e III; no clareamento, o xilol torna o tecido transparente. So banhos sucessivos de 3 min cada nas seguintes solues: Xilol I, II e III.
269
f. Montagem dos cortes entre lmina e lamnula

Material
pina blsamo do Canad lamnula (com o tamanho apropriado para o corte e bem limpa em soluo sulfocrmica)
Procedimento
retirar, cuidadosamente, sem estragar o tecido, uma lmina do ltimo banho de xilol, com o auxlio de uma
pina. Permitir um escoamento do excesso do xilol; manter a lmina em uma posio moderadamente inclinada, colocar uma gota de blsamo do Canad prximo borda do corte; colocar a lamnula de tamanho apropriado, em um ngulo prximo borda da lmina, e permitir que a mesma se deposite sobre o corte. Deve-se tomar cuidado para evitar a formao de bolhas de ar, presas entre a lmina e lamnula. Caso isto ocorra, as bolhas podem ser retiradas, aplicando-se uma presso leve sobre a lamnula, com o auxlio de uma pina. Caso as bolhas persistam, recolocar a lmina no banho de xilol e quando a lamnula for descolada, remontar o corte; aps a montagem do corte entre a lmina e a lamnula, a lmina deve ser levada ao microscpio ptico a fim de verificar aparecimentos de dentes, microdentes, ressecamento e artefatos. A depender dos defeitos encontrados, um novo corte do bloco de parafina dever ser feito.
17.1.3.2 Interpretao das lminas

A anlise histopatolgica exige prtica e conhecimento de histologia, a fim de que as caractersticas a serem observadas nos tecidos sejam bem destacadas. essencial o conhecimento da histologia normal dos rgos que sero estudados. A ateno do observador se concentra em identificar: ninhos de parasitas (clulas com amastigotas em proliferao, e a caracterizao do tipo celular infectado) focos de infiltrados inflamatrios nos diferentes tecidos dos rgos em estudo: presena de clulas polimorfo- ou mononucleares infiltrantes, sua distribuio topogrfica na histologia caracterstica do rgo e a composio citolgica do infiltrado. O infiltrado pode ser focal, zonal, ou difuso e acmulos de macrfagos podem at chegar a formar ndulos edema congesto vascular neurite necrose focal fibrose, hipertrofia e atrofia destruio (degenerao) tissular Aps a anlise e descrio qualitativa das caractersticas histopatolgicas encontradas nas lminas, pode ser feita uma anlise quantitativa, tanto do parasitismo tissular como da inflamao tissular. Nos dois casos pode-se analisar: a freqncia percentual de encontro de ninhos e/ou de focos inflamatrios nos cortes de diferentes animais segundo o grupo experimental estudado o nmero de ninhos de parasitas e/ou de focos inflamatrios por unidade de rea observada, expresso em nmeros absolutos ou relativos, de uma a quatro cruzes o nmero de clulas componentes dos ninhos ou dos infiltrados as leses fibrosas e inflamatrias podem ser graduadas numa escala de cruzes:
270
+ suave e focal ++ moderadamente difusa e focal +++ difusa severa
as leses inflamatrias podem tambm ser graduadas em extenso de inflamao:

0 + + ++ +++ ausente rara e fraca ocasional e atenuada freqente e intensa freqente e muito intensa
17.1.4 Processamento de Tecidos para Imunohistoqumica em Cortes Congelados

O congelamento de rgos para anlises por microscopia ptica indicado quando se pretende realizar reaes imunohistoqumicas, tanto enzimticas como de fluorescncia. A vantagem deste procedimento em reao s tcnicas histoqumicas convencionais a preservao das molculas, uma vez que os tecidos no passam por agresses fsicas (altas temperaturas) ou qumicas (uso de fixadores). A seguir apresentaremos os protocolos de preparo de solues e de realizao destas tcnicas.
17.1.4.1 Revestimento das lminas

Material
lminas gaze papel alumnio solues de revestimento: poli-L-lisina 0,005% em tampo TRIS HCl 10 mM; ou gelatina 1% - alumen aquosa
Procedimento
mergulhar overnight as lminas em uma soluo de ter:lcool absoluto (1:1); secar bem com gaze; no caso de gelatina, mergulhar rapidamente as lminas; no caso de poli-l-lisina mergulhar por 15 min; escorrer e deixar secar na posio vertical, no suporte de lminas; embrulhar em papel alumnio para proteger contra poeira (de dez em dez), identificar e datar por fora com
cuidado para no tocar na superfcie da lmina;
Obs: uma opo barata que tambm funciona o uso de uma soluo com cola plstica (tipo Polar): misturar um frasco pequeno de cola a 500 ml de gua destilada, homogeneizando bem a soluo, e mergulhar rapidamente as lminas nesta soluo, que pode ser usada vrias vezes e deve ser guardada em geladeira.
17.1.4.2 Imunoperoxidase indireta em cortes congelados

Material
tampo TRIS NaCl 0,05 M (salina tamponada com TBS), pH 7,6 MgCl2 10 mM (soluo de uso) soluo de AEC (amino-etil carbazol) 8 mg/ml (soluo substrato para peroxidase) soluo de DAB (diamino benzidina) 6 mg/10ml de Tris 0,05M, pH 7,6
271
PBS pH 7,2 TRIS-HCl 0,1M pH 9,5 tampo acetato 0,1M pH 5,2 soluo de H2O2 3%
Procedimento para revelao com peroxidase
obter corte no criostato e recolher em lmina revestida; secar temperatura ambiente; fixar em acetona 100% gelada por 10 min ou em PFA 2% em PBS por 3 min; secar; hidratar (banho em PBS por 10 min); bloquear a peroxidase endgena com H2O2 3% em PBS por 20 min; bloquear com PBS-BSA 2,5% ou PBS-leite desnatado 10% por 10 min; bloquear com PBS-soro normal de cabra 10% por 30 min a 1h; incubar com o primeiro anticorpo por 60 a 120 min; lavar em PBS trs vezes por 5 min (em banho); incubar com o segundo anticorpo (conjugado com peroxidase) por 60 min; lavar em PBS trs vezes 5 min (em banho); revelar a peroxidase com AEC por 10 min ou DAB por 5 min; lavar rapidamente em gua corrente para bloqueio da reao; fazer contracolorao com hematoxilina de Mayer por 1min; lavar em gua corrente por 10 min; secar e montar em meio aquoso (gelatina) no caso de se usar AEC, ou alcolico no caso de DAB (neste caso, as
lminas podem ser desidratadas, contracoradas e montadas em meio convencional para histologia).
Obs: o protocolo de fixao dever ser inicialmente testado para cada tipo de tecido.
17.1.4.3 Imunocitoqumica com conjugados de fosfatase alcalina em cortes congelados Material
soluo de lavagem: TBS pH 7,6 TBS BSA 1% - adicionar 1g de BSA para cada 100 ml de TBS TBS leite desnatado 5% - adicionar 5 g de leite para cada 100 ml de TBS TBS soro normal 4% - adicionar 4 ml de soro para cada 100 ml de TBS solues de (substrato para fosfatase alcalina): 5-bromo-4-cloro-3-inodolil fosfato/cloreto de nitro-blue tetrazolio
em TBS, pH 9,5. O produto formado azul, insolvel em gua
meio de incubao para fosfatase alcalina: preparar as solues estoques de: X-fosfato 50x, NBT-estoque 50 x,
MgCl2 100 mM e TRIS-HCl 0,2M
meio de incubao para fosfatase alcalina (soluo de uso): X-fosfato 0,38 mM, NBT 0,41 mM, MgCl2 10
mM, em TRIS-HCl 0,2 M pH 9,5. Procedimento O protocolo geral o mesmo usado para reao de imunoperoxidase, mas obedece a alguns cuidados especficos: todas as etapas devem ser feitas com TBS (salina tamponada com Tris) ao invs de PBS, para evitar artefatos pela presena do fosfato do PBS; podem ser usados dois sistemas de revelao, um para azul, com NBT e outro para vermelho, com fast red.
272
17.1.4.4 Montagem, contracolorao e contraste positivo para criocortes

Material
meio de montagem: gelatina/glicerina hematoxilina de Mayer (soluo estoque, para contracolorao de tecidos)
Procedimento
diluir 10x; incubar 30 min; lavar at retirar todo o corante da gua.
17.2 Coleta e Processamento de rgos para Microscopia Eletrnica de Transmisso

17.2.1 Coleta para Fixao de Rotina
A coleta do material uma etapa importante onde devem ser levados em considerao fatores como tempo de retirada do rgo do corpo do animal e manuteno do rgo em soluo fisiolgica a baixa temperatura, objetivando evitar a autlise do material. Em seguida, o espcime deve ser fixado em soluo fixadora previamente escolhida e com metodologia adequada. As diferenas da fixao para microscopia eletrnica em relao descrita para microscopia ptica (item 17.1.1) so basicamente duas: o tamanho do fragmento clivado e o tipo de fixador. No anexo 17.2 descrevemos os mtodos de preparo dos tampes e fixadores utilizados em microscopia eletrnica. Na preparao dos tecidos biolgicos para observao ultra-estrutural necessrio fix-los por mtodos qumicos ou estabiliz-los por mtodos fsicos (congelamento rpido), para que as estruturas celulares permaneam de modo o mais prximo ao real. Os rgos podem ser fixados ainda fazendo parte do organismo (por perfuso) ou o mais rapidamente possvel; aps a colheita cirrgica o tecido cortado em pequenos fragmentos de 1 mm de espessura e colocado imediatamente em soluo fixadora tamponada (por imerso). O processo de fixao envolve reaes qumicas entre os componentes celulares (principalmente protenas) e o fixador e serve para estabilizar as estruturas celulares. Um par conjugado de cido-base age como tampo quando este sistema tende a resistir a uma modificao de pH de uma soluo, quando se adiciona na mesma [H]+ e [OH]-. Diferentes sistemas de tampes so utilizados em microscopia eletrnica com a finalidade de se manter em um determinado pH nas solues de fixao, de lavagem, de reaes enzimticas, etc. Material
o mesmo utilizado para cortes em criostato glutaraldedo (GA) 2,5% em tampo cacodilato de sdio-HCl 0,1 M tetrxido de smio (OsO4) a 1% em tampo cacodilato de sdio-HCl, 0,1M
Procedimento
retirar do rgo e lav-lo rapidamente com soluo salina fisiolgica gelada; imergir o espcime na soluo fixadora de GA a 2,5% em tampo cacodilato de sdio a 0,1M, contendo ou no
sacarose a 3,5%, pH 7,2 a 4C, e se for necessrio recortar em fragmentos de no mximo 1 mm3. A fixao devese processar no mnimo por 1h; lavar em soluo de tampo cacodilato 0,1 M, pH 7,2 a 4C; lavar 3x em tampo para a retirada do excesso de fixador;
273
Obs: nessa etapa pode-se estocar o material para posterior processamento.
lavar o material por 2x em tampo; ps-fixar com soluo de OsO4 a 1% em tampo cacodilato 0,1 M pH 7,2 por 1h em temperatura ambiente e no
escuro; lavar 3x com o mesmo tampo.
17.2.2
Processamento de rotina
Aps a fixao do material de modo apropriado para o processamento por microscopia eletrnica, procede-se desidratao, infiltrao e incluso em resinas para rotina ou especiais para preservao de epitopos imunossensveis. A desidratao total do tecido indispensvel se a incluso for feita em resinas no hidrossolveis, porm dever ser rpida e progressiva, a fim de ser preservada a estrutura celular. Utilizando-se resinas hidrossolveis a desidratao no precisa ser total, estas resinas so polimerizadas mesmo com a presena de pequena quantidade de gua na clula. Os solventes orgnicos mais utilizados so acetona, lcool e metanol. A infiltrao ocorre com uma gradual substituio do agente desidratante pela resina escolhida. Ela realizada por diminuio gradual e contnua da concentrao do solvente proporcionalmente ao aumento da concentrao do meio de incluso. A incluso consiste em uma completa impregnao do tecido com a resina, pura durante 4 h ou durante noite. Aps esse perodo o espcime emblocado em formas ou cpsulas especiais com uma nova resina. Para que acontea a polimerizao com as resinas epoxi necessrio que esta ocorra a 60C. Com as resinas hidrossolveis a polimerizao ocorre a baixa temperatura sob luz ultravioleta (UV). Material
solues dos agentes desidratantes (solventes orgnicos): sries de acetona, etanol e metanol a 15, 30, 50, 70 e 90% resina Epoxi (Epon 812)
Procedimento
coletar e fixar o material; desidratar com srie crescente do agente desidratante (30, 50, 70 90 e 100%), durante 10 min cada etapa,
sendo que a 100% devem ser feitas trs trocas de 10 min cada;
retirar o agente desidratante substituindo por uma soluo do agente desidratante e resina (v/v). Os fragmentos
devem ser infiltrados nesta soluo durante 18 h a 4C em frasco bem fechado;
incluir os espcimes com resina epoxi em cpsulas de gelatina ou em formas prprias, a 60C, e deixar polimerizar
em estufas apropriadas durante 72 h;
obter cortes ultrafinos em ultramicrtomo, pescar em grades de cobre e acondicionar em placas de Petri pequenas;
contrastar com soluo de acetato de uranila 2% em gua por 10 min em placas protegidas da luz e em soluo
de citrato de chumbo por 3 min;
observar o material em microscpio de transmisso e fotografar; os negativos so revelados e as fotomicrografias so ento realizadas. A interpretao qualitativa dos cortes
(caractersticas do tecido a serem observadas) feita em fotomicrografias de alta qualidade.
17.2.3
Coleta e fixao de material para incluir em resina lowicryl
Material
274
PBS e TBS tampo cacodilato de sdio-HCl, 0,2 M 4 % PFA 0,1-0,5 % GA 0,2-1 % cido pcrico
Procedimento
retirar do rgo e lav-lo rapidamente com soluo salina fisiolgica gelada; fixar em PFA 4% + glutaraldedo 0,1 a 0,5% + 0,2 a 1% cido pcrico em tampo cacodilato 0,1 M + sacarose
3,5 % por 1h a 4C.
17.2.4
Processamento de material para incluso em lowicryl
Material
soluo de cloreto de amnia a 50 mM em TBS solues dos agentes desidratantes (solventes orgnicos): sries de etanol ou metanol a 15, 30, 50, 70 e 90% resina Lowicryl K4M
Obs: o Lowicryl neurotxico.
Procedimento
lavar 3x por 10 min em tampo cacodilato 0,1 M + sacarose 3,5%; lavar 1x em TBS; incubar em cloreto de amnia 50 mM em TBS durante 30 min a 4C para bloquear grupos aldedicos reativos; lavar 4x em TBS; desidratar o material em sries crescentes de lcool (metanol ou etanol) por 10 min em cada soluo: 30, 50 (a
4C), 70 e 90% por 10 min a 20C. Quando o material estiver em suspenso, deve-se cortar o sedimento em metanol 90% ou etanol 90% a -20C; infiltrar o material com Lowicryl e agente desidratante nas seguintes propores: metanol 90%/Lowicryl (1:1) (-20C) overnight metanol 90%/Lowicryl (1:2) (-20C) overnight Lowicryl puro por 48 h a -20C incluir em cpsulas de gelatina e deixar polimerizar por 5 dias sob luz UV a -20C. Em seguida, colocar o material temperatura ambiente ainda sob luz UV por 2 dias; obter cortes ultrafinos e colocar sobre grades de nquel (sem contrastar).
17.2.5
Protocolo de imunocitoqumica em cortes de lowicryl
Material
TBS 0,1M cloreto de amnia 50 mM TBS/BSA 1%/Tween 1% anticorpo especfico protena A complexada a ouro coloidal acetato de uranila 2% em gua
275
Procedimento
lavar com TBS 0,1M; incubar com cloreto de amnia 50 mM por 30 min para inativar grupamentos aldedicos reativos; incubar 3x por 10 min em TBS/BSA 1%/Tween 1% (BSA para bloquear stios de ligao inespecfica); incubar com o primeiro anticorpo por 1h a 37C (determinar previamente a concentrao do anticorpo); lavar com TBS/BSA 1%/Tween 1% - 3x 10 min; incubar com a protena A-ouro coloidal diluda 1:10 por 30 min temperatura ambiente (a concentrao da
protena pode variar); lavar com TBS/BSA 1%/ Tween 1% - 2x 5 min; lavar com H2Oddd - 3x 10 min; contrastar por 5 min com citrato de chumbo ou por 20 min com acetato de uranila; lavar com H2Oddd e deixar secar; guardar as grades em ambiente seco com slica gel.
17.2.6 Coleta do rgo, fixao, infiltrao e obteno de cortes congelados

Material
o mesmo utilizado para cortes em criostato (conforme citado anteriormente) suportes especiais para criocongelamento e crioultramicrotomia 4% PFA em PBS
Procedimento
logo aps a abertura do animal, banhar o rgo em PFA para fixao; retirar o rgo; fragmentar o rgo imerso em PFA a 4% (cortes de no mximo 1 mm3); fixar os fragmentos PFA 4 % por 1h; infiltrar com sacarose a 4C, em banhos sucessivos de 1h cada em solues de concentrao crescente de sacarose
(0,5, 1,25, 1,5, 1,7, 1,9 e 2,3 M). Nesta ltima o material deve ficar toda a noite sob agitao colocar o fragmento no suporte juntamente com uma gota de sacarose 2,3 M; congelar em N2 lquido; cortar o fragmento congelado em crio-ultramicrtomo. Os cortes so retirados direto da navalha, com o auxlio de uma pina especial com anel de borracha. Deixa-se secar o anel com sacarose, recolhe-se os cortes que so ento depositados na grade e deixados para secar alguns minutos;
Obs: o mtodo pode ser adaptado para o congelamento de clulas isoladas para corte em crio-ultramicrtomo, incluindo-se as clulas em gelatina antes da infiltrao com sacarose, com o seguinte protocolo:
fixar as clulas em 0,5% GA + 2% PFA em PBS pH 7,4 ou 4% PFA por 1h; lavar 3x em PBS (10 min/vez); emblocar em gelatina 2 a 10% em PBS a 37C por 30 min; centrifugar a 4C por 30 min; cortar em pequenos fragmentos; deixar por 2 h temperatura ambiente em glicina 50 mM em PBS para bloquear grupos aldedos; impregnar em sacarose (crioprotetor): sacarose 0,6 a 2,3 M em PBS pH 7,4 (mnimo de 3 a 6 h).
276
17.2.7 Processamento dos criocortes incluidos em sacarose para imunocitoqumica

Material
solues crescentes de sacarose e de polivinil pirolidina (PVP, Sigma/Peso Molecular 10.000) em PBS pH 7,4
0,5% Sacarose + 20% PVP 1,25% Sacarose + 20% PVP 1,5% Sacarose + 20% PVP 1,7% Sacarose + 20% PVP 1,9% Sacarose + 20% PVP 2,3% Sacarose + 20% PVP soro fetal bovino (SFB) glicina 0,12% PBS-glicina 0,12% protena A-ouro coloidal acetato de uranila 2% em gua Procedimento As grades so transferidas para gotas de PBS sobre uma fita de parafilme. Todas as etapas so feitas a temperatura ambiente: incubar os cortes em PBS com 10% de SFB contendo 0,12% de glicina (para reduzir as ligaes inespecficas de anticorpos); diluir o anticorpo em PBS contendo 5% de SFB e 0,12% de glicina e incubar a amostra durante 30-60 min. Os anticorpos devem ser centrifugados sempre por 1min antes do uso, com a finalidade de remover agregados. Como controle, incubar os cortes pelo mesmo perodo de tempo, sem o anticorpo, no tampo (PBS/glicina); lavar 4x em PBS com 0,12% de glicina, num total de 15 min; diluir a protena A complexada com ouro coloidal em PBS com 5% SFB + 0,12% de glicina (usar diluio 1:10). Aps as lavagens, incubar os controles e os cortes tratados com o anticorpo, por 30 min, com a protena A-ouro coloidal; lavar 6x em PBS com 0,12% de glicina num total de 20 min; lavar em gua destilada 4x num total de 10 min. Esta etapa importante para remover os ons fosfatos antes da reao com acetato de uranila; incubar em acetato de uranila a 3% pH 7,0-7,5 por 5 min; lavar em gua destilada 2x num total de 1 min (as etapas 7 e 8 podem ser omitidas); contrastao final em metil celulose com 3% de acetato de uranila aquosa (nove partes de metil celulose mais uma parte de ouro). Esta soluo fica em gelo e as grades so colocadas nesta soluo por 10 min; recolher a grade com uma ala, remover o excesso de metil celulose e secar ao ar.
17.3
Coleta e Processamento de Tecidos para Hibridizao
A hibridizao uma tcnica que permite a deteco e/ou visualizao de DNA ou RNA celular em cortes de tecidos, clulas em suspenso, preparaes cromossomiais e cidos nuclicos imobilizados em suportes slidos. Esta tcnica baseia-se no fato que fragmentos de cidos nuclicos (DNA ou RNA) marcados com elementos isotpicos ou no isotpicos (sondas) iro hibridizar cidos nuclicos (DNA ou RNA) celulares sob condies apropriadas de temperatura, fora inica e pH, formando hbridos estveis.
277
As primeiras hibridizaes foram feitas com cidos nuclicos (extrados e purificados) imobilizados em membranas de celuloses. Embora desta maneira seja possvel identificar diferentes classes de DNA (Southern) ou RNA (Northern) pelo tamanho dos fragmentos hibridizados com as seqncias de sonda complementares (antisense), no h informaes sobre a distribuio de seqncias especficas em clulas individuais. A hibridizao in situ introduzida na dcada de 60 permite a demonstrao morfolgica do DNA e do RNA celular em cortes de tecidos, clulas em suspenso e preparaes cromossomiais. Uma das vantagens da hibridizao in situ em relao imunocitoqumica convencional que na hibridizao revela-se o verdadeiro stio de sntese de uma determinada protena enquanto por imunocitoqumica somente possvel revelar a presena do peptdeo. Hoje a hibridizao representa um dos principais instrumentos de pesquisa nas mos de morfologistas, principalmente nos diagnsticos patolgicos. Ao contrrio do DNA que estvel, o mRNA extremamente lbil, sendo in vivo continuamente sintetizado e degradado. Devido a sua meia-vida extremamente curta, deve-se minimizar possveis degradaes com ribonucleases congelando ou fixando os tecidos imediatamente aps sua exciso cirrgica. Cuidados para o trabalho com RNA
toda vidraria e plsticos utilizados devem ser RNAse free. Para isso as vidrarias e o material cirrgico so esterilizados em forno por 5 h a 200C e os plsticos e outros objetos no esterelizveis em forno devem ser incubados overnight com H2O tratada com DEPC (dietil pirocarboneto 0,1%, incubando overnight). Ponteiras e tubos para microcentrfuga virgens devem ser autoclavados; todas as solues devem ser preparadas com gua tratada por DEPC e posteriormente autoclavadas. Durante todas a etapas o operador deve utilizar luvas; os tubos de plstico que sero usados na extrao devem ser resistentes a fenol e clorofrmio. Diferentes metodologias so descritas para a preparao do material a ser utilizado em hibridizaes feitas em membranas ou in situ. A escolha do processamento a ser usado deve visar a boa preservao do material biolgico que mantm detalhes da sua morfologia (no caso da hibridizao in situ), alm da reteno dos cidos nuclicosalvo com boa exposio das suas seqncias. Temos entre elas: Hibridizao in situ
fixao do tecido, imediatamente aps sua obteno, com paraformaldedo (PFA) 4% e em seguida imerso em
soluo de sacarose. Aps este tratamento, congelar o tecido em N2 lquido at corte em criostato. Os cortes devem ser aderidos a lminas revestidas com poli-L-lisina; congelamento dos tecidos em N2 lquido, imediatamente aps sua obteno, corte do tecido em criostato, adeso dos cortes em lminas revestidas e fixao com PFA 4% (10 min). Aps a fixao os cortes podem ser estocados a -70C at a reao de hibridizao. Neste protocolo possvel processar simultaneamente parte do material para extrao total do cido nuclico e hibridizao em membranas de celulose, mas h perda na manuteno da morfologia; obteno do tecidos e fixao imediata em PFA 4%, desidratao progressiva em etanol, incubao em xilol e incluso em parafina. Os cortes obtidos por microtomia devem ser aderidos a lminas revestidas; alguns autores sugerem que aps a fixao, as preparaes podem ser estocadas indefinidamente em etanol 70% a 4C permitindo o processamento de amostras de uma cintica experimental ao mesmo tempo. Fixadores
pode-se utilizar PFA, PFA acrescido de glutaraldedo ou soluo de Bouin. A escolha ir depender diretamente
do tipo de tecido, do tipo e do tamanho da sonda;
durante a fixao ocorre cross-linking entre as protenas e carboidratos das clulas e os aldedos dos fixadores. Por
isso, dependendo do fixador escolhido, s vezes se faz necessrio o uso de diferentes tratamentos para facilitar o
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acesso da sonda ao cido nuclico. Os tratamentos mais freqentes empregam o uso de enzimas (pronase, proteinase K), a acetilao de grupamentos amino (reduzindo ligaes eletrostticas no especficas), e o uso de detergentes (Triton X100). Northern blot
a extrao dos cidos nuclicos de tecidos deve ser feita logo aps sua retirada ou, quando no for possvel, o
tecido deve ser imediatamente congelado e estocado em N2 lquido ou a -70C at sua extrao;
no caso de clulas cultivadas em monocamadas ou em suspenso, lavar as clulas 3x com PBS (livre de clcio e
magnsio) gelado, adicionando-se em seguida a soluo desnaturante e mantendo-as a 4C. A monocamada deve ser removida do substrato com auxlio de um rubber policeman virgem (RNAse free) e em seguida processada. Geralmente utilizam-se 100 l de soluo D por 106 clulas ou 1,8 ml de soluo D (ver Anexo 17.3) para cada placa de cultura cujo dimetro de 10 cm; aps a extrao e precipitao, os cidos nuclicos so submetidos a uma eletroforese (geralmente gel de agarose) e transferidos para membranas de celulose ou nilon; os cidos nuclicos podem ento ser hibridizados (com uma prvia etapa de bloqueio) e revelados, dando informaes quantitativas e qualitativas sobre sua expresso; o controle da viabilidade do RNA extrado pode ser feito pela observao das bandas do rRNA de 28S, 18S e 5S que devem estar ntidas e visveis em gis corados por brometo de etdio;
Obs: a soluo de extrao (soluo desnaturante) em geral uma combinao de agentes desnaturantes, detergentes e inibidores de RNAses. Atualmente, mais comum a utilizao de solues comerciais tais como Trizol (Gibco-BRL) e Tri-reagent (Molecular Research Center).
Escolha da sonda Outra etapa importante das hibridizaes se refere escolha do tipo de sonda, sua marcao e sensibilidade do mtodo utilizado para revelao do seu sinal. Em princpio tanto sondas de DNA ou RNA podem ser utilizadas para localizar seqncias de RNA ou DNA. Cada sonda tem vantagens e desvantagens e sua escolha vai depender da experincia pessoal em tcnicas de biologia molecular, acesso e meios para clonagem das sondas e do tipo de seqncia a ser analisada. As sondas podem ser de DNA fita dupla ou simples, de RNA e de oligonucleotdeos. As sondas de cDNA (DNA complementar seqncia de um mRNA) de fita dupla so ainda as mais usadas, embora tenham a desvantagem de aps serem desnaturadas poderem se realinhar competindo com a hibridizao do cido nuclico em estudo. A difuso da sonda e sua especificidade tem relao direta com o seu tamanho. Em geral para hibridizao in situ utilizam-se sondas de RNA de 50-200 nucleotdeos e sondas de DNA de 400-600 nucleotdeos. A concentrao da sonda tambm um fator muito varivel mas recomenda-se para hibridizaes in situ 0,5 ng/ml para sonda de RNA e 1 ng/ml para sonda de DNA. As sondas podem ser marcadas por meios isotpicos e no isotpicos. Devido sua alta sensibilidade ainda se utilizam os primeiros. A escolha do tipo de radioistopo depender do nvel de resoluo necessrio em cada investigao. Filmes de auto-radiografia podem ser suficientes para se detectar cidos nuclicos imobilizados em membranas ou em tecidos mas no em nvel celular. Para este tipo de resoluo so apropriados I125, P32 e S35. Entretanto, se for necessria uma resoluo em nvel celular deve-se escolher H3 ou S35 e as lminas devem ser revestidas com uma emulso fotogrfica lquida seguida de revelao. Em Northern blots em geral utilizam-se sondas marcadas com P32. Problemas devido alta periculosidade, pouca estabilidade da sonda e longo tempo de revelao estimulam cada vez mais o uso de sondas no radioativas. A marcao das sondas por elementos no isotpicos incluem o sistema de biotina-avidina, sistema de fluorocromos e de sistemas enzimticos.
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Metodologia de hibridizao Deve-se levar em considerao alguns fatores durante a escolha da metodologia: a temperatura, a fora inica, a soluo de bloqueio, a concentrao de sonda e o tempo de hibridizao. A formamida (desestabilizador de dupla hlice) que permite uma diminuio da temperatura de hibridizao (quanto mais alta a temperatura, maior a tendncia de desestabilizar os hbridos sonda-cido nuclico-alvo, o que pode contribui para um menor rudo) e o dextran sulfato (fator de excluso de volume) so reagentes que, de um modo geral, sempre fazem parte de protocolos de hibridizao. As preparaes so quase sempre incubadas em solues de bloqueio, visando reduzir o background ou rudo. Estas solues geralmente contm cidos nuclicos no especficos (para DNA usa-se esperma de salmo, e para RNA o tRNA) e uma soluo de bloqueio (soluo de Denhardt) que contm Ficoll, PVP (poli-vinil-pirrolidina) e BSA (albumina bovina). A temperatura tima de hibridizao extremamente variada levando-se em conta o tipo de sonda, o tamanho, a natureza de nucleotdeos, etc. Em geral se recomenda 42C para sondas de DNA, 50-55C para RNA e 37C para oligonucleotdeos. Como controles para teste da especificidade da hibridizao destacamos tratamentos dos espcimes com RNAses ou DNAses, utilizao de sondas no homlogas, utilizao de sondas de RNA sense, ausncia de sonda, etc. A seguir descreveremos uma metodologia utilizada para anlise de mRNA (utilizando sondas isotpicas de cDNA) imobilizadas em membranas de nilon (Lorent et al., 1994).
17.3.1 Northern Blot

Extrao de RNA de tecidos
obter o rgo e congelar e estocar em N2 lquido ou a -70C caso no v ser processado imediatamente; extrair com soluo desnaturante (soluo D) (em geral 1 g tecido/10 ml de soluo D) (ver Anexo 17.3); transferir para tubo de polipropileno e adicionar seqencialmente, misturando gentilmente por inverso, acetato
de sdio 2 M pH 4,0 (1/10 do volume), fenol saturado (1 volume) e clorofrmio + 4% lcool isoamlico (0,2 volume). Agitar vigorosamente por 10 s e incubar no gelo por 15 min; separar a fase aquosa da orgnica, atravs de centrifugao a 39.000 g por 20 min a 4C; adicionar fase aquosa contendo o RNA volume igual de isopropanol e incubar por 1h a -20C para precipitar o RNA; coletar o RNA por centrifugao (3.300xg por 20 min a 4C); incubar o sedimento (rico em RNA) novamente com soluo D e precipitar com isopropanol sob as mesmas condies; centrifugar novamente, desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento por 3x com etanol 75%; secar o sedimento a temperatura ambiente e ressuspender em formamida (100%) ou gua tratada com DEPC, no menor volume possvel, estocando a -70C; calcular a concentrao do RNA total por espectofotometria (260 nm).
Obs: para quantificar o RNA no espectofotmetro, diluir 2 l de RNA em 600 l de H20+DEPC. No tubo controle negativo, adicionar o mesmo volume somente de formamida (2 l) H20 e em outro tubo acrescentar 2 l de extrato total de DNA. Quanto menor for a contaminao de protenas e DNA na preparao, mais prximo a 2 deve ser a relao entre 260/280 nm. A leitura de 280 nm para protenas e a de 260 nm para cidos nuclicos. Cada DO260 significa 40 g/ml de RNA. Com este mtodo obtmse aproximadamente de cada garrafa de cultura de 90 mm cerca de 100/200 g de RNA.
Eletroforese e transferncia
desnaturar o RNA a 70-100C por 10 min em soluo A (ver Anexo 17.3); utilizar 10 g/ml do RNA total por slot. No esquecer de aplicar, tambm, um padro de peso molecular. Gis de 1%
de agarose so apropriados para molculas de RNA maiores do que 1 kb e 1,4% para menores de 1 kb;
preparar o gel de agarose com 6% formaldedo (ver Anexo 17.3) e realizar a corrida por 5 h a 60V em uma vez
280
tampo MOPS (ver Anexo 17.3);
fazer grfico com os valores do log10 do tamanho das espcies de RNA (padro) contra a distncia migrada e
utilizar a curva resultante para clculo do tamanho das espcies de RNA detectadas pela hibridizao aps a transferncia do gel para a membrana de nilon; aps a eletroforese, transferir o RNA, por capilaridade, para uma membrana de nilon (Amersham, UK) em tampo 10X SSPE (ver anexo 17.3); fixar o RNA membrana tratando-o por 20 min a 80C, seguido por UV-cross-linking por 45 s (Stratalinker 1800, Stratagene, Heidelberg, Alemanha) ou por 3 min em transiluminador de UV; guardar a membrana a -20C at a etapa de hibridizao.
Obs 1: a cuba de eletroforese deve ser limpa com detergente, lavada com gua, seca com etanol e incubada com um volume de H2O2 a 3% por 10 min temperatura ambiente. Em seguida lavar abundantemente com H2O2-DEPC. Deve-se tambm pr-incubar a cuba (com os pentes) com H2O2-DEPC, overnight antes da eletroforese Obs 2: como os vapores de formol so txicos, as solues contendo este fixador devem ser manuseadas em capelas de exausto, utilizando-se luvas. O brometo de etdeo mutagnico e txico e somente deve ser manuseado com luvas e as suas solues devem ser adequadamente descontaminadas.
Marcao da sonda Para marcao isotpica ou no isotpica da sonda utilizar protocolo indicado pelo fabricante. Hibridizao
incubar as membranas em soluo de pre-hibridizao (ver anexo 17.3) por 7 h a 42C e em seguida overnight
nesta mesma soluo acrescentando 10% dextran sulfato e a sonda marcada j desnaturada (2x106 cpm/ml); recuperar a soluo e guardar a -20C (para ser utilizada para nova hibridizao); lavar a membrana por trs vezes rapidamente com SSPE 0,3X/0,5 % SDS, lavar por 1h a 60C com SSPE 0,3X/ 0,5 % SDS (200 ml); aps as lavagens, checar o sinal com um contador Geiger (caso seja sonda isotpica) e expor a membrana um filme de raio X com intensificador a -70C; aps revelao, o filme pode ser analisado por um programa de densitometria.
Obs 1: a temperatura e o contedo da solues de hibridizao e de ps-hibridizao variam (dependendo da natureza da sonda, tamanho, natureza de suas bases); desta forma as condies de estringncia devem ser determinadas para cada tipo de sonda e cido nuclico a ser estudado. A soluo citada acima foi utilizada para ensaios de revelao de mRNA para protena srica 2macroglobulina utilizando sonda isotpica de cDNA (50bp) Obs 2: para reutilizar a membrana de nilon para outras hibridizaes, ela deve ser previamente incubada com uma soluo com 0,5% de SDS 40 mM Tris pH 7,8 por 15 min a 80C e em seguida mantida a -20C.
281
Anexo 17.1
Solues para Imunohistoqumica

1. Solues fixadoras Formalina a 10% em PBS
Fixador de Milloning-Rosman
Fosfato de sdio anidro dibsico cido fosfrico (H3PO4) ou difosfrico gua destilada Formaldedo Merck 18,4 g 1,68 g 900 ml 100 ml
dissolver o sal com gua destilada e depois acrescentar o cido fosfrico deixar esfriar acrescentar o formaldeido corrigir o pH se necessrio para 7,3-7,4 com soluo de NaOH
2. Soluo de gelatina para revestimento de lminas

Gelatina Almem de cromo H2O 1g 0,005 g 100 ml
aquecer a 60-70C para dissolver
3. Solues e tampes para reaes de imunohistoqumica com peroxidase

PBS (25X): uso para reaes de peroxidase
NaCl K2HPO4 anidro NaH2PO4.H2O H2O deionizada 180 g 188 g 33 g qsp 1000 ml
Tampo TRIS NaCl 0,05 M (salina tamponada com TBS)

Soluo A: TRIS 0,5M 10X pH 7,6 Tris base 0,5M H2Odd Soluo B: NaCl 10X 1,5M NaCl H2Odd Tampo 0,05 M pH 7,6 Soluo A Soluo B H2Odd 50 ml 50 ml 400 ml 43,83 g 500 ml 30,28 g 500 ml
282
TRIS-HCl 0,2M pH 9,5

Soluo A: TRIS 0,8 M TRIS H2Odd Soluo B: HCl 0,2N HCl1 H2Odd Tampo 0,2 M pH 9,5 Soluo A Soluo B H2Odd
1
24,23 g 1000 ml
0,73g 100 ml
25 ml at pH 9,5 100 ml
densidade especfica: 1,19
Tampo acetato 0,1M pH 5,2

Soluo A Acetato de sdio (CH3COONa.3H2O) 0,1M H2Odd Soluo B cido actico glacial 0,1N H2Odd Tampo 0,1 M pH 5,2 Soluo A Soluo B 79 21 575 ml 1000 ml 13,6 g 1000 ml
AEC (amino-etil carbazol) (substrato para peroxidase)

Soluo estoque AEC AEC N, N, dimetilformamida Soluo trabalho1 AEC estoque Tampo acetato H2O2 3 %
1
120 mg 15 ml
0,5 ml 9,5 ml 50 l
misturar bem
DAB (diamino benzidina) (substrato para peroxidase)

Soluo de uso DAB1 DAB Tampo Tris 0,05M, pH 7,6 H2O2 3 %
1
6 mg 10 ml 100 ml
preparar no momento de usar. Evitar inalao ou contato direto com a pele; a soluo deve ser filtrada se ocorrer precipitao
4. Solues para reaes de fosfatase alcalina
soluo de lavagem: TBS 0,05 M pH 7,6 (o mesmo usado em reaes para peroxidase) TBS/BSA 1% TBS/leite desnatado 5% TBS/soro normal 4%
283
Solues estoque para fosfatase alcalina

X-fosfato 50X 19 mM1 X-fosfato (5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) DMF (dimetilformamida) NBT 50X 20,5 mM1 NBT (cloreto de nitro-blue tetrazlio) DMF MgCl2 100 mM MgCl2.6H2O H2O
1
7 mg 1 ml
16,7 mg 1 ml
0,95 g 100 ml
preparar alquotas de 200 l e congelar
Meio de incubao para fosfatase alcalina

conc. final (mM) TRIS-HCl 0,2M pH 9,5 X-fosfato 19 mM NBT 20,5 mM MgCl2 100 mM 9 ml 200 ml 200 ml 1 ml 0,38 0,41 10
dissolver primeiro X-fosfato e NBT em dimetilformamida 70%

Obs: o produto formado azul, insolvel em gua
5. Meio de montagem para lminas com cortes congelados

Gelatina H2Oddd Glicerina Fenol lquido 10 g 60 ml 70 ml 1 ml
misturar a gelatina com a gua, aquecer para dissolver (banho-maria, placa ou direto no fogo) adicionar glicerina e fenol 6. Solues para contracolorao de criocortes
Hematoxilina de Mayer (soluo estoque) Hematoxilina (cristais) H2Oddd Iodato de sdio Almem de amnia ou potssio cido ctrico Hidrato de cloral 1g 1000 ml 0,2 g 50 g 1g 50 g
dissolver a hematoxilina em gua, usando aquecimento, se necessrio adicionar o iodato de sdio e o sulfato de alumnio misturar at que o sulfato de alumnio esteja completamente dissolvido adicionar o cido ctrico e o hidrato de cloral guardar em vidro apropriado. Evitar usar logo aps o preparo
Obs: a cor final violeta avermelhada
284
Anexo 17.2
Solues para microscopia eletrnica

1. Tampes para microscopia eletrnica
Tampo fosfato 0,1M
Soluo A (fosfato monossdico) 0,2 M NaH2PO4.2H2O (PM 156) H2Oddd Soluo B (fosfato dissdico) 0,2 M Na2HPO4.12H2O (PM 358) H2Oddd Tampo 0,1 M pH 7,2 Soluo A Soluo B H2Oddd Tampo 0,1 M pH 7,4 Soluo A Soluo B H2Oddd 19 ml 81 ml 100 ml 28 ml 72 ml 100 ml 15,6 g qsp 100 ml 35,8 g qsp 100ml
Tampo cacodilato de sdio-HCl

Soluo estoque de cacodilato 0,2 M Na(CH3)2AsO2.3H2O (PM 214) H2Oddd Tampo cacodilato 0,2M Soluo estoque 0,2M HCl 0,2 N gotejar at atingir o pH desejado Tampo cacodilato 0,1 M pH 7,2 Soluo estoque HCl 0,2M H2Oddd Tampo cacodilato 0,1 M pH 7,4 Soluo estoque HCl 0,2N H2Oddd
0,1M
42,8 g qsp 100 ml
50 ml 4,2 ml qsp 100 ml
50 ml 2,7 ml qsp 100 ml
2. Solues de fixadores
glutaraldedo (GA) (HOC.(CH2 )3.COH) comercializado em solues nas concentraes de 25% e 50%; paraformaldedo (PFA) (CH2O)n (trioximetileno), um polmero do formol, comercializado em p; tetrxido de smio (OsO4), comercializado puro, cristalizado, em ampolas de 0,25 g a 5 g.
Soluo estoque de PFA
aquecer 100 ml de H2Oddd, adicionar 8 g de PFA e deixar hidratar por 2-3 min; aquecer a soluo em torno de 60-80C, sob agitao, em capela de exausto por 15-30 min; adicionar uma-duas gotas de NaOH 1N, para clarear a soluo; deixar esfriar e conservar em geladeira em frasco hermeticamente fechado;
Obs: esta soluo pode ser feita em vrias concentraes em geral na faixa de 2 a 8%.
285
Soluo estoque de tetrxido de smio 2%
colocar 25 ml H2Oddd em um frasco mbar e reservar; lavar bem uma ampola de OsO4 500 mg, cort-la com diamante e quebr-la; colocar os cristais de OsO4 juntamente com os fragmentos da ampola e colocar dentro do frasco com os 25ml H 2 O ddd ; deixar o OsO4 dissolver durante uma noite a temperatura ambiente; conservar o frasco contendo a soluo a 2% envolvido com papel alumnio na geladeira.
Soluo fixadora de GA 2,5% Soluo estoque GA 25% Tampo cacodilato 0,1 M pH7,2 Soluo fixadora de PFA% Soluo estoque PFA 8% Tampo cacodilato-HCl 0,2M Soluo fixadora de OsO4 1% Soluo estoque OsO4 2% Tampo cacodilato-HCl 0,2M 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 1 ml 9 ml
3. Agentes desidratantes
os mais utilizados em tcnicas de microscopia eletnica so os solventes orgnicos acetona, lcool e metanol; os agentes desidratantes so diludos em H2Oddd nas concentraes de 15, 30, 50, 70 e 90% e conservados em
geladeira. 4. Resinas As mais utilizadas para rotina em microscopia eletrnica de transmisso so as resinas Epoxi (Epon, Araldite e Spurr) com polimerizao a 60C. As resinas Lowicryl (K4M e HM20) com polimerizao a -20C sob luz ultravioleta e as resinas London (LR-White e LR-Gold) so mais usadas em estudos onde precisam ser preservados os stios antignicos das estruturas celulares.
Preparo da resina Epon
colocar em uma proveta bem limpa 25 ml de Epon 812; adicionar 17 ml de MNA; misturar durante 3 min sem formar bolhas; adicionar 32 gotas de DMP-30 e continuar misturando por 30 min a temperatura ambiente
Obs: a resina j pronta deve ser colocada em recipiente bem fechado e conservada no congelador da geladeira. Ela no deve permanecer fora da refrigerao devido polimerizao comear a ocorrer mesmo a temperatura ambiente. Para ser usada ela deve ser retirada com antecedncia para o descongelamento.
5. Polivinil pirolidina (PVP - 10) para criocortes

PVP-10 H2O Na2CO3 1,1 M Sacarose 2,3 M 3g 2,4 ml 0,6 ml 7 ml
misturar e deixar secar por uma noite na geladeira (soluo estvel por poucas semanas a 4C) antes do uso adicionar 10% de volume de H2O destilada ou 0,1 M tampo fosfato (soluo no estvel)
286
Anexo 17.3
Solues para uso em hibridizao

Soluo D 1
Isotiocianato de guanidina Citrato de sdio 75mM pH 7,0 Sarcosil 10% H2O-DEPC
1
11,81 g 8,33 ml 1,25 ml completar para 25 ml
Chomczynski et al. 1987.
dissolver a 65C; acrescentar 7,2 ml de 2-mercaptoetanol por ml de soluo (180 ml para 25 ml); concentraes finais: isotiocianato de guanidina 4M; citrato de sdio 25mM, sarcosil 0,5% p/v; e 2mercaptoetanol 0,1M. Soluo A 1
10 mg de RNA em formamida Formamida deionizada GLB 2,5 mg/ml H2O-DEPC Formaldedo 37% Brometo de etdeo 5 mg/ml Tampo MOPS 10X pH 8,0
1
10 ml 2,5 ml 3 ml 2,5 ml 4 ml 0,5 ml 2,5 ml
Lorent et al., 1994
concentraes finais: formamida 50%, formaldedo 6%, brometo de etdio 0,1 mg/ml, MOPS 1X.
Tampo SSPE 20X

Cloreto de sdio Fosfato de sdio NaH2PO4 . 2H2O EDTA 0,5M pH 8,0 H2O-DEPC 175,3 g 31,2 g 40 ml 800 ml
ajustar o pH para 7,4 e completar o volume para 1 litro adicionar 1 ml de DEPC, homogenizar, incubar overnight e autoclavar. concentraes finais: cloreto de sdio 3M, fosfato de sdio 0,2M, EDTA 0,02M. Soluo de pr-hibridizao
SSPE 20X Denhardts1 100X SDS 10% Formamida DNA de salmo desnaturado 10 mg/ml heparina 10 mg/ml H2O-DEPC
1
12,5 ml 2,5 ml 2,5 ml 25 ml 500 ml 250 ml 6,75 ml
2% PVP, 2% BSA, 2% Ficoll-400
concentraes finais: SSPE 5X, Denhardts 5X, SDS 0,5%, formamida 50%, DNA 100 mg/ml, heparina 50
g/ml
287
Gel de agarose 1%
Agarose MOPS 10X H2O-DEPC 1g 10 ml 75 ml
aquecer at dissoluo da agarose manter em banho a 60C por 10 min e acrescentar 17 ml de formaldedo (37%) misturar bem Tampo MOPS 10x pH 7,0
3-(morpholene) propane-sulfonic acid Acetato de sdio 3M pH 7,0 EDTA 0,5M pH 8,0 H2O-DEPC 41,86 g 16,6 mg 20 ml 900 ml
ajustar o pH para 7,0, completar o volume para 1 litro com H2O-DEPC adicionar 1 ml de DEPC, homogenizar, incubar overnight e autoclavar concentraes finais: MOPS 0,2 M, acetato de sdio 0,05 M, EDTA 0,01 M. GLB 2,5 mg/ml
Azul de bromofenol Glicerol H2O-DEPC 50 mg 10 ml 10 ml
H 2 O-DEPC
DEPC H2O-DEPC 1 ml 1000 ml
homogenizar bem, incubar overnight temperatura ambiente e autoclavar
CHOMCZYNSKI, P . & SACCHI, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry 162:156-159, 1987. LORENT, K.; OVERBERGH, L.; VAN LEUVEN, F. & VAN DEN BERGHE, H. Distribution of mRNA coding for -2macroglobulin, the murinoglobulins, the -2-macroglobulin receptor and the -2-macroglobulin receptor associated protein during mouse embryogenesis and in adult tissues. Differentiation 55:213-223, 1994.
288
Captulo 18
O bteno de C lulas de C amun dongo p ar a par ara E studos I n V itr o P rimrio itro ultivo o em C ultiv
18.1
Interao do Trypanosoma cruzi com Clulas Hospedeiras: Estudos In Vitro

Maria de Nazareth L. Meirelles & Tania C. Arajo-Jorge
Como toda a vida no reino animal, a vida para um tripanosoma essencialmente uma questo de se nutrir, sobreviver e se reproduzir sob diferentes condies e fontes nutricionais. O T. cruzi desenvolveu uma biologia interessante, adaptada a diferentes ambientes nos hospedeiros vertebrado e invertebrado, e a estocar energia suficiente para assegurar sua reproduo e sobrevida em condies completamente diferentes. O estudo da biologia celular do T. cruzi em seu ambiente intracelular no vertebrado nas clulas do hospedeiras foi iniciado no Brasil com os trabalhos da Dra. Hertha Meyer, que tambm foi a primeira a publicar imagens de microscopia eletrnica deste parasita (Meyer & Porter, 1954). Ela se radicou no Rio de Janeiro, no Inst. de Biofsica da UFRJ, por convite de Carlos Chagas Filho, durante a Segunda Guerra Mundial. Hertha Meyer introduziu a cultura in vitro de clulas musculares e neurais e estudou todos os estgios de desenvolvimento do T. cruzi (De Souza, 1984). A aplicao de cultura de clulas in vitro atinge vrios campos de interesse, tais como os mecanismos de reconhecimento e invaso celular utilizados pelo parasita, sua fisiologia nutritiva e energtica, os mecanismos de sua resistncia ou susceptibilidade a agentes quimioterpicos tais como enzimas envolvidas em processos de virulncia ou de detoxicao. O T. cruzi se desenvolve e multiplica dentro das clulas do hospedeiro vertebrado. O ciclo do protozorio ocorre em clulas de invertebrados e de vertebrados com trs estgios evolutivos do parasita: amastigotas, tripomastigotas e epimastigotas. Epimastigotas e tripomastigotas so encontrados no inseto vetor triatomneo, amastigotas e tripomastigotas no hospedeiro vertebrado (Brener, 1973). A infeco do hospedeiro mamfero ocorre quando clulas hospedeiras so invadidas por formas tripomastigotas metacclicas presentes nas fezes do inseto vetor durante sua alimentao sangucola.
289
Desde os trabalhos pioneiros de Dias (1934), Kofoid et al. (1935) e de Meyer & Xavier-de-Oliveira (1948), sabe-se que, dependendo da cepa, o T. cruzi leva menos de 20 minutos para entrar na clula hospedeira. Ele prolifera por diviso binria por 2 a 9 ciclos at preencher completamente o citoplasma, em 4 a 5 dias, levando ento ruptura e liberao de novos tripomastigotas. Aps a invaso, em 1 a 2 horas o parasita rompe a membrana do vacolo parasitforo que o envolve inicialmente (Burleigh & Andrews, 1995), 2-3 horas para se transformar em amastigotas e entrar na fase G1/G2 do ciclo de diviso celular, e 24 a 44 horas para sintetizar DNA. O tempo de gerao dos amastigotas pode levar de 8 a 15 horas, dependendo da cepa de parasita, mas a citocinese rpida, e ocorre em 20 a 30 minutos (Hyde & Dvorak 1973). Em todos os tipos celulares j estudados, encontrou-se uma distribuio binomial negativa das clulas infectadas (Hyde & Dvorak, 1973; Pcora et al., 1980), indicando que durante as primeiras 24 horas de contato parasita-clula, as clulas que j foram infectadas se tornam mais susceptveis uma segunda invaso, provavelmente porque sua carga de superfcie se modifica aps a infeco (Soeiro et al., 1994). O T. cruzi pode invadir clulas sem ncleo, mas no se desenvolve (Osuna et al., 1983). Os mecanismos moleculares que regulam a patogenidade do T. cruzi no esto esclarecidos, apesar do considervel progresso feito no sentido de esclarecer mecanismos de invaso celular e sobrevivncia do parasito dentro das clulas hospedeiras (Zingales & Coli, 1982; Meirelles et al., 1984, 1986; Arajo-Jorge, 1989; Burleigh & Andrews, 1995). Este evento parece ser um processo de muitas etapas, envolvendo um variado nmero de molculas tanto no parasito como no hospedeiro. exatamente nesses aspectos que reside o grande potencial dos modelos in vitro para o estudo da interao T. cruzi-clula hospedeira. Em animais infectados, assim como no homem, existem evidncias de um tropismo do parasito por clulas do sistema fagoctico mononuclear, e por clulas musculares e nervosas (Andrade, 1974; Melo & Brener, 1978). Porm in vitro, o T. cruzi demonstra capacidade de invaso em todos os tipos celulares testados. Os macrfagos desempenham um papel importante na resistncia do hospedeiro infeco pelo T. cruzi, sendo o hospedeiro inicial para este parasita. O primeiro estudo in vitro realizado com macrfagos foi o de Muniz & Freitas (1946) utilizando macrfagos peritoneais de cobaio e seguindo a multiplicao do parasita no interior das clulas. A interao T. cruzi-clula hospedeira tem sido estudada em trs sistemas principais: a) macrfagos e demais clulas fagocticas, hematolgicas; b) diferentes linhagens celulares estabelecidas (fagcitos profissionais ou no); c) clulas musculares de cultivo primrio (esquelticas e cardacas) ou diferenciadas a partir de linhagens de mioblastos. Em todos os sistemas identifica-se uma fase de reconhecimento e outra de invaso, seguidas de multiplicao intracelular do parasita ou do seu controle (Figs. 1-2). A fase do reconhecimento celular envolve uma etapa inicial de adeso do parasita celula hospedeira seguida de sua internalizao sempre dentro de um vacolo fagoctico. A fuso fago-lisosomal foi observada para todos os trs estgios evolutivos do parasita (Nogueira & Cohn, 1976; Milder & Kloetzel, 1979; Meirelles & De Souza, 1985; Ley et al., 1988; Meirelles et al., 1996).
290
Obteno de Clulas de Camundongo para Estudos In Vitro em Cultivo Primrio
p
C
mf
2
Figura 1. Forma tripomastigota de T. cruzi (cepa Y) obtida do sangue de camundongo aderida a cardiomcitos de uma cultura de clulas musculares de embrio de camundongo. O parasita faz contato com trs clulas (A, B, C). Notar regies mais densas na adeso do parasita ao cardiomicito C (cabeas de seta); p (parasita); mf (miofibrilas). Aumento 29.750X Figura 2. Clulas musculares cardacas acopladas contendo uma forma tripomastigota do T. cruzi no vacolo parasitforo. Notar uma regio de juno gap em contato ntimo com o parasita (setas); p (parasita). Aumento 53.000X
291
18.1.1. Estudos com Macrfagos

A adeso e interiorizao so etapas dissociadas na interao macrfago-T. cruzi. Tratamentos com baixa temperatura ou com drogas que interferem com a maquinria fagoctica permitem a adeso mas no a internalizao (Henriquez et al., 1982; Andrews & Colli, 1982; Meirelles et al., 1982). H uma controvrsia na literatura sobre o uso de drogas como citocalasinas e colchicina, que atuam respectivamente nos microfilamentos e microtbulos: se impedem ou no a etapa de interiorizao. Um substancial conjunto de dados mostra inibio com as citocalasinas em tipos celulares como macrfagos e msculo cardaco indicando a fagocitose como mecanismo principal, mas sugerindo que mecanismos adicionais de interiorizao tambm esto envolvidos nesta interao. Outros autores encontraram em fibroblastos, clulas de linhagem, um aumento na invaso aps uma exposio breve da clula hospedeira citocalasina D, que removeria a barreira cortical do citoesqueleto de actina, facilitando o acesso dos lisosomas at a membrana plasmtica e sua subseqente fuso. A fuso dos lisosomas seria requerida na entrada do T. cruzi, provavelmente como uma fonte de membrana para formar o vacolo onde o parasita encontrado nas etapas iniciais da interiorizao (Tardieux et al., 1994). O papel de carboidratos na adeso e internalizao dos parasitas geralmente aceito. Vrias abordagens experimentais foram realizadas seja pelo tratamento do parasita ou da clula hospedeira com glicosidases ou por ensaios de inibio com lectinas solveis e monosacardeos, ou ainda pelo uso de linhagens mutantes deficientes em glicoconjugados. Um dos principais acares envolvidos na interao parasito-clula o cido silico. Trabalhando com macrfagos peritoneais como clula hospedeira, tratamentos com neuramidase exgena (que remove cido silico) ou o bloqueio do cido silico com lectina especfica, observou-se aumentos nos ndices fagocticos (Arajo Jorge & De Souza, 1984, 1986; de Titto & Arajo, 1987). Esse resultado tambm foi obtido com o tratamento do parasita com ferritina cationizada, molcula que neutraliza a alta negatividade da superfcie das formas tripomastigotas do parasita (Meirelles et al., 1984). Lectinas de superfcie que reconhecem resduos de galactose foram detectados na superfcie de macrfagos e a inibio da interiorizao do T. cruzi por mono- e dissacardeos de galactose sugere que esses resduos na superfcie do parasita esto sendo reconhecidos por galectinas. A adio de asialoeritrcitos inibe fortemente a invaso de tripomastigotas em macrfagos residentes, competindo por uma lectina especfica para galactose (Arajo Jorge & De Souza, 1988; Arajo Jorge et al., 1989). Foi tambm descrito que em pacientes chagsicos so produzidos altos nveis de anticorpos anti-epitopos galactosil (Milani & Travassos, 1988; Avila et al., 1989) e que anticorpos anti-galactose diminuem a invaso em linhagens celulares in vitro (Arruda et al., 1989). Clulas mutantes deficientes em cido silico (Lec2), comparadas com clulas do tipo selvagem, apresentam uma inibio de 50% na interiorizao de formas infectivas do parasita. Se as clulas mutantes forem tratadas com a enzima trans-sialidase do T. cruzi e uma fonte exgena de cido silico, o processo de invaso restaurado e so observados nveis de infeco semelhantes s clulas-controle, sugerindo fortemente que o cido silico est envolvido no processo de reconhecimento e de invaso celular nesta interao (Stanley & Siminovitch, 1977; Vermelho et al., 1994). Experimentos semelhantes realizados com clulas do tipo selvagem e clulas mutantes que no possuem proteoglicanos (clulas CHO, de ovrio de hamster) apontam tambm um papel para glicosaminoglicanos heparan sulfato e heparina na invaso do T. cruzi (Herrera et al., 1994). Estes resultados parecem indicar que o parasita utiliza mleculas ubquas (negativamente carregadas), como receptores da clula hospedeira, o que pode explicar a razo de o parasita invadir uma grande variedade de clulas de vertebrados. Alguns experimentos realizados com macrfagos de aves obtidos pela diferenciao in vitro de moncitos de sangue (Meirelles et al., 1980) interagindo com formas epimastigotas e tripomastigotas das cepas Y e CL, e observadas por perodos de 2, 6, 12 e 20 horas mostraram diferenas acentuadas na interao desses dois estgios e entre as duas cepas. Praticamente todos os macrfagos fagocitam formas epimastigotas da cepa CL aps 2 e 6 horas de contato, mas somente 50-60% foram infectados com a cepa Y. Para a forma tripomastigota,
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entre 6 e 12 horas, quase todos os parasitas da cepa Y foram encontrados no interior dos macrfagos, mas para a cepa CL a internalizao chegou a 60% e muitas formas permaneceram no sobrenadante das culturas indicando que diferentes propriedades de superfcie destas duas cepas tm papel relevante no processo de sua interiorizao. Estudos posteriores com este macrfagos foram feitos para seguir o destino intracelular de formas tripomastigotas do T. cruzi e compar-los com os resultados j conhecidos em macrfagos de camundongos (Meirelles & De Souza, 1983). Entre 24 e 36 horas um intenso processo de digesto foi observado e em 72 horas os parasitas desapareciam e no foram observados nem dentro dos macrfagos nem no sobrenadante dos mesmos. Com a finalidade de esclarecer se esta propriedade de digerir parasitas era especfica contra o T. cruzi, dois outros parasitas intracelulares foram testados: formas amastigotas de Leishmania mexicana mexicana e taquizoitas de Toxoplasma gondii. No caso da Leishmania houve 100% de internalizao, porm aps 48 horas iniciou-se o processo de digesto, de modo que aps 72 horas os parasitas no eram mais observados nos macrfagos de aves. Tanto com Leishmania como com o T. cruzi, os macrfagos de aves aps o processo de destruio dos parasitas se fundiam formando grandes clulas multinucleadas com at oito ncleos. No caso do Toxoplasma gondii, como j referido anteriormente na literatura, os parasitas se multiplicavam dentro de vacolos citoplasmticos dos macrfagos de aves, formando rosetas tpicas (Nery-Guimares & Meyer, 1942). Em experimentos paralelos, feitos em macrfagos de camundongos, as trs formas de parasitos completavam seu ciclo intracelular. Toxoplasma gondii mostrou-se resistente a macrfagos de aves e bem conhecido que este parasita infecta aves (Meirelles & De Souza, 1983). Porm, bem conhecido tambm que aves no so infectadas por T. cruzi e foi descrito que aps 18 dias de incubao aparece um fator ltico no sangue dos embries que os torna resistentes infeco pelo T. cruzi (Dias, 1944; Nery-Guimares et al., 1974; Kierzembaum et al., 1976). Baseados nestes estudos foi considerado que as aves so refratrias ao parasita em conseqncia da susceptibilidade do T. cruzi lise por complemento. Estudos prvios referem que no processo de ingesto do T. cruzi por macrfagos ocorre a produo de grande quantidade de compostos reativos intermedirios do oxignio que tem atividade microbicida. Em nossos estudos localizamos, a nvel ultraestrutural a presena de H2O2 nos vacolos que continham os parasitas. Estes resultados sugerem que alm do conhecido efeito do complemento, mecanismos celulares tm algum papel na refratariedade das aves a tripanosomatdeos (Meirelles & De Souza, 1983).
18.1.2. Estudos com Clulas Musculares

As clulas musculares so o principal alvo na infeco chagsica. Estabelecemos um sistema de cultivo primrio de clulas musculares cardacas (CMC) e esquelticas (CME), obtidas de embries de camundongos, para investigar eventos iniciais envolvidos na invaso do T. cruzi e na sua sobrevivncia dentro destas clulas hospedeiras (Meirelles et al., 1986; Arajo-Jorge et al., 1987). Neste sistema foi possvel localizar pela primeira vez o T. cruzi dentro de um vacolo parasitforo no citoplasma dos micitos e demonstrar a fuso dos lisosomas, marcados com peroxidase e com fosfatase cida, com o fagosoma contendo o parasita (Meirelles et al., 1986). A organizao do citoesqueleto de CMC normais e infectadas pelo parasita foi investigada por imunofluorescncia e microscopia eletrnica de transmisso. As sondas fluorescentes revelaram que com 24-48 horas de infeco os microtbulos, os filamentos de actina e de desmina se mostravam rompidos e que ocorria a quebra das miofibrilas. Combinando tcnicas de microscopia eletrnica analtica com sintonizao do contraste, detectamos uma rede de filamentos altamente interconectada em clulas normais e bastante frouxa nas clulas que continham parasitas j em multiplicao e diferenciao (Pereira et al., 1993). Estudos posteriores feitos com formas metacclicas do clone Dm28c que apresentam altos nveis de interiorizao em clulas musculares e que foram submetidas a tratamentos com citocalasinas (B e D) durante a interao. Estas drogas no afetaram a adeso do parasita mas causaram uma inibio de 65-75% na interiorizao do T. cruzi. Testes com fixadores celulares mostraram que o parasita no capaz de invadir clulas fixadas e que parasitos fixados no so interiorizados
293
em clulas cardacas tratadas ou no com citocalasinas. Em condies normais de interao e em intervalos curtos de contato parasita-clula (5, 10, 15 e 30 minutos), o mecanismo de invaso precedido por projees da membrana da clula hospedeira que envolvem o parasita e que posteriormente so degradadas dentro do vacolo parasitforo muito rapidamente. Estudos com microscopia de varredura revelaram um ativo envolvimento do citoesqueleto da clula cardaca no processo de invaso do parasita (Barbosa & Meirelles, 1995). A carga de superfcie de clulas musculares cardacas e do T. cruzi foi estudada durante sua interao por meio de metodologias que empregam tcnica de eletroforese celular e um sistema de lazer dando uma medida direta do potencial Zeta (ZP), expresso em milivolts (Soeiro et al., 1994, 1995). Nossos estudos com comportamento eletrofortico de CMC infectadas com formas tripomastigotas mostraram que os parasitas so capazes de reduzir a carga negativa da superfcie das clulas hospedeiras, provavelmente atravs de uma atividade neuraminidase-transialidase que catalizada pela mesma enzima. Aps 20, 48 e 96 horas de interao elas expressam uma reduo considervel no ZP de 41, 33, 34%, respectivamente. Estas alteraes persistem durante todo o ciclo intracelular do parasita, sugerindo que em adio s alteraes causadas pela presena do parasita, fatores solveis, talvez secretados pelo parasita, podem contribuir na manuteno da alterao da carga de superfcie. Tripomastigotas sangucolas e metacclicos reduzem a carga de superfcie das CMC, assim como de outras clulas no fagocticas profissionais. Formas amastigotas do parasita em contato por 20 horas com as CMC no expressam nenhuma alterao na negatividade de carga, provavelmente por no possurem atividade da enzima sialidase- transialidase. As maiores alteraes de reduo da carga de superfcie das clulas foram obtidas nas clulas infectadas com o clone Dm28c que apresenta altos ndices de infeco no msculo. Os resultados da eletroforese celular em outros tipos celulares como hepatcitos e fibroblastos mostrou que o parasita afeta o ZP destas clulas, porm nenhuma alterao foi encontrada aps a infeco de macrfagos J774G-8, o que sugere diferenas na composio de glicoconjugados sializados em clulas fagocticas profissionais, ou que o mecanismo de penetrao em macrfagos dispense a sua desializao, pela disponibilidade de outros receptores como por exemplo as lectinas para galactose, como descrito acima. Eritrcitos do sangue de animais contaminados apresentaram uma diminuio bastante significante de seu ZP , de cerca de 58%. A sialidase que pode ser detectada no soro de camundongos e humanos com doena de Chagas a possvel responsvel pelo fato de que eritrcitos de animais infectados mimetizam eritrcitos envelhecidos que so rapidamente retirados da circulao pelo fgado e bao. Provavelmente, isto pode ser uma das causas da anemia, leucopenia e trobocitopenia associada doena de Chagas. O ZP da superfcie dos parasitas tambm foi analisado aps o contato com as CMC e observou-se uma reduo do ZP de cerca de 39%, podendo indicar que enzimas secretadas pelo parasita provavelmente podem alterar sua prpria superfcie, retirando molculas ou expondo importantes aceptores para esta interao (Soeiro et al., 1995). O cido silico tem sido implicado na adeso e interiorizao do parasita em macrfagos e em vrios tipos celulares (Colli, 1993). Experimentos usando trans-sialidase solvel durante a interao de clulas hospedeiras sializadas impedem a interiorizao do parasita (Ming et al., 1993). A modulao da atividade de sialidase trans-sialidase e o cido silico presente nas clulas pode torn-las mais susceptveis invaso do parasita e causar modificaes na superfcie da clula hospedeira, entre elas a perda de anionogenicidade. Em clulas musculares esta alterao pode causar interferncia no fluxo de ons da membrana plasmtica, pois sabe-se que resduos de cido silico esto implicados no transporte de ons no sarcolema. Alteraes no nveis de clcio intracelular foram descritos durante a interao T. cruzi-clula hospedeira, incluindo clulas musculares (Morris et al., 1988; Low et al., 1992; Dorta et al., 1996; Caler et al., 1998; Garzoni et al., 1998). Recentemente foi mostrado que ocorre uma rpida e repetitiva elevao de clcio citoslico na clula hospedeira logo que elas so expostas a formas tripomastigotas de cultura de tecidos e sangucolas no momento da invaso celular. Paralelamente, h tambm um aumento de clcio nas formas do parasita aps sua associao com a clula, sugerindo que estas mudanas so um importante mecanismo de sinalizao para a penetrao do parasita na clula hospedeira (Tardieux et al., 1994; Do Campo & Moreno, 1996). Para estudar o papel de ons clcio em micitos de cultura, usamos o corante indicador fura2. Nossos resultados mostraram um aumento significante nos nveis de clcio intracelular
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durante o processo de invaso e que um aumento constante no clcio foi observado quando o parasita foi encontrado aderido ao cardiomicito (Garzoni et al., 1998; Meirelles et al., 1999). O T. cruzi adere e invade vrios tipos de clulas de mamferos, porm existe bastante controvrsia sobre a natureza dos receptores e seu correspondentes ligantes que mediam esta interface parasita-clula. Dorta et al., (1995) identificaram duas glicoprotenas de tripomastigotas metacclicos que se ligam superfcie de clulas no fagocticas de mamferos e mediam a invaso do parasita: a gp82 e a gp 35/40. Mucinas so protenas expressas em estgios do desenvolvimento encontrados no inseto vetor. O mecanismo que dispara a interiorizao do parasita metacclico desconhecido. Analisamos o papel do receptor de manose em culturas primrias de cardiomicitos usando a peroxidase (HRP) como ligante para localizar este receptor. Os nveis de infeco foram analisados pela adio de 10 ou 50 mM de D-manose durante a infeco por 24 horas a 37C e estudos ultra-estruturais para deteco do receptor foram realizados usando peroxidase acoplada a ouro coloidal. A adio de manose impediu a entrada do parasita, sendo a dose de 10 mM a mais efetiva; os estudos ultra-estruturais mostraram o traador sobre o sarcolema, prximo ou dentro de vesculas sem revestimento, em cavolas e em endosomas. Clulas infectadas mostraram as partculas de ouro no stio de associao parasitaclula e tambm dentro do vacolo parasitforo contendo o parasita. O receptor de manose localizado na superfcie dos cardiomicitos est envolvido na ligao e interiorizao do T. cruzi (Soeiro et al., 1999). O tratamento das formas tripomastigotas de sangue do T. cruzi com diferentes componentes de superfcie tais como protenas e enzimas tem mostrado a participao destas molculas na adeso e interiorizao do parasita nas CMC (Soeiro et al., 1995). O tratamento destas formas com tripsina impede, e com fosfolipase C ou neuraminidase aumenta a sua interiorizao em clulas musculares. CMC pr-tratadas com tripsina tem aumentada, e com fosfolipase C diminuda a invaso do parasita, indicando que estes componentes localizados na superfcie das CMC so importantes para sua infeco pelo parasita. A remoo do cido silico da superfcie do parasita por uma neuraminidase exgena aumentou os nveis de sua invaso em CMC de modo semelhante ao que foi descrito para macrfagos, provavelmente promovendo esta invaso pela exposio de resduos de galactose e N-acetil galactosamina alm da provvel ao de outras enzimas secretadas pelo parasita no processo. A ao de fosfolipases exgenas removendo componentes como a enzima sialidase-trans-sialidase, talvez pela clivagem da ncora de glicosil fosfatidilinositol, poderia estar influenciando a alta infectividade do parasita. Resultados semelhantes foram encontrados com tratamentos de fosfolipases A2 e D em clulas fagocticas (Connelly & Kierszenbaum, 1984). Os tratamentos com tripsina confirmam dados da literatura sobre a relao de infectividade do parasita e as glicoprotenas de superfcie como a Ssp-3 e a Tc-85. Tratamentos das CMC com ferritina cationizada (FC) que se liga a stios aninicos da superfcie celular aumentam a interiorizao de tripomastigotas metacclicos Dm28c, e se contrrio os parasitas so tratados, h um aumento da ligao do parasita superfcie, mas no ocorre a sua interiorizao. As anlises estatsticas destas cinticas de interao mostraram significncia quando feito o bloqueio dos stios aninicos pela FC, que foi capaz de neutralizar a alta carga de superfcie destas formas do parasita e de aumentar sua adeso mas no sua invaso. Nossos estudos indicam que as formas tripomastigotas do T. cruzi so capazes de processar a superfcie das CMC modulando a exposio dos ligantes necessrios invaso ou removendo molculas que impedem o seu acesso s CMC (Soeiro et al., 1995). A perda de anionogenicidade pode ser tambm associada atividade proteoltica do parasita. O T. cruzi possui uma cistena proteinase que expressa em todos os seus estgios evolutivos e compartimentalizada em vesculas. Esta enzima foi descrita como estruturalmente relacionada com as catepsinas L e B e pode desempenhar um papel no catabolismo das protenas, ou promover o processamento de precursores de peptdeos (Murta et al., 1993). Tratamentos com inibidores da cistena proteinase do tipo peptidil diazometano (PDAM), tanto no parasita antes da interao com a clula hospedeira como nas CMC aps a infeco do parasita mostraram que a habilidade de invadir as clulas, bem como de se multiplicar e diferenciar dentro das clulas musculares cardacas depende de modo crtico da atividade da cisteina proteinase (Meirelles et al., 1992).
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A hiptese de que a auto-imunidade pode contribuir na cardioneuropatologia da doena de Chagas teve apoio na descoberta que anticorpos contra certos antgenos de T. cruzi tem reao cruzada com um nmero de antgenos de mamferos. O mimetismo molecular tem sido associado ao processo do reconhecimento imunolgico do T. cruzi (Van Voorhis & Eisen, 1989; Petry & Van Voorhis, 1991). Recentemente, Tarleton et al. (1997), trabalhando com transplantes de coraes neonatais, apresentaram resultados que contestam que a induo do dano tissular na doena de Chagas apresente uma etiologia auto-imune principal, e que demonstram que o parasitismo cardaco necessrio e suficiente para a induo do mesmo. Isolamos glicoesfingolipidios neutros (GSLs) de clulas musculares cardacas de camundongo que representam molculas comuns na superfcie das CMC e do T. cruzi. Fraes de mono-(CMH) e dihexosdeo (CDH) ceramidas tm a mesma mobilidade eletrofortica da glicosil-galactosil ceramida da cepa Y do parasita (Vermelho et al., 1994). Estas molculas tm se mostrado imunorreativas. Por meio de ensaios ELISA, verificamos que anticorpos reativos com cada um dos glicolipdios imunognicos das CMC ou do parasito esto presentes no soro de pacientes chagsicos. possvel que sendo o miocrdio o tecido mais afetado na doena de Chagas, estes GSLs comuns ao parasita e celula muscular cardaca possam ter papel, com outras molculas, nas reaes de dano tissular descrita na doena de Chagas (Vermelho et al., 1997). O T. cruzi necessita invadir a clula hospedeira para assegurar sua multiplicao e sobrevivncia. H uma evidncia na literatura, controversa, mas no contestada experimentalmente, de que aps a infeco, formas intracelulares em diviso do parasita integram minicrculos dos seus kDNA no genoma da clula hospedeira (Teixeira et al., 1994). A cariotipagem dos cromossomas metafsicos mostrou uma associao preferencial desses elementos de DNA com os cromossomas 3, 6 e 11 da clula hospedeira. Os genes que codificam a -actina do miofibrila, a cadeia do receptor da clula T e do gene da cadeia pesada de miosina esto tambm presentes respectivamente nos cromossomas 3, 6 e 11. Foi sugerido que a integrao do DNA do T. cruzi no genoma da clula deva levar a alteraes na regulao da expresso gnica da clula hospedeira. Distrbios de conduo, aparecimento de arritmias, acompanham as manifestaes da doena na fase aguda e crnica. Os micitos cardacos apresentam fluxo de corrente intercelular em especializadas regies do sarcolema - junes gap - formado por canais de baixa resistncia, coordenando o espalhamento da excitao e subsequente contrao atravs do miocrdio. A presena do parasita acompanhada por marcantes distrbios na comunicao intercelular levando a alteraes na distribuio das junes gap, desaparecimento da conexina 43 e perda da funo em clulas infectadas (Campos de Carvalho et al., 1991). Nossos estudos sobre outras caractersticas eletrofisiolgicas das CMC em cultura, como a freqncia da contrao espontnea, mostraram que ela maior em clulas com 3 dias de cultivo e 48h de infeco do que em clulas normais com o mesmo perodo de cultivo, enquanto que a resposta noradrenalina foi maior nas clulas normais do que nas infectadas (Aprigliano et al., 1993). Juntos, estes resultados mostram que o T. cruzi, ao invadir o msculo cardaco, precisa do controle absoluto sobre seu hospedeiro e, para tanto, desliga a comunicao celular, altera a freqncia cardaca e o coordenador dos danos iniciais simultneos que afetam a funcionalidade do corao na doena de Chagas experimental e humana.
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18.2
Protocolos de Cultura Primria

Helene S. Barbosa, Mirian C. S. Pereira & Maria de Nazareth S. L. Meirelles
18.2.1. Clulas Musculares

Culturas primrias compreendem clulas derivadas diretamente de um rgo ou tecido. Basicamente, o tecido isolado fragmentado em pequenas peas com bisturi e pina, dissociado com enzimas proteolticas, dando origem a clulas individualizadas que sero cultivadas em meio nutritivo, in vitro. Clulas musculares so dependentes de ancoragem, requerendo substrato slido para promover a sua proliferao, metabolismo e diferenciao. O emprego de tecidos embrionrios permite o acompanhamento do processo de miognese, com a vantagem de serem estreis desde o incio do isolamento. Este tipo de tecido apresenta desagregao fcil e as clulas isoladas tm alta capacidade de adeso ao substrato, alta motilidade e excelente ndice de multiplicao e diferenciao celular in vitro (Konigsberg, 1960, 1963; Harary & Farley, 1963; De Luca, 1966; Kasten, 1973; Yaffe, 1973).
18.2.1.1. Roteiro para obteno de cultura primria de clula muscular cardaca (Meirelles et al., 1986)
Material:
fmeas de camundongos suos grvidas com 18 a 20 dias de gestao Ringer PBS tripsina colagenase gelatina L-glutamina cloreto de clcio (CaCl2) antibiticos: estreptomicina e penicilina meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) soro fetal bovino soro de cavalo extrato embrionrio de pinto bicarbonato de sdio (NaHCO3)
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placas de Petri de vidro (100 x 15 mm e 35 x 10mm) Erlenmeyer de 50 ml contendo barra magntica (8 x 3mm) pipetas Pasteur pipetas sorolgicas de 2 e 5 ml. lamnulas redondas de vidro (15 x 0,13 mm) tubos cnicos de 15 ml
Obs: o material deve ser embalado apropriadamente e esterilizado em autoclave a 1 atm (120C) por 20 min.
pinas de ponta dente de rato (12 cm) e ponta curva (10 cm), tesoura cirrgica ponta curva ou reta (12 cm) e
bisturi (15 cm)
gaze estril placa de cortia e alfinete cmara morturia material plstico para plaqueamento (garrafas de 25 cm2, placas de 24 poos, placas de 35 mm)
Procedimento:
anestesiar as fmeas grvidas em cmara morturia contendo ter etlico. Levar o animal para o fluxo laminar,
fix-lo na placa de cortia e esterilizar a rea de disseco (rea abdominal) com lcool a 70%; abrir o abdmen expondo a membrana peritoneal. Com material cirrgico estril, abrir a cavidade peritoneal e remover o tero contendo os embries, transferindo-os para uma placa de Petri (100 x 15 mm) contendo soluo de Ringer no gelo; decapitar os embries e abrir a cavidade torcica na altura do osso externo. Remover os coraes e transferi-los para com placa de Petri (35 x 10 mm) contendo soluo de Ringer. Retirar os trios e os vasos da base de cada corao e fragmentar os ventrculos sobre lmina escavada, transferindo os fragmentos para outra placa de Petri (100 x 15 mm) com placa de Petri (35 x 10 mm) contendo soluo de Ringer no gelo; transferir os fragmentos para Erlenmeyer (50 ml) contendo barra magntica, lavar 2x em soluo de Ringer para remoo das clulas sangneas e posteriormente lavar em PBS (sem clcio e magnsio) sob agitao por 5 min a 37 C; iniciar o procedimento de dissociao enzimtica: Soluo de dissociao: 0,025% tripsina + 0, 01% de colagenase (soluo estril e previamente aquecida em banho-Maria) a 37C expor os fragmentos do tecido dissociao seqencial por 5 min cada etapa a 37 C, sob agitao magntica, at completa digesto do tecido recolher o lquido de dissociao contendo as clulas isoladas e transferi-lo para tubos de centrfuga (15 ml) contendo 2 ml de meio DMEM completo, suplementado com 0,5 ml de soro fetal bovino. Manter os tubos no gelo a fim de inativar a atividade enzimtica. Marcar os tubos a cada etapa da dissociao controlar ao microscpio ptico de contraste de fase: o padro morfolgico, a viabilidade celular e o nmero de clulas obtidas, aps cada dissociao centrifugar os tubos com clulas a 1800 rpm (500g) por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as clulas em DMEM completo. Repetir este procedimento 2x, objetivando lavar as clulas e eliminar a presena das enzimas proteolticas. Manter as clulas no gelo at o seu plaqueamento; utilizar uma alquota da suspenso celular para avaliao do nmero de clulas em cmara de Neubauer; iniciar o plaqueamento seqencial para obteno de culturas ricas em mioblastos: plaquear as clulas (0,8-1x106 clulas) em garrafas 25 cm2 previamente revestidas com gelatina 0,01%;
Obs: A gelatina colocada nas garrafas por 15 min a 4 C e posteriormente removida, sendo as garrafas mantidas em estufa a 37C em atmosfera de 5% de CO2 at o momento do plaqueamento. Este revestimento com gelatina propicia uma melhor adeso das clulas ao substrato.
aps 15 a 30 min de plaqueamento, alta proporo de fibroblastos ir aderir ao substrato, devido a sua velocidade de adeso mais rpida do que os mioblastos. Recolher o sobrenadante, rico em mioblastos, plaquear as clulas em recipientes previamente revestidos com gelatina, como descrito acima. A densidade celular de
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plaqueamento varia de acordo com a rea do substrato: 5 placas de 24 poos, com dimetro de 18 mm: 15 x 10 2 6 garrafas de plsticos de 25 cm : 2 x 10 6 placa de Petri com dimetro de 35 mm: 0,8-1 x 10 trocar o meio de cultivo aps 24 horas, para remoo de clulas mortas e debris celulares. Manter as clulas a 37C em atmosfera de 5% de CO2, sendo a troca do meio efetuada a cada 2 dias Caractersticas da cultura (Figs.3 e 4): A miognese de clulas musculares cardacas in vitro obedece etapas distintas: Nas primeiras 24 horas de plaqueamento existem 2 tipos celulares predominantes: pr-mioblastos e mioblastos que apresentam intensa multiplicao e motilidade celular. Aps 24 horas, um percentual de mioblastos mantm a diviso celular e outros iniciam o processo de diferenciao celular com a organizao das protenas do citoesqueleto em miofibrilas e j se evidencia a presena de clulas diferenciadas, micitos cardacos, com contrao espontnea. Aps 48 horas, observa-se alto percentual de clulas diferenciadas. Estas clulas, cardiomicitos, se caracterizam por estabelecerem contato com clulas vizinhas, apresentando interdigitaes membranares formando o disco intercalar, alm de apresentarem regies de alta especializao de membrana com formao de gap-junctions, desmossomos e fascia adherens. Estas especializaes favorecem o acoplamento celular, permitindo o sincronismo de contraes espontneas. Ao final de 96 horas de cultivo, ocorre a formao de miofibras em virtude do alto ndice de clulas acopladas. Caractersticas morfolgicas dos tipos celulares presentes nas culturas:
Fibroblastos:
clulas bem espalhadas freqentemente na forma triangular ou estrelada citoplasma transparente e pouco refratrio em microscopia de contraste de fase uninucleados ncleo e citoplasma pouco corados pelo Giemsa 2 ou mais incluses densas intranucleares arredondadas durante a diviso celular clulas bipolares altamente refratria em contraste de fase ncleo com tendncia a forma alongada uninucleados ncleo bem corado pelo Giemsa citoplasma granular
Mioblastos:
Micitos: (CARDACOS)
- clulas volumosas - presena de estriaes (miofibrilas)
299
C
Figura 3: Aspectos morfolgicos da miognese de clulas cardacas, in vitro. (A) Migrao para alinhamento e acoplamento de clulas cardacas aps 48 h de plaqueamento. As setas indicam a possvel direo do alinhamento, barra: 20 m; (B) Evoluo do acoplamento celular para a formao da miofibra cardaca, em culturas mantidas por 5 dias, barra: 20 m; (C) Clulas musculares cardacas (4 dias de cultivo) coradas com faloidina-FITC para deteco de filamentos de actina. Evidenciao de cardiomicitos apresentando uma complexa organizao do citoesqueleto em miofibrilas, barra: 10 m.
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Figura 4: Aspectos ultra-estruturais de clulas musculares cardacas cultivadas in vitro. (A e B) Uma miofibra apresentando acoplamento e exibindo disco intercalar (DI) com presena de regies especializadas de membrana, como desmossomas (D) e gap junctions (GJ) (A). Detalhe de uma gap junction em (B). (C) Imagem de dois micitos acoplados, observa-se miofilamentos de actina e miosina em cortes transversais (MF). (D) Aspecto de sarcmeros organizados com evidenciao de linhas Z (Z) no citoplasma de um micito aps 5 dias de cultivo. Observa-se tambm a riqueza de grnulos de glicognio distribudos no citoplasma da clula, revelados pela tcnica de Thiry. Barras: 0,2 m.
301
18.2.1.2. Roteiro para obteno de cultura primria de clula muscular esqueltica (Arajo-Jorge et al., 1986)
Material:
basicamente os mesmos utilizados para a obteno de clulas cardacas soluo de dissociao: tripsina associada verseno
Procedimento:
anestesiar as fmeas grvidas em cmara morturia contendo ter etlico. Levar o animal para o fluxo laminar,
fix-lo na placa de cortia e esterilizar a rea de disseco (rea abdominal) com lcool a 70%;
abrir o abdmen, expondo a membrana peritoneal. Com material cirrgico estril, abrir a cavidade peritoneal e
remover o tero contendo os embries, transferindo-os para uma placa de Petri (100 x 15 mm) contendo soluo de Ringer no gelo; remover as coxas traseiras dos embries e transferi-las para uma placa de Petri (100 x 15 mm) com placa de Petri (35x10 mm) contendo soluo de Ringer. Dissecar o material, retirando a pele, os ossos e a cartilagem. Fragmentar o tecido muscular sobre lmina escavada, transferindo os fragmentos para outra placa de Petri (100 x 15 mm) com uma placa de Petri (35 x 10 mm) contendo soluo de Ringer no gelo; transferir os fragmentos para Erlenmeyer (50 ml) contendo barra magntica, lavar 2 vezes em soluo de Ringer para remoo das clulas sangneas e posteriormente lavar em PBS (sem clcio e magnsio) sob agitao por 5 min a 37 C; dissociao enzimtica: Soluo final (v/v): 0,05% tripsina + 0,01% de verseno em PBS (soluo pr-aquecida, estril, a 37C em banho-maria) expor os fragmentos do tecido dissociao seqencial por 5 min cada etapa a 37 C, sob agitao magntica, at completa digesto do tecido recolher o lquido de dissociao contendo as clulas isoladas e transferi-lo para tubos de centrfuga (15 ml) contendo 2 ml de meio DMEM completo, suplementado com 0,5 ml de soro fetal bovino. Manter os tubos no gelo a fim de inativar a atividade enzimtica. Marcar os tubos a cada etapa da dissociao controlar ao microscpio ptico de contraste de fase: o padro morfolgico, a viabilidade celular e o nmero de clulas obtidas, aps cada dissociao centrifugar os tubos com clulas a 1800 rpm (500g) por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as clulas em DMEM completo. Repetir este procedimento 2x, objetivando lavar as clulas e eliminar a presena das enzimas proteolticas. Manter as clulas no gelo at o seu plaqueamento; utilizar uma alquota da suspenso celular para avaliao do nmero de clulas em cmara de Neubauer; iniciar o plaqueamento seqencial para obteno de culturas ricas em mioblastos: plaquear as clulas (0,8-1x106 clulas) em garrafas 25 cm2 previamente revestidas com gelatina 0,01%; aps 15 a 30 min de plaqueamento, alta proporo de fibroblastos ir aderir ao substrato, devido a sua velocidade de adeso mais rpida do que os mioblastos. Recolher o sobrenadante, rico em mioblastos, plaquear as clulas em recipientes previamente revestidos com gelatina, como descrito acima. A densidade celular de plaqueamento varia com a rea do substrato: 5 placas de 24 poos, com dimetro de 18 mm: 15 x 10 2 6 garrafas de plsticos de 25 cm : 2 x 10 6 placa de Petri com dimetro de 35 mm: 0,8-1 x 10 trocar o meio de cultivo aps 24 h, para remoo de clulas mortas e debris celulares. Manter as clulas a 37C em atmosfera de 5% de CO2, sendo a troca do meio efetuada a cada 2 dias.
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Caractersticas da cultura (Figs. 3-7): A miognese de clulas musculares esquelticas in vitro obedece a uma seqncia de transformaes morfofisiolgicas nas primeiras 24 horas de cultivo. Mioblastos dividem-se e migram na cultura, se alinhando a outros mioblastos. Aps 24 horas, estes mioblastos so competentes para fuso e se transformam em miotubos jovens pela fuso de mioblastos, que no mais se dividem e so predominantemente binucleados. A partir de 48 horas formamse os miotubos maduros que se originam da fuso de vrios miotubos jovens e ainda de mioblastos, sendo ento multinucleados. Da fuso de miotubos maduros formam-se as miofibras em torno do quinto ou sexto dia de cultivo. A contrao espontnea ocorre aps 10 dias de cultivo.
18.2.2. Procedimento para Cultivo de Macrfagos Peritoneais de Camundongos (Arajo-Jorge & De Souza, 1986)
Este tipo de cultura primria dispensa o uso de enzimas para dissociao. So clulas obtidas da parede do peritneo, que se soltam facilmente, aps massagem do abdmen do animal. Procedimento:
anestesiar o camundongo (25 a 30g); ao fluxo laminar, prend-lo sobre placa de cortia; injetar, no peritneo, 5-10 ml de soluo salina (Hanks) ou meio de cultivo (DMEM) com seringa estril; massagear o abdmen; recolher o lquido do exudato peritoneal e controlar ao microscpio a presena de bactrias e/ou protozorios,
que se presentes indicam perfurao do intestino, devendo ser desprezado; manter o lquido em banho de gelo para evitar adeso das clulas, principalmente macrfagos, superfcie do tubo de vidro ou do plstico; centrifugar a 4C (500g por 10 min) e ressuspender as clulas em DMEM contendo 5-10% de soro fetal bovino. Avaliar o nmero de clulas obtidas em cmara de Neubauer; plaquear as clulas a uma densidade 1-2 x 104 clulas/mm2, por 20 min a 37C. Trocar o meio aps esse perodo. Caractersticas da cultura: Os macrfagos se apresentam como clulas arredondadas, sendo dependentes de ancoragem ao substrato para o seu metabolismo. Aderidas ao substrato se apresentam em formato de estrela. So clulas j diferenciadas e portanto, no se multiplicam, e tm tempo limitado de manuteno in vitro (em torno de 3-4 dias), sob timas condies de pH, temperatura e nutrientes.
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Figura 5: Aspectos das etapas da dissociao e cultivo de clulas musculares esquelticas, in vitro. (A e B) Micrografias de mioblastos durante sua dissociao parcial (A) e total (B), barras: 0,1 mm; (C) Aspecto geral da cultura aps 24 horas de plaqueamento. As clulas so observadas em processo de alinhamento e alguns fibroblastos destacam-se com ncleos volumosos (cabeas de seta), barra: 1 mm.
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Figura 6: Aspectos morfolgicos da miognese de clulas musculares esquelticas. (A e B) Migrao e alinhamento de mioblastos aps 48 horas de plaqueamento, para a posterior fuso (A; cabea de seta) e a formao de miotubo jovem binucleado (B); (C-F) Crescimento do miotubo com multinucleao (3, 4 ou 7 ncleos) aps 72 horas (C e D) e 96 horas de cultivo (E e F). Nota-se que durante o processo de fuso, miotubos j multinucleados podem fundir-se, apresentando imagens de ramificao angular, (E); (G) Miotubo maduro no 5o dia de cultivo in vitro, apresentando multinucleao com disposio central e linear dos ncleos, barras: 20 m.
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Figura 7: Aspectos ultra-estruturais das clulas musculares esquelticas, in vitro. (A) Miotubo maduro com 4 ncleos; (B e C) Aspectos do citoplasma de um miotubo no qual pode se observar filamentos de actina e miosina em arranjos longitudinais ou transversais (MF) , invaginaes da membrana plasmtica para a formao de tbulos T (setas), mitocndrias com cristas longitudinais paralelas (M), barras: 0,2 m.
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ANEXO 18.1
Solues e Meios de Cultura

Todas as solues e meios devem ter seu pH aferido antes de se iniciar a cultura.
Soluo de Ringer pH 7,0
NaCl KCl CaCl2 gua tridestilada qsp 154 mM 56,28 mM 17 mM 1000 ml 9,0 g tomar 8,4 ml de soluo 5% tomar 5,0 ml de soluo 5%
esterilizar em autoclave (20 min/1 atm)

Soluo de PBS pH 7,0
NaCl K Cl KH2PO4 Na2HPO4 gua tridestilada qsp 137,0 mM 2,7 mM 0,88 mM 6,4 mM 1000 ml 8,0 g 0,20 g 0,12 g 0,91 g
esterilizar em autoclave (20 min/1atm)

Soluo de gelatina 0,01%
dissolver 0,01 g em soluo de Ringer pH 7,0, sob aquecimento esterilizar em autoclave (20 min/1 atm)
Soluo de L-glutamina 200 mM
dissolver 2,9263 g em 100 ml de gua tridestilada filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
Soluo de bicarbonato de sdio (NaHCO 3) 333 mM
Soluo de cloreto de clcio (CaCl 2 . 2 H 2 O) 25 mM
Soluo de tripsina 0,1%
soluo estoque: dissolver 0,1 g em 100 ml de PBS pH 7,0 deixar sob agitao por cerca de 7 h a 4C filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
Soluo de colagenase 0,8%
preparar soluo estoque dissolvendo 0,5 g em 60 ml de PBS filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
307
Soluo de EDTA ou Verseno 0.02%
preparar soluo estoque dissolvendo 0,02 g em 100 ml de PBS filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
Soluo estoque de penicilina - estreptomicina
1 frasco de estreptomicina (1 g) 1 ml de penicilina (1000000 U/ml) 100 ml de gua tridestilada estril concentrao final: 10 mg/ml de estreptomicina e 10000 U/ml de penicilina concentrao de trabalho: 0,1 mg/ml de estreptomicina e 1000 U/ml de penicilina
Meio Eagle (pH 6,8)
meio Eagle MEM 13,4 g nitrato frrico (Fe(NO3)2.9H2O) 0,001 g/l diluir em 10 ml acrescentar 10 ml da sol. estoque de penicilina estreptomicina gua tridestilada qsp 1000ml filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
Meio Eagle Completo (pH 6,8)
73 ml de meio Eagle 10 ml de soro de cavalo (inativado por 30 min a 56C) 5 ml de soro fetal bovino (inativado por 30 min a 56C) 10 ml de CaCl2 a 25mM 1 ml de L-glutamina a 200 mM 1 ml de extrato embrionrio ajustar o pH com bicarbonato de sdio (pH cido) ou gs carbnico (pH bsico) filtrar estril em membrana com poro 0,2 m
Preparo de extrato embrionrio a partir de embrio de pinto (10 dias) (Paul, 1975)
limpar a casca do ovo com lcool quebrar a base da casca do ovo batendo levemente com auxlio de uma pina remover a casca sobre a cmara de ar para expor a membrana soltar e remover a membrana com um outro par de pinas estreis introduzir uma terceira pina estril (ponta curva) abaixo do pescoo do embrio, tomando cuidado para no
exercer nenhuma presso. Extrair o embrio lentamente do ovo e deposit-lo em uma placa de Petri
aps a remoo de todos os embries, lave-os 3x em soluo salina balanceada (soluo de Ringer) para remoo
de todo sangue e a gema de ovo
colocar os embries dentro de uma seringa e introduzir lentamente o mbolo inserir a extremidade da seringa em um tubo de centrfuga e pressionar os embries adicionar igual volume de soluo de Ringer massa embrionria e homogeneizar sucessivamente o material
com auxlio de uma pipeta Pasteur
centrifugar por 20 min a 2.000g, remover o sobrenadante e distribuir em tubos. Fazer um teste de esterilidade pela
adio das 10 ltimas gotas em um tubo contendo meio de cultura e incubar este tubo em estufa a 37 C
estocar no refrigerador caso o extrato seja utilizado no mesmo dia. Para tempos longos de estocagem (6 meses),
o extrato embrionrio deve ser mantido no freezer. Antes de usar, descongelar lentamente e centrifugar por 10 min a 2.000g. Recolher o sobrenadante e diluir em soluo de Ringer na proporo de 1:2 antes de adicionar ao meio de cultura DMES
308
Soluo fixadora de Bouin
soluo estoque: soluo saturada de cido pcrico (filtrada) diluda em formaldedo na proporo de 3:1 (300 ml
cido pcrico + 100 ml de formol).
soluo de uso (1/20): soluo estoque (19 ml) + cido actico (1 ml)
Colorao por Giemsa
lavar as culturas 2x em PBS ou Ringer fixar em soluo de Bouin por 5 min lavar 2x com lcool 70% (PA) por 30 min, para remoo do excesso de fixador lavar com gua destilada corar com Giemsa diludo de 1/10 por 60 min (1 ml de Giemsa + 9 ml H2O destilada) lavar em gua destilada desidratao:
acetona 100% (2x) acetona 70% + xilol 30% acetona 50% + xilol 50% acetona 30% + xilol 70% xilol 100% (2x) montar em Permount
Obs: Este procedimento pode ser interrompido na etapa do lcool 70% e mantido overnight a 4C. Processamento de lamnulas redondas para cultura de clulas
cortar lamnulas de vidro em moldes circulares de 15mm ferver em banho de Extran ou sabo de coco lavar exaustivamente com gua corrente para retirar todo o resduo de sabo ferver 3 vezes em banhos consecutivos de gua destilada deixar pelo menos uma hora em lcool a 70% para remover a gordura lavar exaustivamente em gua destilada, para retirar todo o resduo de lcool ferver novamente em banho de gua destilada secar cada lamnula em leno de algodo limpo e com o auxlio de uma pina distribuir em placas de Petri (100 x 15 mm) revestidas com papel de filtro embrulhar cada placa com papel pardo, identificar e esterilizar em autoclave a 1 atm por 20min) ou em forno
microondas por 15 min em potncia mxima
Lavagem de vidraria para cultura de clulas
ferver a vidraria usada em Extran ou sabo de coco ainda morna, lavar individualmente cada vidro utilizando escovas apropriadas enxaguar bem cada vidro individualmente com gua corrente e colocar de molho em gua por pelo menos 2 h enxaguar o material 3x em gua destilada secar em estufa embalar e esterilizar em autoclave a 1atm por 20 min
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ANDRADE, S.G. Caracterizao de cepas de Trypanosoma cruzi isoladas do Recncavo Bahiano. Revista de Patologia Tropical, 3: 65121, 1974. ANDREWS, N. W. & COLLI, W. Adhesion and interiorization of Trypanosoma cruzi in mammalian cells. Journal of Protozoology, 29: 264-269, 1982. APRIGLIANO, O; MASUDA, MO; MEIRELLES, M.N.L.; PEREIRA, M.C.S.; BARBOSA, H.S. & BARBOSA, J.C.N. Heart muscle cells acutely infected with Trypanosoma cruzi: Characterization of electrophysiology and neurotransmitter responses. Journal of Molecular Cell Cardiology, 25: 1265-1274, 1993. ARAJO-JORGE, T.C. The biology of Trypanosoma cruzi-macrophage interaction. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 84: 441462, 1989. ARAJO-JORGE, T.C. & DE SOUZA, W. Effect of carbohydrates, periodate and enzymes in the process of endocytosis of Trypanosoma cruzi by macrophages. Acta tropica., 41: 17-28, 1984. ARAJO-JORGE, T.C. & DE SOUZA, W. Interaction of Trypanosoma cruzi with macrophages: Effect of previous incubation of the parasites or the host cells with lectins. Zeitschriff fr Parasitenkunde, 72: 153-171, 1986. ARAJO-JORGE, T. C. & DE SOUZA, W. Interaction of Trypanosoma cruzi with macrophagess: Further studies on the involvement of surface galactose and N-acetyl-D-galctosamine residues on the recognition process. Acta tropica., 45: 127-136, 1988. ARAJO-JORGE, T.C.; BARBOSA, H.S.; MOREIRA, A.L.; DE SOUZA, W. & MEIRELLES, M.N.L. The interaction of myotropic and macrophagotropic strains of Trypanosoma cruzi with myoblasts and fibers of skeletal muscle. Zeitschriff fr Parasitenkunde, 72: 577-584, 1986. ARAJO-JORGE, T.C.; BARBOSA, H.S.; MOREIRA, A.L.; DE SOUZA, W & MEIRELLES, M.N.L. The interaction of myotropic and macrophagotropic strains of Trypanosoma cruzi with myoblasts and fibers of skeletal muscle. Zeitscrift fr Parasitenkunde, 72: 577-584, 1987. ARAJO-JORGE, T.C.; SAMPAIO, E.P .; DE SOUZA, W. & MEIRELLES, M.N.L. Trypanosoma cruzi: The effects of variations in the experimental conditions on the levels of macrophage infection in vitro. Parasitology Research, 75: 257-263, 1989. ARRUDA, M.V.; COLLI, W. & ZINGALES, B. Terminal D- galactofuranosyl epitopes recognized by antibodies that inhibit Trypanosoma cruzi internalization into mammalian cells. European Journal of Biochemistry, 182: 413-418, 1989. AVILA, J. L.; ROJAS, M. & GALILI, U. Immnunogenic gal 1-3 gal carbohydrate epitopes are present on pathogenic American Trypanosoma and Leishmania. Journal of Immunology, 142: 2828-2834, 1989. BARBOSA, H.S. & MEIRELLES, M.N.L. Evidence of participation of cytoskeleton of heart muscle cellls during the invasion of Trypanosoma cruzi. Cell Structure and Function, 20: 275-284, 1995. BRENER, Z. Biology of Trypanosoma cruzi. Annual Review Microbiology, 27: 347-383, 1973. BURLEIGH, B.A. & ANDREWS, N. The mechanisms of Trypanosoma cruzi invasion of mammalian cells. Annual Review of Microbiology, 49: 174-200,1995. CALER, E.V.; DE AVALOS, S.V.; HAYNES, P .A.; ANDREWS, N.W. & BURLEIGH, B.A. Oligopeptidase B-dependent signaling mediates host cell invasion by Trypanosoma cruzi. EMBO Journal, 17: 4975-4986, 1998. CAMPOS DE CARVALHO, A.C.; TANOWITZ, H.B.; WITTNER, M.; DERMIETZEL, R..; ROY, C.; HERTZBERG, E. L. & SPRAY, D.C. Gap junction distribution is altered between cardiac myocytes infected with Trypanosoma cruzi. Circulation Research, 74: 733-742, 1991. COLLI, W. Interiorization of Trypanosoma cruzi into mammalian host cells in the light of the parasite membrane chemical composition. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 79 suppl.: 45-50, 1994. CONNELY, M.C. & KIERZENBAUM, F. Modulation of macrophage interaction with Trypanosoma cruzi by phospholipase A2sensitive components of the parasite membrane. Biochemical Biophysical Research Communication, 121: 931-939, 1984. DE LUCA, C. Effects of mode of culture and nutrient medium on cyclic variations in enzyme activities of mammalian cells cultured in vitro. Experimental Cell Research, 43: 39-50, 1966. DE SOUZA ,W. Cell Biology of Trypanosoma cruzi. International Review of Cytology 86: 197-283, 1984. DE TITTO, E.H. & ARAUJO, F.G. Mechanism of cell invasion by Trypanosoma cruzi: Importance of sialidase activity. Acta Tropica, 44: 273-282, 1987. DIAS E. Estudos sobre o Schizotrypanum cruzi. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz 27: 1-110, 1934.
310
DIAS, E. No receptividade do pombo domstico infeco por Schizotrypanum. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 40: 191-193, 1944. DO CAMPO, R & MORENO, S.N.J. The role of Ca2+ in the process of cell invasion by intracellular parasites. Parasitology Today, 12: 61-65, 1996. DORTA, M.L.; FERREIRA, A.T.; OSHIRO, M.E.M.; YOSHIDA, N. Ca2+ signal induced by Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigote surface molecules implicated in mammalian cell invasion. Molecular and Biochemical Parasitology, 73: 285-289, 1995. GARZONI, L.; MASUDA, MO., CAPELLA, M.A.M.; LPES, A.G. & MEIRELLES, M.N.L. Trypanosoma cruzi invasion increases calcium resting levels in cardiomyocytes. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 93 suppl: 86, 1998. HARARY, I. & FARLEY, B. In vitro studies on single isolated beating heart cells. Science 131: 1674-1675, 1960. HENRIQUEZ, D.; PIRAS, R. & PIRAS, M.M. The effect of surface membrane modifications of fibroblastic cells on the entry process of Trypanosoma cruzi trypomastigotes. Molecular and Biochemical Parasitology, 2: 359-366, 1981. HERRERA, E.M.; MING, M.; ORTEGA-BARRIA, R.; PEREIRA, M.E.A. Mediation of Trypanosoma cruzi invasion by heparan sulphate on host cells and penetrin counter-receptors on the trypanosomes. Molecular and Biochemical Parasitology, 65: 73-83, 1994. HYDE, T.P ., DVORAK, J.A. Trypanosoma cruzi: interaction with vertebrate cells in vitro. 2. Quantitative analysis of the penetration phase. Experimental Parasitology 34:284-294, 1973. KASTEN, F.H. Mammalian Myocardial cells. Em: Tissue culture methods And application, ch. 10, Ed. By P.F. Kruse & M.K. Patterson, J, Academic Press New York, pp. 72-81, 1973. KIERSZENBAUM, F.; IVANYI, J. & BUDZKO, D.B. Mechanisms of natural resistance to trypanosomal infection. Role of complement in avian resistance to Trypanosoma cruzi infection. Immunology, 30: 1-6, 1976. KOFOID, C.A, WOOD, F.D., MCNEIL, E. The cycle of Trypanosoma cruzi in tissue culture of embryonic heart muscle cell. Unit Californian Publications in Zoology 41: 23-24, 1935. KONIGSBERG, I.R. The differentiation of cross-striated myofibrils on short term cell culture. Experimental Cell Research, 21: 414420, 1960. KONIGSBERG, I.R. Clonal analysis of myogenesis. Science 140: 1273-1284, 1963. LEY, V.; ANDREWS, N.W.; ROBBINS, E.S.; NUSSENZWEIG, V. Amastigotes of Trypanosoma cruzi sustain an infective cycle in mammalian cells. Journal of Experimental Medicine, 168: 649-659, 1988. LOW, H.P .; PAULIN, J.J. & KEITH, C.H. Trypanosoma cruzi infection of BSC-1 fibroblasts cells causes cytoskeletal disruption and changes in intracellular calcium levels. Journal of Protozoology, 39: 463-470, 1992. MEIRELLES, M.N.L. & DE SOUZA, W. Killing of Trypanosoma cruzi and Leishmania mexicana, survival of Toxoplasma gondii in chicken macrophages in vitro. Journal Submicroscopic Cytology & Pathology, 18: 99-107, 1983. MEIRELLES, M.N.L.; ARAUJO-JORGE, T.C. & DE SOUZA, W. Interaction of epimastigote and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi with chicken macrophages in vitro. Parasitology, 81: 373-381, 1980. MEIRELLES, M.N.L.; ARAUJO-JORGE, T.C. & DE SOUZA, W. Interaction of Typanosoma cruzi with macrophages in vitro: Dissociation of the attachment and internalization phases by low temperature and cytochalasin B. Zeitscrift Parasitenkunde, 68: 7-14, 1982. MEIRELLES, M.N.L.; SOUTO-PADRON, T.C. & DE SOUZA, W. Participation of the cell surface anionic sites in the interaction between Trypanosoma cruzi and macrophages. Journal Submicroscopic Cytology & Pathology, 16: 533-545, 1984 . MEIRELLES, M.N.L.; ARAUJO-JORGE, T.C.; MIRANDA, C.F.; DE SOUZA, W. & BARBOSA, H.S. Interaction of Trypanosoma cruzi with heart muscle cells: Ultrastructural and cytochemical analysis of endocytic vacuole formation and effect upon myogenesis in vitro. European Journal of Cell Biology, 41: 198-206, 1986. MEIRELES, M.N.L.; JULIANO, L.; CARMONA, E.; SILVA, S.G.; COSTA, E.M.; MURTA, A.C.M. & SCHARFSTEIN, J. Inhibitors of the major cysteinyl proteinase (GP57/1) impair host cell invasion and arrest the intracellular development of Trypanosoma cruzi in vitro. Molecular and Biochemical Parasitology, 52: 175-184, 1992. MEIRELLES, MNL; PEREIRA, M.C.S.; SINGER, R.H.; SOEIRO, M.N.C.; GARZONI, L.R.; SILVA, D.T.; BARBOSA, H.S.; ARAUJO-JORGE, T.C.; MASUDA, O.M.; CAPELLA, M.A.M.; LOPES, A.G. & VERMELHO, A.B. Trypanosoma cruzicardiomyocytes: New contributions regarding a better understanding of this interaction. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, C 94(suppl I):149-152, 1999 in press, 1999. MELO, R.C. & BRENER, Z. Tissue tropism of different Trypanosoma cruzi strains. Journal of Parasitology, 64: 475-482, 1978. MEYER, H., XAVIER DE OLIVEIRA, M. Cultivation of Trypanosoma cruzi in tissue culture: A four year study. Parasitology 39: 9194, 1948. MEYER, H., PORTER, K.R. A study of Trypanosoma cruzi with the electron microscope. Parasitology 44: 16-23, 1954.
311
MILANI, S.R. & TRAVASSOS, L.R. Anti--galactosyl antibodies in chagasic patients; possible biological significance. Brazilian Journal of Medical and Biological Resarch, 21: 1275-1286, 1988. MILDER, R. & KLOETZEL, J. The development of Trypanosoma cruzi in macrophages in vitro. Interaction with lysosomes and host cell fate. Parasitology, 80: 139-147, 1979. MING, M.; CHUENKOVA, M.; OTEGA-BARRIA, E. & PEREIRA, M.E.A. Mediation of Trypanosoma cruzi invasion by sialic acid on the host cell and trans-sialidase on the trypanosome. Molecular Biochemical Parasitology, 59: 243-252, 1993. MORRIS, S.A.; TANOWITZ, H.B.; HATCHER, V.; BILEZIKIAN, J.P . & WITTNER, M. Alterations in the intracellular calcium following infection of human endothelial cells with Trypanosoma cruzi. Molecular Biochemical Parasitology, 29: 213-221, 1988. MUNIZ, J. & FREITAS, G. Realizao in vitro do ciclo do Trypanosoma cruzi no vertebrado, em meios de caldo de lquido peritoneal. Revista Brasileira de Biologia, 6: 467-484, 1946. MURTA, A.C.M.; PERSECHINI, P.M.; SOUTO-PADRON, T.; DE SOUZA, W.; GUIMARES, J.A. & SHARFSTEIN, J. Structural and functional identification of Gp57/51 antigen of Trypanosoma cruzi as a cysteine proteinase. Molecular Biochemical Parasitology, 43: 27-38, 1990. NAGAMURA, Y. & KOLB, M. Presence of a lectin-like receptor for D-galactose on rat peritoneal macrophages. FEBS Letters, 115: 59-61, 1980. NERY-GUIMARES F.N. & MEYER, H. Cultivo de Toxoplasma (Nicolle and Manceaux, 1909) em cultura de tecido. Revista Brasileira de Biologia , 2: 123-129, 1942. NERY-GUIMARES, F.N.; VENANCIO I. & GRYNBERG, N. Refratividade das galinhas ao Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi. III Dissociao dos fenmenos da refratividade e da lise dos epimastigotas pelo soro das aves. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 72: 131-136, 1974. NOGUEIRA, N. & COHN, Z. Trypanosoma cruzi: Mechanism of entry and intracellular fate in mammalian cell. Journal of Experimental Medicine, 143: 1402-1420, 1976. OSUNA, A.; JIMENEZ-ORTIZ, A.; MASCARO, C & ALONSO C. Trypanosoma cruzi: Arrested division of amastigote forms in enucleated HeLa cells. Journal of Parasitology 69:629-631, 1983. PAUL, J. Media for culturing cells and tissues. In: Cell & Tissue Culture, ch. V, Ed. by J. Paul, Churchill Livinstone, New York, pp 7189, 1975. PECORA, I.L.; DOS REIS, G.A.; BARCINSKI, M.A. & DORIGO, D.D. Frequency distribution of Trypanosoma cruzi in macrophages from resistant and susceptible strains of mice. Experientia 36: 942-944, 1980. PEREIRA, M.C.S.; COSTA, M.; CHAGAS FILHO, C. & MEIRELLES, M.N.L. Myofibrillar breakdown and cytoskeletal alterations in heart muscle cells during invasion by Trypanosoma cruzi: Immunological and ultrastructural study. Journal Submicroscopic Cytology & Pathology, 25: 559-569, 1993. PETRY, K. & VAN VOORHIS, W.C. Antigens of Trypanosoma cruzi that mimic mammalian nervous tissues: investigations of their role in the autoimmune pathophysiology of chronic Chagas disease. Research Immunolgy, 142: 151-156, 1991. SOEIRO, M.N.C.; SILVA-FILHO, F.C. & MEIRELLES, M.N.L. The nature of anionic sites and the endocytic pathway in heart muscle cells. Journal Submicroscopic Cytology & Pathology, 26: 121-130, 1994. SOEIRO, M.N.C.; SILVA-FILHO, F.C. & MEIRELLES, M.N.L. Alterations in the surface charge of heart muscle cells during interaction with Trypanosoma cruzi. Cell Biophysics, 26: 21-44, 1995. SOEIRO, M.N.C.; PAIVA, M.M.; BARBOSA, H.S.; MEIRELLES, M.N.L. & ARAUJO-JORGE, T.C. A cardiomyocite mannose receptor system is involved in Trypanosoma cruzi invasion and is down modulated after infection. Cell Structure & Function, 24: 139-149, 1999. STANLEY, P . & SIMINOVITCH, L. Complementation between mutants of CHO cells resistant to a variety of plant lectins. Somatic Cell Genetics, 3: 391-405, 1977. TARDIEUX, I.; NATHANSON, M.H. & ANDREWS, N.W. Role in host cell invasion of Trypanosoma cruzi- induced cytosolic-free Ca2+ - transients. Journal of Experimental Medicine, 179: 1017-1022, 1994. TARLETON, R.L.; ZHANG, G. & DOWNS, M.O. Auto-immune rejection of neonatal heart transplants in experimental Chagas disease is a parasite-specific response to infected host tissue. Proceedings of the National Academy of Science USA, 94: 3932-3937, 1997. TEIXEIRA, A.R.L.; ARGAARAZ, E.R.; FREITAS JR., L.H.; LACAVA, Z.G.M.; SANTANA, J.M.. & LUNA, H. Possible integration of Trypanosoma cruzi kDNA minicircles into the host cell genome by infection. Mutation Research, 305: 197-209, 1994. VAN VOORHIS, W.C. & EISEN, H. Fl-160. A surface antigen of Trypanosoma cruzi that mimics mammalian nervous tissue. Journal of Experimental Medicine, 169: 641-652, 1989.
312
VERMELHO, A.B. & MEIRELLES, M.N.L. Sialoglycoconjugates in Trypanosoma cruzi-host cell interaction: Possible biological models - A Review. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, 89: 69-79, 1994. VERMELHO, A.B.; MEIRELLES, M.N.L.; PEREIRA, M.C.; POHLENTZ, G. & BARRETO-BERGTER, E. Heart muscle cells share common neutral glycosphingolipids with Trypanosoma cruzi. Acta Tropica, no prelo, 1997. YAFFE, D. Rat skeletal muscle cells. In: Tissue culture: methods and applications, ch. 16, Ed. by P .F. Kruse & M.K. Patterson, J, Academic Press New York, pp.106-114, 1973. ZINGALES, B. & COLLI, W. Trypanosoma cruzi: Interaction with host cells. p. 129-152. Currents Tropics Microbiology Immunology, 117, Springer Verlag Berlin-Heidelberg, 1985.
313
Captulo 19
Sistematizao e Anlise de Resultados: Confeco de Planilhas, Tabelas, Grficos e Anlises Estatsticas

Solange L. de Castro, Tania C. Arajo-Jorge & Pedro H. Cabello
Faz-se Cincia com fatos, como uma casa com pedras; porm, uma acumulao de fatos no Cincia, exatamente como um monto de pedras no uma casa. (Henri Poincar )
19.1 A Importncia do Registro e da Anlise dos Dados Experimentais

A construo de uma casa, a partir de um monto de pedras, um processo anlogo transformao de dados em informaes (cujo acmulo constitui o conhecimento). Em outras palavras, informao o produto/ resultado do processamento de dados. A citao de Poincar ilustra bem a necessidade de se organizar a coleta dos dados brutos de um experimento, registrando-os de modo a que possam ser compreensveis e anlisveis a qualquer tempo. Os pontos essenciais so: (1) no perder qualquer dado relevante; (2) analisar integralmente cada experimento individual, ou seja, que resposta foi encontrada pergunta formulada, pois essa resposta obtida ao final de cada experimento que vai determinar a necessidade de novos experimentos (repetio para confirmao do resultado, alterao de condies experimentais, etc.); (3) jamais fazer uma srie de experimentos seqenciais sem sistematizao do anterior. Durante o planejamento do experimento (ver Captulo 10) ressaltamos a importncia da clareza na definio do objetivo, da(s) pergunta(s) que o experimento visa a responder e da escolha dos parmetros que precisam ser acompanhados para se alcanar o objetivo proposto. Um detalhe de suma importncia, anterior ao levantamento dos dados, a elaborao/formulao de fichas, cadernos, protocolos e formulrios onde sero registrados os dados originalmente coletados, que podero ser codificados, sintetizados e armazenados geralmente em forma de planilhas. Os primeiros constituiro a memria bsica do trabalho, enquanto as planilhas devem se tornar a base operacional da manipulao e processamento dos dados. Por isso, a elaborao de planilhas de coleta de dados brutos um passo fundamental do desenho experimental e qualquer tratamento posterior dos dados poder ser alterado, mas no a obteno dos dados originais. Sejam as anotaes do nmero de parasitas por rea, seja o peso dos animais, ou qualquer outra parmetro a ser avaliado, essencial que se organize previamente o instrumento de registro desses dados e seu cronograma. No Captulo 20 inserimos diversos exemplos de planilhas de registro de dados brutos para o estudo in vivo de animais infectados pelo Trypanosoma cruzi. Trataremos aqui de procedimentos gerais de anlise desses dados: a tabulao
315
e a expresso grfica dos resultados, bem como a necessidade de anlise estatstica quando, como e que testes utilizar.
19.2
O Papel da Anlise Estatstica dos Dados Obtidos em Animais Experimentalmente Infectados
A anlise estatstica permite duas abordagens. A primeira refere-se descrio dos resultados, por isso mesmo chamada de estatstica descritiva. Neste procedimento, que se pode fazer tanto em programas de planilhas de clculo (tipo Lotus ou Excel) como em programas especficos para anlises estatstica, obtm-se informaes sobre a tendncia central dos dados (mdia, moda, mediana) e de sua disperso (desvio-padro, varincia, faixa, quartis e percentis, valores mnimo e mximo, etc.). Na anlise descritiva tambm se avalia o tipo de distribuio dos dados, ou seja, se so normais ou no. Na segunda abordagem, faz-se a estatstica inferencial (testes de hipteses), atravs de um conjunto de mtodos analticos que permitam inferir sobre a validade das proposies feitas; entre esses pode-se mencionar as anlises comparativas que permitem testar as semelhanas ou diferenas entre dois ou mais grupos experimentais. Estas semelhanas ou diferenas so tratadas em termos probabilsticos (limites/nveis de significncia). A anlise descritiva permite determinar o tipo de distribuio dos dados, de importncia maiscula, pois definir a escolha dos testes estatsticos a serem utilizados posteriormente. A primeira informao importante saber se os dados se ajustam a um padro de distribuio normal. Para isso eles devem ter valores de mdia e mediana aproximadamente iguais e de ndices de Curtose/Kurtosis (que indicam a forma/altura da curva) e de Assimetria/Skewness aproximadamente iguais a 0 (entre 0 e 1), e desse modo devem acompanhar uma curva de distribuio gaussiana de freqncia. Utilizaremos exemplos de dados reais obtidos com animais infectados experimentalmente com T. cruzi para orientar a anlise e a interpretao. Em alguns casos, apenas os clculos de estatstica descritiva, bem como os grficos resultantes de dados individuais ou das tendncias centrais da amostragem podem ser suficientes para gerar a resposta desejada. Em outros, alm da visualizao tabulada ou grfica dos dados obtidos entre diferentes grupos experimentais, ser necessria a anlise da significncia estatstica dessas diferenas. Todos os parmetros qualitativos e quantitativos que foram descritos nos vrios captulos deste manual podem inicialmente ser descritos com os indicadores da estatstica descritiva e ser analisados quanto sua significncia biolgica.
19.3
Anlises Descritivas dos Dados

Anlise do curso da infeco
Cdigo do experimento - INF#1
Objetivo - Acompanhar o curso da infeco em animais a infeco por T. cruzi Pergunta - Como se comporta a cepa X de parasita na linhagem Y de camundongo? Justificativa - O conhecimento do curso da infeco, perodo pr-patente, perodo de aumento e diminuio de parasitemia e perodo de mortalidade, essencial para todos os demais experimentos a serem feitos neste modelo de par parasita/hospedeiro.
Cronograma e protocolo (dpi = dias ps-infeco)
-n dpi (planejamento do experimento: definio dos grupos, do par parasita-hospedeiro, dos inculos e da via
de inoculao). No caso: fmeas de C57BL/6 + cepa Y 104 par/camundongos via intraperitoneal -10 a -7 dpi: pedido dos animais ao biotrio para aclimatao
316
Sistematizao e Anlise de Resultados: confeco de planilhas, tabelas, grficos e anlises estatsticas
-5 a -1 dpi: pesagem dos animais, distribuio entre os grupos, marcao, coleta de plasma 0 dpi: infeco dos animais 6-40 dpi: acompanhamento de parasitemia, mortalidade, peso, leucometria e nveis de IgG anti-T.cruzi
Acompanhamento da cintica de parasitemia Planilha de anlise: incorporam-se os dados brutos referentes a cada animal e a cada dpi e calcula-se o nmero de parasitas/ml, de acordo com o mtodo empregado (ver Captulo 13). Calculam-se tambm as medidas de tendncia central e de disperso dos dados: mdia e desvio padro, mediana e percentis 25 e 75% (Figura 1, Tabela 1). Tabela 1 Resultados de contagens de parasitemia do experimento INF#1
7 dpi (1:3)1
par em 50 par/cp campos 104p/ml2 par em 50 campos
8 dpi (1:5)
par/cp 104p/ml2 par em 50 campos
9 dpi (1:3)
par/cp 104p/ml2
cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia desvio padro mediana perc 25 perc 75
1 2
5 5 17 23 12 3 3 3 2 5
0,10 0,10 0,34 0,46 0,24 0,06 0,06 0,06 0,04 0,10
9,9 9,9 33,7 45,5 23,8 5,9 5,9 5,9 4,0 9,9 15,4 13,4 9,9 5,9 20,3
68 71 174 83 100 39 30 30 30 40
1,36 1,42 3,48 1,66 2,00 0,78 0,60 0,60 0,60 0,80
224,4 234,3 574,2 273,9 330,0 128,7 99,0 99,0 99,0 132,0 219,5 141,7 178,2 106,4 264,0
5 8 10 28 28 25 20 48 20 3
0,10 0,16 0,20 0,56 0,56 0,50 0,40 0,96 0,40 0,06
9,9 15,8 19,8 55,4 55,4 49,5 39,6 95,0 39,6 5,9 38,6 25,8 39,6 16,8 54,0
diluio do sangue contagem pelo mtodo de Pizzi-Brener com microscpio Axioplan (fator=33x104) dpi = dias ps-infeco; par/cp = nmero de parasitas/campo microscpico; cdg = camundongo
Anlise da parasitemia mxima Planilha de anlise: dados calculados em nmero de parasitas/ml e em seu logaritmo decimal. A transformao dos valores reais para logaritmo se deve necessidade de diminuio da disperso comumente observada, e conseqente tentativa de normalizao dos dados (Tabela 2). Estatstica descritiva dos dados de obtidos no 8 dpi (Tabela 3). Tabela 2 Dados reais e em log dos valores de parasitemia mxima e valores de tempo de sobrevida
104 par/ml cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10
1
log10 6,351 6,370 6,759 6,438 6,519 6,110 5,996 5,996 5,996 6,121
dia do pico 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
TS 21 23 401 401 29 401 401 23 401 401
224,4 234,3 574,2 273,9 330,0 128,7 99,0 99,0 99,0 132,0
sobreviventes aps 40 dpi, devem ser excludos da anlise de tempo de sobrevida
317
Tabela 3 Dados de estatstica descritiva referentes ao pico da parasitemia

Indicador Contagem (n) Mdia Desvio padro Mediana Percentil 25% Percentil 75% Varincia da amostra Curtose Assimetria 104 par/ml 10 219,5 149,3 178,2 106,4 264,0 22298 3,0146 1,6477 log10 10 6,27 0,26 6,24 6,02 6,42 0,07 -0,58 0,60 Indicador Intervalo Mnimo Mximo Erro padro Modo Soma Maior (1) Menor (1) p Teste W (Shapiro-Wilks) 104 par/ml 475,2 99 574,2 47,221 99 2194,5 574,2 99 0,0181 log10 0,76 6,00 6,76 0,08 6,00 62,65 6,76 6,00 0,217
A simples observao desta tabela j nos indica que
existe grande disperso nos dados obtidos. Tomando-se os valores reais de parasitas/ml, o desvio-padro 68%
do valor da mdia. J os valores transformados logaritmicamente no apresentam tamanha disperso e o desvio encontrado correspondeu a apenas 4% do valor da mdia; a mdia relativamente diferente da mediana, no caso dos dados reais, e se aproxima no caso dos valores em log; os ndices de Curtose e Assimetria dos valores reais so bem diferentes de zero, enquanto os ndices respectivos obtidos com os valores transformados so menores que 1; estas observaes sugerem que os dados reais no possuem distribuio normal, enquanto os dados transformados possivelmente se distribuem normalmente. Para confirmar se os dados realmente tm distribuio normal, pode-se fazer uma anlise especfica em programas de estatstica. Mostramos abaixo um exemplo, utilizando o programa Statistics for Windows, exatamente sobre estes dados de parasitemia mxima (Fig. 2). Aqui foram obtidos os histogramas de distribuio de freqncia (barras), calculada a curva normal esperada (linha) e os valores do teste W de ShapiroWilks. Este teste o mais recomendado. Se seu resultado for significante (p<0,05) ento porque a distribuio no normal (rejeita-se a hiptese de que a distribuio seja normal). Se os dados forem normais, p ser maior que 0,05 no teste W. Inserimos na Tabela 3 os resultados do teste W, que confirmaram que a distribuio dos dados reais no normal (p<0,05), enquanto a dos dados transformados para log normal (p>0,05). As curvas de probabilidade normal tambm foram obtidas (Figs. 2 a,b) e indicam que os dados reais se correlacionam menos com o esperado, isto , se afastam mais da linha de regresso do que os dados transformados, que praticamente se superpem com a linha de regresso.
Acompanhamento da mortalidade e sobrevida

Com base nos dados de sobrevida construda a planilha de mortalidade cumulativa, como mostrado na Tabela 4. O nmero de animais mortos a cada dia indicado na coluna de mortalidade individual (mi) e o nmero acumulado de animais mortos na de mortalidade acumulada (ma). Neste experimento, como a mortalidade cumulativa foi menor que 50%, no temos o ndice M50, temos apenas o valor de tempo de sobrevida (TS) calculado sobre os poucos animais que morreram at o final da observao do experimento (40 dpi) (Tabela 4). A expresso grfica desses resultados mostrada na Figura 3. A anlise de sobrevida complementar de mortalidade (Fig. 3).
318
Tabela 4 Valores de mortalidade cumulativa e de tempo de sobrevida

INF#1: mortalidade/sobrevida cumulativa n (inicial) =10 dpi 0 22 23 24 25 30 31 40 mi 0 1 0 2 0 1 0 0 ma 0 1 1 3 3 4 4 4 %MC 0,0 10,0 10,0 30,0 30,0 40,0 40,0 40,0 M50 %SC 100,0 90,0 90,0 70,0 70,0 60,0 60,0 60,0 cdgo 1 cdgo 2 cdgo 3 cdgo 4 mdia desvio-padro INF#1: tempo de sobrevida (TS)
Inf 21 23 23 29 24,0 3,0
mi= mortalidade indidvidual; ma= mortalidade acumulada
19.4
Anlises Comparativas dos Dados
Mesmo que tenhamos apenas um grupo experimental a analisar, como no caso do experimento INF#1, alguns parmetros podem ser comparados a diferentes tempos ps-infeco. A anlise comparativa pode ser feita, inicialmente, apenas de forma tabulada e grfica, que indicaro diferenas bvias entre dados quantitativos obtidos em quaisquer parmetros parasitolgicos, imunolgicos ou inflamatrios. Essas diferenas podem at dispensar anlise estatstica detalhada e geralmente indicam processos relevantes do ponto de vista biolgico. Porm, muitas vezes devido a heterogeneidades intrnsecas a populaes de animais, mesmo s linhagens isognicas, a existncia ou no de diferena nos resultados obtidos precisa ser testada por meio de recursos estatsticos apropriados. A questo imediata que surge : que teste estatstico usar? Qualquer livro de estatstica aplicada biologia vai indicar basicamente dois caminhos a seguir: o dos testes paramtricos e o dos no paramtricos. Essa escolha a primeira e depende essencialmente do tipo de distribuio dos dados a serem comparados, que analisada pelos indicadores da estatstica descritiva, como discutido acima, e pelos testes apropriados para se testar normalidade (por exemplo, o teste W de Shapiro-Wilks). Se a distribuio for do tipo normal os testes paramtricos podero ser aplicados. Se a distribuio no for normal, os testes paramtricos no podero ser utilizados. Neste ponto, mais dois caminhos se apresentam: (1) utilizar diretamente testes no paramtricos ou (2) proceder transformaes matemticas que normalizem a distribuio dos dados, como por exemplo, a transformao para logaritmos decimais, como tambm apontado anteriormente. Neste caso, mesmo aps esta transformao, os novos dados gerados devem passar pelo teste de normalidade, como mostrado acima. Alm da definio de uso de um teste paramtrico ou no paramtrico, a segunda questo que se coloca definir o nvel de significncia (p) com o qual os dados sero analisados. Assumir p<0,05 significa trabalhar apenas com 5% de probabilidade de erro do tipo I (rejeitar uma hiptese, sendo ela verdadeira). Mas este limiar pode ser arbitrado em valor maior ou menor. Pode-se inclusive apenas fornecer o valor de p e deixar a interpretao da significncia por conta do experimentador ou do leitor. De qualquer modo, a regra bsica aqui de que melhor no fazer qualquer anlise estatstica sobre diferenas bvias, do que fazer anlises erradas sobre diferenas provveis. Ou seja, no aplicar qualquer teste, sem um conhecimento de como aplic-lo, o que ele mede, e se os dados em questo podem ser analisados por aquele teste. Portanto, se se for trabalhar com estatstica, indispensvel que se estude um pouco o assunto, mas tambm que se converse com quem entende, antes de se aventurar a utilizar erradamente os muitos programas estatsticos disponveis.
319
O tamanho da amostragem a ser analisada tambm outro indicativo do tipo de teste a ser usado. De um modo geral os estatsticos consideram uma amostragem com n = 100 observaes, como o mnimo para anlises de distribuio de freqncia paramtricas. Por outro lado, quando o conjunto de dados for grande (n>100) no faz muito sentido usar estatstica no paramtrica, pois com amostragens grandes os dados tendem a distribuir-se normalmente, mesmo que a respectiva varivel no seja normalmente distribuda na populao. Na maioria destes casos os mtodos no paramtricos, que so menos sensveis (tem menor poder estatstico), podem ser apropriados. comum, na experimentao animal, se obter dados que os estatsticos consideram de baixa qualidade, ou seja, derivados de amostras pequenas (n = 4 a 10), ou de variveis sobre as quais nada se sabe acerca do tipo de distribuio. Os mtodos no paramtricos foram desenvolvidos para serem usados em casos nos quais o pesquisador no sabe nada a respeito dos parmetros de uma varivel de interesse numa populao (por exemplo, a parasitemia mxima de um grupo de animais knock-outs para certo gene, infectados com uma dada cepa de T. cruzi). Da o nome no paramtrico. Eles no se baseiam no conhecimento da mdia e do desvio-padro e portanto dispensam seu clculo. Os mtodos no paramtricos so menos poderosos (menos sensveis) para discriminar diferenas significativas que os paramtricos (portanto, se indicarem estas diferenas, elas tambm certamente seriam indicadas se testes paramtricos fossem usados). Em geral, se o resultado de um estudo tem implicaes econmicas ou teraputicas importantes (por exemplo: uma terapia cara e dolorosa pode ajudar a melhorar a qualidade de vida dos pacientes?), ento aconselhvel que se aplique aos resultados diferentes testes no paramtricos e se houver discrepncia entre eles, procurar entender o porqu destes diferentes resultados. Por outro lado, como so menos sensveis, os testes no paramtricos podem deixar passar certos pequenos efeitos (por exemplo: um certo aditivo nutricional pode ser perigoso para a populao?) e necessrio que se seja bastante cuidadoso na escolha do teste. A estatstica descritiva tambm deve ser mais cuidadosa quando se trabalha com dados de distribuio no normal. Se uma varivel se comporta como uma funo logaritmica e no linear, ento a mdia geomtrica mais informativa do que a mdia aritmtica. A estatstica descritiva do fenmeno observado deve computar uma variedade mais ampla de medidas de locao (mdia, mediana, moda, etc.) e de disperso (varincia, desvio mdio, faixa de quartis, percentis, etc.) para fornecer um quadro mais completo dos dados. A seqncia de aes nessa anlise : criar uma matriz com a base de dados a analisar, organizando em linhas as informaes referentes a cada animal (todos os grupos testados, experimentalmente, e todos os dias) e em colunas as variveis que indicam seu grupamento (controle, grupo A, grupo B, grupo C; dias ps-infeco, etc.) ou os valores que sero testados tais como parasitemia (ou nvel de IgG ou qualquer outro parmetro medido ao longo do tempo); tempo de sobrevida, parasitemia mxima, etc.); obter os dados de estatstica descritiva de cada varivel; testar se estas variveis apresentam distribuio normal ou no (teste W); em funo do resultado, escolher o teste a ser usado; escolher os limites de confiana (90 ou 95%); verificar o valor de p.
19.5 O Vasto Menu de T estes Paramtricos e No Paramtricos para se Utilizar

Como apontado na Tabela 5, para cada tipo geral de teste paramtrico, existe basicamente pelo menos um teste no paramtrico equivalente numa das seguintes categorias: testes de diferenas entre grupos (amostras independentes) testes de diferenas entre variveis (amostras dependentes) testes de relaes entre variveis
320
Observaes:
em todos os testes a hiptese testada de que sejam iguais (hiptese nula). O valor de p obtido em um teste t
representa a probabilidade do erro envolvido no aceite da hiptese sobre a existncia de diferena. Em termos prticos, p<0,05 significa que os grupos testados tm mais de 95% de chance de serem diferentes, ou seja, menos de 5% de chance de serem iguais; dados no normais indicam que seus valores se dispersam muito em torno da mdia ou se distribuem assimetricamente; portanto a mdia no mais um bom parmetro para comparar os grupos em questo. Os testes no paramtricos, em geral, comparam medianas, ou seja, ordenam (fazem um rank) os dados desde o menor at o maior valor e tomam o valor do posto mdio como padro a ser comparado; o teste de Kolmogorov-Smirnov para duas amostras sensvel a diferenas entre mdias e medianas, mas tambm bastante afetado pelas diferenas nas formas das curvas de distribuio dos dados; o teste de Wilcoxon para dados pareados assume que se pode ordenar a magnitude das diferenas nas observaes pareadas de algum modo com significado biolgico. Se no for este o caso, ento deve ser usado o teste dos sinais; o coeficiente de concordncia de Kendall freqentemente usado para expressar a concordncia entre variveis independentes (por exemplo, IgG total e IgG anti T. cruzi) que esto sendo estimuladas pelo mesmo fator (por exemplo, a infeco). Tabela 5 Escolha dos testes estatsticos
Para comparar Teste paramtrico (distribuio normal dos dados ou de sua transformao matemtica) Teste no paramtrico (independentes do tipo de distribuio)
Diferenas entre dois grupos (amostras independentes)
Teste t para amostras independentes:

compara mdias de uma varivel Teste F: compara varincias
Teste U de Mann-Whitney Teste de Kolmogorov-Smirnov Teste de Wald-Wolfowitz Teste de Wilcoxon para dados Teste dos Sinais Anlise de postos de Kruskal-Wallis Teste de mediana Anlise de varincia dois -fatores
de Friedman pareados para duas amostras
Diferenas entre dois grupos (amostras dependentes ou pareadas)
Teste t para amostras dependentes:

compara mdias entre variveis, medidas na mesma amostra ou em amostras pareadas
Diferenas entre mais de dois grupos (amostras independentes)
Anlise de varincia (ANOVA): compara

mdias entre mais de dois grupos, atravs da anlise de sua disperso indicada pela varincia
Diferenas entre mais de duas variveis entre grupos dependentes Medidas de freqncia (propores) em tempos diferentes de variveis dicotomizadas (sim ou no, + ou -) Relao entre variveis quantitativas
Anlise de varincia Teste de Qui-quadrado de McNemar Coeficiente de correlao Coeficiente de regresso Teste de Qui-quadrado
Teste T de Cochran Teste de Kendall Tau Teste R de Spearman Coeficiente Gamma Coeficiente de concordncia de Kendall Coeficiente de Phi Teste exato de Fisher
Relao entre variveis qualitativas (machos x fmeas, + x -)
Seguem-se alguns exemplos: Acompanhamento da srie branca Foi feito esfregao sangneo de animais em diferentes dias ps-infeco e uma contagem do percentual relativo de leuccitos, cujos resultados so mostrados na Tabela 6, cuja expresso grfica est na Figura 4.
321
Tabela 6 Resultados da contagem leucocitria do experimento INF#1

INF#1: contagem de esfregao sanguneo % linfcitos dpi cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia desvio padro W normal p K-W 1 74 68 74 76 80 80 74 79 80 60 74,3 6,0 0,0380 no 0,0001 20 26 24 15 33 32 25 18 26 36 26,1 6,5 0,7346 sim 0,0419 40 50 43 45 51 1 15 23 19 17 14 14 20 12 17 33 18,5 5,7 0,0481 no % neutrfilos 20 24 19 18 21 28 22 25 16 19 21,3 3,6 0,9021 sim 40 15 32 34 31 1 11 9 8 7 6 6 6 8 3 7 7,1 2,0 0,8714 sim % moncitos 20 50 67 46 40 53 67 58 45 61 54,1 9,2 0,6247 sim 40 35 25 21 18
51 54 49,0 3,8 0,4177 sim 0,0001
23 26 26,8 6,5 0,4877 sim
26 20 24,2 5,6 0,3616 sim
Questes
A distribuio dos dados normal? Alguns sim, outros no. Quantos grupos h a comparar? Trs para cada varivel. Que teste usar? Como alguns dos dados iniciais (linfcitos e neutrfilos no dia 1) no tm distribuio normal,
deve-se usar um teste no paramtrico. Como trs grupos sero comparados (dias 1, 20 e 40), o teste deve ser o de Kruskal-Wallis. O valor de p fornecido pelo teste de Kruskal-Wallis indica variao significativa entre os trs grupos? Sim, pois todos so menores que 0.05. Quais so os grupos diferentes entre si? Aps saber que existe uma diferena significativa entre os grupos, podese compar-los dois a dois. Para isso usa-se ento o teste U de Mann-Whitney, que, neste caso, forneceu os resultados da Tabela 7. A nica comparao onde as diferenas so significativas forma as correspondentes a vinte e quarenta dias ps-infeco. Tabela 7 Valores de p do teste U de Mann-Whitney aplicado sobre os dados de anlise leucocitria do experimento INF#1
Grupos 1 x 20 1 x 40 20 x 40 Linfcitos 0,0002 0,0011 0,0140 Neutrfilos 0,0989 0,0509 0,0014 Moncitos 0,0023 0,0113 0,0014
Acompanhamento de peso
Os animais infectados e no infectados (controle) foram pesados em diferentes dias ps-infeco e obtidos, assim, os dados da Tabela 8.
322
Tabela 8 Valores de peso dos animais do experimento INF#1

Controle dpi cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia desvio padro W normal F 0 20,4 17,7 19,0 17,0 20,5 19,5 17,3 17,5 18,5 18,5 18,6 1,2 0,4406 sim 7 27,2 28,6 30,0 27,5 31,2 26,6 28,5 28,0 24,6 27,5 28,0 1,7 0,8517 sim 0,0000001 14 30,8 32,1 30,2 32,3 36,1 34,8 33,9 32,0 33,9 30,9 32,7 1,8 0,7422 sim 20 33,6 32,6 31,6 35,6 38,6 36,7 36,4 32,7 37,2 32,6 34,8 2,3 0,3193 sim Infectado 0 17,6 21,5 20,5 19,0 20,5 19,6 21,6 19,0 20,5 18,3 19,8 1,3 0,6231 sim 7 24,5 29,6 32,5 22,5 26,0 28,2 32,5 24,0 27,3 24,4 27,2 3,3 0,3920 sim 0,000023 14 21,8 27,0 22,5 26,5 30,5 30,7 25,9 24,5 25,8 26,1 2,9 0,5131 sim 20
25,6 18,6
22,1 3,5 <1 ?
Questes
A distribuio dos dados normal? Sim. Quantos grupos h a comparar? Quatro para cada varivel (dias 0, 7, 14, 20). Que teste usar? Paramtrico. Como h quatro grupos a ser comparados, o teste deve ser ANOVA. O valor de p fornecido pelo teste de ANOVA indica variao significativa entre os quatro grupos? Sim, pois
todos so menores que 0,05. Quais so os grupos diferentes entre si? Aps saber que existe uma diferena entre os vrios grupos, avana-se no teste ANOVA para saber quais grupos diferem entre si. Um dos testes que pode ser escolhido o de StudentNeuman-Keuls (SNK), cujos resultados esto mostrados na Tabela 9. Eles indicam que os animais no infectados apresentam uma curva de evoluo ponderal crescente, com valores diferentes significativamente a cada semana (esto engordando normalmente). J os animais infectados ganham peso s at a segunda semana, quando por algum motivo param de engordar. A infeco leva diferena no peso? Para isso compara-se a cada dia os grupos controle versus infectado, com os resultados ANOVA mostrados na Tabela 10. Eles demonstram claramente que os animais infectados no se diferenciam dos normais na primeira semana (7 dpi), mas que aps catorze e vinte dias a sua diferena de peso bastante significativa. Tabela 9 Diferenas no peso dos animais a cada dia
Grupos dpi 1 x dpi 7 dpi 1 x dpi 14 dpi 1 x dpi 20 dpi 7 x dpi 14 dpi 7 x dpi 20 dpi 14 x dpi 20 No infectado 0,000122 0,000127 0,000159 0,000123 0,000127 0,021999 Significncia sim sim sim sim sim sim Infectado 0,000189 0,000293 0,318091 0,453093 0,081881 0,087019 Significncia sim sim no no no no
Tabela 10 Diferenas no peso dos animais infectados em relao aos controles

Grupos Cont x Inf 0 dpi 0,049218 7 dpi 0,521147 14 dpi 0,000027 20 dpi 0,000155
Este o raciocnio bsico a ser seguido em todos os casos: anlise dos nveis de imunoglobulinas, citocinas, enzimas, ou qualquer outro parmetro que se pretenda acompanhar.
323
INF#1 - Cinticas de parasitemia (individual e mdias)

600
cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia mediana
10e4 par/ml
400
200
0 6 7 8 9 dias ps-infeco 10
Mortalidade e Sobr Sobrevida Cumulativas INF#1 - Curva Curva de Mo rtalidade e evida Cum ulati vas
N ormal P robability P lot IN F1_P A R 1.8 E xpected N ormal V alue 1.2 0.6 0 -0.6 -1.2
19.2a
100 80 60 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 100 80 60 40 20 0
50
150
250
350 V alue
450
550
650
%MC
%SC
Normal P robability P lot INF1_LOG 1.8 E x pec ted N orm al V al ue 1.2 0.6 0 -0.6 -1.2 5.9
2b
dias ps-infec o dias ps-infeco
6.1
6.3 V alue
6.5
6.7
6.9
Distribui o de uccitos Distribuio de le leuccitos

100% 80% 60% 40% 20% 0% %M %N %L
pes o (g) 40
Evoluo ponderal ponderal dos dos animais Evoluo animais

Cont 35 30 25 20 15 Infec
21 dias eco diasps-inf ps-infeco
41
10 dias ps-in fe co dias ps-infeco
15
20
Figuras 1 a 5 - Resultados do experimento INF#1: (1) expresso grfica da cintica de variao da parasitemia dos animais infectados: dados individuais, de mdia e de mediana (programa Excel para Windows); (2) teste de probablidade de normalidade para os dados de parasitemia mxima em nmero de parasitas/ml (PAR) (a) e para os dados transformados para logaritmo (LOG) (b) (programa Statistics for Windows); (3) mortalidade e sobrevida acumuladas (programa Excel para Windows); (4) percentagem de moncitos, neutrfilos e leuccitos (programa Excel para Windows); (5) evoluo ponderal (programa Excel para Windows)
324
Teste do efeito de uma droga na evoluo da infeco

Cdigo do experimento - DX#1 Objetivo - Testar o efeito do derivado DX sobre a resistncia dos animais infeco por T. cruzi Justificativa - Entre oito derivados sintetizados de uma certa droga, o derivado DX foi o mais efetivo sobre tripomastigotas in vitro Pergunta - DX tem efeito sobre o curso da infeco por T. cruzi? Cronograma e protocolo
-n dpi (dias ps-infeco): planejamento do experimento: definio dos grupos, do par parasita-hospedeiro, dos
inculos, da via de inoculao e do esquema de administrao do DX a ser testado -10 a -7 dpi: pedido dos animais ao biotrio para aclimatao -5 a -1 dpi: pesagem dos animais, distribuio entre os grupos, marcao, coleta de plasma 0 dpi: infeco dos animais 5 dpi: tratamento com o composto DX por administrao via oral 6-30 dpi: acompanhamento de parasitemia e da mortalidade Grupos Cont: 0,1 ml diluente DX100: 0,1 ml de soluo contendo 16,8 mg DX Clculo da dosagem de DX Pesagem dos animais em 5 dpi para clculo da concentrao da droga
Peso individual em gramas (n=20) 16,9 16,3 16,5 17,5 18,0 19,6 18,2 15,8 19,4 19,2 20,8 18,2 15,3 18,6 20,0 18,0 19,5 17,3 18,3 17,2 Mdia des. pd. 16,8 0,4
Preparo da suspenso de DX administrao de dose nica por via oral de 100 mg/kg peso de DX no volume de 0,1ml para dez animais (grupo DX100) pesando em mdia 16,8 g (os outros dez animais sero inoculados com 0,1 ml do diluente 3% de Tween 80 em gua (grupo Cont)
DX 100 mg x DX 1,68 mg y Peso do animal 1000 mg 16,8 Diluente 0,1 ml 1,0 y = 16,8 mg/ml de diluente > concentrao da suspenso a ser preparada x = 1,68 mg/animal > cada animal dever receber 1,68 mg de DX
Administrao de 0,1 ml (via oral) em dose nica (5 dpi) em dez animais
volume total: 0,1 ml X 10 (animais) = 1,0 ml considerando as perdas, preparar 2,0 ml (33,6 mg em 2 ml do diluente)
Acompanhamento da parasitemia O mtodo de acompanhamento de parasitemia aqui utilizado foi o de contagem em cmara de Neubauer; portanto, os resultados brutos de parasitas contados nos quatro quadrantes da cmara so lanados na planilha (Tabela 11) e calculado o nmero de parasitas por ml, tendo em vista a correo da diluio. Os resultados de anlise descritiva so expressos na Figura 6 e na Tabela 12.
325
Tabela 11 Clculos das curvas de parasitemia do experimento DX#1

Cont animal cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia des.pd. DX100 animal cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia des.pd.
1
6 dpi par/quad 3 1 3 7 3 0 7 4 4 0 0 0 4 9 4 2 6 3 5 1 0 1 1 3 1 1 8 2 3 0 1 0 4 10 3 0 13 3 6 1
1:201 104p/ml 20,0 10,0 60,0 145,0 55,0 15,0 170,0 60,0 90,0 10,0 63,5 53,6 46 16 92 64 40 3 42 32 13 0
7 dpi par/quad 36 10 110 37 42 7 42 32 13 1 24 14 97 59 46 4 46 30 20 5 45 14
1:301 104p/ml 755,0 270,0 1993,3 1066,7 925,0 120,0 865,0 626,7 325,0 40,0 698,7 546,9
8 dpi par/quad 44 15 51 57 36 7 24 76 33 1 40 12 42 64 14 13 33 84 17 0 25 14 62 67 20 9 29 82 27 2
1:301 104p/ml 31 18 66 56 28 12 40 72 25 1
9 dpi par/quad
1:301 104p/ml 3 3 65,0 4 3 60,0 5 1 60,0 0 3 35,0 1 2 45,0 1 2 15,0 1 3 35,0 9 10 253,3 5 3 65,0 1 0 10,0 64,3 65,8 1:301 104p/ml 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 5,0 0,0 0,0 0,0 5,0 5,0 5,0 0,0 0,0 0,0 2,0 2,4
57 10 43 19 2
700,0 4 3 295,0 3 2 1105,0 2 4 1220,0 2 2 490,0 2 4 205,0 0 0 630,0 1 2 1613,3 12 17 510,0 3 2 20,0 0 1 678,8 471,2 9dpi par/quad 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6dpi par/quad 3 1 3 2 0 3 6 1 1 2 2 4 3 1 1 1 3 4 1 3 5 4 1 1 0 1 3 0 0 2
1:201 104p/ml 4 3 1 4 1 1 0 1 1 1 70,0 60,0 40,0 40,0 10,0 30,0 60,0 30,0 15,0 40,0 39,5 18,5 9 5 4 4 3 4 1 5 0 1
7dpi par/quad 5 3 2 3 4 2 2 5 1 4 8 3 2 0 2 2 5 6 2 3
1:301 104p/ml 4 3 3 2 3 0 5 5 1 1 130,0 70,0 55,0 45,0 60,0 40,0 65,0 105,0 20,0 45,0 63,5 30,7 4 0 2 1 2 1 1 1 0 1
8dpi par/quad 3 0 1 0 1 0 2 0 0 0 2 1 0 0 1 0 0 0 0 0
1:301 104p/ml 2 1 0 0 0 0 0 0 1 0 55,0 10,0 15,0 5,0 20,0 5,0 15,0 5,0 5,0 5,0 14,0 14,6
diluio do sangue
Tabela 12 Anlises descritiva e comparativa da parasitemia mxima do experimento DX#1

Pico de parasitemia Animal Cont cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-10 mdia desvio padro W Normal? ANOVA Teste de mediana Man-Whitney 755,0 295,0 1993,3 1220,0 925,0 205,0 865,0 1613,3 510,0 40,0 842,2 594,7 0,7328 sim 0,000998 (par) 0,0003 0,00178 104 par/ml DX00 130,0 70,0 55,0 45,0 60,0 40,0 65 105 20 45 63,5 30,7 0,2606 sim Cont 6,878 6,470 7,300 7,086 6,966 6,312 6,937 7,208 6,708 5,602 6,747 0,481 0,1590 sim 0,000023 (log) 0,0003 0,00178 log10 DX100 6,114 5,845 5,740 5,653 5,778 5,602 5,813 6,021 5,301 5,653 5,752 0,215 0,7667 sim
exemplo de clculo de log10: log 755.104 = log 755+ log104 = 2,878 + 4 = 6.878
326
Questes
A distribuio normal? Sim. Que teste usar? ANOVA ou teste t. O pico de parasitemia do grupo tratado menor do que o do grupo controle? , pois a comparao do grupo
controle com o tratado com a droga DX altamente significativa, tanto com os dados reais como com as transformaes logartmicas. Acompanhamento da sobrevida e da mortalidade As curvas de sobrevida e mortalidade podem ser calculadas e expressas graficamente como demonstrado anteriormente, a partir de planilhas como a da Tabela 13. As Figura 7 e 8 mostram a representao grfica dos resultados obtidos neste experimento, tanto para percentual de mortalidade ou sobrevida (Figura 7) como para mdia do tempo de sobrevida (Figura 8). A questo de interesse aqui passa a ser a comprovao estatstica de se estas curvas de sobrevida so diferentes entre si ou no, e portanto se tal situao experimental mais ou menos favorvel ao hospedeiro. Para essa anlise organiza-se uma base de dados com os animais individuais nas linhas e com trs colunas de variveis: o grupo (controle ou DX), o tempo de sobrevida observado para cada animal, e o indicador de dados a ser censurados, como na Tabela 14. Neste caso sero marcados como censurados todos os animais que no tiverem morrido, ou seja, tiverem sobrevivido ao ltimo dia de observao do experimento (no caso, dia quarenta), ou que tiverem sido sacrificados, ou perdidos por qualquer outro motivo. Os programas de anlise de sobrevida levam em considerao essa restrio. Tabela 13 Planilha de clculo de mortalidade e sobrevida do experimento DX#1
DX#1: mortalidade cumulativa (%MC) dpi mi 0 1 2 2 2 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 Cont (n=10) ma 0 1 3 5 7 7 7 7 8 9 9 9 9 9 9 %MC 0 10 30 50 70 70 70 70 80 90 90 90 90 90 90 mi 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 DX100 (n=10) ma 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 3 3 3 %MC 0 0 0 0 0 0 10 10 10 10 20 20 30 30 30 M50= %MC=30 dpi DX#1: sobrevida cumulativa (%SC) Cont (n=10) sobreviventes 10 9 7 5 3 3 3 3 2 1 1 1 1 1 1 %SC 100 90 70 50 30 30 30 30 20 10 10 10 10 10 10 DX100 (n=10) sobreviventes 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 8 8 7 7 7 %SC 100 100 100 100 100 100 90 90 90 90 80 80 70 70 70
0 13 14 15 16 17 19 20 22 23 24 25 26 27 40
0 13 14 15 16 17 19 20 22 23 24 25 26 27 40
M50=15 %MC=90
mi = mortalidade individual; ma = mortalidade acumulada
327
Tabela 14 Anlise dos dados de sobrevida do experimento DX#1

DX#1: tempo de sobrevida (TS) Animal cdg-1 cdg-2 cdg-3 cdg-4 cdg-5 cdg-6 cdg-7 cdg-8 cdg-9 cdg-1 cdg-2 cdg-3 TS 12 13 13 14 14 15 15 21 22 18 23 26 Grupo Cont Cont Cont Cont Cont Cont Cont Cont Cont DX100 DX100 DX100 Censura no no no no no no no no no no no no Cont mdia des.pd. Testes aplicado para comparar Controle x DX100 15,4 3,4 teste Gehan-Wilcoxon F Cox Log-rank Peto & Peto p 0,00059 0,00162 0,00030 0,00103 0,00059
DX100 mdia des.pd.
22,3 3,3
Para a anlise de sobrevida na pesquisa biomdica utiliza-se um conjunto de testes especialmente desenvolvidos com esta finalidade, geralmente apresentado sob a forma de um mdulo especfico nos diferentes programas estatsticos. Esses mtodos so conhecidos como tcnicas analticas (tabela de vida, distribuio de sobrevida e estimativa de sobrevida (TS). Nestas abordagens, alguns dados sero censurados. Observaes censuradas podem ocorrer quando a varivel em questo o tempo at um evento terminal e a durao do estudo tem um tempo limitado. Por exemplo, limitando-se o acompanhamento da mortalidade de um grupo controle e outro tratado h quarenta dias, observamos que no grupo controle todos os animais morreram enquanto que no tratado apenas trs de um total de dez animais; assim temos registrado quando morreu cada um dos animais, porm os seis animais sobreviventes so considerados observaes censuradas, na medida em que no podem ser contabilizadas, pois o evento no ocorreu. Uma outra situao neste exemplo : se algum dos animais morreu comprovadamente por uma outra causa, ele tambm ser uma observao censurada. Nestes programas geralmente podemos obter as seguintes informaes: anlises de tabelas de vida ajuste da distribuio (fitting) mtodo de Kaplan-Meier (Produto-Limite) comparao de sobrevida em dois ou mais grupos modelos de regresso para dados censurados parmetros de ajuste para estimativas Destas opes, as que mais interessam anlise de experimentos de modulao da resistncia do hospedeiro e da virulncia do parasita nas infeces experimentais so: anlises de tabelas de vida, o mtodo de Kaplan-Meier e a comparao de sobrevida em dois ou mais grupos. A anlise de tabela de vida um dos mais antigos testes para anlise de sobrevida. Pode ser vista como uma tabela de distribuio de freqncia reforada. Os tempos de sobrevida so distribudos em um certo nmero de intervalos e para cada intervalo calculada a freqncia de casos (animais) vivos ou mortos que entram em cada intervalo, bem como o nmero de casos perdidos ou censurados no respectivo intervalo. Com base nestes nmeros e propores, vrias anlises adicionais podem ser computadas: o nmero de casos sob risco (nmero de casos que entram vivos no respectivo intervalo, menos o nmero de casos censurados no respectivo intervalo); a proporo de morte (razo entre o nmero de casos mortos em cada intervalo e o nmero de casos sob risco no intervalo); e proporo de sobrevida (um menos a proporo de morte). Calcula-se tambm a mediana do tempo de sobrevida (M50), ou seja, o TS no qual a funo de sobrevida cumulativa igual a 0,5. Outros percentis (M25 e M75) tambm podem ser calculados. O ajuste de distribuio usado para verificar se a distribuio de TS se d de modo exponencial ou linear ao acaso, se segue a distribuio Weibull para eventos extremos, ou se segue a distribuio de Gompertz, os trs tipos mais freqentes.
328
O mtodo de Kaplan-Meier estima a funo de sobrevida diretamente a partir dos tempos contnuos de sobrevida ou morte. A vantagem sobre a tabela de vida que o resultado estimado no depende de agrupar os dados em certo nmero de intervalos de tempo. Pelo mtodo de comparao de duas ou mais amostras se implementam os testes de Gehan, o teste de CoxMantel, o teste F de Cox, o teste de Peto & Peto, e o teste log-rank. Em princpio, como os tempos de sobrevida no so normalmente distribudos, aplicam-se testes no paramtricos baseados na ordenao (ranking). Os testes no paramtricos so para dados censurados. A maioria destes testes alm do valor de p, indica tambm um valor de z, que pode ser usado para clculos de diferenas entre grupos. No h um guia de regras claras para a escolha de um teste em especial para uma situao particular. O teste F de Cox tende a ser mais potente que o de Geham, quando as amostras forem pequenas (n<50), se seguirem uma distribuio exponencial ou ento a distribuio de Weibull, e se no houver observaes censuradas. O teste de Cox-Mantel e o de log-rank so mais poderosos (independente de censura ou no a dados) quando as amostras vm de uma populao que segue a distribuio exponencial ou a de Weibull. Quando os dados de duas amostras forem comparados, muito importante examinar o nmero de observaes censuradas em cada grupo. No caso de teste de novas drogas ou terapias, nos quais o animal melhora como resultado do tratamento, e tende a sair do estudo e ser censurado, resulta em nmeros diferentes de observaes censuradas em cada grupo. Essa censura sistemtica pode levar a problemas nas comparaes de resultados. No caso especfico do experimento DX#1, todos os testes indicaram diferenas significativas entre os animais infectados no tratados (Cont) e os tratados com a droga X na concentrao de 100 mg/kg de peso (DX100).
DX#1 - Cont role Cin tica ind ivid ual de paras item ia 2400 2000 10e 4 par/ml 1600 1200 800 400 0 6 7 8 9 d ias ps-infe co
cd g - 1 cd g - 2 cd g - 3 cd g - 4 cd g - 5 cd g - 6 cd g - 7 cd g - 8 cd g - 9 cd g -1 0 m d ia
DX#1 - DX100 Cin t ica in dividual de paras item ia 2400 2000 10e 4 par/ml 1600 1200 800 400 0 6 7 8 9
cd g - 1 cd g - 2 cd g - 3 cd g - 4 cd g - 5 cd g - 6 cd g - 7 cd g - 8 cd g - 9 cd g -1 0 m d ia
6a
6b
d ias ps-infe co
Dx#1: Curva Cu rvade de Mortalidade C um ulat iva Mortalidade Cumulativa 100 Cont
DX#1 - Tempo Tem pode de sobrevida sobre vida 30 dias diasps-infeco ps-infeco 25 20 15 10 5 0 Cont DX10 0
DX100 %MC 50
0 0 5 10 15 20 25 30 35 40
dias p s-infe co
Figuras 6-8 Resultados do experimento DX#1 analisando os grupos Controle e DX100: (6) curva de parasitemia; (7) curva de mortalidade cumulativa; (8) distribuio do tempo de sobrevida (grficos obtidos atravs do programa Excel para Windows)
329
Captulo 20
An e xos
Contedo
Princpios, normas e legislao para experimentao animal Princpios ticos na experimentao animal Detalhamento de projetos de pesquisa para obteno de registro junto Comisso de tica Agentes comumente usados para eutansia Modelos de aviso de trabalho com Trypanosoma cruzi Protocolo de descarte de animais infectados O que fazer em caso de acidente Ficha para planejamento de experimento in vivo Check-list para planejamento de experimento in vivo Esquema de marcao dos animais Modelos de ficha de gaiola Ficha de anlise individual de camundongos infectados Calendrio gregoriano Programao de experimento Coleta de dados para hematcrito e avaliao leucocitria Coleta de dados de contagem leucocitria percentual Coleta de dados de evoluo ponderal Coleta de dados de parasitemia pelo mtodo de Pizzi-Brener Coleta de dados de parasitemia por contagem em cmara de Neubauer Coleta de dados de mortalidade Legislao sobre o uso de animais de laboratrio
331
Princpios, normas e legislao para experimentao animal

Desde 1995, quando o Congresso Nacional regulamentou as Normas para o trabalho com microorganismos patognicos e geneticamente modificados (Lei 8974/95) e instituiu pelo decreto 1752/95 a Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana (CTNBio), as diversas instituies de pesquisa tm procurado constituir Comits de tica em Pesquisa com animais. Esses Comits e Comisses de Pesquisa e tica so pr-credenciados junto Comisso Nacional de tica em Pesquisa (CONEP) do Ministrio da Sade e tm elaborado procedimentos especficos a serem seguidos em cada instituio. Essas iniciativas tomaram por base os Princpios ticos na Experimentao Animal, elaborados pelo Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA) em 1990/ 92. Outra instituio que tem sido referncia na formulao de normas e cdigos de conduta tica nessa rea a Universidade Federal do Rio Grande do Sul, atravs de sua Comisso de Biotica, que gerou em 1997 resolues normativas para a Utilizao de Animais em Projetos de Pesquisa. Em 1999, tanto a Fundao Oswaldo Cruz (Portaria da Presidncia 099/99-PR de 06/04/99), como o Instituto de Biofsica da UFRJ, tambm instituram suas comisses de tica para qualificar sob o ponto de vista tico, os protocolos experimentais envolvendo o uso de animais de laboratrio no mbito de seus laboratrios de pesquisa.
Cdigo de conduta aprovada pela Comisso de tica no Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ para o uso de animais de laboratrio na instituio
A escolha sempre que possvel de mtodos alternativos, ou seja, formas de estudo que no utilizem animais; A utilizao de animais em pesquisa deve estar condicionada relevncia cientfica e adequao do mtodo de
estudo;
O pesquisador deve ser treinado para fazer experimentao em animais, e responsvel pelo seu bom uso; Deve-se utilizar o menor nmero possvel de animais, necessrios para obteno de resultados vlidos; A dor e o sofrimento desnecessrios so inaceitveis; O transporte, as acomodaes e o trato dos animais devem ser feitos com o mnimo de estresse, de forma que seu
equilbrio biolgico seja preservado.
Endereos eletrnicos para documentao apropriada referente legislao e aspectos ticos para o uso de animais em experimentao biolgica:
Fundao Oswaldo Cruz: Vice-Presidncia de Pesquisa e Ensino

(http://www.fiocruz.br/vppqe/etica/)
Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (COBEA):

(http://www.meusite.com.br/COBEA/)
Comisso de Biotica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul:

(http://www.ufrgs.br/HPCA/gppg/bioetica.html)
332
Anexos
Princpios ticos na experimentao animal

A evoluo contnua das reas de conhecimento humano, com especial nfase quelas de biologia, medicinas humana e veterinria, e a obteno de recursos de origem animal para atender necessidades humanas bsicas, como nutrio, trabalho e vesturio, repercutem no desenvolvimento de aes de experimentao animal, razo pela qual se preconizam posturas ticas concernentes aos diferentes momentos de desenvolvimento de estudos com animais de experimentao. Postula-se: Artigo I - primordial manter posturas de respeito ao animal, como ser vivo e pela contribuio cientfica que ele proporciona. Artigo II - Ter conscincia de que a sensibilidade do animal similar humana no que se refere a dor, memria, angstia, instinto de sobrevivncia, apenas lhe sendo impostas limitaes para se salvaguardar das manobras experimentais e da dor que possam causar. Artigo III - de responsabilidade moral do experimentador a escolha de mtodos e aes de experimentao animal. Artigo IV - relevante considerar a importncia dos estudos realizados atravs de experimentao animal quanto a sua contribuio para a sade humana em animal, o desenvolvimento do conhecimento e o bem da sociedade. Artigo V - Utilizar apenas animais em bom estado de sade. Artigo VI - Considerar a possibilidade de desenvolvimento de mtodos alternativos, como modelos matemticos, simulaes computadorizadas, sistemas biolgicos in vitro, utilizando-se o menor nmero possvel de espcimes animais, se caracterizada como nica alternativa plausvel. Artigo VII - Utilizar animais atravs de mtodos que previnam desconforto, angstia e dor, considerando que determinariam os mesmos quadros em seres humanos, salvo se demonstrados, cientificamente, resultados contrrios. Artigo VIII - Desenvolver procedimentos com animais, assegurando-lhes sedao, analgesia ou anestesia quando se confignar o desencadeamento de dor ou angstia, rejeitando, sob qualquer argumento ou justificativa, o uso de agentes qumicos e/ou fsicos paralizantes e no anestsicos. Artigo IX - Se os procedimentos experimentais determinarem dor ou angstia nos animais, aps o uso da pesquisa desenvolvida, aplicar mtodo indolor para sacrifcio imediato. Artigo X - Dispor de alojamentos que propiciem condies adequadas de sade e conforto, conforme as necessidades das espcies animais mantidas para experimentao ou docncia. Artigo XI - Oferecer assistncia de profissional qualificado para orientar e desenvolver atividades de transportes, acomodao, alimentao e atendimento de animais destinados a fins biomdicos. Artigo XII - Desenvolver trabalhos de capacitao especfica de pesquisadores e funcionrios envolvidos nos procedimentos com animais de experimentao, salientando aspectos de trato e uso humanitrio com animais de laboratrio.
* Esses princpios foram elaborados pelo COBEA - Colgio Brasileiro de Experimentao Animal (1990/92), entidade filiada ao lnternational Council for Laboratory Animal Science (ICLAS). Seguem trs princpios bsicos: Sensibilidade, Bom Senso e Boa Cincia. Este trabalho foi inicialmente elaborado pelo COMIT DE TICA E LEGISLAO DO COBEA, e se baseou em textos internacionalmente adotados, como os do ICLAS, do CALAS (Canadian Association of Laboratory Animal Science) a do CIAL (Centre d lnformation sur les Animaux de Laboratoire), adaptados s nossas condies. COBEA - Colgio Brasileiro de Experimentao Animal C.G.C 53.781.159/0001-57 Rua Botucatu, 862 - Vila Clementino CEP:04023-900 - So Paulo - Brasil Tel: (11) 576-4558 ou (11) 576-4526
333
Detalhamento de projetos de pesquisa para obteno de registro junto Comisso de tica

De modo geral, cada Comisso de tica nas diferentes instituies disponibiliza formulrios prprios (protocolos) para submisso de projetos, que costumam ser encontrados via internet. Na FIOCRUZ, o acesso se d atravs da pgina da Vice-Presidncia de Pesquisa e Ensino (www.fiocruz.br/vppqe/etica/). Os laboratrios com licena para desenvolver pesquisas que envolvem o uso de animais precisam manter registros de uso para eventuais inspees, e encaminhar Comisso de tica um balano de todos os animais utilizados anualmente. No registro devero constar detalhes do incio e trmino da experimentao, procedimento experimental e mtodo de eutansia empregados; Em caso de experimentao envolvendo animais silvestres, imprescindvel a inteira adequao as pr-condies estabelecidas pelo IBAMA. A experimentao cientfica em animais importante. Algumas pesquisas tm mais importncia que outras, porm existem propostas que, por serem inadequadas, desde o ponto de vista tico, moral ou metodolgico, devem ser at mesmo impedidas de serem realizadas. Esta posio est de acordo com a nova postura da Cincia, onde no h lugar para a Cincia sem conscincia, devido a complexidade de toda a realidade que nos rodeia. A possibilidade de generalizao dos conhecimentos obtidos em animais no deve justificar todo e qualquer experimento. Nem todos os conhecimentos gerados em modelos animais so plenamente transponveis ao ser humano, existem idiossincrasias que devem ser continuamente relembradas. O conflito entre o bem dos seres humanos e o bem dos animais deve ser evitado sempre que possvel. Ou seja, devemos buscar estabelecer estratgias para minimizar este confronto, porm no negando a sua existncia. A avaliao da necessidade da utilizao de animais em experimentos cientficos pode ser realizada em dois diferentes estgios: o pesquisador deve caracterizar que este o nico meio de estudar a situao proposta, no havendo possibilidade de outro mtodo alternativo disponvel; a caracterizao da necessidade deve demonstrar que a pesquisa indispensvel, imperativa ou requerida. A pesquisa considerada indispensvel quando essencial para que alguma coisa seja feita ou ocorra. Por exemplo, quando realmente pode contribuir para o conhecimento bsico ou em atividades de ensino ou formao profissional. A pesquisa considerada imperativa quando est associada a uma prioridade maior, tais como as realizadas com o objetivo de minorar o sofrimento de pessoas com AIDS, cncer ou outras doenas graves. A pesquisa requerida quando demandada por uma deciso legal. Neste caso enquadram-se os testes de novas drogas e de toxicidade de substncias. Os projetos de pesquisa que envolvem o uso de animais precisam explicitar: a abordagem cientfica do grupo a relevncia do trabalho, destacando o potencial benefcio do projeto especfico (mais do que a importncia do tema do projeto) os procedimentos experimentais que envolvam o uso de animais de laboratrio, sua justificativa e grau provvel de severidade resultante dos procedimentos aos quais os animais forem submetidos, para que possam ser equilibrados de acordo com os potenciais benefcios. A severidade resultante dos procedimentos se divide em trs faixas: branda, moderada e substancial. Exemplos de severidade em diferentes procedimentos: 1 Branda Amostras pequenas de sangue ou pouco freqentes; Testes de irritao na pele onde espera-se que substncias produzam somente irritao branda; Procedimentos cirrgicos menores com anestesia;
334
Anexos
Bipsia superficial ou introduo de cnula nos vasos sangneos perifricos sob anestesia; Procedimentos que sero terminados antes que o animal demonstre mais do que pequenas mudanas no seu comportamento habitual. 2 - Moderada Testes de toxidade evitando desfecho letais; Maioria dos procedimentos cirrgicos, desde que o sofrimento possa ser controlado por anestesia e cuidado ps-operatrio confiveis. 3 Substancial Qualquer procedimento que resulte em uma maior mudana no estado normal de sade ou bem-estar dos animais; Procedimentos de toxidade, aguda ou crnica onde morbidade significativa ou morte o desfecho final; Cirurgia grave que pode resultar em ps-operatrio com sofrimento. Quando metodologia experimental, costuma ser necessrio indicar: espcie, linhagem/cepa, sexo e peso dos animais em cada procedimento, e justificar seu uso. fonte(s) provedora(s) dos animais; nmero aproximado de animais, justificando a sua utilizao; as condies gerais, alojamento e alimentao dos animais (local, sala, tipo de alojamento, suas condies ambientais como temperatura, iluminao, umidade, ventilao, etc) o tipo de alimentao (convencional ou outra) e de hidratao (tipo de bebedouro automtico, mamadeira, tijela), e de gua (de rede, filtrada, mineral, autoclavada) as condies de biossegurana empregadas no projeto, segundo o nvel de risco imposto pelo agente microbiolgico as condies de limpeza, desinfeco e esterilizao (produto usado: quaternrios de amnio, lcool a 70%, iodo, cloro ou outro; protocolo de esterilizao de materiais e equipamentos) o tipo de conteno (fsica ou qumica) a que os animais precisam ser submetidos para injeo ou coleta de material, para cirurgia, para alimentao de insetos ou outros procedimentos, e por qual perodo o uso de relaxantes ou paralisantes musculares tipo de anestesia e a situao apropriada em cada modelo animal, e como ser avaliado o nvel anestsico (presso arterial, freqncia cardaca e/ou respiratria, EEG, reflexos flexor, da cauda e/ou coreano, ou outros); exemplos de procedimentos que no requerem anestesia: administrao de fluidos, imunizao, medicamentos orais, coleta de sangue (exceto intracardaca e periorbital), procedimentos da prtica normal de veterinria e outros envolvendo diagnstico e tratamento de doenas; exemplos de procedimentos que envolvem dor e que requerem anestesia incluem: cirurgia, qualquer agente que induza inflamao excessiva ou necrose, coleta de sangue intracardaca ou periorbital. se haver alguma manipulao cirrgica dos animais (simples ou mltipla), porque descrev-la brevemente, onde ser realizada, se resultaro em sobrevida e que cuidados e terapias pr e ps-cirrgicas sero utilizados se haver administrao de drogas, reagentes e material radioativo, quais, por que dose/via, com que freqncia, e qualquer complicao conhecida do material. se sero extrados fluidos antemortem (p.ex. sangue, urina, bile, lquor) dos animais, com tipo, quantidade da amostra, freqncia e mtodo de coleta o procedimento/planejamento de acompanhamento para animais moribundos e o momento no qual ser aplicada a eutansia o mtodo de eutansia a ser usado nos animais (deslocamento cervical, decapitao, CO , dessangramento 2 com anestesia, dose excessiva de anestesia ou outro) condies de descarte de carcaas

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Agentes comumente usados para eutansia

Tabela completa disponvel no endereo: http://www.biof.ufrj.br/ Agente fsico: Deslocamento cervical
Local de ao: Depresso cerebral direta Classificao Hipoxemia devida ruptura dos centros vitais Comentrios: Contrao muscular violenta pode ocorrer aps o deslocamento cervical Caractersticas do trabalho
Segurana do pessoal: Seguro Facilidade de realizao: Requer treinamento e qualificao Velocidade: Moderadamente rpido Consideraes econmicas: Pouco dispendioso Alteraes de tecidos: til se tecidos livres de resduos qumicos so necessrios Eficincia: Irreversvel Adequao espcie: Adequado somente para galinceos, camundongos de laboratrio e ratos com menos de 200gr e coelhos com menos de 1 kg Observao: Aceitvel com sedao prvia ou anestesia ligeira (vide texto)

Agente fsico: Decapitao
Local de ao: Depresso cerebral direta Classificao Hipoxemia devida ruptura dos centros vitais Comentrios: Contrao muscular violenta ocorre aps a decapitao Caractersticas do trabalho
Segurana do pessoal: Seguro, cuidados com ferimentos mecnicos Facilidade de realizao: Facilmente executado com o mnimo de treinamento. Velocidade: Moderadamente rpido, pode manter a conscincia por 13 a 14 s Consideraes econmicas: Pouco dispendioso Alteraes de tecidos: til se tecidos livres de resduos qumicos so necessrios Eficincia: Irreversvel Adequao espcie: Recomendado para assegurar a morte aps o atordoamento por pancada controlada ou tiro em espcies domsticos de grande porte ou coelhos Observao: Aceitvel quando precedido de outros mtodos que aliviam a ansiedade e conscincia
Agente depressor direto dos neurnios: Dixido de carbono
Local de ao: Depresso direta do crtex cerebral e das estruturas subcorticais, depresso direta do msculo
cardaco
Classificao: Hipoxemia devida depresso dos centros vitais Comentrios: Inicialmente ocorre a inconscincia, no h ansiedade nem dor; possvel atividade motora
involuntria aps a inconscincia; nenhuma atividade motora aps breve perodo Caractersticas do trabalho Segurana do pessoal: Risco mnimo Facilidade de realizao: Usado em cmara de conteno fechada Velocidade: Moderadamente rpido Consideraes econmicas: Pouco dispendioso
336
Anexos
Alteraes de tecidos: Alteraes associadas hipxia podem ocorrer Eficincia: Eficaz Adequao espcie: Pequenos animais de laboratrio, aves e pequenos cachorros Observao: Aceitvel mas o tempo necessrio pode ser prolongado em animais imaturos ou neonatos

Agentes depressores diretos dos neurnios: Gases anestsicos (ter, clorofrmio, halotane, xido ntrico, enflurane e isoflurane)
Local de ao: Depresso direta do crtex cerebral e das estruturas subcorticais e dos centros vitais Classificao: Hipoxemia devida depresso dos centros vitais Comentrios: Inicialmente ocorre a inconscincia no h ansiedade nem dor; possvel atividade motora
involuntria aps a inconscincia; nenhuma atividade motora aps breve perodo
Caractersticas do trabalho com ter

Segurana do pessoal: Inflamvel e explosivo Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada Velocidade: Incio vagaroso da anestesia Consideraes econmicas: Relativamente pouco dispendioso Alteraes de tecidos: Pequenas alteraes podem ocorrer nos rgos parenquimatosos Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for suficientemente exposto Adequao espcie: Adequado para gatos, cachorros jovens, aves, roedores e outras pequenas espcies. Quando administrado em animais de maior porte, requer equipamento especializado. O incio vagaroso, vapores so irritantes Observao: Aceitvel, mas perigoso Caractersticas do trabalho com Clorofrmio Segurana do pessoal: No inflamvel e no explosivo; exposio crnica de animais ou pessoas aos vapores pode ser perigoso por causa de danos potenciais no fgado ou rins e carcinognese. Seguro quando usado com ventilao Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada; Pode ser administrado a animais de grande porte por meio de mscara. Usar cmara fechada com enchimento rpido. Velocidade: Incio rpido da anestesia Consideraes econmicas: Pouco dispendioso Alteraes de tecidos: Alteraes extensas podem ocorrer nos rgos parenquimatosos Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for suficientemente exposto; pouco eficiente em jovens ou neonatos Adequao espcie: Adequado para pequenos animais, incluindo aves, roedores e vison. til em animais de grande porte em situaes de emergncia. Observao: Aceitvel em animais de pequeno porte somente em condies controladas (vide texto); Aceitvel somente em situaes de emergncia. um agente eficiente mas outros mtodos so preferveis. No aceitvel para a maioria dos animais com menos de quatro meses Caractersticas do trabalho com Halotane Segurana do pessoal: No inflamvel, no explosivo, exposio crnica de animais ou pessoas aos vapores pode ser prejudicial Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada, pode ser administrado a animais de grande porte por meio de mscara Velocidade: Incio rpido da anestesia Consideraes econmicas: Dispendioso Alteraes de tecidos: Pode ocorrer em rgos parenquimatosos

337
Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for exposto suficientemente Adequao espcie: Adequado para gatos, cachorros jovens, aves, roedores e outras pequenas espcies. Quando administrado em animais de maior porte, requer equipamento especializado. O incio vagaroso. Observao: Aceitvel Caractersticas do trabalho com Enflurane Segurana do pessoal: No inflamvel, no explosivo, exposio crnica de animais ou pessoas aos vapores pode ser prejudicial Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada; pode ser administrado em animais de grande porte por meio de mscara Velocidade: Incio rpido da anestesia Consideraes econmicas: Dispendioso Alteraes de tecidos: Pode ocorrer em rgos parenquimatosos, particularmente rins Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for exposto suficientemente; anestesia profunda pode ser acompanhada de contraes motoras Adequao espcie: Adequado para gatos, cachorros jovens, aves, roedores e outras pequenas espcies. Observao: Aceitvel, mas no recomendvel, devido atividade motora no plano de anestesia profunda Caractersticas do trabalho com Isoflurane Segurana do pessoal: No inflamvel, no explosivo, exposio crnica de animais ou pessoas aos vapores pode ser prejudicial Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada, pode ser administrado em animais de grande porte por meio de mscara facial Velocidade: Alta volatilidade e potncia. Incio rpido da anestesia Consideraes econmicas: Muito dispendioso Alteraes de tecidos: Pode ocorrer em rgos parenquimatosos, particularmente rins Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for exposto suficientemente; a induo no parece ser estressante Adequao espcie: Adequado para pequenos animais incluindo aves e roedores. til em animais de grande porte em situaes de emergncia Observao: Aceitvel em animais de pequeno porte; aceitvel em animais de grande porte somente em situaes emergenciais. Caractersticas do trabalho com xido Ntrico Segurana do pessoal: No inflamvel, mas alimenta combusto; exposio crnica de animais ou pessoas aos vapores pode ser prejudicial Facilidade de realizao: Facilmente realizvel em cmara de conteno fechada, pode ser administrado a animais de grande porte por meio de mscara facial Velocidade: Incio de efeito rpido em concentrao de 100% Consideraes econmicas: Relativamente dispendioso Alteraes de tecidos: Leses hipxicas podem ocorrer Eficincia: Altamente eficiente, quando o sujeito for exposto suficientemente; Adequao espcie: Adequado para gatos, cachorros jovens, aves, roedores e outras pequenas espcies No recomendado sozinho para animais de mauir porte Observao: Aceitvel em animais de pequeno porte; O uso em animais de grande porte requer suplementao com outros agentes

338
Anexos
Modelos de aviso de trabalho com Trypanosoma cruzi
RISCO BIOLGICO: NB 2
AGENTE DE RISCO: T. cruzi GRUPO DE RISCO: II CLASSE DE RISCO : 2 RESPONSVEL PELO LABORATRIO: Tel: E-mail:
339
ACESSO RESTRITO
NESTA SALA SE TRABALHA COM Trypanosoma cruzi
CUIDADO ! ESTAMOS TRABALHANDO NESTE LOCAL COM Trypanosoma cruzi
340
Anexos
Protocolo de descarte de animais infectados
COMO DESCARTAR CAMUNDONGO INFECTADO (tratamento qumico para desinfeco)
Aps sangria ou disseco os animais devem:

ter o ventre aberto e os rgos expostos ser colocados em sacos plsticos (de lixo) ser recobertos com formalina a 4% o saco vedado deve ser deixado em repouso por no mnimo 24 h o saco com os animais pode ento ser descartado
341
O que fazer em caso de acidente com Trypanosoma cruzi

obrigatrio conter o material contaminado por T. cruzi: evitar que lquidos se espalhem, cobrindo com
material absorvente seco para em seguida colocar o desinfetante e depois descontaminar o material absorvente (autoclave ou desinfetante); evitar que resduos slidos contaminados sejam carregados nas solas de sapato ou roupas; Atender o(s) indivduo exposto aos riscos durante o acidente; Quando aerossis e/ou gotas forem projetados distncia, limpar o local com papel absorvente embebido em lcool a 70%. Na roupa ou na pele, saturar a rea com lcool 70%; Limpar a pele imediatamente com lcool ou outro desinfetante; Se o contato for com os olhos ou mucosas, lavar exaustivamente com gua corrente em lava-olhos (se no tiver, lavar com salina ou gua boricada); As feridas superficiais devem ser lavadas exaustivamente e cauterizadas com nitrato de prata; As feridas punctuais (agulha) devem ser espremidas, para obter o mximo de sangue possvel, e cauterizadas; Informar o acidente ao responsvel mdico apropriado para que sejam tomadas as providncias cabveis (teste sorolgico, tratamento, acompanhamento clnico-laboratorial); Colher sangue para teste de parasitemia (pesquisa do parasita em gota espessa e em capilar de microhematcrito, de trs em trs dias, durante os primeiros quinze dias aps o acidente); Colher soro ou plasma para sorologia de fase aguda: IgM anti T. cruzi nos dias 0, 15 e 30 aps o acidente, e se possvel dosar protenas de fase aguda; Se houver apenas um risco leve (suspeita) de infeco, monitorar o sangue por alguns meses mais, com sorologia (IgG anti T. cruzi); Se o risco de infeco for grande (certeza), tratar imediatamente com benznidazol (Rochagan). No aguardar a evidncia de infeco; Informar o acidente autoridade de sade pblica competente, preenchendo o formulrio de notificao de acidentes da Instituio; notificar a chefia imediata e Coordenao de Sade do Trabalhador.
342
Anexos
Ficha para planejamento de um experimento in vivo

Ttulo do experimento
Objetivos (perguntas) _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Grupos experimentais _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Parmetros que sero acompanhados (individuais ou em pool) nos animais _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ em clulas _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ em tecidos _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Previso de nmero de gaiolas, de tempo de ocupao do espao no biotrio e de data para chegarem ao infectrio _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Modelo experimental animal: _______________ parasita/cepa: __________
sexo: m f inculo: __________
idade e/ou peso: __________ via: __________
esquema teraputico: _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ Cdigo de identificao dos animais __ __ __ __ __ __ __ __ __ __
________ ________ experimento gaiola
_____ _____ cdgo dpi
343
Check-list para um experimento in vivo

Identificao do experimento Data prevista para infeco Pedido dos animais ao biotrio Planejamento e preparo dos inculos Avaliao de espao disponvel no infectrio Preparo de gaiolas e mamadeiras Preparo de fichas de gaiolas Preparo das fichas de acompanhamento a. controle de qualidade ambiental b. acompanhamento de parasitemia c. acompanhamento de mortalidade d. acompanhamento de peso e. ficha de coleta de dados hematolgicos Pesagem pr-infeco Sangria pr-infeco Preparo de rtulos para tubos Preparo de planilhas para anlise de dados (Excel) Registro no livro geral de experimentao animal do laboratrio Preparo dos avisos de bancada e de parede
344
Anexos
Esquema de marcao dos animais
Pintura Animal c1 c2 c3 c4 c5
Furos na orelha Marca Animal c6 c7 c8 c9 c10
Cortes na orelha Marca Animal c11 c12 c13 c14 c15 Marca Animal c16 c17 c18 c19 c20 Marca
Exemplos de esquemas
Nmero do animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a 19 20
Pintura com cido pcrico (camundongos brancos) Cabea Orelha esquerda (OE) Orelha direita (OD) Pata dianteira esquerda (PDE) Pata dianteira direita (PDD) Pata traseira esquerda (PTE) Pata traseira direita (PTD) Dorso Base da cauda Linha crnio-dorsal 10+1 10+2 a 10+9 sem marca
Furo ou corte das orelhas (camundongos brancos, pretos ou cinzas) 1 orelha direita (OD) 1 orelha esquerda (OE) 2 OD 2 piques OE 3 piques OD 3 piques OE 1+2 1+4 1+6 sem corte 1+6 sem corte
345
Modelos de ficha de gaiola

Gaiola no: Cepa do camundongo: T. cruzi cepa: Observaes Exp: Sexo: Inc: Resp: Nascimento: Via: n inicial = em: / Peso: em: Data: /
Gaiola no: Cepa do camundongo: T. cruzi cepa: no mortos: dia semana
Exp: Sexo: Inc: Em: ___/___ ___/___ ___/___ ___/___ ___/___ ___/___
Resp: Nascimento: Via: no mortos:
n inicial = em: / Peso: em: Data: dia semana Em: ___/___ ___/___ ___/___ ___/___ ___/___ ___/___ /
Gaiola no: Exp: Animal Sexo: Nascimento: Peso mdio: em: / Observaes:
n inicial = em: / Resp: Parasita Cepa: Data: Inculo: Via:
346
Anexos
Ficha de anlise individual de camundongos infectados

Estudo da Cepa - (relao parasita-hospedeiro) 1
Camundongo no Linhagem
sexo idade peso
inoculado dia ___ morte dia ____
com ____ espontnea [ ] sacrificado [ ]
parasitas
CURVA DE INFECO 2 E ALTERAES PATOLGICAS
dia curva de infeco plo arrepiado movimento edema (localizado) olhos paralisias incontin. urinria diarria orelhas
QUADRO ANTOMO-PATOLGICO
Descrio corao fgado bao outros cond. de morte

Ficha adaptada da Figura 1 do artigo de Silva LHP & Nussenszweig V. Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzi altamente virulenta para o camundongo branco. Folia Clin Biol 20: 191-208, 1953.
2 1
Curva de parasitemia
347
Calendrio Gregoriano
JAN 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 FEV 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 ** MAR 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ABR 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 MAI 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 JUN 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 JUL 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 AGO 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 SET 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 OUT 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 NOV 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 DEZ 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365
348
Anexos
Programao de Experimento
Experimento:__________________Data:__________
dpi -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 Dia Ms Dia semana Esfr Lam Cap Corte FACS Paras _____ _____
349
Coleta de dados para hematcrito e avaliao leucocitria

Gaiola: _____ Cepa: _____ Cepa: _____ Exp.: ______ Sexo: ______ Inculo: _____
Cdgo: ____ T. cruzi: ___
Via: __
Idade na infeco: ______ Data da infeco: _______
dpi Hem (cm) c1 c2 c3 c4 c5 c6 c7 c8 c9 c10
Hematcrito Total (cm) %
Leuc. 103/ml Linf
Contagem leucocitria percentual Neu Mon Eo Bas Total
350
Coleta de dados para contagem leucocitria percentual
Cdgo: ____ T. cruzi: ____
Gaiola: ___ Cepa: ____ Cepa: ____ Idade na infeco: Data da infeco: _______ _______
Exp.: ______ Sexo: ______ Inculo: _____ Via: ___
L: linfcitos; N: neutrfilos; M: moncitos; EB: eosinfilos + basfilos
____ dpi L N M EB L N M EB L N M EB
___ dpi
____ dpi
____ dpi L
____ dpi N M EB
EB
c1
c2
351
c3
c4
c5
c6
c7
c8
c9
c10
Anexos
Coleta de dados de evoluo ponderal
Cdgo: ____ T. cruzi: ____
Gaiola: ____ Cepa: _____ Cepa: _____ Idade na infeco: Data da infeco: _______ _______
dpi
dia ms
dia sem
c1
352
c2
c3
c4
c5
c6
c7
c8
c9
c10
mdia
desvio
Coleta de dados de parasitemia pelo mtodo Pizzi-Brener
Cdgo: _____ T. cruzi: _____
Microscpio: _____; fator multiplicador para no de parasitas/campo (cp): ___ x 104 par/ml; diluio: _____
____ dpi
xf 104 p/ml 104 p/ml no par par/cp x dil xf par/cp x dil no cps no par no cps
____ dpi
____ dpi
xf 104 p/ml
no par
no cps par/cp
x dil
c1
353
c2
c3
c4
c5
c6
c7
c8
c9
c10
mdia
Anexos
desvio
Coleta de dados de parasitemia usando cmara de Neubauer
Cdgo: _____ T. cruzi: _____
q: quadrante ____ dpi

mdia
104 p/ml 104 p/ml
____ dpi
xdil 1q 2q 3q 4q mdia xdil 1q 2q 3q
____ dpi
4q mdia xdil
104 p/ml
1q
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Coleta de dados de mortalidade
Cdgo: _____ T. cruzi: _____
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%CM
Anexos
Legislao sobre uso de Animais de Laboratrio

Antecedentes histricos
O uso de modelos animais em pesquisas vem sendo feito desde a antigidade (Goldim & Raymundo, 1997), de Pitgoras (582-500 aC) a Galeno (129-210 dC). A primeira pesquisa a usar sistematicamente animais talvez tenha sido a publicada por William Harvey em 1638, sobre a rede circulatria e seu funcionamento. Quando Darwin publicou A Origem das Espcies em 1859, estabeleceu os pressupostos do vnculo existente entre as diferentes espcies animais num nico processo evolutivo e, desta forma, possibilitou a extrapolao dos dados obtidos em pesquisas com modelos animais para seres humanos. A primeira lei a regulamentar o uso de animais em pesquisa foi proposta no Reino Unido, em 1876, atravs do British Cruelty to Animal Act. No sec. XIX tambm surgiram as primeiras sociedades protetoras dos animais, na Europa e nos estados Unidos. A primeira publicao norte-americana sobre aspectos ticos da utilizao de animais em experimentao foi proposta pela Associao Mdica Americana em 1909, mesmo ano da descoberta da doena de Chagas. Durante muitos anos as pesquisas que se utilizaram de modelos animais no foram fortemente questionadas devido ao seu alto impacto social, tais como as que possibilitaram o desenvolvimento das vacinas para raiva, ttano e difteria. Por outro lado, neste mesmo perodo surgiram inmeras sociedades de proteo aos animais. No Brasil, o decreto n. 24.645 de 10 de julho de 1934, definiu regras de proteo aos animais. Em 1959, o zoologista William Russell e o microbiologista Rex Burch publicaram um livro, onde estabeleceram os trs Rs da pesquisa em animais: Replace, Reduce e Refine. Esta proposta no impede a utilizao de modelos animais em experimentao, mas faz uma adequao no sentido de humaniz-la. A substituio dos animais (replace) por outros mtodos alternativos, tais como: testes in vitro, modelos matemticos, simulaes por computador, deve ser estimulada. O estabelecimento de alternativas de modelos no-animais para experimentao e utilizao em testes clnicos deve atender a duas importantes exigncias: (1) o risco de um teste no-animal, se utilizado como rotina, deve ser igual ou inferior ao gerado pelo teste em animais, j em uso corrente, principalmente no que se refere a taxa de resultados falsos negativos; (2) o novo procedimento deve aumentar a eficincia do teste atualmente utilizado. As justificativas empregadas por vrios autores para a reduo de pesquisas cientficas em animais (reduce) envolvem questes ticas e morais; de compaixo; de conservao ambiental; de natureza cientfica, econmica, poltica e at mesmo as requeridas por lei. A reduo do nmero de animais utilizados, acompanhada pelo aumento da qualidade do tratamento estatstico dado para pequenas amostras, pode ser uma importante alternativa. O refinamento das tcnicas utilizadas (refine) tem por objetivo minimizar a dor e o sofrimento nos experimentos em animais. Estes procedimentos incluem cuidados de analgesia e assepsia nos perodos pr, trans e ps-operatrio. Podemos incluir tambm neste item as questes metodolgicas e estatsticas que permitem analisar dados obtidos em amostras progressivamente menores. Em 1978 a UNESCO estabeleceu a Declarao Universal dos Direitos dos Animais, documento no qual esto lanados os grandes temas de discusso sobre este assunto. No Brasil, a lei 6.638, de 08 de maio de 1979, estabeleceu as normas para a prtica didtico-cientfica da vivisseco de animais. Estas normas, que nunca foram regulamentadas, estipulam que somente estabelecimentos de terceiro grau podem realizar atividades didticas com animais. Esta lei estabelece que as pesquisas devem ser realizadas sempre dentro do critrio de no causar sofrimento nos animais envolvidos. As Normas de Pesquisa em Sade (Resoluo CNS 01/88), que vigoraram no Brasil de 1988 at outubro de 1996, e propunham que deveriam ser utilizados um mnimo de animais com um mximo de informaes. Nas novas Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Resoluo CNS196/96) esta colocao no foi mantida e a questo dos animais foi omitida, exceto quanto a sua necessidade prvia a realizao de testes em seres humanos. Durante a dcada de 80, alguns movimentos de defesa dos direitos dos animais, especialmente na Inglaterra,
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Anexos
praticaram atentados contra laboratrios, biotrios, instalaes universitrias e at mesmo contra residncias de pesquisadores. Estas aes atingiram tal magnitude, que a Associao Mundial de Medicina publicou uma declarao especfica sobre a necessidade de serem estabelecidas garantias de vida para os pesquisadores e seus familiares. Em 1986, a lei inglesa foi atualizada, porm preservando todo o seu corpo doutrinrio. Foram publicadas novas normas tcnicas para os procedimentos que envolvam animais em projetos de pesquisa. Em 1996 foram apresentados no Brasil vrios projetos de lei estabelecendo novas normas para as pesquisas com animais, sem que qualquer um deles tenha sido aprovado, at o presente momento.
GOLDIM, J.R. & RAYMUNDO, M.M. Pesquisa em Sade e os Direitos dos Animais. 2 ed. Porto Alegre: HCPA, 1997.
Legislao brasileira
a. Decreto no 24.645 de 10 de julho de 1934: proteo aos animais (em vigor) b. Lei no 6638, de 8 de maio de 1979: vivisseco de animais (em vigor) c. Substitutivo do COBEA ao Projeto de Lei no 1.153/95: animais para atividades de ensino e pesquisa Decreto n o 24.645 de 10 de Julho de 1934 O chefe do Governo Provisrio da Repblica dos Estados Unidos do Brasil, usando das atribuies que lhe confere o art. 1o do dec. n. 19.398, de 11 de novembro de 1930. Decreta: Art. 1. Todos os animais existentes no Pas so tutelados ao Estado. Art. 2. Aquele que, em lugar pblico ou privado, aplicar ou fazer aplicar maus tratos aos animais, incorrer em multa de 20$000 a 50$000 e na pena de priso celular de 2 a 15 dias, quer o delinqente seja ou no o respectivo proprietrio, sem prejuzo da ao civil que possa caber. Par. 1. A critrio da autoridade que verificar a infrao da presente lei, ser imposto qualquer das penalidades acima estatudas, ou ambas. Par. 2. A pena de aplicar depender da gravidade do delito, a juzo da autoridade. Par. 3. Os animais sero assistidos em juzo pelos representantes do Ministrio Pblico, seus substitutos legais e pelos membros das sociedades protetoras de animais. Art. 3. Consideram-se maus tratos: 1. Praticar ato de abuso ou crueldade em qualquer animal; 2. Manter animais em lugares anti-higinicos ou que lhes impeam a respirao, o movimento ou o descanso, ou os privem de ar ou luz; 3. Obrigar os animais a trabalhos excessivos ou superiores as suas foras e a todo o ato que resulte em sofrimento para deles obter esforos que, razoavelmente, no se lhes possam exigir seno com castigo; 4. Golpear, ferir ou mutilar voluntariamente, qualquer rgo ou tecido de economia, exceto a castrao, s para animais domsticos, ou operaes outras praticadas em benefcio exclusivo do animal e as exigidas para defesa do homem, ou no interesse da cincia; 5. Abandonar animal doente, ferido, extenuado ou mutilado, bem como deixar de ministrar-lhes tudo o que humanitariamente se lhe possa prover, inclusive assistncia veterinria; 6. No dar morte rpida, livre de sofrimentos prolongados, a todo animal cujo extermnio seja necessrio para consumo ou no; 7. Abater para o consumo ou fazer trabalhar os animais em perodo adiantado de gestao;
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8. Atrelar, no mesmo veculo, instrumento agrcola ou industrial, bovinos com eqinos, com muares ou com asininos, sendo somente permitido o trabalho em conjunto a animais da mesma espcie; 9. Atrelar animal a veculos sem os apetrechos indispensveis como seja balancins, ganchos e lanas ou com arreios incompletos, incmodos ou em mau estado, ou com acrscimo de acessrios que os molestem ou lhes perturbem o funcionamento do organismo; 10. Utilizar, em servio, animal cego, ferido, enfermo, fraco, extenuado ou desferrado, sendo que este ltimo caso somente se aplica localidade com ruas caladas; 11. Aoitar, golpear ou castigar por qualquer forma a um animal cado sob o veculo ou com ele, devendo o condutor desprend-lo do tiro para levantar-se; 12. Descer ladeiras com veculos de trao animal sem utilizao das respectivas travas, cujo uso obrigatrio; 13. Deixar de revestir com couro ou material com idntica qualidade as correntes atreladas aos animais de tiro; 14. Conduzir veculo de trao animal, dirigido por condutor sentado, sem que o mesmo tenha bolia e arreios apropriados, com tesouras, pontas de guias e retranca; 15. Prender animais atrs dos veculos ou atados s caudas de outros; 16. Fazer viajar um animal a p, mais de 10 quilmetros, sem lhe dar descanso, ou trabalhar mais de seis horas contnuas sem lhe dar gua e alimento; 17. Conservar animais embarcados por mais de 12 horas, sem gua e alimento, devendo as empresas de transporte providenciar, sobre as necessrias modificaes no seu material, dentro de 12 meses a partir da publicao desta lei; 18. Conduzir animais, por qualquer meio de locomoo, colocados de cabea para baixo, de mos ou ps atados, ou de qualquer outro modo que lhes produza sofrimento; 19. Transportar animais em cestos, gaiolas ou veculos sem as propores necessrias ao seu tamanho e nmero de cabeas, e sem que o meio de conduo em que esto encerrados esteja protegido por uma rede metlica ou idntica que impea a sada de qualquer membro do animal; 20. Encerrar em curral ou outros lugares, animais em nmero tal que no lhes seja possvel mover-se livremente, ou deix-los sem gua e alimentos mais de 12 horas; 21. Deixar sem ordenhar as vacas por mais de 24 horas, quando utilizadas na explorao do leite; 22. Ter animais encerrados juntamente com outros que os aterrorizem ou molestem; 23. Ter animais destinados venda em locais que no renam as condies de higiene e comodidades relativas; 24. Expor, nos mercados e outros locais de venda, por mais de 12 horas, aves em gaiolas, sem que se faa nestas a devida limpeza e renovao de gua e alimentos; 25. Engordar aves mecanicamente; 26. Despelar ou depenar animais vivos ou entreg-los vivos a alimentao de outros; 27. Ministrar ensino a animais com maus tratos fsicos; 28. Exercitar tiro ao alvo sobre patos ou qualquer animal selvagem, exceto sobre os pombos, nas sociedades de caa, inscritos no Servio de Caa e Pesca; 29. Realizar, ou promover lutas entre animais da mesma espcie ou de espcie diferente, tourada e simulacros de touradas, ainda mesmo que em lugar privado; 30. Arrojar aves e outros animais nas casas de espetculo e exibi-los, para tirar sortes ou realizar acrobacias; 31. Transportar, negociar ou caar, em qualquer poca do ano, aves insetvoras, pssaros canoros, beijaflores e outras aves de pequeno porte, exceo feita das autorizaes para fins cientficos, consignados em lei anterior; Art. 4. S permitida atrao animal de veculo ou instrumento agrcola e industrial, por animais de espcies eqina, bovina, muar e asinina. Art. 5. Nos veculos de duas rodas de trao animal obrigatrio uso de escora ou suporte fixado por dobradia, tanto na parte dianteira como na traseira, de forma a evitar que, quando o veculo esteja parado, o peso da carga
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Anexos
recaia sobre o animal e tambm para os efeitos em sentido contrrio, quando o peso da carga for na parte traseira de veculo. Art. 6. Nas cidades e povoados os veculos trao animal tero tmpano ou outros sinais de alarme, acionveis pelo condutor, sendo proibido o uso de guizos, chocalhos ou campainhas ligadas aos arreios ou aos veculos para produzirem rudo constante. Art. 7. A carga, por veculo, para um determinado nmero de animais dever ser fixada pelas municipalidades, obedecendo sempre ao estado das vias pblicas, declives das mesmas, peso e espcie de veculo, fazendo constar nas respectivas licenas a tara e a carga til. Art. 8. Considerando-se castigos violentos, sujeitos ao dobro das pessoas cominadas na presente lei, castigar o animal na cabea, baixo-ventre ou pernas. Art. 9. Tornar-se- efetiva a penalidade, em qualquer caso, sem prejuzo de fazer cessar o mau trato custa dos declarados responsveis. Art. 10. So solidariamente passveis de multa e priso os proprietrios de animais e os que tenham sob sua guarda ou uso, desde que consistam a seus prepostos atos no permitidos na presente lei. Art. 11. Em qualquer caso ser legtima, para garantia da cobrana da multa ou multas, a apreenso do animal ou do veculo, ou de ambos. Art. 12. As penas pecunirias sero aplicadas pela polcia ou autoridades judicirias. Art. 13. As penas desta lei aplicar-se-o a todos que infringirem maus tratos ou eliminar um animal, sem provar que foi por este acometido ou que se trata de animal feroz ou atacado de molstia perigosa. Art. 14. A autoridade que tomar conhecimento de qualquer infrao desta lei poder ordenar o confisco do animal ou animais nos casos de reincidncia. Par. 1. O animal aprendido, se prprio para o consumo, ser entregue a instituies de beneficncia, e, em caso contrrio, ser promovida a sua venda em benefcio de instituies de assistncia social. Par. 2. Se o animal apreendido estiver imprprio para o consumo, e estiver em condies de no mais prestar servios, ser abatido. Art. 15. Em todos os casos de reincidncia ou quando os maus tratos venham a determinar a morte do animal, ou produzir mutilaes de qualquer de seus rgos ou membros, tanto a pena de multa como a de priso sero aplicadas em dobro. Art. 16. As autoridades federais, estaduais e municipais prestaro aos membros das sociedades protetoras de animais a cooperao necessria para fazer cumprir a presente lei. Art. 17. A palavra animal, da presente lei, compreende todo ser irracional, quadrpede ou bpede, domstico ou selvagem, exceto os daninhos. Art. 18. A presente lei entrar em vigor imediatamente, independente de regulamentao. Art. 19. Revogam-se as disposies em contrrio.
Lei n. 6.638, de 08 de Maio de 1979. Estabelece normas para a prtica Didtico-Cientfico da vivisseco de animais e determina outras providncias. Art. 1 - Fica permitida, em todo o territrio nacional, a vivisseco de animais, nos termos desta Lei. Art. 2 - Os biotrios e os centros de experincias e demonstraes com animais vivos devero ser registrados em rgo competente e por ele autorizados a funcionar. Art. 3. - A vivisseco no ser permitida:
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1. Sem o emprego de anestesia; 2. Em centros de pesquisas e estudos no registrados em rgo competente; 3. Sem a superviso de tcnico especializado; 4. Com animais que no tenham permanecido mais de quinze dias em biotrios legalmente autorizados; 5. Em estabelecimento de ensino de primeiro e segundo graus e em quaisquer locais freqentados por menores de idade. Art. 4. - O animal s poder ser submetido s intervenes recomendadas nos protocolos das experincias que constituem a pesquisa ou os programas de aprendizado cirrgico quando, durante ou aps a vivisseco, receber cuidados especiais. 1. Quando houver indicao, o animal poder ser sacrificado sob estrita obedincia s prescries cientficas. 2. Caso no sejam sacrificados, os animais utilizados em experincia ou demonstraes somente podero sair do biotrio trinta dias aps a interveno, desde que destinados a pessoas ou entidades idneas que por eles queiram responsabilizar-se. Art. 5. - Os infratores esto sujeitos: 1. s penalidades cominadas no artigo 64, caput, do Decreto-Lei n 3.688 de 03.10.1941, no caso de ser a primeira infrao; 2. interdio e cancelamento do registro do biotrio ou do centro de pesquisa, no caso de reincidncia. Art. 6. - O poder Executivo, no prazo de noventa dias, regulamentar a presente Lei, especificando: 1. O rgo competente para o registro e a expedio de autorizao dos biotrios e centros de experincias e demonstrao com animais vivos; 2. As condies gerais exigveis para o registro e o funcionamento dos biotrios; III - rgo e autoridades competentes para a fiscalizao dos biotrios e centros mencionados no inciso I. Art. 7. - Esta Lei entrar em vigor na data publicada. Art. 8. - Revogam-se as disposies em contrrio.
Assinado: Joo Figueiredo, Petrnio Portella, E. Portella e Ernani Guilherme Fernandes da Motta
Substitutivo ao Projeto de Lei n. 1.153/95 a. Decreto no 24.645 de 10 de julho de 1934: proteo aos animais b. Lei no 6638 de 8 de maio de 1979: vivisseco de animais c. Substitutivo ao Projeto de Lei no 1.153/95: dispe sobre a criao e o uso de animais para atividades de ensino e pesquisa. Esta verso (segundo Boletim Informativo no1 de julho 1996 do Colgio Brasileiro de Experimentao Animal, Cobea), do Anteprojeto de Lei sobre o uso de animais de laboratrio no ensino e na pesquisa, foi encaminhada ao Ministrio de Cincia e Tecnologia, visando a sua tramitao no Congresso Nacional, atravs do Poder Executivo.
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Anexos
O Congresso Nacional Decreta

CAPTULO I
Das Condies de Criao e Uso de Animais para Ensino e Pesquisa Cientfica Art. 1. - Esta Lei, com fundamento nos artigos 611, lI, alnea e, 218, 1 e 225, 1., Vll da Constituio da Repblica Federativa do Brasil, estabelece critrios para a criao e o uso de animais em atividades de ensino e pesquisa, de forma a assegurar-lhes tratamento humanitrio. Art. 2. - A criao e utilizao de animais para ensino e pesquisa cientfica, em todo o territrio nacional, regulada nos termos e condies estabelecidos nesta Lei e nos regulamentos dela decorrentes. 1. - A utilizao de animais em atividades de ensino fica restrita a estabelecimentos de ensino superior ou tcnico de 2o grau. 2. - Para os fins desta Lei, so consideradas como atividades de pesquisa todas aquelas relacionadas com cincia bsica, cincia aplicada, desenvolvimento tecnolgico, produo e controle da qualidade de drogas, medicamentos, alimentos, imunobiolgicos, instrumentos, ou quaisquer outros testados em animais, conforme definido em regulamento prprio. 3. - No so consideradas como atividades de pesquisa as prticas zootcnicas relacionadas agropecuria. Art. 3. - O disposto nesta Lei aplica-se aos animais das espcies classificadas como Filo Chordata, Subfilo Vertebrata. Art. 4. - Para as finalidades desta lei entende-se por: I. Filo Chordata - animais que possuem como caractersticas exclusivas um eixo dorsal de sustentao, um sistema respiratrio derivado da faringe e um sistema nervoso tubular oco e dorsal. Apresentam ainda um corao localizado ventralmente em relao ao tubo digestivo e uma regio ps-anal, sem vsceras, a cauda. II. Subfilo Vertebrata - animais que possuem notocorda na fase embrionria, substituda gradativamente pela coluna vertebral cartilaginosa ou ssea. Possuem encfalo e esqueleto interno cartilaginoso ou sseo. III. Cincia bsica - domnio do saber cientfico cujas prioridades residem na expanso das fronteiras do conhecimento, independente de suas aplicaes. IV. Cincia aplicada - domnio do saber cientfico cujas prioridades residem no atendimento das necessidades impostas pelo desenvolvimento social, econmico e tecnolgico. V. lmunobiolgicos - derivados biolgicos destinados a imunizaes ou reaes imunitrias. VI. Experimentos - procedimentos efetuados em animais vivos visando elucidar fenmenos fisiolgicos ou patolgicos, obedecendo a tcnicas especficas e preestabelecidas. VII. Eutansia - prtica que acarreta a morte do animal, sem provocar dor ou ansiedade, visando evitar sofrimento, obedecendo a tcnicas especficas e preestabelecidas. VIII. Centro de criao - local onde so mantidos os reprodutores das diversas espcies animais, dentro de padres genticos e sanitrios preestabelecidos, com a finalidade de pesquisa e/ou ensino. IX. Biotrio - local dotado de caractersticas prprias onde so criados e/ou mantidos animais de qualquer espcie, eleita como modelo, destinados ao campo da cincia e tecnologia voltadas sade humana e animal. X. Laboratrio de experimentao animal - local provido de condies ambientais adequadas bem como de equipamentos e materiais indispensveis realizao de experimentos em animais, que no podem ser deslocados para um biotrio de experimentao. Art. 5. - A criao ou a utilizao de animais para ensino e/ou pesquisa ficam restritas, exclusivamente, s instituies credenciadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA). Art. 6. - Qualquer instituio cientfica ou empresa legalmente estabelecida em territrio nacional que crie ou utilize animais para ensino ou pesquisa dever requerer credenciamento, junto ao CONCEA, para uso de animais, nas seguintes condies:
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I. Satisfazer, no que couber, as exigncias estabelecidas pelo CONCEA nos termos desta Lei. II. Criar Comisso de tica no Uso de Animais (CEUA). 1. - A critrio da instituio e mediante autorizao do CONCEA admitida a criao de mais de uma CEUA por instituio. 2. - Quando se configurar a hiptese prevista no pargrafo anterior, cada CEUA definir os laboratrios de experimentao animal, biotrios e/ou centros de criao sob seu controle. Art. 7. - O animal s poder ser submetido s intervenes recomendadas nos protocolos dos experimentos que constitui a pesquisa ou programa de aprendizado, quando durante e aps o experimento receber cuidados especiais, conforme estabelecido pelo CONCEA. 1. - Encerrado o experimento, ou verificado, em qualquer fase do mesmo, sofrimento intenso do animal, este ser submetido eutansia, sob estrita obedincia s prescries pertinentes a cada espcie, preferencialmente com aplicao de dose letal de substncia depressora do sistema nervoso central. 2. - Excepcionalmente, os animais utilizados em experincias ou demonstraes no sero submetidos eutansia e podero sair do biotrio aps a interveno, ouvida a respectiva CEUA quanto aos critrios de segurana, desde que destinados a pessoas idneas, ou entidades protetoras de animais devidamente legalizadas, que por eles queiram responsabilizar-se. 3. - Sempre que possvel as prticas de ensino devero ser fotografadas, filmadas ou gravadas, de forma a permitir sua reproduo para ilustrao de prticas futuras, evitando-se a repetio desnecessria de procedimentos didticos com animais. 4. - Os projetos de pesquisa devem demonstrar a provvel relevncia de seus resultados para o progresso da cincia e indicar a inexistncia de mtodos alternativos capazes de levar ao mesmo resultado. 5. - O nmero de animais a ser utilizado para a execuo de um projeto e o tempo de durao de cada experimento ser o mnimo indispensvel para produzir o resultado conclusivo, poupando-se, ao mximo, o animal de sofrimento. 6. - Experimentos que possam causar dor ou angstia desenvolver-se-o sob sedao, analgesia, ou anestesia adequadas. 7. - vedado o uso de bloqueadores neuromusculares em substituio a substncias sedativas, analgsicas ou anestsicas, ou de relaxantes musculares em substituio a substncias anestsicas. 8. - vedada a reutilizao do mesmo animal depois de alcanado o objetivo principal do projeto de pesquisa. 9. - Num programa de ensino, vrios procedimentos podero ser realizados num mesmo animal, desde que todos sejam executados durante a vigncia de um nico perodo anestsico e que o animal seja sacrificado antes de recobrar a conscincia. 10. - Para a realizao de trabalhos de criao e experimentao de animais em sistemas fechados, sero consideradas as condies e normas de segurana recomendadas pela Organizao Mundial da Sade e/ou Organizao Pan-Americana da Sade. Art. 8. - O CONCEA, levando em conta a relao entre o nvel de sofrimento para o animal e os resultados prticos que se espera obter, poder restringir ou proibir experimentos que importem em elevado grau de agresso contra os animais. Art. 9. - Todo projeto de pesquisa cientfica ou atividade de ensino sero supervisionados por profissional de nvel superior, graduado, ou ps-graduado na rea biomdica, vinculado entidade de ensino ou pesquisa credenciada pelo CONCEA.
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Anexos
CAPTULO II
Do Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA) Art. 10. - Fica criado, na estrutura bsica do Ministrio da Cincia e Tecnologia, o Conselho Nacional de Controle de Experimentao Animal (CONCEA). Art. 11. - Compete ao CONCEA: I. Expedir e fazer cumprir normas relativas a utilizao humanitria de animais com finalidade de ensino e pesquisa cientfica; II. Licenciar as atividades destinadas ao ensino e pesquisa cientfica tratadas nesta Lei; III. Monitorar e avaliar a introduo de tcnicas alternativas que substituam a utilizao de animais em ensino e pesquisa; IV. Estabelecer e rever, periodicamente, as normas para o uso e cuidados com animais para ensino e pesquisa, em consonncia com as convenes internacionais das quais o Brasil seja signatrio; V. Estabelecer e rever, periodicamente, normas tcnicas para instalao e funcionamento de centros de criao, de biotrios e de laboratrios de experimentao animal, bem como sobre as condies de trabalho em tais instalaes; VI. Estabelecer e rever, periodicamente, normas para credenciamento de instituies que criem ou utilizem animais para ensino e pesquisa; VII. Manter cadastro atualizado dos procedimentos de ensino ou pesquisa realizados, ou em andamento no pas, assim como dos pesquisadores, a partir de informaes remetidas pelas CEUAS; VIII. Apreciar e decidir recursos interpostos contra decises de rgos que lhe sejam subordinados; IX. Elaborar e submeter ao ministro da Cincia e Tecnologia, para aprovao, o seu regimento interno; X. Assessorar o Poder Executivo naquilo que diga respeito s atividades de ensino e pesquisa tratadas nesta lei. Art. 12. - O CONCEA constitudo por: I. Plenrio; II. Cmaras Permanentes e Temporrias; III. Secretaria Executiva. 1. - So Cmaras Permanentes do CONCEA a de tica, a de Legislao e Normas e a Tcnica. 2. - A Secretaria Executiva responsvel pelo expediente do CONCEA e ter o apoio da administrao do Ministrio da Cincia e Tecnologia, conforme determinao ministerial. 3. - O CONCEA poder valer-se de consultores ad-hoc de reconhecida competncia tcnica e cientfica, para instruir quaisquer processos de sua pauta de trabalhos. Art. 13. - O CONCEA integrado por: I. O Ministro de Estado da Cincia e Tecnologia, que ser seu Presidente; II. Dois representantes do Ministrio da Cincia e Tecnologia; III. Um representante do Ministrio da Educao; IV. Um representante do Ministrio do Meio Ambiente, dos Recursos Hdricos e da Amaznia Legal; V. Um representante do Ministrio da Sade; VI. Um representante do Ministrio da Agricultura; VIl. Um representante da Academia Brasileira de Cincias; VIII. Um representante da Sociedade Brasileira para o Progresso da Cincia; IX. Um representante da Federao das Sociedades de Biologia Experimental; X. Um representante do Colgio Brasileiro de Experimentao Animal; XI. Dois representantes das Sociedades Protetoras de Animais legalmente estabelecidas no pas; XII. Um representante da Federao Nacional da Indstria Farmacutica. 1. - de quatro anos o mandato dos membros relacionados nos incisos VIl a XII. 2. - Os membros referidos nos incisos lI a Xll sero indicados pelos seus rgos especficos, juntamente com seus respectivos suplentes, e designados por ato do Ministrio de Estado da Cincia e Tecnologia.
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3. - Os membros referidos nos incisos lI, lll, IV, V, VIl, VlIl e IX devem ser profissionais ativos na rea das cincias biolgicas. 4. - Os membros referidos nos incisos VI e X devero ser, obrigatoriamente, mdicos veterinrios. 5. - O mandato de conselheiro gratuito e se constitui em relevante servio pblico, sendo prioritrio sobre qualquer outra atividade. Art. 14. - O CONCEA, mediante Resoluo, determinar s agncias de amparo ou fomento pesquisa cientfica o no-financiamento de projetos: I. realizados em instituies por ele no credenciadas; II. realizados sem a aprovao da Comisso de tica no Uso de Animais (CEUA), mencionada no artigo 6. desta Lei; III. cuja realizao tenha sido suspensa pela CEUA. Art. 15. - O CONCEA, atravs de Resoluo, recomendar aos peridicos cientficos nacionais que no publiquem os resultados de projetos: I. realizados em instituies por ele no credenciadas; II. realizados sem a aprovao da CEUA; III. cuja realizao tenha sido suspensa pela CEUA. Art. 16. - As organizaes pblicas e privadas, nacionais, estrangeiras ou internacionais, financiadoras ou patrocinadoras de atividades previstas nesta Lei, devero certificar-se da idoneidade tcnico-cientfica e da plena adeso dos entes financiados, patrocinados ou contratados s normas e mecanismos de salvaguardas previstos nesta Lei, sob pena de tornarem-se co-responsveis pelos eventuais efeitos advindos de seu descumprimento.
CAPTULO III
Das Comisses de tica no Uso de Animais (CEUA) Art. 17. - condio indispensvel para o licenciamento das atividades de ensino e pesquisa com animais, a constituio prvia de Comisso de tica no Uso de Animais (CEUA). Art. 18. - As Comisses de tica no Uso de Animais so constitudas por: I. um mdico veterinrio, no mnimo; II. um representante de sociedades protetoras de animais legalmente estabelecidas no pas; III. composio majoritria de docentes e pesquisadores na rea especfica. Pargrafo nico. A falta do representante referido no inciso II no impede a constituio ou o funcionamento da CEUA. Art. 19. - Compete Comisso de tica no Uso de Animais: I. cumprir e fazer cumprir, nos limites de suas atribuies, o disposto nesta Lei e nas demais aplicveis utilizao de animais para ensino ou pesquisa, especialmente nas Resolues do CONCEA; II. examinar previamente os procedimentos de ensino ou pesquisa a serem realizados na instituio s quais estejam vinculadas para determinar sua compatibilidade com a legislao aplicvel; III. manter cadastro atualizado dos procedimentos de ensino ou pesquisa realizados, ou em andamento, na instituio, enviando cpia ao CONCEA; IV. manter cadastro dos pesquisadores que realizam procedimentos de ensino ou pesquisa, enviando cpia ao CONCEA; V. expedir, no mbito de suas atribuies, certificados que se fizerem necessrios junto a rgos de financiamento de pesquisa, peridicos cientficos ou outros;
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Anexos
VI. notificar imediatamente ao CONCEA e s autoridades sanitrias a ocorrncia de qualquer acidente, fornecendo informaes que permitam aes saneadoras. 1. - Constatado qualquer procedimento fora dos limites desta Lei, na execuo de uma atividade de ensino ou pesquisa, a respectiva CEUA determinar a paralisao de sua execuo, at que a irregularidade seja sanada, sem prejuzo de outras medidas cabveis. A omisso da CEUA acarretar sanes a instituio, nos termos dos artigos 20, 21 e 22. 2. - Das decises proferidas pela CEUA cabe recurso, sem efeito suspensivo, ao CONCEA. 3. - Os membros da CEUA respondero pelos prejuzos que, por dolo, causarem s pesquisas em andamento. 4. - Os membros da CEUA esto obrigados a resguardar o segredo industrial, desde que o mesmo seja compatvel com a presente Lei, sob pena e responsabilidade.
CAPTULO IV
Das Penalidades Art. 20. - As instituies que executem atividades reguladas por esta Lei esto sujeitas, em caso de transgresso ao disposto nesta Lei e em seus regulamentos, s penalidades administrativas de: I. Advertncia; II. Multa diria; III. Interdio temporria; IV. Suspenso de financiamentos provenientes de fontes oficiais de crdito e fomento cientfico; V. Interdio definitiva. Pargrafo nico - A interdio por prazo superior a 30 dias somente poder ser determinada por ato do Ministro de Estado de Cincia e Tecnologia. Art. 21. - Qualquer pessoa que execute, de forma indevida, atividades reguladas por esta Lei, ou participe de procedimentos no autorizados pelo CONCEA, ser passvel das seguintes penalidades administrativas: I. Advertncia; II. Multa diria; III. Suspenso temporria; IV. Interdio definitiva para o exerccio da atividade regulada nesta Lei. Art. 22. - As sanes disciplinares previstas nos artigos 20 e 21 sero aplicadas pelo CONCEA, sem prejuzo da responsabilidade penal cabvel, em especial aquela prevista no artigo 31 do Cdigo de Contravenes Penais, bem como o do artigo 64, caput, da Lei n 3.688, de 3 de outubro de 1941.
CAPTULO V
Das Disposies Gerais e Transitrias Art. 23. - A fiscalizao das atividades reguladas por esta lei fica a cargo dos rgos Competentes dos Ministrios da Agricultura, Sade e do Meio Ambiente, Recursos Hdricos e Amaznia Legal. Art. 24. - Qualquer pessoa que, por ao ou omisso, interferir nos centros de criao, biotrios e/ou laboratrios de experimentao animal de forma a colocar em risco a sade pblica e/ou o meio ambiente estar sujeita responsabilidade penal prevista no Art. 22 desta lei. Art 25. - As instituies que criem ou utilizem animais para ensino ou pesquisa existentes no pas antes da data de vigncia desta Lei devero adotar as seguintes providncias:
365
I. criao da Comisso de tica no Uso de Animais no prazo mximo de 90 (noventa) dias aps a regulamentao referida no Art. 27; II. compatibilizao total de suas instalaes fsicas no prazo mximo de 5 (cinco) anos, a partir da entrada em vigor das normas tcnicas estabelecias pelo CONCEA com base no Art. 11., inciso V, desta lei. Art 26. - Os recursos oramentrios necessrios criao e ao funcionamento do CONCEA sero previstos na dotao do Ministrio da Cincia e Tecnologia. Art. 27. - Esta Lei ser regulamentada no prazo de 180 (cento e oitenta) dias. Art. 28. - Esta lei entrar em vigor na data de sua publicao. Art. 29. - Revogam-se as disposies em contrrio, e, em especial, a Lei no 6.638, de 8 de maio de 1979.
366
Formato: 21 x 28 cm Tipologias: American garamond BT Bergell LET EnviroD Papel: Plen Bold 70 g/m2 (miolo) Carto Supremo 250 g/m2 (capa) Fotolitos: Laser vegetal (miolo) Engenho e Arte Editorao Grfica Ltda. (capa) Impresso e acabamento: Millennium Print Rio de Janeiro, abril de 2000. No encontrando nossos ttulos em livrarias, contactar a EDITORA FIOCRUZ: Rua Leopoldo Bulhes, 1.480, trreo - Manguinhos. Rio de Janeiro, RJ. CEP: 21041-210 Tel.: (21) 598-2701/598-2702. Telfax: (21) 598-2509. E-mail: editora@fiocruz.br
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Doena de chagas:

manual para experimentao animal

Tania C. Arajo-Jorge Solange L. de Castro (Orgs.)

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Parte II Protocolos e mtodos de trabalho em doena de Chagas experimental

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1.2.2 Estudos Analticos

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1.2.2.1 Estudos retrospectivos

1.2.2.2 Estudos prospectivos

1.2.2.3 Estudos seccionais

1.2.2.4 Estudos longitudinais

Desafios da pesquisa cientfica aps 90 anos da descoberta da doena de Chagas

Alguns modelos de estudos realizados

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2.1. O Barbeiro na Escala

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Dias aps a infeco

clulas B anticorpos especficos e lticos

---------------------------------------------------------------------Resposta Imune Resposta Imune Adquirida Inata ou Natural Componentes: Componentes:

Figura 1 Cinticadasrespostasimuneinataeadquiridaduranteainfeco por Trypanos oma cruzi , avaliadaapartir dadeteco daparasitemia

4. 1 . 1 Evoluo da Infeco no Stio de Inoculao

Resposta do hospedeiro infeco

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4. 1 .2 A Resposta Imune Inata

Resposta do hospedeiro infeco

macrfago macrfago residente residente

moncito IL1,TNF,IL6 PDGF,FGF clulas intersticiais do estroma

histamina, NO metablitos do c. araquidnico (PGs, LTD4, TXs,) PAF adenosina

IL-1 IL-6 TNF PGs MIF

IL-6, IL-1 TNF, LIF