Quim. Nova, Vol. 31, No. 7, 1755-1774, 2008 Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia em anlises farmacuticas Maria D. P. T.

Sotomayor Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, 14801-970 Araraquara SP, Brasil Iara Lcia T. Dias* e Marcos R. V. Lanza Curso de Farmcia, Universidade So Francisco, 12916-900 Bragana Paulista SP, Brasil Altair B. Moreira Departamento de Qumica e Cincias Ambientais, Universidade Estadual Paulista, 15054-000 So Jos do Rio Preto SP, Brasil Lauro T. Kubota Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, 13083-970 Campinas SP, Brasil Recebido em 20/10/06; aceito em 30/11/07; publicado na web em 4/9/08

APPLICATION AND ADVANCES IN THE LUMINESCENCE SPECTROSCOPY IN PHARMACEUTICAL ANALYSES. This paper provides a review on the latest advances and applications of the luminescence spectroscopy for the development of pharmaceuticals analyses methods, basically based on the photo- and chemiluminescence. The different forms of the drugs determination on pharmaceuticals through the fluorescence and chemiluminescence are discussed. The analyses include the drugs native fluorescence (liquid and solid-phases); the fluorescence from the oxidizing or reducing forms of the drug; the fluorescence from the chemical derivatization and their photochemistry and hydrolysis reactions. The quenching of luminescence and chemiluminescence generation for the pharmaceutical quantification are also shown. Finally, the trends and future perspectives of the luminescence spectroscopy in the field of the pharmaceutical research are discussed.

Keywords: luminescence spectroscopy; drugs; cosmetics analysis;

INTRODUO Devido ao progresso contnuo em tcnicas e instrumentos, a indstria farmacutica busca o emprego de metodologias que ofeream maior sensibilidade, seletividade, robustez, preciso, exatido e rapidez. Neste sentido, um grande nmero de equipamentos de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) com diversos tipos de deteco domina este ramo industrial. Contudo, o advento da sofisticao de instrumentao automatizada de espectrmetros de luminescncia poder resultar em um substancial aumento de aplicaes desta tcnica instrumental na indstria farmacutica, principalmente, no que se refere anlise diretamente na matriz do medicamento. A espectroscopia de luminescncia uma ferramenta analtica extremamente sensvel e tem sido amplamente aplicada na resoluo de problemas que requerem baixos limites de deteco, podendo ser facilmente encontrados na literatura muitos trabalhos mostrando anlises ao nvel de traos.1-6 A sensibilidade inerente a esta tcnica consideravelmente maior em comparao a outras metodologias, entre elas a espectrofotometria UV/visvel, apresentando limites de deteco de at trs ordens de grandeza menores, os quais normalmente se encontram na faixa de ng mL-1, sendo conseqncia do baixo sinal de fundo que as medidas fluorescentes apresentam. Diferentemente do que ocorre no fenmeno da luminescncia, nas medidas de absorbncia o sinal est associado atenuao da intensidade de um feixe de radiao por uma espcie absorvente. Nos casos onde a quantidade da espcie pequena, esta atenuao menor, tornando assim a deteco da espcie difcil. Outra caracterstica importante da luminescncia diz respeito seletividade, porque espcies com rendimentos qunticos de fluorescncia apreciveis so menos co*e-mail: iaratescarollo@terra.com.br

muns do que substncias cuja fluorescncia no pode ser detectada. Desta forma, molculas fluorescentes apresentam comprimento de onda caracterstico de excitao e/ou emisso. Adicionalmente, o comprimento de onda de excitao de molculas fluorescentes est localizado em uma faixa de comprimento de onda diferente do espectro de emisso.7 Outra vantagem que apresenta os mtodos luminescentes sua ampla faixa linear de resposta. Alm disso, a sensibilidade e seletividade oferecidas pela espectroscopia de luminescncia tm encontrado amplo uso na anlise de numerosos compostos de interesse farmacutico, biolgico, ambiental e industrial.8-10 A estas caractersticas devem ser adicionadas a simplicidade instrumental e o baixo custo de manuteno e anlise, quando comparados com outros mtodos analticos. Desta forma, medidas da intensidade luminescente tm permitido a determinao quantitativa seletiva e sensvel de uma variedade de princpios ativos de uso farmacutico. Contudo, apesar de todas as vantagens oferecidas pelos mtodos luminescentes, somente certas classes de substncias exibem luminescncia nativa, como conseqncia dos processos de desativao que ocorrem em uma molcula,11 alm disto, devem ser considerados os efeitos de espalhamento e reabsoro. Isto tem limitado o uso dos mtodos luminescentes quando comparados a outros mtodos analticos, como cromatografia e espectrometria UV/visvel. Apesar disto, muitas vezes possvel converter molculas no-fluorescentes em derivados fluorescentes usando reagentes especficos, ou aproveitar a fluorescncia de compostos que reagem quantitativamente com o analito de interesse, de tal forma que a quantificao indireta do analito possvel.12-17 Por outro lado, possvel aproveitar a versatilidade nos modos de amostragem e de softwares com mais recursos, oferecidos pelos atuais instrumentos disponveis no mercado, com os quais podem ser avaliadas novas tcnicas que antes eram difceis de serem aplicadas,

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tais como a espectroscopia de fluorescncia sincronizada de ngulo varivel para solues diludas; observao da fluorescncia frontal de solues turvas; anlise de amostras slidas, gis, filmes e pulverizadas, e at adaptada para o uso de fibras pticas18-22 para amostras fluorescentes contidas em lminas de cromatografia de camada delgada ou em placas contendo pequenas cavidades empregadas em testes imuno-enzimticos.8,23,24 Considerando-se a potencialidade de aplicao da espectroscopia de luminescncia na rea farmacutica, este artigo visa descrever os principais avanos alcanados, nos ltimos anos, na determinao de frmacos, principalmente em formulaes comerciais, no intuito de demonstrar o desenvolvimento e potencial que esta metodologia apresenta. PRINCPIOS BSICOS DA ESPECTROSCOPIA DE LUMINESCNCIA A luminescncia envolve vrios tipos de fenmenos pticos; os mais difundidos referem-se fluorescncia molecular, fosforescncia e quimiluminescncia.11 Contudo, cabe ressaltar que ainda existem a sonoluminescncia,25-28 a mecano- ou tribulominescncia,29-34 a radioluminescncia,35-38 a termoluminescncia,34,39,40 a bioluminescncia,41 entre outros. Nesta reviso, sero abordados trabalhos envolvendo a determinao de frmacos baseados em fenmenos fotoluminescentes e quimiluminescentes. Os mtodos baseados em fluorescncia e fosforescncia so aqueles nos quais a excitao da molcula conduzida pela absoro de ftons. Como conseqncia, os dois fenmenos so muitas vezes referidos e/ou classificados como mtodos fotoluminescentes. Neste caso, a molcula inicialmente excitada e promovida para um estado eletrnico de maior energia, cujo retorno ao estado fundamental acompanhado pela emisso de radiao eletromagntica (Figura 1S material suplementar). Contudo, importante salientar que a absoro do fton em fluorescncia e fosforescncia envolve transies eletrnicas diferentes. Como observado na Figura 1S, do material suplementar, a energia eletrnica responsvel pela transio fluorescente no envolve uma mudana no nmero quntico do spin do eltron, e passa do nvel S0 S1, emitindo radiao desde o nvel excitado S1 para algum dos nveis vibracionais do estado eletrnico S0. Como conseqncia, a fluorescncia possui tempos de vida extremamente curtos, com a luminescncia cessando quase que imediatamente, por volta de 10-9 a 10-6 s (ns a s). A fluorescncia emitida em comprimentos de onda maiores queles de excitao, deslocando-se entre 50 e 150 nm, quando comparado ao comprimento de onda da luz usado para a excitao da molcula.11,42,43 Por outro lado, uma mudana no numero quntico de spin do eltron acompanha as emisses fosforescentes, envolvendo transies proibidas de eltrons provenientes de um estado excitado tripleto (com spin diferente ao original) para um estado fundamental singleto (T1 S0). Como conseqncia, a radiao existe por um tempo no qual pode ser facilmente detectvel aps o trmino da irradiao, entre 10-4 e 10 s. Contudo, este tipo de transio menos provvel que a transio envolvendo dois estados singletos (fluorescncia), j que processos paralelos de desativao como a converso interna e externa, e o relaxamento vibracional, podem competir com ela (Figura 1S). Desta forma, a emisso de transies fosforescentes tem sido comumente observada apenas em baixas temperaturas, em meios altamente viscosos ou em molculas adsorvidas em superfcies slidas para introduzir rigidez ao sistema. Apesar das vantagens que possam ser enxergadas neste tipo de fotoluminescncia, no se deve esquecer a supresso da fosforescncia originada pelo oxignio molecular, o qual em seu estado fundamental

um tripleto (3) possuindo dois estados singletos conhecidos como oxignio 1 e oxignio 1, cujas energias de excitao so de aproximadamente 23 e 38 kcal mol-1, respectivamente.11 Assim, molculas excitadas, que possuam energia menor ou igual a 23 kcal mol-1, podem ter sua luminescncia suprimida atravs da transferncia de energia para o oxignio tripleto, produzindo o oxignio singleto (1). Contudo, apesar deste fenmeno de supresso ser muitas vezes indesejado, diversas tcnicas de supresso tm sido usadas como ferramentas para aplicaes nas reas de bioqumica e mdica.41,44 O terceiro tipo de luminescncia, a quimiluminescncia (Esquema 1), est baseada na emisso de luz de uma espcie excitada que gerada no curso de uma reao qumica, ao contrrio dos processos fotoluminescentes acima citados, onde a molcula emite luz aps absoro de ftons. Desde que a emisso gerada sem luz, nenhuma fonte ser usada durante a medida do sinal. Desta forma, quando usado um espectrmetro fluorescente convencional (Figura 1) a fonte de luz ser desligada durante a etapa de medida, para no interferir com o sinal de interesse. A quimiluminescncia caracterizada por sua alta sensibilidade, ampla faixa linear de resposta, ausncia de efeitos de espalhamento e simplicidade de instrumentao, tendo sido empregada na determinao de vrios frmacos importantes e de amplo uso.3,29

Esquema 1. Representao esquemtica da gerao de quimiluminescncia mostrando a emisso direta (a) onde a molcula excitada C* pode decair para o estado fundamental emitindo luz, e a emisso indireta (b) na qual a espcie excitada C* transfere energia para um aceptor D adequado, a partir do qual se origina a emisso. Na quimiluminescncia o processo de emisso de luz ocorre porque uma molcula excitada (aquela que emitir luz) formada em uma reao qumica

Figura 1. Representao esquemtica de um luminmetro tpico. A fluorescncia proveniente da amostra propagada em todas as direes, porm mais convenientemente observada em ngulos retos ao feixe de excitao, empregando arranjo ptico adequado de lentes e espelhos. Para uso em quimiluminescncia a fonte desligada e o sistema comporta-se basicamente como um fotmetro

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Sistemas quimiluminescentes como luminol,44-47 mtodos quimiluminescentes baseados no sistema perxi-oxalato47-49 e acridina,50 tm sido empregados na determinao de frmacos. O mecanismo da quimiluminescncia promovida pelo luminol mostrado no Esquema 2. Neste caso, o luminol (5-amino-2,3-diidroftalazina-1,4-diona) reage com perxido de hidrognio na presena de ons hidroxila e um catalisador para formar um intermedirio rico em energia (on aminoftalato excitado) com subseqente emisso de luz.50

Analogamente ao luminol, derivados da acridina reagem com perxido de hidrognio em solues alcalinas, produzindo intermedirios excitados, seguidos por luminescncia. Embora aplicaes na determinao de frmacos ainda no tenham sido devidamente exploradas, este tipo de reaes abre uma nova alternativa de aplicao. Em termos gerais, as medidas da intensidade fotoluminescente ou quimiluminescente permitem a determinao quantitativa seletiva e sensvel de uma variedade de espcies orgnicas e inorgnicas importantes, tais como princpios ativos de medicamentos e cosmticos, inclusive em nveis abaixo de 10-9 mol L-1. Atualmente, como esperado, o nmero de mtodos fluorimtricos descritos na literatura significativamente superior ao nmero de aplicaes de procedimentos fosforescentes e quimiluminescentes, prprio das caractersticas de cada um dos fenmenos luminescentes. APLICAO DA ESPECTROSCOPIA DE LUMINESCNCIA NO CAMPO FARMACUTICO A importncia do controle qumico de produtos farmacuticos como resultado do impacto na sade pblica e socioeconmica demanda mtodos analticos sensveis e confiveis. Adicionalmente a estas exigncias juntam-se aquelas que implicam o acompanhamento das anlises em larga escala com altas velocidades de amostragem. Nos ltimos anos, muitos grupos de pesquisas tm se dedicado ao desenvolvimento de novos mtodos analticos baseados na emisso de luminescncia, dentre eles a quimilumi-nescncia16,39,45,5557 e fluorescncia,1217,19-22,58135 no intuito de determinar diferentes frmacos em diversos tipos de preparaes farmacuticas. As metodologias variam desde o aproveitamento da fluorescncia nativa de alguns frmacos19,20,5874,80,110115,118122,124,125,129,133135 at o uso da quimiluminescncia induzida por diversos reagentes.16,39,45,5557 Determinao de medicamentos baseada na fluorescncia do princpio ativo A fluorescncia nativa tem sido explorada para a quantificao de frmacos em medicamentos; com base nisto, muitos trabalhos tm sido descritos na literatura.19,20,5874,80,110115,118122,124,125,129,133135 A Tabela 1 mostra os principais frmacos determinados atravs da fluorescncia nativa em soluo. A literatura destaca inmeras variaes das metodologias de anlise que repercutem no aumento da intensidade fluorescente da molcula do frmaco, dentre elas destacam-se o uso de meio orgnico,69,71,119,120 cido,65,68,69,7274,122,124 bsico,5961 e at meios micelares usando tensoativos.66,67 Por exemplo, Manzoori e colaboradores67 reportaram a determinao de piroxicam em medicamentos, em soro sanguneo e urina, a partir do aumento da intensidade de fluorescncia nativa do frmaco em presena do surfactante dodecilsulfato de sdio (fase micelar) em meio cido. Outros autores tambm tm relatado o emprego de tensoativos na determinao fluorescente de diversos frmacos.89,92,100,130 O uso da calibrao multivariada62,114,118125 para resoluo de sinais su per postos de misturas de frmacos fluorescentes tambm tem sido empregada. So relatados desde os mtodos multivariados mais simples como PLS (partial least-squares regres-sion),62,114,118,119,121123,125 PARAFAC (parallel factor analysis) e BLLS (Bilinear Least-Squares),124 at o uso de redes neurais mais sofisticadas como as redes de Kohonen120 (Tabela 1), cujo objetivo conferir maior seletividade metodologia, visando determinao dos frmacos em amostras complexas, como soro e urina. Determinao de frmacos em fase slida Uma tcnica recentemente explorada para determinao de frma-

Esquema 2. Representao esquemtica da gerao de quimiluminescncia do luminol na presena de perxido de hidrognio em meio bsico

O sistema pode ser aplicado na quantificao de luminol e seus derivados, perxido de hidrognio ou algum catalisador da reao, como metais,51 frmacos52 ou enzimas. Mtodos quimiluminescentes baseados no sistema perxi-oxalato48 so considerados at o momento os processos no-enzimticos com maior eficincia quntica.47,48,53 O mecanismo pode ser explicado atravs da luminescncia quimicamente iniciada por intercmbio de eltrons ou CIEEL (chemically initiated electron exchange luminescence).47 Uma reao tpica baseada neste tipo de quimiluminescncia mostrada no Esquema 3.

Esquema 3. Reagentes e produtos do sistema perxi-oxalato, usando um ster fenlico do cido oxlico e perxido de hidrognio, na presena de um ativador em meio bsico48,54

O Esquema 3 mostra a quimiluminescncia obtida a partir de um ster fenlico de cido oxlico e perxido de hidrognio, catalisada por base na presena de uma substncia com rendimento quntico alto a qual chamada, neste tipo de reaes, de ativador. Estas reaes so acompanhadas por uma forte emisso de luz, a qual oriunda da fluorescncia do ativador,48,54 resultando em sistemas luminescentes que superam queles baseados em luminol, e apresentam-se como ferramentas em potencial para serem aplicados na determinao de frmacos.49 Outros sistemas quimiluminescentes que eventualmente tambm podem ser empregados na determinao de frmacos incluem aqueles baseados nos derivados da acridina, tal como a lucigenina, cuja reao quimiluminescente mostrada no Esquema 4.

Esquema 4. Reao quimiluminescente para a lucigenina na presena de perxido de hidrognio e em meio alcalino. Mostram-se o intermedirio chave e o produto da reao47

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Tabela 1. Determinao de frmacos com fluorescncia nativa Princpio Classificao ativo cido Analgsico acetilsaliclico Antipirtico cido Analgsico acetilsaliclico Antipirtico cido Antiinfla- flufenmico matrio cido Antiinfla- mefenmico matrio cido Antiinfla- meclofenmico matrio Acrivastina Antialrgico Bromazepan Ansioltico Bumetanida Diurtico Cetoconazol Antimictico Ciprofloxacina Antibitico Clonazepam Sedativo Anticonvul- sivo Codena Antitussgeno Analgsico Codena Antitussgeno Analgsico Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Ref.

Fluorescncia nativa do 0,40 5,2 0,11 mg L-1 No determinado 118 frmaco. exc = 220 nm; mg L-1 em = 408 nm. Fluorescncia nativa do 2,0 12 No reportado Aspirina 119 -1 frmaco em soluo de g mL (comprimido), Bayer clorofrmio contendo cido actico a 1%. exc = 220 nm; em = 330 nm. Usando calibrao multivariada. Fluorescncia nativa do 0,25 1,0 No informado Movisilin (no informado), 120 -1 frmaco em clorofrmio. g mL Sankyo Pharma exc = 352 nm; em = 422 nm. Usando redes neurais artificiais de Kohonen. Fluorescncia nativa do 1,0 4,0 No informado Coslan (cpsula), 120 frmaco em clorofrmio. g mL-1 Parke-Davis exc = 352 nm; em = 449 nm. Usando redes neurais artificiais de Kohonen. Fluorescncia nativa do 0,25 1,0 No informado Meclofen (cpsula), 120 -1 frmaco em clorofrmio. g mL Parke-Davis exc = 352 nm; em = 405 nm. Usando redes neurais artificiais de Kohonen. Fluorescncia nativa do 58 2000 23 ng mL-1 SemprexD (cpsulas), 58 frmaco em tampo acetato ng mL-1 Glaxo-Wellcome (pH 6,5). exc = 230 nm; em = 380 nm. Fluorescncia nativa do 0,03 0,32 5,7 ng mL-1 Calmepan (comprimido), 59 frmaco em soluo g mL-1 no informado metanlica de hidrxido de potssio. exc = 260 nm; em = 570 nm. Fluorescncia nativa do 0,05 0,01 g mL-1 Burinex (comprimido), 60 -1 frmaco em NaOH 0,001 10,0 g mL LEO Pharmaceutical Product mol L-1, empregando sistema Burinex (injeo), de injeo em fluxo. LEO Pharmaceutical Product exc = 314 nm; em = 370 nm. Fluorescncia nativa do 49,7 800 14,9 ng mL-1 Cetoconazol (p), 61 frmaco em soluo tampo ng mL-1 Janseen Pharmaceutical de Teorrel e Stenhagen Cetoconazol (creme), (pH 10,0). exc = 288 nm; Janseen Pharmaceutical em = 375 nm. Fluorescncia nativa em meio 0 200 2 g L-1 Aplicado em anlise 124 -1 cido (pH 4,0). Emprego de g L de urina. mtodos de calibrao multivariada (PARAFAC e BLLS). Fluorescncia nativa do 0,03 0,38 16,5 ng mL-1 Rivotril (comprimido), 59 frmaco em soluo g mL-1 no informado metanlica de hidrxido de potssio. exc = 368 nm; em = 425 nm. Fluorescncia nativa do 0,05 0,25 0,04 mg L-1 No determinado 118 -1 frmaco. exc = 220 nm; mg L em = 350 nm. Fluorescncia nativa do 0,25 3,0 No reportado Codeisn (comprimido), 121 frmaco em tampo fosfato mg L-1 no informado pH 7,0. exc = 220 nm; Codena Perduretas em = 350 nm. Usando (comprimido), calibrao multivariada. no informado

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Tabela 1. continuao Princpio Classificao ativo Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Ref. 59

Diazepam Ansioltico Fluorescncia nativa em 0,03 0,34 7,1 ng mL-1 Valium (comprimido), -1 soluo metanlica de g mL no informado hidrxido de potssio. exc = 380 nm; em = 454 nm. Efedrina Descongestio- Fluorescncia nativa do 0,80 8,0 0,33 mg L-1 No determinado -1 nante nasal e frmaco. exc = 220 nm; mg L tratamento de em = 287 nm. asma -Estradiol Estrgeno Fluorescncia nativa do 1,5 25 0,13 mg mL-1 No determinado -1 frmaco. exc = 285 nm; g mL em = 310 nm. Fenilefrina Descongestio- Aproveitamento da fluores- 0,8 2,0 0,08 mg L-1 Wagner (comprimido), nante nasal cncia nativa, exc = 277 nm; mg L-1 no informado em = 300 nm. Emprego de Tabein (comprimido), calibrao multivariada. no informado Dristan (comprimido), no informado Wilpan (comprimido), no informado Furosemida Diurtico Emprego da espectrometria 10 No relatado Seguril (comprimido), de fluorescncia de varredura 40 g mL-1 Hoechst de ngulo varivel em mistura de vrios diurticos, aprovei tando a fluorescncia nativa do frmaco. Furosemida Diurtico Fluorescncia nativa do 0,212 1,06 No informado Salidur (comprimido), -1 frmaco em tampo tartrato g mL no informado (pH 2,5). exc = 270 nm; Seguril (comprimido), em = 410 nm. Aplicando no informado calibrao multivariada. Ibuprofeno Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,4 2,4 0,2 mg L-1 Ibuprofeno (comprimido), -1 trio frmaco em hidrxido de mg L no informado Antipirtico sdio 0,05 mol L-1. Analgsico exc = 224 nm; em = 290 nm. Isoxsuprina Vasodilatador Fluorescncia nativa do 0,4 4,0 0,11 g mL-1 Duvadilan (comprimido), -1 frmaco em gua destilada. g mL Solvay Duphar B.V. exc = 270 nm; em = 305 nm. Mivacurio Agente Fluorescncia nativa do 5 500 0,93 ng mL-1 Mivacrom (injeo), bloqueador frmaco em soluo tampo ng mL-1 Glaxo-Wellcome neuromuscular acetato (pH 5,5) exc = 230 nm; em = 324 nm. Moxifloxacina Antibitico Fluorescncia nativa do 30 300 10 ng mL-1 Octegra (comprimido), frmaco em tampo fosfato ng mL-1 no informado (pH 8,3). exc = 287 nm; Actira (comprimido), em = 465 nm. no informado Proflox (comprimido), no informado Naproxeno Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,1 1,0 No reportado Naproxin (comprimido), trio frmaco em soluo de g mL-1 Roche S.A. clorofrmio contendo cido actico a 1% (v/v). exc = 220 nm; em = 360 nm. Usando calibrao multivariada. Naproxeno Antiinflama- Fluorescncia nativa do 5,0 20 0,9 g L-1 Naprosyn (comprimido), trio frmaco em hidrxido de g L-1 no informado Analgsico sdio 0,05 mol L-1. exc = 230 nm; em = 355 nm.

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Tabela 1. continuao Princpio Classificao Metodologia empregada Faixa de Limite de ativo para gerar luminescncia anlise deteco Piretamida Diurtico Emprego da espectrometria 1,0 10 No relatado de fluorescncia de varredura g mL-1 de ngulo varivel em mistura de vrios diurticos, aprovei tando a fluorescncia nativa do frmaco. Piridoxina Vitamina B Fluorescncia nativa do 0,10 2,0 No relatado frmaco em tampo fosfato mg L-1 pH 7,0. exc = 220 nm; em = 390 nm. Usando calibrao multivariada. Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,05 1,5 0,015 g mL-1 trio frmaco aumentada na g mL-1 presena do surfactante dodecil sulfato de sdio em meio cido. exc = 340 nm; em = 460 nm. Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,01 1,25 No relatado trio frmaco em meio de HNO3 g mL-1 0,5 mol L-1. exc = 330 nm; em = 440 nm. Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,20 2,0 0,113 g mL-1 trio frmaco em meio de H2SO4 g mL-1 0,05 mol L-1. exc = 345 nm; em = 470 nm. Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,20 0,150 g mL-1 -1 trio frmaco em meio orgnico 1,2 g mL de dioxano. exc = 340 nm; em = 470 nm. Ritrodina Agente simpa- Fluorescncia nativa do 4,0 9,0 0,16 g mL-1 tomimtico frmaco. exc = 278 nm; g mL-1 em = 308 nm. Salicilato Antiinflamat- Fluorescncia nativa do 0,010 0,250 3 ng mL-1 rio, analgsico, frmaco. exc = 297 nm; g mL-1 antipirtico em = 405 nm. Salicilato Antiinflamat- Fluorescncia nativa do 0,5 5 No relatado rio, analgsico, frmaco em soluo de g mL-1 antipirtico clorofrmio contendo cido actico a 1%. exc = 220 nm; em = 450 nm. Usando calibrao multivariada. Salsalato Antiinflama- Fluorescncia nativa do 0,10 1,0 0,017 g mL-1 -1 trio frmaco em meio orgnico g mL de clorofrmio e pirrolidina. exc = 299 nm; em = 410 nm. Tacrina Tratamento Fluorescncia nativa do 1 70 0,24 ng mL-1 de carcinoma frmaco em tampo acetato ng mL-1 (pH 5,6). exc = 242 nm; em = 362 nm. Tartrato de Sedativo Fluorescncia nativa do 0,03 0,61 0,01 mg L-1 -1 ergotamina frmaco em cido clordrico mg L 0,1 mol L-1, em sistema de fluxo seqencial. exc = 236 nm; em = 390 nm. Tenoxicam Antiinflamat- Fluorescncia nativa do 40 200 11 ng mL-1 rio frmaco em cido ntrico ng mL-1 Analgsico 0,5 mol L-1. exc = 350 nm; em = 450 nm. Marca (forma farmacutica) e Fabricante Perbilen (cpsulas), Hoechst Ref. 129

Benadom (comprimido), no informado

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No informado (cpsulas), no informado No informado (gel), no informado No informado (cpsula), no informado Feldene (injeo), Pfizer-Egypt Feldene (comprimido), Pfizer-Egypt Yutopar (comprimido), no informado Ritodrina (ampolas), Pharco Pharmaceuticals Aplicado em anlise de soro. No informado

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Umbradol (p), no informado No informado (cpsulas), no informado Cognex (cpsula), no informado Bellaspon (comprimido), Leciva A.S.

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Epicotil (comprimido), no informado Epicotil (supositrio), no informado Epicotil (p liofilizado), no informado

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Tabela 1. continuao Princpio Classificao ativo Tenoxicam Antiinflama- trio Analgsico Triamtereno Diurtico Triamtereno Diurtico Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Epicotil (comprimido), IPICO Epicotil (p liofilizado), IPICO Triniagar (comprimido), Farmasimes Ref. 69

Fluorescncia nativa do 0,3 2,4 0,137 g mL-1 -1 frmaco em meio orgnico g mL de dioxano. exc = 360 nm; em = 480 nm. Emprego da espectrometria 50 150 No relatado de fluorescncia de varre- ng mL-1 dura de ngulo varivel em mistura de vrios diurticos, aproveitando a fluorescncia nativa do frmaco. Fluorescncia nativa do 0,0204 0,143 No informado frmaco em tampo tartrato g mL-1 (pH 2,5). exc = 360 nm; em = 438 nm. Aplicando calibrao multivariada.

129

Salidur (comprimido), no informado

122

cos em medicamentos tem sido a quantificao da fluorescncia em fase slida (Tabela 2). Esta tcnica tem demonstrado vantagens na reduo do consumo de reagentes e gerao de resduos. Outra vantagem o ganho obtido na intensidade de luminescncia, uma vez que em fase slida a molcula se encontra com uma estrutura mais rgida quando comparada em soluo, evitando com isto perdas da intensidade luminescente por processos paralelos de desativao (Figura 1S). A espectroscopia de luminescncia em fase slida para compostos que possuem fluorescncia nativa ainda tem sido muito pouco explorada,19,20,70,112115,125,133,135 apesar das vrias vantagens que este tipo de aplicao pode oferecer. Adicionalmente, podem ser realizadas anlises no-destrutivas, seguindo a tendncia atual em direo Qumica Limpa, bem como anlises on-line e/ou in situ. Outra vantagem ao induzir luminescncia diretamente na matriz da amostra diz respeito eliminao de reaes paralelas capazes de suprimir a luminescncia, as quais comumente podem ocorrer em soluo, e tm limitado a aplicao da espectroscopia de fluorescncia na determinao de muitos analitos. Recentemente, trabalhos empregando a quantificao de luminescncia diretamente nas amostras slidas, tal como comercializadas (comprimidos e cpsulas sob a forma de partculas slidas finamente pulverizadas), tm sido descritos na literatura por Moreira e colaboradores19,20,125,133 (Tabela 2); os mesmos demonstraram a viabilidade e vantagens inerentes que este tipo de anlise oferece, tais como simplicidade, rapidez, nenhuma gerao de resduos, nenhum preparo de solues, nem pr-tratamento de amostra. Essas caractersticas tornam a espectrofluorimetria em fase slida uma ferramenta bastante promissora para o controle de qualidade, quantificao e identificao de medicamentos com baixa solubilidade, como o ibuprofeno,97,136 possibilitando ainda avaliar interaes reais entre o princpio ativo e os excipientes diretamente na matriz oriunda do frmaco. Uma contribuio extremamente importante dos trabalhos descritos por Moreira e colaboradores o fato de terem encontrado propriedades luminescentes em molculas quando em estado slido, as quais em soluo aparentemente no apresentavam luminescncia.20 Este fato abre um precedente para investigar as propriedades luminescentes de frmacos em fase slida, que at agora, em soluo, no apresentaram luminescncia. Complexos fluorescentes de frmacos No intuito de obter um sinal fluorescente, a formao de complexos entre o frmaco e outras espcies tem sido bastante explorada

por muitos grupos de pesquisa15,74,78,94110,117,132 (Tabela 3). Muitos artigos tm demonstrado que a incluso do frmaco dentro da cavidade de ciclodextrinas pode induzir a emisso de vrias molculas.9499,102,117 Este fato explicado principalmente pela rigidez adicional qual a molcula de frmaco submetida. Outra vantagem deste tipo de complexos que podem ser determinados frmacos que so insolveis em meio aquoso, pois as ciclodextrinas fornecem simultaneamente stios de ligao hidroflicos e hidrofbicos, estes ltimos servindo para incluso da molcula de frmaco, formando complexos do tipo hspede-hospedeiro, como so conhecidos. Complexos ternrios formados na presena de on trbio (III), o frmaco, e molculas de xido de trioctilfosfina100 ou molculas de tris-hidroximetilaminoetano (TRIS),101 ou EDTA em meio alcalino103 tambm oferecem uma forma de quantificar alguns frmacos em formulaes comerciais. A capacidade que possuem alguns frmacos derivados de quinolonas e quinolinas para formar com metais de transio complexos fluorescentes tem sido explorada na determinao desses reagentes fluorognicos (frmacos). Assim, quelatos desta famlia de frmacos com diversos metais de transio como zircnio, molibdnio, vandio, tungstnio104 e alumnio107,108 tm sido descritos na literatura. bastante conhecido que quelatos orgnicos de ons lantandeos exibem propriedades espectroscpicas bastantes peculiares. Enquanto seus espectros de absoro apresentam o perfil esperado para os respectivos complexos orgnicos, seus espectros de emisso so bandas extremamente estreitas caractersticas das transies 4f dentro dos ons lantandeos.106,132 Este fenmeno conhecido como luminescncia sensibilizada por lantandeos5,130132,137 pode ser explicado como sendo devido transferncia de energia intramolecular desde o nvel tripleto mais baixo do complexo para um nvel 4f do on, resultando em uma mudana notria de espectros de bandas largas de excitao para uma banda estreita de emisso.132 Isto tem sido bastante utilizado para determinao de frmacos em preparaes farmacuticas.5,78,105,106,130132 Nestes casos o on mais empregado o Eu(III), e baseia-se no comportamento espectroscpico do complexo Frmaco-Eu(III), no qual o frmaco, aps absorver fortemente radiao eletromagntica a um comprimento de onda caracterstico, transfere esta radiao para o on Eu(III), resultando em um pico de emisso atmica estreito e intenso, caracterstico da emisso do on lantandeo a 615 nm. Deste modo, o pico de emisso atmico do Eu(III) aparece em uma regio espectral distante da possvel interferncia da matriz.137 Adicionalmente, pesquisas demonstraram que a intensidade da fluorescncia em meios micelares de tensoativos no-inicos grandemente amplificada,5,130

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Sotomayor et al.

Quim. Nova

Tabela 2. Determinao de frmacos com fluorescncia nativa em fase slida Princpio Classificao ativo Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Amostras magistrais (comprimido), no informados Amostras preparadas em laboratrio (comprimido) Ref. 19

cido Antipirtico Fluorescncia nativa do 50 170 2,2 mg g-1 -1 acetilsaliclico Analgsico frmaco diretamente em mg g fase slida. exc = 288 nm; em = 318 nm. cido Antipirtico Fluorescncia nativa do 50 170 No informado acetilsaliclico Analgsico frmaco diretamente em mg g-1 fase slida. exc = 288 nm; em = 318 nm. Empregando calibrao multivariada. cido Antipirtico Fluorescncia nativa do 10 400 4 mol L-1 acetilsaliclico Analgsico frmaco impregnado em mol L-1 papel de filtro quantitativo. exc = 298 nm; em = 411 nm. cido 2-fenil- Filtro solar Fluorescncia nativa do 0,001 2,5 12 ng mL-1 benzimidazol- frmaco retido em SAX (clo- g mL-1 5-sulfnico reto de trimetilaminopropil), empregando sistema de fluxo seqencial. exc = 301 nm; em = 681 nm. Amilorida Diurtico Fluorescncia nativa do 10 600 0,92 g L-1 -1 frmaco retido em Sephadex g L SP-C25, empregando sistema por injeo em fluxo. exc = 291 nm; em = 419 nm. Carbamazepina Anticonvulsivo Fluorescncia em estado sli- No informado No informado do do frmaco suportado em membranas de nylon, empre- gando calibrao multivariada. Cloroquina Antimalrico Fluorescncia nativa do 300 700 90 mg g-1 (fosfato) Antireumtico frmaco diretamente em fase mg g-1 slida. exc = 290 nm; em = 413 nm. Naproxeno Antiinflamat- Frmaco extrado em mem- 0,014 0,250 5 ng mL-1 rio, analgsico, brana de fase reversa, g mL-1 antipirtico medindo a fluorescncia nativa do naproxeno direta mente na superfcie slida. exc = 272 nm; em = 350 nm. Paracetamol Antipirtico Fluorescncia nativa do 100 400 13 mg g-1 -1 Analgsico frmaco diretamente em mg g fase slida. exc = 333 nm; em = 382 nm. Triamtereno Diurtico Fluorescncia nativa do 10 400 0,95 ng mL-1 -1 frmaco retido em Sephadex ng mL SP-C25, empregando sistema por injeo em fluxo. exc = 240 nm; em = 440 nm. permitindo a determinao de alguns frmacos em matrizes onde se encontram a nveis de traos, como em alimentos.5 Complexos formados entre frmacos e compostos orgnicos como 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol e 4-cloro-7-nitrobenzofurazan para determinar gentamicina109 e nortriptilina,110 respectivamente, permitiram a quantificao destes frmacos a nveis de g mL-1. Fluorescncia nativa de ons metlicos A quantificao da intensidade fluorescente emitida por compostos

125

Aspirina (comprimido), Bayer; AAS (comprimido), no informado Anlise de soro No analisa amostras farmacuticas

135

112

Ameride (comprimido), 113 Dupont PharmaKalten (comprimido), Zeneca Farma Carbamzepina (comprimido), 114 Denver Farma; Tegretol (comprimido), Novartis;Tegretol (suspenso oral), Novartis Amostras magistrais 133 (cpsulas)

Aplicado em anlise de soro

70

Amostras preparadas em laboratrio (comprimido)

20

Triniagar (comprimido), no informado Salidur (comprimido), no informado

115

que possuem fluorescncia nativa e que, por sua vez, reagem estequiometricamente com o frmaco de interesse tem sido amplamente utilizada na determinao de princpios ativos.64,7577,81,123 O on crico um reagente oxidante bastante verstil que reage estequiometricamente com vrios frmacos. Sua forma reduzida apresenta fluorescncia a 357 nm em meio cido, tendo sido empregado na anlise em batelada e em fluxo de princpios ativos como os antibiticos amoxilina123 e aztreonam;75 dipirona;76 isoniazida (tuberculosttico);77 cloreto de isoxsuprina64 (vasodi-latador) e cloreto de ritodrina (simpatomimtico).81

Vol. 31, No. 7

Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia

1763

Tabela 3. Determinao de frmacos baseada na formao de complexos Princpio Classificao ativo Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Anlise de urina Ref. 102

cido nalidxico Antibitico Fluorescncia do complexo 0,1 2,0 14 ng mL-1 -1 Quimioter- entre o frmaco a g mL pico -ciclodextrina em pH 2,8. exc = 314 nm; em = 357 nm. Dapsona Antileprtico Fluorescncia do complexo 3,4 1,5x103 1,02 ng mL-1 antimalrico entre o frmaco e a -ciclo- ng mL-1 dextrina na presena de lcoois lineares (1-butanol ou 1-pentanol) a 1% (v/v). Diclofenaco Antiinflama- Fluorescncia do complexo 0 5 0,07 g mL-1 -1 de sdio trio (1:1) formado pelo frmaco g mL e a -ciclodextrina em soluo aquosa. Fluoxetina Antidepressivo Fluorescncia do complexo 40 1000 10 g L-1 -1 (1:1) formado pelo frmaco g L (fluoxetina) e a metil- -ciclodextrina. exc = 224 nm; em = 294 nm. Ibuprofeno Antiinflama- Fluorescncia do complexo 0,1 2,0 0,03 g mL-1 -1 trio (1:1) entre o frmaco e a g mL Antipirtico -ciclodextrina em hidrxido Analgsico de sdio (10>pH>7). Ibuprofeno Antiinflama- Fluorescncia do complexo 4,7 58 1,6 g mL-1 -1 trio (1:1) frmaco -ciclodex- g mL Antipirtico trina em NH3 0,02 mol L-1, Analgsico a 10 oC. Menadiona Vitamina K3 Fluorescncia do complexo 0,1 2,0 0,022 mg L-1 Antitumoral (1:1) menadiona mg L-1 -ciclodextrina em tampo citrato (pH 6,2). Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia do complexo 0,02 1 0,02 g mL-1 -1 trio (1:2) formado pelo frmaco g mL (fluoxetina) e a -ciclodex trina em pH cido (3,5). exc = 320 nm; em = 450 nm. cido Antiinflama- Fluorescncia do complexo 4x10-10 10-5 2x10-10 mol L-1 Flufenmico trio ternrio formado pelo frma- mol L-1 (derivado do co, trbio (III) e xido de triocido antranlico) ctilfosfina em soluo aquosa de Triton X-100. cido Antiinflama- Fluorescncia do complexo 4x10-9 10-5 2x10-9 mol L-1 -1 Mefenmico trio ternrio formado pelo frma- mol L (derivado do co, trbio (III) e xido de cido antranlico) trioctilfosfina em soluo aquosa de Triton X-100.

Balance (comprimido), 94 Pharmaceutical Factory Shangai Sunve (comprimido), Shangai Pharmaceutical Co. Ltd. Damixa (comprimido), 95 Merck Dioxaflex (comprimido), Bag Vesalion (comprimido), Argentia Voltarn (comprimido), Novartis Prozac (comprimido), 117 no informado Adofen (comprimido), no informado Reneuronl (comprimido), no informado Ibuprofeno (comprimido), 96 Aria Ibuprofeno (comprimido), Rouzdarou Druisel Ibuprofeno 97 (comprimido), Northia IBU-Buscapina (comprimido), Boehringer Ingelheim Ibupirac Fem (comprimido), Monsanto Ibupirac Migra (comprimido), Monsanto Ibupirac Flex (comprimido), Monsanto Vitaencil CKP 98 (comprimido), Wassermann Lab. BIO-HUBBER (comprimido), ICN Ibrica S.A. Solocalm (cpsulas), 99 Microsules-Bernabo

Anlise de soro

100

Anlise de soro

100

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Sotomayor et al.

Quim. Nova

Tabela 3. continuao Princpio Classificao ativo Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Anlise de soro Ref. 101

cido Antibitico Fluorescncia do complexo 0,02 7,0 6,0x10-3 g mL-1 -1 nalidxico Quimiote- formado pelo frmaco e o on g mL rpico trbio (III) em tampo TRIS em pH 8,0. cido Avalia indireta- Fluorescncia baseada na 0,01 10 0,01 mol L-1 -1 p-amino- mente a funo formao do complexo mol L benzico pancretica ternrio formado pelo Componente de frmaco, trbio (III) e filtros solares EDTA em meio bsico de NaOH (pH 12,6). cido Antiinflama- Fluorescncia do complexo 10-9 10-5 5x10-10 mol L-1 Tolfenmico trio ternrio formado pelo mol L-1 (derivado do frmaco, trbio (III) e cido antranlico) xido de trioctilfosfina em soluo aquosa de Triton X-100. Furosemida Diurtico Fluorescncia do complexo 10-9 10-5 5x10-10 mol L-1 (derivado do ternrio formado pelo mol L-1 cido antranlico) frmaco, trbio (III) e xido de trioctilfosfina em soluo aquosa de Triton X-100. Norfloxacina Antibitico Fluorescncia do complexo 0,4 9,0 0,13 g mL-1 -1 formado pelo frmaco e o on g mL trbio (III) em tampo TRIS em pH 8,0. a cido Antibitico Fluorescncia dos quelatos a,b,c,d10 60 1,8 ng mL-1 b nalidxico Quimiote- do frmaco-metal. Os quela- ng mL-1 1,7 ng mL-1 c rpico tos foram obtidos com os 1,3 ng mL-1 a d seguintes metais: zircnio ; 1,8 ng mL-1 molibdniob; vandioc e tungstniod a Ciproflo- Antibitico Fluorescncia dos quelatos a,b,c,d10 60 1,5 ng mL-1 -1 b xacina do frmaco-metal. Os quela- ng mL 1,4 ng mL-1 c tos foram obtidos com os 1,5 ng mL-1 d seguintes metais: zircnioa; 1,8 ng mL-1 b c molibdnio ; vandio e tungstniod a Norfloxacina Antibitico Fluorescncia dos quelatos a,b,c,d10 60 1,3 ng mL-1 b do frmaco-metal. Os quela- ng mL-1 1,5 ng mL-1 c tos foram obtidos com os 1,6 ng mL-1 d seguintes metais: zircnioa; 1,7 ng mL-1 b c molibdnio ; vandio e tungstniod a Ofloxacina Antibitico Fluorescncia dos quelatos a,b,c,d10 60 1,2 ng mL-1 -1 b do frmaco-metal. Os quela- ng mL 1,5 ng mL-1 c tos foram obtidos com os 1,8 ng mL-1 a d seguintes metais: zircnio ; 1,5 ng mL-1 molibdniob; vandioc e tungstniod. a,b,c,d a Pefloxacina Antibitico Fluorescncia dos quela- 10 60 1,5 ng mL-1 -1 b tos do frmaco-metal. Os ng mL 1,8 ng mL-1 c quelatos foram obtidos com 1,7 ng mL-1 d os seguintes metais: zircnioa; 1,6 ng mL-1 b c molibdnio ; vandio e tungstniod. Amicasina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ 10 70 2,2 g mL-1 aumentada na presena g mL-1 do frmaco em pH 5,5.

Anlise de urina e soro

103

Anlise de soro

100

Anlise de soro

100

Anlise de soro

101

Nalidixic (comprimido), Elnasr Pharm. Chem. Co

104

Serviflox (comprimido), 104 Novartis Pharma Cipro otic (gotas), Chemical Industries Development Ciprofloxacin (injeo), Amriya Pharmaceuticals Spectrama (comprimido), 104 Amoun Pharm. Ind. Co. Norbactin (comprimido), RanbaxyOpto Q3 eye (gotas), Chemical Industries Development Tarivid (comprimido), 104 Hoechst Ofloxacin (comprimido), Sedico Pharm. Co.

Peflacine (ampola), Rhone-Poulenc Rorer

104

Amikin (ampola), Briston Co.

78

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Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia

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Tabela 3. continuao Princpio Classificao Metodologia empregada Faixa de Limite de ativo para gerar luminescncia anlise deteco 3+ Clorotetra- Antibitico Fluorescncia on Eu No informada 2 ng mL-1 ciclina aumentada na presena do frmaco. Diclofenaco Antiinflama- Fluorescncia on Eu3+ 10 200 No reportado trio aumentada na presena g mL-1 do frmaco. Doxiciclina Antibitico Fluorescncia on Eu3+ No informada 3 ng mL-1 aumentada na presena do frmaco. Gentamicina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ 10 70 2,6 g mL-1 -1 aumentada na presena g mL do frmaco em pH 5,5. Kanamicina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ 10 70 2,2 g mL-1 aumentada na presena g mL-1 do frmaco em pH 5,5. Neomicina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ 20 100 2,3 g mL-1 aumentada na presena g mL-1 do frmaco em pH 5,5. Piroxicam Antiinflama- Fluorescncia do on Eu3+ 0,1 2,00 23,0 g mL-1 trio aumentada na presena mg mL-1 do frmaco em metanol e pH 9,0 (tampo TRIS). Tetraciclina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ No informada 1 ng mL-1 aumentada na presena do frmaco. Tobramicina Antibitico Fluorescncia do on Eu3+ 10 70 2,6 g mL-1 -1 aumentada na presena g mL do frmaco em pH 5,5. a Cloroxina Antimictico Fluorescncia do complexo a0,02 51 5,0 nmol L-1 -1 b frmaco - alumnio (III), em g mL 0,13 g mL-1 meio micelar de lauril sulfato b0,56 56 de sdio, em estado estacio- g mL-1 nrioa e em sistema por injeo em fluxob. Norfloxacina Antibitico Fluorescncia do complexo 0,003 6,8 0,4 ng mL-1 -1 frmaco - alumnio (III) em g mL meio micelar de dodecil sulfato de sdio em pH 4.0 Tenoxicam Antiinflama- Fluorescncia do complexo 16 100 4,7 ng mL-1 trio (1:1) frmaco-alumnio (III) ng mL-1 Analgsico em cido ntrico 0,5 mol L-1. Marca (forma farmacutica) e Fabricante No reportada Voltaren (comprimido), Ciba Giegy Rheumafen (cpsula), Apic Co. Voltaren (ampola), Ciba Giegy Voltaren (suspenso), Ciba Giegy Voltaren (ungento), Ciba Giegy No reportada Gentamicina (ungento), Memphis Co. Gentamicina (ampola), Memphis Co. Kanamicina (soluo), no informado Neomicina (comprimido), Memphis Co. Ref. 132 105

132 78

78 78

No relatada (comprimido), 106 no informado No relatada (cpsula), no informado No relatada 132 Nebcin (ampola), Lily Frana S.A. 78

No informado (comprimido), 107 no informado No informado (plula), no informado Senro (cpsula), Biosart 108 Espeden (comprimido), Vita Vicnasl (comprimido), Semar Baccial (comprimido), Pharmaceuticals S.A. Noroxin (comprimido), Merk Sharp and Dohme S.A. Uroctal Norfloxacina (comprimido), Funkk S.A. Amicrobin (cpsula), Hosbon, S.A. Chibroxin (soluo), Merk Sharp and Dohme-Chibret Epicotil (comprimido), 74 no informado Epicotil (supositrio), no informado Epicotil (p liofilizado), no informado

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Sotomayor et al.

Quim. Nova

Tabela 3. continuao Princpio Classificao ativo Metodologia empregada para gerar luminescncia Faixa de anlise Limite de deteco Marca (forma farmacutica) e Fabricante Ref.

Gentamicina Antibitico Fluorescncia do aduto for- 0,56 2,8 0,11 g mL-1 -1 mado pelo frmaco com g mL 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa- 1,3-diazol, em soluo 1:1 (v/v) de metanol e tampo fosfato em pH 7,2. Nortriptrilina Antidepressivo Fluorescncia do aduto 0,6 60 0,18 g mL-1 formado pelo frmaco g mL-1 com 4-cloro-7-nitroben- zofurazan. Dopamina Catecolamina Fluorescncia baseada na 0,02 0,6 No relatado formao do complexo obtido g mL-1 da condensao de etilenodia mina com o produto de oxida o da dopamina com nitrato de mercrio (II). O on fluorescente TlCl32- formado pela reduo quantitativa do on Tl3+ na presena do frmaco em meio de cido clordrico tem sido explorado na quantificao em fluxo de frmacos contendo grupos tiis como a tiopronina (N-2-mercaptopropioniglicina) e a penicilamina (3-mercapto-D-valina),79 empregados no tratamento de doenas do fgado e pele, e na artrite reumatide, respectivamente. Fluorforos obtidos por derivatizao do frmaco Processos mais complexos, com a finalidade de converter o frmaco em um derivado fluorescente,15,8284 permitindo aumentar ou gerar fluorescncia a partir de compostos no fluorescentes, tm sido propostos. Desta forma, o cido ascrbico (vitamina C) tem sido quantificado em batelada e em fluxo em diferentes formulaes comerciais, atravs da fluorescncia da quinoxalina obtida pela reao de o-fenilenodiamina com o cido deidroascrbico (produto da oxidao aerbia do frmaco).12 O antiipertensivo captropil, foi quantificado a partir da fluorescncia do cido 1,2-diidroxinaftaleno-4-sulfnico, produto da reduo estequiomtrica do cido 1,2-naftoquinona-4-sulfnico na presena do frmaco.13 A dopamina foi determinada atravs da fluorescncia do produto de condensao da etilenodiamina com a DOPAquinona, produto de oxidao da dopamina com nitrato de mercrio (II), permitindo analisar dopamina na faixa de concentrao em nveis biolgicos (ng mL-1).15 Aly82 desenvolveu uma metodologia para a determinao de cloreto de prenalterol, agente simpatomimtico, baseada na derivatizao deste frmaco em duas etapas, na primeira, realizada a derivatizao para obter um nitro-derivado, e na segunda o frmaco nitrogenado reage com 2-cianoacetamida em meio amoniacal, obtendo-se um composto fluorescente. O anestsico procana foi determinado pelo composto fluorescente obtido da reao do frmaco com a fluorescamina em tampo citrato/fosfato em pH 4,0,83 permitindo a determinao deste anestsico na faixa de concentrao de ng mL-1. Finalmente, a tiamina (vitamina B1) foi quantificada atravs da fluorescncia emitida pelo composto 1-alquil-tio-2-alquil-isoindol, obtido da derivatizao do grupo amino primrio da vitamina com o o-ftalaldedo na presena de 2-mercaptoetanol.

Gentam (injeo), Spimaco 109 Gentam (gotas), Spimaco Gentamicin (ungento), Schering-Plugh

Martimil (comprimido), 110 Alonga S.A. Norfenazina (comprimido), Alonga S.A. Paxtibi (comprimido), Dista S.A. Tropargal (comprimido), Alonga S.A. Amostras injetveis, 15 fabricante no informado

Quantificao de frmacos baseada em diversos tipos de reaes Determinao de frmacos baseada em reaes fotoqumicas A combinao de reaes fotoqumicas com deteco fluorimtrica em sistemas hidrodinmicos tem demonstrado ser uma estratgia verstil, simples, seletiva e sensvel para a determinao de diversos frmacos em medicamentos.8891 Desta forma, o antiinflamatrio diclofenaco tem sido quantificado sob diferentes apresentaes comerciais (suspenso, comprimido, supositrio), empregando anlise por injeo seqencial (SIA) aps irradiao com radiao ultravioleta (279 nm) durante 30 s. Aps este tempo a soluo de diclofenaco apresenta uma nova banda de emisso em 420 nm, com uma intensidade 485 vezes maior quando comparada com a banda de fluorescncia do diclofenaco em sua forma nativa em 310 nm.88 A vitamina K3 (menadiona) foi determinada atravs da quantificao de sua forma reduzida (diidronaftoquinona), fotoquimicamente obtida pela irradiao UV de uma soluo do frmaco preparada em meio micelar de docecilsulfato de sdio (no qual solvel) e empregando anlise por injeo em fluxo.89 O antibitico sulfametazina foi determinado em diferentes preparaes comerciais (comprimido, p, suspenso), atravs da fluorescncia induzida fotoquimicamente a 287 nm, na presena de sulfito de sdio e tampo borato (pH 8,8) empregando sistema por injeo em fluxo.90 De forma similar, a fluorescncia da tiamina tem sido induzida atravs da reao fotoqumica empregando radiao ultravioleta de 370 nm na presena de uma soluo aquosa contendo 2% de NaOH e 0,4% de sulfito de sdio.91 Determinao baseada na hidrlise de frmacos Muitos frmacos apresentam fluorescncia nativa fraca, contudo a intensidade da emisso pode aumentar aps hidrlise cida,93 bsica120,121 ou at ser promovida em meio orgnico e catalisada por ons metlicos.92 Neste sentido, Fernndez e colaboradores descreveram um mtodo para determinao de ampicilina em cpsula e suspenso, baseada na hidrlise cida (pH 3,7) do frmaco, catalisada pelo on cprico em meio micelar de dodecilsulfato de sdio empregando sistema em fluxo.92

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Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia

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A fluorescncia nativa do salicilato (produto da hidrlise bsica) foi aproveitada por Martos e colaboradores121 na quantificao de cido acetilsaliclico em comprimidos e empregando calibrao multivariada. Linares e colaboradores135 tambm determinaram cido acetilsaliclico a partir da quantificao da fluorescncia em matriz slida do salicilato em amostras de frmacos e de soro sanguneo. Por outro lado, os sedativos derivados das benzodiazepinas, diazepam, oxazepam e nitrazepam, foram quantificados aps hidrlise em meio de cido sulfrico e etanol para os dois primeiros e em metanol para o ltimo.93 O antimictico tolnaftato foi satisfatoriamente determinado aps hidrlise em meio bsico para formar o fluorforo -naftolato, em preparaes comerciais na forma de creme e p.61 Determinao baseada na cintica da reao luminescente de frmacos Outros tipos de configuraes menos exploradas, tais como a inibio da velocidade de oxidao1 ou de reduo111 de compostos fluorescentes, na presena do frmaco tm sido descritos na literatura. Feng e colaboradores1 descreveram a determinao de cido ascrbico ao nvel de traos, baseada na inibio da velocidade de oxidao do fluorforo pironina Y pelo nitrito na presena de cido ascrbico. O mtodo foi convenientemente empregado na determinao de cido ascrbico em comprimidos, injees, vegetais, frutas e bebidas. Por outro lado, Prez e colaboradores111 descreveram um mtodo em fluxo para a determinao do hipotensivo nitroprussida, baseado na inibio da velocidade de fotorreduo do fluorforo fluoxina (fluorescncia rosa, emisso=543 nm) pelo EDTA na presena do frmaco. Quando uma soluo contendo floxina e EDTA irradiada na ausncia de oxignio com luz branca em um pH adequado, a fotorreduo do fluorforo ocorre e a cor rosa desaparece. Na presena de nitroprussida a velocidade da reao fotoqumica diminui grandemente e esta mudana pode ser quantificada pela intensidade de fluorescncia da floxina. Esta inibio pode ser explicada pela interao entre a nitroprussida com o estado triplete da floxina, assim a reduo da cor devido reao com o EDTA impedida. O mtodo foi aplicado satisfatoriamente na determinao do frmaco em preparaes farmacuticas e em soro sangneo. Fluorescncia nativa da espcie oxidada ou reduzida do princpio ativo A fluorescncia inerente das espcies oxidadas e reduzidas de frmacos no fluorescentes tem sido aplicada na determinao de cido flico,138 vitamina K386 e prenalterol.87 Zhang e Tang138 descrevem a determinao de cido flico pela oxidao on line do frmaco com chumbo em um sistema em fluxo. A metodologia foi empregada na determinao em comprimidos e em teste de dissoluo de medicamentos. A vitamina K3 foi determinada pela fluorescncia inerente da espcie reduzida do frmaco, obtida pela reao com zinco metlico em meio de cido clordrico, empregado na forma de um reator de fase slida em um sistema em fluxo. A metodologia foi empregada na determinao de vitamina K3 em diferentes formulaes comerciais (comprimidos, soluo e injetveis) com sucesso. Finalmente, o agente simpatomimtico prenalterol foi determinado a partir da quantificao da forma oxidada fluorescente do frmaco pela ao de hexacianoferrato de potssio em tampo borato a pH 9,2, sendo aplicada na determinao do frmaco em comprimidos e injetveis.87

Determinao de frmacos por mtodos indiretos A determinao indireta de frmacos tem sido aplicada para quantificao de antiinflamatrios, antibiticos e vitaminas.14,16,17,85 Surez e Daz14 desenvolveram um mtodo para determinar cloramfenicol atravs de um ensaio competitivo fluorescente realizado em fluxo e baseado na competio pelos stios de reconhecimento em um polmero sinttico com impresso molecular (MIP), ao qual esto ligadas molculas de estrutura anloga ao frmaco marcadas com reagente fluorescente. De modo similar, Rachkov e colaboradores139 descreveram um mtodo para determinao de -estradiol, baseado em um ensaio imuno-fluorescente acoplado cromatografia lquida e MIPs. Os frmacos piroxicam e propanolol foram quantificados indiretamente, atravs da medida da intensidade emitida pelo fluorforo formado da reao entre a N-bromosuccinimida e cloreto de metildilazina.17 O mtodo envolve a oxidao inicial dos frmacos com um excesso conhecido de N-bromosuccinimida, seguida da gerao do fluorforo pela reao da N-bromosuccinimida no consumida com cloreto de metildilazina. A determinao indireta das vitaminas K1 e K3 tambm tem sido relatada na literatura.16,85 Prez e colaboradores85 desenvolveram um mtodo para determinar vitamina K1 em fluxo, atravs da medida da fluorescncia do cido hidroxibenzico (fluorforo), quantitativamente gerado pela oxidao do cido benzico com perxido de hidrognio e catalisada pelo on ferroso. O perxido de hidrognio foi estequiometricamente gerado, pela oxidao fotoqumica com radiao UV, da glicose na presena da vitamina. Determinao de frmacos baseada na supresso de fluorescncia Metodologias baseadas na supresso da fluorescncia tm sido empregadas para determinao de diversos analitos de interesse em inmeras reas de pesquisa. A teoria da supresso fluorescente tem sido descrita na literatura140149 e basicamente governada pela Equao de Stern-Volmer (Equao 1): (1)

onde, I0 e I so, respectivamente, a intensidade de fluorescncia na ausncia e na presena do frmaco supressor de fluorescncia, [Q] a concentrao do frmaco e KSV a constante de Stern-Volmer. Esta equao permitir a quantificao do frmaco de interesse. Baseado neste princpio, alguns grupos de pesquisa tm proposto metodologias de anlise para antibiticos (derivados das cefaloporinas, metronidazol e tetraciclina)21,22,126,128 e anti-micticos.127 Por exemplo, Bebawy e colaboradores126 descreveram um mtodo altamente sensvel para quantificar cefoperazona de sdio, cefazolina de sdio, cefixima e ceftriaxona de sdio, todos antibiticos da famlia das cefalosporinas. O mtodo baseia-se na supresso da fluorescncia do on trbio (III) em tampo TRIS quando o complexo ternrio entre o Tb3+-TRIS-Frmaco formado. Um pH de 10 permitiu a quantificao da cefoperazona de sdio, e um pH de 8 permitiu a determinao dos outros frmacos. A metodologia foi satisfatoriamente aplicada em formulaes comerciais com diferentes apresentaes, como solues e cpsulas. A determinao de formaldedo, que possui propriedades teraputicas como anti-sptico e antimictico, foi proposta atravs da supresso da fluorescncia do bromato de acridina amarela pelo on brometo, catalisada pelo frmaco (formaldedo) em meio cido, empregando sistema por injeo em fluxo. A metodologia foi satisfatoriamente aplicada na determinao de preparao comercial (Viberol) contendo 45 mg mL-1 de frmaco, assim como na anlise

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de alimentos e ambiental.127 Os antibiticos metronidazol e tetraciclina tambm foram quantificados atravs da supresso da fluorescncia. Sulkowska128 relatou a determinao de metronidazol a partir da supresso da fluorescncia dos resduos de triptofanil contidos na protena de soro albumina na presena do frmaco. A metodologia foi aplicada na determinao de metronidazol em comprimidos. A determinao da tetraciclina foi realizada atravs de um sensor construdo empregando como fase sensora uma membrana plastificada imobilizada na ponta de um feixe bifurcado de fibras pticas. A membrana foi preparada imobilizando o fluorforo 1,4-bi(5,5-dimetilbenzoxazol-1,3-il-2) benzeno em uma matriz polimrica de PVC e bis(2-etilexil)sebacato (DOS). Na presena do frmaco a intensidade de fluorescncia diminui e esta pode ser relacionada com a concentrao de tetraciclina presente na amostra. A metodologia foi aplicada na determinao do frmaco em comprimidos.22 Determinao de frmacos atravs de reaes quimiluminescentes A anlise empregando quimiluminescncia oferece alta sensibilidade, ampla faixa de resposta linear e instrumentao simples. A vitamina K3 tem sido quantificada pela medida da quimi-luminescncia gerada pela reao entre luminol e perxido de hidrognio, catalisada por hematina.16 Neste caso, o perxido de hidrognio estequiometricamente gerado pela oxidao fotoqumica, com radiao UV, de etanol na presena da vitamina. Quando acoplada a sistemas em fluxo, a quimiluminescncia fornece uma metodologia de baixo custo, rpida, simples e altamente reprodutvel para a quantificao, com sucesso, de frmacos como cefmetazol,46 gentamicina,49 dipirona,3,55,56 cloranfenicol,52 antibiticos derivados da fluoroquinolona45 e filtros solares.57 Fukutsu e colaboradores46 determinaram cefmetazol, um derivado semi-sinttico do antibitico cefamicina, em um sistema por injeo em fluxo. Neste sistema a quimiluminescncia entre o antibitico e o luminol foi induzida pela oxidao do luminol com a espcie superxido, gerada da decomposio do grupo -lactmico do antibitico em meio alcalino.150 Esta metodologia permitiu a determinao de traos deste frmaco em guas de limpeza de equipamentos industriais, como reatores, centrfugas, filtros, pulverizadores e tanques da indstria farmacutica Sankyo Co. Ltd.46 O antibitico gentamicina tem sido quantificado empregando anlise em fluxo e a quimiluminescncia do complexo perxi-oxalato.49 Neste caso, o frmaco foi previamente derivatizado com o-ftalaldeido, com a finalidade de obter o ativador necessrio para a reao. O catalisador usado foi o imidazol e a reao quimiluminescente foi realizada empregando dodecilsulfato de sdio (meio micelar) como carregador para evitar a degradao do perxi-oxalato. A metodologia permitiu a determinao de gentamicina em vrias formulaes oftlmicas comerciais, permitindo anlises na faixa de concentraes entre 4 e 30 g mL-1. A determinao da dipirona foi realizada pela gerao da luminescncia aps a oxidao do grupo sulfito da analgina (SO32-) pelo MnO2 em meio cido para formar dixido de enxofre excitado (SO2*). Para aumentar a intensidade luminescente foi adicionada Rodamina B (fluorforo) que gera uma luminescncia mais intensa, aps sua reao com o SO2*, uma vez que a energia adicional do sulfito pode ser facilmente transferida a um fluorforo intencionalmente adicionado ao sistema. Esta metodologia foi aplicada na determinao do frmaco em comprimidos como Dipirona, Novalgina e Metamizol e em testes de dissoluo.55 Huang e colaboradores56 determinaram dipirona pela auto-oxidao do grupo sulfito em meio de cido sulfrico contendo 0,1% de Tween 80 (meio micelar) e empregando

Rodamina 6G para aumentar a sensibilidade do mtodo. A determinao do cloranfenicol, um nitro composto, foi realizada pela gerao qumica da luminescncia da reao entre os produtos da fotlise em soluo aquosa do cloranfenicol, luminol e cobalto(II). A fotlise foi realizada empregando lmpada de mercrio de baixa presso como fonte de irradiao. Neste processo os produtos da fotlise (4-nitrobenzaldeido em maior proporo) oxidam o luminol, sendo catalisado pelo on Co2+. A metodologia foi empregada para a determinao do frmaco em diversas marcas comerciais de colrios, assim como em outros frmacos nitro-derivados como nitrofurantoina, metronidazol e nitroprussida.52 Frmacos derivados da fluoroquinolona (FQ) foram quantificados pela luminescncia gerada na reao entre a fluoroquinolona complexada com ons lantandeos e a molcula de SO2*, que o produto da reao entre sulfito e on crico. Foram avaliadas as respostas para levofloxacina, moxifloxacina e trovafloxacina. Os ons lantandeos empregados para complexar cada frmaco foram Eu3+ para os dois primeiros e Tb3+ para a trovafloxacina. O Esquema 5 mostra o mecanismo de determinao de trovafloxacina.45

Esquema 5. Mecanismo global da formao de luminescncia qumica na determinao de trovafloxacina. Tb(FQ)23+ : complexo Trbio (III) e fluoroquinolona (FQ)

conhecido que nos ltimos anos tem crescido enormemente o consumo e a produo de filtros solares, como conseqncia dos efeitos adversos que a irradiao UV pode causar pele. Neste sentido, Townshend e colaboradores57 relataram a quantificao de octil-dimetil-PABA, um filtro solar de grande absortividade na regio UV-B, atravs da quimiluminescncia do frmaco induzida pelo on MnO4- em meio cido. Esta metodologia foi eficientemente empregada na determinao do filtro solar em cremes comercialmente disponveis, permitindo identificar o composto em concentraes na ordem de ng mL-1. TENDNCIAS E PERSPECTIVAS FUTURAS Emprego de tcnicas fluorimtricas no convencionais No intuito de aumentar a sensibilidade e seletividade na determinao de compostos com fluorescncia nativa outras tcnicas fluorimtricas tm sido descritas. Dentre elas incluem-se a espectroscopia fluorescente sincronizada convencional,151 a espectroscopia sincronizada derivada,108,152,153,157 a espectroscopia fluorescente sincronizada de ngulo varivel129,154,155 e a espectroscopia sincronizada isopotencial.155,156 Sabe-se que a fluorescncia convencional envolve a obteno de um espectro de emisso pela varredura em uma determinada faixa de comprimentos de onda (em) quando uma amostra irradiada com um

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comprimento de onda de excitao (exc) fixo. De maneira similar, um espectro de excitao obtido pela varredura nos diferentes comprimentos de onda de excitao enquanto se registra o sinal de emisso em um nico comprimento de onda. Contudo, existe a possibilidade de variar simultaneamente exc e em, e dependendo da velocidade de varredura dos dois monocromadores possvel obter os diferentes formatos da tcnica fluorimtrica conhecida como espectroscopia de fluorescncia sincronizada. Assim, se a velocidade de varredura constante para os dois monocromadores, ser gerado conseqentemente um intervalo de comprimentos de onda () constante entre exc e em e neste caso obtm-se a tcnica conhecida como espectroscopia de fluorescncia sincronizada convencional, a qual foi introduzida por Lloyd h mais de trs dcadas,151 sendo esta amplamente empregada. Nos casos em que a fluorescncia de um composto mascarada pelo espalhamento de Rayleigh, esta tcnica permite uma melhora nas medidas em relao ao mtodo convencional, desde que os sejam apropriadamente selecionados, os quais podem ser rpida e convenientemente determinados a partir de grficos tridimensionais. Se os comprimentos de onda de excitao e emisso so variados simultaneamente, porm a diferentes velocidades, a tcnica conhecida como espectroscopia de fluorescncia sincronizada de ngulo varivel.129,155 Essas diferentes velocidades permitem a construo de planos em ngulos entre +90O e 90O ao eixo X de excitao em toda a extenso do espectro completo. Esta tcnica mais seletiva e foi proposta por Kubic em 1980,154 e tem sido aplicada determinao simultnea das vitaminas B2 e B6,158 na determinao simultnea dos diurticos, furosemida, triamteno epiretamida,129 assim como em amostras ambientais de hidro-carbonetos aromticos policclicos.159 Quando o ngulo da trajetria da varredura variado continuamente para descrever algum caminho desejado, a tcnica conhecida como espectroscopia de fluorescncia sincronizada de ngulo varivel no-linear.155 Esta tcnica tem sido empregada na determinao seletiva de cloropromazina na presena de seu produto de degradao sulfxido de cloropromazina e de oxitetra-ciclina na presena de aditivos colocados nas formulaes farmacuticas comerciais (vitamina C, tiamina, riboflavina, entre outros).160 A introduo de artifcios matemticos, como o emprego da derivada de primeira e segunda ordem em combinao com a fluorimetria sincronizada, tem sido empregada para aumentar as caractersticas espectrais minoritrias e para conseguir uma identificao mais confivel. J a segunda derivada do espectro sincronizado pode ser til para resolver bandas muito prximas nos casos de anlise de misturas. As principais caractersticas desta tcnica so a seletividade, sensibilidade, rapidez, simplicidade e baixo custo.152 A tcnica tem sido empregada para determinar simultaneamente meticilina e naftilina153 e norfloxacina na presena de cido nalidxico, ambas aplicando-se a primeira derivada do espectro sincronizado. A norfloxacina foi determinada em urina empregando-se a segunda derivada do espectro sincronizado.108 De la Pena e colaboradores157 descreveram um mtodo para determinao simultnea dos cidos saliclico e salicilrico na anlise de urina, atravs da espectroscopia sincronizada com a primeira derivada. Finalmente, em 1996 Pulgarin e Molina155 reportaram uma nova tcnica fluorimtrica chamada de espectroscopia de fluorescncia sincronizada de matriz, isopotencial, onde um programa computacional obtm uma trajetria juntando pontos com a mesma intensidade (trajetria isopotencial) do espectro tridimensional completo. Esta tcnica especialmente til para remover o sinal de fundo proveniente da matriz permitindo a determinao seletiva de algum composto em amostras complexas e tem sido satisfatoriamente aplicada na determinao de cido gentsico155 e cido nalidxico156 em urina.

Emprego de tcnicas de separao com deteco fluorimtrica As Tabelas 4 e 5 relacionam os frmacos que tm sido quantificados empregando mtodos de separao como CLAE161-177 (Tabela 4) e eletroforese capilar50,178-181 (Tabela 5) na anlise de amostras complexas, como plasma e urina, ou na quantificao de misturas de frmacos e em estudos relacionados com bioequiva-lncia, farmacocintica e biodisponibilidade. Desta forma, estas tcnicas apresentam grande potencialidade de uso em situaes especficas onde a matriz da amostra seja muito complexa. A espectroscopia de luminescncia exibe inmeras caractersticas vantajosas quando comparada com mtodos j existentes e bem estabelecidos, pois compostos que aparentemente no apresentam fluorescncia nativa podero ser detectados atravs de tcnicas fluorescentes no-convencionais. As tcnicas no-convencionais conferem maior sensibilidade e seletividade metodologia, uma vez que no necessrio realizar etapas prvias de separao, como ocorre nos mtodos cromatogrficos. Ressalta-se ainda que a implementao em anlise de rotina destas tcnicas no-convencionais no acarretar custo adicional de instrumentao, apenas depender de um treinamento e um software adequados para a execuo dos experimentos e para o tratamento de dados. CONSIDERAES FINAIS E CONCLUSES O controle da qualidade de produtos farmacuticos um ramo da qumica analtica que tem um grande impacto econmico, social e principalmente na sade pblica, de forma tal que o desenvolvimento de metodologias analticas confiveis, rpidas e precisas para determinao de seus princpios ativos ainda bem-vindo. Neste contexto, a espectroscopia de luminescncia apresenta-se como uma tcnica adequada e promissora para esses objetivos. A literatura relata uma ampla gama de metodologias analticas empregadas para a determinao fluorescente de frmacos, que vo desde a modificao do ambiente qumico ao redor do analito para promover fluorescncia em soluo; derivatizao ou complexao da molcula alvo com outras, para gerar uma espcie fluorescente; determinao da fluorescncia em fase slida, at o emprego de tcnicas fluorimtricas mais sofisticadas, como espectroscopia sincronizada, espectroscopia sincronizada derivada e fluorescncia de varredura de ngulo varivel. As vantagens das anlises por fluorescncia incluem economia, reduo no tempo de anlise e na quantidade de rejeitos lanados ao meio ambiente, quando comparada com anlises que empregam tcnicas de separao acopladas com deteco fluorimtrica, visto que pode ser dispensado, em alguns casos, o pr-tratamento de amostra, e at o preparo de solues nos casos da determinao fluorimtrica em fase slida. A versatilidade das tcnicas de amostragem dos novos espectrmetros de luminescncia, como o acoplamento de fibras pticas, anlise em fluxo e monitoramento em fase slida, aliada s inmeras possibilidades para obter compostos fluorescentes, poder implementar novas metodologias baseadas em lumi-nescncia para determinao de substncias de relevncia teraputica. Assim, a quantificao luminescente de analitos, como filtros solares orgnicos, cido p-metocinmico, 2-etil-metil-p-metoxicinamato182 e derivados da benzofenona;183191 substncias estrognicas, como os derivados do estradiol; e antiinflamatrios no-esterides (AINEs) como a indometacina, acetamicina, ibuprofeno, e muitos outros frmacos, ser plausvel dependendo apenas da habilidade do pesquisador para investigar e/ou explorar novas rotas alternativas que permitam quantificar esses analitos atravs da espectroscopia de luminescncia. Por outro lado, a anlise fluorescente diretamente na matriz da amostra pode se tornar uma realidade, visto a excelente resposta

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Tabela 4. Determinao de frmacos empregando CLAE e deteco fluorimtrica Princpio Ativo Classificao Amostra analisada Ref. Alcalides derivados da efedrina{(-) norefedrina, Estimulantes simpatominticos para Comprimentos, cpsulas e p 161 (+) norpseudoefedrina, (-) efedrina, (+) pseudo- perda de apetite e aumento muscular. efedrina, (-) N -metilefedrina, (+) N metilpseudoefedrina}e () sinefrina cido oxolnico Antibitico Na planta Fontinalis antipyretica 162 Captopril Antiipertensivo Plasma, para estudos 163 farmacocinticos. Derivados do cido quinolnico (cido nalidxico, Quimioterpicos Urina, para monitoramento 164 cido 7-hidroxi-metilnalidxico, cido oxolnico, Antibiticos de 6 cidos derivados de cido cido piromdico, cido pipemdico) e do cido quinolnico e cinolnico. cinolnico (cinoxacina) Derivados das quinolonas (ciprofloxacina, danoflo- Antibiticos Carnes de frango, porco, bovino, 165 xacina, difloxacina, enrofloxacina, flumequina, ovino e peixe. marbofloxacina, cido nalidixico, cido oxolnico e sarafloxacina) Derivados da tetraciclina (clorotetraciclina, Antibiticos Comprimidos contendo cada 166 doxiciclina, oxitetraciclina e tetraciclina) frmaco individualmente. Digoxina Tratamento de falncia cardaca Solues de digoxina e seus 167 metablitos (digoxigenina, digoxigenina monodigitoxosida, digoxigenina bisdigitoxisida, diidrodigoxina. Combina imuno-ensaio com HPLC. Digoxina Tratamento de falncia cardaca Soro e plasma, para estudos 168 farmacocinticos. Derivados das quinolonas (cido nalidixico, Antibiticos Carnes de gado e porco. 169 cido oxolnico, cido pipemdico, cinoxacina, ciprofloxacina, danofloxacina, difloxacina, flumequina e norfloxacina). Diurticos (amilorida, bendroflumetiazida, Diurticos Urina de voluntrios sadios. 170 bimetanida, furosemida, hidroflumetiazida, piretanida e triamtereno) Estrgenos (17-estradiol, 17-etinilestradiol) Anticoncepcionais Amostras sintticas de gua 171 contendo nveis de estrognios na faixa de concentrao de ng L-1. Estrgenos (estriol, 17-estradiol,17-estradiol, Anticoncepcionais Urina proveniente de voluntrios 172 17-etinilestradiol, 4-nonilfenol, bisfenol A) de ambos os sexos. Furosemida Diurtico Leite de vaca na presena de outros 173 diurticos, drogas e antibiticos usadas na dieta do gado Gliburida Hipoglicmico Plasma, para realizar estudos 174 farmacocinticos, biodisponibilidade e bioequivalncia. Itraconazol Antimictico Plasma, para monitoramento 175 em nveis teraputicos em pacientes com transplante de medula ssea. -Metildopa Antiipertensivo Plasma, para estudos de 176 bioequivalncia. Triamtereno Diurtico Urina, para monitoramento de 177 17 diurticos. Apenas o triamtereno foi monitorado por fluorescncia. que a determinao de medicamentos diretamente em fase slida tem apresentado. Isto abre a possibilidade de desenvolvimento de metodologias de anlise para quantificar princpios ativos em outros tipos de formulaes como cremes, gis e ungentos, alm das amostras slidas (comprimidos pulverizados e cpsulas) que j tm sido propostas na literatura. A quimiluminescncia como ferramenta analtica tambm pode oferecer muitas vantagens, principalmente em sistemas que possuem boa eficincia quntica, como luminol e peroxi-oxalato. Contudo, pesquisas que elucidem reao quimiluminescente de frmacos (derivatizados ou no) tm sido muito pouco exploradas, o que torna esta uma rea de pesquisa bastante interessante. As

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Tabela 5. Determinao de frmacos empregando electroforese capilar e deteco fluorimtrica Princpio Ativo Classificao Amostra analisada Solues padro dos frmacos. Medidas realizadas atravs de eletroforese capilar acoplada a um ensaio imuno-fluorescente. Urina, para testes de dopping, atravs eletroforese capilar de zona (CZE). Urina, atravs eletroforese capilar de zona (CZE) e cromatografia capilar de eletrocintica miscelar (MECC). Plasma, atravs de eletroforese capilar acoplada a um ensaio imuno-fluorescente. Ref. 178 Digoxina e gentamicina Antibitico Diurticos (amilorida, bendroflumetiazida, Diurticos bumetanida e triamtereno) Furosemida Diurtico Vancomicina Antibitico muitas inovaes das tcnicas de deteco quimiluminescente tambm podem ser uma ferramenta promissora na determinao de molculas de importncia biomdica e ambiental conforme destacado na literatura.192 Desta forma, estudos relacionados com a utilizao de mtodos luminescentes em geral, na determinao de compostos farmacuticos e cosmticos, ainda apresentam um grande campo de explorao e merecem ser incentivados. MATERIAL SUPLEMENTAR O diagrama de Jablonski (Figura 1S), mostrando os processos fsicos que podem ocorrer aps uma molcula absorver um fton com energia da faixa ultravioleta ou visvel, apresentado como material suplementar (disponvel em http://quimicanova.sbq.org.br em forma de arquivo PDF, com acesso gratuito), pois pode ser encontrado em livro texto.43 REFERNCIAS
1. Feng, S.; Wang, J.; Chen, X., Fan, J.; Spectrochim. Acta, Part A 2005, 61, 841. 2. Paleologos, E. K.; Stalikas, C. D.; Tzouwara-Karayanni, S. M.; Karayannis, M. I.; Anal. Chim. Acta 2001, 436, 49. 3. Song, Z. H.; Zhang, N.; Talanta 2003, 60, 161. 4. Tang, Z.; Graefe, K.; March, C.; Karnes, H. T.; Microchim. Acta 2004, 144, 1. 5. Chen, G.; Schneider, M. J.; Darwish, A. M.; Lehotay, S. J.; Freeman, D. W.; Talanta 2004, 64, 252. 6. Schneider, M. J.; J. Agric. Food Chem. 2004, 54, 7809. 7. Guilbault, G. G.; Practical Fluorescence, 2nd ed., Wiley: New York, 1990. 8 Soper, S. A.; McGown, L. B.; Warner, I. M.; Anal. Chem. (Washington, DC, U. S.) 1994, 66, 428R. 9 Murata, Y.; Matsui, H.; Hirano, K. I.; Kondo, Y.; Yanaka, A.; Nakahara, A.; Tanaka, N.; Muto, H.; J. Gastroenterology 2000, 35, 510. 10 Arancibia, J. A.; Escandar, G. M.; Talanta 2003, 60, 1113. 11. Turro, N. J.; Modern Molecular Photochemistry, University Science Books: California, 1991. 12. Prez-Ruiz, T.; Martnez-Lozano, C.; Toms, V.; Fenol, J.; Analyst (Cambridge, U. K.) 2001, 126, 1436. 13. Al-Ghannam, S. M.; El-Brashy, A. M.; Al-Farhan, B. S.; Il Frmaco 2002, 57, 625. 14. Surez-Rodrguez, J. L.; Daz-Garca, M. E.; Biosens. Bioelectron. 2001, 16, 955.

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Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia

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Quim. Nova, Vol. 31, No. 7, S1, 2008

Maria D. P. T. Sotomayor Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, 14801-970 Araraquara SP, Brasil Iara Lcia T. Dias* e Marcos R. V. Lanza Curso de Farmcia, Universidade So Francisco, 12916-900 Bragana Paulista SP, Brasil Altair B. Moreira Departamento de Qumica e Cincias Ambientais, Universidade Estadual Paulista, 15054-000 So Jos do Rio Preto SP, Brasil Lauro T. Kubota Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, 13083-970 Campinas SP, Brasil

Figura 1S. Diagrama de Jablonski, mostrando os processos fsicos que podem ocorrer aps uma molcula absorver um fton com energia da faixa ultravioleta ou visvel. S0 o estado eletrnico fundamental, S1, e T1 so os estados excitados singleto e tripleto de menor energia, respectivamente. S2 um segundo estado excitado singleto. As setas retas representam os processos envolvendo ftons, e as setas onduladas so as transies no-radioativas (que no emitem radiao)43

*e-mail: iaratescarollo@terra.com.br

Material Suplementar

Aplicao e avanos da espectroscopia de luminescncia em anlises farmacuticas