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SRIE EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR

MTODOS EXPERIMENTAIS NO ESTUDO DE PROTENAS

Copyright by Fiocruz, 2013 Todos os direitos desta edio reservados Fundao Oswaldo Cruz. Av. Brasil, 4365 Proibida a reproduo total ou parcial deste contedo

Editores Helene Santos Barbosa Milton Ozorio Moraes Rubem Figueiredo Sadok Menna Barreto Coordenadores Fernando Ariel Genta Richard Hemmi Valente Autores Caroline da Silva Moraes Francisco Odencio Rodrigues de Oliveira Junior Gustavo Masson Karina Mastropasqua Rebello Lvia de Oliveira Santos Narayana Fazolini P. Bastos Rozana Crte-Real Faria Revisores Andr Teixeira da Silva Ferreira Claudia Masini dAvila-Levy Daniela Gois Beghini Luciana Pizzatti Barboza Magno Rodrigues Junqueira Projeto Grfico e Capa Simone Oliveira

Ficha catalogrfica elaborada pela Biblioteca de Cincias Biomdicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ M593 Mtodos experimentais no estudo de protenas / Caroline S. Moraes...[et al]. - Rio de Janeiro: IOC, 2013. 84 p. : il. - (Srie em biologia celular e molecular) Inclui bibliografia ISBN 978-85-99974-04-9 1. Bioqumica. 2. Protenas. 3. Enzimas. 4. Purificao de protenas. 5. Protemica. I. Moraes, Caroline S. II. Ttulo. III. Srie. CDD: 571.6

Caroline S. Moraes Francisco O. R. Oliveira Junior Gustavo Masson Karina M. Rebello Lvia O. Santos Narayana F. P. Bastos Rozana C. R. Faria

SRIE EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR


MTODOS EXPERIMENTAIS NO ESTUDO DE PROTENAS

1 edio Rio de Janeiro IOC - Instituto Oswaldo Cruz

Apresentao coleo
Os cursos de frias no Instituto Oswaldo Cruz surgiram com o objetivo de oferecer aos estudantes de graduao a oportunidade de estudar em uma Instituio de Pesquisa de excelncia, abordando em profundidade temas incomuns grade curricular da universidade. Agregado a este objetivo principal, a formatao desse curso permitiria o trnsito e vivncia dos estudantes no ambiente cientfico dos diferentes laboratrios do IOC. Alm disso, a possibilidade de estimular os estudantes de ps-graduao do IOC a desenvolvem atividades didticas terico-prticas, preencheria tambm uma lacuna importante na formao dos mestres e doutores da nossa instituio que no possui cursos de graduao. A ideia surgiu em 2007, e desde sua primeira edio, os cursos de frias do IOC versam sobre temas relevantes da rea de pesquisa em sade no Brasil. De 2007 a 2012, foram realizadas 11 edies dos Cursos de Frias, nas verses vero e inverno, tendo sido oferecidas as mais variadas disciplinas, coordenadas por mais de 50 pesquisadores do IOC, envolvendo centenas de mestrandos e doutorandos e mais de 1.000 alunos oriundos de dezenas de universidades de todo o pas. Desde o incio, um estmulo adicional aos professores do curso foi o desenvolvimento de material didtico original para servir de apoio s aulas tericas e prticas. O resultado desse esforo coletivo se traduz nesta coleo. Os textos foram desenvolvidos em linguagem simples e objetiva e contedo inovador, abordando temas transversais em biocincias. Assim, desenvolvemos fascculos para a formao de jovens cientistas na vanguarda do conhecimento em reas que apresentam hibridismo e multidisciplinaridades absolutamente cruciais para o desenvolvimento cientfico e tecnolgico do pas. Estamos convencidos de que este material permitir aos leitores acesso rpido e fcil a contedos no abordados durante a graduao, alm de possibilitar a integrao de atividades didticas e o estmulo redao cientfica entre ps-graduandos do IOC. Boa leitura.

Helene S. Barbosa Milton O. Moraes Rubem F. S. Menna-Barreto

Nota dos organizadores


O curso Mtodos Experimentais no Estudo de Protenas foi um dos primeiros cursos de frias realizados no Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), surgindo para suprir a carncia de disciplinas didticas na ps-graduao de uma instituio que no conta com cursos de graduao. Achamos interessante oferecer um curso bsico sobre tcnicas utilizadas, pretendendo em termos gerais, abordar desde medidas bsicas de protenas e ensaios de atividade enzimtica at a purificao de protenas e anlise protemica. A concepo e realizao das trs edies do curso, alm de extremamente gratificantes, mostraram-se um exerccio de compreenso mtua e dilogo entre coordenadores (pesquisadores do IOC), professores (alunos de ps-graduao do IOC) e alunos (graduandos de diferentes instituies de ensino superior do pas). A primeira edio foi realizada no vero de 2009 seguida por outra no inverno do mesmo ano, sendo a ltima no vero de 2010. Ao longo desses dois anos foi possvel acompanhar no s a evoluo das aulas tericas e prticas, mas tambm o ganho de desenvoltura e desenvolvimento conceitual dos alunos de ps-graduao envolvidos. A proposta de aulas tericas em sala seguidas de prticas em laboratrio, com experimentos relacionados ao tema de cada aula, mostrou-se um grande desafio e propiciou aos jovens professores a percepo das dificuldades envolvidas no planejamento e na realizao de resultados padronizados com o objetivo de demonstrar cada tcnica. Aps trs edies, observamos que essa frmula parecia esgotada, sendo o momento de abrir espao para outros cursos com diferentes temticas. Entretanto, a oportunidade de apresentar novamente o curso, agora na forma impressa, propiciou aos alunos no s a experincia de sedimentar e organizar o conhecimento adquirido ao longo de sua realizao, mas tambm a chance de divulgar o contedo do curso para um pblico mais amplo. Os captulos gerados foram submetidos reviso por um corpo independente de pesquisadores, ao qual gostaramos de externar nossos efusivos agradecimentos por terem dedicado seu precioso tempo para a correo dos captulos, assim como pelas inestimveis contribuies para o texto. Vale ressaltar que qualquer erro que eventualmente tenha permanecido de responsabilidade exclusiva dos autores e dos organizadores. Finalmente, agradecemos no s ao Instituto Oswaldo Cruz, que como instituio propiciou as condies para execuo das aulas, como tambm a todos os envolvidos, que pela boa vontade, energia e inspirao transformaram o nosso curso em uma experincia nica e exemplar para todos os participantes. Fernando A. Genta Richard H. Valente

Sumrio
INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS....................................................................................... 8 1.1. Introduo.....................................................................................................................................................................................9 1.2. Aminocidos ..............................................................................................................................................................................9 1.2.1. Classificao................................................................................................................................................................... 11 1.2.1.1. Essenciais e no essenciais........................................................................................................................ 11 1.2.1.2. Cadeia lateral.................................................................................................................................................... 11 1.2.1.2.1. Aminocidos com cadeias laterais apolares e alifticas.............................................. 11 1.2.1.2.2. Aminocidos com cadeias laterais aromticas............................................................... 12 1.2.1.2.3. Aminocidos com cadeias laterais polares no carregadas..................................... 12 1.2.1.2.4. Aminocidos com cadeias laterais carregadas negativamente (cidos)........... 12 1.2.1.2.5. Aminocidos com cadeias laterais carregadas positivamente (bsicos).......... 12 1.3. Protenas....................................................................................................................................................................................14 1.3.1. Funes.............................................................................................................................................................................14 1.3.1.1. Protenas Estruturais....................................................................................................................................14 1.3.1.2. Enzimas...............................................................................................................................................................14 1.3.1.3. Protenas Transportadoras....................................................................................................................... 15 1.3.1.4. Protenas reguladoras................................................................................................................................. 15 1.3.2. Classificao................................................................................................................................................................. 15 1.3.2.1. Composio...................................................................................................................................................... 15 1.3.2.2. Forma...................................................................................................................................................................16 1.3.3. Nveis de organizao estrutural das protenas..........................................................................................16 1.3.4. Foras envolvidas no enovelamento de protenas....................................................................................18 1.4. Mtodos de quantificao de protenas....................................................................................................................19 1.4.1. Mtodo do biureto (Sensibilidade 0,5 a 10 mg por mL)........................................................................20 1.4.2. Mtodo de Folin-Lowry (Sensibilidade 0,1 a 0,3 mg por mL)............................................................. 21 1.4.3. Mtodo de BCA (Sensibilidade 0,1 a 0,5 mg por mL)............................................................................. 21 1.4.4. Mtodo de Bradford (Sensibilidade 0,06 a 0,3 mg por mL).............................................................. 21 ENZIMOLOGIA: ENSAIOS ENZIMTICOS..............................................................................................24 2.1. Introduo................................................................................................................................................................................. 25 2.2. Enzimas..................................................................................................................................................................................... 25 2.3. Nomenclatura enzimtica................................................................................................................................................28 2.4. Cofatores.................................................................................................................................................................................29 2.5. Reao enzimtica...............................................................................................................................................................30 2.6. Ensaios enzimticos........................................................................................................................................................... 32 2.7. Inibio enzimtica..............................................................................................................................................................39 2.8. Concluso.................................................................................................................................................................................40

MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS.............................................................................................42 3.1. Propriedades das protenas............................................................................................................................................43 3.1.1. Propriedades eltricas.............................................................................................................................................43 3.1.2. Solubilidade..................................................................................................................................................................44 3.1.3. Soluo-Tampo.........................................................................................................................................................45 3.1.4. Desnaturao protica...........................................................................................................................................46 3.2. Obteno do extrato celular........................................................................................................................................... 47 3.3. Separao de protenas....................................................................................................................................................49 3.3.1. Centrifugao..............................................................................................................................................................49 3.3.2. Dilise............................................................................................................................................................................... 51 3.3.3. Cromatografia............................................................................................................................................................ 53 ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING........................................................................ 60 4.1. Histrico.....................................................................................................................................................................................61 4.2. Princpio da tcnica e aplicaes..................................................................................................................................61 4.3. Tipos de Eletroforese........................................................................................................................................................63 4.3.1. Eletroforese livre.......................................................................................................................................................63 4.3.2. Eletroforese com suporte....................................................................................................................................63 4.3.2.1. Eletroforese em gel de agarose...........................................................................................................63 4.3.2.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE).............................................................................64 4.3.2.3. Eletroforese nativa....................................................................................................................................65 4.3.2.4. Eletroforese em condies desnaturantes (SDS-PAGE).......................................................65 4.3.3. Eletroforese capilar................................................................................................................................................. 67 4.4. Zimografia...............................................................................................................................................................................68 4.5. Western blot / Immuno blot............................................................................................................................................69 INTRODUO PROTEMICA.................................................................................................................... 72 5.1. Introduo .................................................................................................................................................................................73 5.2. Preparao da amostra......................................................................................................................................................75 5.3. 2D-PAGE Eletroforese Bidimensional ............................................................................................................... 76 5.3.1. Focalizao isoeltrica (IEF) Primeira Dimenso................................................................................... 76 5.3.2. SDS-PAGE .................................................................................................................................................................... 78 5.4. Introduo espectrometria de massas................................................................................................................. 79

INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS


Francisco Odencio Rodrigues de Oliveira Junior

INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS

Cap. 1

1. INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS 1.1. Introduo


Uma das principais caractersticas dos seres vivos a capacidade de transformar a matria; seja matria presente no meio externo, seja aquela acumulada no prprio organismo, fazendo parte da sua composio. Os fenmenos de transformao da matria realizados pelos seres vivos do-se na maior parte dos casos por modificaes qualitativas das molculas (reaes qumicas) catalizadas por enzimas. Desta forma podemos dizer que os seres vivos so agentes de transformaes qumicas, sendo responsveis no ecossistema terrestre por um grande nmero de converses de matria e energia, as quais permitem a vida em nosso planeta. Logo, a Bioqumica a cincia que estuda as reaes qumicas produzidas diretamente ou indiretamente pelos seres vivos, que em seu conjunto constituem os processos biolgicos. As protenas so macromolculas orgnicas que apresentam a capacidade de atuar em conjunto com ons ou outras molculas orgnicas, sendo responsveis por inmeros fenmenos observados nos seres vivos e, por conseguinte, tm um papel de destaque dentro dos processos biolgicos. Desta forma, iremos abordar algumas metodologias bioqumicas clssicas utilizadas para estudar e analisar protenas. Inicialmente, iremos rever alguns conceitos importantes.

1.2. Aminocidos
Dentre os inmeros aminocidos presentes na natureza, apenas 22 so considerados proteinognicos. Os aminocidos proteinognicos so aqueles que podem ser encontra-

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dos como constituintes de protenas e que tenham sido incorporados molcula protica pelo maquinrio celular em funo da existncia de cdon especificado no RNA mensageiro. Logo, aminocidos gerados pela modificao ps-traducional da molcula protica no so considerados proteinognicos. Dentre os 22 aminocidos proteinognicos, selenocistena e pirrolisina ocorrem apenas em procariotos, apresentam mecanismo de incorporao molcula protica especficos e so pouco abundantes. Por isso, no sero abordados neste texto. Aminocidos proteinognicos so molculas orgnicas tambm conhecidas como aminocidos do tipo alfa. Neste tipo de molcula, o carbono alfa est ligado a um grupamento amino (-NH2), um grupamento de cido carboxlico (-COOH), uma cadeia lateral variada e um hidrognio. As cadeias laterais variam de acordo com suas estruturas, tamanho e carga eltrica, fatores que iro influenciar na solubilidade dos aminocidos em gua. Em todos os aminocidos, exceto glicina, o carbono alfa assimtrico (quiral ou oticamente ativo), ou seja, apresenta um arranjo tetradrico com quatro grupos substituintes diferentes que podem ocupar disposies espaciais distintas, as quais so entre si imagens especulares no superponveis (estereoismeros). Esta caracterstica faz com que molculas que contenham centros quirais tenham atividade tica, ou seja, a propriedade de desviar a luz plano-polarizada, sendo a direo desta rotao diferente para as duas formas. A classificao e nomenclatura dos estereoismeros foram baseadas em um composto de referncia, o gliceraldedo, atravs de anlises por difrao de raios-X. Desta forma, as configuraes relacionadas quelas do L-gliceraldedo e do D-gliceraldedo so designadas pela letra L e D, respectivamente (do latim laevus que significa esquerda e dexter que significa direita). Assim, os dois estereoismeros dos aminocidos so designados por L e D aminocidos (Figura 1.1) em funo da sua semelhana com o padro gliceraldedo. Os aminocidos que compem as protenas so sempre L-estereoismeros.

Figura 1.1.

Representao esquemtica de L e D ismeros de aminocidos.

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Cap. 1

1.2.1. Classificao
1.2.1.1. Essenciais e no essenciais
Essenciais, ou indispensveis, so os aminocidos que o organismo humano no tem a capacidade de sintetizar. Assim, estes devem ser obrigatoriamente ingeridos atravs de alimentos. Logo, a alimentao deve ser a mais variada possvel para que o organismo obtenha uma diversidade maior destes aminocidos. A carne, o leite e o ovo so as principais fontes destes aminocidos. Por outro lado, aminocidos no-essenciais, ou dispensveis, so os que nosso organismo pode sintetizar.

Aminocidos
Essenciais Arginina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Valina No-Essenciais Alanina Aspargina cido Asprtico Cistena cido Glutmico Glutamina Glicina Prolina Serina Tirosina

Tabela 1.1. Os vinte aminocidos proteinognicos mais conhecidos.

1.2.1.2. Cadeia lateral


Os aminocidos podem ser classificados de acordo com suas cadeias laterais (Figura 1.2), onde podemos ressaltar principalmente dois critrios de classificao: polaridade e carga destas cadeias. Essas propriedades qumicas isoladas das cadeias laterais persistem mesmo aps a insero de resduos de aminocidos na cadeia protica e desta forma o conjunto destes aminocidos conferir caractersticas peculiares cada protena.

1.2.1.2.1. Aminocidos com cadeias laterais apolares e alifticas


As cadeias laterais desta classe so hidrocarbonetos (compostos de carbono e hidrognio) sendo caracterizadas como grupamentos qumi-

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cos hidrofbicos apolares. Os aminocidos pertencentes a este grupo so: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina e prolina.

1.2.1.2.2. Aminocidos com cadeias laterais aromticas


A fenilalanina, o triptofano e a tirosina constituem este grupo. Eles so relativamente apolares e apresentam anis aromticos em sua estrutura. O triptofano e a tirosina so capazes de absorver luz na regio ultravioleta do espectro, fato esse que responsvel pela absorvncia da luz, por protenas contendo estes aminocidos, no comprimento de onda de 280 nm.

1.2.1.2.3. Aminocidos com cadeias laterais polares no carregadas


As cadeias laterais deste grupo so hidroflicas, ou seja, interagem bem com a gua, por apresentarem grupos funcionais que formam ligaes de hidrognio com a gua. So constituintes deste grupo: serina, treonina, cistena, metionina, asparagina e glutamina. A cistena contm um grupo sulfidrila (-SH) capaz de formar ligaes dissulfeto, as quais so importantes para a manuteno da estrutura tridimensional de algumas protenas.

1.2.1.2.4. Aminocidos com cadeias laterais carregadas negativamente (cidos)


Em pH neutro, as cadeias laterais desses aminocidos encontram-se completamente ionizadas, contendo um grupo carboxilato carregado negativamente. So constituintes deste grupo: cido asprtico e cido glutmico.

1.2.1.2.5. Aminocidos com cadeias laterais carregadas positivamente (bsicos)


Os aminocidos deste grupo apresentam suas cadeias laterais com carga positiva quando em pH cidos. So constituintes deste grupo: histidina, lisina e arginina.

1.2.2. Outras funes dos aminocidos


Os aminocidos no atuam somente como unidades estruturais para a formao das protenas, mas tambm desempenham diversas funes. So precursores de uma srie de substncias biologicamente importantes como

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Cap. 1

Figura 1.2. Estrutura molecular de 20 aminocidos proteinognicos. Entre parnteses esto apresentadas as abreviaturas (de trs letras e de uma letra) dos nomes de cada um dos aminocidos.

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hormnios, alcalides e pigmentos. Dentre outras funes, a glicina, por ser um aminocido altamente hidroflico, frequentemente adicionada a outras molculas para torn-las mais solveis, de modo que possam ser, por exemplo, excretadas pela urina.

1.3. Protenas
Protenas so as macromolculas mais abundantes presentes em todos os sistemas vivos. Elas representam cerca de 50 a 80% do peso seco das clulas. As protenas so compostas por uma combinao de at 22 aminocidos e apresentam uma grande variedade estrutural devido ao nmero expressivo de possibilidades de sequncias de aminocidos. Em teoria, um decapeptdeo (peptdeo composto por 10 aminocidos) poderia apresentar 2,2x1011 (220 trilhes) de sequncias (arranjos) diferentes com o mesmo nmero de resduos de aminocidos na molcula. Mas como os aminocidos so capazes de formar protenas? Os aminocidos apresentam a capacidade de formar ligaes covalentes entre os grupos amino (NH2) de um aminocido e carboxlico (COOH) de outro, reao que catalisada por um conjunto de enzimas, formando as chamadas ligaes peptdicas. Assim, eles originam cadeias polipeptdicas que ao atingirem uma certa extenso (cerca de 50 resduos) recebem o nome de protena.

1.3.1. Funes
Por apresentarem uma grande variedade estrutural, as protenas desempenham uma srie de funes biolgicas e podem ser agrupadas de acordo com essas funes.

1.3.1.1. Protenas Estruturais


Participam da estruturao dos tecidos servindo como filamentos de suporte, cabos ou lminas para fornecer proteo e resistncia a estruturas biolgicas. Podemos citar como exemplo o colgeno que uma protena altamente resistente a tenses que est presente em cartilagens e tendes e protenas do citoesqueleto, tais como actina e tubulina.

1.3.1.2. Enzimas
um grupo altamente variado e especializado de protenas que exibe atividade cataltica. Dentre as protenas com funes enzimticas podemos citar, entre outras, quinases, amilases, lipases e isomerases.

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1.3.1.3. Protenas Transportadoras


Estas protenas atuam no transporte eficiente de muitas molculas, tais como: ons, acares, aminocidos, nucleotdeos e metablitos. Esto presentes nas membranas da clula, no espao intracelular e tambm no plasma sanguneo. Um exemplo de protena transportadora a hemoglobina dos eritrcitos, que responsvel pelo transporte de O2 (oxignio) dos alvolos pulmonares para os tecidos e CO2 (dixido de carbono) dos tecidos para os pulmes, no fenmeno denominado de respirao aerbica.

1.3.1.4. Protenas reguladoras


Estas tm participao na regulao da atividade celular ou fisiolgica. Entre elas esto presentes muitos hormnios proticos, que so sintetizados por glndulas endcrinas. Ao serem liberados na corrente sangunea, podem estimular ou inibir vias metablicas regulando, desta forma, processos celulares. Podemos citar como exemplo a insulina e o glucagon. interessante como um grupo de apenas 20 aminocidos pode originar uma variedade to grande de protenas com propriedades e funes to diferentes. Vale a pena ressaltar que a mudana de um nico aminocido na cadeia primria pode desorganizar completamente a estrutura da protena fazendo com que esta perca sua funo.

1.3.2. Classificao 1.3.2.1. Composio


Muitas protenas so constitudas apenas por uma cadeia de aminocidos, no apresentando nenhum outro grupo qumico. Estas so consideradas protenas simples. Entretanto, existem outras protenas que alm dos aminocidos apresentam outros componentes qumicos e so chamadas de protenas conjugadas. A parte no aminoacdica de uma protena conjugada chamada de grupo prosttico. As protenas conjugadas so classificadas de acordo com a natureza de seus grupos prostticos, onde lipoprotenas contm lipdeos, glicoprotenas contm molculas de acar e metaloprotenas contm um metal especfico. Normalmente este grupo prosttico ir desempenhar um papel importante na funo da protena.

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1.3.2.2. Forma Protenas globulares


A cadeia polipeptdica enovela-se de maneira compacta, resultando em uma molcula esfrica e globular; so geralmente solveis em gua e desempenham diversas funes. Ex: enzimas, albumina, globulinas, hemoglobina.

Protenas fibrosas
A cadeia polipeptdica arranjada em forma de longos cordes ou em forma de folhas; so geralmente insolveis em gua. Ex: actina, tubulina, colgeno e -queratina.

1.3.3. Nveis de organizao estrutural das protenas


Muitas conformaes diferentes so possveis para uma macromolcula como no caso de protenas. Entretanto, poucas destas conformaes possuem atividade biolgica; que so chamadas conformaes nativas. Conceitualmente, a estrutura das protenas pode ser dividida em quatro diferentes nveis de organizao: primrio, secundrio, tercirio e quaternrio (Figura 1.3).

Figura 1.3. Representao dos quatro nveis de organizao estrutural das protenas.

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Cap. 1

Estrutura primria A sequncia linear dos aminocidos unidos por ligaes peptdicas determina a estrutura primria das protenas. Esta estrutura resulta em uma longa cadeia de aminocidos, com uma extremidade amino terminal (NH2) e uma extremidade carboxi terminal (COOH). Sua estrutura primria pode ser desfeita atravs de hidrlise qumica ou enzimtica das ligaes peptdicas, gerando peptdeos ou aminocidos livres. Esta sequncia primria contm toda a informao necessria para que a protena se enovele alcanando sua conformao nativa. Estrutura secundria - Refere-se ao dobramento regular de regies da cadeia polipeptdica. Os dois tipos mais comuns de estrutura secundria so: alfa-hlice e folha beta-pregueada (Figura 1.4). As estruturas em alfa-hlice apresentam-se em aspecto cilndrico com arranjo helicoidal dos aminocidos, que mantido pelas ligaes de hidrognio paralelas ao eixo da hlice. Nas estruturas em folha beta-pregueada, as ligaes de hidrognio formam-se entre as regies adjacentes do polipeptdeo que esto na mesma direo (paralelas) ou em direes opostas (antiparalelas).

Figura 1.4. Representao esquemtica de estruturas secundrias. (A) alfa-hlice e (B) folha beta-pregueada.

Estrutura terciria - Refere-se ao arranjo tridimensional de todos os aminocidos da cadeia polipeptdica. A conformao nativa mantida pelas mltiplas interaes no covalentes que se formam entre os resduos ou grupamentos prostticos da protena. A protena precisa ainda estabelecer uma srie de ligaes no-covalentes entre diferen-

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tes pores da cadeia polipeptdica. Em alguns casos, ainda necessria a formao de ligaes covalentes do tipo dissulfeto. As ligaes dissulfeto (covalentes) entre resduos de cistena so includas na estrutura terciria. Estrutura quaternria Refere-se ao arranjo espacial entre duas ou mais cadeias polipeptdicas com estruturas tercirias definidas. A natureza da interao entre as diferentes cadeias do tipo no-covalente gerando desde um dmero (duas cadeias) at um oligmero (mais de duas cadeias). Cada unidade de uma estrutura quaternria denominada de subunidade. Oligmeros podem ser do tipo homo oligmeros (subunidades com mesma estrutura primria) ou hetero oligmeros (diferentes estruturas primrias).

1.3.4. Foras envolvidas no enovelamento de protenas


Conforme mencionado anteriormente, a estrutura primria de uma protena, que a ordem dos aminocidos na cadeia polipeptdica, depende da formao de ligaes covalentes (ligaes peptdicas). Entretanto, as demais estruturas (secundria e terciria), cujos nveis de organizao so mais complexos, dependem de interaes fracas, do tipo no-covalentes, que ocorrem em maior nmero. Estas interaes fracas iro contribuir para que as protenas adotem uma conformao mais estvel com um nvel menor de energia livre e assim atinjam sua conformao nativa funcional. Neste ponto devemos levar em considerao as caractersticas das cadeias laterais de cada aminocido. Entretanto, quando os aminocidos esto compondo uma cadeia polipeptdica, no podemos consider-los como molculas independentes como fazemos quando estes esto isolados, uma vez que eles influenciam e sofrem influncia dos outros aminocidos que compem a molcula. Em seguida iremos discutir algumas das interaes que so importantes no enovelamento e manuteno da estrutura tridimensional das protenas. Aminocidos que apresentam cadeias laterais apolares tendem a se agrupar no centro da estrutura, como resultado de interaes hidrofbicas evitando desta forma o contato com a gua. As ligaes de hidrognio so observadas entre grupos polares e tm uma grande importncia na arquitetura da estrutura secundria (interao entre carbonilas e aminas da cadeia polipetdica) e terciria (interao entre cadeias laterais). Outra interao importante observada entre os aminocidos so as atraes eletroestticas, que se do atravs de cadeias laterais polares carregadas (por exemplo, pontes salinas, interaes on-dipolo) ou mesmo entre cadeias laterais neutras (interaes de Van der Waals).

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Como resultado desse enovelamento os resduos que esto prximos e interagindo entre si na estrutura terciria, podem estar muito distantes fisicamente na estrutura primria. Alm disso, importante ressaltar que a conformao nativa de uma protena pode ser alterada devido variao das condies s quais esta protena est submetida. Isto se deve a perturbaes nas interaes no-covalentes que estabilizam uma determinada estrutura.

1.4. Mtodos de quantificao de protenas


Agora que fizemos uma pequena reviso sobre as principais caractersticas dos aminocidos e das protenas iremos abordar as principais metodologias utilizadas para quantificao de protenas. A quantificao de protenas um mtodo empregado em anlises clnicas, nutrio animal, cincia de alimentos, bioqumica de protenas, entre outros. Na qumica de protenas, a quantificao um passo fundamental para o acompanhamento do processo de purificao, bem como auxilia as anlises fsico-qumicas posteriores das protenas purificadas. O padro-ouro em quantificao de protenas estabelecido pela tcnica de anlise de aminocidos. Entretanto, esta tcnica muito laboriosa e custosa para uso rotineiro. Por isso, os mtodos espectrofotomtricos utilizando comprimentos de onda na regio do ultravioleta ou do visvel so mais utilizados (mtodos colorimtricos ou colorimetria). A colorimetria uma tcnica analtica que avalia a capacidade dos solutos absorverem a luz em comprimentos de onda especficos. A medida da luz absorvida permite inferir sobre a concentrao de soluto em uma determinada soluo ou material biolgico. Este mtodo conhecido tambm por fotometria ou espectrofotometria. Ele indicado para se determinar a concentrao de solutos naturalmente corados como tambm de solutos incolores, mas adquirem cor mediante o emprego ajustado de certo reativo. Assim, concentraes das solues podem ser determinadas avaliando-se a absoro em um comprimento de onda apropriado. O aparelho utilizado o espectrofotmetro, cujo esquema geral pode ser visto na Figura 1.5. No espectrofotmetro, os raios luminosos emitidos por uma fonte de luz so linearizados em um colimador que capaz de emitir um feixe linear para o monocromador. O monocromador permite selecionar o comprimento de onda que incide sobre a soluo, usando-se um seletor de comprimento de onda (prisma). O comprimento de onda emitido pelo prisma apresenta maior poder de resoluo na cubeta, permitindo anlises tanto na regio do visvel quanto do ultravioleta. Em alguns aparelhos (fotocolormetros), um filtro tico deixa passar apenas certas faixas de comprimento de onda, sendo de uso limitado ao espectro da luz visvel.

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Vol. 1

Mtodos experimentais no estudo de protenas

A anlise quantitativa feita tendo como base a lei de Lambert-Beer. A lei de Lambert estabelece que a diminuio da intensidade de um feixe de luz monocromtica, em funo da espessura do meio absorvente atravessado, proporcional intensidade do feixe incidente, ou seja: a quantidade de luz diminui em progresso geomtrica (exponencial) e no aritmtica. Adicionalmente, a lei de Beer estabelece que a energia deste feixe luminoso decresce de maneira exponencial quando aumenta a concentrao do soluto presente no meio absorvente.

Figura 1.5. Esquema de um espectrofotmetro.

A seguir abordaremos alguns dos mtodos colorimtricos mais comumente utilizados para quantificao de protenas.

1.4.1. Mtodo do biureto (Sensibilidade 0,5 a 10 mg por mL)


O biureto um composto formado pelo aquecimento da uria a 180C. Quando ele colocado na presena de uma soluo de sulfato de cobre em meio alcalino forma-se um composto de cor azul. A cor devida formao de um complexo entre o on cprico e os quatro tomos adjacentes de nitrognio. Este tipo de reao tambm acontece com peptdeos que contenham no mnimo duas ligaes peptdicas e com protenas em geral. Substncias que contenham duas carbonilas ligadas diretamente ou por meio de um tomo de nitrognio tambm apresentam colorao azulada frente soluo alcalina de sulfato de cobre. O produto corado da reao apresenta absoro mxima a 540 nm.

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INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS

Cap. 1

1.4.2. Mtodo de Folin-Lowry (Sensibilidade 0,1 a 0,3 mg por mL)


Em condies alcalinas o on de cobre divalente capaz de formar um complexo com as ligaes peptdicas, sendo reduzido ao on monovalente (reao do biureto). O on de cobre monovalente conjuntamente s cadeias laterais de alguns aminocidos da protena (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina) levam reduo dos componentes cidos presentes no reagente de Folin amplificando a colorao primeiramente obtida pela reao do biureto. Neste mtodo a absoro mxima ocorre de 650 a 750 nm de comprimento de onda.

1.4.3. Mtodo de BCA (Sensibilidade 0,1 a 0,5 mg por mL)


Este mtodo tambm conhecido como mtodo do cido bicinchonnico. Este procedimento muito aplicado para anlises em microplacas e usado para os mesmos objetivos do mtodo de Lowry. Diferentemente do mtodo de Folin-Lowry, o reagente colorimtrico (cido bicinchonnico) mais estvel em condies alcalinas. O BCA segue o princpio do reagente de Folin no ensaio de Folin-Lowry, ou seja, reage com os complexos entre os ons cobre e o peptdeo para produzir um produto de cor roxa que absorve fortemente a 562 nm. Uma vantagem do BCA que como o reagente estvel em condies alcalinas, ele pode ser includo na soluo de cobre para permitir um procedimento de uma nica etapa, tornando a tcnica mais rpida do que a de Folin-Lowry.

1.4.4. Mtodo de Bradford (Sensibilidade 0,06 a 0,3 mg por mL)


O mtodo de Bradford (de Coomassie) e o de Folin-Lowry so os mtodos colorimtricos com maior ndice de citao da literatura. Quando em pH cido, o corante aninico Coomassie Blue forma complexo com protenas que contenham aminocidos bsicos e/ou aromticos. A interao entre a protena e o corante acarreta na alterao do comprimento de onda de absoro mxima do corante (465 nm corante livre) para 595 nm (corante complexado protena). Em suma, no existe mtodo de quantificao universal. Recomenda-se que quando da escolha do mtodo a ser utilizado, leve-se em conta: 1 2 A sensibilidade necessria (dependente da concentrao protica); A presena/ausncia de determinados aminocidos, em virtude do mecanismo de funcionamento do mtodo a ser escolhido, ou seja, a especificidade do mtodo;

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

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A natureza e concentrao de substncias no-proticas (possveis interferentes); A solubilidade protica nas condies do mtodo; Sua facilidade e reprodutibilidade; Sua rapidez e custo.

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INTRODUO BIOQUMICA DE PROTENAS

Cap. 1

Referncias
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ENZIMOLOGIA: ENSAIOS ENZIMTICOS


Caroline da silva Moraes Lvia de oliveira Santos

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Cap. 2

2. ENZIMOLOGIA: ENSAIOS ENZIMTICOS 2.1. Introduo


Para que a vida se perpetue, os organismos devem ser capazes de sintetizar molculas responsveis pelos processos bioqumicos celulares. Neste contexto, todas as reaes metablicas realizadas em uma clula devem ocorrer em uma velocidade til s condies fisiolgicas. O processo de aumento das velocidades das reaes qumicas (catlise) em um organismo ocorre majoritariamente por meio de protenas especficas, denominadas enzimas. As enzimas so responsveis por quase todos os processos metablicos celulares, sendo assim, elas podem ser consideradas a centelha motora da vida, conforme veremos a seguir.

2.2. Enzimas
As enzimas foram descobertas no sculo XIX por uma srie de pesquisadores, incluindo Pasteur. Este, ao observar a fermentao do acar em lcool pelas leveduras, concluiu que tal fenmeno era catalisado por fermentos (as enzimas), que seriam inseparveis da estrutura das clulas vivas do levedo ( en = dentro; zima= levedura, logo, enzima= dentro da levedura). As enzimas esto presentes nos tecidos e rgos dos mais variados seres vivos, desde vrus at eucariotos superiores como o homem, onde participam de diversos mecanismos biolgicos. So consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular, pois so especializadas na catlise de reaes biolgicas. Praticamente todas as reaes que

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

caracterizam o metabolismo celular so catalisadas por enzimas. Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reao, sem, no entanto, participar dela como reagente ou produto. O estudo das enzimas tem uma grande importncia prtica e clnica. Em algumas doenas, mais especificamente nas desordens genticas herdadas, pode ocorrer a deficincia ou mesmo a ausncia total de uma ou mais enzimas. Dentre doenas e erros metablicos conhecidos que so conseqncia de uma deficincia enzimtica temos como exemplos o albinismo oculocutneo, a galactosemia e a fenilcetonria. Outras condies anormais tambm podem ser causadas pela excessiva atividade de uma enzima, e muitas drogas exercem seu efeito biolgico por meio de interaes com as mesmas. Enzimas so tambm, muitas vezes, alvo para o desenvolvimento de frmacos contra agentes infecciosos: vrus, fungos, bactrias ou protozorios. Um exemplo particularmente notvel so as proteases do HIV, as quais so inibidas por diferentes drogas com efeito retroviral. As enzimas tornaram-se importantes ferramentas prticas no apenas na medicina, mas tambm na indstria qumica (indstria do lcool, detergentes, txtil, papel e celulose, curtumes e cosmticos), no processamento de alimentos (produo de bebidas alcolicas, panificao, amido e acares) e no tratamento de efluentes e resduos industriais. As enzimas so catalisadores de sistemas biolgicos responsveis por transformaes qumicas moleculares, podendo aumentar a velocidade de uma reao em at 1012 vezes (12 ordens de grandeza) em relao reao no-catalisada. Para que haja uma reao enzimtica, dois fatores devem estar intimamente ligados: atividade cataltica e especificidade. Enzimas so altamente especficas em sua atividade e geralmente catalisam uma nica reao qumica ou um conjunto de reaes relacionadas entre si. Alm disso, essas notveis protenas com atividade cataltica possuem tambm especificidade na escolha das molculas que sero transformadas quimicamente (substrato). Esta especificidade enzimtica, por sua vez, d-se por meio da interao fsico-qumica entre enzima e substrato. Em uma reao bioqumica, o substrato liga-se enzima, em geral, atravs de ligaes no-covalentes em certa regio contendo uma fenda ou bolso na superfcie dessa protena. Esta regio denominada stio-ativo. Geralmente, as cadeias laterais dos resduos de aminocidos presentes no stio-ativo so responsveis pela ligao ao substrato ou pela catlise da reao (grupos catalticos). Para explicar o processo de ligao enzima-substrato, dois modelos so propostos: modelo chave-fechadura, proposto por Emil Fischer (1894) e o modelo do encaixe induzido, proposto por Daniel Koshland (1958).

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Cap. 2

O primeiro modelo prope a alta similaridade entre enzima e substrato, onde o substrato possui a forma complementar ao stio cataltico da enzima (Figura 2.1), como uma chave na fechadura ou uma pea de quebra-cabea. Atualmente, este modelo de ligao vem sendo substitudo pelo segundo modelo j que a hiptese chave-fechadura no leva em considerao a flexibilidade da estrutura tridimensional da protena.

Figura 2.1. Modelo chave-fechadura mostrando a complementaridade enzima-substrato e os stios de ligao (1) e stio cataltico da enzima (2).

Por sua vez, o modelo do encaixe induzido assume que o stio de ligao da enzima possui sua estrutura tridimensional no complementar ao substrato (Figura 2.2). Somente no momento de ligao do substrato ocorre a induo de uma mudana conformacional na enzima permitindo o direcionamento do substrato aos grupos catalticos da mesma. Aps a formao do complexo enzima-substrato, ocorre a quebra de ligaes ou a formao de novas ligaes qumicas que culminaro na transformao do substrato em produto. Aps a catlise, o produto liberado pela enzima e essa, que pode dar incio a outro ciclo de catlise.

Figura 2.2. Modelo do encaixe induzido mostrando os stios de ligao (1) e a mudana conformacional no stio cataltico da enzima (2) antes da ligao com o substrato (esquerda) e aps a ligao (direita).

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2.3. Nomenclatura enzimtica


Em geral, enzimas so nomeadas levando em considerao o tipo de substrato em que atuam ou a palavra que descreve a sua atividade somada ao sufixo ase. Como exemplo, podemos destacar a ao da amilase sobre o amido ou a DNA polimerase sobre a polimerizao de nucleotdeos. Entretanto, algumas enzimas possuem nomes que no esto diretamente ligados ao nome de seu substrato ou ao, como por exemplo, a lisozima (responsvel pela hidrlise de carboidratos presentes na parede bacteriana). Para solucionar tal problema, a Unio Internacional de Bioqumica adotou a partir do ano de 1964 uma conveno internacional de classificao das enzimas, dividindo-as em seis grandes classes, onde cada classe engloba subclasses. Este sistema de identificao leva em considerao o tipo de reao que catalisada pela enzima (Tabela 2.1). Classe Oxidorredutases Transferases Hidrolases Liases Reao Catalisada Transferncia de eltrons (oxidao ou reduo) Transferncia de grupos nucleosdeo Hidrlise Adio de grupos s duplas ligaes ou formao de duplas ligaes formadas pela remoo de grupos Transferncia de grupos dentro da mesma molcula para formar ismeros Formao de ligaes obtidas pela quebra do adenosil trifosfato (ATP) Exemplo Lactato desidrogenase Monofosfato quinase Amilase Fumarase Triose fosfato isomerase Aminoacil-tRNA sintetase

Isomerases Ligases

Tabela 2.1. Classes Enzimticas

Ainda como estipulado no sistema universal de nomenclatura enzimtica, cada enzima deve ter um nmero classificatrio contendo quatro dgitos e um nome sistemtico formal da enzima que catalisa a reao. Por exemplo, a protease do HIV-1 identificada segundo seu nmero na Comisso de Enzimas como E.C 3.4.23.16, onde o primeiro dgito refere-se ao nome da classe (tipo de reao catalisada); o segundo dgito subclasse (ligao ou grupo qumica sobre o qual atua); o terceiro dgito sub-subclasse (mecanismo utilizado) e o quarto dgito significa o nmero serial (designado sequencialmente conforme as enzimas so identificadas e descritas). Assim sendo, a classificao da protease do HIV-1 por etapas seria feita assim:

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Cap. 2

EC 3 Hidrolase; EC 3.4 Hidrolase, protease; EC 3.4.23 - Hidrolase, protease, endopeptidase do tipo asprtico; EC 3.4.23.16 - Hidrolase, protease, endopeptidase do tipo asprtico, dcima sexta enzima deste tipo a ser identificada e descrita.

2.4. Cofatores
A atividade cataltica de inmeras enzimas depende de molculas menores, no proticas, denominadas cofatores. Assim sendo, estas pequenas molculas ligam-se enzima durante a atividade cataltica e so liberadas para serem utilizadas em reaes futuras. Algumas molculas podem ainda ligar-se muito fortemente enzima fazendo parte da sua estrutura. Neste caso, denominamos tais molculas como grupos prostticos. De acordo com os cofatores conhecidos, podemos agrupar essas molculas em duas classes: a dos ons metlicos e a das coenzimas (compostos orgnicos, sendo geralmente vitaminas) (Tabela 2.2). Tipos de Cofatores ons Metlicos Zn Mg Ni Mo Mn K Coenzimas Biotina Coenzima A Coenzima de flavinas cido lipico Pirofosfato Tiamina Coenzima de nicotinamida adenina

Tabela 2.2. Cofatores envolvidos na atividade cataltica.

De acordo com o seu estado de ligao com os cofatores ou coenzimas, as enzimas podem ser nomeadas como: apoenzimas e holoenzimas. Dizemos que uma enzima uma apoenzima quando ela no est ligada ao seu cofator. Entretanto, quando a enzima encontra-se ligada ao seu cofator, denominada holoenzima.

Apoenzima + cofator = holoenzima

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2.5. Reao enzimtica


Uma reao enzimtica simples pode ser representada pela seguinte seqncia de reaes qumicas:

E+S

ES

EP

E+P

onde E, S e P significam: Enzima, Substrato e Produto, respectivamente; ES e EP so os complexos enzima-substrato e enzima-produto.

Para entendermos os aspectos cinticos de uma reao enzimtica, preciso ter em mente a diferena entre velocidade de reao e equilbrio de reao. Assim sendo, importante ressaltar que as enzimas aumentam a velocidade de reao mas no alteram o equilbrio da mesma. Para compreender os aspectos necessrios para o incio de uma reao enzimtica, importante considerar tanto a diferena na energia livre entre os produtos (estado final) e os reagentes (estado inicial) como a quantidade de energia necessria para transformar o reagente em produto (energia de ativao). Graficamente, conseguimos visualizar esses conceitos utilizando o diagrama das coordenadas (Figura 2.3). Este diagrama descreve as mudanas de energia ocorridas durante uma reao qumica, onde o eixo das abscissas (representando coordenadas da reao) reflete o progresso de uma dada reao enzimtica, ou seja, as mudanas qumicas ocorridas para a transformao do substrato em produto. O eixo das ordenadas, por sua vez, mostra a energia livre dessa reao. O ponto de incio e de trmino de uma dada reao chamado de estado fundamental e representa a contribuio de uma molcula (substrato e produto) para a energia livre do sistema. No ponto mximo da curva, encontramos o estado de transio que est relacionado com a quantidade de energia necessria para que o substrato seja transformado em produto. A diferena entre os nveis de energia do estado fundamental e do estado de transio chamada de energia de ativao. Assim sendo, catalisadores reduzem a barreira energtica entre substrato e produto em um dado sistema, diminuindo a energia de ativao da reao.

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Cap. 2

Figura 2.3. Diagrama das coordenadas. O perfil da energia de ativao, onde G* mostra a energia de ativao da reao, G indica a variao da energia livre. O nmero 1 diz respeito ao estado fundamental do substrato e 2 ao estado fundamental do produto. Uma caracterstica importante nas reaes enzimticas a diminuio da energia de ativao quando comparada a uma reao no enzimtica.

A velocidade de qualquer reao est intrinsecamente ligada concentrao do substrato e constante de velocidade, esta geralmente representada pelo smbolo k. Quando a reao enzimtica depende apenas da concentrao de um reagente (ou substrato), ou seja, uma reao unimolecular SP, dizemos que esta uma reao de primeira ordem. Neste caso, a velocidade da reao (v) pode ser descrita como a quantidade de substrato que reage por uma unidade de tempo, sendo expressa pela equao:

v = k[s]

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Entretanto, se a velocidade da reao depende da concentrao de dois reagentes, dizemos que uma reao de segunda ordem, sendo expressa pela seguinte equao:

v = k[s1] [s2]
2.6. Ensaios enzimticos
Estudos enzimticos in vitro so constantemente desenvolvidos em laboratrio para o estudo do mecanismo cataltico de enzimas. Para isso, adiciona-se ao ensaio pequenas concentraes da enzima de interesse, cerca de 10-12 a 10-7M e concentraes maiores de substrato, geralmente 10-6 a 10-2M. Em muitas reaes enzimticas, a velocidade da reao diretamente proporcional concentrao de enzima e do substrato. Assim sendo, a velocidade de uma dada reao pode ocorrer de forma linear, ou seja, a concentrao do produto diretamente proporcional ao intervalo de tempo da reao. Dessa maneira, podemos representar uma velocidade de reao de acordo com a seguinte equao:

v = P/T ou S/T
Graficamente, esta dada equao para uma velocidade de reao linear poder ser representada pela Figura 2.4.

Figura 2.4 Reao Enzimtica Linear.

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Cap. 2

Iniciar um estudo enzimtico em laboratrio nem sempre uma tarefa fcil, pois necessrio padronizar as condies de ensaio de forma minuciosa. Vrios fatores podem influenciar de forma negativa a linearidade de um ensaio. Dentre eles, a baixa concentrao de enzima, baixa concentrao do substrato, pouco tempo de incubao, utilizao de tampes incorretos, entre outras coisas. Alm disso, devemos conseguir quantificar o produto da reao sem que a concentrao do substrato altere a quantificao do ensaio. Em geral, as quantificaes dos produtos em uma determinada reao so feitas utilizando leituras em equipamentos de laboratrio que medem a absorvncia ou fluorescncia. Assim sendo, as quantificaes dos produtos obtidos nos ensaios utilizando a enzima de interesse devem ser comparadas uma curva padro. Nesta curva, adicionaremos quantidades crescentes da molcula representada como produto da catlise em concentraes pr-determinadas. Para exemplificar, tomemos como base a amilase. Esta enzima caracterizada como uma hidrolase responsvel pela clivagem do amido em acares simples, tendo como produto, entre outros acares, a glicose. Nesse contexto, a curva padro da amilase pode ser feita com glicose em concentraes molares conhecidas (Figura 2.5).

Figura 2.5. Curva Padro de Glicose. Conforme mostra a figura, a curva deve ser feita utilizando uma soluo estoque de glicose de concentrao conhecida (10 mM). Por exemplo, poo nmero 1 - controle sem glicose; poo 2 - 10 L; no poo 3 - 20 L; poo 4 - 30 L; poo 5 - 40 L; poo 6 - 50 L; poo 7 - 60 L e no poo 8 - 70 L. Aps normalizao dos volumes finais em cada poo para 100 L e deteco colorimtrica de acares, pode ser construda uma correlao entre concentrao (de 0 a 7 mM), ou quantidade de glicose (de 100 a 700 nmol), e absorvncia.

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Aps a leitura das absorvncias dos poos, o grfico deve ser plotado e seus valores comparados aos valores obtidos nos ensaios da amilase. As absorvncias dos ensaios de atividade enzimtica devem estar entre o limite inferior e superior da curva padro. Se obtivermos como resultado do ensaio enzimtico valores de absorvncia maiores do que o ponto mais alto da curva padro, as amostras devem ser diludas e o ensaio deve ser repetido. Em contrapartida, se as absorvncias dos ensaios enzimticos forem inferiores ao menor ponto da curva padro, as amostras devem ser concentradas e o ensaio tambm deve ser repetido. As condies de ensaio devem ser sempre padronizadas buscando a linearidade da reao. Uma vez padronizadas as condies timas de ensaio, temos ainda um segundo problema: no conhecemos a concentrao molar da nossa enzima de interesse. Consequentemente, a concentrao dessa enzima deve ser determinada utilizando como parmetro a sua atividade. Para quantificar a atividade enzimtica, a Unio Internacional de Bioqumica definiu que:

Uma unidade internacional de atividade enzimtica (U) corresponde quantidade de enzima que catalisa a formao de 1 mol de produto por minuto.
Nesta etapa de estudo, alguns conceitos devem ser ressaltados:
Inclinao Intercepto Concentrao de atividade Atividade especfica

Para exemplificar esses conceitos, suponhamos que em um determinado experimento, foram obtidos os seguintes resultados: Absorvncia da Curva Padro de Protena (albumina) massa de protena (g) 0 1 2 3 4 5 6 7 Absorvncia 595 nm 0,006 0,020 0,059 0,090 0,120 0,162 0,175 0,210

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Cap. 2

Utilizando esses valores na construo de um grfico, obtemos a seguinte figura: Curva Padro de Protena

Calculando a inclinao da reta no grfico da curva padro, temos: Inclinao = absorvncia/ da quantidade de protena, ento, com os valores fornecidos no exemplo, a inclinao igual a 0,029 Abs/g de ptn. Posteriormente, a concentrao de protena presente na amostra dada na seguinte tabela: Volume da amostra (L) 10 20 30 40 Absorvncia 595 nm 0,045 0,098 0,128 0,190

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

Construindo o grfico de acordo com esses valores, temos:

Quantidade de Protena na Amostra Calculando a inclinao da reta no grfico de quantidade de protena na amostra, temos: Inclinao = absorvncia/ do volume da amostra, ento com os valores fornecidos no exemplo, a inclinao igual a 0,005 Abs/L de amostra. Sendo assim, podemos calcular a concentrao de protena na amostra pela seguinte frmula:

Inclinao na deteco da amostra Inclinao na curva padro de protena

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Cap. 2

Utilizando os valores obtidos no exemplo, calculamos: Analisando a Curva Padro de glicose, temos: Absorvncia da Curva Padro de glicose nmol de Glicose 0 100 200 300 400 500 600 700 Construindo o grfico da curva padro, obtemos: Absorvncia 550 nm 0,010 0,080 0,170 0,270 0,350 0,457 0,535 0,628

Curva Padro de glicose Calculando a inclinao da curva padro de glicose, temos: Inclinao = absorvncia/ da quantidade de glicose, ento utilizando os valores do exemplo acima, a inclinao igual a 0,0009 Abs/ nmol de glicose. A seguir, as condies experimentais para o estudo da atividade da amilase foram padronizadas e utilizamos 25 L (exemplo) de amostra. Nos ensaios enzimticos foram obtidos os seguintes dados:

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Tempo de incubao (horas) 0 1 2 3 4

Absorvncia 550 nm 0,075 0,142 0,220 0,300 0,410

Assim, devemos tambm plotar o grfico dessa atividade e verificar se a mesma ocorre de forma linear, conforme mostra a figura abaixo. Atividade da Amilase

Para calcular a inclinao temos: Inclinao = absorvncia/ intervalo de tempo (em min) = 0,00148 Abs/min. Para calcular a concentrao da atividade enzimtica, levamos em considerao a seguinte frmula:

Inclinao no ensaio da atividade enzimtica Inclinao da curva padro de glicose

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Cap. 2

Sendo assim, calculamos:

L de amostra 0,0009 Abs/nmol


Levando em considerao que 1mU = 1nmol/min, em 1 mL de amostra temos que: Concentrao de atividade = 1,64mU / 25 L que equivale a 0,07 mU/L. Sabemos que a atividade especfica = concentrao de atividade/ concentrao de protena, ento: Atividade especfica = 0,07 mU / L = 0,407 mU / g = 407 mU/mg 0,172 g/ L

2.7. Inibio enzimtica


A atividade de uma reao enzimtica pode ser alterada atravs da ligao de pequenas molculas especficas e/ou ons, que podem associar-se aos stios catalticos ou de ligao de uma enzima. Enzimas tambm podem sofrer mudanas qumicas, as quais afetam a sua atividade neste caso, a diminuio da atividade enzimtica chamada de inativao (no caso de diminuio da atividade) ou modificao. As inibies enzimticas geralmente so reversveis e ocorrem atravs de inibidores enzimticos. Uma inibio reversvel caracterizada pela diminuio da velocidade de reao e rpida dissociao do complexo enzima-inibidor. No caso de mudanas irreversveis, atravs de modificadores qumicos, o complexo enzima-modificador pode estar fortemente ligado atravs de ligaes covalentes, no ocorrendo mais a dissociao do complexo, ou a alterao qumica causada na enzima pelo modificador no pode ser revertida. Em geral, podemos classificar inibidores reversveis de acordo com o stio de ligao na enzima. Sendo assim, dentre os vrios tipos existentes, iremos descrever duas formas de inibio bem conhecidas: competitiva e no competitiva. Nas inibies competitivas, o inibidor possui estrutura muito similar do substrato, podendo ligar-se ao stio-ativo da enzima e bloquear o acesso do substrato. Em outras palavras, em uma inibio competitiva o inibidor compete com o substrato pelo stio-ativo da enzima. Em uma inibio no-competitiva, o inibidor liga-se em um local diferente do stio-ativo da enzima, tendo como resultado a mudana conformacional da mesma, principal-

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Vol. 1

Mtodos experimentais no estudo de protenas

mente prximo ao seu stio-ativo. Aps esta mudana, o substrato at pode ligar-se ao stio-ativo da enzima; entretanto, a enzima no poder catalisar a reao de forma to eficiente. As figuras abaixo exemplificam as inibies enzimticas reversveis competitivas (A) e no-competitivas (B).

Figura 2.6. Tipos de inibies enzimticas reversveis. (A) Inibio Competitiva e (B) Inibio no-Competitiva.

2.8. Concluso
O metabolismo celular de todo organismo pode ser caracterizado como um conjunto de reaes bioqumicas que, por sua vez, depende da ao contnua de catalisadores biolgicos, ou seja, das enzimas. Tendo em vista a sua grande importncia vida, as enzimas devem ser amplamente estudadas, pois alm de serem protenas fundamentais nos processos fisiolgicos, podem tambm contribuir de inmeras maneiras para o avano tecnolgico.

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ENZIMOLOGIA: ENSAIOS ENZIMTICOS

Cap. 2

Assim sendo, o estudo minucioso das enzimas proporciona um conhecimento fundamental para tratamento de doenas, assim como para o desenvolvimento de poderosos e eficientes frmacos. Um exemplo clssico o desenvolvimento de drogas que podem inibir uma determinada enzima de um patgeno, como o caso da zidovudina (AZT) no controle do vrus HIV pela inibio de uma asprtico protease. Em sntese, compreender o funcionamento das enzimas significa compreender o funcionamento de peas fundamentais ao organismo.

Referncias Bibliogrficas
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular Biology of the Cell . 4 ed. New York and London: Garland Science. Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Stryer, L. (2002) Biochemistry. 5 ed. New York: W H Freeman and Co. Campbell, M.K. (2000) Bioqumica. 3 ed. Porto Alegre: Artmed. Nelson, D.L., Cox, M.M. (2006) Princpios de Bioqumica. 4 ed. Artmed.

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS


Rozana Crte-Real Faria

MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

3. MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS 3.1. Propriedades das protenas


Por que e como purificar protenas? Como armazenar protenas? Como avaliar a purificao? Para entendermos e respondermos estas perguntas precisamos rever alguns conceitos importantes sobre como obter e manter protenas de interesse em condies apropriadas para posteriormente serem submetidas aos ensaios experimentais. Assim, nos relembraremos algumas propriedades importantes das protenas que ajudaro a entender seu comportamento. 3.1.1. Propriedades eltricas As cadeias laterais de alguns aminocidos possuem a capacidade de se ionizar em condio cida ou bsica. Desta forma, protenas com composio de aminocidos diferentes podero ter cargas distintas de acordo com a condio a que forem submetidas. Devemos lembrar que aminocidos apresentam propriedades caractersticas quando isolados, mas formando um polipeptdeo eles podem interferir uns nos outros e conseqentemente no comportamento total da protena. As protenas, assim como os peptdeos e aminocidos, possuem pontos isoeltricos caractersticos, nos quais elas possuem carga lquida (soma das cargas positivas e negativas) igual a zero.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

3.1.2. Solubilidade Diversos fatores podem influenciar a solubilidade das protenas. A solubilidade dependente diretamente da composio de aminocidos da cadeia primria e de sua estrutura tridimensional, por influenciar no arranjo de cargas e dipolos presentes na molcula. Alm das cargas devemos considerar o tamanho da molcula ou partcula dissolvida, lembrando que em fsico-qumica as diferenas entre soluo verdadeira, coloidal ou suspenso esto diretamente relacionadas ao tamanho do agente disperso (no caso aqui a protena), e forma, em funo da superfcie de contato estabelecida entre a protena e o solvente. Estes fatores mudam radicalmente com a formao de agregados ou de protenas com estrutura quaternria, devido aos contatos protena-protena. Grupamentos prostticos em protenas, ou seja, a parte no protica (lipdeos, carboidratos, fosfatos etc.), tambm afetam sua solubilidade. No caso de protenas glicosiladas ou fosfatadas estes grupos, por serem polares, podem fazer interaes com o solvente (aumentando a solubilidade) ou mesmo facilitar a interao com outras protenas. Grupamentos lipdicos, pelo contrrio, geralmente no interagem bem com a gua e, frequentemente, so responsveis pela fixao de protenas a membranas lipdicas, fazendo com que no sejam solveis em gua. A solubilidade de protenas de uma maneira geral pode ser modificada por fatores como: pH O pH afeta a natureza e a distribuio de cargas de uma protena. Em geral, as protenas so mais solveis em pH baixos (cidos) ou elevados (alcalinos) devido ao excesso de cargas de mesmo sinal, as quais iro produzir repulso entre as molculas, o que diminui a formao de agregados (por interao eletrosttica) e, alm disso, contribui para uma maior solvatao. Entretanto, valores extremos de pH podem induzir a uma desnaturao protica, expondo regies hidrofbicas, o que poder gerar agregados (por interao hidrofbica) levando precipitao. Por outro lado, quando uma protena se encontra em meio com pH igual a seu ponto isoeltrico, ou seja, quando apresenta carga lquida nula, a repulso eletrosttica entre partculas diminui, possibilitando interaes protena-protena, gerando uma condio favorvel para que as molculas de protena se aproximem, agreguem e precipitem.

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Cap. 3

Fora inica A solubilidade de uma protena pode variar de acordo com a concentrao de sal a que ela submetida. Em baixa concentrao de sal, observamos um aumento na solubilidade das protenas com a presena de ons. Este fenmeno chamado de salting in, onde ocorre uma interao entre os ons salinos e os grupamentos carregados das protenas diminuindo as interaes eletrostticas intermoleculares protena-protena (responsveis pela diminuio da solubilidade protica). Por outro lado, em elevada concentrao salina, observamos uma reduo na solubilidade das protenas. Este processo chamado de salting out, aonde alguns sais, ao interagir com a gua, removem a camada de solvatao das protenas, o que facilita a formao de agregados e leva sua precipitao.

Temperatura
Uma grande parte das protenas solvel temperatura ambiente. O aumento da temperatura at 40C em geral favorece a sua solubilidade. O aumento da energia cintica favorece a interao do soluto com o solvente, fazendo com que se alcance um equilbrio dinmico, o qual permite que a mesma quantidade de solvente presente no sistema possa participar na solvatao de uma maior quantidade de soluto. Entretanto, de uma maneira geral, temperaturas acima deste valor podem desnaturar protenas, o que na maior parte dos casos leva formao de agregados e precipitao. interessante observar que a desnaturao tambm pode ocorrer em baixas temperaturas, sendo que cada protena ter uma determinada estabilidade para uma dada temperatura. Alm disso, mudanas bruscas de temperatura podem levar desnaturao protica afetando seu funcionamento e solubilidade.

3.1.3. Soluo-Tampo
Um tampo uma soluo de um cido ou de uma base fracos, a qual resiste a mudanas de pH quando se adicionam quantidades moderadas de cido ou base. Esta soluo consiste na mistura de um par conjugado cido-base, capaz de doar ou receber prtons. Protenas possuem certo efeito tamponante, devido a alguns grupos ionizveis dos aminocidos (COO-, NH2 etc.), que so cidos ou bases fracos. Entretanto, os valores de pKa desses grupos so muito distantes de 7,4. Os nicos aminocidos

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

que apresentam um grupo com pKa compatvel com o tamponamento a pH fisiolgico so a histidina e a cistena. Adicionalmente, as protenas apresentam um pequeno efeito tamponante, pois esto presentes em baixas concentraes.

3.1.4. Desnaturao protica


Na maioria dos casos, o papel fisiolgico de uma protena est intimamente ligado manuteno da sua estrutura nativa. Entretanto, algumas anlises bioqumicas necessitam que as protenas estejam em sua forma desnaturada. A desnaturao protica resultante do desdobramento e da desorganizao de sua estrutura tridimensional sem que ocorra hidrlise das ligaes peptdicas. A desnaturao tem como resultado uma mudana na conformao das protenas, por perturbar as interaes que estabilizam boa parte desta estrutura, o que ir alterar suas propriedades fisiolgicas. Dessa forma, as protenas se tornam menos solveis. A desnaturao pode ser reversvel e, neste caso, ao se retirar o agente desnaturante a protena retorna sua conformao nativa. Entretanto, as protenas, em sua maioria, uma vez desnaturadas, ficam permanentemente alteradas (desnaturao irreversvel). As protenas podem ser desnaturadas pela utilizao de mtodos fsicos como aquecimento, agitao, radiaes ultravioleta ou visvel, raios x, ou de agentes qumicos como cidos e bases fortes, solventes orgnicos (como etanol ou acetona), detergentes, solues concentradas de uria e cloreto de guanidina e metais pesados (como chumbo ou mercrio). Os fatores descritos nos itens anteriores so importantes para manter as protenas em sua estrutura nativa (Figura 3.1), pois em condies desfavorveis as interaes que as mantm em sua conformao nativa (ligaes de hidrognio, interaes eletrostticas, interaes de Van der Waals) podero se desestabilizar, prejudicando a sua funcionalidade. O conhecimento das propriedades de uma amostra protica pode ajudar na manuteno de sua integridade, pois assim podemos evitar a sua exposio a condies desnaturantes.

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Cap. 3

Figura 3.1. Representao esquemtica de uma protena enovelada na sua forma nativa.

3.2. Obteno do extrato celular


Um ponto crucial para se trabalhar com protenas a sua obteno a partir de um determinado material biolgico. Assim, muitas vezes necessrio dissecar o tecido ou rgo, homogeneiz-lo provocando a lise celular pela ruptura da membrana plasmtica, com conseqente liberao do contedo celular, obtendo-se ento uma soluo chamada de extrato celular bruto. A lise celular relativamente fcil de realizar a partir de clulas animais, em comparao a leveduras, bactrias, esporos e clulas vegetais, que possuem paredes celulares rgidas. Para este procedimento podem ser utilizados mtodos fsicos e/ou qumicos. Mtodos fsico Pode ser feito com mquinas que levam a diferentes graus de ruptura, como nos exemplos a seguir:

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(a) Prensa de French Nesta metodologia, as clulas so foradas a passar atravs de um orifcio estreito, causando estresse e uma descompresso explosiva forte o suficiente para romper a parede celular; (b) Macerao (blender ou potter) Esta tcnica consiste na utilizao de um homogeneizador para provocar a lise celular de forma mecnica. O homogeneizador composto por um pisto que inserido em um tubo de vidro ficando muito prximo da parede do tubo, de modo que, pelo processo de frico do tecido, as clulas so obrigadas a passar pelo espao entre o pisto e o vidro, sendo maceradas e tendo sua membrana plasmtica rompida; (c) Choque trmico As clulas so rompidas por variaes bruscas de temperatura atravs de ciclos de congelamento e descongelamento; (d) Processador ultra-snico (sonicador) As ondas de presso criam micro bolhas, que alm de quebrar as clulas, podem romper molculas de DNA e desnaturar protenas; (e) Homogeneizador com partculas de moagem Microorganismos e vegetais so agitados em um tubo cilndrico contendo partculas esfricas de vidro ou de cermica. Estes movimentos fazem com que as clulas se rompam, mesmo as clulas mais resistentes. Mtodos qumicos (a) Lise osmtica A osmose envolve a passagem de molculas do solvente (gua, em sistemas biolgicos) por uma membrana semi-permevel. Sendo assim, se colocarmos clulas em uma soluo hipotnica a tendncia que elas absorvam gua. A presso gerada pela entrada de solvente no interior da clula provoca ento o seu rompimento. Este mtodo de extrao no muito eficiente para clulas vegetais, bactrias e fungos, pois estes possuem uma parede celular que protege a clula; (b) Detergentes Os detergentes, por possurem a capacidade de solubilizar lipdeos de membrana e extrair as protenas integrais, so capazes de formar poros na membrana das clulas eucariticas, provocando seu rompimento. Exemplos: Dodecil sulfato de sdio (SDS), Triton, CHAPS, Tween-20.

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

Mtodos Enzimticos Para facilitar o rompimento de clulas bacterianas pode-se adicionar lisozima ao tampo de lise. Analogamente, para a lise de clulas vegetais so usadas enzimas como celulase e hemicelulases e para a lise de clulas fngicas so usadas enzimas lticas como beta-glucanases e quitinases.

3.3. Separao de protenas


As clulas so constitudas por uma grande variedade de protenas. Para que possamos estudar uma protena especfica determinando suas propriedades fsico-qumicas so necessrias preparaes homogneas, com diferentes graus de pureza (dependendo dos objetivos, acima de 99%). Os mtodos de purificao de protenas utilizam o conjunto de propriedades caractersticas de cada protena, para distingui-las e separ-las umas das outras. Estas propriedades envolvem seu volume molecular, carga superficial, hidrofobicidade e afinidade por ligantes. Dessa maneira, foram desenvolvidos inmeros mtodos para se purificar protenas. Iremos abordar as metodologias mais clssicas, como centrifugao, dilise e alguns tipos de cromatografias (excluso molecular, troca inica, fase reversa, interao hidrofbica e afinidade). Estas metodologias so, em geral, usadas sequencialmente de modo que a preparao purificada obtida numa fase anterior o ponto de partida para o passo seguinte. A prtica da purificao de protenas tem levado a sucessivos melhoramentos nas diversas tcnicas e procedimentos.

3.3.1. Centrifugao
A centrifugao uma tcnica que torna possvel a obteno de fraes subcelulares e/ou organelas. Nesta tcnica, a separao de pequenas e grandes partculas ocorre pela aplicao de diferentes foras centrfugas ao extrato celular. As partculas maiores e mais densas sedimentam primeiro, ficando no sobrenadante as partculas pequenas e menos densas (Figura 3.2). Para isolar organelas utilizam-se centrifugaes diferenciais aumentando a fora centrfuga.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

Figura 3.2. Sedimentao diferencial por centrifugao de homogeneizado celular a diferentes foras centrfugas relativas (em g). H = homogeneizado; S = Sobrenadante; P = precipitado ou sedimento ou pellet.

O homogeneizado submetido a diferentes foras centrfugas (Figura 3.2) ser separado de acordo com a densidade ou tamanho das partculas presentes em cada sedimento (ou precipitado). Por exemplo: o homogeneizado submetido a 600g (fora centrfuga relativa, em gravidade) apresentar um sedimento (P1) rico em ncleos e clulas que no lisaram (partculas maiores). O sobrenadante da primeira centrifugao (S1), sendo submetido a 1.500g, resultar em um sedimento (P2) rico em mitocndrias, cloroplastos, lisossomos e peroxissomos (todos com densidades semelhantes). O sobrenadante da segunda centrifugao (S2), ao ser submetido a 100.000g, apresentar membranas plasmticas e fragmentos do retculo no precipitado (P3). O sobrenadante da terceira centrifugao (S3), ao ser submetido a 300.000g, formar um sedimento rico em ribossomos (P4) e um ltimo sobrenadante (S4) que ir conter partes solveis do citoplasma. Outra possibilidade de separao por centrifugao da utilizao de um gradiente de densidade. Nesta centrifugao, construdo um gradiente de densidade com substncias mais ou menos inertes como a sacarose, com a densidade aumentando do topo para a base (Figura 3.3). A mistura de organelas ento aplicada no topo do gradiente de densidade e o tubo submetido centrifugao sob fora centrfuga relativa nica. As organelas iro sedimentar separadamente at que a densidade de flutuao se iguale do gradiente. Posteriormente, as fraes referentes aos gradientes podem ser recolhidas separadamente.

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

Aumento da densidade de sacarose (g /cm3)

Figura 3.3. Gradiente de densidade feito com sacarose.

3.3.2. Dilise
A dilise um mtodo utilizado para separar molculas atravs do seu tamanho utilizando uma membrana semipermevel com tamanho do poro definido, de maneira a permitir a passagem seletiva de molculas. Na prtica, uma mistura heterognea composta por molculas grandes e pequenas colocada em um saco de dilise, o qual posteriormente imerso em um grande volume de solvente aquoso. As pequenas molculas podem atravessar a membrana para o fluido externo e as molculas maiores so retidas (Figura 3.4). O fenmeno que favorece a passagem de molculas pequenas pela membrana a difuso destas, propiciada pela diferena de concentrao destas entre a soluo presente no interior do saco de dilise e no seu exterior. O fluxo de difuso destas partculas ocorre de acordo com o seu gradiente de concentrao, indo da regio de maior concentrao para uma de menor concentrao at que se atinja o equilbrio, com concentraes iguais nos dois compartimentos. Assim sendo, as molculas que so capazes de atravessar a membrana diluem-se por todo o recipiente. Se trocarmos apenas a soluo externa, pode-se continuar a dilise, pois o efluxo de molculas pequenas do interior do saco novamente retomado, atingindo-se uma concentrao ainda menor aps o equilbrio. A eficincia de uma dilise depende,

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

portanto, dos volumes e da concentrao do soluto a ser retirado nos dois compartimentos, tanto no interior da membrana como no recipiente externo.

t
Trocas do tampo (seta)

Saco de dilise Solvente aquoso (gua ou tampo diludo) Barra magntica Agitador magntico Figura 3.4. Esquema da separao de molculas por dilise. O saco de dilise, composto por uma membrana semipermevel, contm uma mistura de protenas imersa em tampo.

A eficincia da dilise dependente de vrios fatores como:


Permeabilidade da membrana - quanto mais permevel a membrana s partculas do soluto em questo, maior ser a taxa de difuso destas para o compartimento externo. Natureza do solvente solventes muito viscosos tendem a apresentar taxas de difuso menores. Temperatura quanto maior a temperatura maior a taxa de difuso. Gradiente de concentrao quanto maior a diferena entre as concentraes nos dois compartimentos, maior ser a taxa de passagem de partculas do soluto. Nmero de trocas do tampo e diluio quanto maior o nmero de trocas da soluo externa, maior ser a remoo das partculas do soluto, pois ocorrer uma diluio seriada. A razo entre os volumes dos compartimentos define a diluio do soluto no equilbrio. Desta forma, utilizam-se compartimentos externos grandes (da ordem de 1 litro) para amostras contidas em sacos de dilise pequenos (da ordem de 1 mililitro). Agitao do solvente absolutamente necessrio que o solvente no compartimento externo esteja com agitao, para que o equilbrio entre os dois compartimentos seja atingido em um tempo razovel (algumas horas).

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Cap. 3

3.3.3. Cromatografia
A palavra cromatografia, de origem grega, onde chroma significa cor e grafein significa escrita, ou seja, escrita em cores, envolve uma srie de processos de separao de misturas. O termo cromatografia foi empregado primeiramente em 1906, sendo sua utilizao atribuda ao botnico russo, Mikhail Semyonovich Tswet. Em seu estudo, a passagem de ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de clcio (fase estacionria) permitiu a separao em faixas coloridas de pigmentos vegetais obtidos de um extrato de folhas de plantas. O mtodo foi descrito em 30 de dezembro de 1901 no 11 Congresso de Mdicos e Naturalistas em So Petersburgo. Em 1907, Tswet demonstrou sua cromatografia para a Sociedade Botnica Alem. Em 1952, Archer John Porter Martin e Richard Laurence Millington Synge ganharam o Prmio Nobel de Qumica pela inveno da cromatografia de partio. Desde ento, a tecnologia tem avanado rapidamente.

Figura 3.5. Desenho das colunas usadas por M.S. Tswet.

A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Este mtodo visa a migrao diferencial dos componentes de uma mistura, atravs de uma fase mvel e uma estacionria. Diferentes foras intermoleculares iro influenciar na interao entre os componentes da mistura e das duas fases.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

Fase mvel A fase mvel o material que se move atravs da fase estacionria, carreando a amostra. So observadas trs tipos de fase mvel: gasosa, lquida e supercrtica. A lquida se subdivide em: clssica, onde a fase mvel passa atravs da coluna pela fora da gravidade apenas ou e empurrada por bombeamento de baixa presso, e a cromatografia lquida de alta eficincia, aonde utilizado um dispositivo de alta presso que bombeia a fase mvel atravs de uma tubulao capilar e de uma matriz porosa. Na cromatografia gasosa so separados compostos volteis, os quais devem apresentar uma razovel presso de vapor na temperatura de trabalho. Na cromatografia gasosa de alta resoluo usam-se colunas capilares, enquanto na cromatografia gasosa habitual utilizam-se colunas com um dimetro maior. Na cromatografia supercrtica emprega-se um fenmeno denominado de ponto crtico (capacidade de um lquido passar para vapor) em condies de presso, tipo de gs utilizado, temperatura crtica e densidade. Fase estacionria A fase estacionria pode apresentar-se como slida, lquida ou quimicamente ligada. Tcnica cromatogrfica A fase estacionria pode ser depositada em suportes planos (cromatografia planar) ou em colunas, as quais so comumente cilndricas. Temos como cromatografias planares a cromatografia em papel e a cromatografia em camada delgada. Nestas tcnicas o tipo de cromatografia de partio e o suporte um papel ou uma placa de vidro (camada delgada). Na cromatografia em papel a gua que solvata as fibras de celulose a fase estacionria e na camada delgada um gel ou silicato que depositado sobre a placa de vidro. Na cromatografia de camada delgada o suporte mais utilizado atualmente para deposio da fase estacionria uma folha de alumnio. Apesar das cromatografias planares serem muito utilizadas para anlise de acares, lipdeos e outros produtos naturais, no so utilizadas para purificao de protenas. Na cromatografia em coluna, uma mistura de protenas aplicada em um suporte cilndrico, o qual est preenchido por uma matriz (resina) hidratada que pode, ou no, apresentar determinado tipo de grupamento qumico funcional acoplado ela. A matriz ento percolada com uma soluo apropriada para eluir diferencialmente as protenas de interesse. As diferentes protenas migraro atravs da coluna em velocidades diferentes, que dependero do grau de interao com a matriz, o que permite a sua separao. Os vrios mtodos de cromatografia em coluna disponveis diferem quanto matriz utilizada e so classificados de acordo com as propriedades fsicas ou qumicas nas quais se baseia o processo de diferenciao e separao

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

de protenas da amostra. So conhecidas cromatografias baseadas no volume molecular (cromatografia de excluso molecular), polaridade (cromatografia de troca inica, hidrxiapatita e de carvo ativado), hidrofobicidade (cromatografia de interao hidrofbica e de fase reversa) e especificidade de ligao (cromatografia de afinidade). Cromatografia de excluso molecular A cromatografia de excluso molecular ou filtrao em gel separa protenas pelos seus diferentes volumes moleculares. A matriz constituda por esferas com poros de tamanho bem definido. As molculas menores do que o dimetro dos poros penetram nas esferas, ao passo que as maiores so foradas a percorrerem um caminho diferente, por fora das esferas. Deste modo, as molculas menores percorrem, ao longo de uma coluna, um trajeto muito maior do que as molculas maiores, que sairo da coluna em primeiro lugar (Figura 3.6). Um material comumente empregado para a fabricao de gis cromatogrficos a dextrana, um polmero de glicose, comercialmente disponvel com o nome de Sephadex; este produto sintetizado com diferentes tamanhos de poros, permitindo a excluso de molculas em um amplo intervalo de volume molecular. A filtrao em gel tambm pode ser utilizada para diminuir a concentrao de sais de uma soluo de protena, por exemplo, quando ela precipitada com sulfato de amnio. A B C

Figura 3.6. Esquema da cromatografia de excluso molecular. (A) Aplicao da amostra coluna. (B) Percurso das molculas de diferentes volumes moleculares, resultando na eluio das molculas maiores; (C) Eluio das molculas de menor volume molecular e no detalhe o poro da matriz retardando a passagem das molculas.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

Cromatografia de troca inica As primeiras observaes registradas na literatura, referentes troca inica, foram feitas por Way e Thompson em 1850. Os autores descobriram a capacidade do solo de remover NH4+ de solues, substituindo por quantidades equivalentes de Ca2+. Em 1917, foram relatadas as primeiras tentativas do processo de troca inica para resolver problemas na rea da bioqumica. Por volta de 1935, as resinas de trocadores de ons comearam a ser produzidas, sendo muito mais eficientes e passando a constituir um meio qumico de separao com um alto valor em processos analticos. A cromatografia de troca inica baseia-se na interao entre cargas (positivas ou negativas) da protena que est sendo isolada com uma matriz contendo molculas ionizveis de carga oposta (trocadores inicos, cujos stios de interao esto carregados positiva ou negativamente), que compem a coluna. Os trocadores de ons, de natureza complexa, so polmeros que quando possuem carga positiva (ctions), efetuam uma cromatografia de troca aninica e quando possuem carga negativa (nions), de troca catinica (Figura 3.7). Molculas apresentando carga de

Figura 3.7. Cromatografia de troca inica. Os passos representam algumas etapas de uma troca aninica. Esferas maiores representam grnulos da matriz (fase estacionria), esferas menores, protenas, e sinais livres so ons em soluo. Molculas do solvente no esto representadas. Em uma troca catinica, as cargas da matriz e das protenas seriam opostas. (A) A fase estacionria est equilibrada com contra-ons negativos presentes no tampo. (B) Aps a aplicao da amostra, protenas com carga superficial negativa ligamse matriz. Protenas com carga superficial positiva ou zero no interagem com a coluna e so eludas junto com contra-ons. (C) A aplicao de uma soluo salina concentrada desfaz a ligao entre protenas e fase estacionria, recarregando a matriz com contraons negativos e propiciando a eluio das protenas que estavam interagindo com a coluna.

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

mesmo sinal que os da matriz no interagem com ela, passando livremente por toda a coluna. Entretanto, as molculas de cargas opostas iro se ligar a matriz sendo eludas em uma ordem definida pela magnitude da carga apresentada pelas protenas, nas condies da cromatografia. A eluio das protenas realizada, em geral, com a passagem de um gradiente crescente de sal (contra-on) atravs da matriz. As protenas com maior carga permanecero ligadas mais fortemente matriz da coluna e consequentemente sero eludas nas concentraes mais elevadas de contra-on. Outras vezes, um gradiente de pH utilizado para eluio das molculas proticas de maneira seletiva. Os trabalhos na separao de aminocidos, peptdeos, cidos nuclicos e outros tipos de amostras, mostram o valor do processo de troca inica na rea da bioqumica. Cromatografia de Interao Hidrofbica A cromatografia por interao hidrofbica um mtodo que se baseia nas propriedades hidrofbicas das protenas para separ-las. A mistura de protenas aplicada coluna na presena de altas concentraes de sulfato de amnio (sal comumente utilizado). Este sal remove a camada de solvatao das protenas, expondo as regies hidrofbicas das mesmas, que iro interagir com as regies hidrofbicas da matriz da coluna. Ao reduzir a concentrao de sal na coluna, reconstituindo a camada de solvatao, as protenas com menor hidrofobicidade sero eludas primeiro e em seguida as protenas com maior hidrofobicidade. Cromatografia de Fase Reversa Assim como a cromatografia de interao hidrofbica, a cromatografia de fase reversa utiliza a hidrofobicidade das protenas para separ-las. Esta tcnica baseia-se na utilizao de uma fase estacionria apolar contendo cadeias longas de hidrocarbonetos e uma fase mvel polar. As protenas iro se ligar s cadeias de carbono presentes na matriz de acordo com seu grau de hidrofobicidade. As protenas adsorvidas na matriz sero eludas em gradiente crescente de solvente apolar (Ex. acetonitrila), sendo as protenas com menor hidrofobicidade eludas primeiro (Figura 3.8). Em comparao interao hidrofbica, a cromatografia em fase reversa apresenta uma matriz cromatogrfica altamente hidrofbica. A utilizao de solventes orgnicos pode levar desnaturao da protena de interesse durante a cromatografia; por isso, este tipo de cromatografia no se aplica a um grande nmero de casos.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

Figura 3.8. Princpio de separao na cromatografia de fase reversa. (A) Em baixa concentrao de solvente (meio com maior polaridade), protenas mais hidrofbicas (esferas cinza) so adsorvidas fase estacionria apolar (cadeias de hidrocarbonetos). Protenas polares (esferas brancas), mais hidroflicas, so arrastadas pela fase mvel. (B) Em uma concentrao maior de solvente orgnico, mais apolar, protenas hidrofbicas que antes estavam adsorvidas so dissolvidas pela fase mvel e eludas.

Cromatografia de Afinidade Esta tcnica consiste em imobilizar na matriz cromatogrfica, atravs de ligao covalente, determinada molcula (ligante) pela qual a protena que queremos purificar tenha afinidade. Posteriormente, nosso extrato protico aplicado coluna. Todas as protenas com afinidade para o ligante ficaro retidas na coluna e as outras protenas passaro atravs da coluna sem nenhum tipo de interao (Figura 3.9). As protenas adsorvidas coluna podero ser eludas com concentraes crescentes de sal ou em valores extremos de pH. Em alguns casos a eluio feita com uma soluo concentrada do prprio ligante (eluio por deslocamento de equilbrio). O receptor de insulina, uma protena da superfcie celular, foi isolado por cromatografia de afinidade em agarose contendo insulina covalentemente ligada. A cromatografia de afinidade tem, frequentemente, um poder de enriquecimento muito maior que os outros mtodos cromatogrficos, embora seja restrita a uma classe especial de protenas.

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MTODOS DE PURIFICAO DE PROTENAS

Cap. 3

Figura 3.9. Cromatografia de afinidade. (A) Matriz cromatogrfica com ligantes covalentemente presos fase estacionria. (B) Protenas com diferentes afinidades, ou stios de ligao, esto presentes na amostra aplicada. (C) Apenas as protenas capazes de reconhecer o ligante da matriz interagem com a fase estacionria. Protenas sem afinidade com a matriz so eludas no lavado. (D) Protenas ligadas coluna com alta afinidade permanecem aderidas matriz mesmo aps a lavagem da coluna. (E) Aps alguma alterao nas condies fsico qumicas da fase mvel (pH, concentrao de sais, presena de solventes orgnicos ou do prprio ligante na forma solvel), as protenas de interesse so eludas da coluna.

Referncias Bibliogrficas Amersham, Pharmacia Biotechnology AB, (1999) Protein Purification Handbook, USA. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2002) Molecular biology of the cell, edio Garland Science, 4 ed. Collins, C.H.; Braga, G.L., Bonato, P.S. (1995) Introduo a mtodos cromatogrficos, Editora da Unicamp, 6 ed. Nogueira, J., Mikhail, T. (2005) Um legado para a cromatografia moderna, Destaque100, Universidade de Lisboa, Portugal. Lehninger, A. (1986) Princpios de Bioqumica, editora Sarvier. Radler, F., Nunes, D. (2003). Cromatografia princpios bsicos e tcnicas afins, editora Intercincia.

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ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Narayana Fazolini Paula Bastos Gustavo Masson

ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Cap. 4

4. ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING 4.1. Histrico


O termo eletroforese foi introduzido por Michaelis em 1909, para descrever o movimento de colides sob a influncia de um campo eltrico. Esta tcnica de separao baseada na migrao de molculas carregadas foi realizada por Arne Tiselius, pela primeira vez, em 1937, onde criou o mtodo denominado eletroforese em campo livre. Este trabalho lhe rendeu o Prmio Nobel em 1948. Este mtodo era bastante limitado devido instabilidade do equipamento e, principalmente, pelos efeitos de difuso e aquecimento gerados pelo campo eltrico, os quais comprometiam a separao dos compostos. Estes efeitos foram minimizados com a introduo de um suporte (gel ou papel) que ajudou a conter o movimento livre das molculas, de forma que o efeito da difuso fosse reduzido.

4.2. Princpio da tcnica e aplicaes


O princpio fsico-qumico que norteia a eletroforese a capacidade de molculas carregadas migrarem sob influncia de um campo eltrico. Esta migrao segue a Lei de Coulomb, onde partculas de carga positiva migram para o plo negativo (catodo) e partculas de carga negativa migram para o plo positivo (anodo). A velocidade de migrao das molculas proporcional ao campo eltrico e inversamente proporcional ao seu volume molecular. Assim, uma amostra submetida eletroforese ter cada molcula constituinte localizada em uma zona do gel, onde molculas com menor volume molecular iro migrar mais rapidamente e as que possuem maior volume molecular iro migrar mais lentamente.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

O objetivo principal desta tcnica separar molculas orgnicas, como DNA, RNA e protenas, de acordo com sua carga eltrica e volume molecular. A tcnica pode ser conduzida em diferentes meios-suporte tais como papel de filtro, gel de slica, membranas de acetato de celulose, gis de agarose, acrilamida etc. Atualmente existem dois modelos mais utilizados de eletroforese: um baseado em gel de agarose e outro em gel de poliacrilamida. Estes polmeros formam tramas de poros com tamanhos variveis. Dois componentes bsicos so necessrios para se realizar uma eletroforese: um campo eltrico (obtido atravs de uma fonte de corrente contnua) e a prpria molcula carregada. Para visualizao das molculas separadas (na forma de bandas eletroforticas) so utilizados corantes especficos para protenas, como Coomassie Blue, e solues especficas contendo os componentes necessrios (substratos, coenzimas, soluo-tampo e sais) para revelao das bandas de atividade enzimtica. No caso de molculas de DNA e RNA, diversos sistemas de revelao de bandas so empregados. J no caso do corante brometo de etdio, a deteco da amostra feita atravs da fluorescncia emitida por esse corante em presena da luz ultravioleta. As bandas podem ser detectadas tambm por radioatividade, nitrato de prata ou quimioluminescncia. Na tcnica, utiliza-se uma cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os plos positivo e negativo em cada compartimento, onde adicionada uma soluo-tampo com sal, que conduz eletricidade. O gel montado entre os dois compartimentos de tal forma que a nica conexo eltrica entre os compartimentos seja atravs do gel.

Figura 4.1. Esquema representativo da eletroforese em gel horizontal.

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ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Cap. 4

4.3. Tipos de Eletroforese


Todo o processo de eletroforese realizado empregando uma soluo-tampo apropriada, a qual essencial para manter um estado constante de ionizao das molculas a serem separadas. Qualquer variao no pH pode alterar a carga e ento a mobilidade (taxa de migrao no campo eltrico aplicado) das molculas que esto sendo separadas.

4.3.1. Eletroforese livre


Este um tipo de eletroforese onde as substncias a serem separadas esto em suspenso ou soluo, no empregando um suporte. A fora de frico das partculas constitui nico obstculo mecnico. Com a passagem da corrente eltrica, h aquecimento da soluo resultando em movimentos hidrodinmicos de conveco. Este movimento hdrico espalha e distorce a distribuio geogrfica dos elementos a serem separados, prejudicando a separao. Este tipo de eletroforese necessita de instalaes dispendiosas e o manuseio muito trabalhoso; est praticamente restrito obteno de valores fsico-qumicos de macromolculas. Esta tcnica foi desenvolvida por Tiselius e atualmente est praticamente abandonada.

4.3.2. Eletroforese com suporte


Os componentes bsicos para a realizao desta tcnica so: o campo eltrico, o suporte e a molcula carregada. O suporte geralmente consiste em um gel onde as molculas se deslocaro; a densidade do gel e o volume molecular influenciaro na velocidade de movimentao das molculas. Desta forma, a eletroforese pode ser classificada de acordo com o suporte do gel, uma vez que cada tipo de suporte ser mais indicado para um determinado tipo de molcula, pois estas molculas, como DNA e protenas, diferem no que diz respeito ao seu volume molecular.

4.3.2.1. Eletroforese em gel de agarose


Os gis de agarose, por possurem poros mais largos, so normalmente usados para separar macromolculas como cidos nuclicos, protenas maiores ou complexos proticos. Este tipo de gel tambm usado em tcnicas como imunoeletroforese ou focalizao isoeltrica, onde as protenas so solicitadas a mover-se de forma livre na matriz do gel de acordo com sua carga nativa. O gel

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

formado entre dois vidros, tendo geralmente dimenses da ordem de 10 x 15 cm.

4.3.2.2. Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE1)


O suporte amplamente utilizado nessa tcnica para protenas a poliacrilamida, formada por uma malha transparente estvel, gerada pela copolimerizao qumica de monmeros de acrilamida com N,N-metilenobisacrilamida (Bis-acrilamida) na presena de persulfato de amnio e tetrametiletilenodiamina (TEMED). O TEMED catalisa a liberao de radicais livres do persulfato que, por sua vez, iniciam e aceleram a polimerizao.

Figura 4.2. Formao da malha de poliacrilamida (suporte); quanto maior a concentrao de acrilamida, menores os poros formados.

Do ingls PolyAcrilamide Gel Electrophoresis.

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Cap. 4

Esta forma de eletroforese em gel de poliacrilamida o mtodo mais utilizado para anlise de misturas de protenas de forma qualitativa. Este mtodo baseado na separao de protenas de acordo com a carga e o volume molecular; em uma de suas variantes (SDS-PAGE) pode ser utilizado na determinao da massa molecular relativa de protenas. Eventualmente, podemos utilizar gis contendo um gradiente de poliacrilamida, onde a concentrao do polmero (acrilamida) e o tamanho dos poros varia uniformemente ao longo do gel (ex: 5 % acrilamida no topo do gel aumentando at 25% ao final do gel). A vantagem da utilizao destes gis consiste no seu poder de separao de protenas com volumes moleculares muito similares. Este tipo de gel pode ser utilizado tanto na eletroforese nativa quanto na eletroforese em condies desnaturantes (SDS-PAGE).

4.3.2.3. Eletroforese nativa


Atualmente, este tipo de eletroforese mais utilizado com o objetivo de medir a atividade enzimtica e, em alguns casos, para determinar a formao de complexos entre duas protenas. Neste tipo de eletroforese, as protenas presentes na amostra so separadas de acordo com sua carga lquida nativa e seu volume molecular. Por exemplo, uma enzima de interesse pode ser identificada incubando o gel em uma soluo com substrato adequado, produzindo um produto corado devido reao com o stio da enzima. Este tipo de eletroforese deve ser empregado quando a estrutura nativa da protena importante para as anlises.

4.3.2.4. Eletroforese (SDS-PAGE)

em

condies

desnaturantes

O detergente aninico dodecil sulfato de sdio (SDS2) forma interaes hidrofbicas com as protenas na proporo de uma molcula de detergente para cada dois resduos de aminocidos das mesmas. O SDS ento adiciona carga negativa em grande
2

Do ingls Sodium Dodecyl Sulfate.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

quantidade s protenas, conferindo-lhes uma carga negativa homognea. Alm disso, o SDS um agente desnaturante capaz de desfazer parcialmente a estrutura tridimensional de protenas. Entretanto, o detergente no capaz de romper ligaes covalentes como as pontes dissulfeto.

Figura 4.3. O detergente aninico dodecil sulfato de sdio (SDS).

O SDS-PAGE uma tcnica freqentemente utilizada na bioqumica e biologia molecular para determinao das massas moleculares relativas das protenas presentes em uma amostra. Este tipo de eletroforese pode ainda ocorrer em condies redutoras, atravs da adio de agentes redutores como ditiotreitol ou beta-mercaptoetanol. Estes agentes complementam a desnaturao das protenas atravs da reduo de ligaes dissulfeto finalizando o processo de desmantelamento das estruturas tercirias e quaternrias (eventuais), previamente separao eletrofortica. As protenas podem ser detectadas em amostras de clulas (homogenato) ou em extratos de tecidos. Estas amostras so preparadas atravs da lise celular, promovendo o rompimento das clulas e das organelas. O tampo de lise celular tradicionalmente composto por um detergente, como o SDS ou Triton X-100, associado a um coquetel de inibidores de proteases. Ento, a soluo centrifugada e ao sobrenadante (material solvel) adicionado um tampo de amostra que, geralmente, contm um corante, um composto redutor (betamercaptoetanol) e detergente (SDS). Este tampo possibilitar o desenovelamento das protenas, pois a estrutura terciria ser desfeita devido desestruturao de interaes hidrofbicas (detergente) e rompimento de ligaes dissulfeto (composto redutor). Alm disso, a amostra ainda fervida, o que favorece a desnaturao protica. Anteriormente adio do tampo de amostra, a concentrao de protenas determinada para a padronizao do volume da amostra que dever ser aplicado na eletroforese unidimensional. No caso de cultura de clulas, o nmero de clulas tambm pode ser utilizado como indicador da concentrao de protenas da amostra.

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ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Cap. 4

4.3.3. Eletroforese capilar


A tcnica de eletroforese capilar foi introduzida em 1981 por Jorgenson e Lukacs e se tornou um importante mtodo analtico, possibilitando o desenvolvimento de outras tcnicas, como o seqenciamento automtico de DNA. Neste tipo de eletroforese emprega-se um tubo capilar preenchido com uma soluo de eletrlito, assemelhando-se tcnica original descrita por Tiselius, sendo empregada na determinao de amostras como protenas, peptdeos, hidrocarbonetos, vitaminas, dentre outras. O equipamento de eletroforese capilar envolve aplicao de alta voltagem em um capilar de dimetro reduzido gerando correntes de 10 a 100 mA e um intenso campo eltrico (permitido pela alta resistncia eltrica do capilar), que por sua vez favorece a diminuio do tempo de anlise, sua eficincia e sua capacidade resolutiva. Tambm so utilizados neste tipo de eletroforese, capilares cheios de gel com a aplicaco de campos eltricos elevados. Na eletroforese capilar, uma soluo tampo adicionada ao capilar e suas extremidades so imersas em recipientes contendo a soluo-tampo, que permite a aplicao de um campo eltrico,

Figura 4.4. Esquema representativo de eletroforese capilar. Os recipientes contm solues eletrolticas onde ficam os eletrodos, submetidos a uma alta voltagem. As molculas carregadas migram em um campo eltrico e so detectadas por um detector acoplado a um computador, gerando assim o registro temporal dos sinais.

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

gerando uma corrente no interior do capilar atravs de eletrodos mergulhados na soluo. Uma pequena quantidade da amostra introduzida em uma das extremidades do capilar e a aplicao do campo eltrico promove o movimento das molculas em direo aos eletrodos. Um fenmeno eletrofortico que gera o fluxo da soluo dentro do capilar faz com que os solutos se movimentem em direo ao detector. Esse tipo de eletroforese atualmente utilizada em sequenciadores de DNA.

4.4. Zimografia
A zimografia consiste em um mtodo sensvel para medida da atividade enzimtica aps uma separao eletrofortica. O princpio fsico-qumico da eletroforese permite a separao das protenas, e a atividade enzimtica determinada pelo nvel de degradao do substrato (normalmente co-polimerizado no mesmo gel de corrida). Usaremos como exemplo o substrato gelatina, para proteases. Aps a corrida eletrofortica e incubao, o gel com gelatina corado com azul de Coomassie, permitindo a revelao das bandas. A diminuio, ou eventual desaparecimento de cor nas bandas do gel, est relacionado com a quantidade de gelatina (substrato) degradada na reao de protelise. Este mtodo amplamente utilizado para busca de enzimas que degradam a matriz extracelular, em especial, metaloproteases de matriz extracelular (MMPs).

Figura 4.5. Representao esquemtica do ensaio de zimografia. As amostras A, B e C apresentam atividade enzimtica semelhante como representado no gel acima.

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ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Cap. 4

4.5. Western blot / Immuno blot


Na dcada de 70, o britnico Edwing Southern desenvolveu o mtodo de identificao de uma seqncia de DNA a partir de sua transferncia para uma membrana e sua deteco com sondas especficas, o qual acabou designado como Southern blot. Posteriormente, foi descrita outra tcnica de transferncia em membrana, porm para verificar a expresso de RNAm. Esta tcnica foi denominada de northern blot, fazendo um trocadilho entre os pontos cardeais e o mtodo de identificao de DNA. Em 1979, o protein blot ou blot foi introduzido por Towbin e colaboradores e chamado de western blot. Esta tcnica caracterizada pela transferncia de um extrato protico para uma membrana, comumente de nitrocelulose. J o immuno blot o western blot aonde, aps a transferncia para a membrana, as protenas so identificadas com anticorpos especficos. Atualmente, utiliza-se o termo western blot como sinnimo de immuno blot. A primeira etapa da tcnica pode consistir, por exemplo, de uma eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), possibilitando a separao das protenas da amostra de acordo com a sua massa molecular. Ao final da eletroforese, as protenas so transferidas para uma membrana, possibilitando a imunodeteco. O processo de transferncia mais comumente utilizado consiste no contato direto entre o gel proveniente da eletroforese e uma membrana, geralmente de nitrocelulose, sob aplicao de um campo eltrico, num ambiente imerso em tampo bsico. A capilaridade do gel permite que o tampo entre nos poros e remova as protenas para a membrana, mantendo-as separadas. As protenas se ligam quase irreversivelmente com a membrana atravs de interaes hidrofbicas. Os dois principais tipos de membranas so: nitrocelulose (vantajosa no que diz respeito ao custo) e PVDF (maior sensibilidade, capacidade de ligao com as protenas e tempo de reteno destas). Alguns fatores podem determinar a eficincia da transferncia como a composio do gel, do tampo, volume molecular das protenas, temperatura e tempo de transferncia. Aps a transferncia, a membrana incubada com uma soluo bloqueadora, que tem a funo de cobrir as regies da membrana que no possuem as protenas submetidas eletroforese. O bloqueio inibe a ligao inespecfica entre os anticorpos a serem aplicados e a membrana. Esta soluo composta por albumina bovina ou leite, permitindo a associao entre as regies livres da membrana e as protenas da soluo bloqueadora. Aps o bloqueio, a membrana tratada com anticorpo reativo para a protena que se deseja analisar (anticorpo primrio) dissolvido em uma soluo de PBS (soluo salina tamponada com fosfato). Na etapa seguinte, a membrana submetida a lavagens consecutivas para remoo dos anticorpos que no se liga-

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Mtodos experimentais no estudo de protenas

ram aos seus antgenos (protenas) correspondentes. Posteriormente, a membrana incubada com o anticorpo secundrio, o qual especfico para a espcie animal na qual foi desenvolvido o anticorpo primrio. O anticorpo secundrio, comumente, est complexado a uma enzima reveladora, a qual, na medida em que for incubada com seu substrato especfico, emitir um sinal, por exemplo, fotossensvel. A quantificao deste sinal a medida indireta de quanto de protena-alvo (antgeno) est presente na amostra (Figura 4.6). O immunoblotting se limita a uma anlise semi-quantitativa (eventualmente quantitativa) da protena pois no permite estimar a funcionalidade desta ltima.

Substrato

Produto (luz)

DETECO

Anticorpo primrio (produzido em coelho)

Ig G anti-coelho ligada a enzima

Protena de interesse Protena bloqueadora que no apresenta reao cruzada (albumina do soro bovina)

Protenas transferidas para a membrana de nitrocelulose

Figura 4.6. Esquema do processo de imunorevelao aps western blotting.

Existem quatro tipos principais de deteco do sinal no western blotting aps a adio do anticorpo primrio: a) Colorimtrica Neste mtodo a deteco depende da incubao da membrana com um substrato que reaja com a enzima reveladora, como a peroxidase, que est conjugada ao anticorpo secundrio. Esta reao converte o corante solvel em insolvel, colorindo a membrana e gerando as bandas. Aps a lavagem para a remoo do co-

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ELETROFORESE, ZIMOGRAFIA & WESTERN BLOTTING

Cap. 4

rante, o nvel de abundncia protica analisado por densitometria, que consiste na medida da intensidade da banda; b) Quimioluminescente Os mtodos de deteco quimioluminescentes so caracterizados pela incubao da membrana com substrato que emita luz aps a reao com a enzima reveladora. A luz emitida capturada por um filme fotogrfico ou por cmeras digitais e a anlise feita por densitometria. A quimioluminescncia um dos mtodos mais sensveis de deteco no western blot; c) Radioativa Diferentemente das tcnicas de deteco anteriores, este mtodo no necessita de substratos enzimticos uma vez que o anticorpo secundrio est acoplado a uma sonda radioativa, o que permite a associao de filmes mdicos de Raios-X para revelao diretamente com o western blot. O emprego deste mtodo est diminuindo devido ao seu alto custo e aos riscos sade com o uso de material radioativo; d) Fluorescente Assim como a deteco radioativa, esta tcnica no necessita de substratos enzimticos, pois o anticorpo secundrio est acoplado a uma sonda fluorescente. Quando excitada no comprimento de onda apropriado, esta sonda emite a fluorescncia que captada por um fotosensor, como uma cmera CCD, permitindo a anlise das bandas por densitometria. A deteco fluorescente tambm considerada um dos mtodos mais sensveis de deteco no western blot.

Referncias
Kurien, B.T., ScoWeld, R.H. (2006) Western blotting. Methods. 38: 283293. Chen, H., Chang, G.D. (2001) Electrophoresis. 22: 18941899. Kurien, B.T., Matsumoto, H., ScoWeld, R.H. (2001) Indian Journal of Biochemistry and Biophysics. 38: 274276. Reese, G., Schmechel, D., Ayuso, R., Lehrer, S.B. (2001) Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 756: 151156. Leber, T.M., Balkwill, F.R. (1997) Analytical biochemistry. 15(249): 2428. http://www.icb.ufmg.br/mor/pad-morf/eletroforese.htm Silva Jnior, J.G. (2001) Eletroforese de protenas: guia prtico-terico, editora Intercincia, Rio de Janeiro. Jager, A.V., Tavares, M.F.M. (2001) Determinao simultnea de ctions por eletroforese capilar: Fundamentos e Aplicaes. Quim. Nova. 24: 363-373. Snoek-van Beurden, P.A., Von den Hoff, J.W. (2005) BioTechniques. 38(1):73-83.

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INTRODUO PROTEMICA

Karina Mastropasqua Rebello

INTRODUO PROTEMICA

Cap. 5

5. INTRODUO PROTEMICA 5.1. Introduo


A Teoria Central da biologia molecular explica como a informao gentica contida nos genes transferida para o citoplasma. Este processo inicia-se com a formao de uma molcula, o RNA mensageiro (RNAm), atravs do processo da transcrio, e no citoplasma esta molcula de RNAm traduzida em uma protena que exerce sua funo biolgica. As protenas so macromolculas abundantes e relevantes pois desempenham diversas funes biolgicas, tais como estrutural, hormonal, transportadora, imunolgica e enzimtica. O intenso avano da Biologia, em especial aps o sequenciamento do genoma humano e de genes completos de vrios organismos, gerou uma infinidade de informaes sobre a organizao gentica destes. Entretanto, o sequenciamento de genes no gera informaes sobre quais protenas esto sendo expressas em um dado momento, sob determinada condio. Ao contrrio do genoma, que permanece relativamente estvel ao longo do ciclo de vida de um organismo, o proteoma, ou seja, o perfil de expresso protica de uma clula extremamente dinmico, pois se modifica dependendo das condies e estmulos a que este organismo est exposto. A necessidade de suprir essa grande demanda de conhecimento sobre a biologia da clula atravs do mapeamento de perfis proticos, quantificao de protenas e estudos de modificaes ps-traducionais, levou ao surgimento da protemica, que permite investigar, alm do controle da expresso gnica, modificaes ps-traducionais e o metabolismo celular. O termo protemica, sugerido por Marc Wilkins em um simpsio na

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Vol. 1

Mtodos experimentais no estudo de protenas

Figura 5.1. Teoria Central da biologia molecular com indicao dos diversos pontos de controle existentes, os quais podem ocorrer na transcrio (1), no processamento do RNA (2), no transporte do mRNA do ncleo para o citoplasma (3), na eventual degradao desse mRNA (4), na traduo (5) e, finalmente, na eventual adio de grupamento qumico e/ou processamento da protena recm-sintetizada para gerar sua forma ativa (modificaes ps-traducionais) (6).

Itlia, em 1994, e subsequentemente publicado em 1995, definido como a caracterizao em larga escala do conjunto de protenas contidas em uma clula. Este conjunto de protenas expressas em uma clula ou tecido, a partir do genoma, que denominamos proteoma. A anlise protemica uma tcnica relativamente recente, que permite caracterizar um proteoma de uma amostra qualitativa e quantitativamente. As duas principais tcnicas para a anlise do proteoma so: eletroforese bidimensional (2D-PAGE 2-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis) e espectrometria de massas. A tcnica de 2D-PAGE, descrita por OFarrel em 1975, consiste na separao de protenas com base em duas importantes propriedades fsico-qumicas independentes: ponto isoeltrico e massa molecular. Inicialmente, a tcnica consistia na preparao de gis cilndricos de poliacrilamida, em que o gradiente de pH era estabelecido atravs de uma pr-corrida com partculas carregadas (tambm chamados de anflitos) especficas com elevada capacidade de tamponamento em pHs prximos aos seus pontos iso-

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INTRODUO PROTEMICA

Cap. 5

eltricos (pI). Na primeira etapa da tcnica (primeira dimenso), a amostra submetida a uma migrao eletrofortica em fita de gel contendo um gradiente de pH. Assim, as protenas migram horizontalmente no gel at chegarem ao pH em que sua carga lquida (soma das cargas positivas e negativas) seja zero (pI ponto Isoeltrico) (Berg et al., 2002). Esta tcnica conhecida como focalizao isoeltrica (IEF - IsoElectric Focusing). Na etapa seguinte, a fita resultante da primeira dimenso submetida eletroforese tradicional SDS-PAGE para uma segunda separao das protenas, agora pela diferena em suas massas moleculares. A espectrometria de massas determina a relao massa/carga (m/z) de ons em fase gasosa. Inicialmente, esta tcnica era aplicada principalmente na determinao de estruturas qumicas de molculas pequenas e volteis. No entanto, com o desenvolvimento de tcnicas de ionizao suaves (que ionizam macromolculas sem degrad-las) no incio da dcada de 80, tornou-se possvel sua aplicao na anlise de molculas maiores e polares, como peptdeos e protenas. A partir desse momento, novos equipamentos passaram a ser desenvolvidos com a finalidade de solucionar questes relacionadas qumica de protenas. As tcnicas de protemica podem ser aplicadas nas reas biomdicas, em diversos estudos, tais como: identificao de biomarcadores de doenas, efeito de frmacos sobre clulas e, ainda, na comparao de expresso de cepas patognicas e no patognicas, para auxiliar no desenvolvimento de mtodos diagnsticos e de agentes teraputicos.

5.2. Preparao da amostra


a etapa fundamental do estudo. O protocolo ideal varia de acordo com a amostra. A preparao da amostra consiste basicamente em duas etapas: inicialmente ocorre a lise celular (rompimento das clulas) seguida das etapas de extrao e solubilizao das protenas. A lise celular feita em temperatura baixa (gelo) utilizando uma soluo fortemente desnaturante, com auxlio de ciclos de congelamento/descongelamento em N2 lquido, sonicao e/ou macerao. Ainda na primeira etapa, possvel utilizar inibidores de proteases, para impedir a degradao das protenas. Na segunda etapa, utilizada uma soluo de extrao contendo agentes caotrpicos (Uria e Tiouria, que desfazem interaes no-covalentes, como as ligaes de hidrognio nas protenas), detergentes noinicos ou zwiterinicos (CHAPS, TRITON X-100 e Nonidet P-40 que auxiliam na solubilizao das protenas e desfazem os agregados proticos), agentes redutores (ditiotreitol ou beta-mercaptoetanol que rompem as ligaes dissulfeto intra e inter-cadeias) e tampo com anflitos carreadores os quais auxiliam na solubilizao das protenas, alm de manter a condutividade mais uniforme ao longo do gradiente de pH (Figura 5.2).

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Figura 5.2. Representao esquemtica de diferentes protocolos de extrao de protenas. DTT (ditiotreitol); CHAPS (3-[(colamidopropil) dimetilamnio]-1-propano-sulfonato); IPG buffer (tampo de anflitos).

5.3. 2D-PAGE Eletroforese Bidimensional


Esta etapa consiste basicamente em trs passos. O primeiro a focalizao isoeltrica (IEF Isoelectric Focusing), seguido pelo equilbrio das tiras de IPG para a terceira e ltima fase, que o SDS-PAGE. Como qualquer outra tcnica, a tcnica de eletroforese bidimensional tem suas limitaes: dificuldade de solubilizar protenas de membrana, dificuldade da resoluo/ separao de protenas com pI extremos (abaixo de 3 e acima de 10) e de protenas pouco abundantes, dificuldade de automao e de reprodutibilidade, alm de ser um mtodo bastante trabalhoso. 5.3.1. Focalizao isoeltrica (IEF) Primeira Dimenso Em 1975, OFarrell descreveu a tcnica de separao de misturas complexas de protenas em primeira dimenso, de acordo com seu ponto isoeltrico (pI). Desde ento, esta tcnica sofreu aperfeioamentos em vrios aspectos e tornou-se mais simples e confivel devido introduo de gradientes de pH imobilizados em suporte, comercialmente disponveis, tornando os gis mais reprodutveis. Esta tcnica conhecida como focalizao isoeltrica, onde a

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separao das cadeias polipeptdicas ocorre atravs de um gradiente de pH, gerado por carreadores anflitos (substncias polimricas que contm em suas estruturas vrios grupos ionizveis do tipo carboxila e amina) em gis de poliacrilamida, na presena de um campo eltrico. A tcnica inicialmente apresentava limitaes na reprodutibilidade, pois os gradientes gerados por anflitos eram instveis e sofriam variao durante a sua produo. No entanto, ela foi aperfeioada tornando-se operacionalmente simples devido a gradientes de pH comercialmente disponveis, imobilizados em tiras ou strips de poliacrilamida, tambm conhecidas como tiras de IPG (IPG Immobilized pH gradient) (Grg et al., 1985) (Figura.5.3).

Figura 5.3. Representao esquemtica de uma isoeletrofocalizao entre pH 3 e 10 ao longo do tempo de corrida.

Entre as etapas de IEF e a segunda-dimenso (SDS-PAGE) as tiras de IPG ou strips so equilibradas, para que as protenas previamente separadas pelo seu pI interajam com o SDS e possam ento ser separadas segundo seu volume molecular (Figura 5.4). O SDS um detergente apresentando uma cadeia longa apolar ligada a grupo terminal carregado. Possui uma ao desnaturante porque sua cauda hidrofbica se insere no interior da protena e se associa com radicais apolares, rompendo interaes hidrofbicas que mantm

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a estrutura proteica nativa. Alm disso, confere uma carga negativa a todas as protenas, fazendo com que estas se distingam somente pelas suas massas moleculares.

SDS se liga a protena

Molculas menores correm mais rpido no gel

Molculas maiores correm mais lentamente

Figura 5.4. Ilustrao da ao do SDS em protenas.

5.3.2. SDS-PAGE Na segunda etapa, a fita resultante da primeira dimenso submetida tradicional eletroforese SDS-PAGE para uma segunda separao das protenas, agora pela diferena na massa molecular (Figura 5.5).

Figura 5.5. Resultado final de uma 2D-PAGE. As molculas sofreram separao em duas dimenses: pI (carga) X massa molecular relativa (volume molecular).

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5.4. Introduo espectrometria de massas


A espectrometria de massas uma ferramenta analtica capaz de identificar as composies, qualitativa e quantitativamente, de misturas complexas (incluindo a distribuio isotpica de seus elementos), assim como permite analisar modificaes ps-traducionais como metilao, glicosilao, acetilao e fosforilao. A espectrometria de massas permite tambm determinar a seqncia de aminocidos dos peptdeos, visando identificao das protenas que constituem a amostra. O espectrmetro de massas um instrumento que determina a razo entre massa e carga (m/z) de ons em fase gasosa, sendo constitudo pelos seguintes componentes: fonte de ionizao (responsvel pela introduo de cargas e vaporizao da amostra), analisador (es) de massas (determina a relao m/z do analito) e detector de ons (detecta a presena do analito) (Figura 5.6).

vcuo

amostra

Fonte de Ionizao
MALDI

Analisador de massas 1
TOF Q TridimensionaI Ion Trap

Analisador de massas 2
TOF TOF ----------ORBITRAP -FT ICR -FT

Detector de ons

ESI

Linear Ion Trap Linear Ion Trap Linear Ion Trap

Computador

Inte nsidade %

Busca em bancos de dados e Identificao de protenas

m/z Espectro de massas

Figura 5.6. Esquema dos componentes possveis de um espectrmetro de massas utilizado em estudos protemicos. ESI (Electrospray Ionization), MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization), ICR-FT (Ion cyclotron ressonance Fourier transform), Q (Quadripole) e TOF (Time of Flight) .

Basicamente, existem dois tipos principais de fonte de ionizao que so utilizadas na anlise de protenas e peptdeos: ionizao por eletrospray (ESI - Electrospray Ioni-

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zation) (Figura 5.7) e ionizao por desoro a laser auxiliada por matriz (MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) (Figura 5.8). Geralmente, estas fontes podem ser combinadas de diferentes formas com os analisadores permitindo a construo de equipamentos hbridos de alto desempenho. Uma combinao que tem se mostrado eficiente da fonte de ionizao MALDI com dois analisadores TOF (Time of Flight) em tandem (um atrs do outro; alinhados). No espectrmetro MALDI TOF-TOF a amostra misturada a uma matriz orgnica e aplicada a uma placa de ao inoxidvel contendo microfissuras. medida que os solventes da matriz e da amostra evaporam, ocorre uma co-cristalizao destes. A placa ento submetida a tiros de laser, o que provoca a fotoionizao dos analitos pela transferncia de carga dos ons da matriz para a amostra, e posterior dessoro, fazendo com que os ons do analito entrem em fase gasosa. Aps entrarem em fase gasosa, os analitos so encaminhados ao analisador do tipo TOF, onde os ons so acelerados pela aplicao de uma diferena de potencial e percorrem um espao livre (tubo de vo) sob vcuo, at serem detectados. Os ons de m/z diferentes atingem o detector em tempos diferentes; os ons de maior massa levam mais tempo para atingir o detector, o que pode ser visualizado pela frmula a seguir:

Assumindo os valores de e, U e L constantes;

Lembrando que na maioria das vezes z = 1. e carga elementar t tempo m massa U diferena de potencial L espao percorrido z carga do on

Desta forma, os componentes individuais em uma mistura de ons so separados de acordo com as suas relaes entre massa e carga (m/z), tornando possvel a determinao da massa de cada protena ou peptdeo intacto. Para este resultado d-se o nome de espectro MS. Os peptdeos previamente detectados durante o espectro MS (chamados de ons precursores) so ento isolados e submetidos fragmentao por coliso com molculas de um gs inerte, tal como argnio, nitrognio ou hlio. O espectro obtido chamado espectro de fragmentao ou MS/MS. A identificao das protenas feita a partir dos resultados obtidos tanto do espectro MS, bem como dos espectros de fragmentao (MS/MS), atravs da comparao destes dados experimentais com dados de fragmentao tericos, gerados in silico, de

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todas as protenas presentes em determinado banco de dados, utilizando ferramentas (softwares) especficas tais como Mascot ou Sequest. Estes programas reportam os resultados encontrados na forma de estimadores da confiabilidade de identificao. Assim, quanto maior o valor do estimador, menor a probabilidade de que este resultado seja fruto de uma coincidncia, ou seja, uma identificao falso-positiva. A identificao de protenas de um determinado organismo atravs da busca em banco de dados possvel somente se este organismo possui o seu genoma seqenciado e disponvel. Em situao na qual o genoma de uma determinada espcie ainda no esteja completamente seqenciado ou disponvel, necessrio derivar a seqncia primria de aminocidos de determinados peptdeos baseado nica e exclusivamente nos dados obtidos por espectrometria de massas, isto , sem recorrer aos algoritmos e a banco de dados. Esta tcnica denominada de seqenciamento de novo (Steen & Mann, 2004).

Figura 5.7. Ionizao e dessolvatao por ESI (Electrospray Ionization).

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Figura 5.8. Ionizao e dessoro por MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization).

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Referncias Bibliogrficas
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