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EFEITO DO ESTRESSE CRNICO NA PROGRESSO DE PERIODONTITE INDUZIDA POR LIGADURA EM RATOS

Effect of chronic stress on the progression of ligature-induced periodontitis in rats
Alex Semenoff Segundo 1, Tereza Delle Vedove Semenoff 1, lvaro Francisco Bosco 2, Eder Ricardo Biasoli 2, Reginaldo Vicente Ribeiro 3, Grace Emanuelle Guerreiro Dias Rocatto 4, Samyra Lopes Buzelle 5, Dhayane Macagnan Cirilo 5, Suellen Lara Guirra Rosa 5

RESUMO O objetivo deste trabalho foi pesquisar o efeito do estresse crnico na progresso da periodontite induzida por ligadura em ratos. Para o estudo foram utilizados 24 ratos adultos da espcie Rattus novergicus da linhagem Wistar, distribudos em grupo estresse, ligadura e controle. Aps anestesia dos grupos estresse e ligadura, colocou-se fio de seda em volta do segundo molar superior direito de cada animal. No grupo estresse, um dia aps a induo de periodontite, os animais foram submetidos a ensaio de estresse crnico, alternando-se o modelo de conteno em um dia e conteno associado exposio ao frio no outro, ambos uma vez ao dia, durante duas horas. Nos grupos ligadura e controle nenhum estresse foi realizado. Decorrido o perodo de 60 dias de estresse, todos os grupos foram eutanasiados por dose excessiva de anestsico. Na avaliao histomtrica, foram determinadas as distncias entre a juno amelo-cementria na face mesial do segundo molar at a poro mais coronria do epitlio juncional (Jac-I) e crista ssea alveolar (Jac-CO). Foram observadas diferenas significativas (p<0,05) entre os grupos estresse, ligadura e controle para as mdias Jac-I (1,32 mm, 0,58 mm e 0 mm respectivamente) e Jac-CO (2,64 mm, 1,74 mm e 0,95 mm, respectivamente). Concluindo, o modelo de estresse crnico foi capaz de induzir a maior progresso de periodontite induzida por ligadura em ratos. UNITERMOS: estresse, periodontite, ratos. R Periodontia 2006; 17:00-00.

INTRODUO A relao do sistema ner voso central (SNC), interferindo na proteo ou destruio do organismo frente a agentes agressores intra ou extra-corpreos um tema atual e controverso. A doena periodontal induzida por biofilme microbiano na maioria das vezes uma doena crnica, assim como a maioria das doenas de origem da psique que influenciam o ser humano (BAELLUM et al ., 1986; ANISMAN et al ., 1996; MOYNIHAN, 2003). Diversos estudos de natureza epidemiolgica tm relacionado problemas psicossomticos com parmetros clnicos da doena periodontal (MOSS et al., 1996; GENCO et al., 1999; ELTER et al., 2002). Apesar disso, evidncias recentes tm revisto essa relao (SOLIS et al., 2004; CASTRO et al., 2006). Os resultados das evidncias que envolvam o estresse crnico e periodontite em ratos so divergentes em seus resultados, seguindo a direo dos achados epidemiolgicos. Provavelmente este fato ocorra por existir diferenas no modelo de estresse crnico, como: durao, forma, variao no perodo do dia, linhagem dos ratos, alm da forma de leitura e processamento histolgico do periodonto (GASPERSIC et al., 2002; BENATI et al., 2003; SEMENOFF-SEGUNDO et al., 2006b). As vias de ligao entre o periodonto e o SNC
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Doutorandos pela Faculdade de Odontologia do Campus de Araatuba - UNESP e professores do Centro Universitrio de Vrzea Grande (MT) - UNIVAG
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Professores Adjuntos da Faculdade de Odontologia do Campus de Araatuba - UNESP

Mestrando em cincias da sade pela Universidade Federal de Mato Grosso -UFMT e professor do Centro Universitrio de Vrzea Grande - UNIVAG (MT)
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Fisioterapeuta - Centro Universitrio de Vrzea Grande - UNIVAG (MT) Graduando de farmcia pelo Centro Universitrio de Vrzea Grande - UNIVAG (MT)

Recebimento: 00/00/00 - Correo: 00/00/00 - Aceite: 00/00/00

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comeam com um estimulo fsico ou emocional, desencadeando impulsos eltricos e qumicos como o hormnio adrenocorticotrpico (ACTH) e adrenalina, capazes de interagir em rgos endcrinos como as glndulas supra-renais e clulas imuno-inflamatrias especficas como clulas Th0 (T helper), ambas importantes na etiopatogenia da doena periodontal (BREIVIK & THRANE, 2000; GASPERSIC et al., 2002; SUSIN & RSING, 2003; SEMENOFF-SEGUNDO et al., 2006b). Diante desse contexto, o presente trabalho teve por objetivo pesquisar o efeito do estresse crnico na progresso da periodontite induzida por ligadura em ratos. MATERIAL E MTODOS Animais Para o presente experimento foram selecionados vinte e quatro ratos machos da espcie Rattus novergicus da linhagem Wistar, com trs meses de idade, com peso inicial de 292,60 + 38,60 gramas, obtidos do Biotrio Central do Univag (Centro Universitrio de Vrzea Grande, MT, Brasil) divididos em trs grupos. Os mesmos passaram por uma adaptao ao novo ambiente durante uma semana. Os animais mantiveram-se em caixas moradias em nmero de quatro, com rao padronizada e gua ad libitum, sob ciclo claro/escuro, temperatura controlada a 23 C e umidade + 60%. O experimento foi aprovado e registrado pelo Comit de tica na Experimentao animal (CEEA) com o nmero de protocolo 0074"2005. Doena periodontal experimental Todos os procedimentos de induo de doena periodontal foram realizados sob anestesia geral, atravs de administrao intramuscular de 0,1 ml de cloridrato de quetamina (Dopalen, Agribrands. Sade Animal, Paulnia, SP , Brasil), associado a 0,05 ml de cloridrato de xylazina (Rompun, Bayer. Sade Animal, So Paulo, SP . Brasil) por cada 100 gramas de peso corporal. Os animais foram divididos de forma aleatria (pessoa de fora do estudo) em grupo estresse, grupo ligadura e grupo controle. Selecionaram-se para anestesia os grupos estresse e ligadura, acondicionando um fio de sutura de seda estril nmero 4 (Ethicon, Johnson e Johnson, So Paulo, Brasil) em volta do segundo molar superior direito. Aps 24 horas de colocao das ligaduras, iniciou-se o estresse no grupo respectivo, por um perodo de 60 dias, sendo todos os grupos submetidos eutansia por excesso anestsico aps o ltimo dia do ensaio de estresse. Modelo de estresse Os modelos escolhidos para o estresse foram imobilizao e imobilizao associado exposio ao frio. Durante 60 dias, sem interrupo, em momentos variados entre o perodo das 08h 00min as 18h 00min, usava-se em um dia a imobilizao e
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no outro imobilizao junto com exposio ao frio, sendo realizadas a eutansia de todos os grupos no ltimo dia, logo aps o estresse. Imobilizao: Os animais expostos a uma temperatura mdia de 28 graus centgrados foram embutidos em tubos de PVC, compatveis com seu tamanho e, posteriormente, selados com arame, de forma a possibilitar a respirao dos animais. Esse procedimento teve a durao de duas horas. Imobilizao e exposio ao frio: Expuseram-se os animais a uma temperatura mdia de 5 graus Centgrados (geladeira) por um perodo de duas horas. A imobilizao foi feita da mesma forma j descrita. Exame histolgico As peas removidas, contendo hemi-maxila direita, foram fixadas em formol a 10% por 48 horas. Em seguida foram descalcificadas em EDTA 10% por um perodo prximo h duas semanas, sendo lavadas, desidratadas, diafanizadas e includas em parafina. Os blocos foram includos de maneira a permitir cortes histolgicos ao longo eixo dos dentes no sentido mesiodistal, com espessura dos cortes de 5 m. Durante o processo de microtomia, cuidados foram tomados, de maneira que os cortes seriados fossem visualizados ao microscpio, e permitissem identificar os primeiro e segundo molares, a crista ssea interproximal, a cmara pulpar coronria e a radicular. Os cortes foram corados com hematoxilina de Harris e eosina. Para anlise, foram selecionadas as dez lminas seriadas, nas quais necessariamente deviam ser observados o primeiro e o segundo molar, contendo polpa coronria e polpa radicular, juno amelo-cementria evidente na poro mesial do segundo molar, crista ssea interproximal e insero conjuntiva (SEMENOFF- SEGUNDO et al., 2006a). A histometria foi realizada atravs da captao das imagens (microscpio trinocular, Jenamed 2, Carl Zeiss, lente 12,5/0,25, Germany acoplado a Cmara JVC, Japan), e mensurada em mm, utilizando-se o software ImageLab 2000 (Diracon Bio Informtica Ltda., Vargem Grande do Sul, SP , Brasil). O parmetro da anlise histomtrica do presente estudo foi a distncia entre a juno amelo-cementria na face mesial do segundo molar e a poro mais coronria do epitlio juncional (Jac-I). Esse parmetro foi estabelecido como perda de insero histolgica. Analisouse, tambm, a distncia entre a juno amelo-cementria e a crista ssea alveolar (Jac-CO) que, neste estudo, foi considerado perda ssea. O examinador realizou a histometria do estudo cego, sendo as lminas codificadas por um pesquisador de fora do trabalho. Para confiabilidade da leitura dos dados foram realizadas calibragens intra-examinador, sendo uma prvia e outra durante

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Tabela 1
REPRESENTA AS MDIAS E DESVIOS PADRES (+) EM MM, COM LENTE 12,5/0,25 DOS GRUPOS ESTRESSE, LIGADURA E CONTROLE, PARA AS HISTOMETRIAS JAC-I E JAC-CO.

Jac-I Mdia Estresse Ligadura Controle 1,32 0,58 0,00 + + + Desvio Padro 0,26 A 0,51 B 0,00 C Mdia 2,64 1,74 0,95

Jac-CO Desvio Padro + + + 0,29 A 0,66 B 0,21 C

Letras diferentes em linha vertical representam diferena estatstica significativa( p<0,05).

a anlise das lminas. Na calibragem prvia ao estudo, selecionaram-se aleatoriamente 10% do total de lminas, sendo realizadas duas leituras com intervalo de uma semana de diferena. Para calibragem durante a anlise, a cada dez lminas examinadas, retornava-se primeira desse grupo de lminas analisadas e uma nova leitura era realizada (Susin e Rsing, 2003). Ambas as calibragens no apresentaram diferenas estatsticas (p>0,05), e com a diferena mnima do erro padro da mdia de 0,05 mm. Anlise dos resultados Compararam-se os grupos experimentais utilizando-se Anlise de Varincia, sendo que o mtodo de Bonferroni foi utilizado para as comparaes entre os grupos. Todos os testes tiveram um nvel de significncia de 5%. Resultados O grupo controle no apresentou perda de insero, enquanto que o grupo com ligadura apresentou uma perda de insero estatisticamente significante de aproximadamente 0,6 mm. O grupo com ligadura e submetido aos agentes estressores apresentou perda de insero duas vezes maior do que o grupo que recebeu apenas ligadura, sendo essa diferena estatisticamente significante (tabela 1). Em relao perda da altura da crista ssea, o grupo controle apresentou menor mensurao quando comparado ao grupo com ligadura, o qual apresentou uma distncia estatisticamente significante de aproximadamente 1,74 mm. Assim como o parmetro de perda de insero, o grupo submetido aos agentes estressores, assemelhou-se nos resultados, com maior destruio da crista ssea do que o grupo que recebeu apenas ligadura, sendo essa diferena estatisticamente significante (tabela 1). DISCUSSO Os resultados desse estudo evidenciam o efeito do estresse crnico em uma maior progresso da periodontite. Observa-se que, tanto para Jac-I como Jac-CO ocorreu uma maior progresso para apical do epitlio juncional e do tecido sseo, em comparao ao controle negativo e positivo. Comparados

esses achados a trabalhos que usaram estresse e induo de periodontite atravs de ligadura, os resultados foram controversos (GASPERSIC et al, 2002; SUSIN & ROSING, 2003; BENATI et al, 2003, TAKADA et al, 2004; SEMENOFF-SEGUNDO et al, 2006b). Uma das possveis respostas pode ser a variedade de modelos de estresse citados na literatura. Nesse estudo optouse pelo frio associado conteno, por ser bastante citado e estar prximo ao modelo de estresse usado por outros autores (GASPERSIC et al., 2002; BENATI et al., 2003; MIZUMO et al., 2004; BLATCHFORD et al., 2005). Desde os estudos clssicos do estresse, sabe-se que o mesmo pode direcionar seu efeito no organismo (SELYE, 1946). Em recente publicao FUJIOKA et al. (2006) modulam a resposta do eixo hipotlamo-pituitrio-adrenal (HPA) com objetivo de obter respostas positivas e negativas conforme as variveis do tempo de estresse e tipo de estresse aplicado (FUJIOKA et al., 2006). Em relao metodologia, usando o modelo de induo de periodontite, estresse e ratos, observa-se aspectos de modulao do estresse em relao a doena periodontal. SUSIN & RSING (2003) usando um modelo de estresse crnico moderado demonstraram uma tendncia de menor progresso de doena no grupo ligadura associado com estresse crnico, comparado ao grupo somente com ligadura. SEMENOFF-SEGUNDO et al. (2006b), utilizando o mesmo modelo de estresse crnico supracitado, entretanto com tempo de durao de 30 dias, perceberam uma modificao no padro de resposta do periodonto. Em metodologia prxima a utilizada nesse trabalho GASPESIC et al. (2002), utilizando ratas, no encontraram diferenas, aplicando 2,5 h por dia de conteno associado a ligadura, durante 30 dias, contudo encontrou diferena, quando aumentou para 12h de contenso. Um trabalho que usou o mesmo modelo de 12 h de contenso com os tempos experimentais de eutansia de 2, 4, 6, 8 e 10 dias perceberam que a partir de oito dias existiram modificaes no processo infecto-inflamatrio e maior progresso de periodontite, quando comparado com controle (TAKADA et al., 2004). Muitos aspectos tanto da doena periodontal quanto do estresse, ainda so
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desconhecidos, sendo preciso cautela e maior nmero de trabalhos na tentativa de modular o eixo HPA com segurana. Um dos motivos das diferenas dos resultados pode ser as diferentes formas de processamento histolgico e histometria para trabalhos dessa natureza; em geral, todos os trabalhos esto bem prximos; entretanto, em uma anlise atenta, os critrios de escolha das lminas centrais ou lmina central e a quantidade de lminas escolhidas para realizar a anlise podem sugerir diferenas nos resultados dos diferentes estudos. Nesse trabalho utilizaram-se os critrios usados por SEMENOFFSEGUNDO et al, (2006a), que estudaram duas formas de histometria de periodontite em ratos, usando-se critrios claros e padronizados, desde a forma de processamento histolgico at a escolha das lminas histolgicas centrais. Procurou-se usar princpios de pesquisa importantes na confiabilidade dos resultados desse trabalho (ALTMAN, 1991; KINGMAN & ALBANDAR; 2002), de modo que, a histometria e a distribuio dos animais para os grupos conduziram-se por um pesquisador que desconhecia por completo os objetivos. Outro fundamento da pesquisa, a fim de evitar um vis de aferio, foi a realizao da calibragem. Procedeu-se duas calibragens, uma prvia ao incio do estudo e outra durante a anlise das lminas. Foram avaliadas, em ambas, 10% do total de lminas do estudo, sendo o mtodo reproduzvel e a diferena do erro padro da mdia prximo a outros trabalhos (SUSIN & RSING, 2003; SEMENOFF-SEGUNDO et al, 2006a e b). Os mecanismos do estresse e doena periodontal so ainda, em muitos pontos, de difcil compreenso (ANISMAN et al., 1996; PAGE & KORNMAN, 1997). Sabe-se que o estresse conduz a mudanas no eixo hipotlamo-pituitrio-adrenal, capaz de interferir nas intercomunicaes dos sistemas, suprimindo o sistema de defesa, estabelecendo-se a doena (ANISMAN et al., 1996). Na doena periodontal existem estudos em animais e humanos que ligam o estresse e suas vias doena periodontal (MOSS et al., 1996; GENCO et al., 1999; BREIVIK & THRANE, 2000; ELTER et al., 2002). Acredita-se que o mecanismo de uma maior progresso de periodontite est ligado a estmulos no eixo HPA, capazes de gerar maior estmulo da glndula supra-

renal e por conseqncia maior quantidade de cortisol e adrenalina, que modificariam o padro de resposta imunolgica no periodonto, conduzindo a maior progresso de doena periodontal (BREIVIK & THRANE, 2000). notrio que esse tema complexo e de difcil explicao, sendo necessria cautela nas interpretaes e inferncias dos seus resultados. Concluindo, nesse modelo de estresse crnico foi observada maior progresso de periodontite induzida por ligadura em ratos. Agradecimentos: Agradecemos ao UNIVAG - Centro Universitrio de Vrzea Grande (MT) e a Fapemat - Fundao de Amparo Pesquisa do Estado do Mato Grosso, (APQ0036/2005). ABSTRACT The objective of this work was to investigate the effect of chronic stress on ligature-induced periodontitis progression in rats. For the study, 24 adult Wistar rats (Rattus novergicus) were distributed into stress, ligature and control groups. After anesthesia, all rats from the stress and ligature groups were submitted to suture thread ligature placement around the upper right second molar. In the stress group, one day after periodontitis induction, the rats were submitted to chronic stress assay using the contention model and contention associated with low temperature on alternate days, once a day, for two hours. No stress was applied to the ligature and control groups. After a 60 day stress period, all groups were euthanized by an excess dose of anesthetic. Histometric evaluation determined the distances between the amelocemental junction on the mesial face of the second molar up to the most coronary portion of the epithelial junction (Jac-I) and the alveolar bone crest (Jac-CO). Significant differences were observed (p<0.05) between the stress, ligature and control groups for the measurements Jac-I (1.32 mm, 0.58 mm and 0.0 mm respectively) and Jac-CO (2.64 mm, 1.74 mm and 0.95 mm respectively). In conclusion, the chronic stress model was capable of eliciting greater progression in ligatureinduced periodontitis in rats. UNITERMS: Stress, periodontitis, rats.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1- Altman DC. Designing research. In: Altman DC. Practical statistics for medical research. 2rd ed. London: Chapaman & Hall; 1991. p74103. 2- Allmon HB. Man is not a giant rat. J Public Health Dent 1971; 31:218224. 3- Anisman H, Baines MG, Berczi, I, Bernstein CN, Blennerhassett MG, Gorczynski RM, et al. Neuroimmune mechanisms in health and diseases: 2. Disease. CMAJ 1996; 155:1075-1082. 4- Anisman H. Baines MG, Berczi, I, Bernstein CN, Blennerhassett MG, Gorczynski RM, et al. Neuroimmune Mechanisms in Health and Diseases: 1. Health. CMAJ 1996a; 155: 867-740. 5- Baellum V, Ferjerskov O, Karring T. Oral hygiene, gingivitis and periodontal breakdown in adult tanzanians. J Periodontol Res 1986; 21:221-32. 6- Benatti BB, Nogueira-Filho GR, Diniz MC, Sallum EA, Sallum AW, Nociti FH Jr. Stress may enhance nicotine effects on periodontal tissues. An in vivo study in rats. J Periodontal Res 2003; 38: 351-353. 7- Blatchford KE, Diamond KR, Westbrook F, McNally GP.Increased Vulnerability to Stress Following Opiate Exposures: Behavioral and Autonomic Correlates. Behavioral Neuroscience 2005; 119: 1034104. 8- Breivik T, Gundersen Y, Osmundsen H, Fonnum F, Opstad PK. Neonatal dexamethasone and chronic tianeptine treatment inhibits ligatureinduced periodontitis in adults rats. J. Periodontal Res 2006; 41: 2332. 9- Breivik T, Thrane PS. Psychoneuroimmune interactions in periodontal disease. In: Alder R, Felten DL, Cohen N. Psychoneuroimmunlogy. 3rd ed. San Diego: Academic Press; 2000. p.627-644. 10- Castro GD, Oppermann RV, Haas AN, Winter R, Alchieri JC. Association between psychosocial factors and periodontitis: a case-control study. Journal Clin. Periodontol. 2006; 33:109-14. 11- Elter JR, White A, Gaynes BN, Bader JD. Relationship of clinical depression to periodontal treatment outcome. J. Periodontol 2002: 73; 441-449. 12- Fujioka A, Fujioka T, Ishida Y, Maekawa T, Nakamura S. Differential effects of prenatal stress on the morphological maturation of hippocampal neurons. Neuroscience 2006; 141:907-915. 13- Gaspersic R, Stiblar-Martincic D, Skaleric U. Influence of restraint stress on ligature-induced periodontitis in rats. Eur. J. Oral Sci 2002; 110: 125-129. 14- Genco RJ, Ho AW, Grossi SG, Dunford RG, Todesco LA. Relationship of stress, distress, and inadequate coping behaviors to periodontal disease. J. Periodontol 1999; 70: 711-723. 15- Kigman A, AlabandarJM. Methodological aspects of epidemiological studies of periodontal diseases. Periodontology 2000 2002; 29: 1130. 16- Klausen B. Microbiological and immunological aspects of experimental periodontal disease in rats: A review Article. J. Periodontol 1991; 62: 59-73. 17- Kuhr A, Papa-Wagner A, Schmoll H, Schwahn C, Kocher T. Observations on experimental marginal periodontitis in rats. J. Periodontal Res 2004; 39:101-106. 18- Mizuno S, Kato K, Asai S, Takahashi Y, Nagata T, Komuro S, et al. Gene expression analysis in the stomachs of water immersion restraint stress rats using high-density oligonucleotide array. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2004: 19: 1264-1269. 19- Moss ME, Beck JD, Kaplan BH, Offenbacher S, Gary W, Genco RJ, Mathei EE, Tedesco LA. Exploratory case-control abalysis of psychosocial factors and adult periodontitis. J. Periodontol 1996; 67: 1060-1069. 20- Moynihan JA. Mechanisms of stress-induced modulation of immunity. Brain, Behavior, and Immunity 2003; 17 Suppl1:S11-S16. 21Page CR, Korman KS. The Pathogenesis of Human Periodontitis: An Introduction. Periodontol. 2000 1997; 14: 9-11. 22- Page, C. R.; Schroeder, H. E. Periodontitis In Man and Other Animals. A Comparative Review. Basel: Karger, 1982. p. 71-107. 23- Peterson, K. P. et al. Stress and Pathogenesis of Infectious Disease. Rev. Infect. Dis.1991; 13: 710-720. 24- Selye, H. The General Adaptation Syndrome and Disease of Adaptation. J. Clin. Endocrinol 1946; 5:117-230. 25- Semenoff-Segundo A, Bosco AF, Semenoff TDV,Buzelle SL, Ribeiro RV, Jardim-Jnior EG. Dois mtodos histomtricos distintos comparativos de periodontite induzida em ratos. Rev. Periodontia 2006; 16: 22-26. 26- Semenoff-Segundo A, Hennemman, Fontanela VRC, Rsing CK. The Role of Psychoneuroimmune Interactions in the Pathogenesis of Ligature-Induced Periodontal Disease in Wistar rats. Journal of the International Academy of Periodontology 2006 (in press). 27- Solis AC, Lotufo RF, Pannuti CM, Brunheiro EC, Marques AH, LotufoNeto F. Association of periodontal disease to anxiety and depression symptoms, and psychosocial stress factors. Journal Clinical Periodontol 2004; 31: 633-38. 28- Susin C, Rsing CC, Effect of variable moderate chronic stress on ligature-induced periodontal disease in Wistar rats. Acta Odontol Scand 2003; 61:273-277. 9

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29- Susin, C.; Rsing, C. C. O Rato Como Modelo Para o Estudo das Repercusses do Estresse nas Doenas. Rev. Periodontia 2002; 13: 5-10. 30- Takada T, Yoshinari N, Sugiishi S, Kawase H, Yamane T, Noguchi T. Effect of restraint stress on the progression of experimental periodontitis in rats. J. Periodontol 2004; 75: 306-315.

Endereo para correspondncia: Alex Semenoff Segundo Rua Professora Azlia Mamor de Melo, 318 - Apto 63 - Edifcio Renoir - Bairro Aras CEP: 78005-700 - Cuiab - MT Tels: (18) 3608-1909 e (65) 9982-6089 E-mail semenoff@uol.com.br 10