Protemica O termo proteoma apareceu em meados dos anos 90 e designa o conjunto de protenas expressas por um determinado genoma.

A protemica e o estudo em larga escala das protenas. A anlise protemica permite saber se e quando um produto gentico est sendo expresso, a concentrao relativa desse produto e, por fim, as modificaes que podem ocorrer nessas protenas aps a sua traduo. A anlise protemica vai muito alm da simples listagem de protenas e pode fornecer indcios substanciais quanto organizao e dinmica dos processos metablicos, regulatrios e de sinalizao atravs dos quais a clula se desenvolve. Mais ainda, a anlise protemica pode mostrar como esses processos se tornam disfuncionais nos estados patolgicos e como podem ser manipulados, mediante, por exemplo, a administrao de medicamentos ou a terapia gnica. Portanto, uma das grandes inovaes prometidas pelo conhecimento dos proteomas, alm do mapeamento de intrincados caminhos metablicos celulares, a possibilidade de identificar novos alvos farmacolgicos, novas molculas bioativas e marcadores biolgicos que podem ser usados para diagnsticos clnicos. A eletroforese de duas dimenses em gel de poliacrilamida (2DE) em conjunto com a espectrometria de massa so as duas tecnologias mais usadas atualmente para anlise de proteoma. A primeira aplicada para separao, deteco e quantificao das protenas e a espectrometria de massa para identificao das protenas graas aos grandes avanos da bioinformtica. Eletroforese 2D-PAGE, as protenas so separadas com base em duas das suas propriedades: numa primeira dimenso, de acordo com o seu ponto isoeltrico (pI) e numa segunda dimenso, em gel de SDS PAGE de acordo com o seu peso molecular. Ou seja, a eletroforese 2D resulta da combinao de duas tcnicas: a focalizao isoeltrica (IEF), seguida por uma separao de SDS PAGE. Focalizao isoeltrica separa protenas de acordo com seus pI. Um gradiente de pH estabelecido quando uma mistura de cidos e bases orgnicos de baixa densidade molecular (anflitos) se distribui em um campo eltrico gerado atravs do gel. Uma mistura de protenas aplicado no poo do gel. Com aplicao do campo eltrico, as protenas entram no gel e migram at que cada uma alcance um pH equivalente a seu pI. Lembrando que, quando pH = pI, a carga lquida da protena zero (O pH no qual a protena tem carga lquida zero chamado de ponto isoeltrico (pI). Depois de coradas as protenas aparecem distribudas ao longo do gradiente de pH de acordo com seus valores de PI. OBS: Entretanto, o uso de anflitos com esta finalidade tem diversos problemas incluindo a incapacidade de correr grandes quantidades de protenas necessrias para a micro seqncia, pouca estabilidade do gradiente de pH durante a eletroforese e freqente falta de reprodutibilidade dos gis entre os laboratrios. O uso dos gradientes de pH imobilizados (IPG) para a separao por cargas na 2DE solucionou muitos dos problemas. Encontra-se no mercado fitas de gis IPG desidratadas (Amersham Biosciences) feitas de uma matriz de poliacrilamida, a qual modificada covalentemente com grupos cidos e bsicos que formam o gradiente de pH imobilizado em toda a

extenso do gel. H diversas faixas de pH, desde ampla (3-10), como faixas estreitas, como por exemplo de 4,5-5,5 ou 7,0-11,0. Esta flexibilidade na escolha das faixas de pH a serem utilizadas de grande utilidade para separar eficientemente o maior nmero de protenas possvel. Segunda dimenso: A eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS) e um mtodo muito utilizado para a anlise de massas moleculares de protenas. As protenas inicialmente separadas por focalizao isoeltrica so colocadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente eltrica, fazendo com que elas migrem atravs da malha de acrilamida em direo ao plo positivo. Dependendo do seu tamanho, cada protena se mover diferentemente: as protenas menores migraro mais rapidamente, enquanto que as maiores tero mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se movero mais lentamente. Mais de 8.000 protenas podem ser separadas em um nico gel bidimensional. Como os parmetros usados na primeira dimenso (ponto isoeltrico) e na segunda dimenso (massa molecular) so independentes, uma grande resoluo atingida, o que permite a visualizao de centenas de protenas diferentes ao mesmo tempo. A eletroforese em 2 dimenses separa protenas de massa molecular idntica que diferem em pI, ou protenas com valores de pI semelhantes, mas massas moleculares diferentes. A separao de protenas por tcnicas bidimensionais apresenta alto poder de resoluo e boa reprodutibilidade quando so usados para separar solues complexas de protena, assim como extratos de plantas ou soro humano. Quando bem sucedida obtem-se um gel de poliacrilamida contendo numerosos spots, bem separados, cada um correspondendo a uma proteina (ou a uma forma proteica). Estes gis bidimensionais sero utilizados para criar bases de dados de todas as protenas expressas. Hoje a principal tcnica de separao de protenas utilizada antes da aplicao da amostra no espectrmetro de massas. Aps a 2DE as protenas so visualizadas diretamente no gel, atravs de mtodos de colorao com azul de Comassie ou por colorao com prata, resultando num perfil bidimensional de pontos. A imagem deste perfil posteriormente documentada atravs de programas de computador apropriados como o Melanie desenvolvido pela Genebio (Genebra, Suia), Image Master (Amersham BioSciences) e outros. Estes programas apresentam vrias funes, entre elas a de permitir uma anlise da abundncia da protena em cada spot atravs do volume, intensidade e rea. Diversos gis representando diferentes proteomas podem ser comparados com o objetivo de detectar protenas diferencialmente expressas. A identificao das protenas nos perfis de 2DE feita por espectrometria de massa. A espectrometria de massa uma tcnica analtica que mede a relao entre a massa e a carga (m/z) de molculas ionizadas, com altssima preciso. Apenas no incio da dcada de 80, a espectrometria de massa comeou a ser mais aplicada em determinaes de massas moleculares de protenas. Com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais especializados para protenas, a espectrometria de massa tornou-se ferramenta revolucionria na qumica de protenas moderna. De uma maneira

geral, um espectrmetro de massas e constitudo por uma fonte de ionizao, um analisador de massas um detector e um sistema de aquisio de dados. Na fonte de ionizao de molculas so ionizadas e transferidas para a fase gasosa. No analisador de massas os ons formados so separados de acordo com suas relaes m/z e posteriormente detectados (usualmente por eltron multiplicador).

A espectrometria de massa vem permitindo a identificao de protenas por uma metodologia denominada peptide mass fingerprinting. Esta metodologia baseada na digesto da protena a ser identificada por uma enzima proteoltica (por exemplo, a tripsina) produzindo fragmentos denominados peptdeos. As massas desses peptdeos so ento determinadas com grande qualidade (0,1-0,5 Da) por espectrometria de massa. As massas obtidas formam uma espcie de impresso digital (peptide mass fingerprinting) da protena. Softwares especiais permitem comparar o peptide mass fingerprinting da protena que queremos identificar com os gerados teoricamente para todas as sequncias de protenas presentes nos bancos de dados. Se a sequncia da protena problema estiver no banco de dados ela ser imediatamente identificada. A anlise protemica uma ferramenta poderosa para estudos sobre a fisiologia e a gentica de vrios organismos vivos, inclusive as plantas. Primeiro, a caracterizao protemica a chance de desvendar os intrincados caminhos metablicos nas diversas etapas celulares, gerando um conhecimento sem precedentes na biologia celular. Tal conhecimento tornar possvel identificar novos alvos farmacolgicos especficos, relacionados, por exemplo, a determinada etapa de desenvolvimento de uma clula cancerosa. Segundo, ela viabiliza a identificao de novas molculas bioativas em extratos biolgicos naturais, levando ao desenvolvimento de novos medicamentos. Terceiro, permite a identificao e caracterizao de marcadores biolgicos, ou seja, molculas endgenas ou exgenas especficas de um determinado estado patolgico. A capacidade de identificar essas molculas extremamente til no diagnstico precoce de doenas e no acompanhamento da evoluo do tratamento. Apesar da novidade do tema, vrios grupos de pesquisa, no mundo inteiro, usam as abordagens protemicas em seus estudos. Na medicina, por exemplo, muitas aplicaes j foram descritas. Inmeros estudos protemicos foram aplicados na caracterizao do cncer, principalmente, mas tambm de doenas neurolgicas (como o mal de Alzheimer), infecciosas e cardacas, ou na caracterizao de agentes infecciosos, como Bacillus anthracis (antraz) e Mycobacterium tuberculosis (tuberculose). Alm disso, estudos protemicos tm sido utilizados na busca de novas molculas bioativas em venenos de animais peonhentos e extratos naturais e no desenvolvimento de novas drogas teraputicas.

Western Blotting Outra tcnica de separao de protenas o WB, assim chamada em contraposio s tcnicas de anlise de DNA (Southern blot) e RNA (Northern blot). Esta tcnica e caracterizada pela transferncia de um extrato protico para uma membrana, comumente de nitrocelulose. Esta tcnica consiste em algumas etapas: a primeira uma eletroforese unidimensional (SDS-PAGE), possibilitando a separao das protenas da amostra de acordo com a sua massa molecular. Ao final da eletroforese, as protenas so transferidas para uma membrana. Apos a transferncia, a membrana e incubada com uma soluo bloqueadora. Apos o bloqueio, a membrana e tratada com anticorpo reativo para a protena que se deseja analisar (anticorpo primrio). Posteriormente, a membrana e incubada com o anticorpo secundrio. O anticorpo secundrio, comumente, esta complexado a uma enzima reveladora, a qual, na medida em que for incubada com seu substrato especifico, emitira um sinal, por exemplo, fotossensvel. A quantificao deste sinal e a medida indireta de quanto de proteina-alvo (antgeno) esta presente na amostra. A eletroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS) e um mtodo muito utilizado para a analise de massas moleculares de proteinas. O gel e uma matriz constituida de um polimero de acrilamida cuja porosidade da malha pode ser escolhida. Quanto maior a concentrao de acrilamida menores sero os poros da malha formada. Antes de iniciar a eletroforese, as variveis como so a forma e carga nativa das proteinas devem ser eliminadas para que a separacao dependa apenas de sua massa molecular. Para isso, as proteinas sao homogenizadas com Dodecil sulfatode sodio (SDS), um detergente anfipatico cuja funcao e desnaturalizacao, ou seja, converte-las numa estrutura linear a forma nativa e geralmente globular e conferir-lhes densidade de carga uniforme. O SDS tem alta carga negativa e uma carga hidrofobica que interage com as cadeias polipeptdicas, tornado-as negativamente carregadas. Na ausencia do SDS, as proteinas com massas iguais podem migrar diferentemente na malha do gel devido ao diferencial de cargas de suas estruturas tridimensionais. Alem da adicao do SDS, as proteinas podem ser opcionalmente fervidas na presenca de um agente redutor, como ditiotreitol (DTT) ou 2-mercaptoetanol, que desfazem as pontes de dissulfetos, ajudando a eliminar a estrutura tridimensional dos polipeptideos. Apos esse tratamento as proteinas sao aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida e submetidas a uma corrente eletrica, fazendo com que elas migrem atraves da malha de acrilamida em direcao ao polo positivo. Dependendo do seu tamanho, cada proteina se movera diferentemente: as proteinas menores migraro mais rapidamente, enquanto que as maiores terao mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se moverao mais lentamente. Aps a corrida, as protenas separadas por seu peso molecular devem ser transferidas e imobilizadas em uma membrana (Vrios tipos de membrana esto disponveis para a realizao do processo) de PVDF (polivinil fluorado) ou nitrocelulose. A membrana de transferncia colocada face-a-face com o gel de separao, e aplica-se uma corrente eltrica. Durante a transferncia, o gel esta na face do eletrodo negativo e a membrana em sua face positiva.

Ento, as protenas contendo carga eltrica se movem do gel para a membrana mantendo a mesma disposio do gel. Como resultado desse processo de transferncia e ligao membrana, as protenas so expostas a uma fina camada para deteco. A ligao das protenas membrana baseada tanto em interaes hidrofbicas quanto em interaes de cargas entre a membrana e as protenas. OBS: Embora a transferncia de protenas do SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose ou de PVDF possa ser executada de diferentes maneiras tais como: difuso simples; transferncia a vcuo; electroblotting, esta ltima a que correntemente tem sido utilizada na atualidade. As principais vantagens do Electroblotting so a velocidade e a transferncia completa quando comparada difuso simples e transferncia a vcuo. O eletroblotting pode ser realizado por imerso completa de um sanduche gelmembrana em uma soluo tampo (transferncia mida). Alguns fatores podem determinar a eficiencia da transferencia como a composicao do gel, do tampao, volume molecular das proteinas, temperatura e tempo de transferencia. Apos a transferencia, a membrana e incubada com uma solucao bloqueadora, que tem a funcao de cobrir as regioes da membrana que nao possuem as proteinas submetidas a eletroforese. O bloqueio inibe a ligacao inespecifica entre os anticorpos a serem aplicados e a membrana. Esta solucao e composta por albumina bovina ou leite, permitindo a associacao entre as regioes livres da membrana e as proteinas da solucao bloqueadora. O bloqueio baseia-se no princpio de que as protenas do leite ou do BSA liguemse em todos os stios onde as protenas transferidas no estejam ligadas, fazendo com que os nicos lugares possveis onde os anticorpos possam se ligar sejam os stios especficos das protenas alvo. Aps este passo, iniciada a incubao com os anticorpos primrios, os quais se ligam diretamente em stios especficos das protenas de estudo. Estes anticorpos podem ser: Policlonais: anticorpos criados contra um antgeno que foi injetado em um animal in vivo. Estes anticorpos so uma mistura heterognea de imunoglobulinas com diferentes afinidades para os diversos eptopos de uma protena. Monoclonais: produzidos in vitro, so o produto da fuso de uma clula imortalizada de mieloma e plasmcitos secretores de imunoglobulinas. Neste caso, toda a cultura celular produz somente um anticorpo de uma nica classe, geralmente uma IgG, direcionada a um eptopo especfico. Apos o bloqueio, a membrana e tratada com anticorpo reativo para a proteina que se deseja analisar (anticorpo primario) dissolvido em uma solucao de PBS (solucao salina tamponada com fosfato). Na etapa seguinte, a membrana e submetida a lavagens consecutivas para remocao dos anticorpos que nao se ligaram aos seus antigenos (proteinas) correspondentes. Posteriormente, a membrana e incubada com o anticorpo secundario, o qual e especifico para a especie animal na qual foi desenvolvido o anticorpo primario. O anticorpo secundario, comumente, esta complexado a uma enzima reveladora, a qual, na medida em que for incubada com seu substrato especifico, emitira um sinal, por exemplo, fotossensivel. A quantificao deste sinal e a medida indireta de quanto de proteina-alvo (antigeno) esta presente na amostra.

Existem quatro tipos principais de deteccao do sinal no western blotting apos a adio do anticorpo primario: a) Colorimetrica Neste metodo a deteccao depende da incubacao da membrana com um substrato que reaja com a enzima reveladora, como a peroxidase, que esta conjugada ao anticorpo secundario. Esta reacao converte o corante soluvel em insoluvel, colorindo a membrana e gerando as bandas. Apos a lavagem para a remocao do co rante, o nivel de abundancia proteica e analisado por densitometria, que consiste na medida da intensidade da banda; b) Quimioluminescente Os metodos de deteccao quimioluminescentes sao caracterizados pela incubacao da membrana com substrato que emita luz apos a reacao com a enzima reveladora. A luz emitida e capturada por um filme fotografico ou por cmeras digitais e a analise e feita por densitometria. A quimioluminescencia e um dos metodos mais sensiveis de deteccao no western blot; Fluorescente Assim como a deteccao radioativa, esta tecnica nao necessita de substratos enzimticos, pois o anticorpo secundario esta acoplado a uma sonda fluorescente. Quando excitada no comprimento de onda apropriado, esta sonda emite a fluorescncia que e captada por um fotosensor, como uma cmera CCD, permitindo a analise das bandas por densitometria. A deteco fluorescente tambem e considerada um dos mtodos mais sensveis de deteco no western blot.

Cromatografia A cromatografia e um metodo fisico-quimico de separacao. Este metodo visa a migracao diferencial dos componentes de uma mistura, atravs de uma fase movel e uma estacionaria. Diferentes forcas intermoleculares irao influenciar na interacao entre os componentes da mistura e das duas fases.