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Para realizar PCR so necessrias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampo salino contendo a polimerase, oligonucletidos iniciadores, os quatro desoxinucletidos constituintes do DNA e o cofactor Mg2+. Esta mistura submetida a vrios ciclos de amplificao que consistem em: Desnaturao do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96C), de modo a separar as duas cadeias Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associao, a mistura de reaco arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar) Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72C) O processo envolvendo estes trs passos, pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura 2). Em teoria, se for possvel levar a cabo 25 ciclos de amplificao seguidos, a concentrao de DNA aumentaria 225 vezes embora, na prtica, devido a alguma ineficincia no processo de amplificao, esse aumento fique por um milho de vezes.
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03/10/12
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