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Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Unidade de Novo Hamburgo Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Microbiologia Geral
Professora Dra. Jane Marlei Boeira

Angenor Geovani Auler Paola Tosi

Setembro de 2013

Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Unidade de Novo Hamburgo Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Microbiologia Geral Aula prtica 4: Meios de cultivo seletivo e diferencial (10-09-13) Experimento Cultura e identificao microbiana

Setembro de 2013

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INDICE

Introduo.....................................................................................................4

Objetivos.......................................................................................................11

Metodologia..................................................................................................12

Resultados e discusso ...............................................................................14

Concluso ....................................................................................................16

Referncias ..................................................................................................17

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1. INTRODUO

Na natureza os microrganismos encontram-se formando populaes mistas. Por outro lado, o desenvolvimento da microbiologia assim como todos os procedimentos laboratoriais para o diagnstico depende da obteno e do crescimento dos microrganismos na forma de populaes puras, que quando crescidas em meios de cultura denominam-se culturas puras ou axnicas. A obteno de uma cultura pura a partir de uma cultura mista denomina-se isolamento, conseguido atravs da semeadura dos microrganismos na superfcie de meios de cultura slidos em placas de Petri, o que permitir a formao de colnias. (MENDONA & NASCIMENTO) Como todos os seres vivos, os microrganismos necessitam de nutrientes apropriados ao seu desenvolvimento, assim como condies fsicas ou ambientais favorveis. Quando cultivados em laboratrio, estas necessidades devem ser respeitadas. O meio de cultura, portanto, deve conter nutrientes em concentraes adequados ao crescimento do microrganismo que desejamos cultivar, alm das condies ambientais requeridas. (MENDONA & NASCIMENTO) Os meios de cultivo podem ser classificados em meios sintticos (quimicamente definidos) e meios complexos. Os meios sintticos so aqueles em que a composio qumica exata conhecida. Alguns microrganismos necessitam de um meio definido com muitos fatores necessrio para o crescimento e so denominados fastidiosos ou muito exigentes em termos nutricionais. Meios quimicamente definidos so utilizados normalmente em trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres autotrficos (TORTORA et al., 2005). J os meios complexos so aqueles que apresentam algum componente que tem uma composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras, de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. Quando o meio complexo est na forma lquida chamado de caldo nutriente e quando est na forma solidificada chamado de Agar nutriente. Esses meios so utilizados

normalmente para bactrias heterotrficas e fungos. Meios complexos tambm so

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usados quando as necessidades nutricionais de um microrganismo em particular no so conhecidas e, portanto, um meio definido no pode ser construdo (TORTORA ET al., 2005). Quando h substncias que favorecem o crescimento de determinado organismo e/ou inibem o de outros no meio, eles passam a ser chamados de meios seletivos. Nesses meios h componentes como saem de bile e cristal violeta (inibem o desenvolvimento de bactrias gram-positivas), substratos degradados somente por alguns tipos de microrganismos, ou antibiticos (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Os meios de cultivo tambm podem ser diferenciais quando possvel distinguir de alguma forma os diferentes tipos de microrganismos. : O Agar MacConkey um meio seletivo (pela presena de sais biliares, cristal

violeta e NaCl) para o isolamento de bacilos Gram negativos, principalmente as enterobactrias (Salmonellas, Shigellas e bactrias coliformes). Diferencia as bactrias fermentadoras de lactose (colnias vermelho tijolo a rosa, opacas se o crescimento for denso, podem estar rodeadas por zonas de precipitado de bile. Cultivando neste meio possvel encontrar: E.coli, Klebsiella spp, Grupo Enterobacter spp) das no fermentadoras de lactose (colnias transparentes a incolores, observadas melhor a luz transmitida; possibilidades: Salmonella spp, Shigella spp, Proteus spp e Edwardsiella) pela presena de lactose e vermelho neutro na composio do produto. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073) Atualmente, encontram-se disponveis muitos meios de cultura para o isolamento, cultura e identificao de Enterobacteriaceae e determinados

organismos no fermentadores. Um dos primeiros meios deste tipo a ser desenvolvido foi de autoria de MacConkey, tendo sido publicado em 1900 e 1905. Esta formulao foi concebida sabendo-se que os sais biliares so precipitados por cidos e que determinados microrganismos entricos fermentam a lactose ao passo que outros no tm esta capacidade. Mais tarde, este meio foi modificado vrias vezes. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073) O gar de MacConkey apenas ligeiramente seletivo uma vez que a concentrao de sais biliares, que inibe os microrganismos gram-positivos, reduzida relativamente a outros meios entricos em placas. Este meio

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recomendado para utilizao com amostras clnicas com probabilidade de conter flora microbiana mista como, por exemplo, a urina, vias respiratrias, feridas e outras fontes, porque permite um agrupamento preliminar de bactrias entricas e outras bactrias gram-negativas fermentadoras e no fermentadoras da lactose. O gar de MacConkey tambm utilizado no exame microbiolgico dos alimentos.

(http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073) No MacConkey Agar, as peptonas fornecem os nutrientes. O cristal violeta inibe as bactrias gram-positivas, especialmente os enterococos e os estafilococos. A diferenciao de microrganismos entricos faz-se atravs da combinao de lactose e do indicador de pH vermelho neutro. Produzem-se colnias incolores ou de cor rosa a vermelho consoante a capacidade do isolado para fermentar o hidrato de carbono. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073) A morfologia tpica das colnias no BD MacConkey II Agar a seguinte:

http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073 As bactrias gram-positivas so parcialmente a completamente inibidas. O MacConkey II Agar um dos meios padro utilizados para a colocao primria de amostras clnicas em placas e para uma variedade de materiais no clnicos. Neste meio, desenvolver-se-o todos os organismos da famlia das Enterobacteriaceae e uma variedade de outros bastonetes gram-negativos como, por exemplo, as Pseudomonas e gneros relacionados. Os organismos no fermentadores ou outros bastonetes gram-negativos sensveis aos ingredientes seletivos no se desenvolvem neste meio.

(http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073). Foi referido que algumas Enterobacteriaceae e Pseudomonas aeruginosa so inibidas pelo MacConkey Agar quando incubadas numa atmosfera enriquecida com CO2. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073).

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Embora possam ser realizados alguns testes de diagnstico diretamente neste meio, necessria a realizao de testes bioqumicos para uma completa identificao e, se indicado, a realizao de testes imunolgicos usando culturas puras. O meio de cultura gar EMB (do ingls Eosin Methylene Blue) um meio para diferenciao ligeiramente seletivo utilizado para o isolamento e diferenciao de bacilos entricos gram-negativos (Enterobacteriaceae e outros bastonetes gramnegativos) provenientes de amostras clnicas. O Agar EMB baseia-se numa formulao descrita inicialmente por Holt-Harris e Teague em 1916. A formulao original de Holt-Harris e Teague foi modificada por Levine. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9068) A principal diferena entre as duas consiste na incluso de sacarose no meio de Holt-Harris e Teague. A sacarose fermentada por determinados organismos entricos de forma mais rpida do que a lactose. O EMB Agar contm corantes de eosina Y e azul-de-metileno que inibe as bactrias gram-positivas num determinado grau. Os corantes funcionam tambm como indicadores de diferenciao em resposta fermentao da lactose e/ou sacarose por microorganismos. Os coliformes produzem colnias pretas-azuladas, enquanto as colnias de Salmonella e Shigella so incolores ou tm uma cor mbar transparente. As colnias de Escherichia coli podero apresentar um reflexo verde metalizado caracterstico, devido rpida fermentao da lactose.

(http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9068) O Agar EMB (com ou sem sacarose) includo no conjunto de meios de isolamento de seletividade reduzida para a Salmonella de amostras fecais e de outro tipo. (http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9068) As bactrias gram-positivas como, por exemplo, estafilococos, leveduras e estreptococos fecais, podero desenvolver-se neste meio e formar colnias puntiformes ou podero ficar inibidas. A morfologia tpica das colnias a seguinte:

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http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9068 Conforme j dito, o estudo dos microrganismos depende da obteno de uma grande quantidade de microrganismos idnticos (cultura pura), que so obtidos em laboratrio atravs do isolamento a partir de uma populao mista. Para isto

devemos preparar meios de cultura estreis e conserv-los em condies estreis. Ao introduzirmos no meio estril o inoculo, teremos o cuidado tcnico necessrio para que no haja contaminao externa. (RIBEIRO & SOARES, 2005) Depois de inoculado, o meio de cultura contendo os microrganismos incubado em local apropriado e se for o caso, em local cuja temperatura seja controlada. Aps semear a amostra na placa necessrio acompanhar o seu crescimento por 2-3 dias. No caso de haver crescimento de muitos microrganismos ser necessrio realizar isolamento por esgotamento para obter-se culturas puras. O crescimento significar o desenvolvimento de uma populao a partir de uma ou algumas clulas. Este poder ser evidenciado a olho nu pela formao de colnias quando em meio slido. O isolamento feito de acordo com a proporo de microrganismos na amostra. Pode ser diretamente da amostra ou aps o enriquecimento. Os mtodos mais utilizados para o isolamento so por estrias (meio slido) ou por diluio (meio lquido). (MENDONA & NASCIMENTO) A tcnica de esgotamento consiste em depor sobre um ponto da superfcie do meio uma pequena alquota do material e depois espalh-lo em forma de estrias. Para fazer o esgotamento divide-se a placa em setores, conforme mostra a figura a seguir.

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Figura 1: Tcnica de esgotamento Com o auxlio de uma ala de platina, deve-se espalhar o material em estrias, lembrando-se de no voltar a ala sobre a estria que j foi feita, de maneira a obter quantidades cada vez menores do material. (RIBEIRO & SOARES, 2005) O crescimento dos microrganismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informaes para a sua identificao. importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao perfil bacteriano esperado para cada material.

(http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42) Isolamento consiste na obteno de culturas puras que envolvem somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de uma colnia atravsdaobservaodaproduodedeterminadoprodutooudamorfologiada (MENDONA & NASCIMENTO) Normalmente, as colnias de microrganismos se originam somente de uma clula ou esporo de microrganismo. Essas colnias apresentam caractersticas morfolgicas diferentes, as quais permitem a distino entre os microrganismos. No entanto, para conseguir uma visualizao das colnias independentes no meio slido, necessria a distribuio uniforme das bactrias sobre a placa de Petri. (TORTORA et al., 2005). colnia.

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2. OBJETIVOS

Diferenciar atravs dos meios de cultura gar Mac Conkey e gar BEM (Ecosin-methylene Blue Agar) os micro-organismos cultivados, provenientes da amostra ambiental (gua de vertente) coletados na aula 2..

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3. METODOLOGIA

Para a realizao do experimento necessita-se dos seguintes equipamentos e materiais: Placas de Petri contendo os meios de cultura (previamente esterilizados); Cmara de fluxo laminar; Ala de platina Na 2a aula prtica, referente ao dia 27-08 foram coletados os microorganismos de uma garrafa pet contendo gua de vertente e da maaneta da porta de um armrio, com auxlio de um cotonete esterilizado. Os micro-organismos foram semeados na placa de Petri com o meio de cultura preparado na aula anterior, na cmara de fluxo laminar, e incubado em estufa a 37C, devendo ficar ali por 2-3 dias, quando devero ser guardados em geladeira. Com o auxlio de uma ala de platina estril, depor sobre um ponto da superfcie do meio uma pequena alquota do material e depois espalh-lo em forma de estrias. Para fazer o esgotamento divide-se a placa em setores, conforme mostra a figura 1. O material a ser semeado dever conter poucos microrganismos porque o inculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colnia formada na superfcie de um meio slido originada de um ou alguns microrganismos. Quando maior o nmero, menor possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inculo for obtido a partir de meio slido (inculo pesado), este poder ser diludo em salina estril ou ser utilizada a tcnica de esgotamento adequada. O inculo obtido a partir de uma cultura em caldo ou de uma diluio da cultura em meio slido feito da seguinte maneira: 1. Retiramos o inculo do tubo com a ala j flambada e fria. 2. Abrimos a placa, de modo que a tampa forme um chapu com a placa.

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3. Colocamos o inculo junto parte superior da placa, espalhando-o a seguir atravs de estriamento (que poder ser contnuo ou descontnuo). O estriamento poder se feito de maneiras variadas, tomando-se sempre o cuidado de nunca passar a ala duas vezes no mesmo local. O estriamento permite o esgotamento dos microrganismos que se encontram na ala. Quando passamos a mesma dois vezes no mesmo local, promovemos o recarregamento do local, deixando ali mais bactrias, o que dificultar o seu perfeito isolamento. Durante o estriamento, aps termos semeado metade da placa, deveremos cessar o mesmo. A seguir flambamos a ala, esperamos esfriar e continuamos o estriamento novamente, carregando a ala na ltima estria que realizamos. Aps terminado o estriamento, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubao na estufa, com a tampa voltada para baixo. 4. Flambar a ala utilizada, esperar esfriar e guardar no suporte apropriado. OBS: Para a realizao da semeadura utilizando-se inculos pesados no diludos, a tcnica a mesma que a descrita anteriormente, s que ao invs de interrompermos o processo uma vez para flambarmos a ala, o faremos duas vezes.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

O MacConkey Agar um meio diferencial seletivo utilizado para o isolamento e diferenciao de Enterobacteriaceae e uma variedade de outros bastonetes gramnegativos provenientes de amostras clnicas. Como no houve crescimento nas placas contendo os meios de cultura gar EMB e gar Mac Conkey, pode se chegar a 3 hipteses: 1- A semeadura dos micro-organismos no foi bem conduzida. A ala de platina estava muito quente quando entrou em contato com a colnia a ser repicada, matando os micro-organismos. 2- O organismo repicado no corresponde a E. coli, e aos gneros Enterobacter, Klebsiella, Proteus; Salmonella, Shigella e Pseudomonas 3- O organismo repicado Gram-negativo, o que pode ser comprovado pela colorao de Gram efetuada na aula prtica anterior.

Figura 4: Foto resultante da microscopia da amostra bacteriana selecionada

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5. CONCLUSO

Felizmente, pela amostra provir de uma fonte de gua utilizada para consumo humano, no houve crescimento de micro-organismos malficos sade.

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6. REFERNCIAS

Amendoeira, M. R. R. Caputo, L. F. G. Molinaro, E. M. Conceitos e Mtodos para Formao de profissionais em Laboratrios de Sade, disponvel em <http://www.fiocruz.br/ioc/media/ConceitosMetodos_volume4.pdf> acesso em 07 Set. 2013. 237-241p.

MENDONA, S. C.; NASCIMENTO, C. Microbiologia Industrial CEFET- PE. Cultivo de microrganismos e laboratrio, s/d, p. 1-6.Disponvel em: <recife.ifpe.edu.br/recife/Isolamento_Microrganismos.doc > Acesso em: 31 Ago. 2013.

Nicsio,

R.

G.

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de

Cultura.

Disponvel

em acesso

<http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html> em 31 Ago. 2013

RIBEIRO, Mariela C.; SOARES, Maria M. S. R. Microbiologia prtica: Roteiro e Manual: Bactrias e Fungos. 1 ed. So Paulo: Atheneu, 2005. 3,5,6,7,8 p.

Prescott, L.M. Harley, J.P. Klein, D.A. Microbiology 5a edicao: The McGrawHill Companies, Madrid, 2002. 109-116p. Tortora,G.J., Funke, B.R., Case, C.L. Microbiologia 8a edio: Editora ArtmedPorto Alegre, 2005. 54-68 p. Departamento de Microbiologia ICB/UFMG. Procedimentos bsicos em microbiologia: tcnicas asspticas e cultivo de microrganismos. Disponvel em: <http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42>.

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<http://www.biomedicinapadrao.com/2011/11/guia-meios-de-cultura-parabacterias.html>. Acesso em 14 Set. 2013.


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<http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9073> Acesso em 14 Set. 2013.

<http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9068>. Acesso em 14 Set. 2013 Figura 1 disponvel em

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