Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
INSTITUTO DE QUMICA
BIOQUMICA QBQ230N
Biologia Noturno
Professores :
Alexander Henning Ulrich, Bloco 8 sup., sala 853.
Mario Jose Politi, Bloco 12 sup., sala 1258.
Monitores:
Ariane Ferreira Nunes Alves email:anunesalves@usp.br
Arquimedes Cheffer email: arquiqbq@iq.usp.br
Erika de S. Molina email: molina.kk@gmail.com
Talita Glaser email:talita.glaser@usp.br
2013
NDICE
BIOQUMICA QBQ230N.
INTRODUO E NORMAS GERAIS..........................................................................................................................3
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO...............................................................................................3
AVALIAO..................................................................................................................................................................4
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA..............................................................................................................................4
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2013...............................................................................................5
MDULO 1: GUA; REAO CIDO-BASE, PH E SISTEMA TAMPO..............................................................6
MDULO 2: AMINOCIDOS: ESTRUTURA, PROPRIEDADES QUIMICAS.........................................................7
MICROPIPETADORES.................................................................................................................................................10
MDULO 3: PROTEINAS: ESTRUTURA PRIMARIA..............................................................................................12
Laboratrio 1 FRACIONAMENTO DE PROTENAS:................................................................................................13
MDULO 4: INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUIMICA.................................................... 21
Laboratrio 2 COLORIMETRIA E ESPECTROMETRIA:..........................................................................................26
MDULO 5: PROTEINAS: ESTRUTURA 3D E CONFORMAO.........................................................................30
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA.....................................................................................................................33
Laboratrio 3: CINTICA DA INVERTASE ...............................................................................................................37
Laboratrio 4: REAO DE TRANSAMINAO.....................................................................................................41
MDULO 7: ACARES; ESTRUTURA E FUNO..............................................................................................47
MDULO 8: GLICLISE.............................................................................................................................................51
MDULO 9: ACETIL-COA e CICLO DE KREBS......................................................................................................54
MDULO 10: CADEIA RESPIRATRIA E FOSFORILAO OXIDATIVA.........................................................55
MDULO 11: GLICONEOGNESE............................................................................................................................57
MDULO 12. CIDOS GRAXOS: ESTRUTURA, FUNO E METABOLISMO..................................................58
MDULO 13: LPIDEOS, MEMBRANA & TRANSPORTE......................................................................................60
MDULO 14: CICLO DAS PENTOSES......................................................................................................................63
MDULO 15. FOTOSSNTESE...................................................................................................................................64
MDULO 16: METABOLISMO DO GLICOGNIO E CONTROLE HORMONAL DO METABOLISMO .........66
MDULO 17: METABOLISMO DE AMINOCIDOS...............................................................................................71
MDULO 18: CICLO DO NITROGNIO...................................................................................................................72
AVALIAO
b)
O clculo da mdia final consistir na soma das seguintes parcelas: [(mdia das
PROVAS LAB) X 2 ] + [(mdia dos GDs) X 0,5] + [ Av1 X 2] + [Av2 X 2,5] + [Av3 X 3,0]
dividida por 10.
Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das avaliaes individuais.
Reposies das PROVAS LAB E PG no sero possveis. A presena em todas as
atividades obrigatria e ser registrada em lista diria de presena. importante
destacar que faltas a laboratrio incorrero em reduo de nota na PROVA LAB
correspondente. Alunos que alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia
70% estaro aprovados. Aqueles cuja mdia for no mnimo igual a 3,0 e
apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de recuperao.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
H3N
Ca
COO-
H
2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos
seus grupos radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com
gua em pH biolgico ( 7,0).
3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um
aminocido cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como
uma base. O grupo carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo
amino tem um pK entre 9,0 e 10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das
molculas de todos os aminocidos est na forma de ons dipolares (zwitterions).
Chama-se pI de um aminocido o pH da soluo na qual suas molculas
possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os aminocidos apresentam
grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base.
4. Titulao de aminocidos: A curva de titulao mostra como varia o pH em funo
de equivalentes do titulante (cido ou base forte) adicionados. Para um aminocido,
deve-se observar no mnimo dois patamares nessa curva correspondendo titulao
dos grupos carboxilato e a-amino, respectivamente. No meio de cada um desses
patamares h um ponto de inflexo, cujo valor de pH numericamente igual ao pKa
MICROPIPETADORES
10
Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/
11
Esta reao, como est escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos
aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs
de um complexo aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos
ribonuclicos, vrias protenas e enzimas num processo chamado traduo. A
equao mostra apenas o resultado liquido do processo.
3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do
polmero formado. A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao
de ligao, tem caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla
ligao, devido s interaes entre duas formas de ressonncia.
12
O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por
unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel:
o carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser
formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas.
4.
Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas,
graas a possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e
C-C), que so ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so
chamadas phi (f) e psi (y) respectivamente.
5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias
laterais (grupos R) ligados aos carbonos alfa.
I. FUNDAMENTOS
Mtodos de Purificao de Protenas
possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que
levam em conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas
13
Solubilidade
mg/mL
pH
14
15
II. OBJETIVOS
1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os
conceitos de precipitao no pI.
2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as
protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao.
16
1,0 mL
2,7
Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 mL) (padro de peso molecular: 66,0 KDa)
Amostra
padro
amostra 1
amostra 2
amostra 3
amostra 4
amostra 5
amostra 6
amostra 7
V. APNDICE
Preparao do gel de acrilamida / SDS
Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar
o espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar
resfriamento.
PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre
luvas descartveis para manipular solues contendo acrilamida. Evite inalar TEMED
(mesmo diludo, pode ser txico) e butanol.
Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida):
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as
placas de vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de
17
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de
resoluo (deve preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente
plstico para formar os poos onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a
demonstrao). Sero necessrios aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a
polimerizao do gel (15 minutos)
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e
rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
Solues utilizadas
Soluo A: Acrilamida e bis-acrilamida
45 g acrilamida
1,2 g bis-acrilamida
gua destilada (at 100 mL)
Soluo B: Tris-HCl pH 8,8
18,17 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 8,8 (com HCl)
Adicionar SDS (4,0 mL, soluo a 10%)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)
Soluo C: Tris-HCl pH 6,8
6,06 g Tris (em 50 mL de gua destilada)
Ajustar o pH para 6,8 (com HCl)
Completar o volume com gua destilada (at 100 mL)
Tampo de corrida:
3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%)
Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL
18
Tampo de amostra:
SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M
(0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua
destilada (at 20,0 mL).
19
20
B/A = K
DG = - 2,3 RT logK
21
que do que o dos reagentes no Estado Inicial, isto , DG* positivo. Quanto maior o
valor de DG*, menor ser a velocidade de reao.
7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v 1=k1[A]. A
velocidade da reao inversa ser, consequentemente, v -1=k-1[B]. k1 e k-1 so
constantes de velocidade e reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem,
porque as suas respectivas velocidades dependem de concentrao molar de um
nico reagente elevado potncia 1. As constantes de velocidade k 1 e k-1 so
diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A]. No estado de equilbrio, por
definio, v 1=v-1 e, portanto, formalmente, K=k1/k-1. As reaes representadas pelas
equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas velocidades so,
respectivamente, v=kA[A]2 e v=kAB[A][B]. Notar que a ordem da reao no coincide
necessariamente com a estequiometria da equao qumica.
8.
Energia
Livre
(G)
Estado de Transio
(T)
DG*
DG'
Coordenada de Reao
Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica.
9. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se
caracterizam por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para
uma outra substncia receptora.
10. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo
fosfato em ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi)
com um DG0 negativo e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos
fosforilados com o fosfato em ligaes ester ou tioester tambm mostram um DG0 de
hidrlise negativo, mas de valor absoluto da ordem de 3kcal/mol. Estas classes de
compostos esto ilustradas na Tabela 2. O principal composto fosforilado da clula o
ATP; cuja frmula estrutural est na Figura 5. O ATP possui fosfato em ligaes
anidrido e ester, aos quais correspondem DG0 de hidrlise de, respectivamente, -
22
8kcal/mol e -3,5kcal/mol. Todas estas reaes so, portanto, muito voltadas para os
produtos de hidrlise, sendo praticamente irreversveis. No entanto, nenhuma destas
reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise por uma
enzima especfica, da classe das fosfatases.
11. No metabolismo muito importante a transferncia de fosfatos de um composto
fosforilado de alta energia para outro. Uma das reaes chave deste tipo :
DG0=-5kcal/mol
Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs
de uma enzima quinase especfica.
NH2
C
N
O-
O-
Ad e n i n a
C H
C
N
O-
- O- P - O- P - O- P - O- CH
2
O
H C
O
H
HO
Ri b o s e
OH
A MP
ADP
AT P
FIGURA 2
Frmula estrutural do ATP.
23
12. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para
metablitos, existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente
referidas como quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam
a transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos
especficos de serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo
so genericamente chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que
causam mudana de conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica.
Por exemplo, um grande nmero de enzimas so fosforiladas para sofrer uma
transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa. Mais raramente as protenas so
fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
24
Compostos fosforilados.
R
C
R
P
H2O
CH2
CH3
Fosfoenol
cetona
Pi
cido
R
C
H2O
CoA
H2O
H2O
H2O
H2O
R C OH + HS-CoA
ADP
AMP
H2 O
Adenosina monofosfato
tiolcool
Pi
cido
+
cido
+
Pi
cido
cido
Adenosina difosfato
AMP
O
cido
Adenosina trifosfato
ADP
R OH
lcool
O
Tioster
ATP
Pi
cido
cido
ster fosfrico
R C S
O
Anidrido fosfrico
R O
C OH
A OH +
lcool
(Adenosina)
Pi
cido
Pi
cido
Na clula:
[ATP] + [ADP] + [AMP] = constante
25
I. FUNDAMENTOS
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante
a absoro de energia radiante (luz).
Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de
intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo.
Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e
para quantificao do composto atravs de 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo
colorimtrico. Essa intensidade de absoro depende:
1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o lmx - onde o
composto absorve mais luz),
2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e
3) da concentrao do composto nessa soluo.
A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional
concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a
transmitncia = It/I0) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a
concentrao da amostra (figura 1).
A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que:
A = e.l.c
Onde:
A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser
uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It
intensidade de luz transmitida);
e = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm;
c = concentrao da substncia em mol/L.
l
I0
It
26
*
*
Absorbncia
*
*
*
Concentrao (mol/L)
27
II. OBJETIVOS
1) Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por
fotometria.
2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e
pirimidnicas.
Adicionar no tubo 2:
-
1,5 mL de gua,
2,5 mL de reagente de biureto.
Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC.
Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as
absorbncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600,
630, 650, 680 e 700 nm. Usar a soluo de biureto como branco (tubo 2).
Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do
comprimento de onda. Estabelecer qual o lmx do produto da reao de biureto.
1b) Determinao da concentrao de protena
Preparar os tubos como descrito na tabela 1 utilizando uma soluo de 8 mg/mL de
albumina (protena padro) e a soluo de protena desconhecida. No tubo branco no
28
albumina
(8mg/mL)
protena
gua
reagente
concentrao
absorbncia
desconhecida
destilada
biureto
(mg/mL)
(540 nm)
branco
1,5 mL
2,5 mL
0,1mL
1,4 mL
2,5 mL
0,2mL
1,3 mL
2,5 mL
0,4mL
1,1 mL
2,5 mL
0,7mL
0,8 mL
2,5 mL
1,0mL
0,5 mL
2,5 mL
1,0 mL
0,5 mL
2,5 mL
amostra
desconhecida
29
tubos
Triptofano
(0,01 mg/mL)
gua destilada
branco
2,0 mL
0,1 mL
1,9 mL
0,2 mL
1,8 mL
0,4 mL
1,6 mL
0,7 mL
1,3 mL
concentrao
(mg/mL)
absorbncia
obtida
b
a
Diagramas
de
Ramachandran.
Esquerda:
Estruturas
secundrias
correpondentes s combinaes estericamente permitidas para angulos phi e
psi. Direta: ngulos observados para todas as ligaes em 12 protenas com
estruturas de alta resoluo determinadas por cristalografia.
30
a-hlice.
Folha b pregueada.
31
d.
Topografia
de superfcie
modelo space-filling
32
Energia
Livre (G)
DG10#
Estado de transio da
reao no catalisada
DG0#-1
Estado de transio da
reao catalisada
DG0#1cat
DG0#-1cat
Estado Inicial
(S)
(Reagentes)
DG0
Estado Final
(P)
(Produtos)
Coordenada de Reao
33
4. Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente
decompostas por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:
H2N
UREASE
C=O + H2O
CO2 + 2 NH3
H2N
Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k 1[uria], apesar de a equao
estequiomtrica indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser
acompanhada em tubo de ensaio no laboratrio.
As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.
Cintica da enzima urease.
o
Tubo n
Tempo (minuto)
NH3(mmoles)
0.084
0.168
0.252
0.336
10
0.420
Uria (mM)
2,5
5,0
10
15
25
50
100
200
200
Urease (mg)
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
-
NH3 (mmoles)
0,21
0,42
0,59
0,67
0,73
0,78
0,79
0,78
0,00
34
E + S
k1
ES
kcat
E + P
k-1
A derivao da equao Michaelis Menten:
Velocidade mxima
Kdiss aparente do
Complexo enzima-substrato
Concentrao
do substrato
35
onde a = (1+[I]/KI)
36
7.
I.
FUNDAMENTOS
E + S
k1
k-1
ES
k2
E + P
Vmx . [S]
v =
Km + [S]
Na figura 1 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da
concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis
e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso
de velocidade apresentada acima.
37
Vmx
Vmx / 2
Km
C12H22O11 + H2O
Sacarose
C 6H12O6 + C6H12O6
Glicose
Frutose
38
adicionada por ltimo. Levam-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para
reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de
enzima necessria para a formao de 1 mmol de produto por minuto.
II. OBJETIVOS
Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de
uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os
parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.
soluo
redutora (mL)
tampo (mL)
branco
2,0
2,0
0,2
1,8
2,0
0,4
1,6
2,0
0,6
1,4
2,0
0,8
1,2
2,0
1,0
1,0
2,0
tubos
reagente
DNS
(mL)
absorbncia
sacarose
(540 nm)
hidrolisada(mmols)
0,000
0,00
39
sacarose 5%
em tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
branco
1
2
3
4
5
6
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
-
0,1
0,3
0,5
0,7
0,9
1,0
Concentrao
enzima (mM)
Abs. 540
nm
0,00
0,000
sacarose
hidrolisada por
min. (mmol/min)
0,00
tubos
sacarose
5% em
tampo
(mL)
tampo
pH 4,77
(mL)
soluo
enzima
(mL)
concentrao
sacarose (mM)
Abs. 540
nm
sacarose
hidrolisada por
min. (mmol/min)
40
branco
1
2
3
4
5
6
1,0
0,05
0,1
0,3
0,5
0,7
1,0
1,0
1,45
1,4
1,2
1,0
0,8
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,000
0,00
I. FUNDAMENTOS
Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de
aminocidos, pois transferem o grupo aNH3+ de um aminocido para um a
cetocido. Foram identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos
os tipos de clulas e sendo encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de
clulas eucariticas. O grupo aNH3+ de todos os aminocidos (com exceo de Lys,
Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em diferentes organismos. As
transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente especfica para o
acetocido aceptor do grupo NH3+ e, numa menor intensidade, para o aminocido
doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e
vrias outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP
derivada da vitamina B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os
41
NH3+
R
O
COO-
C
COO-
a -CETOCIDO
AMINOCIDO
O
C
NH3
H
CH2
HO
CH2
CH2
HO
+
N
H
H3 C
+
N
H
H3C
Piridoxal-fosfato
Piridoxamino-fosfato
O
NH3+
-OOC
-OOC
CH2
CH2
GLUTAMATO
C
H
COO-
CH2
CH2
C
COO-
a -CETOGLUTARATO
42
43
com um lquido. A fase mvel, que pode ser lquida ou gasosa, preenche os
interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs desta. As fases
mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero
separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio
definido entre as duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio
podem ser empregados: a distribuio pode ser uma simples partio entre dois
lquidos imiscveis; um equilbrio de adsoro entre uma fase estacionria adsorvente
e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica entre uma fase estacionria
trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um eletrlito.
Cromatografia de aminocidos em papel
Neste protocolo emprega-se uma mistura de solventes que interagem com as fibras
de celulose no papel de formas diferentes. O deslocamento do soluto pode ser
explicado da seguinte forma: as fibras de celulose do papel possuem uma forte
afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela
fase orgnica. O papel, assim, pode ser visto como um suporte inerte contendo uma
fase estacionria aquosa (polar). Na medida em que o solvente flui atravs de uma
seo do papel contendo o soluto, uma partio deste composto ocorre entre a fase
mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa (polar). Desta forma, parte
do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Com o fluxo contnuo de solvente, o
efeito desta partio entre a fase mvel e a fase estacionria a transferncia do
soluto do seu ponto de aplicao ao papel para um outro ponto localizado a alguma
distncia do local de aplicao, no sentido do fluxo de solvente. Aps o equilbrio do
papel com o vapor de um solvente saturado com gua, o desenvolvimento do solvente
produz a separao (figura 2).
44
no papel e a distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I
apresenta valores de RF de alguns aminocidos nas condies descritas.
RF = distncia percorrida pelo aminocido no papel
distncia percorrida pela fase mvel
Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em
comparao com quatro outros conhecidos (denominados de aminocidos-padro).
Com ajuda da Tabela II e dos valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a
identidade do aminocido.
A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por
alteraes na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado
inico dos aminocidos. Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada
molcula de uma mistura ir se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase
estacionria e estar a uma distncia especfica de um do ponto de origem, quando
cessar o fluxo de solvente.
Devido ao fato dos aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda
visvel, eles no podem ser vistos. Assim, algum mtodo deve ser usado aps a
cromatografia para localiz-los. A reao de ninhidrina usada para este propsito por
que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido
(usualmente prpura) (figura
3). Diversos aminocidos,
contudo, produzem diversas
tonalidades de cores com a
ninhidrina, o que pode
ajudar em sua identificao.
A reao da ninhidrina com
prolina, por exemplo, gera
um composto amarelo e a
reao da ninhidrina com a
tirosina
produz
uma
colorao azul metlica.
Figura 2 Reao da ninhidrina com aminocidos.
II. OBJETIVOS
Estudar as reaes de transaminases e identificar os produtos e reagentes atravs da
cromatografia em papel.
45
46
Gliceraldedo e diidroxiacetona.
47
Ciclizao da D-glicose
48
49
2.
Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente
designada para distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem
estruturas isomricas que so uma imagem especular da outra, por exemplo, cada
membro da famlia D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um,
enantimero na famlia L. So epmeros pares de estereoismeros que diferem
apenas pela configurao de um C assimtrico. So anmeros os dois ismeros
resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura cclica da hexose. E,
finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que no caem em
nenhuma das categorias anteriores.
3.
Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como
o caso da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo
reagente de Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH
glicosdico livre um dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.
4.
Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de
resduos de monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a
celulose (1-4-poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido.
O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por
ligaes 1-4-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas
(Figura 13). O glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no
resduo final na ltima molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no
redutoras. A partir das extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de
resduos do polmero. Portanto, as molculas de glicognio no tm tamanhos
definidos.
50
MDULO 8: GLICLISE
1. A gliclise a principal via catablica da glicose compreendendo as 10 reaes
enzimaticamente catalisadas que so mostradas na figura abaixo e cuja
estequiometria total pode ser observada na equao qumica seguinte:
Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+
A gliclise, como todas as vias catablicas, exergnica e a equao acima
corresponde a
interessante em termos de DG, cujo valor exato depende de cada clula especfica,
por exemplo, em msculo cardaco estima-se que seja igual a 74,0 kJ/mol.
2. A finalidade da gliclise obteno de energia, como a equao estequiomtrica
indica, cada molcula de glicose degradada a duas de piruvato e parte da energia
livre liberada nesta degradao retida nos produtos na forma de 2 NADH e 2 ATP.
3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise,
pela qual gliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de
NAD+ catalisada pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da
capacidade oxidante da gliclise exige que NADH seja re-oxidada a NAD+ , uma
alternativa para isso apresentada na figura, atravs da reao pela qual NADH reduz
piruvato a lactato, recuperando NAD+. Esta alternativa ocorre no msculo esqueltico
com baixos nveis de O2.
4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil
transferido de, respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em
transferncias catalisadas por glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta
maneira de fosforilao de ADP conhecida como fosforilao a nvel do substrato,
para distingui-la da fosforilao oxidativa da mitocndria que ser vista mais adiante.
51
52
HOCH2
O
GLICLISE
OH
HO
OH
Glicose
OH
ATP
ATP
ADP
ADP
P -OCH2
O
OH
Glicose 6-fosfato
HO
OH
OH
P -O-CH2 O
CH2OH
HO
OH
Frutose 6-fosfato
HO
ATP
ATP
ADP
P -O-CH2 O
ADP
CH2O- P
HO OH
HO
HC=O
H2C-O- P
C=O
Diidroxiacetona
fosfato
HC-OH
H2C-OH
Gliceraldedo
3-fosfato
H2C-O- P
Pi
NAD+
Pi
NAD+
NADH
NADH
O=C-O- P
HC-OH
1,3 Bisfosfoglicerato
H2C-O- P
ADP
ADP
ATP
ATP
O=C-OHC-OH
3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COOHC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COOC-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH2
ADP
ADP
ATP
C=O
HC-OH
CH3
ATP
COO-
COO-
NAD+
NADH
CH3
Lactato
Piruvato
NAD+
NADH
53
54
6.
As
enzimas
citrato
sintase,
isocitrato
desidrogenase
a-cetoglutarato
Acetil-CoA
H2O
CoASH
Oxaloacetato
Citrato
NADH + H+
H 2O
NAD+
cis-Aconitato
L-Malato
H2O
H2O
Fumarato
Ciclo de Krebs
FADH2
Isocitrato
NAD+
FAD
NADH + H+
Succinato
Oxalosuccinato
GTP
CO2
GDP + Pi
Succinil-CoA
NADH
+ H+
CoASH
CO2
a-Cetoglutarato
NAD+
55
2 H+
Espao
Intermembranar
4 H+
2 H+
Cit C
Complexo I
Matrix
Mitocondrial
Complexo III
Complexo IV
NAD+
1/2 O2 + 2H+
NADH + H+
H2O
Complexo II
FADH2
3. A ATP sintase distinta e fisicamente separada da cadeia de transporte de
eltrons. A transferncia de 2e de NADH at O2 envolve um G0= -218kJ/mol, que
gera um incremento no gradiente de prtons suficiente para mover a ATP sintase,
permitindo a produo de 3 moles de ATP (G 0= +30,5kJ/mol). Nestas condies, a
ATP sintase trabalha com uma eficincia termodinmica igual a 42%. , no entanto,
necessrio destacar que quando os 2e saem do nvel redox de FADH 2 , formam-se
apenas 2ATP. Naturalmente, para uma melhor medida da real eficincia
termodinmica da fosforilao oxidativa seria preciso estimar o G da transferncia de
eltrons em vez do G0.
4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da
glicose a CO2 e H2O [C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O; DG0= -2823 kJ/mol]
aproveitada para produo de ATP, graas quase exclusivamente ao processo de
fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por mol de glicose (incluindo neste total 2ATP
da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).
5. Vrios mecanismos da cadeia de transporte de eltrons e de seu acoplamento
sntese de ATP foram elucidados atravs da utilizao de inibidores e desacopladores,
entre os quais esto: rotenona, amital, antimicina A, cianeto e DNP.
- Rotenona e amital inibem a reduo dos complexo I e III por NADH.
- Antimicina A inibe o transporte de eltrons no complexo II.
- Cianeto inibe o transporte no complexo IV.
56
na
gliconeognese
por
reaes
exergnicas,
tornando
57
58
59
(acil-CoA)
oxidao
FAD
FADH2
H
R CH2 C = C C S-CoA
(enoil-CoA)
H
hidratao
H2O
HO H
R CH2 C C C S-CoA
H
(L-hidroxiacil-CoA)
H
NAD+
oxidao
NADH
O
(ceto acil-CoA)
CoA
O
R CH2 C S-CoA +
H3C C S-CoA
(acetil-CoA)
60
2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e
esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das
membranas biolgicas.
Micela
Bicamada
61
4.
As membranas so barreiras hidrofbicas que oferecem grande resistncia
passagem de solutos hidroflicos, cuja permeao exige protenas transportadoras
especficas, conforme esquematizado na figura abaixo. Desta maneira a membrana,
atravs de transportadores especficos, regula o transporte de metabolitos entre
compartimentos celulares.
62
63
Nestas reaes, 2 NADPH + H+ e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose6-fosfato oxidada.
- ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela
transcetolase e transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de
C2 de uma cetose para uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma
aldose para uma cetose.
As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via
das pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2
hexoses e 1 triose a partir de 3 pentoses:
C5 + C5
C 3 + C7
Transcetolase
C7 + C3
C4 + C6
Transaldolase
C5 + C4
C 3 + C6
Transcetolase
6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser
completamente convertido em intermedirios da via glicoltica.
7. A primeira reao da via das pentoses, a desidrogenao da glicose-6-fosfato,
praticamente irreversvel. E essa a reao em que a via das pentoses controlada.
O fator regulatrio mais importante o nvel de NADP+, o receptor de eltrons na
oxidao da glicose-6-fosfato a 6-fosfogluconolactona. Alm disso, NADPH compete
com NADP+ pela ligao enzima. A parte no oxidativa da via das pentoses
controlada principalmente pela disponibilidade de substratos.
8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH
+ H+, ribose-5-fosfato e ATP:
- Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H+, a maior parte de
glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via
glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato.
- Quando a necessidade de NADPH + H+ e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a
reao predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6fosfato pela fase oxidativa da via das pentoses.
- Quando muito mais NADPH + H+ requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6fosfato completamente oxidada a CO2, ou convertida a piruvato.
64
luz
(CH2O) + H2O
65
66
ciclo
que,
2 Pi
UDPG
Glicognion
Fosforilase
Pi
SintaseI
Glicognion+1
UDP
67
68
69
70
71
72
73