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EXTRAO E QUANTIFICAO DE MICRO E

MACROMOLCULAS ORGNICAS EM TECIDOS VEGETAIS

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS


DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
SETOR DE FISIOLOGIA VEGETAL

EXTRAO E QUANTIFICAO DE MICRO E


MACROMOLCULAS ORGNICAS EM TECIDOS VEGETAIS

Relatrio apresentado Disciplina


Laboratrio de Bioqumica e
Metabolismo de Plantas como parte
das exigncias do curso de
Mestrado em Agronomia/Fisiologia
Vegetal.

Prof. Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira


Discentes:

UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS


2006/2

Sumrio
1. INTRODUO .................................................................................................... 4
2. REFERENCIAL TERICO .................................................................................. 5
2.1 Micro e Macromolculas ................................................................................ 5
2.2 Anlise Qumica............................................................................................. 6
2.3 Conservao do Material Vegetal .................................................................. 7
2.4 Homogeneizao ........................................................................................... 8
2.5 Extrao....................................................................................................... 10
2.5.1 Acondicionamento dos Produtos de Extrao .......................................... 11
2.5.2 Avaliao do resultado do processo de extrao ..................................... 11
2.6 Identificao e Quantificao de Biomolculas............................................ 12
2.6.1 Espectrofotometria ................................................................................ 12
2.6.2 Cromatografia ....................................................................................... 13
2.7 Tratamentos dos dados.............................................................................13
3. OBJETIVOS ...................................................................................................... 14
4. MATERIAL E MTODOS .................................................................................. 15
4.1 Preparo das amostras.................................................................................. 15
4.2 Homogeneizao ......................................................................................... 15
4.3 Extrao....................................................................................................... 15
4.3.1 Extrao com MCW................................................................................... 16
4.3.2 Extrao com Etanol 80%...........................................................................17
4.3.3 Extrao com tampo fosfato 0,1 M, pH 7,5 ou gua.................................18
4.4 Quantificao de Macro e Micromolculas .................................................. 18
5. RESULTADOS E DISCUSSO......................................................................... 19
5.1. Quantificao bioqumica de folhas frescas de Seringueira com diferentes
homogeneizadores e extratores. ....................................................................... 19
5.1.1 Aucares Solveis Totais ...................................................................... 20
5.1.2 Acares Redutores.............................................................................. 21
5.1.3 Protenas ............................................................................................... 22
5.1.4 Aminocidos...........................................................................................23
5.2. Quantificao bioqumica de folhas secas de Seringueira com diferentes
extratores........................................................................................................... 25
5.2.1 Aucares Solveis Totais ...................................................................... 25
5.2.2 Acares Redutores.............................................................................. 26
5.2.3 Protenas ............................................................................................... 26
5.2.4 Aminocidos...........................................................................................27
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 28
7. ANEXOS.............................................................................................................29

1. INTRODUO
Dentro do universo vegetal, e mesmo em uma nica planta, existem diversos
compostos orgnicos que so fundamentais para o desenvolvimento e
manuteno das funes vitais desses organismos. As substncias que compem
um vegetal podem ser classificadas de uma maneira geral, em micromolculas
(aminocidos, nucleotdeos e oligossacardeos) e macromolculas (protenas,
cidos nuclicos, polissacardeos e lipdeos), sendo as macromolculas
constitudas de monmeros de unidades micromoleculares.
Muitas biomolculas tm que ser extradas e isoladas da sua fonte biolgica
antes que possam ser estudadas com alguma profundidade. Os modelos
biolgicos para estudos moleculares podem ser vrios e das mais diversas
naturezas. Dependendo do objetivo da investigao, pode ser mais relevante
trabalhar com organismos inteiros (plantas, animais, microorganismos) ou, no
outro extremo com sistemas sub-celulares "cell-free", ou sistemas livres de
clulas.
A separao entre micro e macromolculas uma prtica comum, tendo por
finalidade a identificao e quantificao das mesmas. Tal prtica, no entanto,
considerada grosseira, mas constitui-se numa etapa essencial, a qual antecede a
separao de cada uma das classes que compem essas biomolculas.
Uma anlise qumica de tecidos vegetais requer uma srie de etapas que se
iniciam desde a seleo do material vegetal at a identificao e quantificao de
metablitos ativos de interesse. evidente que para cada molcula ou grupo de
molculas-alvo, reunidas por suas afinidades qumicas, existem diferentes
mtodos que variam de acordo com a natureza qumica, funo biolgica e
compartimentalizao das mesmas o que requer conhecimentos dos processos
metablicos que participam.
De modo geral, os passos para a anlise completa de um tecido vegetal
abrangem: conservao do material vegetal, desde a coleta at sua posterior
utilizao, homogeneizao, extrao e fracionamento (purificao) de grupos

qumicos, e finalmente identificao e quantificao de uma molcula ou mesmo


de uma classe de molculas.
2. REFERENCIAL TERICO
2.1 Micro e Macromolculas
As clulas, de uma maneira geral, possuem quatro grupos principais de
micromolculas: os acares; os cidos graxos; os aminocidos e os
nucleotdeos. Estas quatro famlias de molculas pequenas, juntamente com as
macromolculas resultantes da ligao de pequenas molculas formando longas
cadeias, correspondem a uma grande frao da massa celular.
Os

carboidratos

podem

ser

definidos

como

poliidroxialdedos

ou

poliidroxicetonas, ou ainda como substncias que pela hidrlise fornecem esses


compostos. Podem ser classificados em trs grandes grupos: monossacardeos e
oligossacardeos (solveis em gua) e polissacardeos (insolveis em gua) (Corn
& Stump, 1980).
Os lipdeos so constitudos de monmeros de cidos graxos que, por sua
vez, so longas cadeias carbnicas (saturadas ou insaturadas) com uma
extremidade carboxlica terminal. So macromolculas insolveis em gua e de
considervel solubilidade em solventes orgnicos de baixa polaridade.
Os cidos nuclicos so constitudos de grupamentos fosfato interligados
extremidade de um acar (ribose ou desoxirribose), o qual por sua vez, possui
em sua outra extremidade uma base nitrogenada (purnica ou pirimidnica).
As protenas so polmeros de aminocidos. A variabilidade de suas funes
biolgicas est diretamente ligada sua especificidade qumica nos processos
celulares e esta, uma funo da conformao espacial que cada protena
adquire. Esta relao estrutura-funo, que especfica para cada protena, e
talvez seja a caracterstica essencial delas, determinada pelo arranjo especfico
de aminocidos que compem a estrutura, ou seja, pelos tipos, quantidade e
posio dos aminocidos na seqncia. Embora haja um nmero quase infinito de

possibilidades de seqncias aminoacdicas, relativamente poucas so estveis


termodinamicamente no meio celular. A estabilidade termodinmica, em meio
aquoso, de determinada conformao espacial de uma protena uma funo do
equilbrio entre cargas eltricas, controlado principalmente por tampes celulares
e a flexibilidade da estrutura. De um modo geral so considerados 4 tipos de
protenas: albuminas (solveis em gua; compreendem a maioria das enzimas);
globulinas (solveis em solues de sais diludos; ocorrem em corpos proticos
ligados a membranas); prolaminas (solveis em solues aquosas de lcool;
protenas de armazenamento verdadeiras) e glutelinas (solveis em solues
cidas ou alcalinas). A composio de aminocidos de cada um desses tipos de
protenas varia de uma forma caracterstica. Entretanto, a proporo de cada tipo
varia de espcie para espcie.
2.2 Anlise Qumica
A anlise qumica vegetal um processo que requer conhecimentos cerca
da natureza qumica dos constituintes vegetais e dos processos metablicos dos
quais participam, como foi detalhado acima. Requer tambm uma srie de etapas
que se iniciam desde a escolha do material at a purificao, identificao e
quantificao de uma molcula ou mesmo de uma classe delas. evidente que
para cada molcula ou grupo de molculas-alvo, reunidas por suas afinidades
qumicas existem diferentes mtodos que variam de acordo com o que se quer
avaliar, funo e/ou compartimentalizao. Um dos problemas do analista
selecionar uma dentre as vrias possibilidades de anlise de uma determinada
amostra. Para escolher melhor, o analista deve conhecer os detalhes prticos das
diversas tcnicas e seus princpios tericos. Ele deve estar familiarizado tambm
com as condies nas quais cada mtodo confivel, conhecer as possveis
interferncias que podem atrapalhar e saber resolver quaisquer problemas que
eventualmente ocorram. O analista deve se preocupar com a acurcia e preciso,
o tempo de anlise e o custo. Os mtodos mais acurados para uma certa
determinao podem ser muito lentos ou exigir reagentes muito caros. Levando

em conta a economia, pode ser necessrio escolher um mtodo que, embora


menos exato, d resultados de acurcia suficiente em tempo razovel.
Os fatores importantes que se deve levar em conta ao selecionar um mtodo
apropriado de anlise incluem a natureza da informao procurada, a quantidade
de amostra disponvel, a percentagem do constituinte a ser determinado, e a
utilizao dos resultados da anlise.
Seja qual for o mtodo escolhido para uma determinada anlise, ele deve ser
um mtodo especfico, isto , deve ser capaz de medir com eficincia a
quantidade da substncia de interesse, sejam quais forem as substncias
presentes. Na prtica, poucos procedimentos analticos atingem este ideal, mas
muitos deles so seletivos, isto , podem ser usados para determinar um grupo
limitado de ons ou molculas na presena de muitos outros ons ou molculas.
Melhor seletividade pode ser obtida executando-se a anlise sob condies
cuidadosamente controladas.
De uma maneira geral, os passos para uma anlise completa de um tecido
vegetal abrangem: conservao do material vegetal, desde a coleta at sua
posterior utilizao, homogeneizao, extrao bruta, purificao e finalmente
identificao e quantificao (PASSOS, 1996).
2.3 Conservao do Material Vegetal
Pode-se dizer, que a validade das anlises qumicas depende, inicialmente,
da qualidade e da integridade da amostra a ser analisada. importante que as
amostras de tecido a serem utilizadas neste estudo estejam o mais prximas
possveis da sua condio fisiolgica. Por isso, no se deve realizar ensaios de
extrao a partir de amostras em estado de decomposio ou hidrlise evidentes.
Para a conservao de suas caractersticas, as amostras devem ser selecionadas
de acordo com o tipo de biomolcula a estudar. Por exemplo, estudos de DNA
exigem amostras conservadas em lcool, enquanto que este processo de
preservao inutiliza ensaios com protenas.

No caso do congelamento como mtodo de conservao, deve-se atentar


para o fato de pedaos grandes de amostra demorarem por vezes demasiado
tempo para congelar, o que pode resultar na hidrlise das molculas desejadas.
Deve-se assim congelar-se pedaos pequenos de tecidos (10 a 20 g no mximo).
As amostras a serem utilizadas devem ser cortadas em fragmentos
suficientemente pequenos, com tesouras ou bisturis afiados e bem limpos, antes
de ser iniciado o processo de homogeneizao.
2.4 Homogeneizao
Esta etapa visa obteno de contedos intracelulares onde estejam
contidas as biomolculas de interesse, a partir da ruptura de estruturas
membranares.
Estruturas

biolgicas

duras

obrigam

utilizao

de

tcnicas

de

homogeneizao mais agressivas. Os peptideoglicanos das paredes bacterianas,


as paredes glucomanosdicas de fungos e leveduras e as paredes celulsicas de
plantas so exemplos de estruturas de difcil rompimento.
Dependendo da finalidade da homogeneizao, como por exemplo, para
anlises enzimticas, alm de exigirem-se temperaturas baixas, entre 0 e 5C, a
utilizao de nitrognio lquido tambm imprescindvel para o sucesso da
anlise. Existem mtodos de homogeneizao mecnicos e no mecnicos.
Sendo difcil definir a priori o mtodo certo para obter uma determinada
biomolcula, a pesquisa na literatura, de trabalhos feitos com amostras e objetivos
semelhantes, fornece as melhores indicaes para iniciar qualquer trabalho.
So vrios os mtodos de homogeneizao existentes. No entanto, os mais
utilizados esto listados abaixo.
Graal ou Almofariz: pode ser usado com ou sem areia lavada, gelado ou
no. A utilizao da areia aumenta a eficincia da quebra da parede celular, alm
de fornecer extratos com organelas celulares intactas. Apesar disso, o uso da
areia apresenta um inconveniente. Ela pode adsorver determinadas molculas,
especialmente enzimas.

Vrtex:

apresenta

maior

potncia,

entretanto,

pode

ocasionar

desnaturao de enzimas.
Microtriturador: o mais eficiente mtodo de homogeneizao, utilizando o
sistema de facas associado ao ultra-som. Atravs dele possvel estudar
organelas celulares intactas, ainda que o rendimento no seja grande. Para cada
tipo de estudo necessrio determinar o tempo e a potncia a ser utilizada na
homogeneizao.
Homogeneizadores:
Liquidificador (Blendor) constitui-se num dos mtodos mais empregados.
Atravs de suas lminas de alta velocidade exerce uma grande fora sobre as
clulas, podendo, no entanto, trazer como conseqncia, a desnaturao
enzimtica.
Vidro utilizado na homogeneizao de amostras de textura macia e em
quantidades pequenas.
Durante a homogeneizao, para preservar a integridade das molculas-alvo,
meios de extrao especficos devem ser utilizados. A escolha destes meios
depende de uma srie de questes: se a determinao a realizar apenas
quantitativa; se a molcula em questo solvel nas substncias extratoras; se a
molcula est presa ou no parede celular e a membranas; se o objetivo da
extrao medir apenas a atividade de uma determinada enzima; se o objetivo
isolar e estudar determinado compartimento celular. Os meios de extrao podem
ser constitudos por vrias substncias, tais como:
Tampes: visam preservar a integridade metablica de algumas molculas,
principalmente das enzimas.
Agentes quelantes: grupamentos sulfidrilas de certas molculas podem
sofrer oxidao e reagir com metais pesados das prprias solues tampes
utilizadas na extrao. Para contornar este problema, agentes quelantes como o
EDTA e o Dietil-Ditiocarbamato so utilizados nestas solues.
Agentes antioxidantes: com o rompimento das clulas durante o processo
de homogeneizao, compostos fenlicos presentes nos tecidos vegetais se
oxidam e polimerizam, formando complexos com as protenas. Estes complexos

so

em

geral

coloridos

por

isso

dificultam

as

determinaes

espectrofotomtricas e interferem nos estudos enzimticos. Alm disso, a


presena de fenlicos provoca a formao de pontes dissulfeto inter e
intramoleculas nas cadeias proticas, resultando em perda de atividade
enzimtica. Por este motivo, agentes redutores so utilizados nos meios de
extrao para impedirem a formao das pontes dissulfetos, atuando como
agentes antioxidantes. Vrios so os compostos utilizados como protetores
enzimticos: Mercaptoetanol; DTT; GSH; Cistena; Metabissulfito de Sdio;
Ascorbato; PVP; PVPP; Nylon em p; Resina trocadora de nions; BSA; PMSF;
NEM; Glicerol; Sacarose.
importante registrar cuidadosamente as observaes feitas no decorrer e
no final do processo de homogeneizao (por exemplo, susceptibilidade
observada, aspecto translcido ou opaco dos extratos, massas, rendimentos, etc.).
A realizao de ensaios de monitorao da concentrao da molcula pretendida
nos extratos, aps a homogeneizao, extremamente importante. Efetivamente,
s assim se pode avaliar o sucesso do processo e/ou concluir cerca da
adequao da metodologia escolhida ao objetivo proposto. Esta monitorao tira
partido de caractersticas especficas da biomolcula de interesse, e deve ser
usada para acompanhar a presena da mesma nos ensaios ao longo de suas
diversas etapas. Como sugesto geral para potencializar o processo de
homogeneizao deve-se procurar os tecidos mais moles, o que nos vegetais
normalmente implica regies no vascularizadas.
2.5 Extrao
O processo de extrao consiste numa separao grosseira que serve como
passo inicial para uma posterior separao de cada uma das classes constituintes
das macro e micromolculas. Os seguintes mtodos podem ser utilizados:
Extrao com MCW (metanol: clorofrmio: gua): este um mtodo
bastante

eficiente

na

separao

entre

macro

micromolculas.

As

macromolculas so insolveis no MCW e precipitam. No sobrenadante

10

permanecem as micromolculas, alm de lipdeos e clorofila. Para separar os


lipdeos e a clorofila das micromolculas, particiona-se o sobrenadante com
clorofrmio e gua (4 mL de sobrenadante + 1 mL de clorofrmio + 1,5 mL de
gua).
Extrao com tampes: tampes podem ser utilizados quando o extrato a
ser obtido for direcionado a estudos comuns de micro e macromolculas,
especialmente enzimas.
Extrao com gua pura: este tipo de extrao pode ser utilizado quando as
molculas a serem estudadas forem solveis nesta condio, como por exemplo,
protenas e certos carboidratos.
Extrao com etanol 80% : as macromolculas so insolveis em etanol
80% e precipitam. No sobrenadante permanecem as micromolculas, alm de
lipdeos e clorofila. A parte lipdica do sobrenadante extrada com Tetracloreto
de carbono ou clorofrmio.
Extrao com TCA 5% (cido tricloroactico) ou PCA 5% (cido
perclrico): neste mtodo, as macromolculas ficam insolveis, precipitando. No
sobrenadante permanecem as micromolculas e um tipo de polissacardeo solvel
em gua denominado de W.S.P.
2.5.1 Acondicionamento dos Produtos de Extrao
Os produtos extrados devem ser acondicionados fsica (temperatura,
umidade) e quimicamente (pH, osmolaridade).
No caso de biomolculas preservadas por congelamento, estas devem ser
descongeladas e recongeladas o menor nmero de vezes possvel. No caso de
molculas preservadas em solventes volteis (etanol, por exemplo) devem ser
utilizados recipientes hermeticamente fechados para evitar evaporao.
2.5.2 Avaliao do resultado do processo de extrao
As caractersticas das amostras biolgicas condicionam profundamente a
qualidade e quantidade do produto final das extraes. Os processos de extrao

11

so normalmente estudados no que diz respeito a dois parmetros: rendimento e


grau de pureza dos produtos. Para avaliar o grau de pureza, recorre-se
freqentemente a mtodos indiretos espectrofotometria, atividades enzimticas,
etc. O clculo do rendimento implica o registro da quantidade de amostra biolgica
inicial e de produto biomolecular final (nas mesmas unidades), e geralmente
expresso em percentagem:
Rendimento = 100 x (quantidade de biomolcula/quantidade de amostra
biolgica)
A avaliao do rendimento e do grau de pureza dos produtos finais ao longo
de todas as etapas aconselhada para monitorar o sucesso do procedimento
adotado.
2.6 Identificao e Quantificao de Biomolculas
2.6.1 Espectrofotometria
A espectrofotometria nas regies visvel e ultra-violeta um dos mtodos de
rotina mais prticos para a quantificao de substncias em soluo. Essa
praticidade decorre do fato de haver uma proporcionalidade direta entre a
quantidade de luz absorvida a comprimentos de onda especficos e a
concentrao de solues. Por outro lado, a espectrofotometria tambm utilizada
para detectar a presena de compostos especficos em extratos complexos (os
biolgicos, por exemplo), ou para monitorar o grau de pureza de biomolculas
isoladas.
A medio de quantidades de radiao absorvidas por solues pode ser
realizada experimentalmente em aparelhos designados espectrofotmetros. As
radiaes so produzidas a uma intensidade inicial numa fonte de radiao,
atravessam uma cmara onde se encontra colocada a soluo amostra, at
atingirem um detector que mede a intensidade de luz restante. O comprimento de
onda da radiao a ser emitida selecionvel, dependendo da quantificao a ser
realizada. necessrio, no entanto, possuir valores de referncia ou, melhor
ainda, uma relao de absorbncias registradas experimentalmente para uma

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srie de concentraes de solues. Na prtica isso equivale construo de


retas de calibrao. Quando forem conhecidos valores de absorbncia de
solues problema obtidos experimentalmente o recurso s retas de
calibrao permite determinar matematicamente as concentraes respectivas.
2.6.2 Cromatografia
A cromatografia um mtodo muito utilizado na separao, identificao e
quantificao de substncias presentes em solues. Baseia-se em processos
fsico-qumicos (polaridade, adsoro, partio, soro e neutralizao) de
separao dos componentes de uma mistura, por meio da migrao diferencial de
uma fase mvel (lquida ou gasosa) sobre uma fase fixa (lquida ou slida). Pode
ser definida de acordo com sua aplicao como: analtica (identificao e anlise
de substncias isoladas) ou preparativa (fracionamento e isolamento de
compostos) (COLLINS, 1990).
Existem diferentes tipos de cromatografia, os quais se distinguem pela
composio e estado fsico das fases mveis e estacionrias, bem como pelos
processos fsico-qumicos em que se baseiam. So conhecidas: cromatografias de
troca inica, afinidade, excluso molecular e partio, onde so empregados
equipamentos simples, a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) e a
gasosa (CG), as quais utilizam equipamentos mais sofisticados.
2.7 Tratamento dos Dados
A anlise deve ser procedida em duplicata ou, de preferncia em triplicata.
Todos os resultados analticos devem ser cuidadosamente registrados em um
caderno prprio para preserva-los. Muitos instrumentos modernos so operados
por computador ou ligados a computadores, de modo que os resultados no
somente podem ser apresentados em uma tela, mas tambm registrados como
grficos ou tabelas que servem como registro detalhado. Outros clculos podem
ser necessrios para apresentar os resultados na forma adequada. Muitos

13

instrumentos so capazes de tratar os dados brutos e relaciona-los com cartas de


calibrao, limites de ao e anlises estatsticas.
Como todas as medidas fsicas, os resultados obtidos esto sujeitos a
alguma incerteza e necessrio estabelecer a grandeza desta incerteza para
apresentar resultados que tenham algum significado. necessrio, portanto,
estimar a preciso dos resultados, isto , at que ponto eles podem ser
reproduzidos. Isso comumente expresso em termos da diferena numrica entre
um determinado valor experimental e a mdia de todos os resultados
experimentais. A amplitude ou o espalhamento em um conjunto de resultados a
diferena numrica entre o maior e o menor valor e tambm uma indicao da
preciso das medidas. Entretanto, as medidas mais importantes da preciso so o
desvio padro e a varincia.
A diferena entre o valor analtico mais provvel e o valor verdadeiro da
amostra chamado de erro sistemtico da anlise e indica a sua acurcia. O
clculo de parmetros estatsticos a partir de um conjunto de dados tem, por si s,
pouco valor. Na anlise dos resultados deve-se levar em conta: a confiabilidade
dos resultados e sua comparao com o valor verdadeiro ou com outros conjuntos
de dados. Um ponto muito importante poder rejeitar certos resultados de forma
sensata. Deve ser enfatizado, entretanto, que um resultado s pode ser rejeitado
quando isto for sugerido pela aplicao de um teste estatstico adequado ou
quando houver uma razo qumica ou instrumental muito bvia que justifique sua
excluso.
3. OBJETIVOS
O objetivo deste relatrio apresentar os resultados das prticas de extrao
e

quantificao

de

biomolculas,

comparando-se

os

diversos

tipos

de

homogeneizadores e extratores utilizados e tambm comparando-se a utilizao


de matria seca e fresca de folhas de seringueira, determinando qual o melhor tipo
de amostra para as quantificaes qumicas efetuadas.

14

4. MATERIAL E MTODOS
4.1 Preparo das amostras
O preparo das amostras ocorreu imediatamente aps a coleta do material.
Para a anlise em matria fresca, inicialmente, as folhas selecionadas tiveram
retiradas de sua estrutura a nervura central. Posteriormente, o restante das
lminas foliares foi picado com o auxlio de um bisturi em fragmentos de
aproximadamente 4 mm2 e separado em amostras de 500 mg. Para a anlise em
matria seca, as folhas foram, aps a coleta, colocadas em uma estufa de
circulao mecnica sob temperatura de 70C, onde permaneceram at a
aquisio de peso constante.
4.2 Homogeneizao
Para a matria fresca, trs tipos de homogeneizadores foram utilizados:
Graal, Graal com Nitrognio Lquido e Microtriturador. A amostra de matria seca
foi homogeneizada em moinho tipo Wiley e dividida em 4 repeties de 500 mg
cada.
4.3 Extrao
Para a extrao, usou-se gua destilada, tampo fosfato 0,1M, pH

7,5,

etanol 80% e MCW (metanol:clorofrmio:gua 12:5:3). O volume final de cada


extrator foi de 30 mL, divididos em trs centrifugaes de 30 a 3000 g, com 10 mL
cada.
Foram feitas quatro repeties por homogeinizador em cada extrator.

15

4.3.1 Extrao com MCW

Figura 1. Extrao de macro e micromolculas vegetais utilizando MCW.

16

4.3.2 Extrao com etanol 80%

Figura 2. Extrao de macro e micromolculas vegetais utilizando Etanol 80%.

17

4.3.3 Extrao com tampo fosfato 0,1 M, pH 7,5 ou gua.

Figura 3. Extrao de macro e micromolculas vegetais utilizando tampo ou


gua.
4.4 Quantificao de Macro e Micromolculas
Para

quantificao

das

biomolculas

extradas,

foi

utilizada

espectrofotometria (UV-vis), e mtodos especficos de colorao para cada tipo de


molcula:
Protenas Mtodo de Bradford (Bradford, 1976).
Aminocidos Ninhidrina (Yemm & Cocking, 1995).
Acares Redutores DNS (Miller, 1959).

18

Acares Solveis Totais Mtodo da Antrona (Yemm & Willis, 1954).


Para cada determinao foram testadas as melhores alquotas, tendo como
base as curvas padres desenvolvidas na prtica anterior.
5. RESULTADOS E DISCUSSO
5.1. Quantificao bioqumica de folhas frescas de Seringueira com
diferentes homogeneizadores e extratores.

160
140

mg/g MF

120
100
80
60
40
20
0
AST

TP GSN

AR

TP GCN

AA

PTN

TP Micro

Figura 1. Concentraes mdias de AST, AR, AA e PTN encontradas em folhas


frescas de seringueira com a utilizao de diferentes homogeneizadores.

19

140
120

mg/g MF

100
80
60
40
20
0
AST

TP

AR

GUA

AA

ETANOL

PTN

MCW

Figura 2. Concentraes mdias de AST, AR, AA e PTN encontradas em folhas


frescas de seringueira com a utilizao de diferentes extratores.
5.1.1 Aucares Solveis Totais
Tabela 1. Teores mdios de Acares Solveis Totais em folhas frescas de
Seringueira obtidos com a utilizao de diferentes homogeneizadores.
HOMOGENEIZADORES

MDIAS

TP + Graal com N2

135,82 a

TP + Graal sem N2

130,24 b

TP + Microtriturador

129,49 b

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

Para a quantificao de Acares Solveis Totais, os maiores valores


encontrados foram na utilizao do graal com nitrognio lquido e tampo fosfato,
sendo que a utilizao dos outros homogeneizadores (tampo fosfato sem
nitrognio lquido e Tampo fosfato com microtriturador), no apresentaram
diferenas significativas entre os seus resultados.

20

Tabela 2. Teores mdios de Acares Solveis Totais em folhas frescas de


Seringueira obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Tampo Fosfato

129,49 a

gua

100,48 b

Etanol 80%

101,26 b

MCW

79,84 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Para a extrao de AST em folhas frescas de seringueira, o tampo fosfato
foi o que se mostrou mais eficiente no processo, seguido de gua e etanol 80%
que no se diferiram estatisticamente entre si, seguidos do MCW que foi o extrator
que apresentou os menores resultados.

5.1.2 Acares Redutores


Tabela 3. Teores mdios de Acares Redutores em folhas frescas de Seringueira
obtidos com diferentes homogeneizadores.
HOMOGENEIZADORES

MDIAS

TP + Graal com N2

31,03 a

TP + Graal sem N2

31,48 a

TP + Microtriturador

28,07 b

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

21

Para a extrao de acares redutores, no houveram diferenas


significativas entre os homogeneizadores graal com N2 e graal sem N2, sendo que
os seus valores superaram os encontrados com a utilizao do microtriturador.
Tabela 4. Teores mdios de Acares Redutores em folhas frescas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Etanol 80%

49,84 a

gua

40,31 b

MCW

30,23 c

Tampo Fosfato

28,07 d

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Todos os extratores utilizados para a quantificao de acares redutores
apresentaram diferenas significativas entre si, sendo que o etanol 80% foi o
extrator que apresentou maior eficincia, superando os demais extratores
utilizados.

5.1.3 Protenas
Tabela 5. Teores mdios de Protenas em folhas frescas de Seringueira obtidos
com diferentes homogeneizadores.
HOMOGENIZADORES

MDIAS

TP + Graal com N2

18,59 a

TP + Graal sem N2

18,65 a

TP + Microtriturador

19,71 a

22

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Para a extrao de protenas, no houve diferena significativa entre os trs
tipos de homogeneizadores utilizados. Entretanto o microtriturador apresentou
maior eficincia no processo.
Tabela 6. Teores mdios de Protenas em folhas frescas de Seringueira obtidos
com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Tampo Fosfato

20,71 a

gua

16,05 b

MCW

15,04 b

Etanol 80%

11,66 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Para a extrao de protenas, o tampo fosfato foi o extrator que
apresentou maior eficincia, superando a gua e o MCW, que apresentaram
mdias iguais. O etanol 80% foi extrator que apresentou os menores valores de
AR.
5.1.4 Aminocidos
Tabela 7. Teores mdios de Aminocidos em folhas frescas de Seringueira
obtidos com diferentes homogeneizadores.
HOMOGENIZADORES

MDIAS

TP + Microtriturador

48,09 a

TP + Graal sem N2

46,71 b

TP + Graal com N2

46,04 b
23

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

Para a extrao de aminocidos, o uso do microtriturador apresentou uma


maior eficincia, sendo que os demais homogeneizadores no diferiram
estatisticamente entre si.
Tabela 8. Teores mdios de Aminocidos em folhas frescas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Tampo Fosfato

48,07 a

gua

40,19 b

Etanol 80%

39,64 b

MCW

30,20 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Para a quantificao de aminocidos em folhas frescas de seringueira, o
extrator que se apresentou mais eficiente foi o tampo fosfato, seguido de gua e
etanol 80%, que no se diferiram estatisticamente entre si. O MCW foi o extrator
que se mostrou menos eficiente neste processo, apresentando os menores
resultados.

24

5.2. Quantificao bioqumica de folhas secas de Seringueira com


diferentes extratores.

160
140

mg/g MS

120
100
80
60
40
20
0
TP

AST

GUA

AR

AA
ETANOL

PTN
MCW

Figura 3. Concentraes mdias de AST, AR, AA e PTN encontradas em folhas


secas de seringueira com a utilizao de diferentes extratores.
5.2.1 Aucares Solveis Totais
Tabela 9. Teores mdios de Acares Solveis Totais em folhas secas de
Seringueira obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Etanol 80%

155,55 a

gua

137,81 b

Tampo Fosfato

139,01 b

MCW

100,43 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Na quantificao de AST com diferentes extratores, o etanol foi o extrator que
se mostrou mais eficiente, seguido de gua e tampo fosfato que no se diferiram

25

estatisticamente entre si, sendo que todos estes superaram os valores obtidos
com o MCW.
5.2.2 Acares Redutores
Tabela 10. Teores mdios de Acares Redutores em folhas secas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Tampo Fosfato

64,71 a

gua

55,48 b

Etanol 80%

54,47 b

MCW

39,70 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Entre os extratores, o tampo fosfato foi o que se mostrou mais eficiente na
extrao de AR, superando a gua e o etanol 80%, que no se diferiram
estatisticamente, seguidos do MCW, que foi o extrator que se apresentou menos
eficiente.
5.2.3 Protenas
Tabela 11. Teores mdios de Protenas em folhas secas de Seringueira obtidos
com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

gua

19,58 a

MCW

16,10 b

Etanol 80%

12,67 c

Tampo Fosfato

6,69 d

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
26

Todos

os

extratores

utilizados

para

quantificao

de

protenas

apresentaram diferenas significativas entre si, sendo que a gua foi o extrator
que apresentou maior eficincia, superando os demais extratores utilizados.
5.2.4 Aminocidos
Tabela 12. Teores mdios de Aminocidos em folhas secas de Seringueira
obtidos com a utilizao de diferentes extratores.
EXTRATORES

MDIAS

Tampo Fosfato

64,71 a

gua

55,48 b

Etanol 80%

54,47 b

MCW

42,33 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
O tampo fosfato foi o extrator que se mostrou mais eficiente para na
extrao de PTNs, seguido de gua e etanol 80% que no se diferiram
estatisticamente entre si, superando o MCW, que foi o extrator que se mostrou
menos eficiente neste processo.

27

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. 3. Ed.
Biologia molecular da clula. Porto Alegre: Artes mdicas, 1997, 1320p.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the qauntification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemestry, v. 72, p. 248-254, 976.
CLARK, J.M. Bioqumica experimental. Zaragoza: editorial Acribia, 1966, 290 p.
COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introduo
cromatogrficos. 4. ed. Campinas: UNICAMP, 1990. 279 p.

mtodos

CORN, E.E.; STUMPF, P.K. Introduo a Bioqumica. 4 ed. Traduo, MENNUCCI


et al. So Paulo: Edgard Blucher, 1980. 525p.

MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing


sugar. Analytical Chemistry, Washington, v. 31, n. 3, p. 426-428, Mar. 1959.
PASSOS, L.P. Mtodos analticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel
Pacheco: EMBRAPA, 1996.

YEMM, E.W.; COCCKING, E.C. The determination of aminoacid with ninhydrin.


Analyst, London, 80: 209-213, 1955.
YEMM, E.W; WILLIS, A.J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by
anthrone. The Biochemical Journal, London, 57: 508-514, 1954.

28

7. ANEXOS
ANLISE ESTATSTICA SISVAR
HOMOGENEIZADORES

Acares Solveis Totais Matria Fresca


Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares solveis totais em folhas
de seringueira com diferentes homogeneizadores
FV

GL

SQ

Homogeneizador
Erro

2
21

191.44
25.54

Total

23

216.98

QM
95.72
1.21

Fc
78.70

Pr>Fc
0.0000

CV (%) = 0.84

Quadro 2. Mdias para teores de acares solveis totais com diferentes


homogeneizadores
Tratamentos
Microtriturador
Graal sem N2
Graal com N2

Mdias
129.49 a
130.24 a
135.82 b

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

Acares Redutores Matria Fresca


Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares redutores em folhas de
seringueira com diferentes homogeneizadores.
FV

GL

SQ

Homogeneizador
Erro

2
21

54.95
15.25

Total

23

70.20

QM

Fc

Pr>Fc

27.47
0.72

37.83

0.0000

CV (%) = 2.82

29

Quadro 2. Mdias para teores de acares redutores com diferentes


homogeneizadores
Tratamentos
Graal com N2
Graal sem N2
Microtriturador

Mdias
31,49 a
31.03 a
28,07 b

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Protenas Matria Fresca
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de protenas em folhas de seringueira
com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

QM

Fc

Pr>Fc

Homogeinizador
Erro

2
21

6.32
53.61

3.16
2.55

1.23

0.0000

Total

23

59.94

CV (%) =

8.42

Quadro 2. Mdias para teores de protenas com diferentes homogeneizadores.


Tratamentos
Graal com N2
Graal sem N2
Microtriturador

Mdias
18.59a
18.65a
19.71a

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

30

Aminocidos Matria Fresca

Quadro 1. Anlise de varincia para teores de aminocidos em folhas de


seringueira com diferentes homogeneizadores.
FV

GL

SQ

QM

Fc

Pr>Fc

Homogeinizador
Erro

2
21

17.55
19.10

8.77
0.90

9.64

0.0000

Total

23

36.66

CV (%) = 2.03

Quadro 2. Mdias para teores de aminocidos com diferentes homogeneizadores.


Tratamentos
Microtriturador
Graal sem N2
Graal com N2

Mdias
48,09 a
46.71 a
46,04 b

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

31

EXTRATORES NA MATRIA FRESCA


Acares Solveis Totais
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares solveis totais em folhas frescas de
seringueira com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

QM

Material Vegetal
Erro

3
28

9978.76
22.83

3326.25
0.81

Total

31

10001.60

Fc
4078.57

Pr>Fc
0.0000

CV (%) = 0.88

Quadro 2. Mdias para teores de acares solveis totais com diferentes extratores.
Tratamentos
TP
GUA
ETANOL
MCW

Mdias
129,49 a
100,49 b
101,27 b
79,84 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Acares Redutores Matria Fresca
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares redutores em folhas frescas de
seringueira com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

QM

Fc

Pr>Fc

Material Vegetal
Erro

3
28

2409.66
54.21

803.22
1.93

414.81

0.0000

Total

31

2463.88

CV (%) = 3.75

Quadro 2. Mdias para teores de acares redutores com diferentes extratores.


Tratamentos
ETANOL
GUA
MCW
TP

Mdias
49,84 a
40,31 b
30,23 c
28,07 d

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

32

Protenas Matria Fresca


Quadro 1. Anlise de varincia para teores de protenas em folhas de seringueira
com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

Material Vegetal
Erro

3
28

335.11
17.81

Total

31

352.92

QM
111.70
0.63

Fc

Pr>Fc

175.60

0.0000

CV (%) = 5.03

Quadro 2. Mdias para teores de protenas com diferentes extratores.


Tratamentos
TP
MCW
GUA
ETANOL

Mdias
20,71 a
15.05 b
16.05 b
11,66 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Aminocidos Matria Fresca
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de aminocidos em folhas frescas de
seringueira com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

Material Vegetal
Erro

3
28

1286.96
22.71

Total corrigido

31

1309.67

QM
428.98
0.81

Fc

Pr>Fc

528.88

0.0000

CV (%) = 2.28

Quadro 2. Mdias para teores de aminocidos com diferentes extratores.


Tratamentos
TP
ETANOL
GUA
MCW

Mdias
48,09 a
39.64 b
40.19 b
30,20 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

33

EXTRATORES NA MATRIA SECA


Acares Solveis Totais Matria Seca
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares solveis totais em folhas
secas de seringueira usando diferentes extratores.
FV

GL

SQ

QM

Material Vegetal
Erro

8
28

11387.45
100.11

Total

31

11487.56

Fc

3795.81
3.5753

Pr>Fc

1061.66

0.0000

CV (%) = 1.43

Quadro 2. Mdias para teores de acares solveis totais com diferentes


extratores
Tratamentos

Mdias

Etanol
gua
TP
MCW

150,55
137,81
139,01
100,44

a
b
b
c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
Acares Redutores Matria Seca
Quadro 1. Anlise de varincia para teores de acares redutores em folhas de
seringueira usando diferentes extratores.
FV

GL

SQ

Material Vegetal
Erro

3
28

2567.01
114.91

Total

31

2681.92

QM
855.67
4.10

Fc
208.49

Pr>Fc
0.0000

CV (%) = 3.78

Quadro 2. Mdias para teores de acares redutores com diferentes extratores


Tratamentos
TP
ETANOL
GUA
MCW

Mdias
64,71 a
54.47 b
55.48 b
39,70 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
34

Protenas Matria Seca


Quadro 1. Anlise de varincia para teores de protenas em folhas de seringueira
com diferentes extratores
FV

GL

SQ

QM

Material Vegetal
Erro

3
28

722.97
17.43

240.99
0.62

Total

31

740.40

Fc
387.10

Pr>Fc
0.0000

CV (%) = 5.73

Quadro 2. Mdias para teores de protenas com diferentes extratores


Tratamentos
GUA
ETANOL
MCW
TP

Mdias
19,59a
16,10b
12,67c
6,69d

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.

Aminocidos Matria Seca


Quadro 1. Anlise de varincia para teores de aminocidos em folhas de
seringueira com diferentes extratores.
FV

GL

SQ

Material Vegetal
Erro

3
28

2024.96
498.17

Total

31

2523.14

QM
674.98
17.79

Fc
37.938

Pr> Fc
0.0000

CV (%) = 7.78

Quadro 2. Mdias para teores de aminocidos com diferentes extratores


Tratamentos
TP
ETANOL
GUA
MCW

Mdias
64,71 a
54,47 b
55,48 b
42,33 c

As mdias seguidas de mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%


de probabilidade.
35