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Universidade Estadual de Maring

Ps-Graduao em Fsica

Gutierrez Rodrigues de Morais

Espectroscopia fotoacstica para o estudo da difuso de um extrato de Caesalpinia


peltophoroides Benth. em feridas cutneas e das mudanas estruturais de tecidos
do pulmo infectados por Paracoccidioides brasiliensis

Orientador:
Co-orientadoras:

Mauro Luciano Baesso


Eneri Vieira de Souza L. Mello
Luzmarina Hernandes

Maring, Janeiro de 2012

Universidade Estadual de Maring


Ps-Graduao em Fsica

Gutierrez Rodrigues de Morais

Espectroscopia fotoacstica para o estudo da difuso de um extrato de Caesalpinia


peltophoroides Benth. em feridas cutneas e das mudanas estruturais de tecidos
do pulmo infectados por Paracoccidioides brasiliensis

Orientador:
Co-orientadoras:

Mauro Luciano Baesso


Eneri Vieira de Souza L. Mello
Luzmarina Hernandes

Dissertao de mestrado apresentada


Universidade Estadual de Maring para a
obteno do ttulo de mestre em Fsica

Maring, Janeiro de 2012

III

IV

Dedico este trabalho s pessoas


mais importantes de minha vida,
pelo carinho, compreenso e
estmulo, meus pais Daguimar e
Jandira e minha noiva Nayana.

Agradecimentos
Esta dissertao o resultado de um verdadeiro trabalho em equipe, que
no seria possvel sem a importante colaborao de algumas pessoas,
agradeo em especial:
Primeiramente a Deus, por mais esta bno alcanada, e pelo conforto
encontrado nas oraes durante os momentos difceis.
Ao meu orientador, professor Dr. Mauro Luciano Baesso, por quem
aprendi a ter imensa admirao. Sou muito grato por sua pacincia, estmulo,
conhecimento adquirido e principalmente pela confiana em meu trabalho.
A minha co-orientadora professora Dra. Eneri Vieira de Souza L. Mello,
do Departamento de Cincias Morfolgicas (UEM), ao professor Dr. Joo
Carlos Palazzo de Mello, do Departamento de Farmcia (UEM), e doutoranda
Fernanda Bueno, parceiros no estudo da cicatrizao de feridas.
minha co-orientadora, professora Dr. Luzmarina Hernandes, do
Departamento de Cincias Morfolgicas (UEM), a Professora Dra. Terezinha
Inez Estivalet Svidzinski, do Departamento de Anlises Clnicas e Biomedicina
(UEM), e mestre Edilaine Martins Moratto, parceiras no trabalho com
Paracoccidiodes brasiliensis. Agradeo por todo conhecimento adquirido
durante este tempo de convvio e sobretudo pelo crdito depositado em mim e
pela afetuosa ateno.
professora Dr. Francielle Sato, por toda ajuda, tanto nos experimentos
quanto pela valiosa ateno e discusses. Jamais me esquecerei de todo esse
carinho e amizade.
Aos amigos e amigas: Ana Claudia, Giselly, Gustavo, Marcelo, Marcel,
Rogrio, Jos Renato e Vitor, pela ajuda, companheirismo e apoio;
Aos Professores do Mestrado, por todo conhecimento e ensinamento.
Obrigado pela pacincia e disponibilidade para ensinar.
Aos Professores do GEFF, pela colaborao, sugestes e importantes
discusses.
A todos os funcionrios do DFI-UEM, e em especial Akiko;
Capes, CNPq, FINEP, Fundao Araucria e UEM pelo apoio
financeiro.

Muito obrigado a todos!

VI

Resumo
Neste trabalho a Espectroscopia Fotoacstica (PAS) foi empregada na
realizao de dois estudos: no primeiro, utilizando-se as regies espectrais do
ultravioleta e do visvel, para a determinao ex-vivo, em feridas cutneas de
ratos, da taxa de difuso de uma frmula farmacutica gel, na qual foi
incorporado o extrato bruto a 1% obtido de cascas de Caesalpinia
peltophoroides Benth (sibipiruna), para estudo de sua ao cicatrizante; no
segundo estudo, a tcnica de espectroscopia fotoacstica de infravermelho com
transformada de Fourier (photoacoustic spectroscopy of the Fourier transform
infrared FTIR-PAS), foi empregada para a determinao ex-vivo das
mudanas

estruturais

no

pulmo

de

camundongos

infectados

por

Paracoccidiodes brasiliensis (Pb). O primeiro estudo foi realizado em feridas


excisionais na pele de ratos Wistar aps 4, 7, 10 e 14 dias de tratamento com o
gel de C. peltophoroides. No segundo, camundongos Swiss foram infectados
com uma cepa de Pb18. Os pulmes infectados foram analisados aps 1, 2, 4 e
8 semanas de infeco. Os resultados do primeiro estudo mostraram que a taxa
de difuso da formulao de C. peltophoroides foi dependente do estgio de
cicatrizao das feridas. A tcnica PAS foi eficaz em demonstrar o potencial de
permeao do gel de C. peltophoroides em feridas excisionais em diferentes
etapas da cicatrizao. A maior taxa de permeao ocorreu no 10 o dia de
tratamento, perodo em que tambm foi observado um aumento na banda de
absoro ptica da meta-hemoglobina. No segundo estudo, a avaliao fsicoqumica mostrou que os pulmes infectados com Pb apresentaram mudanas
significativas nos grupos funcionais amida I, CH3 e fosfato, e que as mudanas
nas bandas de absoro ptica foram uma consequncia das alteraes
morfolgicas ocorridas no pulmo infectado.

Em concluso, os resultados

deste trabalho mostraram mais uma vez que a espectroscopia fotoacstica


uma tcnica muito importante para se determinar a difuso de formulaes em
sistemas biolgicos, permitindo que se faa especificamente na cicatrizao
cutnea, uma correlao entre a taxa de difuso e os eventos biolgicos do
processo cicatricial. A tcnica FTIR-PAS mostrou grande potencial para anlise
de alteraes fsico-qumicas em sistemas biolgicos sem a necessidade de
reagentes ou manipulao da amostra, indicando que esta tcnica pode tornarse promissora para o estudo dos mecanismos fsico-qumicos envolvidos nos
processos que resultam em apoptose.

VII

Abstract
In this work, the Photoacoustic Spectroscopy (PAS) was applied for two different
studies: First, using the UV-Vis spectral region, to determine ex vivo, in rats
cutaneous wound, the diffusion rate of a pharmaceutical gel, in which a 1% of
extract of Caesalpinia peltophoroides Benth skin was incorporated, to study its
healing properties; next, the technique in the infrared with Fourier transform set
up and photoacoustic detection (FTIR-PAS) was employed for ex-vivo
determination of tissue structural changes of infected Swiss mouse lungs with
Paracoccidiodes brasiliensis (Pb). The first study was performed in induced
wounds in rats Wistar after 4, 7, 10 e 14 days of treatment with the gel of C.
peltophoroides. In the second study, Swiss mouse lungs were infected with a
strain of the Pb18. The infected lungs were investigated after 1, 2, 4 and 8
weeks of infection. The results of the first study showed that the C.
peltophoroides formulation diffusion rate was dependent on the wound healing
stages. The technique was able to demonstrate the penetration of the C.
peltophoroides gel in induced wounds in different stages of the healing. The
higher penetration rate occurred at the 10o day of treatment, period in which an
increase in the meta-hemoglobin optical absorption bands was also observed. In
the second study, the physico-chemical evaluation showed that the infected
lungs with Pb presented significant changes in the optical absorption bands of
the functional groups amide I, CH3 and phosphate, and that the changes in the
optical absorption bands occurred as a consequence of morphological
alterations in the infected lungs. In conclusion, the results of this work showed
once again that the photoacoustic spectroscopy is a technique useful to
determine the diffusion of formulations in biological systems, allowing to
perform, specially in cutaneous wound, a correlation between the diffusion rate
with the biological events in the healing processes. The FTIR-PAS technique
showed potential for physico-chemical alterations studies in biological systems
without the need of using chemical reagents and sample manipulation,
suggesting that this method is promising for the study of the processes involved
in cellular apoptosis.

Sumrio
Resumo ......................................................................................................................... VI
Abstract ............................................................................................................... VII
1.

Introduo .....................................................................................................9

1.1

Objetivos ............................................................................................................ 11

2.

Histrico e fundamentos tericos sobre a espectroscopia fotoacstica ............12

2.1

Espectroscopia ptica ........................................................................................ 12

2.2

Espectroscopia Fotoacstica.........................................................................14

Histrico do efeito fotoacstico ..................................................................................... 14


Efeito fotoacstico: definio atual ................................................................................ 15
Comportamento ptico e trmico das amostras ............................................................ 16
O sinal fotoacstico ...................................................................................................... 19
2.3

Espectroscopia no infravermelho ....................................................................... 21

Vibraes moleculares.................................................................................................. 22
3.

Consideraes gerais sobre as amostras e os sistemas estudados ..................27

Caesalpinia peltophoroides Benth................................................................................. 27


Morfologia da pele ........................................................................................................ 27
Histofisiologia da cicatrizao da pele .......................................................................... 29
Paracoccidioides brasiliensis (Pb)................................................................................. 33
Estrutura do pulmo ..................................................................................................... 34
4.

Procedimentos e montagens experimentais ...................................................36

4.1

Estudo da taxa de permeao em feridas cutneas de ratos ............................. 36

Preparao das amostras para a avaliao da atividade cicatrizante ........................... 36


Montagem experimental da espectroscopia fotoacstica .............................................. 37
4.2 Estudo fsico-qumico e histolgico de pulmo de camundongos infectados com
Paracoccidiodes brasiliensis. ........................................................................................ 39
Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier com deteco
fotoacstica (FTIR-PAS) ............................................................................................... 40
5.

Resultados e discusso ................................................................................42

Parte I - Espectroscopia fotoacstica para o estudo da difuso de um extrato de


Caesalpinia peltophoroides Benth em feridas cutneas ................................................ 42
Parte II - FTIR-PAS como mtodo de estudo da Paracoccidioidomicose ...................... 52
6.

Concluses .................................................................................................60

Referncias .................................................................................................................. 60
ANEXO I ...............................................................................................................74

1. Introduo

Embora seja conhecida h mais de 30 anos como uma tcnica que apresenta
caractersticas especiais para estudos em sistemas biolgicos in vivo, ex vivo ou in
vitro

[1]

, a Espectroscopia Fotoacstica (Photoacoustic spectroscopy - PAS) vem se

consolidando como um mtodo muito til para se determinar a propagao e a


distribuio espacial, em tecidos biolgicos, de formulaes de aplicao tpica [2-3].
A princpio foi empregada essencialmente para a determinao da penetrao
de cosmticos na pele, entretanto, atualmente vem tambm sendo muito aplicada na
avaliao da dinmica de difuso e distribuio espacial de frmacos de aplicao
tpica em outros sistemas biolgicos, como pele

[3]

, unhas [4], e dentes

[5]

. Isto vem

ocorrendo em funo de uma caracterstica especial da tcnica que a de


possibilitar a determinao da taxa de penetrao das substncias ao longo da
espessura da amostra e tambm pelo crescente interesse nos medicamentos de uso
tpico, que sabidamente podem minimizar a ocorrncia de efeitos adversos nos
indivduos. Estes fatos vm contribuindo para a consolidao da PAS para uso
rotineiro na rea farmacutica.
Outras vantagens esto relacionadas s caractersticas da PAS: no
destrutiva, permite estudos em amostras semi-slidas e muito sensvel na
deteco dos componentes absorvedores da formulao no corpo de prova, mesmo
quando esto em concentraes muito baixas.
Para cada estudo utilizando a fotoacstica importante estabelecer
previamente as regies espectrais. Na regio do ultravioleta e visvel (UV-VIS), os
mecanismos responsveis pela absoro da luz so governados essencialmente por
processos que envolvem transies eletrnicas. Nestes casos, o espectro
fotoacstico permite obter as bandas de absoro ptica associadas s molculas,
aglomerados ou ons presentes na amostra. Nos espectros na regio do
infravermelho prximo e mdio, os mecanismos envolvidos na absoro so as
vibraes e/ou as rotaes moleculares. Os espectros no infravermelho, em geral,
permitem no s identificar as molculas presentes, mas tambm acessar
informaes sobre a natureza das ligaes qumicas. Assim, a tcnica FTIR-PAS
promissora

para

diagnstico

clnico,

pois

possibilita

identificar

alteraes

bioqumicas em amostras, alm de permitir a anlise de fenmenos biolgicos [6].

10

Neste trabalho foram realizados dois estudos utilizando a tcnica da PAS. No


primeiro avaliou-se a dinmica de penetrao de um fitofrmaco em feridas
excisionais da pele, durante o processo de cicatrizao. Recentemente, avaliamos,
com este mesmo objetivo, por meio de PAS no UV-VIS, a taxa de permeao de
uma pomada de prpolis em feridas excisionais na pele de ratos. Os resultados
foram correlacionados com os eventos de reepitalizao e re-vascularizao,
obtendo-se desta forma a dinmica do processo

[7]

. Entre as justificativas para se

ampliar este estudo est o grande interesse atual nos fitoterpicos

[8-15]

. A

biodiversidade brasileira conta com aproximadamente 55 mil espcies vegetais


catalogadas

[16-[

18], oferecendo um grande potencial para se obter molculas com

funcionalidades que possam caracteriz-las como princpios ativos de interesse


farmacutico. Embora tenha este potencial, s recentemente os definidores de
poltica cientfica vm imprimindo aes para o desenvolvimento de projetos
voltados para a obteno de novas formulaes de interesse farmacutico

[19]

Uma planta medicinal aquela que contm substncias bioativas com


propriedades teraputicas, profilticas ou paliativas. Desde os perodos prhistricos, h um grande nmero de espcies que so usadas na medicina popular
por diversos povos. Com a evoluo do conhecimento cientfico, novas ferramentas
de anlise e de extrao dos princpios ativos foram desenvolvidas. Isto resultou na
possibilidade de se isolar as substncias que conferem propriedades medicinais,
permitindo assim a produo de novos frmacos [20-21].
No segundo estudo a tcnica fotoacstica no infravermelho (FTIR-PAS) foi
empregada numa avaliao fsico-qumica de pulmo de camundongos Swiss
infectados com Paracoccidiodes brasiliensis (Pb). Pb um fungo dimrfico trmico,
responsvel pela paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistmica de natureza
granulomatosa, autctone da Amrica Latina

[22-23]

. A principal porta de entrada

deste fungo no organismo a respirao, e os condios produzidos por Pb podem


causar infeco a partir de um foco pulmonar inicial [24].
A importncia da PCM para a sade pblica est relacionada no s com a
atividade da doena, mas tambm com as leses secundrias causadas por esta
micose, que podem levar morte se no tratadas

[25-26]

. As manifestaes clnicas

principais que ocorrem so tosse seca, aumento de secrees e dificuldade para


respirar. No entanto, a consequncia mais limitante desta micose a ocorrncia de
insuficincia pulmonar crnica [27], resultante do desenvolvimento de fibrose.

11

A infeco experimental de animais que so suscetveis ao fungo em geral


capaz de mostrar o comportamento da doena

[28-30]

. O uso da fotoacstica no

infravermelho parece ser promissor neste estudo, uma vez que os espectros de
absoro podem fornecer informaes sobre as mudanas conformacionais em
molculas que constituem o parnquima pulmonar.

1.1 Objetivos
Os objetivos deste trabalho so:

Avaliar ex-vivo, com a espectroscopia fotoacstica nas regies espectrais do


ultravioleta e do visvel, a taxa de difuso de uma formulao contendo
extrato bruto de Caesalpinia peltophoroides Benth. em feridas cutneas de
ratos;

Utilizar a fotoacstica no infravermelho mdio, com o procedimento via


transformada de Fourier, para a determinao das mudanas estruturais em
pulmo de camundongos infectados com Paracoccidiodes brasiliensis;

Associar os resultados das anlises fsico-qumicas com aqueles obtidos a


partir das anlises histolgicas.

12

2. Histrico e fundamentos tericos sobre a espectroscopia


fotoacstica
2.1

Espectroscopia ptica
Sir Isaac Newton (1643-1727), foi um dos pioneiros da espectroscopia

ptica. Embora tenha se tornado famoso por sua obra das leis da mecnica,
PhilosophiaeNaturalis Principia
publicada em latim em 1687

[31]

Mathematica,

mais

conhecida

por

Principia,

, a ptica sempre esteve entre seus principais

interesses. O primeiro curso dado por Newton na Universidade de Cambridge, em


1669, foi sobre ptica. Seu primeiro artigo publicado em 1672 e seu ltimo livro,
Opticks, publicado em ingls em 1704

[32]

, foram estudos sobre a natureza da luz [33].

Newton foi o primeiro a descrever regras matemticas para explicar o


comportamento da refrao da luz [34].
A espectroscopia a rea da cincia dedicada ao estudo da interao da
radiao eletromagntica com a matria. Comprimentos de onda distintos
transportam diferentes quantidades de energia, resultando em interaes que
podem ser analisadas para se obter informaes sobre as caractersticas da
estrutura molecular dos compostos e suas possveis funcionalidades [35-36].
Cada radiao eletromagntica pode ser caracterizada por um comprimento
de onda, conforme ilustrado na Figura 2.1. Na ordem crescente de energia, mostrase desde as ondas de rdio at radiaes de alta energia, como os raios-X e os
raios-

[7,37]

. Embora no haja uma definio especfica dos limites entre cada regio

espectral, suas denominaes auxiliam na caracterizao e no processo de


entendimento dos mecanismos de interao de cada radiao com a matria.

13

Figura 2.1. Representao esquemtica do espectro eletromagntico [38].

De modo geral, quando uma radiao com um determinado comprimento de


onda interage com a matria, ocorre um fenmeno espectroscpico, como por
exemplo,

absoro,

transmisso,

reflexo,

espalhamento,

luminescncia,

fluorescncia, entre outros, os quais dependero da energia da radiao incidente e


do meio material considerado

[35]

. Os estudos espectroscpicos so to eficientes

para revelar as propriedades de um meio que suas informaes podem ser


consideradas como sua impresso digital do referido meio.
As frequncias da regio do visvel correspondem a menos de 1% de todo o
espectro eletromagntico, cujos comprimentos de onda esto compreendidos entre
400 e 700 nm. A radiao ultravioleta est compreendida entre 200 e 400 nm. As
radiaes do visvel e do ultravioleta podem induzir excitaes nos materiais a partir
de transies de determinados eltrons de seu respectivo estado de menor energia
para outros de maior energia, ou ainda podem provocar transferncias de eltrons
entre tomos ou molculas [35-39].

Espectros no infravermelho prximo, mdio

e longnquo refletem transies entre os nveis rotacionais dos vrios nveis


vibracionais de um estado eletrnico e os nveis rotacionais e vibracionais de outro
estado eletrnico

[39]

. Nesta regio espectral pode-se avaliar as ligaes qumicas

das molculas a partir da deteco das vibraes ou rotaes que elas apresentam.
Isto obtido, por exemplo, com a tcnica fotoacstica no infravermelho via

14

transformada de Fourier, denominada de (photoacoustic spectroscopy of the Fourier


transform infrared FTIR-PAS).
Em outras palavras, dependendo da radiao utilizada, pode-se recorrer a
uma tcnica espectroscpica especfica. Neste trabalho, destacamos as regies
espectrais do ultravioleta e do visvel para o estudo da taxa de difuso do extrato de
C. peltophoroides em feridas cutneas e a regio do infravermelho para a
determinao das mudanas estruturais em tecidos do pulmo induzidas por Pb.

2.2

Espectroscopia fotoacstica

Histrico do efeito fotoacstico


Em 1880, Alexandre Graham Bell utilizou sua prpria voz para modular um
feixe de luz solar que insidia em um slido posicionado em uma cmara fechada.
Neste experimento, ele observou a ocorrncia de efeitos sonoros que podiam ser
ouvidos por meio de um tubo ligado na referida clula, como ilustrado a Figura 2.2
[40]

Figura 2.2. Foto da montagem experimental usada por Graham Bell para avaliar a
transmisso de efeitos sonoros [41].

Bell fez experimentos subsequentes utilizando uma variedade de slidos,


lquidos e gases. Ele observou que os efeitos sonoros induzidos dependiam da
natureza das substncias expostas radiao e ainda do respectivo comprimento
de onda absorvido pelo corpo. Seu trabalho provocou grande interesse na poca,
sendo considerado o primeiro a relatar o efeito fotoacstico [40].

15

Em razo da inexistncia de microfones sensveis e sistemas de


sincronizao de sinais poca, o efeito fotoacstico foi negligenciado por um longo
perodo de tempo. Na dcada de 40, com o surgimento dos primeiros microfones, o
efeito foi utilizado para o estudo de amostras na forma de gs. No entanto, foi
somente em 1973 que a espectroscopia fotoacstica, como a conhecemos hoje, foi
estabelecida para o estudo de gases, slidos e lquidos. Isto ocorreu graas ao
trabalho pioneiro dos pesquisadores Allan Rosencwaig e Allen Gersho que
desenvolveram as bases tericas e experimentais da tcnica, estabelecendo
protocolos para estudos quantitativos que permitem a determinao de quantidades
fsicas de qualquer tipo de material

[1,40,42]

. Como consequncia, a espectroscopia

fotoacstica tornou-se uma ferramenta valiosa para a determinao de propriedades


pticas e trmicas de materiais. Entre outros fatores, os autores destacaram a
possibilidade do mtodo permitir a realizao de anlise do perfil de profundidade de
centros absorvedores distribudos ao longo da espessura da amostra sob teste [40].
O referido modelo permitia a utilizao de equaes analticas para descrever
o comportamento do sinal fotoacstico tanto em termos da potncia de luz incidente,
como da frequncia de sua modulao. Em seus experimentos, eles demonstraram
que o sinal fotoacstico era o resultado do fluxo peridico de calor, induzido aps a
incidncia de luz, entre a superfcie da amostra e o gs contido na clula
fotoacstica. Tratava-se, portanto, de um fenmeno fototrmico

[40-41]

Efeito fotoacstico: definio


O efeito fotoacstico pode ser observado quando um feixe de luz modulada
absorvido por uma amostra posicionada dentro de uma clula fechada contendo
gs, que pode ser o prprio ar. A absoro da radiao incidente resulta em
excitao dos nveis de energia da amostra. Em seguida, se a relaxao no
radiativa haver gerao de calor de forma peridica na amostra. Haver assim,
ondas de presso no gs que est em contato com a amostra. Um microfone
acoplado cmara fotoacstica detecta esta variao da presso produzindo o sinal
fotoacstico. Sua intensidade depende da potncia e da frequncia de modulao
da luz incidente. Portanto, o sinal fotoacstico o resultado da interao da radiao
com a matria. Sua natureza definida pelas propriedades pticas e trmicas das

16

amostras. A obteno de espectros de absoro ptica gerados a partir do sinal


fotoacstico caracteriza a tcnica espectroscopia fotoacstica.

Comportamento ptico e trmico das amostras


Em materiais transparentes ou semitransparentes, a atenuao da radiao ao
longo de sua espessura depende do comprimento de onda desta radiao e ocorre
de tal forma que a intensidade do feixe incidente diminui exponencialmente,
conforme prev a Lei de Beer-Lambert

[42]

. A distncia de penetrao do feixe na

amostra at sua intensidade ser atenuada a 1/e (do valor I0 incidente na superfcie)
caracteriza a absoro ptica do material. O parmetro que mede essa penetrao
denominado de comprimento de absoro ptica, l , que definido como: l 1 ,
sendo o coeficiente de absoro ptica do material.
A Figura 2.3 mostra as trs classificaes que uma dada amostra pode
receber em termos do seu comprimento de absoro ptica e de sua espessura, ls .

Figura 2.3. Classificao do comportamento ptico das amostras.

Uma vez que a amostra esteja classificada em termos do comprimento de


absoro ptica, necessrio estabelecer como o calor gerado em uma
determinada profundidade pode contribuir para o aumento de presso na clula, ou
seja, para a gerao do sinal fotoacstico. Atualmente, sabe-se que o sinal
fotoacstico pode ser gerado por pelo menos quatro mecanismos principais, sendo
eles: difuso trmica, expanso trmica, efeito termoelstico e efeito fotobrico.

17

Difuso trmica: Neste processo, a incidncia da luz modulada sobre a


amostra produz um fluxo trmico no interior da mesma at o gs circundante,
provocando neste uma variao de temperatura com a mesma frequncia de
modulao da luz incidente, como mostra a Figura 2.4. Uma fina camada do gs, a
que est prxima interface amostra-gs, que responde termicamente s
flutuaes de temperatura da amostra. Esta camada de gs, que est em contato
com a amostra, se aquecer e passar a expandir e contrair periodicamente
funcionando como um pisto, gerando uma onda de presso no interior da cmara
fechada. O sinal fotoacstico resultar dessa variao de presso que detectada
por um microfone acoplado clula. Este processo conhecido como modelo de
pisto simples.

Figura 2.4. Representao esquemtica do fenmeno de difuso trmica.

Expanso trmica: Neste mecanismo, a prpria amostra se expande e contrai


devido ao aquecimento peridico causado pela absoro da luz modulada, como
ilustrado na Figura 2.5. Deste modo o movimento da superfcie da amostra atua
sobre a coluna de gs provocando uma onda acstica, no gs. Neste caso, a
intensidade do sinal governada pelo coeficiente de expanso trmica do material.
Em geral, este mecanismo dominante quando a amostra de um material que
apresenta alto valor para o coeficiente de expanso trmica.

Figura 2.5. Representao esquemtica do fenmeno de expanso trmica.

Flexo termoelstica: Este processo acontece quando h formao de um


gradiente de temperatura ao longo da espessura da amostra. Este gradiente

18

gerado devido ao decrscimo da absoro medida que a luz penetra no material.


Isto faz com que a expanso trmica seja diferente para diferentes planos da
amostra (perpendiculares ao gradiente), o que induz uma flexo. Em especial isto
ocorre quando as bordas da amostra esto presas, conforme ilustra a Figura 2.6.
Este processo tambm peridico, gerando ondas de presso no gs e,
consequentemente, sinal fotoacstico.

Figura 2.6. Representao esquemtica do fenmeno de flexo termoelstica.

Efeito fotobrico: Este efeito observado em amostras fotoquimicamente


ativas, com troca gasosa entre a amostra e o gs da clula fotoacstica. o que
acontece, por exemplo, com folhas de plantas que liberam oxignio quando realizam
fotossntese, conforme ilustrado na Figura 2.7.

Figura 2.7. Representao esquemtica do fenmeno de efeito fotobrico.

Comprimento de difuso trmica


O comprimento de difuso trmica, s, tem unidade de comprimento (cm), e
definido pela expresso (2.1):

D
f

(2.1).

em que D a difusividade trmica (cm2/s) e f a frequncia de modulao (Hz) do


feixe de luz incidente. Escolhida uma dada frequncia de modulao para o
experimento, este parmetro fornece a camada da amostra (no lado da incidncia de
luz) que a radiao absorvida convertida em calor contribui para a gerao do sinal
fotoacstico.

19

Classificao trmica: classificam-se termicamente as amostras a partir da


comparao de sua espessura (ls) com o comprimento de difuso trmica (s):

Se s>>ls: amostra termicamente fina;

Se s<<ls: amostra termicamente grossa.

importante ressaltar que uma amostra opaca pode ter seu espectro
resolvido, desde que s<l. Na fotoacstica, uma amostra considerada saturada se
toda luz absorvida gera sinal acstico. A saturao pode ser contornada diminuindose as dimenses da amostra (tornando-a no opaca), ou aumentando-se a
frequncia de modulao (o que reduz o valor de s). Isto porque com o aumento da
frequncia o sinal gerado em camadas cada vez mais superficiais. Assim, com a
dependncia do comprimento de difuso trmica, s, em funo da frequncia de
modulao, possvel efetuar uma anlise do perfil de profundidade no material. Ou
seja, possvel obter espectros de absoro ptica das diferentes camadas da
amostra em estudo.
A Figura 2.8 mostra um esboo do perfil de penetrao numa amostra,
ilustrando o que ocorre se a frequncia angular de modulao da luz () for
modificada. As flechas representam as profundidades at onde o sinal PA gerado,
para a respectiva frequncia de modulao. Nesta figura, a frequncia cresce a
partir de 1 at 6. Quanto menor a frequncia de modulao da luz maior ser a
profundidade de gerao do sinal fotoacstico.

Figura 2.8. Diagrama do perfil de profundidade na gerao do sinal fotoacstico.

O Sinal Fotoacstico
No nosso objetivo neste trabalho apresentar todos os modelos tericos
para a espectroscopia fotoacstica. Mostraremos apenas os aspectos principais do
modelo de difuso trmica para o sinal fotoacstico de Rosencwaig e Gersho.

20

Tratamentos mais completos dos modelos para outros mecanismos de gerao do


sinal ou arranjos experimentais podem ser encontrados em outros trabalhos
[1,3,7,40,42]

O modelo de difuso trmica para o sinal fotoacstico consiste em considerar


uma pequena camada de gs em contato com a superfcie da amostra, a qual
capaz de responder termicamente s variaes de temperatura provocadas pela
absoro da luz incidente.
A

configurao

unidimensional

padro

da

clula

fotoacstica

est

representada na Figura 2.9.

Figura 2.9. Geometria da clula fotoacstica convencional [42].

Em que 0(zero) a origem do sistema unidimensional; 2g a espessura do


gs que responde a variao de temperatura da amostra; lg a espessura da
amostra; lg + lb a espessura da amostra mais a do suporte.
O sinal fotoacstico gerado pela variao de presso do gs no interior da
clula. No caso em que a coluna de ar termicamente grossa, ou seja, lg 2 g , a
intensidade do sinal fotoacstico torna-se bem reduzida, tendendo a se anular. A
mxima intensidade do sinal obtida quando lg g . Um fato importante que o
sinal fotoacstico processado por um analisador sncrono, o Lock-in, que
sincroniza os sinais eltricos provenientes do microfone e do modulador da luz. Isto
significa que o sinal processado a componente no temporal da variao de
presso na clula, sendo composto por uma intensidade e uma fase. A fase o
atraso temporal entre o sinal eltrico do modulador (referncia que define o instante
da incidncia da radiao na amostra) e o sinal proveniente do microfone. Este
atraso est ligado com o intervalo de tempo necessrio entre a absoro da
radiao pela amostra at a variao de presso no gs ser detectada pelo
microfone. Em outras palavras, est ligado ao valor do tempo de relaxao no

21

radiativa do centro absorvedor na amostra. Assim, o sinal fotoacstico pode ser


representado por um fasor no plano complexo, como mostra a Figura 2.10.

Figura 2.10. Representao fasorial do sinal fotoacstico.

Em que
(2.2).
A amplitude e a fase so os principais parmetros em medidas experimentais
com a fotoacstica. A intensidade do sinal depende linearmente da potncia
luminosa e do inverso do comprimento da coluna de gs. O sinal depende ainda do
comprimento de onda utilizado e da frequncia de modulao com que esta radiao
chega at o material a ser estudado. Por outro lado, a fase do sinal fotoacstico
independe da potncia incidente. Ela diferente para cada comprimento de difuso
trmica, s, variando com a profundidade onde h gerao de calor. Alm disso, ela
depende do tempo de relaxao no radiativa de cada centro absorvedor na
amostra, ou seja, pode distinguir absores geradas por diferentes molculas ou
estruturas moleculares nas amostras.

2.3

Espectroscopia no infravermelho

A descoberta da regio espectral do infravermelho atribuda a Friedrich


Willian Herschel (17381882) que em 1800 investigou qual cor da radiao solar
produzia mais calor. Para isto, ele utilizou um prisma de vidro, transparente
radiao, que decompe a luz solar

[43-44]

. Com auxlio de um termmetro, Herschel

verificou que ao posicion-lo na regio espacial aps a vermelha do espectro,


ocorria um aumento inesperado da temperatura. Descobria-se assim o que hoje se
chama de radiao infravermelha

[45]

. A condio para que ocorra absoro da

radiao infravermelha que haja variao do momento de dipolo eltrico da

22

molcula, como consequncia das alteraes nos seus movimentos vibracional ou


rotacional [46-47].
A energia de vibrao dos tomos no interior de uma molcula est na regio
do infravermelho, entre aproximadamente (10 e 12.500 cm-1)

[47-48]

. Esta regio

subdivida em infravermelho prximo (4.000 12.500 cm-1), mdio (400 4.000 cm-1)
e longnquo (10 400 cm-1), ilustrado na Figura 2.11 [46-49].

Figura 2.11. Subdivises do infravermelho no espectro eletromagntico [47].

Vibraes moleculares
Mesmo em um slido em temperaturas prximas do zero absoluto, os tomos
esto em continuas oscilaes em torno de uma posio de equilbrio. As amplitudes
das oscilaes so da ordem de 10-11 a 10-12 metros, enquanto suas frequncias
vibracionais correspondem s regies das radiaes infravermelhas.
As vibraes moleculares podem ser classificadas em dois tipos, vibrao de
deformao axial (stretching) e vibrao de deformao angular (bending), conforme
ilustrado na Figura 2.12. As deformaes axiais ou por estiramento so oscilaes
radiais das distncias entre os ncleos, enquanto que as deformaes angulares
envolvem mudanas nos ngulos entre o plano que contm a ligao e um plano de
referncia. Transies entre os nveis vibracionais podem ocorrer quando houver
mudana do momento dipolar devida variao da distribuio carga ao redor das
ligaes. Isto pode ser observado quando se aplica um campo eltrico no sistema.
Alteraes do momento dipolar

podem ocorrer em molculas diatmicas

heteronucleares e para molculas poliatmicas que apresentam vibraes


assimtricas [48-50].
Se em um sistema h N tomos no combinados, livres para se
movimentarem em trs dimenses, o sistema teria 3N graus de liberdade. Contudo,
se estes tomos esto combinados, formando uma molcula, continua, ainda,
existindo 3N graus de liberdade, dos quais trs so relacionados translao do

23

centro de massa da molcula e trs para a rotao da mesma em torno de trs eixos
perpendiculares. Logo restariam (3N-6) graus de liberdade para as vibraes [51].

Figura 2.12.Ilustrao da vibrao por deformao axial (stretching) e por vibrao de


deformao angular (bending) [48].

Para molculas lineares no h rotao em torno do eixo internuclear e, em


consequncia, restam (3N-5) graus de liberdade para as vibraes. Estes graus de
liberdade correspondem aos diferentes modos normais de vibrao da molcula.
Um modo normal de vibrao aquele no qual cada ncleo realiza uma
oscilao harmnica simples em torno de sua posio de equilbrio e todos os
ncleos se movem em fase com a mesma frequncia. O centro de gravidade da
molcula permanece inalterado.
Para explicar o comportamento vibracional das molculas existem vrios
modelos. O mais utilizado a descrio tipo oscilador harmnico por meio da teoria
de perturbao para determinar os nveis de energia do sistema

[52]

. Neste modelo a

energia vibracional do sistema uma funo quadrtica da distncia entre os


tomos e a oscilao entre eles simtrica. Considera-se que a ligao entre os
tomos descrita por um comportamento tipo massa-mola, no qual a frequncia de
vibrao () descrita pela lei de Hooke, representada pela Equao 2.3. Aqui k
representa a constante de fora e a massa reduzida do sistema, que se representa
pela Equao 2.4. Em que m e M correspondem s massas dos tomos presentes
na ligao.
(2.3).
(2.4).

24

Este modelo s permite a transio entre nveis vibracionais adjacentes, dado


que todos os nveis esto igualmente espaados, e estas transies tm de respeitar
os critrios de simetria [53].
No caso de molculas diatmicas, para o modelo do oscilador harmnico
ideal, a energia potencial (E) contm apenas um termo quadrtico, sendo
representada pela Equao 2.5. Em que r a distncia internuclear e re a distncia
internuclear de equilbrio, representando-se esta diferena entre as distncias por x.

(2.5).

A energia vibracional (
Equao 2.6, na qual

) de cada nvel para este modelo dada pela

representa o nmero quntico vibracional e

a constante de

Planck.

(2.6).

Figura 2.13. Perfil da energia potencial, no modelo do oscilador harmnico [54].

Um modelo mais realista o do oscilador anarmnico, uma vez que a ligao


entre os tomos no um oscilador perfeitamente harmnico e ainda podem ocorrer
quebras de ligao se a molcula se estender alm do regime elstico, podendo
ocorrer dissociao. Assim, o oscilador anarmnico prev nveis de energia
separados por diferenas de energia decrescentes. Isto ocorre medida que
aumenta o nmero quntico vibracional (lei de Morse), resultando em transies

25

entre nveis no adjacentes, denominadas de sobreposies, e transies que


envolvem duas vibraes diferentes, denominadas de combinaes.
A energia potencial

no modelo anarmnico descrita pela funo de Morse,

conforme apresentada na equao a seguir.


(2.7).
em que

uma constante molecular,

distncia interatmica de equilbrio e


A constante

a energia de dissociao,

a distncia interatmica num dado instante.

est relacionada constante K da molcula:


(2.8).

Assim, a energia de um oscilador com potencial de Morse quantizada e tem


valores dados por:
(2.9).
em que

a frequncia vibracional harmnica,

o nmero quntico vibracional, e

uma constante sem dimenso, chamada de constante de no-harmonicidade.


A constante de anarmonicidade aparece como uma combinao de outras
constantes vibracionais, definida como:
(2.10).
em que as unidades de

so as mesmas, para que

no tenha unidade.

Nas Figuras 2.13 e 2.14 esto representadas as variaes da energia


potencial para o modelo do oscilador harmnico e para o anarmnico. Nota-se que
as distncias entre os nveis vibracionais so diferentes em cada modelo, isto , no
do oscilador harmnico a distncia entre cada nvel sempre a mesma, enquanto
que no anarmnico ela diminui medida que a energia aumenta. As figuras
demonstram tambm, que para elevadas distncias nucleares entre os dois tomos
presentes na ligao, o modelo do oscilador anarmnico prev a dissociao da
molcula, enquanto o harmnico no.
A explicao de uma molcula diatmica como sendo um oscilador com o
potencial de Morse plausvel, pois correlaciona vrios observveis importantes,
como: frequncia clssica, energia de dissociao, constante de fora, nohamonicidade.

26

Figura 2.14. Perfil da energia potencial no modelo anarmmico [54].

27

3. Consideraes gerais sobre as amostras e os sistemas estudados


3.1

Caesalpinia peltophoroides Benth.

A espcie Caesalpinia peltophoroides Benth., conhecida como sibipiruna ou


falso pau brasil, utilizada como planta ornamental e possui potencial madeireiro.
No Brasil, encontrada na regio de mata atlntica e ainda na regio do pantanal
[55]

. A madeira muito utilizada na construo civil e na produo de mveis em

geral, por ser pesada, dura e de mdia durabilidade [56].


C. peltophoroides possui sinonmia cientfica com Caesalpinia pluviosa DC. e
na Bolvia utilizada para tratamento de disenteria

[56]

. Extratos da casca de C.

pluviosa apresentaram, em estudos in vitro, atividades contra o agente etiolgico da


malria, Plasmodium falciparum [57-59].

Figura 3.1. (A) Partes areas e (B) tronco de Caesalpinia peltophoroides [60].

3.2

Morfologia da pele

A pele um rgo multifuncional muito complexo, resistente, flexvel e bastante


impermevel que, moldando e revestindo o corpo, o isola do meio exterior

[61]

. Por

sua inervao, vascularizao e presena de neuromediadores, a pele muito


importante pelas inmeras funes que desempenha, tais como: proteo,
renovao e reparao, secrees sebceas e sudoral, regulao da temperatura do
corpo e absoro da radiao ultravioleta para a sntese de vitamina D [62].
Na composio qumica desse tecido o elemento mais importante a gua,
com cerca de 70% da massa total. As substncias de natureza proteica, como
aminocidos, protenas (elastina, colgeno, melanina), azotados (cidos graxos e
uria), representam 27,5% de seus constituintes qumicos. Destacam-se ainda os

28

lipdeos simples como o colesterol, lipdios complexos como as ceraminas e


fosfolipdios e ainda os lipdios de reserva. Na pele tambm so encontrados sais
minerais, principalmente, sdio, potssio, clcio, magnsio, zinco, ferro, fsforo,
enxofre e iodo [63].
Estruturalmente constituda por duas camadas, uma externa, a epiderme,
constituda por tecido epitelial e logo abaixo a derme, de natureza conjuntiva. Abaixo
da derme est a hipoderme que apesar de ter a mesma origem da derme, no faz
parte da pele, apenas serve de suporte e unio com rgos adjacentes, como
mostra a Figura 3.2 [63].

Figura 3.2. Representao das camadas e estrutura da pele e tecido subcutneo


[64]
.

A epiderme constituda por um epitlio estratificado pavimentoso


queratinizado, formado por camadas sobrepostas de clulas sendo a mais comum
os queratincitos. Na epiderme tambm se encontram os melancitos, que
produzem a melanina, pigmento que confere cor a pele e absorve os raios
ultravioletas (UV); as clulas de Langerhans, fagocitrias; e as clulas de Merkel,
mecano-receptoras. A epiderme um tecido avascular [64-66].
A derme, localizada abaixo da epiderme, constituda por colgeno e elastina
mergulhados em uma matriz extracelular vascularizada. O principal tipo celular da
derme so os fibroblastos, mas tambm so encontrados macrfagos e outras
clulas do sistema imune [64].

29

3.3

Histofisiologia da cicatrizao da pele

Qualquer ruptura na integridade da pele deve ser rapidamente e eficazmente


reparada num processo que se d de forma espao-temporal altamente organizada
e envolvendo diversas etapas que incluem: inflamao, reepitelizao, contrao
das feridas, fibroplasia e remodelao [67].

Fase inflamatria
Injria tecidual inicia uma resposta celular e vascular que limpa a ferida de
tecidos desvitalizados e estranhos e dispara os eventos para a cicatrizao e
regenerao.
A primeira reao do organismo ao trauma a vasoconstrio no local da
ferida, para controlar a hemorragia. Segue-se a vasodilatao com extravasamento
de sangue e formao de um cogulo de fibrina que tampona a leso fornecendo
assim uma matriz provisria para a migrao das clulas responsveis pelo
processo de reparo

[68-70]

. O cogulo serve tambm como um reservatrio de fatores

de crescimento que so liberados a partir da desgranulao das plaquetas

[68-60]

Os grnulos das plaquetas se difundem pela matriz provisria formando um


gradiente quimiottico que orienta a migrao dos leuccitos, tanto da circulao
como das regies adjacentes

[68]

. Os capilares prximos da ferida tornam-se mais

permeveis e o exudato inflamatrio infiltra-se nos tecidos circundantes e na rea da


ferida. Estas manifestaes so todas locais, originando um aumento de sinais
cardinais da inflamao (rubor, calor, tumor e dor) [66].
Os neutrfilos e moncitos so as primeiras clulas a migrarem para a
superfcie da ferida, para formar uma barreira contra a invaso de microorganismos.
Estudos recentes mostram que os neutrfilos so tambm uma fonte de
citocinas pr-inflamatrias que provavelmente liberam os primeiros sinais para ativar
fibroblastos e queratincitos locais. A menos que a ferida esteja infectada, o
infiltrado de neutrfilos cessa aps alguns dias

[68]

Em seguida as clulas que surgem na regio so os macrfagos (segundo ao


quinto dia) que auxiliam os neutrfilos na eliminao de microorganismos pela
fagocitose de debris teciduais. No entanto, sua participao mais relevante na
inflamao a produo e liberao local de diversos fatores de crescimento e
citocinas amplificando os primeiros sinais liberados pelas plaquetas e neutrfilos. Os

30

macrfagos tornam-se predominantes e assim permanecem at o final do reparo


[66,68,71]

A seguir os linfcitos comeam a aparecer em grande nmero. Embora seu


papel no processo de reparo no seja bem definido, parecem ter uma funo na
secreo de citocinas que so mitgenas e quimioatraentes para fibroblastos e
participam na remoo de neutrfilos velhos [70].
Qualquer processo que retarde esta fase, como infeco, leso fsica
provocada durante a colocao do curativo ou movimento repetido, nocivo para a
cicatrizao.

Fase de reepitelizao
O processo de reepitelizao da ferida se inicia imediatamente aps a leso.
Os estgios mais importantes desta etapa compreendem: a) migrao das clulas
atravs da rea danificada; b) proliferao dos queratincitos basais prximas ao
leito da ferida.
Em uma pele normal os queratincitos esto presos na lmina basal por
hemidesmossomos e ligados uns aos outros por desmossomos. No stio da leso,
os hemidesmossomos so desmontados. Aps perderem a inibio por contato as
clulas adjacentes ferida so estimuladas a migrar ao longo da matriz provisria
[68]

.
So propostas duas estratgias diferentes para migrao celular: 1) por um

fenmeno denominado de efeito de vizinhana livre, as clulas basais prximas


regio de ferida, so ativadas e rastejam de forma sequencial, por meio da formao
de lamelipdios, envolvendo a contrao de filamentos de actinomiosina intracelular
[66]; 2) ou por um processo chamado leap-frog (pulo do sapo) na qual as clulas
rolam umas sobre as outras (as clulas da camada supra basal sobre aquelas da
camada basal) [68].
A migrao das clulas epiteliais faz-se utilizando a disposio da fibrina
como guia e dirigindo-se da margem para a zona central da ferida. Quando as
clulas epiteliais provenientes de uma e outra margem se encontram no centro, a
migrao e a mitose param como resultado da inibio por contato

[66,70-71]

31

Algumas horas depois do incio da migrao ocorre um pool proliferativo de


clulas epiteliais na margem da ferida, para substituir aquelas perdidas durante o
dano [68].
A superfcie da ferida umedecida e oxigenada um fator que acelera o
processo de migrao. medida que a regio da leso vai sendo coberta, as clulas
voltam ao seu estado normal e a membrana basal refeita e os hemidesmossomos
e desmossomos so reconstitudos [66].

Contrao das feridas


Durante o processo de contrao, as margens das feridas se movem uma em
direo outra, como se houvesse uma fora de atrao. Isto ocorre devido
diferenciao de alguns fibroblastos dermais em miofibroblastos. Este fenmeno se
chama contrao e faz com que as feridas abertas na pele encolham e fechem,
empurrando o tecido normal para a rea lesada cobrindo o defeito

[70-71]

Fase de fibroplasia
A migrao e ativao de fibroblastos intensa devido presena de
macrfagos derivados de moncitos e produo e liberao dos mediadores
qumicos produzidos por eles. Com o aumento de fibroblastos ativados para a
sntese de colgeno, inicia-se a fibroplasia. Os fibroblastos so estimulados a migrar
atravs da matriz provisria formada e seguindo a orientao do gradiente qumico
de substncias quimioatraentes

[71-72]

. Concomitante a esta fibroplasia, ocorre

intensa proliferao vascular (angiognese) a partir dos vasos pr-existentes nas


bordas da ferida. O sucesso da fibroplasia depende da formao dos novos vasos
uma vez que oxignio e nutrientes so requeridos pelas clulas metabolicamente
ativas [66].
Este tecido formado por fibroblastos, substncias produzidas por eles e vasos
sanguneos denominado tecido de granulao, clinicamente apresentando-se com
aspecto granuloso e avermelhado.
A maior parte dos fibroblastos que surgem na rea lesada parece se originar
a partir de clulas precursoras que rodeiam os vasos sanguneos. O sinal que leva
diferenciao destas clulas tem sido atribudo a fatores de crescimento derivados
das plaquetas e dos macrfagos [71].

32

Na fase proliferativa precoce, a sntese e a lise de colgeno ocorrem


simultaneamente, qualquer aumento na lise e atraso ou diminuio na sntese
podem causar deiscncia da ferida.
Feridas em locais altamente vascularizados, como na cabea e pescoo,
tornam-se seguras to rpido que os pontos de sutura podem ser retirados entre o
3 a 5 dia. Em reas menos vascularizadas como no tronco a cicatrizao mais
lenta e os pontos de sutura devem ser retirados entre o 7 a 8 dia. As feridas nas
extremidades cicatrizam ainda mais lentamente, devendo manter-se os pontos de
sutura durante 10 a 15 dias [71-72].

Fase de remodelao
A ltima fase a de remodelao ou maturao. Nesta, a estruturao do
novo tecido da cicatriz extensivamente remodelada. medida que a angiognese
supre as necessidades metablicas, a sntese de colgeno comea a decair,
fibroblastos e macrfagos desaparecem e o colgeno excessivo removido

[66]

. Uma

grande parte do colgeno, originalmente distribudo ao acaso, ser destrudo e


substitudo por novas fibras colocadas de forma conveniente ao longo das linhas de
tenso. A resistncia da cicatriz aumenta gradualmente at ficar semelhante do
tecido normal, mas no esteticamente nem funcionalmente perfeito, pois, uma
cicatriz cutnea completamente madura possui apenas 70% da resistncia da pele.
A elasticidade provavelmente nunca retornar ao normal e mesmo passados muitos
anos, aps um exame cuidadoso pode-se identificar o tecido da cicatriz [68,70-71].

33

Ferida incisional
Epiderme

A - 24 horas ps-leso

Neutrfilos
infiltrando

Derme
Subcutneo

Queratincitos
B Uma semana ps-leso

Novos vasos formados


Fibroblastos

Processo mittico
Proliferao de clulas
Encurtamento da cicatriz
Restaurao da epiderme

C 6 semanas ps-leso
Fibroblastos

Regresso dos vasos sangunios

Figura 3.3. Fases de cicatrizao: (A) fase inflamatria, (B) fase proliferativa e (C) fase de
remodelao [73].

3.4

Paracoccidioides brasiliensis (Pb)

Paracoccidioides brasiliensis (Pb) um fungo dimrfico trmico

[23]

, que na

natureza, encontra-se na forma de filamento, que produz condios, estrutura que


pode induzir infeco em humanos [24].
Estima-se que aproximadamente 10 milhes de pessoas so infectadas por
Paracoccidioides brasiliensis (Pb) nas regies endmicas na Amrica Latina

[74]

. A

taxa de incidncia anual da paracoccidioidomicose (PCM) entre a populao


brasileira estimada de 1-3 por 100.000 habitantes e a mortalidade de
aproximadamente 0,14 por 100.000 habitantes, destacando-a como oitava causa de
morte por doena predominantemente crnica ou repetitiva. Entre as doenas
infecciosas e parasitrias, a taxa de mortalidade mais elevada entre as micoses
sistmicas

[75]

. No Paran, corresponde quinta causa de bitos por doenas dessa

natureza e onde est registrada a maior taxa de mortalidade por PCM do Sul e
Sudeste, cerca de 3,52 bitos por 1.000.000 de habitantes [75].

34

A virulncia pode ser estudada pela infeco experimental de animais


susceptveis ao fungo, apresentando as mesmas caractersticas de cronicidade e
generalizao da doena observadas no homem. A influncia da virulncia de P.
brasiliensis na relao parasita-hospedeiro pode ser evidenciada pelas diferentes
manifestaes clnicas da PCM, incluindo padro de formao do granuloma e
rgos envolvidos [76].
O pulmo o rgo mais frequentemente acometido. A infeco causa
severas modificaes hemodinmicas comprometendo anatomicamente o rgo

[77]

A doena caracterizada por uma inflamao granulomatosa crnica e fibrose, que


visam isolar o agente infectante [76-77].

3.5

Estrutura do Pulmo

Os pulmes so rgos pares situados na cavidade torcica. Esto


separados um do outro pelo corao e por outras estruturas situadas no mediastino.
Os brnquios principais do origem a brnquios secundrios, ou lobares.
brnquio principal direito mais largo, mais curto e mais vertical que o esquerdo

O
[78]

Os brnquios lobares, trs do lado esquerdo e dois do lado direito, do origem a


brnquios tercirios, ou segmentares. Os brnquios tercirios ramificam-se diversas
vezes, formando os bronquolos terminais. Por sua vez, estes se ramificam e
transformam-se em bronquolos respiratrios, que por sua vez do origem a vrios
ductos alveolares que terminam nos alvolos.
Cada pulmo dividido em lobos por uma ou mais fissuras. O pulmo
esquerdo tem uma fissura oblqua e dois lobos; o pulmo direito tem duas fissuras,
obliqua e horizontal, e trs lobos (figura 3.4)

[79]

. O pulmo constitudo por uma

substncia esponjosa leve, mas altamente elstica, denominada parnquima, que


permite a expanso e contrao dos mesmos e as trocas gasosas [78].
Todos os lbulos contm um vaso linftico, uma arterola, uma vnula e um
ramo de um bronquolo terminal. A pleura uma membrana serosa de dupla
camada que envolve e protege cada pulmo. constituda por dois folhetos: visceral
e parietal

[80]

. Entre a camada externa e a interna h um pequeno espao, a

cavidade pleural, que contm lquido pleural produzido por estas membranas.

35

Figura 3.4. Esquema representativo da anatomia macroscpica do pulmo com seus


lobos [79].

36

4.

Procedimentos e montagens experimentais


Todos os procedimentos envolvendo o uso de animais foram aprovados pelo

Comit de tica em Experimentao Animal da Universidade Estadual de Maring


(anexo I e II).

4.1 Estudo da taxa de permeao em feridas cutneas de ratos


Preparao das amostras para a avaliao da atividade cicatrizante
Este estudo foi desenvolvido em parceria com os professores Dra. Eneri Vieira
de Souza L. Mello e Dr. Joo Carlos Palazzo de Mello e a doutoranda Fernanda
Bueno do Departamento de Farmcia (UEM). O tema tambm fez parte da
dissertao de mestrado da referida ps-graduanda [60].
Foram utilizados 20 ratos Wistar divididos em quatro grupos correspondente a
4, 7, 10 e 14 dias de tratamento. Neste perodo os animais foram mantidos em
gaiolas individuais no biotrio setorial do Departamento de Cincias Morfolgicas
(DCM) em condies laboratoriais padronizadas (temperatura de 221 C e umidade
relativa de 5010%) e, ciclo dia-noite de 12 h recebendo rao e gua.
Para a epilao dos animais e realizao das feridas, os mesmos foram
anestesiados com Rompum/Ketamina 1:1 (1 mg/kg).

Aps a assepsia do local,

utilizou-se um molde (punch) de 1 cm para marcar na pele a rea das feridas. Com
auxlio de tesoura realizou-se duas feridas, ou seja, com remoo da epiderme e
derme, como mostra a Figura 4.1.
Vinte e quatro horas aps a realizao das feridas, aquelas do lado esquerdo
receberam uma aplicao diria de uma frmula farmacutica gel contendo 1% de
extrato bruto obtido de cascas de C. peltophoroides. As feridas do lado direito
receberam o gel base sem a adio de extrato.

37

Figura 4.1. a) Feridas realizadas no dorso dos animais e b) punch utilizado para marcao
no dorso.

Aps 4, 7, 10 e 14 dias de tratamento, os animais foram injetados com


0,5mg/kg de sulfato de vincristina (Tecnocris1 mg/mL), um bloqueador do fuso
mittico, para estudo da proliferao celular. Duas horas aps a injeo os animais
foram mortos com uma sobre dose de anestsico.

Montagem experimental da espectroscopia fotoacstica


O arranjo experimental da espectroscopia fotoacstica para a regio do UVVis est esquematizado na Figura 4.2.
As medidas foram realizadas posicionando-se as amostras na clula,
conforme ilustrado na figura 4.2.a. Inicialmente a amostra foi posicionada com a
superfcie da ferida voltada para cima, onde a iluminao foi realizada e o espectro
fotoacstico determinado. Em seguida, a amostra foi girada de modo que o feixe de
luz atingisse a regio da derme, lado oposto aquele onde a formulao foi aplicada.
Esta estratgia garante detectar se houve penetrao da formulao atravs da
ferida.
Nesta montagem a fonte de luz uma lmpada de arco de Xennio da marca
Oriel, modelo 68820, com potncia de at 1000 Watts [W], e emisso no intervalo
entre 180 e 4.000 nanmetros (nm). O monocromador, modelo 77250 (1/8 m) da
marca Oriel, foi utilizado com fendas de entrada e sada ajustadas em 3,16
milmetros. A grade de difrao da marca Oriel, modelo 77296. Filtros foram
usados para se eliminar ordens superiores de difrao. A frequncia de modulao

38

da luz foi controlada por um modulador mecnico, modelo SR 540 da Stanford


Research Systems que, com um fotodiodo, fornece um sinal de referncia para o
amplificador Lock-in. As lentes da montagem devem fazer com que a amostra seja
excitada na regio do foco do feixe de luz, para que esta receba o mximo de
intensidade possvel. A luz atinge o interior da clula fotoacstica aps ser
transmitida atravs de uma janela de quartzo, j que este material transparente na
regio espectral de interesse, desde 190 nm at 4 m.
a)

b)

Figura 4.2. a) Representao do arranjo experimental da PAS para a regio do UV-Vis; b)


detalhe de um dos dois posicionamentos da amostra na clula, com a regio da ferida
voltada para cima. A medida tambm foi realizada com a excitao feita no lado da derme.

O microfone acoplado clula fotoacstica da marca Brel&Kjaer, modelo


BK 2669, e est conectado a uma fonte de alimentao e a um pr-amplificador. O
sinal do microfone transferido para o Lock-in (amplificador sincronizado) modelo
5110 da marca EG & G Instruments. O Lock-in fornece a intensidade e a fase do
sinal fotoacstico que so transferidos para um microcomputador via interface GPIB.
Como a lmpada no emite a mesma intensidade de luz em todos os comprimentos
de onda, o sinal normalizado pelo de referncia obtido de uma amostra de p de
carvo ultra puro.

39

4.2 Estudo fsico-qumico e histolgico de pulmo de camundongos


infectados com Paracoccidiodes brasiliensis.

Este estudo foi desenvolvido em parceria com as professoras Dr. Luzmarina


Hernandes do Departamento de Cincias Morfolgicas (UEM) e Dra. Terezinha Inez
Estivalet Svidzinski do Departamento de Anlise Clnicas e Biomedicina (UEM) e
com a mestre Edilaine Martins Moratto. O tema tambm fez parte da dissertao da
referida mestre [81].
Foi obtido um isolado de P. brasiliensis (Pb18) da coleo do Departamento
de Imunologia da Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP) e cultivado em
meio de cultura Fava Neto a 35 C no laboratrio de Micologia Mdica da
Universidade Estadual de Maring (UEM).
Foram utilizados 24 camundongos machos da linhagem Swiss e com um peso
mdio de 30 gramas. Com a idade entre 4 e 5 semanas os animais foram
transferidos do Biotrio Central de Animais da UEM para o Laboratrio de
Experimentao em Paracoccidioidomicose do Departamento de Anlises Clnicas e
Biomedicina da UEM. Os animais foram mantidos em condies ambientais
controladas, com uma temperatura de 23 a 24 C e um ciclo claro/escuro de 12
horas, com livre acesso gua e alimento.
Os camundongos foram distribudos em quatro grupos de seis e cada grupo
possua 1 animal controle. Os animais foram infectados, por meio da veia caudal
lateral, com 0,1 mL de suspenso fngica, contendo 2 10 6 clulas leveduriformes
de Pb18. Os animais controle receberam 0,1 mL de PBS (pH 7,4).
Animais de ambos os grupos, infectados e controles, foram mortos 1, 2, 4 e 8
semanas aps a inoculao, com uma sobre dose (3 vezes maior que a dose usual
de 40 mg/ kg) de tiopental sdico (Cristal Pharma BR) na veia caudal lateral. Aps a
remoo dos pulmes, o lobo superior esquerdo foi separado e fixado em soluo
de para-formaldedo 4% por 24 horas e processado para incluso em parafina.
Foram feitos cortes semi-seriados de 5 m de espessura. Os cortes foram corados
com H&E para avaliao histolgica, com Gomori-Grocott para identificao do
fungo e pelo mtodo imunohistoqumico de deteco in situ da fragmentao do
DNA (terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated UTP nickend labelling, TUNEL)
para avaliao da morte celular programada, utilizando o kit comercial ApopTag plus

40

peroxidase (Chemicon, Temecula CA, EUA). O lobo inferior e mdio direito de cada
pulmo foi encaminhado para anlise por FTIR-PAS.

Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier com deteco


Fotoacstica (FTIR-PAS)

A base de funcionamento desta tcnica o interfermetro de Michelson


(Figura 4.3), contendo um espelho mvel e outro fixo. medida que o espelho mvel
se desloca, o divisor de feixe direciona o feixe para os dois espelhos, gerando uma
diferena de caminho ptico para os feixes refletidos em ambos os espelhos, que ao
atingirem o detector estaro em diferena de fase, originando assim um
interferograma.

Figura 4.3. Modelo representativo do interfermetro de Michelson.

Nos Espectrmetros de Transformada de Fourier, o espelho mvel do


interfermetro oscila sobre sua posio. No modo step scan, a velocidade do
espelho interrompida com determinada frequncia de modulao e de amplitude.
Desta forma, a modulao de fase do sinal fotoacstico fornecida.

41

Figura 4.4. Representao esquemtica da FTIR-PAS.

Uma transformada de Fourier converte o sinal obtido no domnio do tempo


para o domnio de frequncias. Como no se usam monocromadores em
instrumentos FTIR, a totalidade da faixa de radiao chega simultaneamente na
amostra com grande ganho de tempo, permitindo resolues extremamente altas. O
resultado de vrias varreduras combinado para diminuir o rudo, e espectros
excelentes podem ser obtidos com pequena quantidade de amostra

[48]

Amodulao do sinal Fotoacstico assegurada pelo processador de


aquisio, que realiza uma transformada de Fourier, via software, originando um
espectro (Figura 4.4)

[82]

. Quando as ligaes qumicas dos componentes da

amostra oscilam nas mesmas frequncias da radiao IR incidente, uma banda de


absoro pode ser detectada

[82-84]

. O fato de que a tcnica fornece uma modulao

uniforme de frequncia para todos os nmeros de onda e, consequentemente, uma


inspeo uniforme de profundidade, representa a vantagem mais importante deste
mtodo. Ele d a capacidade de realizar perfis de profundidade controlveis da
amostra.

42

5. Resultados e discusso

5.1 Parte I - Espectroscopia fotoacstica para o estudo da difuso de


um extrato de Caesalpinia peltophoroides Benth. em feridas cutneas
A espectroscopia fotoacstica tem se mostrado um excelente mtodo para
avaliar a permeao de fitofrmacos na pele ntegra ou lesionada

[84]

. Neste estudo

avaliou-se por espectroscopia fotoacstica no UV-Vis se os componentes do extrato


bruto obtido de cascas de Caesalpinia peltophoroides Benth. (sibipiruna),
incorporado a uma forma farmacutica gel, foram capazes de atravessar a pele
excisionada. Foram analisados vrios perodos de tempo que caracterizam
diferentes estgios morfolgicos da cicatrizao.
A figura 5.1 mostra os espectros de absoro ptica do extrato bruto de C.
peltophoroides, do gel base, e do gel contendo 1% de extrato bruto. Nota-se que o
extrato bruto apresenta absoro intensa, com uma estrutura de bandas
superpostas em quase toda regio do UV-Vis.
O gel base quase no apresentou absoro ptica nesta regio espectral.
Aps a adio do extrato bruto de C. peltophoroides, 1%, ao gel, foram observadas
duas bandas nas regies de 280 e 380 nm. A partir de um tratamento matemtico
com ajuste utilizando funes gaussianas (Figura 5.2), foi possvel mostrar a
absoro do extrato bruto no gel base. Observa-se que existem trs picos, em 249,
295 e em 353 nm. Esta anlise possibilitou a identificao da formulao na pele,
como demonstrado mais adiante.

43

Sinal fotoacstico (u.a.)

0,6

Extrato bruto de C. peltophoroides


Gel de C. peltophoroides
Gel Base

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0
300

400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.1. Espectro de absoro ptica do extrato bruto de Caesalpinia peltophoroides


Benth., do gel base e do gel contendo 1% de extrato bruto.

Espectro de absoro ptica do gel de C. peltophoroides


Ajuste do espectro de absoro ptica do gel de C. peltophoroides
Absoro do gel base
Absoro do extrato bruto do gel de C. peltophoroides
Absoro do extrato bruto do gel de C. peltophoroides

Sinal fotoacstico (u.a.)

0,15

0,10
xc1
A1
xc2
A2
xc3
A3

0,05

249
10
295
3
353
2.8

2
1
2
1
1
0.1

0,00
250

300

350

400

450

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.2. Espectro de absoro ptica do gel de C. peltophoroides. Curvas gaussianas


ajustadas, associadas ao gel base (azul) e ao extrato bruto (verdes). A curva vermelha
representa o espectro total ajustado.

44

Para as anlises ex-vivo, as medidas foram realizadas nas amostras de pele


com feridas cutneas que receberam a aplicao tpica do gel base ou do gel de C.
peltophoroides. As medidas foram feitas iluminando-se a face epidermal, onde a
formulao foi aplicada, e tambm no lado da face dermal. A modulao da luz
incidente foi de 22 Hz. Os resultados esto mostrados nas figuras 5.3 e 5.4.
Os espectros das figuras 5.3 e 5.4 mostram que a absoro gerada pelo
extrato bruto ocorre em comprimentos de onda muito prximos daqueles que a pele
tambm absorve, entre 260 e 410 nm

[85]

. Isto dificultou a decomposio do espectro

principalmente porque a concentrao do extrato bruto no gel muito pequena, e


assim a intensidade do espectro foi determinada majoritariamente pela absoro da
pele e do sangue. Alm disso, as leituras dos espectros de absoro das feridas
cutneas dependem das quantidades de formulao aplicadas nas feridas.

0,20

0,20

Controle 4 dias
Controle 7 dias
Controle 10 dias
Controle 14 dias

Sinal fotoacstico (u.a.)

0,15

Tratado 4 dias
Tratado 7 dias
Tratado 10 dias
Tratado 14 dias
Gel de C. peltophoroides

0,15

0,10

0,10

0,05

0,05

0,00

0,00
300

400

500

600
-1

Nmero de onda (cm )

700

800

300

400

500

600

700

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.3. Espectros de absoro ptica da face epidermal: do lado esquerdo, as amostras
controles com aplicao tpica do gel base; do lado direito, as amostras tratadas com
aplicao tpica do gel de C. peltophoroides. A iluminao foi no lado da epiderme, com a
frequncia de modulao em 22 Hz.

A banda de absoro em torno de 400 nm, que no est presente no gel


base, no extrato bruto e nem no gel de C. peltophoroides, atribuda ao sangue
remanescente na rea lesada [85].

800

45

0,20

0,20

Controle 4 dias
Controle 7 dias
Controle 10 dias
Controle 14 dias

Sinal fotoacstico (u.a.)

0,15

Tratado 4 dias
Tratado 7 dias
Tratado 10 dias
Tratado 14 dias
Gel de C. peltophoroides

0,15

0,10

0,10

0,05

0,05

0,00

0,00
300

400

500

600

Comprimento de onda (nm)

700

800

300

400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.4. Espectros de absoro ptica da face dermal: lado esquerdo, amostras controles
com aplicao tpica no lado epidermal do gel base; lado esquerdo, amostras tratadas com
aplicao tpica no lado epidermal do gel de C. peltophoroides. A iluminao foi no lado da
derme, com a frequncia de modulao em 22 Hz.

Para ilustrar o processo de permeao na pele, foi feita a subtrao dos


espectros da derme da pele tratada com o gel de C. peltophoroides daqueles da
pele tratadas com gel base. Os resultados esto mostrados na Figura 5.5. Uma vez
que estas medidas foram realizadas no lado oposto em relao aquele onde o gel de
C. peltophoroides foi aplicado, a presena de bandas nos espectros subtrados, em
torno de 290 nm, indica que houve permeao da formulao atravs da ferida.
Nota-se que isto ocorreu mesmo aps 14 dias de tratamento.
Para quantificar a penetrao da formulao em funo dos dias de
tratamento, as curvas subtradas foram ajustadas com funes gaussianas,
mostradas na figura 5.6. O clculo da rea foi realizado tomando-se como referncia
a banda em torno de 290 nm, uma vez que ela proveniente do extrato bruto de C.
peltophoroides. Este procedimento foi feito em duplicata para cada dia de
tratamento. As reas mdias obtidas esto mostradas na figura 5.7, e revelam o
comportamento da permeao do frmaco na ferida do animal em funo do perodo
de tratamento.

- Subtrao dos espectros: derme tratada com a formulao - derme controle

46

0,05

4 dias
7 dias
10 dias
14 dias

0,04

0,03

0,02

0,01

0,00
250

300

350

400

450

500

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.5. Subtrao dos espectros da face dermal tratada com o gel de C. peltophoroides
pela face dermal controle, que teve aplicao tpica do gel base no lado epidermal.

- Subtrao dos espectros: derme tratada com a formulao - derme controle

0,020

4 dias
Ajuste da curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia
0,015
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3

0,010

7 dias
Ajuste da curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia

0,025

297
61
0.8
377
106
0.7
472
21
0.04

0,020

1
2
0.1
6
10
0.1
1
3
0.01

xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3
xc4
w4
A4

0,015

0,010

265
30
0.21
288
53
1.47
353
39
0.31
409
46
0.34

2
2
0.02
1
2
0.05
1
3
0.04
1
2
0.02

0,005
0,005

0,000
250

0,000
300

350

400

450

500

Comprimento de onda (nm)


10 dias
Ajute da curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia

0,04

250

300

350

400

450

500

Comprimento de onda (nm)

0,03

14 dias
Ajusteda curva da subtrao
Curva da gaussiana de referncia

0,03
xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3

0,02

291
38
1.59
331
25
0.15
362
40
0.42

1
1
0.02
1
1
0.02
1
1
0.02

xc1
w1
A1
xc2
w2
A2
xc3
w3
A3

0,02

287
41
1.29
354
47
0.32
422
35
0.22

1
1
0.02
1
2
0.01
1
1
0.01

0,01
0,01

0,00
250

300

350

400

Comprimento de onda (nm)

450

500

0,00
250

300

350

400

450

500

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.6. Curvas da subtrao dos espectros da face dermal tratada com o gel de C.
peltophoroides pela face dermal controle, ajustadas com funes gaussianas.

47

1.4

1.2

rea (u.a)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
4

10

12

14

Tempo (dias)

Figura 5.7. Comportamento da difuso do gel de C. peltophoroides nas feridas em funo do


perodo de tempo de tratamento.

As taxas de difuso de frmacos nas feridas so influenciadas pela evoluo


morfolgica decorrente do reparo. A reepitelizao um dos eventos mais
importantes da cicatrizao da pele porque tem a finalidade de reestabelecer a
funo de barreira deste rgo. Para avaliar a influncia de C. peltophoroides na
reepitelizao o nmero de mitoses bloqueadas em metfase num perodo de duas
horas foi determinado (Figura 5.8).

Figura 5.8. Representao da mdiaEPM do nmero de metfases contadas na camada


basal e suprabasal da rea reepitelizada das feridas com tratamento aos 4, 7, 10 e 14 dias.

48

A anlise estatstica foi realizada pelo teste estatstico ANOVA com *(P<0,05) em relao ao
dados da amostra controle. Medidas realizadas pela doutoranda Fernanda Bueno [60].

O nmero de metfases aumentou significativamente e progressivamente


aps 4 e 7 dias de tratamento com o gel de C. peltophoroides em comparao com
as feridas tratadas com o gel base. Paralelamente, nos perodos de 4, 7 e 10 dias a
quantidade de gel de C. peltophoroides detectado na face dermal aumentou
gradativamente e declinou aps 14 dias de tratamento das feridas. No 10 dia,
quando detectou-se a maior taxa de permeao, foi quantificado o menor nmero de
metfases (p<0,05) nas feridas tratadas com o gel de C. peltophoroides.
No processo de reepitelizao de feridas excisionais ocorre um pool inicial na
atividade proliferativa, com a finalidade de repor as clulas perdidas

[68]

. Segue-se

ento uma diminuio da proliferao dos queratincitos e aumento na atividade de


migrao, com a finalidade de cobrir o leito ferido

[68]

. Neste estudo, feridas tratadas

e controles apresentaram a mesma curva na evoluo da proliferao da epiderme.


O gel de C. peltophoroides apresentou um significativo efeito estimulatrio
sobre a proliferao epitelial. O maior pico proliferativo foi observado aps 7 dias de
tratamento, enquanto que nas feridas controle, sem estmulo medicamentoso, a
proliferao epitelial progrediu at o 10 dia. Este resultado sugere que o gel de C.
peltophoroides pode aumentar a velocidade de reepitelizao.

A reduo significativa no nmero de metfases no mesmo perodo em que


se observa a maior taxa de permeao do frmaco, 10 dia, conforme mostrado na
Figura 5.7, mostra que mesmo na presena de maior concentrao do frmaco, o
epitlio parece no ter perdido seu equilbrio cintico, ou seja, somente foram
produzidos o nmero de clulas necessrias para a restaurao da continuidade
epitelial, uma vez que observa-se neste perodo, um declnio significativo no nmero
de metfases.
A reepitelizao da pele um evento que envolve proliferao e migrao dos
queratincitos. Neste estudo a migrao no foi avaliada e por esta razo no
podemos afirmar se C. peltophoroides estimulou o processo de reepitelizao como
um todo. Mais estudos envolvendo a cintica da reepitelizao e a expresso de
fatores de crescimento contribuiriam para dar suporte aos nossos resultados.
Outra ponto que merece ateno neste estudo a elevada taxa de
permeao do extrato de C. peltophoroides detectada no 10 dia do reparo mesmo
com o reestabelecimento quase completo da continuidade epitelial. Neste caso trs

49

hipteses podem ser implicadas: a primeira sugere que a formulao tem elevado
poder de permeao; a segunda hiptese sugere que poderia ter ocorrido um atraso
na diferenciao dos queratincitos e consequentemente na queratinizao da
epiderme, permitindo desta forma que o gel permeasse com facilidade por um
perodo maior de tempo; e a terceira sugere uma reduo na vascularizao, o que
provocaria um retardo na absoro sistmica do medicamento que seria detectado
em maior concentrao na regio da ferida.
Pode-se observar na face epidermal (Fig. 5.3), nas amostras tratadas com o
gel de C. peltophoroides e nas amostras com o gel base, a presena de bandas
referentes hemoglobina. A hemoglobina oxigenada, ou oxi-hemoglobina, se
caracteriza pelo estado reduzido ou ferroso (Fe2+) do ferro inserido no grupo heme.
Entretanto, as contnuas reaes metablicas do organismo, entre elas a
cicatrizao, do organismo, liberam produtos qumicos com alto potencial oxidativo,
mudando o ferro da hemoglobina para o estado frrico (Fe3+) e formando a metahemoglobina [86-88].
A oxi-hemoglobina tem absores especficas em 540 e 577 nm, a metahemoglobina tem dois comprimentos de ondas com maior intensidade de absoro
em 500 nm e em 630 nm [87-88].
A figura 5.9 mostra que os espectros das amostras controles e tratadas, aps
quatro dias de tratamento, apresentam trs bandas de absoro ptica de baixa
intensidade, em 540 e 570 nm atribudas oxi-hemoglobina e em 630 nm metahemoglobina.

0.30

0.20

Controle 4 dias
Tratado 4 dias

Controle 4 dias
Tratado 4 dias

Sinal Fotoacstico (u.a.)

Sinal Fotoacstico (u.a.)

0.25

0.20

0.15

0.10

0.15

Duplicata
0.10

0.05

0.05

0.00
250

300

350

400

450

500

550

600

650

Comprimento de onda (nm)

700

750

800

0.00
250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.9. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps quatro dias de tratamento. Os espectros do lado direito referemse s duplicatas.

50

Aos 7 dias, nas feridas controle, foram observadas as maiores bandas de


absoro para oxi-hemoglobina (Figura 5.10). Este perodo do processo cicatricial se
caracteriza pela ocorrncia de um pico de vascularizao na regio da ferida

[85]

. As

feridas controles e tratadas de 10 dias apresentaram bandas semelhantes de oxihemoglobina com destaque neste perodo, para um aumento na banda de absoro
ptica em 630 nm, da meta-hemoglobina nas feridas tratadas com gel de C.
peltophoroides. Aos 14 dias as bandas de absoro foram menos intensas do que
aos 10 dias. Neste perodo as intensidades para oxi-hemoglobina e metahemoglobina foram maiores nas feridas tratadas com o gel de C. peltophoroides.
A formao de meta-hemoglobina, como dissemos antes, est relacionada
com a oxidao do Fe2+ da oxi-hemoglobina, que passa para Fe3+. A maior presena
de meta-hemoglobina nas feridas tratadas poderia estar relacionada com a
formulao do gel de C. peltophoroides, sendo, provavelmente, induzida pelos
nitratos presentes na planta, que absorve esta substncia do solo, resultando no
processo de nitrificao transformando nitrato em nitrito [89-90].
0.20

Sinal Fotoacstico (u.a.)

Sinal Fotoacstico (u.a.)

Tratada 7 dias
Controle 7 dias

Tratada 7 dias
Controle 7 dias

0.20

0.15

0.10

0.05

0.15

Duplicata
0.10

0.05

0.00

0.00
250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Comprimento de onda (nm)

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.10. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps sete dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se
s duplicatas.

O mecanismo bioqumico de oxidao da hemoglobina pelo nitrito no est


ainda totalmente esclarecido

[91]

. Provavelmente ocorra a passagem do nitrito a

nitrato, juntamente com transformao da oxi-hemoglobina em hidrxido de metahemoglobina e reduo da gua, conforme a equao:

(5.1)

51

0.25

0.20

Controle 10 dias
Tratado 10 dias

Controle 10 dias
Tratado 10 dias
Sinal Fotoac stico (u.a.)

Sinal Fotoacstico (u.a.)

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00
250

Duplicata

0.15

0.10

0.05

0.00

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

250

800

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Comprimento de onda (nm)

Comprimento de onda (u.a.)

Figura 5.11. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps 10 dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se s
duplicatas.

0.25

0.25

Controle 14 dias
Tratado 14 dias

Controle 14 dias
Tratado 14 dias
0.20

Sinal Fotoacstico (u.a.)

Sinal Fotoacstico (u.a.)

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00
250

Duplicata
0.15

0.10

0.05

300

350

400

450

500

550

600

650

Comprimento de onda (nm)

700

750

800

0.00
250

300

350

400

450

500

550

600

650

700

750

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 5.12. Espectro de absoro ptica da face epidermal controle e da tratada com o gel
de C. peltophoroides aps 14 dias de tratamento. Os espectros do lado direito referem-se s
duplicatas.

Estes resultados sugerem que ao se monitorar as bandas do sangue, pode-se


obter a informao da hemoglobina na transformao do seu estado oxigenado (oxihemoglobina) para o estado oxidado (meta-hemoglobina).

52

5.2 Parte II FTIR-PAS como mtodo de estudo da Paracoccidioidomicose


A Figura 5.13 mostra o espectro de absoro ptica do tecido do pulmo do
camundongo Swiss sem infeco. A atribuio de cada banda de absoro ptica
est indicada na tabela 5.1.
As bandas identificadas nos nmeros de onda ~1087 cm-1 e 1242 cm-1 so
originadas, respectivamente, de ligaes simtricas e assimtricas do estiramento
das vibraes de ons dos grupos fosfato, que fazem parte do DNA. Para a amida I
foi em 1681 cm-1 e para a amida II em 1527 cm-1. No caso do grupo CH3 ocorre em
~1450, 2854, 2924 cm-1, e para o C-C/C-O em ~972 cm-1, correspondente ao grupo
funcional da desoxirribose-ribose [92-94].

700
Pulmo controle

Sinal Fotoacstico (u.a.)

600

-1

2924 cm

-1

2854 cm

500

-1

1242 cm
-1

1450 cm

-1

1398 cm

-1

1087 cm

400

-1

1527 cm

-1

972 cm

300

-1

3672 cm

-1

-1

1743 cm

1681 cm

-1

2360 cm

200

100

0
4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

500

-1

Nmero de onda (cm )

Figura 5.13. Espectro de absoro do pulmo do camundongo Swiss controle.

53

Tabela 5.1. Atribuies para as posies dos picos do espectro no infravermelho

Posi
o
doPico
(cm-1)
3672

Atribuio

Maior
contribuio

Referncias

Amina, N-H, OH Livre

Protenas

Karippalet al., 2010 [95].

2924

CH2anti-simtrico

Protenas e
Lipdios

Wartewiget al,2005 [96].

2854

CH2 simtrico

Protenas e
Lipdios

Wartewiget al,2005 [96].

2360

CO2

Protenas

1743

C=O
Vibrao em
estiramento
Amida I
(C=O,C - N, C-C, N-H)

Protenas

Taraschewskiet al., 2005


[97]
.
Afanasyevaet al., 2000 [98].

Protenas

Brooks et al., 1999 [99].


Afanasyeva et al., 2000 [98].
Salman et al., 2003 [100].
Yang et al., 2009 [101].

1527

Amida II
(N-H, C-N,CN-H)

Protenas

Brooks et al., 1999 [99].


Afanasyeva et al., 2000 [98].
Yang et al., 2009 [101].

1450

CH3anti-simtrico

Fosfolipdios

Yang et al., 2009 [101].

1398

Grupo COO-

Protenas

Sindhuphak et al.,2003 [102].


Yang et al., 2009 [101].

1234

cidos
Nuclicos

Salman et al., 2003 [100].


Yang et al., 2009 [101].

1087

PO2- antisimtrico(grupo do
fosfato)
PO2- simtrico

cidos
Nuclicos

Salman et al., 2003 [100].


Yang et al., 2009 [101].

972

C-C/C-O

Desoxirribos Zelig et al., 2009 [103].


Di Giambattista et al., 2011
e-ribose
[104]
.

1681

A Figura 5.14 mostra os espectros das amostras do pulmo aps 1, 2, 4 e 8


semanas de infeco com a frao Pb18. Os espectros esto normalizados pela
banda da amida II, em 1527 cm-1, e que corresponde, principalmente, flexo no

54

plano do grupo funcional N-H presente no grupo amida das protenas

[105]

. Esta

banda foi adotada como referncia porque apresentou a menor variao ao longo do
perodo de tempo aps a infeco. Para minimizar fatores como o tamanho e
umidade da amostra, que podem influenciar na amplitude do sinal fotoacstico,
foram calculadas as razes entre as intensidades das bandas de absoro no
prprio espectro. Paralelamente, as mudanas espectrais foram relacionadas com
as observaes histolgicas.
Nos pulmes dos camundongos infectados com Pb foram encontradas
mudanas conformacionais nas seguintes regies do espectro de absoro: amida I
(1681 cm-1), CH3 (1450 cm-1), fosfato assimtrico (1242 cm-1) e grupo C-C/C-O (972
cm-1).
A razo amida I/amida II mostra as alteraes ocorridas na amida I em funo
da amida II no decorrer do perodo experimental, caracterizada por uma reduo na
2 semana, seguido de um aumento at a 8 semana (Figura 5.15). O aumento da
razo amida I/amida II poderia estar relacionado com a maior quantidade de
colectinas, que so protenas do surfactante pulmonar que tm a capacidade de
fazer ligao com molculas de superfcie expressas por microorganismos, e de
modular

vrias

funes

do

sistema

mononuclear

internalizao e morte dos microorganismos

[106]

fagocitrio,

incluindo

Neste trabalho as colectinas no foram quantificadas, mas a resposta


inflamatria foi monitorada e apresentou uma evoluo temporal, na qual, a resposta
imune foi levemente mais acentuada na segunda semana, em relao primeira
(Figura 5.16 - E.1). Nos dois perodos avaliados, a maior parte das leveduras se
localizou no parnquima e uma menor quantidade de fungos fragmentados ocupava
o interior de macrfagos (Figura 5.16 - E.2). A resposta inflamatria se intensificou
ao longo da quarta e oitava semanas, com o aumento da celularidade localizados no
parnquima pulmonar. Na oitava semana foram observados grandes nmeros de
macrfagos com fragmentos de Pb fagocitados (Figura 5.16 - E.3 e E.4).

55

3.5

Controle
1 Semana
2 Semana
4 Semana
8 Semana

Sinal Fotoacstico (u.a.)

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-1

Nmero de onda (cm )

Figura 5.14. Espectro FTIR-PAS do pulmo de camundongo Swiss infectado com Pb18,
aps 1, 2, 4 e 8 semanas.

1.4

Razo Amida I (1681 cm-1) / Amida II (1535 cm-1)


1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0

Perodo (semanas)

Figura 5.15. Razo entre as intensidades das bandas de absoro ptica: amida I/amida II.

56

Figura 5.16. Fotomicrografia de pulmes de camundongos Swiss infectados com Pb18. E.1
e E.2 aps 2 semanas. E.3 e E.4 aps 8 semanas. E.1 e E.3 corados por H&E, E.2 e E.4
corados por Gomori-grocott. Aumento Original: 100x. Estas medidas foram realizadas pela
[81]

mestre Edilaine Martins Moratto

Dessa forma, considerando que os macrfagos so as clulas mais


envolvidas na defesa contra Pb

[107]

, podemos inferir indiretamente que a evoluo

da razo amida I/amida II, que tem sido relacionada com o aumento do teor de
protenas

[101]

, acompanhou aquela do processo inflamatrio, observado por meio

das tcnicas histolgicas.


A Figura 5.17 mostra a razo CH3/amida II na qual observa-se que houve um
declnio do grupamento CH3 em funo da amida II. Vibraes de estiramento em CH3 (~1450 cm-1) correspondem aos fosfolipdios

[101]

. A reduo dos fosfolipdios

pode estar relacionada ao aumento da fosfolipase B, enzima que hidrolisa as


ligaes ster presentes nos fosfolipdios, um dos fatores de virulncia de Pb
necessrio para eventos iniciais da infeco

[108]

. Entretanto, a fosfolipase est

envolvida na modulao da resposta imune inata e adquirida


regulao da ativao de macrfagos

[108]

[109]

, contribuindo na

. Dessa forma, a hiptese a de que a

reduo progressiva do radical CH3 corresponderia diminuio progressiva de

57

molculas de fosfolipdios, resultante do contnuo aumento da fosfolipase, que por


sua vez representa um reflexo direto da evoluo da infeco e indireto da resposta
inflamatria.

1.4

Razo CH3 (1450 cm-1) / Amida II (1535 cm-1)


1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0

Perodo (semanas)

Figura 5.17. Razo da intensidade da banda do grupo CH3 em relao a grupo da amida II.

A razo fosfato assimtrico (1234 cm-1) em funo da amida II (1535 cm-1)


est ilustrada na Figura 5.18. A diminuio do fosfato assimtrico foi relacionada
anteriormente com o aumento de morte celular programada

[110]

. A avaliao

qualitativa do pulmo corado para TUNEL demonstrou uma maior quantidade de


clulas TUNEL-positivas nas 1 e 4 semanas de infeco, perodos nos quais foram
observadas as menores razes fosfato/amida II.
A intensidade de aboro nas vibraes de fosfato assimtrica permite avaliar
mudanas qualitativas e quantitativas nos fosfolipdeos e cidos nucleicos

[111]

. O

estudo in situ de clulas cancerosas, por espectroscopia de reflectncia total


atenuada (FTIR-ATR), tem revelado que no processo de apoptose ocorre um
decrscimo na razo fosfato/protena

[101]

. Alm disso, a apoptose tem sido

identificada por meio de observao da reduo da quantidade de fosfato em


fibroblastos malignos utilizando a razo da mdia das bandas de absorbncia dos
grupos fosfato assimtrico (1151-1350 cm-1) em relao amida Il [100].

58

A diminuio dos grupamentos C-C/C-O (970 cm-1) (Figura 5.18) tm sido


relacionada com a mudana na absorbncia de DNA e aumento de morte celular
programada

[102]

, a mesma forma, a diminuio na absoro de ribose (C-O) foi

relacionada com o aumento na frequncia de apoptoses [104].


As oscilaes na frequncia de clulas TUNEL-positivas podem estar
relacionadas com variaes na intensidade de infeco, de acordo com a resposta
imunolgica do hospedeiro. Observamos picos de infeco mais intensos com maior
frequncia de clulas em apoptose, na 1 e 4 semanas. Na 2 e 8 semanas,
haviam menos clulas marcadas (Figura 5.19).

1.4

Razo Fosfto (1234 cm-1) / Amida II (1535 cm-1)


Razo Grupo C-C/C-O (972 cm-1) / Amida II (1535 cm-1)

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
0

Perodo (semanas)

Figura 5.18. Em preto: razo do grupo fosfato pela Amida II; em azul: razo do grupo C-C/CO pela Amida II.

Dessa forma, conclui-se que o pulmo infectado por Pb apresentou alteraes


estruturais que variaram de acordo com o perodo de tempo analisado e que as
mudanas nas bandas de absoro ptica de vrios grupamentos qumicos foram
uma consequncia dessas alteraes morfolgicas. At onde se sabe essa a
primeira

vez

que

foi

utilizado

FTIR-PAS

como

mtodo

de

estudo

da

paracoccidioidomicose experimental. Nossos resultados sugerem que este mtodo


pode se tornar uma tcnica promissora para o estudo desta patologia.

59

Figura 5.19. Fotomicrografia de cortes histolgicos do pulmo de camundongos Swiss


infectados por Pb18 corados por TUNEL e contra-corados por Hematoxilina de Meyer
evidenciando clulas em apoptose. H.1(20x) e H.2(100x) na primeira semana e H.3(100x) e
H.4(100x) na quarta e oitava semana, respectivamente. Estas medidas foram realizadas
pela mestre Edilaine Martins Moratto [81].

60

Concluses

Em concluso, os resultados do primeiro estudo mostraram que a taxa de


difuso da formulao de C. peltophoroides foi dependente do estgio de
cicatrizao das feridas. A tcnica PAS foi eficaz em demonstrar o potencial de
permeao do gel de C. peltophoroides em feridas excisionais em diferentes etapas
da cicatrizao. A maior taxa de permeao ocorreu no 10 o dia de tratamento,
perodo em que tambm foi observado um aumento na banda de absoro ptica da
meta-hemoglobina. No segundo estudo, a avaliao fsico-qumica mostrou que os
pulmes infectados com Pb apresentaram mudanas significativas nos grupos
funcionais amida I, CH3 e fosfato, e que as mudanas nas bandas de absoro
ptica foram uma consequncia das alteraes morfolgicas ocorridas no pulmo
infectado.

Essas mudanas foram correlacionadas com a ocorrncia de morte

celular programada. Portanto, os resultados deste trabalho mostraram mais uma vez
que a espectroscopia fotoacstica uma tcnica importante para se determinar a
difuso de formulaes em sistemas biolgicos, permitindo que se faa,
especificamente na cicatrizao cutnea, uma correlao entre a taxa de difuso e
os eventos biolgicos do processo cicatricial. A tcnica FTIR-PAS mostrou grande
potencial para anlise de alteraes fsico-qumicas em sistemas biolgicos sem a
necessidade de reagentes ou manipulao da amostra, indicando que esta tcnica
pode tornar-se promissora para o estudo dos mecanismos fsico-qumicos
envolvidos nos processos que resultam em apoptose.

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ANEXO I

75