ARTIGO DE REVISO/ REVIEW ARTICLE

Metodologias para identificar adulterao em queijos produzidos

com leite de diferentes espcies de animais
Methodologies for identifying the adulterants in cheese manufactured with
milk from different animal species
RIALA6/1226
1*

Sabrina da Silva DIAS , Vernica LOBATO , Marta Regina VERRUMA-BERNARDI

*Endereo para correspondncia: Rua Geraldo Matos Moreira, 50 - Campo Grande, Rio de Janeiro,

RJ, Brasil, CEP: 23087-170

1

UFRRJ, Seropdica, RJ, Brasil

Departamento de Tecnologia de Alimentos, UFRRJ, Seropdica, RJ, Brasil.
3
Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Scio-Economia Rural, DTAiSER/CCA/UFSCar, Araras, SP, Brasil.
Recebido: 27.05.2009 Aceito para publicao: 08.11.2009
2

RESUMO
A adulterao de produtos lcteos pode ocorrer de diferentes formas. A diversidade de produtos e os seus
valores agregados estimulam a fraude, que lesam os consumidores em relao as caractersticas sensoriais,
nutricionais e preo. Diversos mtodos podem ser utilizados para identificar as fraudes, pela avaliao dos
distintos componentes do leite. O objetivo da presente reviso de apresentar e discutir os mtodos de
referncia utilizados na anlise de adulterao de queijos baseados na avaliao de diferentes protenas do
leite e de suas respectivas espcies de animais dos quais originam o leite.
Palavras-chave. vigilncia sanitria de produtos, controle e fiscalizao de alimentos e bebidas, alimento,
laticnios, queijo.
ABSTRACT
Dairy products adulteration may be done by different ways. The diversity of products and their
compound values favor to be deceived, and consequently cheat the consumers as for their sensory and
nutritional characteristics and price. Several methodologies can be used for identifying adulterants in
cheeses based on varied milk components. This review aimed to comment upon and discuss the reference methodologies employed for analyzing adulterated cheese based on the different milk proteins and
the respective animal species from which the milk was originated.
Key words. sanitary surveillance of products, control and surveillance of foods and drinks, food, dairy
products, cheese.

INTRODUO
Estudos tm demonstrado que produtos lcteos durante dcadas vm sofrendo adulteraes de diferentes
formas: adio de gua, soro, retirada de componentes, mistura de leite de diferentes espcies, adio de espessantes
e etc. O mercado oferece uma infinidade de produtos atendendo aos interesses especficos de cada consumidor, com
preos variados. Esses consumidores buscam qualidade e produtos mais saudveis e prezam pela confiana de que esto
levando o que especificado no rtulo. Nas embalagens, a origem dos ingredientes utilizados para a fabricao deve
ser relatada, pois a adio no mencionada de ingredientes fere o direito do consumidor e a legislao vigente.
So considerados matrias-primas ou produtos fraudados aqueles que apresentem modificaes espontneas
ou propositais de natureza fsica, qumica ou biolgica que alterem caractersticas sensoriais, ou sua composio

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intrnseca, comprometendo seu valor nutritivo. Assim, o

produto pode ser considerado adulterado quanto tenha
sido empregada substncia de qualquer qualidade, tipo ou
espcie diferente das expressas na formulao original1.
O Cdigo Penal Brasileiro especifica a definio
de adulterao no captulo III Dos crimes contra a sade
pblica, no artigo 272, Corromper, adulterar, falsificar ou
alterar substncias de produtos alimentcios destinados ao
consumo, tornando-o nocivo sade ou reduzindo-lhe
o valor nutritivo, com pena de recluso, de 4 a 8 anos e
multa2.
O Ministrio da Agricultura (MAPA), Agncia de
Vigilncia Sanitria (ANVISA) e o Cdigo de Defesa do
Consumidor respaldam o consumidor na hora de exigir
as caractersticas dos produtos oferecidos no comrcio do
pas. A RDC (Resoluo da Diretoria Colegiada) no 259,
de 20 de setembro de 20023, o Decreto-lei no 986, de 21
de outubro de 19694, e Portaria no 157, de 19 de agosto de
20025, discriminam os componentes presentes nos rtulos
das embalagens de produtos de origem animal e lcteos.
A rotulagem deve estar de acordo com a elaborao do
produto, sua origem, peso, marca, denominao de venda,
sendo obrigatrios a lista de ingredientes, a validade e
o lote. Dessa forma a lei no 8078, de 11 de setembro de
19906, que se refere ao cdigo de defesa do consumidor,
ampara o consumidor de possveis alteraes provocadas
pelo produtor na rotulagem, levando a interpretaes
duvidosas quanto aos componentes originais, sendo
um direito bsico do consumidor, a informao clara,
adequada, com especificaes corretas da quantidade

e qualidade do produto, alm da proteo contra a

publicidade enganosa no produto final.
Os produtos lcteos de caprinos, ovinos e bubalinos, alm de representarem iguarias especiais, em
relao s caractersticas sensoriais, como aroma e sabor,
apresentam relao com razes nutricionais, econmicas
e religiosas7.
As flutuaes na disponibilidade do leite de outras
espcies e o preo mais elevado em comparao ao bovino
incentivam os produtores a fraudarem produtos como
queijos 8.
Para detectar as possveis fraudes, mtodos de
referncia podem ser utilizados se baseando na anlise
das diferentes protenas do leite, casenas e protenas
do soro. So mencionados na literatura mtodos de
eletroforese, imunologia, cromatografia e espectroscopia
de infravermelho, que muitas vezes, alm de identificarem
a diferena entre os produtos, quantificam a mistura de
forma confivel e sensvel.
A casena, principal protena do leite, pode
ser separada em quatro grupos: casenas , , e ,
apresentando diferenas simples na sua cadeia base de
cidos nuclicos9, segundo a espcie de origem, como
pode ser exemplificado na Figura 1.
Esta reviso teve como objetivo abordar os
mtodos para identificao de adulterao por adio
de leite de diferentes espcies em queijos, baseados
nas diferenas das casenas entre as espcies, como
representado na Tabela 1, visando garantir a qualidade e
segurana dos produtos adquiridos pelos consumidores.

Figura 1. Diferenas na seqncia multiplex da casena no leite segundo a espcie de origem.

Fonte: REALE et al, 200819

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Tabela 1. Mtodos aplicados anlise de adulterao por tcnicas proticas

Mtodos de identificao
Eletroforticos

Imunoenzimtico
ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay)

Reao em Cadeia da
Polimerase (PCR)

Espectroscopia
Infravermelho
HPLC
(Highperformance Liquid
Chromatography)

Protena analisada

Gel de Poliacrilamida com sdio

dodecil sulfato (SDS - PAGE)
Gel de Poliacrilamida com Uria
(Uria - PAGE)
Bidimensional (2D-PAGE)
Focagem isoeltrica (IEF)
Elisa
Anticorpos
Indireto
Monoclonais
Elisa
Anticorpos Policlonais
Sanduche

Multiplex
Simplex
Duplex
SYBR Green Real Time
(restrio enzimtica)
SSCP ( Single- Stranded
Conformation Polymorphism)
RFLP ( Restricion Fragment Length
Polymorphism)
Near Infrared spectroscopy
IE-HPLC (on Exchange HPLC)
RP-HPLC (Reverse phase HPLC)

MTODOS IMUNOLGICOS

Diversos mtodos imunolgicos, para deteco

de casena bovina, podem ser encontrados na literatura10.
No incio dos anos 70, o desenvolvimento de tcnicas
imunolgicas que utilizavam a enzima como marcador
tornou esses testes aplicveis a alimentos8.
A tcnica imunolgica est baseada na presena de
antgenos e anticorpos em uma amostra, no caso, fraes
especficas de protenas do leite bovino. Como anticorpos,
so utilizados os monoclonais, (clulas homogneas
derivadas de uma clula produtora de anticorpos, onde
todos os anticorpos possuem a mesma especificidade
necessria para um antgeno), ou policlonais (clones
de clulas nicas propagadas em meio de cultura com
uma nica especificidade), altamente especficos, que
ao reagirem formam um complexo antgeno-anticorpo
precipitado11. Segundo Hurley (2004)12 o tipo de anticorpo

- casena

Referncia
47, 45,32

1 casena
2 casena
- casena
Para- casena
- casena

10, 12, 17, 18, 48

- casena
2 - casena
casena
IgG
DNA mitocondrial

24, 28, 19, 26, 23, 21, 22,

27, 25

Clulas Somticas
Leuccitos
Epitliomamrio
- casena

44, 39, 40, 38

- casena
1 casena
s2 casena
- casena
casena

45, 47, 46

utilizado pode alterar a eficincia do ELISA: os anticorpos

policlonais podem ser menos especficos que os anticorpos
monoclonais. Segundo Benjamini (2002)11, esse fato pode
ser devido reao cruzada de anticorpos policlonais,
onde essas clulas, tendo especificidade um pouco menor,
reagem com duas molculas que apresentam o mesmo
antgeno, mas que so diferentes em outros aspectos.
Embora haja outras tcnicas para anlise de adulterao baseada na determinao de protenas, o mtodo
imunolgico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
assay ou Ensaio de Imunoabsoro ligado enzima)
mantm-se como alternativa vivel devido a sua
simplicidade, baixo tempo de elaborao, especificidade
e sensibilidade13, alm de no requerer equipamentos
especializados14. Para Richter (1997)10, o ELISA indireto
apresenta sensibilidade de 1 10% em leite ou queijo, e
o ELISA sanduche apresenta limite de deteco de 0,5%
na mistura desses mesmos produtos.

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O teste ELISA est caracterizado como imunoensaio de fase slida e aproveita a propriedade dos plsticos
de adsorver protenas na superfcie em forma de camada
nica, permitindo que a maioria do antgeno possa reagir
com anticorpos correspondentes, marcados com uma
enzima que poder ser detectada por colorimetria quando
adicionado substrato 11.
Existem duas variaes para o teste ELISA,
segundo Asensio et al. (2008) 14: o ELISA indireto,
utilizando dois anticorpos, um especfico ao antgeno e
outro conjugado enzima. Neste, o segundo anticorpo
dar a reao enzimtica, que quando presente poder
ser observada e quantificada por diferentes tcnicas.
Na segunda forma mais utilizada, o ELISA sanduche, o
antgeno colocado entre dois anticorpos, para deteco
e captura do anticorpo e um dos anticorpos estar
conjugado com a enzima para que possa ser analisada a
formao do complexo, por tcnicas como cromatografia,
fluorescncia e densitometria. Dessa forma, os testes
ELISA podem apresentar resultados de forma qualitativa
e quantitativa.
Os testes imunolgicos so baseados, principalmente, na casena como antgeno, devido a sua estabilidade
a tratamentos trmicos15,16, o que possibilita a utilizao
destes em anlises de produtos lcteos pasteurizados12. As
principais fraes da casena analisadas so as casena,
- casena, s2 casena, - casena e a imunoglobulina
IgG10,12,1718. O limite de deteco desses marcadores pode
detectar at 0,1% de antgeno bovino em leite de outras
espcies12.

Os primers padres, para anlise da sequncia

amplificada podem ser produzidos atravs de anlise
do sangue dos animais alvos ou consultando bibliotecas
virtuais como GenBank Database, no site (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)21,19,22 e HUSAR (http://genome.
dkfz-heidelberg.de/menu/husar)23.
Essa tcnica apresenta sensibilidade alta, de acordo
com Feligini et al (2005)21, no nvel de 0,5% de mistura de
espcies, podendo chegar a 0,1% de limite de deteco22,
para Maskov & Paulickov (2006)7 essa sensibilidade no
ultrapassa o limite de 1% de mistura. Sua alta sensibilidade
e especificidade na anlise de adulteraes compensam
o preo alto da tcnica, sendo amplamente utilizada na
Europa.
Diferentes tcnicas podem ser utilizadas na
ampliao desses fragmentos de DNA como: MultiplexPCR24,22,21,19, Simplex-PCR24, SSCP- PCR (Single-Stranded
Confromation Polymmorphis, analysis)23,25, DuplexPCR26,27, SYBR-Green Real-Time- PCR21 e RFLP PCR
(Restriction Fragment Length Polymorphism)24,25.
A identificao dessas espcies utiliza a tcnica de
eletroforese, mas comumente, com gel de agarose24,22,21,19,26,28
e em alguns casos gel de poliacrilamina23.
Tcnicas como SSCP e RFLP-PCR, possibilitam
analisar sequncia de DNA que podem sofrer polimorfismo
gentico como no caso da - casena e - casena, que
apresentam formas distintas, a - casena A e B e casena K2 e KY, que apresentam corrida diferente na
anlise por eletroforese. No leite de bfala esta variao
rara, porm abundante no leite bovino29,30.

MTODOS BASEADOS EM DNA

MTODOS ELETROFORTICOS

A tcnica de PCR (Polymerase chain Reaction ou

Reao em cadeia da polimerase) baseia-se na anlise de
DNA, amplificando fragmentos de DNA mitocondrial
de clulas somticas, leuccitos, clulas mamrias e casena19.
possvel extrair DNA de produtos lcteos
processados utilizando primers (Oligonucleicos
especficos), codificando a sequncia do gene desejado,
amplificando e identificando por eletroforese8.
Essa tcnica possibilita que sequncias de DNA
sejam multiplicadas em milhes de cpias, facilitando
sua anlise gentica, aumentando a sensibilidade,
especificidade e analisando um grande nmero de
amostras simultaneamente. Esse processo se assemelha
ao processo de replicao de clulas vivas20.

A eletroforese vem do grego transporte por

eletricidade, onde as protenas migram submetidas a um
campo eltrico, as cargas positivas e negativas so atradas
para seus plos contrrios correspondentes e assim sendo
possvel sua separao e identificao. Alm de sua carga,
sua forma, tamanho e associao com outros ons, podem
alterar sua mobilidade31.
Essa tcnica apresenta alta sensibilidade, porm
com percentuais distintos conforme o tipo, segundo
Egito et al.(2006) 32, o mtodo Ureia-PAGE (Gel de
poliacrilamina contendo ureia) pode detectar em torno
de 2,5% de adio de leite bovino em outras espcies e 1%
de leite misturado atravs do mtodo de IEF (Isoelectric
Focusing ou Focalizao Isoeltrica). Dennis (1998)33,
utilizando EC (Eletroforese Capilar) relata limite de

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deteco de fraude ao redor de 2,5%, empregando o modo

de separao Ureia-PAGE e Borkov & Snaselov (2005)13,
atravs de IEF, relataram a possibilidade de deteco de
0,5% e 1% de adio de leite por fraude. Esta diferena
de sensibilidade est no tipo de separao das protenas
nos diferentes meios, dessa forma o objetivo da separao
indicar o tipo de eletroforese selecionado.
O mtodo de Ureia-PAGE separa por diferena na
carga eltrica e o SDS- PAGE (Gel de Poliacrilamida com
sdio dodecil sulfato) por tamanho da molcula, esses dois
tipos podem separar por grupos de protenas e variaes
genticas32,34. Na IEF, os diferentes pontos isoeltricos,
onde a carga dos compostos nula, determinam a
individualidade das casenas em gradiente de pH desejado.
Sendo este um mtodo oficial para a Unio Europeia,
onde a EC 213/200135, anexo XV, especifica a metodologia
para identificao de adulterao analisando - casena,
podendo ser utilizada em produtos lcteos processados
e crus13.
Na eletroforese capilar, a separao feita por
diferena na carga das protenas analisadas, tcnica
tambm conhecida como Eletroforese Capilar em Zona
(CZE)36,37. Na eletroforese bidimensional, h separao das
protenas de idntico massa molar, porm com diferentes
pontos isoeltricos, e vice-versa, pois soma a separao
pelo mtodo SDS-PAGE com a IEF31.
MTODOS ESPECTROSCPICOS

Nos ltimos anos, uma nova tcnica para

determinao de protenas se apresentou como alternativa
para anlise na indstria de alimentos. A espectroscopia
de infravermelho pode ser utilizada para identificao de
componentes do alimento, assim como sua quantificao,
tendo a vantagem de ser um mtodo rpido, podendo
chegar a 400 amostras/h, com custo moderado de
equipamentos, facilidade de preparao da amostra,
podendo ser realizada muitas vezes no alimento ntegro38,39.
Este mtodo analisa vrios parmetros ao mesmo
tempo, podendo separar protena,, casena e protena do
soro40, lipdios, lactose, cinzas, entre outros41, alm de
verificar vrios tipos de adulterao, como no relato de
Sato et al (1990)42 onde a mistura de gordura animal e
vegetal puderam ser analisadas em manteiga, Frankheizen
(1992)43 analisou o tempo de maturao de queijo Edam e
Gouda com at sete meses, j que estes so vendidos com
preo decorrente do seu tempo de maturao. GonzlezMartin et al. (2007)44 analisaram o percentual de adio

de leite de diferentes espcies ao longo de seis meses de

maturao, sendo possvel detect-los com segurana, aps
este perodo, se mostrando uma alternativa no combate
a adulterao de queijos maturados em comparao
com HPLC que analisa com limite de 4 a 8 semanas de
maturao.
A tcnica para anlise das matrias-primas de
diferentes espcies se baseia nos diferentes picos espectrais
apresentados pelas protenas das distintas espcies aps
sofrerem isolamento, com alterao de pH, dessa forma
uma anlise estrutural dos grupos funcionais presentes
em determinadas regies do espectro, a partir de seus
perfis caractarsticos, podem ser quantificados atravs de
curvas analticas38.
MTODOS CROMATOGRFICOS

Tcnicas de cromatografia lquida (HPLC) esto

entre as tcnicas para separao de protenas, as mais
utilizadas so RP-HPLC (Reverse- phase High Pressure
Liquid Chromatrography ou cromatografia de fase
reversa), onde as substncias so separadas devido a
diferena de hidrofobicidade, e IE-HPLC (on Exchange
HPLC ou Cromatografia de troca inica), onde a
separao se baseia na diferena de afinidade dos ons com
a coluna, ou outro componente, como pH, fora inica
da coluna, que podem variar dependendo das protenas
analisadas45,13.
Borvok & Snaselov (2005)13 em sua reviso
apresentaram as duas tcnicas com finalidade de
identificar e quantificar a presena de protenas do soro,
lactoglobulina e - lactoglobulina, com deteco da
origem do leite adicionado na quantidade mnima de
2%13, ou 1%46.
Mayer (2005)45 utilizou a IE-HPLC para separar
protenas do leite, como a s1- casena e para-k-casena,
em leites e queijos frescos. Haza et al (2005)47 relatou as
duas tcnicas de HPLC para separao das protenas e
posterior caracterizao por ELISA.
Desta forma podemos concluir, que as tcnicas de
deteco de adulterao de queijos com leite de diferentes
espcies so muito pertinentes e sensveis, na funo
de garantir a segurana do consumidor em relao aos
produtos adquiridos no comrcio varejista.

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