CULTIVO HETEROTRFICO DE MICROALGA Chlorella vulgaris CPCC90

UTILIZANDO SACAROSE HIDROLISADA COMO FONTE DE CARBONO

ORGNICO.

Liliana F. Acosta1; Talita L. Honorato; Telma T. Franco.

Faculdade de Engenharia Qumica UNICAMP Cidade Universitria "Zeferino Vaz" Av.
Albert Einstein, 500 - CEP 13083-852. Lab. Engenharia Bioqumica, Biorrefino e
Produtos de Origem Renovvel LEBBPOR. Campinas - SP Brasil.
lilianamarcelafranco@gmail.com

RESUMO
Glicose a fonte de carbono mais empregada em cultivos heterotrficos de microalgas,
atingindo as taxas mais elevadas de crescimento quando comparada a outros
substratos. Entretanto essa fonte de carbono tambm o substrato com maior custo.
Portanto, a utilizao da sacarose, que pode ser obtida a partir da cana de acar e
beterraba, uma alternativa interessante, pois dentre suas diversas finalidades, est
sua utilizao em processos fermentativos. O principal subproduto da produo de
acar o melao de cana que contm altas concentraes de sacarose (40-60%),
podendo ser utilizado em cultivos fermentativos que visem reduo de custos com
matria prima e a elevao da competitividade dos bioprodutos gerados durante o
processo. Estudos preliminares utilizando sacarose 2 g.L-1 indicaram que a microalga
Chlorella vulgaris CPCC90 no foi capaz de assimilar essa fonte de carbono orgnico.
Entretanto, a hidrlise da sacarose em meio cido produz uma mistura equimolar de
glicose e frutose. Obtivemos um rendimento de 93% na hidrlise da sacarose e
diferentes concentraes do hidrolisado de sacarose (2, 5, 8, 10 e 20g.L-1) foram
utilizadas como substrato no cultivo da C. vulgaris CPCC90. Os mximos valores de
concentrao celular, pH e produtividade obtidos em 122 horas de cultivo, contendo
inicialmente 20 g.L-1 de sacarose hidrolisada, foram 5,3 g.L-1; 8,80 e 0,040 g.L-1.h-1,
respectivamente. A mxima velocidade especfica de crescimento e o mnimo tempo de
gerao foram obtidos no experimento contendo inicialmente 2 g.L-1 de sacarose
hidrolisada (0,51 h-1 e 13,92 h-1, respectivamente). Analogamente foi testado o uso da
frutose e os resultados no evidenciaram crescimento celular do microrganismo quando
cultivado com essa fonte de carbono orgnico. Evidenciamos tambm que
concentraes maiores que 5 g.L-1 afetam negativamente o crescimento da microalga,
diminuindo sua velocidade de crescimento.
Palavras chave: Heterotrfico, Chlorella vulgaris, sacarose, hidrlise, fontes de carbono.

INTRODUO
Na ultima dcada o desenvolvimento de biocombustveis como, por exemplo, o
biodiesel, foi considerado uma das maiores estratgias para minimizar os problemas
ambientais e de gerao de energia em muitos pases. A produo de biodiesel usando
lipdeos microbianos pode ser vista como uma excelente alternativa para reduo do
custo dos combustveis obtidos a partir de matrias primas alimentares (Chisti 2008).
Segundo Day, Brinkmann et al. (2009), as microalgas produtoras de lipdeos
microbianos so promissoras matrias-primas para a produo de biodiesel, visto que
diversas caractersticas essenciais de seus leos so desejveis e adequadas
substituio do diesel. Neste sentido o biodiesel de microalga apresenta vantagens
frente os outros, podendo representar uma importante tecnologia a ser desenvolvida
para a nova matriz energtica que as sociedades buscam (Smith, Sturm et al. 2010).
Embora a produo de lipdeos de microalgas para combustveis seja promissora, em
escala industrial ainda um processo invivel, devido os altos custos das tecnologias
de colheita da biomassa e extrao dos lipideos (Chisti 2007; Chisti and Yan 2011).
Deste modo, para levar o biodiesel de microalgas a um processo competitivo no
mercado precisa-se de novas pesquisas, visando o desenvolvimento e principalmente,
o aperfeioamento dos sistemas de produo em escala comercial, a fim de reduzir
custos e aumentar a produtividade. Neste sentido o cultivo heterotrfico de microalgas
pode oferecer vantagens quando comparada ao sistema fotossinttico, como a
ausncia de luz, diminuindo gastos com a iluminao constante. Efluentes industriais
ricos em carbono orgnico, contendo carboidratos, podem ser empregados em tais
cultivos. Essas caractersticas poderiam reduzir o custo dos sistemas heterotrficos,
sendo uma alternativa econmica e ambiental vivel para obteno de lipdeos a partir
de biomassa de microalgas. A sacarose constitui at 60% da biomassa seca de
algumas plantas como a beterraba e a cana de acar. Dentre as diversas finalidades
da sacarose, ela pode ser utilizada na produo de etanol, goma xantana, dentre outros
processos fermentativos (Olgun, Snchez-Galvn et al. 2008; Satyawali and
Balakrishnan 2008). O presente trabalho avaliou o cultivo heterotrfico da microalga C.
vulgaris CPCC90, empregando sacarose hidrolisada como fonte de carbono orgnico,
visando
aumentar
seu
crescimento
e
produtividade
em
lipdeos.

MATERIAIS E MTODOS
Microrganismo
Chlorella vulgaris CPCC90, obtida do Canadian Phycological Culture Centre.
Hidrlise da sacarose
A sacarose foi hidrolisada com adio de 0,4% (m/m) de cido (HCl 3 M) uma soluo
de 500 g.L-1 de sacarose (xarope). Essa mistura foi incubada em banho a 80C por 30

minutos, com posterior resfriamento em banho de gelo at temperatura ambiente. O pH

foi neutralizado utilizando uma soluo de NaOH 3M.
Meio de cultivo e condies de cultivo
Meio sinttico BBM composto por, K2HPO4 (0,075 g.L-1), KH2PO4.7H2O (0,175 g.L-1),
MgSO4.7H2O (0,075 g.L-1), CaCl2.2H2O (0,025 g.L-1), Na2EDTA (0,050 g.L-1), NaCl
(0,025 g.L-1), NaNO3 (0,250 g.L-1), KOH (0,0031 g.L-1), FeSO4.7H2O (0,00498 g.L-1),
H2SO4 (1,18 g.L-1), H3BO3 (11,42 mg.L-1), MnCl2.4H2O (1,44 mg.L-1), ZnSO4.7H2O (0,882
mg.L-1), Co(NO3)2.6H2O (0,049 mg.L-1), MoO3 (0,71 mg.L-1). O meio sinttico BBM foi
suplementado com: i) sacarose na concentrao de 2 g.L-1, ii) sacarose hidrolisada nas
concentraes de 2; 5; 8; 10 e 20g.L-1, iii) frutose na concentrao de 2 g.L-1, iv) glicose
na concentrao de 10 g.L-1, v) glicose e frutose nas concentraes de 10 e 5g.L-1, vi)
glicose e frutose nas concentraes de 10 g.L-1, sempre mantendo a relao
carbono/nitrognio constante em 20, ajustada pela adio de NaNO3. O pH do meio de
cultivo foi ajustado a 6,8 com HCl 1M e NaOH 1 M. Todos os cultivos foram incubados
em incubadora rotatria (modelo 430-RD- Nova tica), sob agitao constante a 140
RPM e temperatura de 26C, na ausncia de luminosidade.
Mtodos analticos
O pH foi monitorado ao longo dos cultivos por mtodo potenciomtrico, empregando um
potencimetro (QUIMIS, modelo Q-400A). A concentrao celular foi determinada por
gravimetria, utilizando filtrao vcuo de 15mL de meio de cultura em uma membrana
de 0,22 m e biomassa seca em estufa 60C at peso constante. O consumo de
glicose foi determinado por mtodo enzimtico, utilizando um kit glicose-oxidase
(Laborlab). A frutose e sacarose foram determinadas por cromatografia de troca inica
em sistema Metrohm. A verificao da axenia dos cultivos foi por microscopia tica,
empregando um microscpio modelo BVM-100 (Marca Bel Photonics, Milano, Itlia).
RESULTADOS E DISCUSSO
Cultivo em sacarose
Foi avaliado o cultivo da microalga C. vulgaris em sacarose. Os resultados dos testes
contendo inicialmente 2 g.L-1 mostraram que a microalga no metabolizou a sacarose,
causando morte celular. Resultados similares foram apresentados por (Kessler 1982)
onde a Chlorella protothecoides foi incapaz de utilizar sacarose como fonte de carbono.
Resultados negativos foram encontrados em estudos de crescimento e produo de
metablitos a partir de microalgas cultivadas em sacarose. Ainda segundo esses
autores, especula-se que as microalgas no possuam a enzima invertase para
assimilao dessa fonte de carbono (Perez-Garcia, Escalante et al. 2011).
Estudos evidenciaram um significativo crescimento da alga vermelha Galdieria
sulphuraria cultivada em sacarose, mas apenas em pH 2. Isso pode ser um indicativo
de que a sacarose foi hidrolisada em glicose e frutose, assimiladas por microalgas

(Schmidt, Wiebe et al. 2005). Portanto, foi avaliado o cultivo da C. vulgaris em sacarose
hidrolisada, no fim de aproveitar essa fonte de carbono.
Cultivo em sacarose hidrolisada
Segundo Xiong, Gao et al. (2010), a hidrlise da sacarose numa soluo de 10
gsacarose.L-1 deve ser tratada com cido clordrico suficiente para um pH final 2,0 e
aquecida a 121C por 30 minutos, com posterior resfriamento em banho de gelo at
temperatura ambiente. A ltima etapa desse processo a neutralizao da soluo
utilizando hidrxido de sdio.
A porcentagem de inverso da sacarose pode ser calculada por meio da equao
abaixo, levando em considerao as concentraes de sacarose, glicose e frutose na
soluo final (Rodrigues 2000).

Sendo,
1,05= relao entre as massas moleculares dos acares redutores e no redutores.
(360,28 g.mol-1/342,24 g.mol-1)
Acares redutores= glicose e frutose (g.L-1)
Acares no redutores= sacarose (g.L-1)
Inicialmente foram realizados testes comparando a utilizao de banhos termostticos e
de autoclave para promover o aquecimento durante o processo de hidrlise, pois o uso
de altas temperaturas no processo ocasiona um conjunto de reaes complexas
conhecidas como caramelizao, provocando desidratao e gerao de compostos
que podem ser inibidores de crescimento celular (Oetterer 2006). A Tabela 1 apresenta
os resultados dos testes da hidrlise da sacarose utilizando autoclave e banho
termosttico. Os resultados foram analisados pelo Teste de Tukey com 95% de
confiana e indicaram que o uso do banho termosttico, comparado com a autoclave,
para a obteno da hidrlise apresenta diferena significativa no grau de inverso da
sacarose, sendo escolhido o banho termosttico por apresentar a maior porcentagem
de inverso da sacarose, alm de utilizar menores temperaturas, reduzindo a
possibilidade de formao de compostos inibidores durante o processo.

Tabela 1 Resultados da hidrlise da sacarose (10 g.L-1)

banho termosttico (T: 80 C).
HCl (%)
% Inverso
Autoclave
Desvio padro Banho
0,4
65,13a
+
0,21
67,00b
a
0,8
53,50
+
0,40
55,40b
1,2
50,87a
+
0,25
54,27b
a
2,0
46,47
+
0,15
44,20b

em autoclave (T: 121 C) e

+
+
+
+

Desvio padro
0,30
0,36
0,25
0,20

n=numero de amostras; xi=amostra;

=mdia; s=varincia

Letras diferentes na mesma linha, so estatisticamente diferentes (p< 0,05) pelo Teste de Tukey.

Visando melhorar a porcentagem de inverso obtida no banho termosttico, diferentes

concentraes de cido clordrico foram utilizadas na hidrlise de uma soluo de 500
gsacarose.L-1. A Tabela 2 mostra as porcentagens de inverso obtidas nas diferentes
hidrlises, os resultados mostram que a porcentagem de inverso da sacarose foram
semelhantes para todos os testes avaliados.
Tabela 2 Resultados da hidrlise da sacarose em banho
concentraes de cido clordrico.
% de Inverso Concentrao de HCl % (m/m)
93,37
0,4
93,37
0,8
93,67
1,3

termosttico com diferentes

+
+
+

Desvio padro
0,12
0,25
0,25
n=numero de amostras;

xi =amostra;

=mdia; s=varincia.

Com base nos resultados apresentados acima, as condies estabelecidas para a

realizao da hidrlise da sacarose foram: soluo de 500 gsacarose.L-1, 0,4% (m/m) de
cido clordrico e aquecimento 80C por 30 min.
A hidrlise da sacarose em meio cido produz um mistura equimolecular de D-Glicose
(aldose) e D-frutose (cetose). Devido proporo (1:1), associada solubilidade em
gua, estes dois carboidratos so de difcil separao por mtodos convencionais.
Dessa forma, a mistura de D-glicose e D-frutose foi utilizada no cultivo da C. vulgaris,
considerando as concentraes iniciais de 2, 5, 8, 10 e 20 g.L-1 de sacarose. O
rendimento mdio da porcentagem de inverso da sacarose foi de 87.3 4.6%.
Em todos os testes o pH inicial foi superior 6 e a razo C/N inicial foi mantida em 20
pela adio de nitrato de sdio. A Figura 1 apresenta os perfis de consumo de glicose,
consumo de frutose e crescimento celular. Na Tabela 3 possvel observar os valores
dos parmetros cinticos de cada experimento realizado.

Figura 1 Perfis de concentrao de glicose ( ), frutose ( ) e celular ( ) para os experimentos com

diferentes concentraes de sacarose hidrolisada. Legenda: X= concentrao celular.

Os resultados tambm evidenciaram o aumento do pH com o tempo de cultivo (Dados

no apresentados), associado ao crescimento celular. Analogamente foi possvel
associar o consumo da glicose com o aumento celular. Os mximos valores de
concentrao celular, pH e produtividade foram, respectivamente, 5,3 g.L-1; 8,80 e
0,040 g.L-1.h-1, obtidos em 122 horas de cultivo contendo inicialmente 20 g.L-1 de
sacarose hidrolisada. A mxima velocidade especfica de crescimento e o mnimo
tempo de gerao foram 0,51 h-1 e 13,92 h-1, respectivamente, alcanados no
experimento com 2 g.L-1 de sacarose hidrolisada.
Em todos os testes a glicose foi totalmente consumida. O fator de converso de glicose
em clulas foi em torno de 0,30 para todos os casos. Durante todo o perodo dos
experimentos no evidenciamos o consumo da frutose pela C. vulgaris e, aps o
consumo total da glicose, o microrganismo atingiu a fase estacionria seguida de morte
celular.
Estudos utilizando frutose como fonte de carbono em cultivos heterotrficos da
Chlorella evidenciaram baixo crescimento celular e baixas velocidades de crescimento
quando comparados aos resultados obtidos com outras fontes de carbono (Sun, Wang
et al. 2008; Liu, Huang et al. 2010). Nesse sentido, um experimento foi realizado
contendo inicialmente 2 g.L-1 de frutose para verificar a possibilidade de crescimento
celular da microalga C. vulgaris nessa fonte de carbono. No foi observado consumo da
frutose assim como nos experimentos realizados com sacarose hidrolisada, e tambm
foi
observada
morte
celular
do
microrganismo.
Tabela 3 Parmetros cinticos obtidos a partir dos experimentos com sacarose
hidrolisada.
Sacarose hidrolisada (g.L-1)
Parmetro
10
20
2
5
8
Glicose inicial (g.L-1)
Xmx (g.L-1)

0,88
0,61

2,21
1,36

3,50
1,97

4,21
2,33

9,23
5,28

pHmx

7,92

8,42

8,62

8,59

8,79

0,051
13,63
22

0,035
19,92
47

0,027
25,20
67

0,030
23,03
72

0,026
26,87
122

22

47

67

72

122

Px (g.L .h )

0,014

0.023

0,024

0,028

0,040

-1

r (g.L .h )

0,040

0,047

0,052

0,058

0,076

X (%)

43,85

44,22

43,71

42,10

41,17

0,31

0,27

0,25

0,23

0,26

-1

mx (h )
Tg (h)
tx_max (h)
tx (h)
-1

-1

-1

YX/S (g/g)
-1

-1

densidade celular mxima (Xmax, [g.L ]); velocidade mxima especfica de crescimento ( max [h ]) foi calculada pelo grfico ln(X) x t;
tempo de gerao: tg=ln(2)/ max [d]; tempo de residncia celular para a obteno da densidade celular mxima (tXmax, [h]); tempo
-1 -1
total de residncia celular (tX, [h]); produtividade celular: Px=X/t [g.L .h ]; converso global de substrato (X, [%]); fator de
-1 -1
converso de substrato em clulas: YX/S=X/-S [gbiomassa/gsubstrato]; taxa de consumo de substrato (rs=-S/t [g.L .h ].

Inibio pela frutose

A fim de determinarmos a possvel inibio da frutose no crescimento da microalga C.
vulgaris foram avaliadas duas concentraes de frutose, 5 e 10 g.L-1, acrescentadas ao
meio BBM contendo uma concentrao de 10 g.L-1 de glicose no meio de cultivo.
Paralelamente foi realizado um teste controle com glicose na concentrao de 10 g.L-1.
A Tabela 4 apresenta os parmetros cinticos obtidos nas fermentaes realizadas.
Pode-se observar que o aumento na concentrao de frutose causou uma diminuio
na velocidade de crescimento da microalga e um aumento significativo no tempo de
residncia celular para a obteno da densidade celular mxima. No entanto a
concentrao celular foi aproximadamente igual em todos os cultivos estudados.
A Figura 2 apresenta os perfis de crescimento celular e consumo de substrato dos
cultivos avaliados.
Tabela 4 Parmetros cinticos nos cultivos com glicose e frutose.
Frutose (g.L-1)
Parmetro
0
5
10
-1
Glicose inicial (g.L )
9,42
9,20
9,01
-1
Frutose inicial (g.L )
4,85
10,17
Xmx (g.L-1)

4,92

4,83

4,86

pHmx

8,40

8,55

8,33

mx (h-1)
tg (h)
tx_max (h)

0,030
23,18
80

0,029
23,50
95

0,025
27,29
99

80

95

99

Px (g.L .h )

0,056

0,046

0,045

-1

r (g.L .h )

0,118

0,097

0,091

Xgli (%)

100

100

100

tx (h)
-1

-1

-1

YX/Sgli (g/g)
0,52
0,52
0,54
-1
-1
densidade celular mxima (Xmax, [g.L ]); velocidade mxima especfica de crescimento ( max [h ]) foi calculada pelo grfico ln(X) x t;
tempo de gerao: tg=ln(2)/ max [h]; tempo de residncia celular para a obteno da densidade celular mxima (tXmax, [h]); tempo
-1 -1
total de residncia celular (tX, [h]); produtividade celular: Px=X/t [g.L .h ]; converso global de substrato (X, [%]); fator de
-1 -1
converso de substrato em clulas: YX/S=X/-S [gbiomassa/gsubstrato]; taxa de consumo de substrato (rs=-S/t [g.L .h ]).

Figura 2 Perfis de concentrao de glicose ( ), frutose ( ) e celular ( ) para os experimentos com

diferentes concentraes de glicose e frutose. Legenda: X = concentrao celular.

CONCLUSES
C. vulgaris CPCC90 no apresentou crescimento empregando como substrato as
fontes de carbono sacarose e frutose. No entanto foi utilizado como substrato a
sacarose hidrolisada sendo obtidos mximos valores de concentrao celular, pH e
produtividade na concentrao de 20 g.L-1. Evidenciamos tambm que concentraes
maiores que 5 g.L-1 de frutose afetam negativamente o crescimento da microalga.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradem ao CNPq pela bolsa concedida, FAPESP e CAPES pelo auxlio
financeiro, e ao Laboratrio de Engenharia Bioqumica, Biorrefino e Produtos de Origem
Renovvel - LEBBPOR da UNICAMP por permitir o desenvolvimento deste estudo.

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