UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE ZOOTECNIA E ENGENHARIA DE ALIMENTOS

LUDMILA CAMARGO LOPES

Composio e caractersticas fsico-qumicas do leite

instvel no cido (LINA) na regio de Casa Branca,
Estado de So Paulo

Pirassununga
2008

LUDMILA CAMARGO LOPES

Composio e caractersticas fsico-qumicas do leite

instvel no cido (LINA) na regio de Casa Branca,
Estado de So Paulo

Dissertao apresentada Faculdade

de Zootecnia e Engenharia de
Alimentos da Universidade de So
Paulo, como parte dos requisitos para
a obteno do Ttulo de Mestre em
Zootecnia.
rea de Concentrao: Qualidade e
Produtividade Animal
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto
Fernandes de Oliveira

Pirassununga
2008

FICHA CATALOGRFICA
preparada pela
Biblioteca da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de So Paulo

L864c

Lopes, Ludmila Camargo

Composio e caractersticas fsico-qumicas do leite instvel
no cido (LINA) na regio de Casa Branca, Estado de So
Paulo. / Ludmila Camargo Lopes - Pirassununga, 2008.
63 f.
Dissertao (Mestrado) -- Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos - Universidade de So Paulo.
Departamento de Engenharia de Alimentos
rea de Concentrao: Qualidade e Produtividade Animal
Orientador: Prof. Dr. Carlos Augusto Fernandes de Oliveira
Unitermos: 1. LINA 2. Fraes de casena 3. Cromatografia
4. Estabilidade da casena 5. Anlises fsico-qumicas. I. Ttulo.

DEDICATRIA

minha querida me Sandra Mara (in memorian),

por tudo o que fez e significa para mim. De diversas formas voc
continua presente em minha vida.
Saudades.

Ao meu pai Luiz, por tudo.

Ao Jos Renato pela companhia, amor, dedicao e

cumplicidade.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Carlos Augusto Fernandes de Oliveira, pela orientao, ensinamentos

transmitidos e confiana em mim depositada.

A CAPES pela concesso da bolsa de mestrado.

Ao Senhor Celestino dos Santos Pantaleo, pela permisso da coleta de amostras no

Laticnio Trevo de Casa Branca.

Aos funcionrios do Laticnio Trevo de Casa Branca, pela colaborao na coleta das
amostras.

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Campus Pirassununga USP,

pela oportunidade oferecida para a realizao deste curso.

Raquel Cardoso Franco e Fabiane Mascari, estagirias de Iniciao Cientfica, pela

dedicao ao experimento.

minha amiga, madrinha e companheira de laboratrio Juliana Victorino, por me

ajudar e sempre estar presente em todos os momentos da minha vida.

minha querida amiga Josiane Ortolan, por tudo.

Roice Eliana Rosim, tcnica do LMMA, por sua pacincia, amizade e essencial
ajuda nas anlises laboratoriais.

Andrezza Maria Fernandes, pela incalculvel ajuda, tanto em assuntos cientficos

como nos mais corriqueiros.

s colegas de ps-graduao e amigas Andrezza Felcio, rika e Marcinha.

Aos professores e funcionrios dos departamentos de Zootecnia e Engenharia de

Alimentos, pela amizade e convvio durante todos esses anos.

s minhas eternas amigas Flvia, Ellen, Camila (Sama) e Cludia.

A todos aqueles que, direta ou indiretamente, contriburam para a realizao deste

trabalho o mais profundo agradecimento.

RESUMO
LOPES, L.C. Composio e caractersticas fsico-qumicas do leite instvel no cido
(LINA) na regio de Casa Branca, Estado de So Paulo. 2008. 63f. Dissertao
(Mestrado) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So Paulo,
Pirassununga, 2008.
O objetivo do estudo foi determinar a composio e as caractersticas fsico-qumicas (pH,
acidez, estabilidade ao lcool, slidos totais, gordura, lactose, teor de extrato seco
desengordurado e protena total), contagem de clulas somticas (CCS) e as fraes de
casena (-S1, -S2, e ) dos leites identificados como leite instvel no cido (LINA) e de
leites estveis prova de lcool a 78% (v/v). A amostragem contemplou todas as propriedades
leiteiras fornecedoras de leite de um laticnio localizado no municpio de Casa Branca
Estado de So Paulo, nos meses de maro, maio, julho e setembro de 2007. Considerou-se,
como critrio de identificao de LINA, a amostra de leite de conjunto de cada propriedade
que apresentasse instabilidade prova do lcool a 72% (v/v) e acidez inferior a 18D. Do total
de amostras instveis ao teste do lcool a 72% (v/v), 64,77% foram identificadas como LINA.
A freqncia de amostras de LINA variou de acordo com o ms de amostragem, indicando
uma possvel influncia sazonal sobre a ocorrncia deste problema nos rebanhos analisados.
No ms de julho, a incidncia de LINA foi maior, coincidindo com o perodo seco, quando a
disponibilidade e a qualidade das forragens so reduzidas. No ms de setembro, poca de
chuvas em que ocorre maior oferta de forragens de melhor qualidade, a incidncia de LINA
diminuiu. Em julho, houve um aumento significativo nos nveis de gordura, lactose e CCS,
observando-se, porm, uma diminuio significativa nas concentraes de protena bruta nas
amostras. Neste ms, notou-se tambm uma menor concentrao de -casena no LINA,
embora as diferenas entre as casenas -S1, -S2, e do LINA e do leite estvel no tenham
sido significativas nos meses de amostragem. Os resultados evidenciaram que a ocorrncia de
LINA freqente nos rebanhos leiteiros da regio estudada, o que pode acarretar perdas
significativas indstria de laticnios e aos produtores devido ao descarte do leite.

Palavras-chave: LINA; fraes de casena; cromatografia; estabilidade da casena;

anlises fsico-qumicas.

ABSTRACT
LOPES, L.C. Composition and physical-chemical characteristics of unstable non-acid
milk in the region of Casa Branca - So Paulo State. 2008. 63f. M. Sc. Dissertation
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de So Paulo,
Pirassununga, 2008.

The aim of this study was to determinate the composition and the physical-chemical
characteristics (pH, acidity, alcohol stability, total solids, fat, lactose, non fat solids and total
protein), somatic cells counts (SCC) and casein fractions (-S1, -S2, and ) of unstable nonacid and stable milks at the alcohol test at 78% (v/v). Samples were collected from all the
dairy farms that provide milk to a dairy plant located in Casa Branca So Paulo State.
Sampling procedures were done on March, May, July and September 2007. Milk samples
from each dairy farm presenting instability to alcohol test at 72% (v/v) and acidity less than
18D were considered as unstable non-acid milk. From the total of unstable samples to
alcohol test at 72% (v/v), 64.77% were identified as unstable non-acid milk. The frequency of
unstable non-acid milk samples varied according the month of sampling, hence indicating a
possible seasonal influence on the occurrence of this problem in the dairy herds studied. On
July, the incidence of unstable non-acid milk was higher, coinciding with the dry season,
when the quality and availability of forage are reduced. On September, at rainfall season,
when the availability and quality of forage are better, the incidence of unstable non-acid milk
decreased. There was a significant increase in the levels of fat, lactose and SSC in samples
collected on July, although a significant decrease was observed in the concentrations of total
protein. In this month, a lower concentration of -casein was also noted in unstable non-acid
milks. However, the differences between the -S1, -S2, and casein of unstable non-acid
milk and stable milk were not significant in all sampling months. Results showed that the
occurrence of unstable non-acid milk is common in dairy herds in the studied area, which can
cause significant losses to the dairy industry and dairy farms due to the discharging of milk.

Keywords: unstable non-acid milk; casein fractions; chromatography; casein stability;

physical -chemical analyses.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Frascos etiquetados contendo as amostras de leite e placas de petri onde eram
realizadas as leituras diante do teste do lcool. ........................................................................32
Figura 2. Solues de lcool nas concentraes 72, 74, 76 e 78% (v/v)..................................33
Figura 3. Demonstrao do teste do lcool (Etapa I): Colocao de 4 mL de leite da amostra
nas placas de petri.....................................................................................................................33
Figura 4. Demonstrao do teste do lcool (Etapa II): Colocao de 4 mL de soluo de lcool
nas placas de petri.....................................................................................................................34
Figura 5. Demonstrao do teste do lcool (Etapa III): Homogeneizao...............................34
Figura 6. Demonstrao do teste do lcool (Etapa IV): Interpretao do resultado: Ausncia
de formao de grumos, resultado negativo. ............................................................................35
Figura 7. Demonstrao do teste do lcool (Etapa IV): Interpretao do resultado: Presena de
grumos, resultado positivo........................................................................................................35
Figura 8. Injeo da amostra no sistema CLAE. ......................................................................38
Figura 10. Resultados da prova do lcool em diferentes percentuais (v/v) e meses de
realizao da anlise. n = 451...................................................................................................42
Figura 11. Ocorrncia de Leite Instvel No cido (LINA) e de amostras cidas em relao s
amostras positivas ao teste do lcool a 72% (v/v) em diferentes meses...................................43
Figura 12. Cromatograma obtido na anlise das fraes de casena. Padro contendo 4,0
mg/mL de S-casena, 3,0 mg/mL de -casena e 1,5 mg/mL de -casena. ...........................15
Figura 13. Cromatograma das fraes de casena de uma amostra de leite estvel. ................15
Figura 14. Cromatograma das fraes de casena de uma amostra de LINA...........................16

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composio (porcentagem) do leite de vacas de diferentes raas especializadas de15

regies temperadas. ..................................................................................................................15
Tabela 2. Requisitos fsico-qumicos do leite cru resfriado. ....................................................15
Tabela 3. Nmero de amostras por perodo de amostragem. ...................................................31
Tabela 4. Composio e caractersticas fsico-qumicas dos leites estveis e LINA. ..............48
Tabela 5. Concentraes das fraes de casena nos leites estveis e LINA nos diferentes
meses de colheita. .....................................................................................................................17
Tabela 6. Percentuais de cada frao em relao ao total de casena (S1 + S2 + + ) nos
leites estveis e LINA nos diferentes meses de colheita. .........................................................18

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AOAC

Association of Official Analitycal Chemists

Ca

Clcio

CMT

California Mastitis Test

cel

Clulas

CCS

Contagem de clulas somticas

ESALQ

Escola de Agricultura Luiz de Queiroz

ESD

Extrato seco desengordurado

EST

Extrato seco total

FZEA

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Grama

IN 51

Instruo Normativa n. 51

LMMA

Laboratrio de Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos

LINA

Leite Instvel No cido

Litros

MAPA

Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento

mg

Miligrama

min

Minutos

mL

Mililitro

Fsforo

USP

Universidade de So Paulo

UHT

Ultra High Temperature

rpm

Rotaes por minuto

UV

Ultravioleta

UFC

Unidade formadora de colnia

SILA

Sndrome do Leite Anormal

ST

Slidos totais

LISTA DE SMBOLOS

alfa

Beta

Kapa

Graus centgrados

Graus Dornic

Coeficiente de correlao

r2

Coeficiente de determinao

Massa

Micro

volume

Igual

>

Maior

Marca Registrada

Mais ou menos

Porcentagem

SUMRIO
1. INTRODUO....................................................................................................................12
2. REVISO DA LITERATURA ............................................................................................14
2.1 Composio e Caractersticas fsico-qumicas do leite ..................................................14
2.2 Consideraes Gerais sobre Protenas no Leite..............................................................16
2.2.1 Classificao das Protenas no Leite .......................................................................17
2.3 Estabilidade das Micelas de Casena ..............................................................................19
2.4 Avaliao da Estabilidade das Protenas do leite ...........................................................20
2.5 Ocorrncia do Leite Instvel No cido (LINA)...........................................................22
2.6 Composio e Caractersticas Fsico-Qumicas do Leite Instvel No cido (LINA)..26
3. OBJETIVOS.........................................................................................................................29
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................................29
3.2 Objetivos Especficos .....................................................................................................29
4. MATERIAL E MTODOS..................................................................................................30
4.1 Descrio do Universo Amostral....................................................................................30
4.2 Colheita de Amostras de Leite .......................................................................................30
4.3 Avaliao da Estabilidade do Leite Prova do lcool ..................................................32
4.4 Caracterizao do Leite Instvel No cido (LINA) e do Leite Estvel .......................36
4.5 Anlises de Composio e Fsico-Qumica do Leite......................................................36
4.6 Avaliao das Fraes de Casena..................................................................................37
4.7 Anlise dos Resultados...................................................................................................41
5. RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................................................42
5.1 Avaliao da Estabilidade do Leite Prova do lcool ..................................................42
5.2 Caracterizao do Leite Instvel No cido (LINA) e do Leite Estvel .......................43
5.3 Composio e Fsico-Qumica do Leite .........................................................................46
5.4 Fraes de Casena do Leite ...........................................................................................14
6. CONCLUSES ....................................................................................................................20
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................21

12

1. INTRODUO

O leite constitui a matria-prima para as indstrias de laticnios, apresentando grande

valor nutritivo para a nutrio humana, e, portanto, merecendo ateno especial e um controle
de qualidade adequado (DONATELE et al., 2003).
Ao se falar em qualidade do leite, os avanos foram lentos e por etapas, pois o
transporte do leite era realizado em lates no refrigerados. A implantao definitiva da coleta
a granel s veio ocorrer na dcada de 90, quando uma palavra chave contaminou a economia
brasileira e mundial: globalizao. A partir deste momento a sociedade passa a ter uma
postura mais crtica em relao aos produtos que compra, exigindo leite de melhor qualidade
(RUBEZ, 2007).
A qualidade do leite est diretamente relacionada sade, alimentao e manejo dos
animais, com a qualificao da mo-de-obra, higiene dos equipamentos e utenslios utilizados
durante a ordenha, bem como o transporte adequado at a indstria. Todos esses fatores
influenciam a sua composio original e, conseqentemente, as caractersticas de sabor, cor,
cheiro e viscosidade (PINNA e LIZIEIRE, 2000).
O principal fator que tem impulsionado a melhoria da qualidade do leite no Brasil a
demanda crescente por parte dos laticnios, indstrias e dos consumidores por produtos de
qualidade aumentada, refletindo assim, na necessidade de implantao de medidas visando
seu aumento na matria-prima.
O tratamento trmico do leite tem como objetivo a garantia da segurana ao
consumidor e o aumento da conservao dos produtos, o que obtido pela reduo de
microrganismos patognicos e deteriorantes, assim como da atividade enzimtica (SPREER,
1991).
A indstria de laticnios busca a recepo de leite de elevada estabilidade trmica, uma
vez que tal caracterstica essencial para o processamento de derivados lcteos,
principalmente para os que sofrem tratamentos trmicos severos ou com vida de prateleira
longa. Atualmente, a reduo da estabilidade trmica do leite um problema freqentemente
encontrado em vrios estados do Brasil (BALBINOTTI et al., 2003).
A acidez elevada, principalmente aquela decorrente da proliferao de bactrias
mesfilas, constitui o principal fator que diminui a estabilidade trmica do leite. Entretanto, a

13

perda da estabilidade pode ocorrer em leites no cidos, determinando a ocorrncia do

produto conhecido como Leite Instvel No-cido (LINA).
Este problema pode provocar enormes prejuzos ao setor lcteo, pois a perda da
estabilidade da casena frente prova do lcool, que causa a sua precipitao, ocorre mesmo
sem o aumento da acidez do leite. Em muitos casos, o leite com tais alteraes erroneamente
interpretado como cido, penalizando o produtor sem que este possa identificar o que
acontece no rebanho. Por outro lado, acredita-se que caso esse leite chegue indstria, no
resista ao processo trmico, especialmente Ultra High Temperature (UHT) (BALBINOTTI et
al., 2003; DONATELE et al., 2003).
Estes fatos justificam a importncia do presente trabalho, cuja finalidade foi
determinar a ocorrncia de LINA no Estado de So Paulo, comparando seus parmetros
fsico-qumicos, contagem de clulas somticas e fraes de casena com os obtidos por leites
estveis prova do lcool a 78% (v/v).

14

2. REVISO DA LITERATURA

2.1 Composio e Caractersticas Fsico-Qumicas do Leite

O leite, sem outra especificao, o produto normal, fresco, integral, oriundo da

ordenha completa, ininterrupta e em condies de higiene, de vacas sadias (MAPA, 1980). O
leite bovino um lquido complexo que contm gua, glicdios (basicamente lactose),
gorduras, protenas (principalmente casena), minerais e vitaminas em diferentes estados de
disperso (WALSTRA e JENNESS, 1987). O leite e seus derivados so os principais
componentes da dieta humana em muitas partes do mundo (FOX e MCSWEENEY, 2003).
A funo biolgica do leite o fornecimento de nutrientes e proteo imunolgica
para o recm nascido, uma vez que esto presentes na sua composio todos os nutrientes
requeridos para a mantena e o crescimento (energia, aminocidos, minerais e vitaminas), o
que caracteriza o leite como alimento completo. O leite uma combinao de vrias
substncias na gua e pode ser caracterizado como: suspenso coloidal de micelas de casena
ligadas ao clcio (Ca) e fsforo (P); emulso de glbulos de gordura e vitaminas lipossolveis
e soluo de lactose, protenas solveis em gua, sais minerais e vitaminas hidrossolveis
(SANTOS e FONSECA, 2007).
A mudana na composio do leite pode alterar significativamente o seu valor como
matria-prima para a fabricao de derivados. Para ilustrar esse fato, Santos e Fonseca (2007),
citam que, uma diminuio de 0,5% de slidos totais ou 0,1% em protenas pode significar
uma perda de at 5 toneladas de leite em p ou 1 tonelada de queijo, respectivamente, para
cada milho de litros de leite processados.
Segundo Santos e Fonseca (2007), a composio mdia do leite de vacas das
diferentes raas leiteiras apresentada na Tabela 1.

15

Tabela 1. Composio (porcentagem) do leite de vacas de diferentes raas especializadas de

regies temperadas.

Componentes

Colostro 2

Holandesa

Jersey

Pardo-

Ayrshire

Guernsey

suio
Protena (%)

14,30

3,29

3,98

3,64

3,48

3,75

Gordura (%)

3,60

3,54

5,13

3,99

3,95

4,72

Cinzas (%)

5,20

0,72

0,77

0,74

0,72

0,76

Lactose (%)

3,10

4,68

4,83

4,94

4,60

4,71

EST1 (%)

22,10

12,16

14,42

13,08

12,77

14,43

Extrato seco total.

Adaptado de Roy, 1980.

Segundo o Regulamento Tcnico de Identidade e Qualidade de Leite Cru Resfriado,

(MAPA, 2002), o leite cru resfriado deve apresentar os seguintes requisitos mnimos de
qualidade dentro da propriedade rural.

Tabela 2. Requisitos fsico-qumicos do leite cru resfriado.

Requisitos

Limites

Gordura, g/100g

>3,0 (leite integral)1

Densidade relativa a 15oC g/mL

1,028 a 1,034

Acidez titulvel, g cido ltico/100mL

0,14 a 0,18 (14-18oD)

Extrato seco desengordurado, g/100g

>8,4

ndice crioscpico

Mx. - 0,512oC

Protenas, g/100g

>2,9

proibida a realizao de padronizao ou desnate na propriedade rural.

Fonte: MAPA, 2002.

O conhecimento da composio do leite uma ferramenta estratgica para o produtor

que pode planejar e aplicar os efeitos da alimentao, do manejo reprodutivo e da gentica
sobre a lactao. Tambm importante para a indstria processadora para manipulao das

16

caractersticas fsico-qumicas do leite para a elaborao de diferentes produtos lcteos

(SANTOS e FONSECA, 2007).
A gordura possui importantes funes e caractersticas especficas, dentre elas: a
maior fonte de energia do leite, possui inmeras propriedades que permitem diversificao
nas indstrias lcteas, responsvel por boa parte das caractersticas sensoriais do leite.
Existem essencialmente trs maneiras de influenciar o teor de gordura do leite: seleo
gentica, identificao e manipulao dos genes que controlam a composio do leite e pela
nutrio. Apesar do melhoramento gentico ser uma importante via para o aumento da
gordura no leite, a nutrio a forma mais rpida de se atingir tal objetivo (SANTOS e
FONSECA, 2007).
De acordo com Harris e Bachamn (1988) o fator que mais interfere no percentual de
gordura do leite o teor de fibra da dieta, ou a relao concentrado/volumoso. Assim, quanto
maior o teor de fibra na alimentao, maior o teor de gordura do leite, devido variao na
proporo de cidos graxos volteis produzidos no rmen. Uma maior ingesto de fibra
aumenta a produo de cido actico e reduz a proporo de cido propinico. O cido
actico um dos principais precursores da gordura do leite e seu acrscimo est diretamente
relacionado com o aumento desta no leite (CARVALHO, 1977).

2.2 Consideraes Gerais sobre Protenas no Leite

Uma das principais funes fisiolgicas do leite a de fornecer proteo ao organismo

de quem o consome, sendo a maior parte desta funo proporcionada pelas protenas e
peptdeos em sua composio (FOX e MCSWEENEY, 2003).
A protena atualmente o componente do leite mais valorizado na maioria dos pases.
A valorizao da protena em detrimento da gordura tem se tornado uma tendncia, uma vez
que muitos consumidores esto mais conscientes dos valores nutricionais e calricos dos
alimentos e a sua relao com a sade (SANTOS e FONSECA, 2007).
A facilidade com que o leite pode ser convertido em uma extensa variedade de
diferentes e atrativos produtos , provavelmente, a sua mais importante caracterstica do ponto
de vista industrial. A fabricao de muitos destes produtos depende de algumas propriedades
nicas das protenas do leite, que vm recebendo uma ateno considervel da pesquisa (FOX
e MCSWEENEY, 2003).

17

Segundo Ribas (1998), as porcentagens de protena nos leites oriundos de vacas das
raas Holandesa, Jersey e Pardo-Suia so 3,11; 3,68 e 3,37%, respectivamente.
Dentre os parmetros de qualidade, a protena do leite uma das mais importantes,
principalmente para a indstria, em decorrncia da sua relao com o rendimento industrial.
Assim como esta visa a protena do leite, a legislao nacional com a Instruo Normativa 51
(IN51) do Ministrio da Agricultura, estabelece o teor de protena mnimo de 2,9% para o
leite ser passvel de comercializao entre produtor e indstria (MAPA, 2002). Com isso
intensificaram-se as pesquisas na rea de quantidade de protena no leite.
Diversos fatores podem afetar a produo de protena lctea da vaca, entre os quais
destacam-se as caractersticas genticas, estgio de lactao, alimentos utilizados, formulao
da dieta, manejo alimentar e condies ambientais. Dentre esses fatores, a grande maioria
apresenta possibilidades limitadas de manipulao, quando comparado com a gordura do leite
(SANTOS e FONSECA, 2007).
Embora a quantidade de protena seja importante para o rendimento industrial, existe
tambm a preocupao com a qualidade da protena em termos de estabilidade trmica, uma
vez que as indstrias de laticnios buscam matrias primas que resistam ao processamento
trmico (ROMA JUNIOR et al., 2007).

2.2.1 Classificao das Protenas no Leite

As protenas do leite podem ser classificadas em quatro grupos, de acordo com suas
propriedades fsico-qumicas e estruturais: protenas do soro, casenas, protenas das
membranas dos glbulos de gordura e enzimas e fatores de crescimento (SGARBIERI, 1996;
LOURENO, 2000).
As protenas do soro do leite apresentam excelente composio em aminocidos, alta
digestibilidade e biodisponibilidade de aminocidos essenciais, portanto, elevado valor
nutritivo (SGARBIERI, 1996). Constituem um grupo bastante diversificado de protenas com
caractersticas estruturais bem diferentes (WONG et al., 1996). No soro de leite bovino
predomina a -lactoglobulina (-LG), que praticamente no ocorre no leite humano. Cerca de
12 variantes genticas j foram identificadas no soro de leite bovino, sendo as duas principais
as -LG A e B (PANICK et al., 1999). A -LG uma protena termossensvel e vrios efeitos
so produzidos por ao da temperatura, entre eles, a perda de solubilidade (IAMETTI et al.,
1996). Durante o processamento do leite em escala industrial, a -LG apontada como

18

responsvel pelo incio do processo de agregao que conduz a uma obstruo e

conseqente perda de eficincia dos trocadores de calor (SAWYER e KONTOPIDIS, 2000).
Outra importante protena encontrada no soro de leite a -lactoalbumina (-LA),
sendo que duas variantes genticas j foram identificadas (A e B), porm somente a variante
B tem sido encontrada em leite das raas bovinas ocidentais (SGARBIERI, 2005). A -LA
tem uma alta afinidade pelo Ca++ e outros ons metlicos.
Das protenas do soro, a proporo das fraes de -lactoalbumina e -lactoglobulina
corresponde a 3:1 (m/m), respectivamente (WALSTRA e JENNESS, 1984).
As casenas compreendem as principais protenas encontradas no leite, sendo que
aproximadamente 80% da protena total do leite bovino, formada pela casena (CHEFTEL
et al., 1989).
A casena uma fosfoprotena sintetizada nas clulas epiteliais da glndula mamria e
secretada na forma de micelas. Normalmente, a casena bastante estvel em altas
temperaturas e no afetada pela pasteurizao, entretanto quando h acidificao do leite,
ocorre a desestruturao das micelas e formao do cogulo (SANTOS e FONSECA, 2007).
So classificadas em quatro subgrupos: casenas , , e , sendo que as casenas formam
uma famlia de protenas com caractersticas diferenciadas ( S0 a S5). Dentro de cada grupo
de casenas aparecem ainda variantes genticas, que so mutaes que ocorreram na estrutura
primria das casenas em que um ou mais aminocidos foram substitudos por outros na
seqncia primria da cadeia polipeptdica (SGARBIERI, 2005).
As propores de ocorrncia para -S1, -S2, , -casenas, so, respectivamente,
4:1:4:1 (m:m:m:m) (WALSTRA e JENNESS, 1984).
A casena -S1 precipita com nveis de clcio muito baixos, j a casena -S2
caracteriza-se por ser mais sensvel a esta precipitao. A -casena uma fosfoprotena
sensvel ao clcio, porm em menores nveis do que as casenas . Diferentemente das outras
casenas, a -casena uma glicoprotena, sendo, portanto, estvel na presena de ons de
clcio e assumindo importante papel na estabilidade da micela de casena (WALSTRA,
1999).
Cerca de 80-90% de toda a casena presente no leite bovino est na forma de micelas
(SGARBIERI,1998). As micelas de casena apresentam estrutura supramolecular, cujo arranjo
molecular ainda no foi totalmente esclarecido. Vrios modelos so encontrados na literatura
para representar as micelas de casena. Nos ltimos anos tem ganhado suporte a estrutura

19

proposta por Walstra (1999), com as seguintes caractersticas: as micelas apresentam-se

essencialmente esfricas, contudo sua superfcie no se apresenta lisa; so formadas de
unidades menores denominadas submicelas, contendo principalmente casena, mas apresenta
composio mista; as submicelas variam em composio, existindo particularmente dois tipos
principais, isto , um tipo formado pelas casenas -S, e e outro formado pelas casenas S

e ; as submicelas parecem permanecer ligadas por aglomerados de fosfato de clcio; as

submicelas se agregam at formao completa da micela, em que a casena se posiciona na

superfcie da micela; a poro C-terminal da casena (glicopeptdeo) projeta-se para fora da
superfcie da micela, formando uma camada esponjosa que previne por repulses estticas e
eletrostticas qualquer agregao posterior de submicelas.

2.3 Estabilidade das Micelas de Casena

A estabilidade da micela de casena depende da presena de -casena na sua
superfcie, a qual se constitui na frao hidroflica da casena, que reage com a gua e impede
a agregao das micelas (CREAMER et al., 1998). Segundo Tuinier e Kruif (2002), a
estabilidade estrica gerada pela relativamente esparsa camada externa de -casena em forma
de escova o fator estabilizante mais importante.
Hidrlise enzimtica de -casena, temperatura, pH, excesso de Ca++ e adio de etanol
esto entre os principais fatores que afetam a estabilidade coloidal das micelas de casena
(OCONNELL et al., 2006).
A hidrlise enzimtica da -casena reduz a estabilizao estrica das micelas, bem
como a repulso eletrosttica intermicelar, resultando na coagulao do leite (FOX et al.,
1996).
Microrganismos psicrotrficos, ao se multiplicarem no leite armazenado em baixas
temperaturas, produzem enzimas proteolticas termoestveis, a maioria das quais tem ao
sobre a -casena, resultando na desestabilizao das micelas e coagulao do leite
(FAIRBAIN e LAW, 1986).
A 4-5oC a interao hidrofbica fica fraca e parte das casenas, em especial, a casena inicia a dissociao das micelas. A hidratao aumenta, j que as cadeias de -casena
projetam-se da superfcie micelar, e uma pequena parte do fosfato de clcio se dissolve. Estas
trocas so responsveis pela ligeira desintegrao das micelas. A 0oC a agregao micelar
difcil de acontecer e, em altas temperaturas, a quantidade de fosfato de clcio associado s

20

micelas aumenta e ocorre dissociao da -casena, diminuindo a estabilidade (WALSTRA,

1999).
As ligaes que mantm as micelas de casena juntas so mais fracas e escassas a pH
5,2 ou 5,3. A pH inferior, com o aumento da atrao eletrosttica entre as molculas de
casena, as micelas mantm-se mais fortemente juntas; a pH superior uma quantidade
crescente de fosfato de clcio coloidal faz o mesmo (WALSTRA, 1999).
Leite masttico e do final da lactao tm trs vezes mais probabilidade de ser
instveis do que leites de vacas no incio ou meio da lactao. O fator responsvel por este
efeito o aumento do pH do leite, devido maior permeabilidade do epitlio mamrio a
pequenas partculas e ons (HOLT, 2004).
O excesso de Ca++ diminui a solubilidade das protenas em gua. O excesso de sais
domina as cargas do solvente (gua), diminuindo, conseqentemente, o nmero de cargas
disponveis para se ligarem ao soluto (protena). Desta forma, aumenta a interao
soluto/soluto, ocorrendo a precipitao das protenas (HOLT, 2004).
De acordo com Varnam e Sutherland (1995), a concentrao de citrato afeta o
contedo de clcio solvel e a estabilidade do leite. O citrato seqestra o clcio inico,
reduzindo o clcio disponvel para unir-se com a casena e estabilizando as micelas, evitando
sua agregao.

2.4 Avaliao da Estabilidade das Protenas do leite

A estabilidade trmica do leite pode ser definida como o tempo necessrio para ocorrer
coagulao visvel, em determinado pH e temperatura. Esta estabilidade est diretamente
relacionada com a capacidade do leite resistir coagulao pelo calor e, portanto s suas
caractersticas de processamento (SILVA, 2003). De forma geral, considera-se aceitvel
estimar a estabilidade trmica do leite pelo emprego da prova do lcool ou do alizarol, que
um teste muito utilizado para determinar a aptido do leite para o tratamento trmico (SILVA,
2003).
A prova do lcool o principal teste utilizado nas plataformas de recepo dos
laticnios, a fim de detectar a termoestabilidadade do leite cru (MOLINA et al., 2001).
Segundo Ponce (2000), tal prova pode ser considerada como a mais simples na
recepo de leite em uma indstria de laticnio. Ela pode ser usada como mtodo rpido para
estimar a estabilidade das protenas do leite, uma vez que este teste mede indiretamente a
estabilidade do leite ao tratamento trmico (BARROS, 2001). Inicialmente, a prova do lcool

21

foi utilizada como estimativa da presena de cido ltico oriundo da fermentao de

microrganismos mesfilos, mas atualmente, em condies de refrigerao do leite na prpria
fazenda, o seu uso est relacionado com a definio da aptido do leite ao processamento.
Os microrganismos mesfilos predominam em situaes em que h falta de condies
bsicas de higiene ou falhas de refrigerao do leite. Nessas circunstncias, bactrias como
Lactobacillus, Streptococcus, Lactococcus e algumas enterobactrias atuam pela fermentao
da lactose, produzindo cido ltico e gerando, assim, acidez do leite (SANTOS e FONSECA,
2007).
A prova do lcool apresenta, como princpio, a atuao do lcool como um
desidratante, simulando as condies do aquecimento. Para isto, so colocados em um tubo de
ensaio 2 mL de leite e 2 mL de etanol a 68-72% (v/v) (MAPA, 1981). Caso haja floculao do
leite, pode-se suspeitar de leite cido ou com instabilidade de protena, sendo esta amostra
considerada no apta para a industrializao (MOLINA et al., 2001).
Deve-se destacar que, inicialmente, o Ministrio da Agricultura recomendava que a
prova do lcool fosse realizada utilizando-se 68% de lcool, e que atualmente a grande
maioria das indstrias utiliza este mesmo teste na concentrao de at 78%, o que, segundo
Molina et al. (2001), pode levar ao descarte de leite de forma injustificada.
No estudo de Molina et al. (2001), realizado no Chile, a estabilidade trmica do leite
foi correlacionada com os resultados da prova do lcool a 70, 75, 80 e 85% (v/v), sendo que o
leite estvel a 75% de lcool apresentou estabilidade trmica de 60 70 segundos a 135C.
No foi observada uma correlao significativa entre a resistncia prova do lcool e a
estabilidade trmica do leite, o que no justificaria a utilizao desta prova em concentrao
acima de 75% de lcool. Ressalta-se que, para a fabricao de leite UHT (Ultra High
Temperature) o produto submetido, durante 2-4 segundos, temperatura entre 130C e
150C.
Zadow (1993) menciona que j nos primeiros estudos sobre a estabilidade do leite ao
etanol, determinou-se que os ctions bivalentes e a concentrao do etanol teriam um
importante efeito na prova do lcool, estabelecendo que a concentrao de etanol requerida
para coagular a casena, em um volume igual de leite, estava inversamente relacionada com a
concentrao do on clcio. Ao se utilizar uma maior concentrao de etanol na prova do
lcool, produz-se uma maior desestabilizao das protenas, devido reduo da constante
dieltrica ao meio, modificando a carga das protenas.
Hone e Parker (1981) afirmaram que o lcool reduz a constante dieltrica ao meio,
eliminando a barreira de energia que previne a coagulao. Se a constante dieltrica

22

reduzida at um valor de pH crtico, as micelas de casena precipitam. Hone e Parker (1980)

indicam que a estabilidade do leite ao etanol ocorre em funo do pH, entre pH 6,4 a 7,0;
obtendo-se uma curva sigmide ao relacionar o pH versus concentrao de etanol.
De acordo com Pierre (1989), ocorrem variaes nas cargas das micelas de casena. O
pH referente mnima estabilidade ser diferente segundo a amostra, visto que depender da
carga inicial das micelas, o que poderia estar relacionado com a composio qumica das
casenas do leite.
A estabilidade do leite frente s solues de etanol depende da composio dos sais e
tambm da composio das casenas (SCHMIDT e KOOPS, 1977). Guo et al.(1998), ao
compararem a estabilidade do leite de cabra e de vaca frente prova do lcool, determinaram
um valor mdio para leite de cabra de 44% e para leite de vaca de 72%, o qual foi explicado
pela carncia de S1 casena no leite de cabra e seu maior contedo de sais.
Farah e Atkins (1992) encontraram valores distintos de termoestabilidade entre os
leites de camela e vaca. A menor termoestabilidade determinada no leite de camela, justificase pela menor concentrao de -casena e -casena.
Guo et al. (1998) mencionam que a estabilidade coloidal das micelas de casena
depende de vrios fatores, entre eles, composio das micelas e/ou sua estrutura, pH do meio,
temperatura, fora inica e balano de sais, especialmente o nvel de Ca++ e distribuio de
fosfatos. De acordo com Holt (1991), uma elevada concentrao de Ca++ tende a unir as
micelas de casena favorecendo a coagulao.
Segundo Santos e Fonseca (2007), de forma semelhante ao clcio, o citrato do leite
encontra-se na forma solvel e coloidal. A adio de citrato ao leite aumenta a estabilidade
trmica em razo de seu efeito de seqestrar o clcio inico.

2.5 Ocorrncia do Leite Instvel No cido (LINA)

O Leite Instvel No cido (LINA) definido como o produto que apresenta perda da
estabilidade da casena do leite ao teste do lcool, porm como acidez titulvel abaixo de
18oD (graus Dornic). Este fato causa significativos prejuzos econmico-financeiros a toda
cadeia produtiva, pois o leite rejeitado ou subvalorizado pela indstria, mesmo apresentando
nveis de acidez considerados normais pelos padres do MAPA, sendo deixado, na maioria
das vezes, na propriedade rural (RIBEIRO et al., 2007).
H vrias dcadas existem dados sobre alteraes nas caractersticas fsico-qumicas
do leite por causas no totalmente esclarecidas. O aparecimento de leite que reage

23

positivamente prova do lcool ou prova do cozimento, sem estar cido nem ser originrio
de vacas com mastite, um problema prtico que acomete com freqncia rebanhos leiteiros
e/ou indstrias lcteas (PONCE, 2000).
Em trabalho sobre coagulao do leite fresco frente ao lcool, Mitamura (1937)
menciona variaes na estabilidade do leite que ocorreram em Utrecht, na Holanda, em 1930.
De acordo com Davies e White (1958), nos casos de Utrecht, a instabilidade da
protena ao calor e ao etanol estava relacionada com a concentrao de ons de clcio no leite.
A adio de substncias alcalinas ou nions que combinam com o clcio, como citrato de
sdio, reduz a concentrao de ons de clcio, aumentando a estabilidade do leite ao etanol.
Alteraes dessa natureza foram relatadas pela literatura em diferentes regies do
mundo, como no Japo (YOSHIDA, 1980), na Itlia (PECORARI et al., 1984), no Iran
(SOBHANI et al., 1998), no Uruguai (BARROS et al., 1999), na Bolvia (ALDERSON,
2000), em Cuba (PONCE, 2000), na Argentina (NEGRI et al., 2001) e no Brasil
(CONCEIO et al., 2001; DONATELE et al., 2003; MARQUES, 2004; ZANELA, 2004).
Na Itlia, Pecorari et al. (1984), estudando leite com tempo de coagulao anormal,
encontraram valores baixos para os teores de casena, lactose e minerais (clcio e fsforo) e
alteraes nas propriedades fsico-qumicas, como baixa acidez titulvel, alto pH e resultado
positivo na prova do lcool.
No Uruguai, Barros et al. (1999), estudando variaes na composio do leite
individual em funo da positividade prova do lcool, encontraram 146 amostras de leite
negativas na prova do lcool e 70 positivas. Segundo esses autores, a estabilidade do leite ao
teste do lcool depende da composio das pastagens, da composio qumica do leite, das
propriedades das micelas de casena e dos componentes do soro lcteo. A reao positiva de
leite com pH normal (6,6 a 6,8) ao teste do lcool pode estar relacionada com variaes
metablicas ou nutricionais e com o perodo de lactao das vacas.
Em Cuba, Ponce (2000) relatou que desde 1976 ocorria, em uma regio deste pas,
produo de leite com reao alcalina e resultado positivo prova do lcool, sem que este
leite fosse proveniente de vacas com mastite ou com lactao prolongada. A nica condio
associada a estas alteraes foi a alimentao de animais da raa Holandesa de alto potencial
gentico baseada na utilizao de cana-de-acar como forragem durante a poca de seca. O
autor props a denominao Sndrome do Leite Anormal (SILA) para este tipo de
anormalidade do leite.

24

A SILA, de acordo com Ponce e Hernndez (2001), refere-se a um conjunto de

alteraes nas propriedades fsico-qumicas do leite, caracterizadas por diminuio dos
slidos totais, da estabilidade trmica e da capacidade tamponante, que causam transtornos
nos processos de elaborao de derivados lcteos, no seu rendimento e/ou na sua qualidade
final. um fenmeno ainda no bem identificado em todos os casos, de causa multifatorial
associada a transtornos fisiolgicos metablicos e/ou nutricionais com implicaes nos
mecanismos de sntese e secreo lcteas. Os desequilbrios em energia e protena associados
s caractersticas da rao, com implicaes no ambiente ruminal e comprometimento do
metabolismo geral (acidose), so os fatores de maior considerao nos casos que ocorreram
em Cuba. Essa sndrome teve maior ocorrncia em bovinos com alto potencial gentico e em
pocas de estresse nutricional e/ou calrico.
No perodo de seca do ano de 1993, em Havana, foi realizado um estudo em 227
propriedades leiteiras com 15.000 vacas em ordenha. Das amostras analisadas, 79%
apresentaram resultado positivo no teste do lcool, com acidez menor que 13D, indicando
que nem sempre o resultado positivo no lcool est relacionado com acidez elevada. Nesse
estudo, foi acompanhado o processo de ordenha para excluir adulterao por aguagem, bem
como foi verificada a ocorrncia de mastite, excluindo amostras positivas ao California
Mastitis Test (CMT) com duas ou mais cruzes. A maior parte dos rebanhos que apresentavam
leite instvel se caracterizava por apresentar animais com baixa condio corporal e sofrendo
de subnutrio, e a alimentao atendia a cerca de 50 a 70% das necessidades bsicas.
(PONCE e HERNNDEZ, 2001).
No Brasil, a incidncia do LINA ainda carece de diagnstico devido escassez de
trabalhos de pesquisa (RIBEIRO et al., 2007).
Em estudo realizado por Balbinotti et al. (2003), foi avaliada a ocorrncia de
instabilidade do leite na regio Sul do Rio Grande do Sul. Foram analisadas 3.353 amostras de
leite quanto prova do lcool (76% (v/v)) e acidez titulvel. De acordo com os resultados, a
grande maioria (72,2%) das amostras positivas prova do lcool (com instabilidade da
protena) apresentou acidez titulvel normal, caracterizando que a instabilidade do leite
observado no estudo no tinha origem da presena de cido ltico.
Zanela (2004), ao analisar 2.396 amostras de leite provenientes da regio noroeste do
Rio Grande do Sul de setembro de 2002 a agosto de 2003, verificou que 55,2% destas
apresentaram LINA.
Na regio Norte do Estado do Rio de Janeiro, Donatele et al. (2003) constataram que
59,6% dos quartos analisados de vacas leiteiras produziram leites positivos ao teste do

25

Alizarol diludo em lcool a 72% (v/v), sem que houvesse nenhum fator conhecido
determinante de acidificao. Observou-se que 13,6% das amostras positivas possuam acidez
entre 18,1 e 20D, ou seja, dentro do padro normal estabelecido pela legislao brasileira
(15-20oD) (MAPA, 1980). Segundo os autores, esse problema acarreta perdas econmicas ao
produtor, j que o leite pago atualmente pela negatividade neste teste. No mesmo estudo, os
autores verificaram que 89,55% das amostras positivas para o teste do Alizarol estavam
dentro da faixa normal de pH, onde nenhuma amostra apresentou valor de pH inferior a 6,4.
Scarlatelli (1999) considera o pH normal do leite entre 6,4 e 6,8.
Roma Junior et al. (2007) realizaram um estudo em que 2.981 amostras provenientes
dos Estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e So Paulo, foram analisadas no perodo de
outubro de 2005 a setembro de 2006. Foram consideradas, neste estudo, como LINA, as
amostras que apresentaram coagulao na prova do lcool (78% v/v), acidez titulvel menor
que 18oD e pH acima de 6,6. Como resultado, os autores verificaram que 222 amostras foram
classificadas com protena instvel (7,4%).
No mesmo experimento foram avaliados os perodos de maior incidncia de LINA,
que resultaram nos meses de maro e agosto de 2006. Os autores atriburam tal resultado ao
fato de haver uma relao direta entre a incidncia de LINA e a nutrio animal, onde ocorre
sua maior incidncia no incio do outono (maro) e a queda da incidncia a partir do incio da
primavera (setembro), fato este explicado pela estacionalidade de produo e qualidade das
forragens entre os perodos citados.
As pastagens representam a fonte de alimento mais importante para a produo de
bovinos no Brasil, assim, a produo dos rebanhos depende, fundamentalmente, da produo
de forragem, principalmente de gramneas e leguminosas das pastagens (MARQUES, 2003).
No Brasil, existem duas estaes climticas bem definidas, que afetam diretamente a
produo de forragem: a das guas e a da seca. Na estao das guas, as condies de
umidade, temperatura e luminosidade so geralmente favorveis ao crescimento das espcies
tropicais. Por outro lado, esses fatores climticos, durante a estao da seca quase sempre so
adversos ao crescimento dessas espcies. Como conseqncia, ocorre uma marcante
estacionalidade anual na produo de forragem e na disponibilidade de leite bovino
(MARQUES, 2003).
Zanela et al. (2006), realizaram um experimento com o objetivo de avaliar o efeito da
restrio alimentar na incidncia do LINA e concluram que a restrio alimentar de 40%, nas
exigncias nutricionais de matria seca, protena e energia, aumenta a ocorrncia de LINA em
vacas Jersey, quando se utiliza lcool 76% na avaliao da instabilidade.

26

2.6 Composio e Caractersticas Fsico-Qumicas do Leite Instvel No cido (LINA)

Oliveira e Timm (2006) analisaram 282 amostras de leite cru obtidas na Regio Sul do
Brasil; comparando as amostras com instabilidade da casena (LINA) com as amostras de
leites normais. O componente do leite que apresentou maior variabilidade foi a gordura,
havendo um aumento significativo da mdia dos teores de gordura do leite normal (3,04%)
em relao ao LINA (3,30%). Por outro lado, o leite normal apresentou teores mdios de
lactose (4,33%) significativamente mais elevados que a mdia da lactose do LINA (4,16%).
Marques et al. (2007) verificaram um aumento significativo nos nveis de gordura ao
compararem os valores apresentados pelo leite normal (3,52%) com os do LINA (3,62%).
Outros autores obtiveram resultados semelhantes. Barros et al. (2001), estudando
variaes do leite individual em funo da positividade prova do lcool, encontraram para
teores de gordura e lactose, respectivamente, mdias de 3,95% e 4,65%, para resultados
positivos, e de 3,40 e 4,84%, para resultados negativos.
Ponce e Hernndez (2001) observaram aumento nos teores de gordura e diminuio
nas concentraes de lactose no leite aps a reproduo experimental de um quadro de
sndrome do leite anormal (SILA). Marques (2004) tambm obteve uma queda nos nveis de
lactose, sendo que os valores mdios obtidos para leite normal e LINA foram
respectivamente, 4,42% e 4,32%.
J Zanela et al. (2006), encontraram uma tendncia de aumento no teor de gordura no
LINA, porm no estatisticamente significativa. Sobhani et al. (1998) no encontraram
diferena significativa para a variao de gordura no leite instvel ao lcool, porm a lactose
para as amostras deste tipo de leite apresentou valores inferiores quando comparados com os
do leite normal.
Uma alimentao rica em fibras explicaria as alteraes de composio observadas e,
conseqentemente, levantaria a hiptese da ligao deste tipo de alimentao com a
ocorrncia de instabilidade da casena, possivelmente atravs de desequilbrios minerais que
provocariam alteraes inicas no leite (OLIVEIRA e TIMM, 2006).
A composio do leite com casena estvel sugestiva, devido aos mecanismos
metablicos mencionados, de que os animais que o produziram tenham recebido
suplementao com concentrados, em geral melhor balanceados, o que permitiria a produo
de leite com equilbrio inico normal e com casena estvel. Esta hiptese corroborada pelo
estudo de Rodas et al. (2000), que, trabalhando com rebanhos suplementados e no
suplementados com alimento concentrado, observaram que o leite proveniente de rebanho que

27

no recebeu suplementao apresentou positividade no teste do lcool, com acidez variando

de 14D a 15D.
Oliveira e Timm (2006) tambm verificaram que no houve diferena estatisticamente
significativa entre o teor de protena do leite normal (2,91%) e do leite com instabilidade da
casena (2,89%). Segundo os autores, talvez seja possvel que, como o contedo protico do
leite no to varivel quanto a gordura, os fatores que promoveram a elevao desta no
tenham sido suficientemente fortes a ponto de alterar os teores de protena do leite com
casena instvel. Tambm no houve diferena significativa entre o teor de extrato seco total
do leite normal (11,17%) e do leite com instabilidade da casena (11,25%), o que pode ser
explicado pela compensao da queda no teor de lactose pelo aumento no teor de gordura. O
mesmo ocorreu com o estudo de Sobhani et al. (1998), em que os valores para protena no se
diferenciaram.
Porm, Barros et al. (2001) encontraram diferena significativa entre o teor de protena
em amostras negativas no teste do lcool, com mdia de 3,23%, e positivas, com mdia de
3,49%. J Marques (2004), verificou que os nveis de protena bruta diminuram no leite
classificado como LINA (3,03%) quando comparado com o leite normal (3,06%). Resultados
semelhantes foram obtidos por Ponce e Hernndez (2001).
A contagem de clulas somticas (CCS) apresentou diferena estatstica no
experimento de Marques (2004). Para as amostras normais foi encontrado o valor de 401.000
cl/mL, enquanto que para o LINA, 463.000 cl/mL. Tais resultados diferem dos obtidos por
Donatele et al. (2003) e Zanela et al. (2006), que analisaram amostras de leite e no
encontraram relao entre leite positivo ao lcool e alta CCS.
No Brasil, a incidncia do LINA ainda necessita de diagnsticos devido falta de
trabalhos de pesquisa. As causas do LINA ainda no esto totalmente esclarecidas, entretanto,
sabe-se que o LINA um problema multifatorial. H indcios de que o padro de protena
produzido possa ter importante influncia na estabilidade do leite. Alm disso, h citaes da
ao de microrganismos como causa da instabilidade. Tambm existem indcios de que nveis
elevados de clcio inico resultem em menor estabilidade, e por outro lado, a temperatura
provocaria alterao na conformao da casena aumentando a estabilidade do leite
(RIBEIRO et al., 2007).
Zanela et al (2006) afirmam que a etiologia do LINA no se encontra associada apenas
a fatores nutricionais, mas pode estar associada tambm a fatores genticos. Tais autores
ainda afirmam que h necessidade de maior nmero de trabalhos para avaliar com maior
preciso as causas do LINA. Ressalta-se que a ocorrncia do LINA tem sido constatada em

28

vrias regies do Brasil, porm as causas relacionadas ainda no foram completamente

esclarecidas. Conseqentemente, leites identificados como LINA so erroneamente
interpretados como cidos, penalizando o produtor sem que este possa identificar o que
acontece no rebanho.
A Instruo Normativa n 51, do Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento
evidencia a preocupao com as condies higinicosanitrias do leite, porm no faz
referncia composio qumica, que tambm importante para a obteno de produtos de
qualidade, e pode estar relacionada com as causas para a ocorrncia do LINA. No h muitas
referncia de estudos disponveis na literatura sobre a participao relativa das fraes
proticas nos leites identificados como LINA.
Com relao possvel a influncia do LINA sobre o rendimento e a qualidade dos
derivados lcteos, Ponce (2000) observou maior deposio de sujidades nos equipamentos de
processamento trmico, ocasionando interrupes adicionais durante o processo para
realizao de limpezas nos trocadores de calor. Alm disso, o autor tambm relatou alteraes
na fabricao de derivados lcteos (especialmente de queijos e iogurtes), tais como: reduo
no rendimento, aumento no tempo de coagulao, surgimento de caractersticas indesejveis
no cogulo, alta reteno de gua, perda de protenas no soro. Estes resultados, no entanto,
diferem dos obtidos por Ribeiro et al. (2007), que compararam o efeito do LINA na
industrializao do iogurte batido com iogurtes fabricados com leites considerados normais.
Neste experimento, os autores observaram que no houve alteraes no tempo de
fermentao, pH e viscosidade do iogurte batido elaborado com LINA oriundo de vacas da
raa Jersey. Tendo em vista as controvrsias sobre o assunto, Ribeiro et al. (2007), destacaram
a falta de dados cientficos na literatura, o que impossibilita concluir satisfatoriamente a
respeito dos efeitos do LINA sobre os derivados lcteos.

29

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Determinar a ocorrncia e as caractersticas fsico-qumicas do LINA no leite
de propriedades leiteiras da regio de Casa Branca, Estado de So Paulo.

3.2 Objetivos Especficos

a) Identificar o LINA em amostras de leite de conjunto das propriedades leiteiras citadas
no perodo de maro a setembro de 2007;
b) Determinar as caractersticas fsico-qumicas (pH, acidez, slidos totais, gordura,
lactose, protena total), contagem de clulas somticas (CCS) e as fraes de casena
(casenas -S1, -S2, e ) dos leites identificados como LINA e de leites estveis
prova do lcool;
c) Avaliar comparativamente os resultados obtidos nos leites identificados como LINA e
estveis prova do lcool.

30

4. MATERIAL E MTODOS

4.1 Descrio do Universo Amostral

As amostras de leite foram colhidas em propriedades leiteiras fornecedoras de uma

usina de beneficiamento localizada no Municpio de Casa Branca, Estado de So Paulo, cujo
volume mdio de leite captado atualmente encontra-se em torno de 40.000 L/dia. A referida
empresa conta no momento com cerca de 100 produtores, sendo a coleta de leite totalmente
granelizada.
Tal empresa possui em mdia 9 linhas para a captao do leite, contemplando
diversos produtores da regio de Casa Branca/SP. Todas as propriedades cadastradas para o
fornecimento de leite possuem tanques de expanso, visando manuteno da qualidade desta
matria prima. Durante o ano, ocorre uma pequena variao no nmero de produtores
cadastrados, ou seja, no h um nmero fixo de produtores ao longo dos meses.
O transporte do leite das propriedades at a usina de beneficiamento feito atravs
de caminhes isotrmicos conduzidos por seus respectivos motoristas, estes passam por um
treinamento, onde so instrudos sobre a correta maneira de realizar as colheitas das amostras
de cada propriedade.
A usina processa, principalmente, leite longa-vida, mas apresenta tambm, outras
linhas de processamento, tais como diversos tipos de queijos, manteiga, bebidas lcteas e doce
de leite, alm de leite pasteurizado tipo B.

4.2 Colheita de Amostras de Leite

Foram realizadas amostragens nos meses de maro (vero), maio (outono), julho
(inverno) e setembro (primavera) de 2007 (Tabela 3). As amostragens contemplaram todos os
produtores fornecedores de leite do laticnio nos respectivos perodos, totalizando 451
amostras de leite durante o experimento.

31

Tabela 3. Nmero de amostras por perodo de amostragem.

Perodo

Amostras de Leite

Maro

117

Maio

100

Julho

125

Setembro

109

Total

451

De acordo com a rotina de procedimentos da usina, o leite de conjunto de cada

propriedade rural foi colhido em sacos plsticos, de capacidade de 300 mL, regularmente no
momento da coleta a granel e encaminhado ao laboratrio da indstria para a realizao de
uma srie de testes fsico-qumicos (MAPA, 1981).
Antes do incio do experimento, o laticnio forneceu uma lista com os nomes e as
respectivas linhas de todos os produtores fornecedores de leite para a empresa. Com estes
dados recipientes plsticos de 200 mL com tampa de rosca foram identificados. Em cada pote
foram colocadas pastilhas do conservante Bronopol

(2-bromo-2-nitropropano-1,3-diol) com

1 tablete para cada 40 mL de leite, com a finalidade de inibir o crescimento bacteriano no leite
por at 7 dias.
No momento em que os caminhes chegavam ao laticnio com os sacos plsticos
contendo amostras de leite dos tanques de mistura de cada propriedade rural, cerca de 200 mL
do seu volume era transferido para os recipientes plsticos identificados e era realizada uma
leve agitao para dissolver as pastilhas do conservante.
Aps a coleta, os recipientes eram colocados em uma caixa de isopor identificada e
encaminhados cmara fria do estabelecimento.
Aps um perodo mdio de trs dias, ou seja, no momento em que as amostras de
todos os produtores de todas as linhas j estavam coletadas, os potes eram enviados em caixas
de isopor para o Laboratrio de Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos (LMMA) da
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP), em Pirassununga/SP.

32

4.3 Avaliao da Estabilidade do Leite Prova do lcool

No laboratrio, era realizada a identificao das amostras no mais curto tempo

possvel, para evitar que as amostras se deteriorassem, afinal elas ainda seriam enviadas a
outro laboratrio para realizao de outras anlises.
Em uma bancada eram colocados quatro potes por vez, com suas respectivas Placas de
Petri (Figura 1) para a realizao da prova do lcool a 72%, 74%, 76% e 78% (v/v) (Figura 2).
Optou-se por utilizar as Placas de Petri, ao invs de tubos de ensaio, para uma identificao
mais clara e precisa das amostras positivas atravs da visualizao de grumos.
O teste do lcool era realizado da seguinte forma: colocava-se 4 mL (Figura 3) de leite
e em seguida o mesmo volume da soluo de lcool (Figura 4), realizava-se uma leve mistura
(Figura 5) e, imediatamente era feita a interpretao do resultado (Figuras 6 e 7).

Figura 1. Frascos etiquetados contendo as amostras de leite e placas de petri onde eram
realizadas as leituras diante do teste do lcool.

33

Figura 2. Solues de lcool nas concentraes 72, 74, 76 e 78% (v/v).

Figura 3. Demonstrao do teste do lcool (Etapa I): Colocao de 4 mL de leite da amostra

nas placas de petri.

34

Figura 4. Demonstrao do teste do lcool (Etapa II): Colocao de 4 mL de soluo de lcool

nas placas de petri.

Figura 5. Demonstrao do teste do lcool (Etapa III): Homogeneizao.

35

Figura 6. Demonstrao do teste do lcool (Etapa IV): Interpretao do resultado: Ausncia

de formao de grumos, resultado negativo.

Figura 7. Demonstrao do teste do lcool (Etapa IV): Interpretao do resultado: Presena de

grumos, resultado positivo.

36

4.4 Caracterizao do Leite Instvel No cido (LINA) e do Leite Estvel

As amostras que, ao serem testadas na prova do lcool a 72% (v/v), apresentassem

formao de grumos foram encaminhadas para a realizao do teste de acidez Dornic, atravs
da titulao com 0,1 N NaOH (Hidrxido de Sdio), usando como indicador uma soluo
alcolica de fenolftalena a 1%, segundo Laboratrio Nacional de Referncia Animal
(LANARA, 1981).
As amostras que obtiveram acidez Dornic entre 14 e 18oD foram consideradas como
LINA e foram separadas.
Foram consideras amostras de leite estvel, aquelas que apresentaram resultado
negativo diante da prova do lcool a 78% (v/v) e acidez titulvel entre 14 e 18oD. Estas
amostras tambm foram separadas.

4.5 Anlises de Composio e Fsico-Qumica do Leite

As mensuraes do pH foram realizadas logo aps a identificao das amostras de

LINA e leite normal (com casena estvel) no LMMA.
Utilizou-se um pHmetro de bancada (Digimed, DM20), o qual era ligado 15 minutos
antes e calibrado, atravs das solues padres de pH 4,86 e 7,54. Em seguida colocava-se o
bulbo do aparelho na amostra e fazia-se a leitura.
A partir das amostragens do ms de maio (334 amostras, Tabela 3), as amostras
caracterizadas como LINA ou de leite estvel foram separadas e parte do seu contedo (35
mL) foi transferida para tubos prprios para serem enviados Clnica do Leite, localizada na
Escola de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), Piracicaba/SP. Neste local foram
realizadas as anlises de determinao dos teores de gordura, protena, lactose, slidos totais e
teor de extrato seco desengordurado pelo mtodo infravermelho, segundo Association Of
Official Analitical Chemistry (AOAC, 1972).
Tambm na Clnica do Leite, localizada na Escola de Agricultura Luiz de Queiroz
(ESALQ/USP), Piracicaba/SP, foi realizada a Contagem de Clulas Somticas (CCS) nas
amostras caracterizadas como LINA e de leite normal.
Tal procedimento foi realizado pelo aparelho Somacount 150
EUA), atravs de citometria de fluxo.

(Bentley Instruments,

37

4.6 Avaliao das Fraes de Casena

As amostras identificadas como LINA e de leite estvel foram avaliadas quanto s

fraes de casena (casenas S1, S2, e ), sendo que as anlises foram realizadas em
duplicata e o valor final para cada amostra foi obtido pelas suas respectivas mdias.
A determinao quantitativa das fraes de casena e protenas do soro foi realizada
atravs de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), de acordo com a metodologia
preconizada por Bobe et al. (1998) no LMMA.
O mtodo estabelece que alquotas de 500 L de leite devem ser colocadas em um
tubo (ependorf) e congeladas em freezer a - 20oC. Tal procedimento foi realizado em todas as
amostras selecionadas.
No momento anterior s anlises acrescentaram-se 500 L de soluo contendo 0,1 M
de tampo BisTris (pH 6,8), 6 M de cloridrato de guanidina, 5,37 mM de citrato de sdio e
19,5 mM de ditiotreitol (pH 7), seguido de agitao por 10 segundos em temperatura
ambiente. Aps permanecerem 1 hora em repouso, os tubos foram centrifugados por 5
minutos a 14.000 rpm. A camada de gordura foi removida com uma esptula e o restante da
amostra diludo com uma soluo contendo 4,5 M de cloridrato de guanidina e mistura de
solventes (solvente A, composto por acetonitrila + gua + cido trifluroactico 100 : 900 : 1,
pH 2,0). Esta soluo continha, aproximadamente, 4 mg/mL de protenas totais foi utilizada
para a determinao das fraes no cromatgrafo. Estas amostras foram previamente filtradas
atravs de membrana de PTFE (Millipore, USA) de 0,22 m e armazenadas em geladeira
(7oC) at o momento da anlise cromatogrfica, onde 20 L de amostra so injetados no
sistema CLAE (Figura 8).

38

Figura 8. Injeo da amostra no sistema CLAE.

A separao, identificao e quantificao das protenas foram realizadas no mesmo
sistema CLAE descrito anteriormente equipado com detector de luz UV. Foi utilizada coluna
Jpiter C18 (4 m x 4,6 x 150 mm) (Phenomenex, Torrance, USA), sendo que 20 L da
soluo foram injetadas no sistema CLAE. A corrida cromatogrfica era realizada em
temperatura ambiente.nas condies preconizadas por Bobe et al. (1998), detalhadas a seguir:
Fases mveis: misturas de solventes A (acetonitrila + gua + cido trifluroactico
100 : 900 : 1) e B (acetonitrila + gua + cido trifluroactico 900 : 100 : 1). O programa de
gradiente foi iniciado com 25% do solvente B, aumentando-se gradativamente a proporo do
solvente B imediatamente aps a injeo da amostra [34% (4min.), 48% (11 min.), 50%
(13min), 10% (17min)], retornando em seguida s condies iniciais aps 2 min;Fluxo: 1,0
mL/minuto; comprimento de onda do detector: 220 nm.
A quantificao das fraes (casenas s1, s2, e ) nas amostras foi realizada
atravs da interpolao das reas dos picos cromatogrficos, obtidos nas amostras, nas
equaes de regresso das curvas de calibrao, construdas utilizando-se padres de
protenas do leite bovino purificadas (Sigma, USA), preparados nas mesmas condies
descritas para as amostras de leite nas seguintes concentraes:

Casena S1 : 0,375, 0,75, 1,50 e 3,00 mg/mL;

Casena S2: 0,125, 0,25, 0,50 e 1,00 mg/mL;

Casena : 0,375, 0,75, 1,50 e 3,00 mg/mL;

Casena : 0,187, 0,375, 0,75 e 1,50 mg/mL.

39

Preliminarmente, os referidos padres foram injetados 10 vezes no sistema CLAE

(10 vezes cada um, separadamente) sendo que o desvio padro relativo das reas obtidas
(consideradas, portanto, como replicatas) foi menor que 0,8% para os nveis descritos de
protenas. Deste modo as curvas de calibrao foram construdas em cada dia de anlise. O
coeficiente de determinao (r2) das curvas variou de 0,9627 a 0,9998, sendo a repetibilidade
da tcnica de preparao das curvas de calibrao para fraes proticas consideradas como
adequadas para os fins propostos no experimento.
O mtodo em apreo j se encontrava validado no laboratrio, mediante a realizao
de ensaios repetidos com amostras de leite integral fortificadas com os padres das fraes
proticas (FERNANDES, 2007).
Exemplos de curvas de calibrao das fraes proticas encontram-se na Figura 9

Peak: kCN3 -- ESTD

Peak: kCN2 -- ESTD

1,5

Amount ( mg/mL )

Amount ( mg/mL )

1,5

1,0

0,5

1,0

0,5

0,0

0,0
0

200000

400000

600000

800000

200000

600000

Peak: bCN -- ESTD

Peak: aCNs2 -- ESTD

Amount ( mg/mL )

1,0

Amount ( mg/mL )

400000

Area

Area

0,5

0,0
0

500000

1000000

Area

1500000

2000000

2000000

4000000

6000000

Area

Figura 9. Exemplos de curvas de calibrao obtidas na anlise cromatogrfica das fraes de

casena do leite.

40
500 L da amostra de leite
Congelar (-20oC)
Acrescentar 500 L da Soluo A
Soluo A
Bis Triss Buffer

0,1 M (pH 6,8)

Cloridrato de Guanidina

6M

Citrato de Sdio

5,37mM

DTT (ditiotreitol)

19,5mM (pH 7)

Agitar por 10 segundos (temperatura ambiente)

Deixar em repouso por 1 hora

Centrifugar por 5 minutos a 14000 rpm

Remover a camada de gordura com esptula

Diluir o restante da amostra com a Soluo B (1:3)

Soluo B
Cloridrato de
Guanidina

4,5M
Acetonidrila + gua + cido
trifluroactico ( 100 + 900 + 1)

Solvente A

(pH2)

Injetar 20 L da soluo filtrada em membrana PTFE 0,22 m

Quadro 1: Fluxograma para a quantificao das fraes de casena do leite em sistema CLAE.

41

4.7 Anlise dos Resultados

Os resultados obtidos nos exames laboratoriais foram submetidos anlise de

varincia, utilizando-se os procedimentos do General Linear Model do SAS (SAS Institute,
1992), para a verificao de diferenas estatisticamente significativas entre as mdias das
variveis estudadas nas amostras de LINA e de leite estvel analisadas durante o estudo. Para
a comparao entre as mdias, quando aplicvel, empregou-se o teste t-Student, adotando-se,
como nvel de rejeio, = 0,05 (GACULA e SINGH, 1984).

42

5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Avaliao da Estabilidade do Leite Prova do lcool

Os resultados obtidos na realizao da prova do lcool, nas concentraes utilizadas

no presente estudo, nos diferentes meses de amostragem podem ser observados atravs da
Figura 10.

50

Amostras (%)

40
30
20
10
0
maro
Positivas a 72%

Positivas a 74%

maio
Positivas a 76%

julho

setembro

Positivas a 78%

Estveis a 78%

Figura 10. Resultados da prova do lcool em diferentes percentuais (v/v) e meses de

realizao da anlise. n = 451.

As porcentagens de amostras positivas em relao prova do lcool a 72%, 74%, 76%

e 78% (v/v) foram, respectivamente para o ms de: maro (26,50 %, 12,82%, 14,53% e
15,38%), maio (39,00%, 8,00%, 21,00% e 17,00%), julho (44,80%, 9,60%, 20,00% e
12,80%) e setembro (45,87%, 18,35%, 10,09% e 13,76%).
Ressalta-se, que segundo as normas do Ministrio da Agricultura, a prova do lcool
deve ser realizada em concentraes entre 68-72% (v/v) (MAPA, 1981), porm, sabe-se que
diversas indstrias receptoras de leite realizam tal teste em concentraes superiores a esta
(MOLINA et al., 2001).

43

Como pode-se observar, os valores de amostras que apresentaram positividade diante

da prova do lcool a 72% so altos. Tais dados podem estar associados a uma alta
concentrao de microrganismos mesfilos, no caso de ter ocorrido falha no sistema de
refrigerao do leite nas propriedades. Segundo Santos e Fonseca (2007), esses
microrganismos tambm predominam em situaes em que h falta de condies bsicas de
higiene. Em ambientes propcios, os microrganismos mesfilos atuam pela fermentao da
lactose, produzindo cido ltico e gerando, assim, acidez do leite.
J os valores de amostras estveis prova do lcool a 78% (v/v), ou seja, que no
apresentaram coagulao, foram, respectivamente para os meses de maro, maio, julho e
setembro de 30,77%, 15,00%, 12,80% e 11,93%.

5.2 Caracterizao do Leite Instvel No cido (LINA) e do Leite Estvel

Segundo Molina et al. (2001) a prova do lcool o principal teste utilizado nas
plataformas de recepo dos laticnios, a fim de detectar a termoestabilidadade do leite cru.
Caso haja floculao do leite, pode-se suspeitar de leite cido ou com instabilidade de
protena, sendo esta amostra considerada no apta para a industrializao.
A incidncia de LINA entre as amostras que apresentaram positividade diante da

Amostras (%)

prova do lcool a 72% (v/v) pode ser verificada na Figura 11.

80
70
60
50
40
30
20
10
0
maro

maio

julho
LINA

setembro

Total

CIDAS

Figura 11. Ocorrncia de Leite Instvel No cido (LINA) e de amostras cidas em relao s
amostras positivas ao teste do lcool a 72% (v/v) em diferentes meses.

44

Neste experimento, do total de amostras positivas a 72% (v/v), 64,77% foram

classificadas como LINA e 35,23% como oriundas de leite com presena de acidificao
(acidez Dornic superior 18oD).
Tal resultado comprova a ocorrncia do LINA na regio de Casa Branca, Estado de
So Paulo, concordando com os resultados obtidos por Roma Junior et al. (2007), que tambm
relataram a incidncia deste problema neste Estado.
Diante disso, mostra-se que grande parte do leite acaba por ser erroneamente
interpretado como cido. Este fato causa significativos prejuzos econmico-financeiros a
toda cadeia produtiva, pois o leite rejeitado ou subvalorizado pela indstria, mesmo
apresentando nveis de acidez considerados normais pelos padres do MAPA, sendo deixado,
na maioria das vezes, na propriedade rural (RIBEIRO et al., 2007). Os produtores ficam
desorientados, pois desconhecem as razes para tal resultado falso-positivo na prova do
lcool.
Geralmente, estas amostras no so aceitas pelos laticnios, que alegam a possvel
ocorrncia de precipitao da casena do leite, principalmente para a fabricao de leite UHT,
que requer tratamento trmico severo.
Tais resultados, descritos neste experimento, demonstrando a grande incidncia de
LINA, so semelhantes aos obtidos por Yoshida,(1980), Pecorari et al. (1984), Sobhani et al.,
(1998), Barros et al., (1999), Alderson (2000) , Ponce (2000) e Negri et al. (2001) em
diferentes partes do mundo e no Brasil por Conceio et al., (2001); Donatele et al., (2003),
Marques (2004), Zanela (2004), Oliveira e Timm (2006) e Roma Junior (2007). Todos estes
pesquisadores relataram a ocorrncia do LINA, destacando sua importncia para que novas
pesquisas fossem realizadas.
Em maro, 67,74% das amostras positivas em relao prova do lcool a 72% (v/v),
foram classificadas como LINA, ou seja, apresentavam acidez titulvel entre 14 e 18oD e
32,26% foram classificadas como cidas, apresentando acidez titulvel superior a 18oD. Para
os meses de maio, julho e setembro, as porcentagens de amostras encontradas de LINA e de
amostras de leite cido foram: 71,79% e 28,21%, 75% e 25%, 46% e 54%, respectivamente.
Tais dados demonstram que h uma crescente incidncia de LINA nos meses de
maro, maio e julho sendo que em maro ocorreu o final do vero e o incio do outono. J a
maior incidncia de amostras cidas ocorreu no ms de setembro, onde iniciou-se a
primavera. Em setembro tambm, pode-se observar uma queda na incidncia de LINA. Estes
dados indicam que as estaes do ano interferem na ocorrncia de LINA.

45

De maio a julho, com o fim do outono seguindo-se do inverno, ocorreu o perodo de

seca, o que segundo Marques (2003), leva a uma produo de pastagens de baixa qualidade
nutricional para o rebanho leiteiro. Tal estacionalidade na produo de pastagens, que
corresponde ao principal alimento do gado, pode estar relacionada com o aumento na
incidncia de LINA neste perodo.
No Brasil, muito comum o fornecimento de cana-de-acar, como opo de
volumoso na poca da seca, tal fato pode ter contribudo para a maior incidncia de LINA
neste perodo. Ponce e Hernndez (2001), tambm verificaram que este fenmeno ocorre mais
freqentemente nos ltimos meses do perodo seco e incio da primavera, quando existe baixa
disponibilidade de pastos e forragens, alm do incremento relativo no fornecimento e
consumo de cana.
No perodo de seca, ainda pode ocorrer uma carncia alimentar, ou seja, muitas vezes,
os animais no possuem 100% das suas exigncias nutricionais atendidas, devido escassez
das pastagens de boa qualidade. Tal fato pode contribuir para a ocorrncia de LINA. Tais
associaes entre restrio alimentar e incidncia de LINA foram relatadas por Ponce e
Hernndez (2001) e Zanela et al (2006).
Em maro, final do perodo de chuvas, a qualidade das pastagens ainda encontrava-se
superior, neste perodo h uma menor incidncia de LINA quando comparado com os meses
de maio e julho. J no incio de setembro, com a primavera, ocorre uma melhor qualidade das
pastagens, sendo ento o perodo com a menor incidncia de LINA.
Estes resultados permitem a afirmao de que a baixa disponibilidade de pastos e
forragens limita consideravelmente o consumo total de matria seca e sua digestibilidade,
causando transtornos em nvel ruminal que se expressam finalmente em problemas
metablicos e alteraes variadas na qualidade do leite.
Os resultados do presente trabalho so similares aos obtidos por Roma et al. (2007),
que verificaram que os perodos de maior incidncia de LINA compreendem os meses de
maro e agosto de 2006. Os autores atriburam tal resultado ao fato de haver uma relao
direta entre a incidncia de LINA e a nutrio animal, onde ocorreu sua maior incidncia no
incio do outono (maro) e a queda da incidncia a partir do incio da primavera (setembro),
fato este explicado pela estacionalidade de produo e qualidade das forragens entre os
perodos citados.

46

5.3 Composio e Fsico-Qumica do Leite

Os resultados de composio e fsico-qumica das amostras de leite estveis e de

LINA, nos diferentes meses de amostragem, podem ser observados na Tabela 4.
Nos meses de maio e setembro, no houve diferenas estatsticas entre as amostras de
leite estveis e as amostras de LINA. Ou seja, ambos os tipos de leite, apresentaram
resultados semelhantes de pH, acidez Dornic, protena total, gordura, lactose, slidos totais,
extrato seco desengordurado e contagem de clulas somticas.
Diante de tais resultados, possvel afirmar, que, em meses do ano, fora do perodo de
seca, tanto as amostras estveis quanto as de LINA apresentam composio e caractersticas
fsico-qumicas semelhantes, o que no justificaria a rejeio do LINA pelas indstrias ou a
penalizao dos produtores que fornecessem este tipo de amostra.
Relativamente aos resultados obtidos em julho, que foi caracterizado pelo perodo de
seca, o pH das amostras de LINA foi estatisticamente inferior ao obtido pelas amostras
estveis, 6,70 e 6,76, respectivamente. Com isso observa-se que ambos os leites apresentaram
valores de pH considerados normais. Scarlatelli (1999), considera normal o pH do leite entre
6,4 e 6,8. Diante disso, pode-se afirmar que o LINA no apresenta valores de pH fora da
normalidade. A acidez Dornic no apresentou diferenas significativas entre os dois tipos de
leite, sendo que a mdia obtida foi de 17D. Este valor est dentro do padro estabelecido pelo
Ministrio da Agricultura (MAPA, 2002), que considera como normal os valores de acidez
entre 14-18D.

48

Tabela 4. Composio e caractersticas fsico-qumicas dos leites estveis e LINA.

pH

Acidez (D)

Protena
Total (%)

Gordura
(%)

Lactose (%)

Slidos
Totais (%)

ESD (%)

Maio
LINA 6,64+0,017 17,12+0,012 3,18+0,045 3,72+0,120 4,35+0,036 12,11+0,123 8,39+0,074
(n=30)
Estvel 6,70+0,012 16,93+0,102 3,21+0,064 3,45+0,170 4,35+0,051 11,84+0,174 8,43+0,105
(n=15)
Mdia
6,66
17,05
3,20
3,63
4,35
12,02
8,41

CCS
(x1.000cl/mL)
335,60+65,011
286,54+91,939
319,25

Julho
LINA 6,70b+0,015 16,99+0,035 2,98b+0,033 3,61a+0,098 4,38a+0,039 11,75+0,121 8,14b+0,072 491,18a+57,817
(n=23)
Estvel 6,76a+0,018 17,01+0,041 3,11a+0,039 3,28b+0,118 4,54b+0,047 11,81+0,145 8,54a+0,086 299,06b+69,321
(n=16)
Mdia
6,72
17,00
3,04
3,47
4,42
11,78
8,31
412,36
Setembro
LINA 6,64+0,017 16,54+0,021 3,03+0,032 3,87+0,179 4,34+0,044 12,32+0,184 8,26+0,081 567,52+73,038
(n=24)
Estvel 6,70+0,026 16,58+0,40 2,99+0,049 3,66+0,272 4,35+0,067 11,87+0,279 8,20+0,123 306,40+110,769
(n=10)
Mdia
6,66
16,56
3,03
3,74
4,35
12,190
8,25
488,39
LINA: Leite Instvel No cido.
ESD: Extrato seco desengordurado
CCS: Contagem de clulas somticas
As mdias seguidas de letras diferentes apresentaram diferenas significativas no Teste t-Student (p>0,05).

Analisando-se, tanto os valores de pH quanto os de acidez do LINA, observa-se que

tais amostras que apresentaram formao de grumos diante do teste do lcool a 72% (v/v),
no se apresentaram realmente cidas, com isso, nota-se que o uso somente do teste do lcool
para a identificao de acidez no leite, leva obteno de resultados falso-positivos.
Resultados semelhantes foram obtidos por Barros et al. (2001), Donatele et al. (2003), Zanela
et al. (2006), Oliveira e Timm (2006) e Marques (2004).
A concentrao mdia de gordura no LINA foi significativamente superior do leite
estvel, 3,61% e 3,28%, respectivamente. Tais resultados corroboram com os obtidos por
Barros et al. (2001), Ponce e Hernandz (2001), Zanela et al. (2006), Oliveira e Timm (2006),
Marques (2004). J Sobhani et al. (1998) verificaram no haver diferenas nos teores de
gordura entre LINA e leite estvel.
Tais resultados podem estar associados pela maior ingesto de volumosos ou por um
desbalano na concentrao de concentrado:volumoso. O aumento de volumosos leva a um
aumento na concentrao de cido actico que o principal precursor da gordura no leite.
Em relao porcentagem de protena bruta, o LINA apresentou valores mdios
significativamente inferiores (2,98%) aos obtidos pelo leite estvel (3,11%). Tais dados
concordam com os obtidos por Ponce e Hernandz (2001), Oliveira e Timm (2006) e Marques
(2004) que tambm verificaram uma menor concentrao de protena no LINA quando
comparado com leites estveis. Porm Barros et al. (2001), obtiveram o oposto, sendo que
amostras de LINA possuam maiores concentraes de protena.
O decrscimo da concentrao de protena bruta do LINA quando comparado com o
leite estvel pode ser justificado tambm pelo aumento na ingesto de volumosos ou
desbalano na concentrao de concentrado:volumoso, com isso ocorre um aumento na
produo de cido actico (precursor da gordura no leite) e decrscimo na de cido propinico
(precursor da protena do leite).
A concentrao mdia de lactose foi significativamente superior no leite estvel
(4,54%) quando comparada com a obtida pelo LINA (4,38%). Sobhani et al. (1998), Barros et
al. (2001), Ponce e Hernandz (2001), Marques (2004), Zanela et al. (2006) e Oliveira e
Timm (2006) obtiveram resultados semelhantes.
A porcentagem de slidos totais no apresentou diferenas significativas, j em
relao ao extrato seco desengordurado, o leite estvel apresentou valor mdio
significativamente superior (8,54%) ao obtido pelo LINA (8,14%).
Quanto contagem de clulas somticas, a mdia foi significativamente superior no
LINA (491.000 cl/mL), quando comparada com o valor mdio obtido pelo leite estvel

(299.000 cl/mL). Considerando a relao direta entre a ocorrncia de mastite e a perda das
caractersticas do leite, h uma crescente importncia da CCS como parmetro para avaliar a
qualidade do leite no processado. Nas ltimas dcadas, vrios pases tm estabelecido limites
de referncia, cujos valores compreendem: 750.000 cl/mL nos Estados Unidos, 400.000
cl/mL na Unio Europia (PHILPOT, 2002) e na Nova Zelndia, e 500.000 cl/mL no
Canad; (LARANJA e AMARO, 1998).
No Brasil, o Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento estabeleceu atravs
da Instruo Normativa N 51, de 18 de setembro de 2002, o limite mximo de 1.000.000
cl/mL para o leite cru refrigerado (MAPA, 2002). Com isso, percebe-se que mesmo que os
resultados para a CCS tenham sido considerados significativos, observa-se que ambos os
valores mdios esto abaixo do limite estipulado pelo Ministrio da Agricultura. Entretanto,
de fundamental importncia a realizao de novos estudos que avaliem as possveis causas da
relao entre a CCS e a ocorrncia do LINA, conforme obtido no presente trabalho.

5.4 Fraes de Casena do Leite

Na anlise das fraes de casena por CLAE, os tempos de reteno para S1-casena,
S2-casena, -casena e -casena foram 10,24 min, 8,34 min, 10,96 min e 7,60 min,
respectivamente. Na Figura 12, pode-se observar um exemplo de cromatograma obtido para o
padro de protenas, contendo 4,0 mg/mL de S-casena, 3,0 mg/mL de -casena e 1,5
mg/mL de -casena.

Volts

0,2

kCN1

0,1

bCN

kCN2
kCN3
aCNs2

aCNs1

0,3

0,0

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

M inutes

Figura 12. Cromatograma obtido na anlise das fraes de casena. Padro contendo 4,0
mg/mL de S-casena, 3,0 mg/mL de -casena e 1,5 mg/mL de -casena.
kCN: -casena; aCNs1: S1-casena; aCNs2: S2-casena; bCN: -casena.

O cromatograma apresentado por uma amostra de leite classificada como estvel, pode
ser observado na Figura 13.

bCN

0,8

aLA
bLG

kCN2
kCN3
aCNs2

0,4

kCN1

Volts

0,6

aCNs1

0,2

0,0

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

Minutes

Figura 13. Cromatograma das fraes de casena de uma amostra de leite estvel.
kCN: -casena; aCNs1: S1-casena; aCNs2: S2-casena; bCN: -casena.

Nota-se que o cromatograma de uma amostra de leite estvel, similar ao obtido pela
amostra padro.
Observando-se a Figura 14, verifica-se que o cromatograma de uma amostra de LINA
no apresenta diferenas nos picos das fraes de casena quando comparado com os
cromatogramas apresentados por amostras estveis (Figura 13) ou pela amostra padro
(Figura 12). Tal fato indica que no h diferenas no perfil das fraes de casena encontradas
no leite estvel e LINA.

bCN

0,8

0,4

kCN1
kCN2
kCN3
aCNs2

Volts

0,6

aCNs1

0,2

0,0

0,0

2,5

5,0

7,5

10,0

12,5

15,0

17,5

20,0

Minutes

Figura 14. Cromatograma das fraes de casena de uma amostra de LINA.

kCN: -casena; aCNs1: S1-casena; aCNs2: S2-casena; bCN: -casena.

Os resultados das concentraes das diferentes fraes de casena, bem como sua
quantidade total, de leites estveis e dos classificados como LINA, nos diferentes meses de
amostragem podem ser observados na Tabela 5. As concentraes mdias de
S2

S1

casena,

casena, casena, casena e casena total, bem como suas mdias (mg/mL) no

apresentaram efeito significativo. Porm, nota-se que a concentrao mdia de casena no

ms de julho foi de 4,60 mg/mL, sendo este, o menor valor obtido quando comparado com as
mdias dos meses de maio e setembro, que foram 5,56 e 5,07 mg/mL, respectivamente.
O ms de julho caracterizou-se por ter sido o ms em que ocorreu a maior incidncia
de LINA, tal fato pode ter sido influenciado pela menor concentrao de casena nessas

amostras de leite. Tal associao amplamente aceita na literatura (FOX et al. (1996),
CREAMER et al. (1998), TUINIER e KRUIF (2002) e O CONNELL et al. (2006)).

Tabela 5. Concentraes das fraes de casena nos leites estveis e LINA nos diferentes
meses de colheita.
S1 casena

S2 casena

casena

casena

casena

Casena

(mg/mL)

(mg/mL)

(mg/mL)

(mg/mL)

(mg/mL)

Total
(mg/mL)

Maio
LINA

21,60+1,401

1,71+0,076

23,31+1,434

9,96+0,285

5,64+0,232 38,35+1,661

24,66+1,981

1,74+0,108

26,40+2,029

10,53+0,404 5,39+0,323 41,96+2,349

22,62

1,72

24,34

10,15

20,26+0,760

1,64+0,154

21,68+0,712

9,38+0,317

4,45+0,549 35,51+0,905

20,13+0,910

2,03+0,185

22,15+0,854

9,65+0,380

4,81+0,658 36,61+1,086

20,20

1,80

22,00

9,49

22,66+0,740

1,32+0,137

23,85+0,786

7,84+0,655

5,33+0,346 39,16+1,126

23,41+1,146

1,37+0,213

24,78+1,217

9,84+1,015

4,89+0,536 37,05+1,745

22,88

1,34

24,22

9,25

(n=30)
Estvel
(n=15)
Mdia

5,56

40,05

Julho
LINA
(n=23)
Estvel
(n=16)
Mdia

4,60

36,09

Setembro
LINA
(n=24)
Estvel
(n=10)
Mdia

5,07

LINA: Leite Instvel No cido.

Os valores no apresentaram diferenas significativas no Teste de t-Student (p>0,05).
1

Valores expressos em mdia + desvio padro.

38,54

Tabela 6. Percentuais de cada frao em relao ao total de casena (S1 + S2 + + ) nos

leites estveis e LINA nos diferentes meses de colheita.
S1 casena

S2

casena

casena

casena

Casena

(%)

casena (%)

(%)

(%)

(%)

Total (%)

Maio
LINA

55,28+1,463 4,57+0,207 59,85+1,372 25,81+0,847 13,35+1,010

100

57,74+2,069 4,23+0,293 61,97+1,941 25,83+1,198 12,21+1,428

100

(n=30)
Estvel
(n=15)
Mdia

56,10

4,46

60,56

26,48

12,96

100

Julho
LINA

56,87+1,473 4,69+0,450 60,62+1,304 26,53+0,922 12,49+1,304

100

55,01+1,766 5,61+0,540 60,98+1,564 26,65+1,106 12,73+1,564

100

(n=23)
Estvel
(n=16)
Mdia

55,76

5,07

60,83

26,58

12,59

100

Setembro
LINA

58,11+1,644 3,44+0,410 61,56+1,877 20,93+1,555 13,50+0,731

100

63,67+2,548 3,87+0,635 67,55+2,908 24,42+2,410 12,02+1,133

100

(n=24)
Estvel
(n=10)
Mdia

59,75

3,57

63,32

23,62

13,06

100

LINA: Leite Instvel No cido.

Os valores no apresentaram diferenas significativas no Teste de t-Student (p>0,05).
1

Valores expressos em mdia + desvio padro.

Resultados semelhantes foram obtidos por Farah e Atkins (1992), que associaram a
menor estabilidade do leite de camela perante o de vaca, com a menor concentrao de
casena existente no leite do primeiro animal.

A estabilidade da micela de casena depende da presena de -casena na sua

superfcie, a qual se constitui na frao hidroflica da casena, que reage com a gua e impede
a agregao das micelas (CREAMER et al., 1998). Segundo Tuinier e Kruif (2002), a
estabilidade estrica gerada pela relativamente esparsa camada externa de -casena em forma
de escova o fator estabilizante mais importante.
Embora, no presente trabalho, os resultados para e -casenas no tenham sido
significativos, pode-se observar que as concentraes destas fraes e seus respectivos
percentuais (Tabelas 5 e 6) foram inferiores nos leites caracterizados como LINA, quando
comparados com os leites estveis nos meses de maio, julho e setembro.
Tal fato pode indicar uma influncia da composio das fraes de casena na ocorrncia de
LINA, fato que est de acordo com as afirmaes feitas por Schmidt e Koops (1977) e Guo et
al. (1998) que afirmaram que a estabilidade do leite frente s solues de etanol depende da
composio dos sais e tambm da composio das casenas. Porm mais estudos devem ser
conduzidos para verificar a possvel associao entre -casena e LINA.

6. CONCLUSES

Face aos resultados obtidos no presente estudo, e considerando os objetivos propostos,

pode-se concluir que:
1. A incidncia de LINA maior em julho (inverno) e menor em setembro (primavera),
indicando uma possvel influncia sazonal sobre a ocorrncia deste problema.
2. Os valores de acidez Dornic, slidos totais e extrato seco desengordurado tanto do LINA
como do leite estvel, no apresentam diferenas significantes.
3. Apesar dos valores referentes ao pH do LINA e do leite estvel apresentarem diferenas
significativas em julho, ambos esto dentro dos nveis considerados normais.
4. A concentrao de gordura e a CCS no LINA, em julho, so superiores do leite estvel.
5. Os teores de protena bruta e lactose nas amostras colhidas em julho so menores no
LINA, em relao ao leite estvel.
6. Apesar do nvel de -casena ser menor no LINA no ms de julho, no h diferenas
significativas entre as concentraes das fraes de casenas -S1, -S2, e entre os leites
estveis e o LINA.
7. A ocorrncia de LINA freqente em rebanhos leiteiros da regio de Casa Branca, Estado
de So Paulo, o que pode acarretar perdas significativas indstria de laticnios e aos
produtores devido ao descarte do leite..

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