Produo de Bromelina (rBRM) por expresso de gene em organismo

procarionte.
ROCHA, A. C. P., S, A. F. G.
carolinapr.rocha@gmail.com,, angelicafgs@live.com
Bioqumica experimental Professora Ktia Castanho Scortecci

Resumo
As bromelinas so proteases cistenicas que possuem diversas propriedades teraputicas exploradas
pela indstria. Estas protenas so extradas do caule de abacaxi juntamente com colides, sais
inorgnicos e materiais orgnicos simples, em um extrato denominado bromelana que
comercializado. Este estudo visa o estabelecimento de protocolo para a expresso do gene de
bromelina em sistema bacteriano para a produo de bromelina recombinante, uma vez que sua
extrao limitada e apresenta baixo rendimento e alto custo.
Palavras-chave: Ananas comosus, bromelana, transformao.

50% do total do peso do precipitado

desidratado (HEINICKE, & GORTNER,
1957).
As bromelinas so polipeptdeos bioativos
encontrados principalmente no caule e no fruto
da j referida espcie Ananas cosmos, sobre as
quais se descobriu que desempenham um papel
de defesa contra herbivoria (HARRISON &

INTRODUO
Bromeliaceae uma famlia de grande
diversidade da regio neotropical. Ocupa
significativa variedade de habitats, desde
ambientes montanhosos at a Mata Atlntica, e
pode apresentar hbito terrestre e epfito.

so

Abacaxi o nome popular da espcie mais

proteases cistenicas, sendo esta caracterstica

conhecida e explorada da famlia Brome-

enzimtica que confere protena diversas de

liaceae, Ananas cosmos.

suas propriedades teraputicas (MAURER,

extensivamente cultivado no Hava, Filipinas,

2001), sendo as principais a inibio da

Caribe, Malsia, Austrlia, Mxico, frica do

agregao plaquetria, atividade fibrinoltica,

Sul e Brasil (SO PAULO, 2015). Sua

ao

antitumoral,

popularidade d-se no somente pelo seu sabor

modulao de citocinas e da imunidade,

propriedade debridante de pele, aumento da

adocicado e valor nutricional, mas tambm

absoro de outras drogas, propriedades

utilizado, para alm do preparo de sucos,

BONNING,

2010).

As

antiinflamatria

bromelinas

Este fruto

por sua utilidade na indstria e culinria, onde

digesto,

doces e compotas, na dissoluo de gorduras e

aceleradora da cicatrizao alm de promover

amaciamento de carne, e ainda na clarificao

de cerveja (SPAT & OLIVEIRA, 2015). O

mucolticas,

facilitadora

da

melhora da circulao e sistema cardiovascular

(PAVAN et al, 2012). Destarte este trabalho
tenciona o estabelecimento de um protocolo
para a expresso do gene de bromelina em
sistema bacteriano objetivando a produo de
bromelina recombinante, tendo em vista que
sua extrao limitada, e apresenta baixo
rendimento e alto custo (DEVAKATE et al,
2009).
MATERIAIS E MTODOS
Matria prima
Como matria prima para a extrao foram
utilizados caules de Ananas comosus
cultivados e coletados no campus central da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Extrao do RNA total do abacaxi

fruto tambm apresenta diversas propriedades

teraputicas amplamente utilizadas nas regies
tropicais e subtropicais, conhecidas pela
medicina popular dos povos da Amrica do Sul
e Central desde o sculo XVII (TAUSSIG &
BATKIN, 1988).
Tais propriedades so atribudas ao seu extrato
bruto, a bromelana, que geralmente extrada
do talo do vegetal e preparada atravs de
precipitao com acetona (AWANG &
RAZAK, 1978). O composto resultante
constitui-se de uma mistura de colides, sais
inorgnicos e materiais orgnicos simples, que
tambm so precipitados pela acetona. Neste
extrato, a protena bruta, conhecida como
bromelina, geralmente corresponde a cerca de

A amostra foi centrifugada (12.000g por 15

Amostras do caule foram separadas dos galhos

minutos a 4 C) e a fase aquosa foi transferido

de abacaxi fresco e tiveram sua superfcie

para um novo tubo de 2mL. Para precipitao

esterilizada

do

500L de

impurezas exgenas. Em seguida, foram

isopropanol (1:2 v/v) com agitao por

lavadas com H2O DECP (gua Milli-Q tratada

com dietilpirocarbonato 0,01%) e maceradas

RNA foram

adicionados

inverso, durante 2 minutos. Em seguida, as

amostras foram centrifugadas (12.000 g por 10
minutos a 4 C) e o RNA precipitado, formou
um sedimento gelatinoso no fundo do tubo. O
sobrenadante foi descartado e esse precipitado
foi lavado com 1mL de etanol gelado 75%. As
amostras foram centrifugadas (7.500 g por 5
minutos a 4 C) e o material sedimentado foi
seco a 24 C e solubilizado em 50 L de H2O
DEPC.

para

remoo

de

quaisquer

com nitrognio lquido, objetivando o

rompimento da parede e membrana celulares
para a liberao do contedo da clula. Para
toda tcnica de extrao de RNA, de suma
importncia a limpeza da rea de trabalho, e o
tratamento da gua a ser utilizada durante as
experimentaes com DEPC para inativar
RNAses

assim

prevenir

indesejveis

degradaes de material gentico, observandoObteno do mRNA e cDNA

O mRNA foi separado por cromatografia de

se que RNAses so enzimas muito resistentes e

afinidade dos demais RNAs. Para a separao

foi utilizado um kit de gel de sepharose ligado

tornando fcil a sua degradao. O material

assim obtido foi transferido para tubos de

a oligonucleotdeos poli-T que capturam os

microcentrfuga de 2,0 mL para a realizao

mRNAs pela extremidade poli-A. Aps lavar

das extraes de RNA. O RNA foi isolado com

com tampo todo o material no aderido,

deslocou-se o mRNA da coluna com uma

a adio de 1 mL do reagente Trizol

soluo de alta fora inica.

Para
obter
cDNA,
foi

do tipo vrtex, a amostra foi homogenizada

empregado

oligonucleotdeo poli-T como primer. Este

oligonucleotdeo prolongado no sentido 5,
por um conjunto de bases que contm o stio
de restrio para a enzima XhoI, cujo stio de

as molculas de RNA muito instveis,

amostra e, com auxlio de um agitador de tubos

durante 1 minuto. O Trizol uma soluo
monofsica de fenol, guanidina isotioconato e
outros componentes que facilitam a extrao
de vrias espcies de RNA. Os componentes

restrio 5- CTCGAG - 3. Dessa forma,

do Trizol rompem as clulas, dissolvem os

componentes celulares e inibem RNAse. As

pde-se adicionar ao DNA de interesse um

amostras foram mantidas por 5 minutos 24

stio de restrio conhecido na extremidade 3.

C de modo a permitir a completa dissociao

Uma vez pareado, o primer permite a sntese

dos complexos de nucleoprotenas antes da

da primeira fita de DNA, estendida atravs da

adio de 200 L de clorofrmio gelado (1:5

v/v). As amostras foram homogeneizadas em
por 1 minuto e posteriormente incubadas por 3

ao da transcriptase reversa e com dNTPs.

Para proteger a fita de DNA contra a ao de
enzimas de restrio, o sistema de reao tem,
no lugar de desoxicitosina-trifosfato, um
precursor metilado, a 5-metil-citosina-

minutos a 24C. O acrscimo do clorofrmio

separa a soluo em fase aquosa, onde est
dissolvido o RNA, e fase orgnica, onde esto
dissolvidos os outros componentes da mistura.

trifosfato, que impede a ao das enzimas de

Amplificao do gene

restrio sobre o DNA recm sintetizado.

A amplificao do gene completo de

bromelina (BRM) foi realizada por RT-PCR

Para a sntese da segunda fita de DNA foi

com a utilizao de primers projetados e

especficos do gene AJ009830. O PCR foi
realizado em 25 L de soluo contendo 1 g
de cDNA, 10 mM de dNTP, 25mM de MgCl2,
100 pmol de iniciadores diretos e inversos e 1
unidade de DNA Taq-polimerase. A reao

utilizado um kit que age atravs de traduo

por cortes. Inicialmente, com o uso da
atividade endonuclesica de uma enzima
adequada, inseriu-se pequenos cortes na cadeia
de fosfatos do RNA. Estes cortes criam

ocorreu em termociclador e teve incio com a

automaticamente extremidades 3-OH, que so

reconhecidos pela DNA polimerase. A partir
deles a DNApol I sintetiza pequenos trechos de

desnaturao do DNA durante 2 minutos a 95

DNA, apoiando-se nas extremidades 3-OH

C, em seguida, a amostra foi

incubada durante 30 segundos a
62C para a hibridizao com os primers

criadas pelos nicks. Ao trmino desta etapa, a

que se ligaram com especificidade suas

extremidade 3 do DNA. Em seguida, os

seqncias complementares das fitas de DNA

fragmentos so ligados entre si pela ao da

j separadas. Aps isso, temperatura foi

ligase e eventuais salincias (overhangs) da

elevada

fita

72C

para

sntese

pela

DNA pol produz uma srie de fragmentos e

reconstitui, em fita dupla, o stio Xho I na

so

retirados

pela

ao

de

uma

DNApolimerase. Esta sequncia decorreu por

exonuclease adicionada ao tubo, numa ao

35 ciclos de 30 segundos. A sntese do gene de

interesse foi acompanhada em tempo real pela
leitura da emisso de florescncia pelo
composto Sybr Green, capaz de intercalar as
duplas de DNA e emitir florescncia.

denominada trimming. Aps esta etapa, foram

Lise

alcalina

de

preparao

de

DNA

plasmdico em grande escala (Maxi-prep)

Bactrias portando os plasmdeos com marca
de resistncia foram inoculados em 3mL de

adicionados adaptadores, que so pequenos

fragmentos de DNA fita dupla contendo um
stio de restrio para uma segunda enzima.
Estes

adaptadores

so

inseridos

durante

algumas horas pela incubao do DNA

'trimado" na presena de ligase. A seguir,
clivou-se o fragmento de DNA de fita dupla
com as duas enzimas de restrio para as quais

antibitico necessrio e incubadas durante 12

adicionamos stios (Xho I e Eco RI). As duas

enzimas cortam o DNA formando extremidades
coesivas. O DNA recm sintetizado est

horas sob agitao a 37 C. Aps esse perodo,

protegido pela adio das bases metiladas,

as clulas foram inoculadas na proporo

assim, no sofre ao das enzimas de

1:500 em 400 mL de meio LB com antibitico

e novamente incubadas sob as mesmas

restrio caso contenha algum stio de

condies.
As bactrias foram ento centrifugadas a
3.000g por 15 minutos e o sedimento foi

XhoI, contudo, no tm esta proteo e podem

ser clivados. Os fragmentos de DNA gerados
por estes cortes foram eliminados por

solubilizado em 15mL de soluo de lise

precipitao.

meio LB contendo a concentrao ideal do

restrio interno. Os adaptadores e o stio

com o brometo aps a decantao. Repetiu-se

(Glicose 50 mM; Tris-HCl 20 mM e EDTA 10

a lavagem at o desaparecimento completo do

mM, pH = 8,0). A soluo foi mantida em

brometo da soluo de DNA. O sal foi retirado

24C por 10 minutos e em seguida, adicionou-

por dilise em tampo TE sob agitao (12

se 30mL de soluo II (NaOH 0,2 M e SDS

horas a 4 C). O material foi quantificado por

1%). Aps incubao no gelo por 10 minutos,

migrao eletrofortica e espectrometria.

acrescentou-se 20mL de soluo de KOAc

(5/M, pH=4,8). O material foi mantido no gelo
por 20 minutos e centrifugado a (6.000g por 20

Produo de plasmdeo recombinante

O gene BRM amplificado foi clonado no vetor
pTZ57R/T e para este procedimento
inicialmente

procedeu-se

digesto

do

plasmdeo com enzima de restrio apropriada

para stio de clivagem (figura 1). Em um
microtubo, em gelo, foram adicionados 0,2-

minutos a 4 C). O sobrenadante foi filtrado e

transferido para outro tubo. A seguir,
adicionou-se 0,6 vezes o volume de
isopropanol, e a soluo foi deixada para
reagir por 15 minutos a 24C. O material foi
ento centrifugado (8000g por 30 minutos a 4

1g de DNA plasmidial, 2L de tampo Tris

C) e o sedimento solubilizado em 4 mL de

(pH 7,5- 8,0 ,10x conc.) 19l de gua ultra-

tampo TE. A esse volume de soluo

pura esterilizada. A soluo foi agitada em

acrescentou-se 4,1 g de CsCl e 200 L de EtBr

equipamento do tipo vrtex com o microtubo

ainda em gelo, e posteriormente foram

(10 mg/mL). Agitou-se com cuidado at o

desaparecimento de grumos antes de proceder

adicionados 1L da enzima EcoRI seguidos de

agitao em aparelho vrtex.
O gene BRM, depois de preparado para que

centrifugao (400.000g por 16 horas a 4

C). A banda obtida foi coletada com auxlio de

suas extremidades fossem complementares s

extremidades do plasmdeo, foi posto em
soluo incubada em temperatura apropriada
para a ao de DNAligase. Em um tubo de 0,5
mL, foram adicionados: 0,5 L do plasmdeo
pTZ57R/T (50 ng) digerido com a enzima
EcoRI, 0,5 L do produto de PCR purificado
(200 ng) 1,5 L do tampo de ligao (10X) 1
L de T4 DNA ligase (5U/L) e gua milli-Q
para completar um volume final de 15 L. A
reao de ligao foi incubada a 4 C por 24
h.
Subclonagem em vetor de expresso
O gene BRM gene foi subclonado em pET32b
(Invitrogen) e com este vetor as clulas de
Escherichia coli JM109 foram transformadas.
Para isso, foi realizada a clivagem do

Fig 1: Plasmdio de clonagem

seringa descartvel e novamente purificada

num segundo gradiente de CsCl na mesma
densidade que a anterior. O gradiente foi
centrifugado a 400.000 x g por 7 horas a 4 C e
a banda coletada transferida para um tubo de
15 mL. Para a retirada do brometo de etdio,
cerca de 1 mL de lcool isoamnico foi
adicionado cuidadosamente e eliminado junto

noite a 37 C em 50 mL de meio LB a 250

r.p.m. Foram aliquotados 4 mL desta cultura
que posteriormente foram incubados em 40 mL

plasmdeo recombinante com as enzimas de

de meio LB nas mesmas condies at que se

inserto isolado foi ento subclonado no vetor

atingisse densidade ptica de 0,375 (DO590).

Neste ponto a cultura foi transferida para 8

restrio de forma a retirar o gene integro

juntamente com seu marcador seletivo. Este
de expresso pET32b (Invitrogen). O vetor foi
previamente linearizado com as mesmas
enzimas de restrio a fim de criar terminais
coesivos para a clonagem in frame do inserto.

Transformao bacteriana
O plasmdeo recombinante foi inserdeo dentro
da bactria atravs de canais situados nas
chamadas zonas de adeso, que so locais
onde a membrana interna e externa da clula
bacteriana unem-se formando poros. Estes
poros s esto presentes durante o
crescimento

bacteriano.

Em

condies

Fig 2: Plasmdio de expresso

naturais, a captao do DNA torna-se difcil

tubos de 50 mL que foram incubados em gelo

durante 10 minutos. Em seguida a amostra foi

devido a repulso eletrosttica existente entre

as cargas negativas da camada de
fosfolipdeos da membrana bacteriana e dos

centrifugada (1600g durante 7 miutos a 4 C),

o sobrenadante foi dispensado e o sedimento

grupo fosfato da molcula do DNA. O papel

foi solubilizado em 10 mL de soluo de CaCl2

em cada tubo. Posteriormente os tubos foram

do clcio explicado pela hiptese de que a 0

centrifugados (1100g durante 5 minutos a 4C)

e os sedimentos foram solubilizados do mesmo
modo. Em seguida os tubos foram mantidos em
gelo durante 30 minutos, centrifugados e cada
sedimento foi solubilizado novamente em 2mL

estabilizando a distribuio dos fosfatos

de soluo de CaCl2. E alquotas de 250 l

C fluidez da membrana celular cristalizada,

carregados. Os ons Ca +2 formam um
complexo com este grupamento, cobrindo as
cargas negativas e assim facilitando a atrao
eletrosttica com as molculas do DNA na

foram separadas e congeladas a -70 C

zona

Transformao de bactrias competentes

provavelmente criando um desbalano trmico

As bactrias competentes foram descongeladas

e uma aliquota de 100l foi utilizada para
solubilizar 10 ng de DNA plasmidial. Esta

entre o interior e o exterior da clula

bacteriana, auxiliando o bombeamento do
DNA atravs da zona de adeso.

soluo foi mantida em gelo durante 10

minutos e posteriormente foi provocado um

Preparao de bactrias competentes

choque trmico nas clulas

Para a preparao de bactrias competentes

uma cepa de E. Coli foi incubada durante a

que foram

de

adeso.

choque

trmico,

complementa este processo de captao,

gelada (pH 7.4). A suspenso celular foi

centrifugada e lavada duas vezes com PBS. O
sedimento formado foi solubilizado em 1 mL
de PBS e foram adicionados 5 L de aprotinina
(1 mg/mL) e 10 L de lisozima (10 mg/mL). A

incubadas a 42 C durante 2 minutos e

recolocadas em gelo.
A insero do plasmdeo pET32b-BRM (figura
2) nestas clulas foi confirmada pela digesto

lise celular foi realizada atravs de repeties

de congelamento e descongelamento em

com enzima de restrio apropriada e corrida

em gel de eletroforese.
Os clones confirmados foram selecionados por

nitrognio lquido. Adicionou-se 10 L de

DNAse (1 mg/mL) e RNAse A (10 mg/mL) ao

incubao em placas de agarose contendo por

LB suplementado com ampicilina (50 lg / ml)

lisado que foi encubado por 10 minutos a 4 C

em 37C at que os valores de densidade

sob agitao. Em seguida, o lisado foi

ptica atingissem 0,6-1 (OD600). Como controle

o vetor pET32b sem o gene BRM foi inserido

centrifugado (12.000g por 30 min. a 4 C). O

sobrenadante foi coletado e o sedimento

em clulas de Escherichia coli JM109 e

formado foi solubilizado em tampo A

(NaH2PO4, 200 mM, NaCl 500 mM, Imidazol
5 mM e ureia 8 M). Esta amostra foi incubada

incubadoa nas mesmas condies. As bactrias

sobreviventes ao meio demonstraram possuir o

a 4C por 1 hora. A soluo foi centrifugada a

(14.000g por 60 min) e o sobrenadante
coletado foi armazenado e utilizado como fonte
protena recombinante foi purificada por

antibitico dentro do plasmdeo e foram

selecionadas.
A cultura foi armazenada a 4 C por uma noite
e posteriormente 2 mL desta cultura foi
centrifugado (10.000 rpm durante 2 minutos a

cromatografia de afinidade usando Ni+ e

4 C) e sedimento foi solubilizado em 2 mL de

tampo de eluo com Imidazol 200 mM. A

PBS

meio LB lquido contendo ampicilina. Essa

amostra foi inoculada 50 mL de meio LB com

contendo concentraes decrescentes de ureia

ampicilina e incubado a 37C at atingir a

de

protena

protena

bromelina

eluda

foi

recombinante.

dializada

com

(6, 4, 2, 1, 0 M). A protena recombinante, que

foi diluda durante o processo de dilise foi
concentrada usando o composto higroscpico
de sacarose sobre a membrana de dilise
contendo a protena recombinante. A qualidade
da amostra purificada foi confirmada em gel de
SDS-PAGE 12%.

gene BRM ligado ao gene de resistncia ao

densidade ptica de 0,4-1.

Purificao de Bromelina recombinante
(rBRM)
A expresso proteica de bromelina foi induzida
pela adio de IPTG at a uma concentrao
final de 1 mM durante 3 h com agitao a
37C. A cada hora decorrida da solubilizao
foram coletados 1 ml de cada cultura, estas

Extrao de RNA produo de cDNA e

amostras foram mantidas a 4 C e a expresso

do gene BRM foi analisada por SDS-PAGE.
Foram aliquotados 50 mL de cultura aps 3

amplificao.
O gene da bromelina (BRM) teve sua

horas de inoculao. Esta amostra foi

centrifugada (5.000g durante 5 minutos a 4

sequncia amplificada por RT-PCR com a

C), e o sedimento foi solubilizado em 1 mL de

utilizao de primers desenhados especficos,

soluo salina tamponada com fosfato (PBS)

RESULTADOS E DISCUSSO

pares de base da amostra. A intensidade da

diretos

reversos.

amplificao

da

sequncia foi acompanhada em tempo real e

posteriormente a amostra amplificada foi
submetida a gel de eletroforese em agarose
com Sybr Green (figura 3). Neste gel
possivel confirmar a presena deste gene e seu
peso molecular.
Lise

alcalina

de

preparao

de

DNA

plasmdico em grande escala (Maxi-prep)

O plasmdeo pTZ57R/T foi extrado das
Fig 3: Gene BRM de Ananas comosus amplificado por PCR

banda comparada com a de um outro DNA

previamente quantificado pode indicar a
quantidade de material obtido na extrao.
Analisando os resultados obtidos pde-se
observar que a quantidade e o tipo de material
obtidos foram satisfatrios, indicando sucesso
dos procedimentos realizados e o rendimento
obtido foi em mdia 2 mg de DNA a cada 400
mL de cultura bacteriana.
Subclonagem em vetor de expresso
Aps a subclonagem e replaquemaneto em LB
com ampicilina apenas as cepas contendo
BRM ligado ao gene de resistncia
ampicilina foram capazes de multiplicarem-se.
A insero do gene pET32b-BRM em E. coli
JM109 foi confirmada por anlise da digesto

bactrias previamente preparadas por processo

de amplificao de plasmdeo. Este plasmdeo
foi analisado em gel de eletroforese para
comprovar seu tamanho e eficincia da
extrao em grande escala (figura 4).
Neste gel, aps a irradiao com
transiluminador, puderam ser observadas duas
bandas principais, sendo a primeira
correspondente ao plasmdeo em sua forma
no enovelada. O plasmdeo linearizado corre
de forma mais lenta e aparece mais prxima
canaleta. A segunda banda, mais distante da
canaleta, equivale a forma superenovelada do
plasmdeo (super-coiled). Esta forma do
plasmdeo corre mais rapidamente com maior
facilidade entre as malhas do gel. Comparando
a distncia percorrida pela amostra com o
DNA padro, pode-se estimar o nmero de

g 4: Vetor de clonagem pTZ57R/T em sua forma no enovelada e supercoiled.

Fig 5: Vetor de expresso pET32b-BRM aps digesto com enzimas de restrio d

quantidade mnima de protena necessria

muita biomassa da planta de interesse que
contm a protena em pequena quantidade
(DEVAKATE et al, 2009).

deste plasmdeo com enzimas de restrio. A

digesto com estas enzimas (que tm um stio
de clivagem) demonstrou o tamanho correto
esperado deste plasmdeo quando da
subclonagem. No gel de eletroforese, na
digesto com algumas enzimas, possvel
observar duas bandas. Estas bandas so
referentes clivagem do plasmdeo em at
dois stios indicando inespecificidade da
enzima e ou a existncia de stio de clivagem
no interior da sequncia do gene inserido. A
clonagem em vetor pCR Blunt e a
subclonagem em vetor pET23a(+) foram
realizadas sem mutaes.

Fig 6: Perfil de purificao de rBRM.

Expresso do gene BRM e purificao de

bromelina

A manipulao gentica, alm de permitir

uma padronizao da qualidade da protena
obtida,
permite tambm que sejam
adicionados outros componentes adjuvantes a
depender da finalidade a qual a bromelina
utilizada, objetivando um maior controle,
qualidade e rendimento na produo. Posto
isto fica evidenciada a importncia das
tcnicas de clonagem enquanto mtodo para
obteno de bromelinas.

CONCLUSO
O processo de produo de bromelina pela
expresso do gene em bactria E. coli JM109
provou-se uma tcnica eficaz para produo
industrial dessa substncia. O rendimento
obtido por este mtodo foi superior ao da

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

extrao da protena do caule da planta. Este

resultado foi evidenciado pelo baixo custo de
produo por micrograma de protena pura.

AWANG, M. I.; RAZAK, O. A. Proteolytic

activity of locally prepared pineapple

A extrao de protenas configura um processo

dispendioso onde o produto pode variar de

bromelain. Mardi Research Bulletin, Malsia,

v. 6, n. 2. p. 165-171, 1978.
DEVAKATE, R. V., PATIL., V. V., WAGE, S.
S., THORAT, B. N. Purification and drying of
bromelain.Separation
and
Purification

acordo com as condies de extrao, do

Technology 64, 259264. 2009.

clima, do local de cultivo ou at mesmo entre

plantas diferentes. Ademais, a cada passo de
purificao, parte da protena de interesse
perdida, de forma que, para obter uma

update,Journal of Ethnopharmacology, vol. 22,

no. 2, pp. 191 203, 1988.

Outras coisas para se ajeitar

- Inserir as duas partes que combinamos

ontem que eu j esqueci quais so;

- Citar referncia das metodologias:

- Colocar em algum lugar como irao ser
referenciadas as partes do texto que no sao
metodologias mas sim explicacoes sobre a
metodologia, por exemplo * com asterisco
so explicacoes;
- Inserir aquele recuosinho de paragrafo com
tab, aqui nao ta dando direito pra eu fazer
isso;
- substituir todos vortex por vrtex (com
acento);
- juntar todas as temperaturas a ao simbolo
C;
- separar os nmeros da unidade por exemplo
7 mL em vez de 7mL
- padronizar a media de rotao e se ela vai
junto ou separado do numero, se 1000g ou
1000 x g;
- Ver a idia geral se h alguma
incongruencia ou loucura;
- FAzer adendo dizendo que tudo fictcio.

HARRISON, R. L., & BONNING, B. C.

Proteases as insecticidal agents. Toxins, 2,
935953. 2010.
HEINICKE, R.M. and W.A. GORTNER. Stem
bromelain-a new protease preparation from
pineapple plants. Econ. Bot. 11 (3): 225-234.
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MAURER, H. R. Bromelain: biochemistry,
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