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Extrao de DNA, reao de polimerase em cadeia e eletroforese em gel de agarose

Dom, 01 de Maio de 2011 22:01

Resumo
A biologia molecular a rea das cincias biolgicas que mais tem se desenvolvido nos
ltimos 50 (cinqenta) anos. A biologia molecular o estudo da biologia a nvel molecular, com
foco especial na estrutura e funo do material gentico e seus produtos de expresso, as
protenas. Mais concretamente a biologia molecular investiga as diversas interaes entre
sistemas celulares, incluindo as relaes entre DNA, RNA e snteses protica. A bio. mol.
Abrange outras reas de biologia e da qumica, em especial a gentica e a bioqumica.
Tradicionalmente a seleo de animais tem sido feita com base em desempenhos fenotpicos.
Esse tipo de seleo pode ter sido influenciado por fatores de meio que marcou o mrito
gentico, no entanto, esse mtodo no tem sido efetivo para caractersticas econmicas de
baixa herdabilidade. O avano da gentica molecular, atravs de seus mapas genticos e
marcadores moleculares, facilitou enormemente a seleo de aractersticas de interesse
econmico em vrias espcies domesticas.

Introduo
O DNA composto por manmeros chamados nucleotdeos. Cada nucleotdeo formado por
um cido fosfrico, um acar de cinco carbono desoxiribose - e quatro bases nitrogenadas:
adenina (A); guanina (G); timina (T); citosina (C). Estas bases nitrogenadas esto destribudas
em dois grupos: Purinas: adenina e guanina; pirimidinas: tiamina e citosina.

Desenvolvimento
Watson e Crick (1953), propuseram a estrutura molecular do DNA, para tanto, consideraram as
propriedades qumicas de seus componentes, bem como, as evidencias obtidas por Chargaff
et.al., sobre a composio de bases do DNA de diferentes espcies; bem como, dos estudos
de Franklin e Wilkim sobre a difrao com raio X..De acordo com Watson e Crick (1953), o
DNA tem sua estrutura molecular constituda por duas fitas paralelas, enroladas para a direita
em forma de dupla hlice. A ligao do acar-fosfato ocorre de tal forma que a osio 3 da
molcula de acar liga-se ao grupamento fosfato, o qual liga-se posio 5 da molcula de
acar subseqente. Nota-se que as duas fitas ocorrem em direo opostas enquanto uma
fita dar-se de 5a 3, a outra ocorre de 3 a 5, por essa razo chamadas de antiparalelas.

Extrao de DNA
Materiais:
Abelhas; Laminas de bisturi; Placas de Petri; Bastes de vidro; Luvas; Ependorfs; estantes
para ependorfs; micropipetas; Vortex; Micro centrifuga; Banho maria.

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Solues:
Tris-HCL 10mM, pH 7,5;Tampo de Extrao;Proteinase K (5mg/mL), conservada em
frezer;NaCl 5M;Etanol P.A. (absoluto);Etanol 70%TE (Tampo de Eluio).Obs. Todas as
solues j se encontravam preparadas.

Procedimentos:
Nesta prtica foi utilizada uma tcnica para amostras com pequena quantidade de DNA. Foram
coletadas trs amostras de fragmentos (Melpona sp) de trax, asas e tarso.
1.) Separou-se 10 a 50mg de uma abelha (Melpona sp)o trax, a asa e tarso;
2.) Macerou-se as amostras individualmente em placas de Petri;
3.) Transferiu-se o macerado (amostras) para tubos de ependorf de 1,5mL;
4.) Microcetrifugou-se as amostras para concentrar-las no fundo dos ependorfs;
5.) Lavou-se as amostras em soluo Tris-HCl 10mM em pH 7,5 por 5 min;
6.) Microcetrifugou-se por 10s, removeu-se o sobrenadante;
7.) Adicionou-se 300L de Tampo de Extrao, colocando-se em seguida 10L de Proteinase
K(de acordo com o tecido utilizado);
8.) Misturou-se bem, (microcentrifugar,vortexar) e colocou-se em banho maria por 2 a 3h,
agitou-se ocasionalmente por inverso a cada 20min., ate dissolver o tecido;* Esta etapa pode
permanecer over night a 37C.** Os procedimentos dos itens 9 a 19 s foram realizados na
aula do dia seguinte.
9.) Retirou-se do BM, vortexou-se e centrifugou-se rapidamente (13.000 rpm por 5min a 20C);
10.) adicionou-se 100L de NaCl 5M; vortexou-se por 10min;
11.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 20C);
12.) Coletou-se o sobrenadante para outro tubo ependorf;
13.) Adicionou-se 1 mL de lcool P.A. gelado;* **Agitou-se e observou-se a formao de uma
nuvem (filamentos) de DNA.**** Esta etapa pode permanecer over night a -20C.
14.) Centrifugou-se (13.000 rpm por 10min a 4C), e desprezar o sobrenadante,
conservando-se o pellet formado;
15.) Adicionou-se 500L de lcool 70%. Agitou-se bem e centrifugou-se (conforme o item
12para reduzir o tempo para 5min.). Desprezou-se o sobrenadante, repetiu-se esta operao
maisuma vez.
16.) Verteu-se os tubos ependorfs sobre papel absorvente para secar os tubos.
17.) Adicionou-se 50L de Tampo de Eluio;
18.) Agitou-se e colocou-se os tubos ependorfs em BM a 55C por aproximadamente 15min.,
atea dissoluo dos pellets;
19.) Estocou-se as amostras entre 4C e 20C.

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Discusso:
Nesta prtica foi utilizada uma tcnica para amostras com pequena quantidade de DNA. Foram
coletadas trs amostras de fragmentos (Melpona sp) de trax, asas e tarso. A macerao
realizado no item 2 foi para aumentar a superfcie de contato do substrato (tecido) com a
enzima proteinase K, facilitando a digesto da membrana celular e outros constituintes. No item
4 a microcentrifugao realizada serviu para juntar todos fragmentos da amostra no fundo do
ependorf. Na 5 etapa, caso a amostra tenha sido conservada em lcool, esta deve ser lavada
com gua para retirar o excesso de lcool e facilitar a ao do Tris-HCl.No item 7 a soluo
tampo de extrao manem o pH da clula (ambiente) inalterado para que no ocorra
destruio do DNA. J no 8 passo o bm ajuda na acelerao da reao facilitando a quebra
das molculas damembrana e citoplasma. A soluo de NaCl presente na etapa 10 deste
protocolo ir retirar a gua presente no substrato.Nas etapas 13 e 15 o lcool fixara e
desnaturar o DNA tornando-o visvel; se no se utilizar uma membrana em coluna o DNA se
deposita no fundo do tubo. No item 17 o Tampo de Eluio contem Tris-Hcl para lavar e retirar
o execesso de lcool e RNAse que far a lise das molculas de RNA.

Reao de PCR
O objetivo da PCR multiplicar um trecho especifico do DNA (gene ou parte dele, regies
supravarveis, Junk DNA, etc).A PCR utiliza-se de desoxinucleotideos como manomeros ate
um ponto em que sua concentrao em dada soluo seja to alta que possa ser facilmente
detectvel por mtodos simples e clssicos de separao e identificao de substancias
Saiki et. al., 1985; Kary Mullis, 1987.

A multiplicao desses trechos especficos se d alternando-se a temperatura de ensaio


entre:
1- Desnaturao das cadeias de DNA genomico (~ 95C);
2- Anelamento (annealinng) dos primers, usados paara delimitar a seqncia a ser amplificada
(50C a 70C);
3- Extenso dos produtos PCR (72C);
4- Reinicio do Ciclo (32X).

Materiais:
Balana analtica; microcentrifuga; centrifuga refrigerada; cubas e fonte para eletroforese
horizontal; sistema de fotodocumentao; transluminador; frezer vertical; autoclave vertical;

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capela de fluxo laminar horizontal; termociclador; vortex; banho maria; forno microondas; estufa
de esterilizao e secagem; barrillete para gua destilada; ponteiras; micropipetas; ependorfs;
e suportes para ependorfs.

Solues/produtos:
DNA para amplificao;
Par de primers especficos;
Enzima tag polimerase;
Tampo;
MgCl2;
dNTPS;
H2O ultrapura.

Procedimento:
O material utilizado nesta pratica foi amostras de DNA de carangueijos 06 amostras.Para
preparao da quantidade do mix a ser utilizado nesta pratica fez-se uso de uma tabela
(programa) elaborada pelo Dr. Fabio Brito, que facilita muito a elaborao do mix para a PCR.
1.) Preparou-se em um ependorf o mix dreao com todos os reagentes descritos acima,
exceto o DNA da amostra.
2.) Distribuiu-se o mix em tubos ependorfs para PCR;
3.) Colocou-se uma a uma, as amostras, (5 L de DNA) a serem testadas nos tubos;
4.) Levou-se as amostras ao termociclador previamente programado;

Discusso:
A PCR uma reao bioqumica que a partir de uma cpia de uma molcula de DNA d
origem a vrias outras copias, que obedecem a seguinte seqncia replicao (DNA),
transcrio (RNA) e traduo (formao de protenas especificas). O cdigo gentico apresenta
64 combinaes diferentes para os codons.

Quanto maior a concentrao de Mg++ maior ser a especificidade da reao.

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A seqncia dos primers determinar o comprimento do produto PCR, sendo que o


comprimento dependente do local onde os primers fazem o anelamento.
A tag polimerase s reconhece as molculas de DNA.

Durante os ciclos da reao PCR observa-se as etapas de desnaturao, linearidade do DNA


(abertura das fitas) entre 92 a 95C, o anelamento (hibridao) que ocorre entre 50 a 70C,
nesta fase a tag comea a ligar as bases e formar novas cadeias; bem como a exteno
(sntese do DNA) que d-se entre 70 a 75C, as cadeias que eventualmente ficaram
inacabadas iram se formar. Ao atingir 4 C + ocorrer a estabilizao do DNA.

Eletroforese em gel de agarose:


A eletroforese em gel de agarose permite a separao de moleculas de DNA em funo de seu
tamanho. Dependendo da faixa de separao requerida, utilizam-se diferentes concentraes
de agarose, variando-se de 0,5 a 3%. Assim para uma separao de fragmentos variando de
0,5 a 10kb, usa-se uma concentrao de 0,8 a 1,0%. Em fragmentos maiores usa-se uma
concentrao menor de agarose de ate 0,5%. Se com fragmentos menores de 50 a 500 bp,
malha mais fina concentrao de 2 a 3% de agarose.

Tampo:
Para que o pH no se altere na corrida eletroforetica e garanta a formao de um campo
eltrico usa-se uma soluo de Tris/Borato/EDTA (TBE) ou Tris/Acetato/EDTA (TAE) em pH
alcalino.

Procedimentos:
1. Pesou-se 0,8 g de agarose. Adicionou-se 100mL de tampo TBE (Tris-borato 89mM, EDTA
2mM pH8).
2. Aqueceu-se em banho fervente e misturou-se at completa dissoluo da agarose. 3.
Enquanto esperava-se a dissoluo da agarose, preparou-se a forma para o gel. 4. Resfriou-se
a soluo (gel) at 40 C (at conseguir-se segurar com as mos).
5. Acrescentou-se 5m L de uma soluo de brometo de etdio 10mg/mL.
* CUIDADO BROMETO DE ETDIO CARCINOGNICO!
6. Despejou-se a soluo sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a
colocao do pente; teve-se o cuidado de no haver formao de bolhas. Deixou-se solidificar
por pelo menos 30min.
7. Retirou-se o pente e transferiu-se o gel para a cuba. Adicionou-se tampo TBE cuba de
modo a cobrir o gel com menor volume possvel.

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8. Aplicar as amostras preparadas nas duas experincias anteriores. Aplicar o marcador de


tamanho em uma das canaletas. Anotou-se a ordem de aplicao das amostras no gel.
9. Ligou-se a fonte de eletroforese e aplicou-se aproximadamente 100V. Cuidado para no
tocar o tampo.
10. Interrompeu-se a eletroforese quando o corante azul de bromofenol estiva a 0,5cm do fim
do gel. O corante xileno-cianol mostra colorao esverdeada.
11. Transferiu-se o gel para o transiluminador e, em seguida observou-se o gel sob luz UV,
utilizando culos protetores, em seguida levou-se o gel para o sistema de fotodocumentao
por escanner digital.
* A luz UV lesiva pele e especialmente aos olhos, podendo cegar rapidamente. Deve-se
usar sempre culos especiais de proteo.

Discusso:
O DNA tem carga eltrica negativa, ento quando submetido a um campo eltrico ele migrar
para o plo positivo. O tamanho do DNA determina a taxa na qual ele passa atravs do gel,
permitindo uma separao efetiva de mistura de fragmentos.
De modo geral os fabricantes de cubas sugerem valores ideais em volts, que variam na faixa
de 50 a 150V, dependendo do tamanho da cuba (8 a, 10v por cm).
O brometo de etidium intercala-se com a molcula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento, aps
sua insero esse exerce uma ligao do tipo van der Waals. A radiao UV capaz de
estimular essa ligao entre o DNA e o corante tornando a molcula ou banda visvel no gel
atravs de um dispositivo de transiluminao.

Alguns fatores determinam a migrao do DNA atravs do gel de agarose:


a) tamanho da molcula de DNA
b) concentrao da agarose
c) conformao do DNA (formas circulares ou no lineares: I; II e II I)
d) a presena de brometo de etidium no gel
e) voltagem aplicada
f) tipo de agarose
g) tipo do tampo de eletroforese

O DNA permanece intacto durante o processo de eletroforese, podendo ser eluido do gel e
utilizado em outros procedimentos como clonagem, preparao de sondas,construo de
bibliotecas, etc.

Referencias Bibliogrficas:
AZEVEDO, Ana Luisa Sousa. 2006. Varredura genmica para QTL associados resistncia a

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Boophilus microplus em bovinos. 65 p. Universidade Federal de Viosa. Dissertao de


Mestrado.
AUSUBEL, FM., et al (1997) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons, Inc.
New York.
Metods in Molecular Biology, vol. 226: PCR Protocols, Second Edition Edited by: J. M. S.
Bartlett and D. Stirling Humana Press Inc., Totowa, NJ.

RONALDO SOUSA SANTOS


Doutorando em Gentica e Melhoramento Animal - UFPI

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