Universidade do Vale do Paraba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Biomodulao de cartilagens articulares tratadas com laser 830nm: caracterizao por

meio de Espectroscopia Raman e Histologia

Luciano Moreira Rosa

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-graduao em Engenharia
Biomdica, como complementao dos
crditos necessrios para a obteno do ttulo
de Mestre em Engenharia Biomdica

So Jos dos Campos, SP

2003

Universidade do Vale do Paraba

Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento

Biomodulao de cartilagens articulares tratadas com laser 830nm: caracterizao por

meio de Espectroscopia Raman e Histologia

Luciano Moreira Rosa

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-graduao em Engenharia
Biomdica, como complementao dos
crditos necessrios para a obteno do ttulo
de Mestre em Engenharia Biomdica
Orientador: Prof. Dr. Sokki Sathaiah.
Co-orientador: Prof. Dr. Wellington Ribeiro

So Jos dos Campos, SP

2003

Agradecimentos
A Deus por sempre iluminar-me.
Aos meus pais pela educao, amor e carinho dedicados a mim e aos meus
irmos.
minha famlia, em especial a minha av Virginia urea e famlia de minha
esposa, em especial a sua me Ana Maria por ter sempre to bem me acolhido.
Aos meus colegas e amigos Luciano Valentim, Francis R. Nassar, Rodrigo S.
Santos e Renato J. Soares pelo apoio pessoal e profissional.
Aos colegas do IPD Jos de Oliveira, Cibele Lopes, Rodrigo Labat e a todos que
colaboraram para realizao deste trabalho.
Aos professores da graduao pelos conhecimentos transmitidos que me
possibilitaram a formao continuada na ps-graduao, em especial ao Prof. Paulo C.P.
Deliberato, Prof. Marcelo T. Zanin e Prof. Luis Carlos Guanabara.
Ao Professor Ulysses F. Ervilha pela oportunidade e pela confiana profissional
creditada.
Ao Prof. Dr. Miguel A.C. Salgado pela colaborao e ensinamentos nas anlises
histolgicas realizadas neste presente trabalho e ao tcnico de laboratrio Walter Cruz,
pela colaborao na execuo das lminas histolgicas na Faculdade de Odontologia da
Universidade Estadual Paulista.
Universidade do Vale do Paraba UNIVAP pela possibilidade de realizar
este trabalho.
E ao meu orientador Prof. Dr. Sokki Sathaiah e co-orientador Prof. Dr. Wellington
Ribeiro pelos conhecimentos e orientaes transmitidas durante a realizao deste
trabalho, sem os quais no seria possvel a realizao desta monografia.

Dedicatria

Dedico este trabalho minha amada esposa.

Epgrafe

No atentando ns nas coisas que se vem, mas nas que no se vem; porque as que
se vem so temporais, e as que no se vem so eternas
2 Co 2.18

Sumrio

1. Introduo............................................................................................

1.1 Caractersticas da cartilagem articular.........................................

1.2 Alteraes da cartilagem articular na ausncia de cargas.............

12

1.3 Terapia laser de baixa potncia em cartilagem articular...............

16

1.4 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP).......

20

2. Objetivos.............................................................................................

25

3. Mtodos...............................................................................................

27

3.1 Animais..........................................................................................

28

3.2 Modelo animal...............................................................................

29

3.3 Terapia com laser de baixa potncia.............................................. 30

3.4 Sacrifcio dos animais e retirada dos espcimes............................

33

3.5 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP).......

34

3.6 Metodologia estatstica..................................................................

37

3.7 Anlise histolgica......................................................................... 37

4. Resultados............................................................................................

39

4.1 Modelo Animal..............................................................................

40

4.2 Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)........ 40

4.3 Anlise estatstica dos resultados Raman....................................... 45
4.3.1 Matriz orgnica...........................................................................

45

4.3.2 Matriz inorgnica........................................................................

49

4.4 Anlise histolgica......................................................................... 54

5. Discusso.............................................................................................. 58
6. Concluses............................................................................................ 66
7. Referncias bibliogrficas.................................................................... 68

Lista de Figuras

Figura 1.1: Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia cartilagem

articular (Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio
de Janeiro: Guanabara Koogan. 1982)......................................................................

Figura 1.2: Disposio das fibrilas e condrcitos nas zonas da cartilagem

articular (Modificado:. NORDIN, M; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of
the musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989)...

Figura 1.3: Resposta das proteoglicanas s foras mecnicas compressivas

(Modificado:. NORDIN, M; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of the
musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).. 11
Figura 1.4: Desenho do espalhamento da luz de forma inelstica .......................... 20

Figura 1.5: Diagrama de Jablonskii (diagrama dos nveis de energia)..................... 21

Figura 3.1: Procedimento de imobilizao articular do joelho por meio de fio de
sutura ......................................................................................................................... 30
Figura 3.2: Pontos de aplicao laser nos animais irradiados (Modificado:
JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan. 1982). ......................................................................................................... 31
.
Figura 3.3: Aplicao laser pontual em joelho do rato wistar do grupo irradiado.... 32
Figura 3.4: Laser diodo AsGaAl 830nm (IVP) e acessrios ................................... 32
Figura 3.5: Diagrama esquemtico do Sistema Raman no infravermelho prximo. 36
Figura 3.6: Componentes do Sistema Raman (ER-IVP).......................................... 36
Figura 3.7: Trs reas em retngulos em que foram analisadas as intensidades da
colorao de cada corte histolgico........................................................................... 38
Figura 4.1: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens normais de cndilos
mediais de fmures de ratos wistar jovens................................................................. 41
Figura 4.2: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular aps 15
dias de imobilizao................................................................................................... 42

Figura 4.3: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 7 dias
aps a retirada da imobilizao................................................................................. 43
Figura 4.4: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com13 dias
aps a retirada da imobilizao.................................................................................. 44
Figura 4.5: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 19
dias aps aa retirada da imobilizao......................................................................... 44
Figura 4.6: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e
irradiado com densidade de energia de 80J/cm2 (IIA) aps 15 dias de
imobilizao............................................................................................................. 54
Figura 4.7: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e
irradiado com densidade de energia de 720J/cm2 (IIB) aps 15 dias de
imobilizao............................................................................................................. 56
Figura 4.8: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e no
irradiado (I) aps 15 dias de imobilizao...............................................................

56

Figura 4.9: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo controle (C) aps
15 dias de imobilizao............................................................................................. 57

Lista de Grficos
Grfico 4.1: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680
cm-1 (MO) aps 15 dias de imobilizao................................................................... 46
Grfico 4.2: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680
cm-1 (MO) com 7 dias aps a retirada da imobilizao............................................. 47
Grfico 4.3: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680
cm-1 (MO) com 13 dias aps a retirada da imobilizao........................................... 48
Grfico 4.4: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680
cm-1 (MO) com 19 dias aps a retirada da imobilizao........................................... 48
Grfico 4.5. Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680
cm-1 (MO) em relao ao tempo (dias)...................................................................... 49
Grfico 4.6: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1450
cm-1 (MO) em relao ao tempo (dias) ..................................................................... 50
Grfico 4.7: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 961 cm1
(MI) em relao ao tempo (dias)............................................................................. 51
Grfico 4.8: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza aps 15 dias
de imobilizao articular........................................................................................... 58
Grfico 4.9: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza com 19 dias
retirada a imobilizao articular................................................................................ 59

Lista de abreviaturas e smbolos

Al

Aluminio

As

Arsnio

Ca

Clcio

Cl

Cloro

Graus Celsius

CCD

Camera digital colorida

DNA

cido desoxirribonuclico

ER-IVP

Espectroscopia Raman no infravermelho prximo

Ga

Glio

GAGs

Glicosaminoglicanas

HA

cido hialurnico

He

Hlio

Joule

LBP

Laser de baixa potncia

LLLT

Low-level laser therapy

Mg

Magnsio

MI

Matriz inorgnica

MO

Matriz orgnica

MW

Miliwatt

Nd

Neodmio

Ne

Nenio

nm

Nanmetro

Pa

Pascal

PAS

cido peridico e Schiff

PGs

Proteoglicanas

pH

Potencial de hidrognio

RNA

cido ribonuclico

Ti

Titnio

UV

Ultra-violeta

YAG

Ytrium-Alumunium-Garnet

Ni

Resumo

Existe um interesse em investigar as alteraes nos constituintes bioqumicos da

cartilagem articular, afim de prevenir modificaes nas respostas mecnicas que causam
efeitos degenerativos. A biomodulao com laser de baixa potncia pode ser utilizada
como um recurso clnico para estimular os condrcitos a produzirem substncias com as
proteoglicanas, glicoprotenas e colgeno para prevenir as alteraes na cartilagem
citadas. Mtodos modernos de diagnsticos pticos, tal como a espectroscopia Raman
no infravermelho prximo permite um diagnstico menos invasivo e uma avaliao dos
constituintes bioqumicos de tecidos biolgicos. Neste presente trabalho foi utilizado
um modelo animal para a imobilizao articular e as consequentes alteraes nos
constituintes bioqumicos da cartilagem, sendo caracterizado por meio da
espectroscopia Raman no infravermelho prximo e estudo histolgico. Para o modelo
de imobilizao, um total de 52 ratos wistar machos foram utilizados e divididos em
quatro grupos: grupo imobilizado, grupo controle (sem imobilizao) e outros dois
grupos que foram imobilizados e tratados com laser de baixa potncia com densidade de
energia de 80 J/ cm2 e 720 J/cm2 . Os animais foram sacrificados nos perodos de 15 dias
aps a imobilizao e 7, 13 e 19 dias de recuperao aps a retirada do fio de sutura
usado para a imobilizao articular. A irradiao laser foi realizada por meio de um
diodo laser As-Ga-Al com comprimento de onda em 830 nm, em intervalos de 48 horas,
durante 34 dias (15 dias de imobilizao mais 19 dias de recuperao). Foram utilizados
para os estudos Raman: um laser Ti:Safira bombeado por um laser argnio no
infravermelho prximo (830 nm), um espectrgrafo dispersivo para a luz espalhada
Raman coletada do tecido e uma cmera digital colorida resfriada com nitrognio
lquido para detectar o espectro Raman. Para o estudo histolgico foi usado um corante
com reagente de Schiff especfico de glicosaminoglicanas. Nas anlises detalhadas dos
dados espectrais Raman, foram encontrados em ambos grupos tratados, aps o perodo
de 15 dias de imobilizao articular um aumento na concentrao da matriz orgnica
estatisticamente significante (P<0,01) quando comparada ao grupo imobilizado sem
tratamento. Aps o perodo de 19 dias de recuperao foi observado o retorno da
concentrao das substncias da matriz orgnica no grupo imobilizado sem tratamento.
Em relao as diferentes densidades de energia utilizadas para o tratamento com laser,
no foram encontradas diferenas estatisticamente significantes entre os grupos. Os
resultados histolgicos apresentaram concordncia com os observados nos estudos
Raman. Esses resultados demonstram que a biomodulao com laser de baixa potncia
pode ser utilizada para prevenir as alteraes nos constituintes bioqumicos da
cartilagem articular. Alm disso, foi demonstrado que a espectroscopia Raman uma
importante ferramenta para a investigao de variadas formas de modificaes na
cartilagem articular.

Palavras-chaves: bioestimulao,
cartilagem articular, imobilizao.

laser

infravermelho,

espectroscopia

Raman,

Abstract
There has been a lot of interest to investigate the changes in the biochemical
constituents of the articular cartilages in order to prevent modifications in the
mechanical responses that cause degenerative effects. Biomodulation with low-level
laser can be used as a clinical resource to stimulate the chondrocyte cells to produce
substances like proteoglycans, glycoproteins and collagen which in turn can prevent the
mentioned changes in the cartilage. Modern methods of optical diagnosis such as near
infrared laser Raman spectroscopy (NIR-RS) can allow a less invasive diagnosis and
evaluation of biochemical constituents of biological tissues. In the present work, an
animal model has been used to stimulate articular immobilization and the consequent
alterations in the biochemical constituents of the cartilage have been characterized by
NIR-RS and histological studies. For the immobilization model, a total of fifty-two
wistar male rats have been utilized and they have been divided into four groups:
immobilized group, control group (without immobilization) and another two groups
were immobilized and treated with low-level laser therapy (LLLT) with energy
densities of 80 J/ cm2 and 720 J/cm2 . The animals were sacrificed in the periods of 15
days after immobilization, 7, 13 and 19 days of recuperation after the removal of the
suture used for articular immobilization. Laser irradiation has been performed, using a
Ga-Al-As diode laser with 830 nm wavelength, in the interval of every 48 hrs during the
observational period starting from the first day of immobilization to a maximum of 34
(15 days of immobilization plus 19 days of recuperation) days. For Raman studies, a
Ti:Sapphire laser pumped by an argon laser provides near-infrared laser excitation (830
nm). A spectrograph disperses the Raman scattered light collected from the tissue. A
liquid N2 -cooled CCD detects the Raman spectra. For histological study, a PAS stain
specific of the glycosaminolglycans was used. From the detailed analysis of Raman
spectral data, it has been found that both the laser treated groups, after the period of 15
days of articular immobilization, exhibited a statistically significant (P<0.01) increase in
organic matrix (OM) concentration compared to the immobilized groups without
treatment. A recovery of OM concentration, in immobilized & non treated group, has
been observed after 19 days of recuperation. In relation to the different energy densities
used for laser treatment, there was no statistically significant difference found among
the groups. The observed histological results are in accordance with the Raman
observations. The results demonstrate that the biomodulation with LLLT can be used to
prevent the alterations in the biochemical constituents of the articular cartilage. Further,
it has been demonstrated that Raman spectroscopy is an important tool for investigation
of various modifications in the articular cartilages.

Key words: biostimulation, infrared laser, Raman spectroscopy, articular cartilage,

immobilization

1. Introduo

1. Introduo

Os estudos de patologias articulares tm concentrado-se em alteraes

degenerativas da articulao, as quais so evidenciadas pela danificao da superfcie
da cartilagem, sendo encontradas em todos os tipos de articulaes sinoviais. Alm
disso, tambm foram realizados trabalhos em articulaes sinoviais com o objetivo de
estudar como ocorrem as alteraes das substncias qumicas da cartilagem articular e
quais as conseqncias em suas propriedades mecnicas. Nesses experimentos, foram
realizadas algumas formas de induo de degenerao articular em modelos animais,
destacando-se entre elas, o modelo por meio de instabilidade articular, por um excesso
de estresse articular, por trauma direto e pela imobilizao articular (CURRIER;
NELSON, 1992).
Muitas pesquisas tm sido realizadas para investigar essas alteraes, porm
pelo fato da cartilagem articular estar intimamente associada ao osso subcondral para
atuar no sistema de adaptao e mediao de foras mecnicas (NORDIN; FRANKEL,
2001), existe uma dificuldade de isolar eventos ocorridos em um componente que no
afete o outro, dificultando tambm a anlise de alteraes isoladas de cada
componente.
Os estudos realizados com espectroscopia vibracional por emisso ou absoro
demonstram ser um mtodo preciso para anlise qumica de biomateriais quando os
componentes bioqumicos possuem caractersticas espectrais (HANLON, 2000). A
espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP) usada para identificaes
quantitativas de substncias em tecidos biolgicos sem que ocorram danificaes aos
mesmos. Devido a essa caracterstica da ER-IVP, CALL et al (1983) em
experimentos realizados com esse tipo de espectroscopia estudaram os efeitos da
perfuso interna de clcio, magnsio e ATP nas fibras musculares. OTERO (2002)
tambm utilizou as qualidades da ER-IVP para realizar identificaes de bandas
espectrais de colgeno e clcio para diagnstico de alteraes em vlvula cardaca,
assim como LOPES (2002) que analisou a reparao do tecido sseo, alm de WANG
et al (2000) que utilizaram a ER-IVP para anlise de resposta mecnica de tecidos
moles, que demonstrou ser uma importante tcnica para anlise biomecnica de
tecidos.

Como as molculas de protena-polissacardeos denominadas proteoglicanas

(PGs) e glicosaminoglicanas (GAGs) sulfatadas so substncias que sofrem alteraes
quantitativas na fase precoce da degenerao da cartilagem articular, podem com isso
ser parmetro para maior compreenso de estudos de alteraes qumicas articulares,
assim como da anlise biomecnica da cartilagem articular (HAAPALA et al, 2001) e
com isso podem tambm ser utilizadas em mtodos de identificao que mensurem
essas alteraes quantitativas, como por exemplo, a espectroscopia Raman.
A terapia com laser de baixa potncia da cartilagem articular tem com objetivo o
efeito de biomodulao, pois, por meio da bioestimulao, pode-se aumentar o
metabolismo celular dos condrcitos da cartilagem e aumentar o contedo das
substncias qumicas que so importantes para manter em equilbrio o sistema de
proteo mecnica na cartilagem articular (TORRICELLI et al, 2001). AKAI et al
(1987) verificaram essa bioestimulao na resposta mecnica da cartilagem articular
aps a irradiao da luz laser de baixa potncia. Em outros trabalhos os estudos foram
direcionados para a aplicao da luz laser na cartilagem articular para determinar as
propriedades pticas deste tecido (YOUN et al 2000; EBERT et al, 1998; RAUNEST;
SCHWARZMAIER, 1995). Porm a maioria dos estudos com laser de baixa potncia
em articulaes foram realizados para tratamento de processos inflamatrios articulares
(GUERINO et al, 2000; HONMURA et al, 1992; TRAUNER et al, 1998; HENDRICH,
1997; PALGREN et al, 1989; BASFORD, 1987) alm de uma pesquisa especfica por
meio da utilizao de espectroscopia da cartilagem articular (ZAIA et al, 2000).

1.1. Caractersticas da cartilagem articular

A maioria das articulaes do corpo humano representada pela articulao

sinovial ou diartrodial. Uma articulao complexa, projetada basicamente para a
mobilidade, embora muitas destas articulaes tambm proporcionem estabilidade
(NORKIN; LEVANGIE, 2001).
As articulaes sinoviais ou diartrodiais so constitudas de cpsula articular,
principal meio de unio, formada por tecido fibroso, uma espcie de manguito que
envolve a articulao prendendo-se nos ossos que se articulam. Um espao virtual
denominado de cavidade articular envolvido pela cpsula, onde se encontra o lquido

sinovial ou sinvia (figura 1.1). A membrana sinovial a camada interna da cpsula

articular, possui vascularizao e inervao, sendo encarregada da produo da sinvia.
A camada externa da cpsula, denominada de camada fibrosa composta de tecido
conjuntivo fibroso denso, cujas fibras esto firmemente aderida ao peristeo dos ossos
(SPENCE, 1991).
A Cartilagem articular o revestimento das superfcies sseas da articulao
sinovial composta por uma fina camada de aproximadamente 1 a 5 mm. Em virtude
deste revestimento as superfcies articulares se apresentam lisas, polidas e de colorao
esbranquiada, alm de serem avascular e aneural tambm a superfcie de movimento
da articulao sinovial. Possui um grau elevado de especializao para permitir uma
eficaz distribuio de cargas, resistncia s foras de compresso e uma reduo nas
foras de atrito entre as superfcies articulares (DANGELO; FATTINI, 1997;
KUETTNER et al, 1991).

Figura 1.1: Representao esquemtica da diartrose entre fmur e tbia - cartilagem

articular (Modificado: JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan. 1982).
A cartilagem inicia-se a partir do mesnquima embrionrio sendo que a primeira
modificao

ocorre

com

arredondamento

das

clulas

mesenquimatosas,

multiplicando-se de forma rpida para constituir os aglomerados. Essas clulas

formadas possuem citoplasma muito basfilo sendo denominadas de condroblastos.
Com o incio da sntese da matriz ocorre o afastamento entre os condroblastos, e como

a diferenciao das clulas da cartilagem inicia-se do centro para a periferia, nessa fase
as clulas mais centrais apresentam as caractersticas de condrcitos, enquanto que as
clulas mais perifricas ainda encontram-se com caractersticas de condroblastos
tpicos. O crescimento da cartilagem ocorre por dois processos: pelo crescimento
intersticial, por meio de diviso mittica dos condrcitos preexistentes, e, pelo
crescimento aposional que se faz a partir das clulas do pericndrio, esses novos
condrcitos logo produzem fibrilas colgenas, proteoglicanas e glicoprotenas
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995).
A

composio

celular

na

cartilagem

articular

apresenta

condrcitos

escassamente distribudos, menos de 10% do volume tecidual. Apesar desta deficiente

distribuio, os condrcitos so responsveis pela secreo e manuteno dos
componentes orgnicos da matriz extracelular. Alm do colgeno, outras substncias
tambm so produzidas pelos condrcitos como as proteoglicanas e as no protenas
glicosaminoglicanas como o cido hialurnico, esse ltimo responsvel pela
diminuio do coeficiente de atrito da cartilagem (SMITH et al, 2000; ALLAN, 1998).
O componente orgnico extracelular composto por uma densa cadeia de fibras
de colgeno do tipo II situada numa soluo concentrada de proteoglicanas e
representa cerca de 10 a 30% do peso lquido da cartilagem articular, enquanto que as
proteoglicanas representam de 3 a 10% do peso lquido da cartilagem articular, e os 60
a 87% restantes so constitudos por gua, sais inorgnicos, e uma pequena quantidade
de outras protenas, glicoprotenas e lipdeos (BONASSAR et al, 1995; NORDIN;
FRANKEL, 1989).
Na cartilagem hialina das articulaes sivoviais so encontradas quatro zonas ou
camadas distintas: superficial, intermediria ou mdia, hipertrfica ou profunda e
calcificada (figura 1.2). Essas zonas esto relacionadas com a direo dos feixes de
fibrila em relao superfcie e com as caractersticas morfolgicas dos condrcitos
(NORDIN; FRANKEL, 1989; DUNHAM et al, 1988; ROTH et al, 1980).
A zona superficial representa de 10 a 20% da espessura total da cartilagem, na
qual os feixes de fibrilas esto dispostos paralelamente superfcie. Esta camada
regular ajuda a reduzir a frico entre as superfcies articulares opostas. Quanto
disposio dos condrcitos, esses se encontram paralelos superfcie com
caractersticas ovaladas e de pequenas dimenses, alm de possuir organelas reduzidas

e pouco desenvolvidas. Essa considerada uma zona em que a rede de colgeno

encontra-se mais ordenada e em maior concentrao em relao as outras zonas
(NORDIN; FRANKEL, 1989; DUNHAM et al, 1988)
A segunda zona, intermediria ou mdia, representa 40 a 60% da espessura
total. Os feixes de fibrilas esto dispostos aleatoriamente e mais afastados, formando
uma trelia aberta como uma rede de fibras frouxamente enroladas que permite a
deformao e auxilia na absoro de parte da fora imposta sobre as superfcies
articulares. Os condrcitos tambm possuem distribuio aleatria, formas mais
arredondadas e dimenses maiores em relao camada superficial, alm de possuir
um nmero maior de organelas citoplasmticas (KUETTNER et al, 1991; DUNHAM,
1988).
J a terceira zona, profunda ou hipertrfica, representa 30% da espessura total,
algumas fibras situam-se perpendicularmente superfcie, estendendo-se atravs da
interface entre as cartilagens no calcificada e calcificada, nas quais fixam-se
firmemente a cartilagem calcificada. Nessa zona so encontrados condrcitos ricos em
organelas citoplasmticas que possuem direo perpendicular a zona calcificada
(KUETTNER et al, 1991).
A zona calcificada da cartilagem, denominada tambm de quarta zona, localizase adjacente ao osso subcondral e fixa fortemente a cartilagem regio ssea. A
interface entre a cartilagem calcificada e no calcificada denominada marca de mar,
sendo esta regio importante devido sua relao com o crescimento, cicatrizao e
envelhecimento. So encontradas nessa zona clulas e matriz extracelular de
hidroxiapatita de clcio devido proximidade ao osso subcondral (NORKIN;
LEVANGIE, 2001; KUETTNER et al, 1991).

Figura 1.2: Disposio das fibrilas e condrcitos nas zonas da cartilagem articular
(Modificado: NORDIN, M; FRANKEL,

VH. Basic Biomechanics of the

musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).

O componente fibroso do tipo hialino da cartilagem em sua matriz extracelular

compe-se principalmente de colgeno dos tipos II, IX e XI, e embora a gua seja o
componente mais abundante da cartilagem hialina, a substncia fundamental forma um
gel rgido. O colgeno, sendo o principal constituinte na matriz extracelular quase
exclusivamente o do tipo II, apesar de colgenos do tipo VI, IX, X, XII, e XIV estarem
presentes em pequenas quantidades (ALLAN, 1998).
O colgeno uma protena muito abundante e corresponde a 30% de toda
protena do corpo humano, possui grande resistncia tensiva, sendo responsvel pela
integridade funcional das estruturas do tecido conjuntivo (NORKIN; LEVANGIE,
2001).
Estrutura-se na forma fibrilar, sendo representado por um conjunto de trs
cadeias peptdicas seqenciais de aminocidos, entre os quais os elementos
hidroxilados mais representativos esto a hidroxiprolina e a hidrolisina, sendo que a
primeira representa tipicamente 13% da estrutura colgena (DOUGLAS, 2002).

As fibrilas de colgeno do tipo II so estabilizadas por ligaes cruzadas

covalentes que esto presentes em suas molculas. Possuem dimenses reduzidas,
possibilitando que suas fibrilas dispersem na matriz extracelular e consequentemente
aumentem a relao com os agregados de proteoglicanas na cartilagem (ROTH et al,
1980). A rede desse tipo de colgeno responde pela estrutura da cartilagem articular e
proporciona resistncia s foras tensivas empregadas a ela (KUETTNER et al, 1991).
Alm do colgeno tipo II, os outros tipos de colgenos encontrados na
cartilagem articular possuem funes sugeridas para o comportamento mecnico do
tecido, pois atuam na formao e manuteno da rede de fibrilas. O colgeno tipo VI
possui uma funo sugerida de atuao na ligao entre os condrcitos e a matriz
extracelular, sendo que sua concentrao no ultrapassa os 2% do colgeno presente na
cartilagem articular (THOMAS et al, 1994).
Quanto ao colgeno do tipo IX, estudos indicam que responsvel pelas
ligaes covalentes entre a fibrilas de colgeno tipo II (THOMAS et al, 1994; EYRE,
1991), enquanto que a funo do colgeno do tipo X ainda no est bem elucidada,
porm muito encontrado em processos de ossificao endocondral, sendo que ambos
possuem concentrao de 1% cada na cartilagem articular madura (THOMAS et al,
1994). O colgeno tipo XI responde pelo mecanismo de estabilizao da rede colgena,
e sua concentrao, com exceo do tipo II, supera todos os outros tipos de colgeno
com a presena de aproximadamente 3% na matriz extracelular. E para os tipos XII e
XIV, alguns autores sugerem que eles atuem na formao da matriz da cartilagem, alm
de possurem as menores concentraes de colgeno na cartilagem articular,
aproximadamente de 0,1 % (THOMAS et al, 1994; EYRE, 1991).
Alm do colgeno, esto presentes tambm na matriz extracelular da cartilagem
hialina as PGs, assim como outros componentes, as GAGs sulfatadas e no sulfatada
como o cido hialurnico (HA), porm em baixa concentrao (NISHIDA et al, 2000).
As PGs so responsveis pelas propriedades viscoelsticas da cartilagem
articular, atuam na reteno de gua e proporcionam resistncia s cargas compressivas
e para deformao elstica (VOLPI; KATZ, 1991).
Quanto as GAGs, dois sulfatos so encontrados na cartilagem articular, o
condroitin-sulfato e o queratan-sulfato. Estes sulfatos so cadeias de polmeros
repetidos de unidades de dissacardeos especficos, sendo a cadeia condroitin-sulfato

formada por 25 a 30 unidades dissacardeos, enquanto que a cadeia de queratan-sulfato

menor e composta aproximadamente por 13 unidades de dissacardeos. A
concentrao desses sulfatos sofrem alteraes durante o envelhecimento, com um
aumento de queratan-sulfato em relao ao condroitin-sulfato. (BRAND et al, 1991;
NORDIN; FRANKEL, 1989).
A maioria das PGs da cartilagem articular est disposta em forma de agregados
com uma interao na forma no covalente com o HA (GAG no sulfatada)
estabilizado por uma protena de ligao (BRAND et al, 1991).
De acordo com NORDIN e FRANKEL (1989), na cartilagem articular normal, a
estrutura e a interao qumica das GAGs influenciam as propriedades e conformao
dos agregados PGs (figura 1.3). Essas macromolculas de cargas repulsivas estendemse no espao interfibrilar formado pelas cadeias de colgeno. Os ctions mveis na
soluo, tais como o sdio e o clcio so atrados para fixarem em grupos nions nas
GAGs, criando uma presso osmtica de dilatao aproximada de 0,35 Mpa. A presso
de dilatao por sua vez resistida e balanceada pela tenso desenvolvida pela cadeia
de colgeno, restringindo as PGs em somente 20% de sua soluo dominante,
consequentemente esta presso de dilatao caracteriza a cadeia de colgeno ao estado
de pr-carga.
Quando uma carga compressiva aplicada na superfcie da cartilagem, ocorre
uma deformao instantnea causada primariamente pela mudana molecular nas PGs
dominante. Essa carga externa faz a presso interna na matriz exceder a presso de
dilatao e o lquido comea fluir para fora do tecido. Como o fluxo do fluido sai, a
concentrao das PGs aumenta, e esta alterao torna a aumentar a presso osmtica de
dilatao, a fora repulsiva das cargas e o volume de estresse compressivo ocorre at o
equilbrio com a carga externa (SCHWARTZ et al, 1994; NORDIN; FRANKEL,
1989).
Alm disso, a alterao do pH, e/ou a concentrao inica alteram as foras das
cargas repulsivas intermoleculares das PGs e causam alterao no tamanho do agregado
dominante. Isto demonstra que a propriedade fisicoqumica das PGs entre as cadeias de
colgeno na cartilagem realiza uma importante funo de resistncia compresso,
sendo que essa qualidade das PGs de resistncia compresso est associada a dois
fatores: o primeiro fator relacionado com a presso osmtica de dilatao dominante

devida interao com os conjuntos dos grupos inicos fixados nas GAGs; e o outro
fator relacionado massa de rigidez compressiva do emaranhado entre os agregados
PGs e a cadeia de colgeno (NORKIN; LEVANGIE, 2001; SCHWARTZ et al, 1994;
KUETTNER et al, 1991; NORDIN; FRANKEL, 1989).
Durante a aplicao e remoo de foras compressivas na articulao, ocorre a
remoo e absoro de gua juntamente com outros nutrientes, sendo considerado
tambm um processo importante para o controle e manuteno da cartilagem. A
mobilidade articular e foras compressivas fisiolgicas resultam no aumento de
proteoglicanas sintetizadas pelos condrcitos, favorecendo as propriedades mecnicas
da cartilagem articular (KIVIRANTA et al, 1987).
As alteraes e danos na cartilagem articular so muito comuns, sendo doenas
debilitantes encontradas na prtica ortopdica. Devido a esse fato o conhecimento da
fisiologia da cartilagem normal pr-requisito para a compreenso dos processos
patolgicos da cartilagem articular (COHEN, 1998).

Figura 1.3: Resposta das proteoglicanas s foras mecnicas compressivas

(Modificado: NORDIN, M.; FRANKEL, VH. Basic Biomechanics of the
musculoskeletal system. Philadelphia: Lea and Febiger, 1989).

1.2. Alteraes da cartilagem articular na ausncia de cargas

Na degenerao da cartilagem articular so encontradas vrias alteraes de seus

componentes, sendo estas alteraes de formas evolutivas. Algumas substncias da
cartilagem articular apresentam uma maior alterao na fase precoce de sua
degenerao, como por exemplo, o condroitin-sulfato, PGs, hialuronato e colgeno.
Devido a estas modificaes precoces, aumenta o interesse nos estudos das formas de
identificao destas substncias na cartilagem articular (HAAPALA et al, 2001).
Em experimentos realizados com ovelhas, comparando o estresse articular
causado pela caminhada entre solo de concreto e solo de terra ou mato, RADIN et al.
(1982) obtiveram resultados significantes com o aumento do nvel de rigidez da
cartilagem articular femoral e uma diminuio das GAGs associada rigidez da mesma
cartilagem nas ovelhas que caminharam em solo de concreto em comparao com as
ovelhas que caminharam em solo de terra ou mato. Porm, neste estudo foi realizada
uma induo de uma degenerao crnica da cartilagem articular, pois a anlise da
cartilagem ocorreu somente aps nove meses de caminhada pelas ovelhas.
A ausncia de mobilidade tambm causa efeitos deletrios cartilagem. A
imobilizao um mtodo frequentemente utilizado como terapia para acometimentos
msculo-esquelticos desde a poca de Hipcrates. Quando ocorrem fraturas sseas,
leses ligamentares, musculares e distrbios articulares degenerativos e traumticos
realizado tratamento cirrgico, e ou o tratamento conservador com a imobilizao do
membro, normalmente aplicado por meio de atadura gessada (APPEL, 1986).
Estudos clnicos e experimentais demonstram que a mobilizao precoce
controlada melhor do que a imobilizao do membro para o tratamento primrio de
leses msculo-esquelticas agudas, pois ao contrrio da imobilizao evita a
contratura dos tecidos periarticulares e consequentes danos cartilagem (KANNUS,
2000).
A reduo de movimentos na articulao sinovial altera a morfologia,
bioqumica e caractersticas biomecnicas dos componentes da articulao. A
diminuio do estmulo mecnico na interface das cartilagens pode causar a reduo
da cartilagem e permite que ocorra a sua ossificao endocondral (ROOIJ et al, 2001).

Em outras alteraes resultantes da imobilizao so encontradas: a

proliferao de tecido conectivo fibroso dentro do espao articular, aderncias dos
tecidos conectivos fibrosos das superfcies da cartilagem, atrofia da cartilagem,
ulceraes dos pontos de contatos entre cartilagem-cartilagem, e, em casos extremos, a
disfuno permanente do membro imobilizado. A aplicao de cargas mecnicas
provm importantes estmulos teciduais para o desenvolvimento e manuteno da
homeostase na articulao sinovial, pois o movimento articular melhora o fluxo da
nutrio transinovial. O mecanismo de estimulao celular dos condrcitos
influenciado por foras mecnicas e est relacionado s taxas de sntese e degradao
dos componentes da matriz orgnica (AKESSON et al, 1987).
As alteraes bioqumicas e histolgicas dos componentes da matriz na
imobilizao articular so decorrentes da privao de estresse na articulao. Em
experimentos in vitro para a verificao da reao tecidual sob cargas mecnicas, foi
observado a ocorrncia do aumento no metabolismo do condrcito em resposta
carga de presso hidrosttica intermitente intra-articular, enquanto as cartilagens que
no permaneceram sob esse tipo de carga no apresentaram o aumento do
metabolismo celular (SUCH et al, 1999).
Segundo AKESSON et al (1987), na ausncia de estresse articular ocorrem
alteraes bioqumicas da matriz tecidual tais como a diminuio do contedo de gua,
diminuio de GAGs, diminuio da massa de colgeno e aumento da ligao cruzada
do colgeno. Aps 9 semanas de imobilizao ocorre a reduo de 5% da massa de
colgeno, com o aumento das ligaes cruzadas que so associadas com a sntese de
novo colgeno, e a presena delas em grandes quantidades indica aumento de colgeno
imaturo no tecido. A perda insignificante da massa do colgeno nos estgios precoces
da imobilizao no se repete em estgios de imobilizao mais prolongada, como em
perodos de 12 semanas, no qual ocorre uma grande perda da massa do colgeno, cerca
de 25% com degradao exponencial na imobilizao continuada. As mudanas das
PGs na matriz so inferidas pela gua e alteraes das GAGs na matriz orgnica. Alm
disso, ocorre tambm a perda de cido hialurnico (40%), gua (6%), condroitin-sulfato
(20%) e demartan-sulfato (8%). A implicao da diminuio da gua e das GAGs est
relacionada com a diminuio do espao e da lubrificao deficiente da matriz
orgnica, e essas alteraes causam efeitos mecnicos considerveis nos tecidos moles.

PALMOSKI et al, 1980, relataram ao realizar estudos com um grupo de ces

com uma pata posterior amputada, que aps 6 semanas a cartilagem articular do cndilo
femoral do lado amputado apresentou diminuio da espessura da cartilagem,
diminuio do contedo de GAGs, aumento do contedo de gua, estrutura defeituosa
das GAGs e reduo na sntese de rede de GAGs. Os mesmos autores caracterizaram
essas alteraes como similares s que ocorre no estgio precoce da doena
degenerativa articular. BENICHOU e WIROTIUS (1980) examinaram 53 pacientes
para anlise do quadril do membro inferior amputado, e relataram que metade dos
pacientes apresentou reduo de 50% da reduo da espessura da cartilagem do quadril
do lado amputado e que todos os pacientes tiveram osteoporose desse mesmo lado.
Em outro experimento comparativo de carga articular controlada em joelhos de
ratos realizado por TAGIL e ASPENBERG (1999), foi encontrado crescimento
intrnseco de cartilagem no grupo submetido ao estresse de compresso intermitente
aproximado de 2 Mpa, enquanto no grupo em que os espcimes no foram submetidos
a nenhum tipo de carga, no houve o crescimento intrnseco da cartilagem articular.
Esses resultados esto de acordo com a descrio de modelos tericos que preconizam
que a estimulao mecnica intermitente necessria para manter a diferenciao da
cartilagem articular, pois quando ocorre essa ausncia mecnica, como por exemplo, na
imobilizao articular, a cartilagem substituda por tecido sseo (ROOIJ et al, 2001).
JORTIKKA et al (1997) verificaram a influncia do movimento intra-articular
na cartilagem com experimento de imobilizao articular em joelhos de ces jovens,
sendo que encontraram diferenas significativas bioqumicas na cartilagem articular,
principalmente na reduo do contedo de PGs e condroitin-sulfato, no grupo que
permaneceu imobilizado, e assim como ELDER et al. (2000) sugerem que a quantidade
de movimento articular seja um fator relevante para a condrognese na cartilagem.
Em um trabalho com imobilizao similar ao de JORTIKKA et al (1997), os
pesquisadores ODRISCOLL et al. (1986) utilizaram coelhos e observaram que a
reparao da cartilagem articular danificada foi mais eficaz no membro com a
realizao do movimento contnuo passivo em comparao ao membro imobilizado.
AKESSON et al, 1987 relataram dois experimentos com imobilizao de joelho
de ratos adultos. No primeiro detectaram que as primeiras alteraes ocorreram em
duas semanas, sendo caracterizadas pela atrofia muscular e presena de tecido

conectivo fibroso. A proliferao do tecido conectivo foi estabilizada em 30 dias, neste

perodo tambm foi observado a atrofia da cartilagem pela diminuio de sua espessura.
O perodo de 30 a 60 dias foi caracterizado pelo desenvolvimento de adeso do tecido
conectivo fibroso nas superfcies da cartilagem. Aps 60 dias ocorreu ulcerao da
cartilagem nas reas de compresso. Quanto ao outro experimento, foi utilizada a
imobilizao da articulao com compresso articular extrema pelo mtodo de
imobilizao com flexo forada do joelho, na qual foi observada degenerao
acelerada com leso da cartilagem aps o perodo de 6 dias.
FU et al. (1998), verificaram que aps 6 semanas de imobilizao articular em
coelhos, a cartilagem articular apresentou significante diminuio do contedo de PGs e
uma moderada degenerao da cartilagem.
AKAI et al. (1997), tambm realizaram experimentos com ratos utilizando a
imobilizao com flexo forada do joelho seguindo modelo de WILSON e DHANERS
(1988), com o objetivo de estudar os efeitos do laser de baixa potncia nas propriedades
mecnicas do osso e da cartilagem articular, e obtiveram resultados de alteraes
mecnicas quanto rigidez da cartilagem aps o perodo de uma semana de
imobilizao, sendo realizado aps este perodo o tratamento com laser de baixa
potncia.
USUBA et al. (1998), utilizaram o mesmo protocolo de WILSON e DHANERS
(1988), na imobilizao com flexo forada do joelho em ratos para estudos da
viscoelasticidade de tecidos conectivos periarticulares, e observaram que aps o
perodo de uma semana esses tecidos apresentaram alteraes de suas propriedades
mecnicas.
HAAPALA et al. (2001), em experimentos realizados com a imobilizao da
articulao do joelho direito em ces beagles, demonstraram que aps 11 semanas de
imobilizao, houve uma diminuio dos nveis de interleuk alfa I, inibidor de
metaloproteinase e da concentrao de condroitin-sulfato em 38% em comparao com
o grupo controle. Outro componente apresentou reduo da concentrao na cartilagem
articular aps a imobilizao, o hialuronato, pois foi observado tambm que o seu
decrscimo foi acompanhado da reduo de PGs. A quantidade e qualidade dos
movimentos na articulao so fundamentais para o metabolismo dos condrcitos e
para a eficcia da reparao de defeitos da cartilagem (JORTIKKA et al, 1997).

1.3. Terapia laser de baixa potncia em cartilagem articular

A palavra laser um acrmio resultante de light amplication by stimulated

emission of radiation. Difere de outras fontes de luz por apresentar caractersticas
particulares como a monocromacidade, coerncia, a brilhncia, e a direcionalidade
(NICOLAU, 2001; LOPES, 2001)
O laser o resultado de eltrons ou molculas que, ao serem estimulados,
realizam um salto quntico, passando de um estado energtico mais baixo para um
estado energtico mais alto, tendo como consequncia a emisso de ondas
eletromagnticas com mesma freqncia e nica direo (ORTIZ, 2001; KITCHEN,
1991).
O mecanismo pelo qual o laser de baixa potncia (LBP) atua, est relacionado
com o aumento de ATP e com a modificao do transporte inico, ou seja, ao nvel de
organelas celulares, como as mitocndrias e membranas celulares (KARU, 1987).
A regio do espectro eletromagntico mais utilizada no tratamento por LBP para
tecidos mais profundos est entre 600 nm a 1300 nm, pois nessa regio espectral os
comprimentos de ondas so absorvidos em menor intensidade na pele, proporcionando
uma transmisso mais eficaz. Nessa regio espectral encontram-se a luz visvel
(vermelho) e o infravermelho prximo, sendo denominada tambm de janela espectral
para tecidos biolgicos (RIGAU, 1996).
Segundo KICTCHEN e PARTRIDGE (1991), os comprimentos de onda que
esto na regio do infravermelho prximo possuem maior capacidade de penetrao no
tecido vivo em relao aos comprimentos de onda que afastam dessa regio no sentido
da regio ultravioleta. As caractersticas dos pigmentos influenciam diretamente a
transmisso e absoro da luz laser nos tecidos mais profundos, estando entre esses
pigmentos a melanina, a hemoglobina e a mioglobina (BAXTER, 1997).
O LBP pode gerar dois tipos de reaes no tecido biolgico. O efeito
fotoqumico, que gerado por conseqncias da interao fotoreceptor- luz laser, tais
efeitos so: acelerao na transferncia de eltrons, aumento da produo de superxido e formao de oxignio molecular, alm da possibilidade da absoro da luz pela
mitocndria, podendo gerar alteraes na sntese de DNA e RNA, alm do aumento da
proliferao celular. O efeito fotoeltrico do laser no infravermelho est associado s

mudanas no potencial de membranas ocasionando um aumento da sntese de ATP

intracelular nos processos patolgicos, pois intervm no mecanismo de intercmbio
inico da membrana. Em curto prazo o LBP acelera a sntese de ATP, a gliclise e a
oxidao fosforilativa e ao longo prazo a transcrio e replicao do DNA (LOPES,
2002; ORTIZ et al, 2001; NICOLAU, 2001; RIGAU, 1996; KARU, 1999; KARU,
1987).
Para que ocorram os efeitos fotoqumicos, existem fotorreceptores celulares,
sensveis aos determinados comprimentos de onda (KARU, 1987). Segundo LAAKSO
et al (1993) os comprimentos de onda no infravermelho so primeiramente absorvidos
pelas protenas e pela gua, e possuem pouca sensibilidade para os pigmentos como a
melanina e a hemoglobina.
Os fotorreceptores celulares, tambm denominados de cromforos, aps serem
estimulados por uma energia eletromagntica da luz laser convertem em reao
fotoqumica. considerado como fotorreceptor primrio, para a regio espectral no
infravermelho prximo (700 a 900 nm), o citocromo-oxidase, porm este fotorreceptor
somente eficaz quando no est totalmente oxidado ou totalmente reduzido,
permitindo assim, que a bioestimulao ocorra (KARU, 1999; LUBART et al, 1992).
CALATRAVA et al (1997) realizaram um estudo comparativo de terapia com
LBP em leses na cartilagem articular de joelhos de coelhos. Foi comparado o
tratamento entre dois grupos, um grupo com laser He-Ne (vermelho) com comprimento
de onda de 632,8 nm e outro grupo com laser As-Ga (infravermelho) com comprimento
de onda 904 nm. Aps treze sesses de irradiao laser durante duas semanas, no grupo
com laser As-Ga (infravermelho), a cartilagem articular apresentou caractersticas de
cartilagem hialina com poucos componentes fibrosos e aumento do nmero de
condrcitos; enquanto no grupo com laser He-Ne (vermelho), a cartilagem apresentou
reas de tecido de granulao e fibrocartilagem, e o grupo controle apresentou somente
tecido de granulao. Em ambos os grupos irradiados houve um aumento significativo
da quantidade de GAGs e de cidos mucopolissacardeos na cartilagem .
Em outros estudos experimentais foram encontrados resultados similares, quanto
ao aumento do nmero de condrcitos na cartilagem aps o tratamento com LBP,
porm os laseres utilizados foram o He-Ne e o Nd-YAG (LABAJOS et al, 1990;
SCHULTZ et al, 1985). HERMAN e KHOSLA (1988) relataram que aps o tratamento

de cartilagem bovina por irradiao com um laser Nd-YAG, obtiveram resultados

semelhantes quanto ao aumento da quantidade de GAGs na cartilagem, alm do
aumento do colgeno aps doses maiores, alm de aumento da sntese de DNA.
Em experimentos in vitro com culturas de condrcitos tratadas com irradiao
LBP no infravermelho com As-Ga-Al houve aumento significativo no nmero de
clulas, tanto em culturas de condrcitos de coelhos quanto em culturas de condrcitos
humanos, demonstrando um efeito de bioestimulao eficaz (TORRICELLI et al, 2001).
MANZANARES et al (1992), tambm encontraram efeitos de bioestimulao na
cartilagem de crescimento em ratos wistar. O tratamento ocorreu durante trs dias
seguidos com a utilizao de laser He-Ne, obtendo resultados mais significativos com
densidades de energia de 5,4 e 7,2 J/cm2 .
AKAI et al (1997) realizaram um trabalho de anlise da biomecnica da rigidez
da cartilagem articular aps o tratamento com laser As-Ga-Al com comprimento de
onda de 810 nm e energia acumulada de 43 J e 65 J. O experimento foi realizado com
ratos wistar com imobilizao em flexo do joelho de um membro inferior mantida por
sete dias. Aps esse perodo o joelho imobilizado foi tratado com irradiao LBP
durante duas semanas com aplicaes realizadas a cada dois dias. O teste biomecnico
com espectrmetro viscoesltico revelou que a rigidez da cartilagem articular do joelho
imobilizado tratado com laser foi preservada, demonstrando ser uma possibilidade de
tratamento para a preveno de alteraes biomecnicas por imobilizao.
O tratamento LBP em processo inflamatrio articular induzido mostrou-se eficaz
num estudo experimental em joelhos de cobaias, promovendo uma reduo na
proliferao de clulas inflamatrias no tecido danificado, alm de induzir a formao
de pontes de cartilagens favorecendo a reparao tecidual da cartilagem lesada
(GUERINO et al, 2000). HONMURA et al (1992) demonstraram em modelo
experimental de induo de inflamao em ratos tratados com irradiao laser de diodo
As-Ga-Al, efeitos positivos para a inibio do edema articular e das alteraes na
formao do tecido de granulao na cartilagem articular.
TRAUNER et al (1998) em experimentos em joelhos de coelhos com artrite
reumatide induzida realizaram o tratamento com LBP de 630 nm com energia total de
100 J/cm2 , para verificar a influncia da energia laser entregue na terapia fotodinmica,
obtendo como resultado a eficcia da utilizao do laser com photofrin na reduo de

processo inflamatrio do lquido sinovial. HENDRICH e SIEBERT (1997) tambm

encontraram eficcia na terapia fotodinmica, porm seus experimentos foram
realizados com culturas de clulas de fibroblastos de humanos portadores de artrite
reumatide.
PALMGREN et al (1989) aps estudos clnicos de tratamento com LBP com
pacientes com artrite reumatide obtiveram como resultados diminuio de edema
articular, aumento da flexibilidade articular, alm de relatos de reduo do quadro
lgico como encontrados em estudos similares realizados por outros autores
(AILIOAIE et al, 1999; ASADA et al, 1989; COLOV et al, 1987; BLIDDAL et al,
1987). Por meio da utilizao da biopsia da membrana sinovial do joelho com artrite
reumatide, BARBERIS et al (1996) verificaram a diminuio de prostaglandina aps o
tratamento com irradiao laser He-Ne com densidade de energia de 8 J/cm2 . Nos
experimentos realizados por NISHIDA (1988) foram encontrados resultados
semelhantes, alm de outras alteraes histolgicas aps o tratamento de irradiao
articular com laser de baixa potncia.
LONAUER (1986) tambm realizou um trabalho com terapia com LBP em
pacientes portadores de artrite reumatide, relatando que encontrou melhores resultados
quanto diminuio da dor articular, quando utilizou a associao de laser He-Ne com
laser infravermelho do que somente a utilizao isolada do laser He-Ne. Em outro
trabalho AMANO et al (1994) realizaram o tratamento com LBP utilizando o As-Ga-Al
com comprimento de onda de 790 nm, potncia de 10 mW e com durao de 6 dias,
obtendo bons resultados quanto diminuio do infiltrado celular inflamatrio e alvio
da dor. J WALKER et al (1987) utilizaram um laser He-Ne, vermelho, com
comprimento de onda de 632, 8 nm, potncia de 1 mW e durao de tratamento de 10
semanas em pacientes com artrite reumatide, o qual demonstrou ser um tratamento
eficaz para o alvio da dor. Alm da diminuio dos sintomas dolorosos, o LBP tambm
eficaz na melhora da rigidez matinal principalmente quando utilizada a densidade de
energia de 3 J/cm2 (BROUSSEAU et al, 2000).

1.4. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)

A anlise espectral por meio da utilizao da radiao laser com comprimento de

onda no infravermelho prximo para mensurar a resposta espectral de radiao
espalhada inelstica emitida pelo meio conhecida por efeito Raman. Este efeito foi
primeiramente analisado em experimento por Chandrasekhara Venkata Raman em 1930
(SILVEIRA Jr, 2001,VERDEYEN, 1995).
A espectroscopia Raman verifica o nvel vibracional molecular, situa-se
comumente na regio espectral do infravermelho, sendo que suas frequncias so
determinadas pela diferena entre as frequncias das radiaes incidentes e espalhadas
(SALA,1995).
A absoro, transmisso e espalhamento so efeitos que ocorrem na interao da
radiao eletromagntica com a molcula. A irradiao espalhada com a mesma
frequncia da irradiao incidente denominada de espalhamento elstico (Rayleigh),
enquanto que o espalhamento com frequncia diferente da irradiao incidente
chamado de espalhamento inelstico (figura 1.4) (HALON et al, 2000; VERDEYEN,
1995).

Figura 1.4: Espalhamento inelstico demonstrado na figura pelas setas menores.

A maior parte do espalhamento possui o componente elstico (Rayleigh) e

somente uma pequena frao da irradiao incidente sofre alterao no espalhamento,
ou seja espalhamento inelstico "Raman", sendo que ocorre com a diminuio da
energia (h( i-r)) "stokes" ou com o aumento da energia (h( i + r)) "anti-stokes" (figura
1.5) (HANLON et al, 2000).
preconizado que a interao entre as molculas possuem banda vibracional
espectral especfica, como uma impresso digital da molcula. So determinadas pelas
frequncias vibracionais caractersticas das ligaes qumicas da molcula. Esse
processo do espalhamento inelstico ou Raman ocorre a partir da irradiao laser, com
uma absoro molecular de um fton incidente e emisso de um fton espalhado
inelstico na transio da molcula de um estado fundamental para o estado vibracional
excitado (SILVEIRA Jr, 2001; VERDEYEN, 1995; SALA, 1995).

Figura 1.5: Diagrama de Jablonskii (diagrama dos nveis de energia), no qual, as linhas
horizontais largas representam os nveis eletrnicos e as linhas horizontais finas
representam os nveis vibracionais de cada nvel eletrnico. S0 estado eletrnico
fundamental; S1 estado eletrnico excitado; exc freqncia da radiao de excitao;
R freqncia do espalhamento Raman; F freqncia da emisso fluorescente; UV
radiao ultravioleta; IV radiao infravermelha (Silveira Jr., 2001).

A espectroscopia Raman um meio seguro para classificar uma substncia

especfica sem a necessidade da extrao do material biolgico, pois analisa o
comportamento vibracional de uma molcula (SATHAIAH et al, 1996).
A anlise por meio da espectroscopia Raman apresenta uma vantagem de possuir
um sinal Raman de baixa intensidade para gua e vidro. Portanto, essas so substncias
que no prejudicam a anlise espectral e isso facilita a coleta de sinal de amostras
(SHIN, 1993).
Vrias aplicaes biomdicas de espectroscopia Raman foram realizadas
(SILVEIRA et al, 2002; PILOTO et al, 2001; LIMA et al, 2000; HANLON, et al, 2000;
SATHAIAH et al, 1996), como por exemplo, WANG et al (2000) que utilizaram em
seus experimentos a espectroscopia Raman para anlise de alteraes moleculares no
tecido conjuntivo sob aplicaes de foras, por esse tipo de espectroscopia oferecer a
importante vantagem da baixa interferncia da gua no sinal Raman. CAILL et al
(1983) elegeram a espectroscopia Raman com laser de argnio (514,5 nm) para analisar
in vitro os efeitos especficos de substncias presentes nas fibras musculares e
obtiveram eficcia na anlise com alteraes dos picos do Ca+ e Mg+ durante a perfuso
intramuscular dessas substncias e tambm durante modificaes de comprimento dos
sarcomros.
As substncias da MO e MI tambm possuem picos espectrais Raman
caractersticos, que foram utilizados para analisar tecidos biolgicos. CARDEN e
MORRIS (2000) estudaram a diferena na largura do pico de hidroxiapatita de clcio
puro e do fosfato (largura de pico maior) em processos de mineralizao ssea em
patologias sseas e biocompatibilidade de implantes sseos pela identificao de sinais
pela espectroscopia Raman. OTERO (2002), por exemplo, realizou um diagnstico
experimental para calcificaes de vlvulas cardacas, no qual foram analisados os picos
espectrais de 960 cm-1 para o clcio e 1450 cm-1 para o colgeno, substncia essa
tambm presente na MO da cartilagem, KONTOYANNIS e VAGENAS (2000) tambm
analisaram o colgeno, porm de forma quantitativa em modelo artificial de
desmineralizao ssea de fmur.
LOPES (2002) utilizou a espectroscopia Raman para anlise da MI e MO em
reparao ssea aps a terapia com LBP, e, observou em seus experimentos, um pico no

espectro em 1450 cm-1 caracterstico para a MO, sendo que esse pico espectral tambm
encontrado na MO da cartilagem articular, porm com uma intensidade elevada.
Portanto, para estudar as substncias da MO na cartilagem articular, os picos
caractersticos com intensidades mais elevadas representadas no sinal Raman so: os
picos espectrais em 1250 cm-1 para Amida III, 1450 cm-1 para C-H/ MO e 1650 cm-1
para Amida I (TIMLIM et al, 1999; BRENNAN et al, 1997; RAVA et al, 1991).

2. Objetivos

2. Objetivos

Verificar a utilizao da espectroscopia Raman para deteco de alteraes da

cartilagem articular;

Verificar se a espectroscopia Raman capaz de identificar as alteraes da

cartilagem articular oriundas da imobilizao articular;

Verificar se existe diferena na aplicao da bioestimulao por meio da terapia

laser de baixa potncia em duas diferentes densidades de energia (80 e 720
J/cm2 ) na cartilagem articular desprovida de mobilidade.

3. Materiais e mtodos

3. Materiais e mtodos

3.1 Animais

O animal utilizado neste trabalho foi o rato da raa Wistar (Ratus norvegicus
albinus). Cinquenta e dois animais adultos, jovens, machos, pesando 250 50g,
fornecidos pelo biotrio da Unicamp (Campinas-SP). Os mesmos foram mantidos em
gaiolas individuais abastecidas com gua e rao ad libidum, em condies normais de
temperatura e iluminao no biotrio do laboratrio de experimentao animal do IP &
D na Univap.

Grupo

n de

Sacrifcio

animais
Imobilizado e Irradiado com 80

13

J/cm2 (IIA)

Imobilizado e Irradiado com 720

dias aps a retirada da imobilizao

13

J/cm2 (IIB)

Imobilizado e No irradiado

(C)

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

13

(I)

No imobilizado e No Irradiado

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

13

15 dias aps imobilizao e 7, 13 e 19

dias aps a retirada da imobilizao

Tabela 3.1.: Diviso dos animais em grupo e cronograma do sacrifcio.

3.2 - Modelo animal

Foi realizado o modelo de imobilizao adaptado de WILSON e DHANERS (1988).

No dia do procedimento da imobilizao os animais foram submetidos ao procedimento
anestsico de hidrato cloral intraperitonial (1ml/kg em soluo salina a 10 %). Aps a
anestesia, o membro inferior direito dos animais foi tricotomizado com tosquiadeira
recarregvel (Oster) e, em seguida foi realizada a assepsia com soluo tpica de
polvidona Iodo 10% (LM Farma). Em seguida a esses procedimentos iniciou-se a
transfixao do fio de sutura no absorvvel de mononylon 0.0 (Shalon) para
imobilizao do membro inferior em flexo do joelho. O fio de sutura foi transfixado na
regio proximal e anterior da coxa, entre a face anterior do fmur e a face posterior do
msculo quadrceps femoral, e na regio distal e anterior da perna, entre a face anterior
da tbia e a face posterior do msculo tibial anterior (figura 3.1). Aps esse
procedimento o joelho do animal foi posicionado em flexo de 140 com um
tensionamento do fio de sutura e fixao final por meio de ponto cirrgico. Em seguida
foi realizado um movimento passivo no sentido da extenso do joelho para avaliar se a
fixao estava segura. Aps o trmino dos procedimentos de imobilizao os animais
foram colocados em gaiolas individuais onde permaneceram imobilizados por um
perodo de 15 dias. Ao trmino desse perodo, os fios de sutura foram retirados e os
animais recolocados nas gaiolas.

Figura 3.1: Procedimento de imobilizao articular do joelho por meio de fio de sutura
adaptado de WILSON e DHANERS (1988).

3.3 Terapia com laser de baixa potncia

Os animais foram separados em quatro grupos, dois grupos irradiados e outro dois
no irradiados, contendo 13 animais cada grupo (tabela 3.1). Os grupos dos animais no
irradiados foram subdivididos em: um grupo imobilizado e outro grupo controle (no
imobilizado), enquanto que os grupos irradiados apresentavam todos os animais
imobilizados subdivididos em grupo "A" com densidade de energia utilizada para a
terapia de 80J/cm2 e outro grupo "B" com densidade de energia de 720 J/cm2 (tabelas
3.2 e 3.3). A primeira irradiao laser foi realizada no primeiro dia do procedimento de
imobilizao, sendo que a aplicao foi realizada pela tcnica pontual transcutnea em
quatro pontos ao redor do joelho imobilizado (cndilo femoral lateral e medial, e
plat tibial medial e lateral) a cada 48 horas (figuras 3.2 e 3.3). Os animais que foram
sacrificados com 15 dias de imobilizao receberam um total de 8 aplicaes, os
sacrificados com 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao receberam
respectivamente um total de 11, 14 e 17 aplicaes. O aparelho laser utilizado foi um

diodo com meio ativo AsGaAl, infravermelho prximo, e rea do feixe (fibra ptica) de
0,002827 cm2 .

Figura 3.2: Pontos de aplicao laser nos animais irradiados (Modificado:

JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. Histologia Bsica. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan. 1982).

Figura 3.3: Aplicao laser pontual em joelho do rato wistar do grupo irradiado.

Laser diodo 830 nm

Figura 3.4: Laser diodo As-Ga-Al 830nm (IVP) e acessrios: culos de proteo, fibra
ptica e pedal de acionamento.

Valores
Parmetros de irradiao

Grupo "A" (80 J/cm2 )

Grupo "B" (720 J/cm2 )

Densidade de energia por ponto

20,0 J/cm2

180 J/cm2

Potncia

10 mW

10 mW

Comprimento de onda

830 nm

830 nm

rea do feixe

0, 002827 cm2

0, 002827 cm2

Modo de aplicao

Pontual

Pontual

N de pontos por sesso

Tempo por ponto

6 segundos

50 segundos

Tabela 3.2: Protocolo de irradiao com laser As-Ga-Al.

Sacrifcios

Total de energia acumulada (J)

15 dias com imobilizao

Grupo A (80 J/cm2 )

1,92

Grupo B (720 J/cm2 )

16

7 dias aps retirada da imobilizao

2,64

22

13 dias aps retirada da imobilizao

3,36

28

19 dias aps retirada da imobilizao

4,56

34

Tabela 3.3: Total de energia acumulada relacionada com o perodo de sacrifcio.

3.4. Sacrifcio dos animais e retirada dos espcimes

Para o sacrifcio dos animais foi administrado injeo intramuscular de Zoletil

0,8 ml/Kg e aps foi realizada overdose de hidrato cloral (soluo a 10 %) via peritonial
e intracrdia. Em seguida o membro inferior imobilizado foi desarticulado do quadril
para a remoo cuidadosa dos msculos que cruzam a articulao do joelho. Isto feito, o
joelho foi cuidadosamente desarticulado e a cartilagem articular foi retirada juntamente
com a epfise do osso, com irrigao constante de soro fisiolgico 0,9% (Labormdica)
a 10C.

Os perodos de sacrifcios dos animais foram de 15 dias aps a imobilizao

articular e com 7, 13, e 19 dias aps a retirada da imobilizao articular,
correspondendo ao perodo de recuperao, sendo que em cada perodo foram
sacrificados 3 animais de cada grupo para remoo das cartilagens dos cndilos mediais
dos fmures que permaneceram imobilizados.
Os espcimes foram armazenados em nitrognio lquido (-196C) para anlise
por meio de Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP) e posterior
anlise histolgica.
3.5. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)
Foi realizada anlise da cartilagem articular in vitro por meio de ER-IVP no
Laboratrio

de

Espectroscopia

Biomolecular

no

Instituto

de

Pesquisa

Desenvolvimento (IP&D) na Universidade do Vale do Paraba.

Para a anlise espectral foi utilizado o sistema ptico composto por um laser
Titnio: Safira (cristal) com comprimento de onda de 830nm (Spectra Physics, mod
3900S), potncia de chegada na amostra de 100 mW, sendo bombeado por um laser de
Argnio com comprimento de onda entre 488 e 514 e potncia de 5 W (Spectra
Physics, modelo 2017S).
Um posicionador com deslocamento micromtrico nos trs eixos (x,y,z) foi
necessrio para colocar o porta-amostra com a cartilagem, isso permitiu realizar
espectros em oito pontos diferentes em cada espcime.
Para permitir a passagem do sinal Raman ao espectrgrafo (Chromex, NM,
USA, modelo 250IS) aps o laser incidir sobre a cartilagem, foi necessrio eliminar a
radiao elstica espalhada. Para isso foi utilizado um filtro rejeita-banda notch (Kaiser
Optical System, MI, USA, modelo HNPF 3804) com comprimento de onda de rejeio
de 830 nm localizado na entrada da fenda do espectrgrafo. Em seguida uma cmara
digital colorida (CCD) (Princeton Instruments, NJ, USA, modelo LNCCD 1024x256)
realizou a deteco do sinal luminoso da luz que foi dispersada pelo espectrgrafo
(figuras: 5 e 6). O programa CSMA (Princeton Instruments, NJ, verso 2.4) instalado
no microcomputador (Magitronic, 486/100 MHz) foi utilizado para realizar a aquisio
e armazenamento dos espectros coletados. O programa CSMA controlou o tempo de
exposio do detector e o nmero de aquisies por ponto da amostra, que neste

presente trabalho foi de 5 segundos para o tempo de exposio e 10 aquisies em cada

ponto. Foram realizadas aquisies em 8 pontos de cada cartilagem, sendo adquiridos
um total de 384 espectros de 48 espcimes (Tabela 3.4).

N total de cartilagens

n de pontos por cartilagem

48

08

n total de espectros obtidos

384

Tabela 3.4: Relao do n total de espectros obtidos dos espcimes

Para os procedimentos de anlise espectral foi realizada a calibrao por meio da

transformao de pixel para cm

dos espectros que foram obtidos dos espcimes. O

solvente Indino que possui posies dos picos espectrais conhecidos na literatura
(WOLLMAN, BOHN, 1993), foi utilizado como padro para a calibrao. Para isso o
espectro do Indino foi adquirido no mesmo dia da realizao do experimento para
equivalncia dos picos em cm

. Aps a obteno dos espectros ocorreu o processo de

filtragem dos espectros para eliminar o background de fluorescncia da amostra, e,

diminuir o rudo gerado pela CCD. Ambos os procedimentos, calibrao e a filtragem
dos espectros foram realizados por meio do Mat Lab (The Mathworks, MA, USA,
verso 4.2) e um programa especfico para anlise de ER-IVP desenvolvido no
Laboratrio de Espectroscopia Biomolecular do IP&D na Universidade do Vale do
Paraba (OLIVEIRA FILHO, 2003). Para prevenir as variveis na execuo do
experimento e possveis interferncias nas anlises dos espcimes, foi necessria a
realizao do procedimento de normalizao dos espectros calibrados por meio de
isolamento de uma regio que no apresentava picos caractersticos dos espcimes
estudado nesse trabalho.

Filtro passa-banda
hologrfico

Laser de
Ti: Safira

Laser de
Argnio

Espectogrfo

Filtro notch

L2
Pinhole

CCD

L1
Porta - Amostra

Prisma

Microcomputador

Lente Amostra

Figura 3.5: Diagrama esquemtico do Sistema Raman no infravermelho prximo. (L1 e

L2-lentes)

D
C

Figura 3.6: Componentes do Sistema Raman (ER-IVP). A laser de Argnio; B laser

de Ti:Safira; C espectrogrfo; D cmera CCD; E porta-amostras com a epfise do
fmur com a cartilagem; F conjunto de lentes; G . filtro notch .

3.6. Metodologia estatstica

O programa Instat foi utilizado como auxlio para anlise estatstica de todas as
variveis aferidas neste estudo, no qual foi verificado primeiro a normalidade dos dados
por meio do Teste de Kolmorogov e Smirnov. Em seguida, como todos os dados
apresentaram distribuio normal, foram tratados pelo teste de estatstica ANOVA
Turkey-Kramer. O nvel de diferena estatisticamente significante para todos os casos
foi fixado em p<0,05.

3.7. Anlise histolgica

Para a anlise histolgica os espcimes foram retirados do nitrognio lquido e

fixados em soluo de formoldedo 10% por 24 horas, depois desse perodo a soluo
de formoldedo 10% foi renovada e os espcimes mantidos por mais 24 horas.
Terminado esse perodo, todos os espcimes foram lavados e colocados em uma soluo
de cido descalcificador (AlCl3 6H2 O) por 25 dias para permitir os cortes histolgicos
dos mesmos. Aps os emblocamentos dos espcimes com parafina foram realizados os
cortes histolgicos com o micrtomo para posterior colorao das lminas, sendo em
seguida armazenadas na estufa para retirar a parafina. Para a colorao dos cortes
histolgicos foi usado o corante cido Peridico & Reagente de Schiff (PAS) devido a
sua especificidade para GAGs, sendo utilizado o mesmo corante PAS e o mesmo tempo
(15 minutos) de colorao para todos os cortes histolgicos. Para anlise dos cortes
histolgicos, alm da microscopia ptica foi utilizado o software LEICA QWIN (LEICA
Imaging Systems Ltd.), um microscpio LEICA DMIL com lente 10x/0.22 conectado a
uma CCD (JVC ), alm do microcomputador em que foi conectado a cmera e instalado
o software. Foram estabelecidas 3 reas na cartilagem articular referentes a dois teros
da espessura da cartilagem a partir da superfcie articular. Por meio do software LEICA
QWIN foi utilizada a escala de tonalidade do cinza para mensurar a intensidade de
colorao das GAGs da matriz orgnica da cartilagem articular (figura 3.7).

Figura 3.7: Trs reas em retngulos em que foram analisadas as intensidades da

colorao de cada corte histolgico (10x/0.22).

4. Resultados

4. Resultados

4.1. Modelo animal

Com relao aos 52 animais utilizados neste trabalho, dois morreram aps a
anestesia, e, em um animal, o fio de sutura soltou durante o procedimento passivo de
tensionamento em extenso do joelho em seguida ao procedimento de imobilizao.
Todos os animais restantes permaneceram com a imobilizao fixada no perodo
determinado de 15 dias.

4.2. Espectroscopia Raman no infravermelho prximo (ER-IVP)

Na anlise detalhada por meio da espectroscopia Raman para medir as
mudanas bioqumicas nas cartilagens, foram realizados espectros tpicos de cartilagem
retirada da epfise, cartilagem com epfise e do osso (epfise) mostrados na figura 4.1.
Nos espectros Raman da cartilagem normal retirada da epfise ssea apresentaram os
picos espectrais mais importantes relacionados matriz orgnica (MO) em 1450 cm-1 e
1680 cm-1 intensidades elevadas em comparao ao pico espectral relacionado matriz
inorgnica (MI) em 961 cm-1. No espectro filtrado do osso (epfise) os picos espectrais
em 1450 cm-1 e 1680 cm-1 (MO) as intensidades permaneceram baixas enquanto que o
pico em 961 cm-1 (MI) apresentou intensidade elevada quando comparados aos picos
espectrais da cartilagem retirada da epfise ssea. Nos espectros da cartilagem fixada na
epfise ssea o pico em 961 cm-1 (MI) apresentou uma intensidade elevada pelo fato de
haver uma sobreposio do sinal Raman da matriz inorgnica da cartilagem articular e
do osso subcondral, porm os picos da MO apresentaram intensidades elevadas
semelhantes aos espectros obtidos da cartilagem retirada da epfise ssea.

MO 1450

25000

MO 1680

intensidade (u.a.)

961

Cartilagem sem osso

MI

10000
Cartilagem com osso

-5000
800

Osso (epfise)

1200

1600

deslocamentoRaman(cm -1)

Figura 4.1: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens normais de cndilos

mediais de fmures de ratos wistar jovens. Trs bandas espectrais so destacadas, 961
cm-1 correspondente matriz inorgnica (MI), 1450 cm-1 correspondente matriz
orgnica (MO) e 1680 cm-1 tambm correspondente matriz orgnica (MO).
Para anlise dos espectros das cartilagens foram utilizadas as intensidades dos
picos espectrais em 1450 e 1680 cm

para anlise das mudanas na MO e 961 cm

para a MI. As intensidades foram calculadas pela mdia de 24 pontos obtidos das
amostras de cada grupo, sendo determinadas a partir do valor mximo do pico de
interesse subtrado do valor mnimo desse mesmo pico. O valor de interesse resultante
dessa subtrao est relacionado com a concentrao dos componentes da matriz
analisada. Na anlise dos espectros das cartilagens com 15 dias de imobilizao,
ocorreram intensidades mais elevadas nos picos de 1450 e 1680 cm

(MO) para os

grupos que permaneceram imobilizados e irradiados (IIA e IIB), enquanto que o grupo
que ficou imobilizado e no irradiado (I) apresentou a menor intensidade quando
comparado com o grupo controle (C) e grupos irradiados Quanto ao pico em 961 cm

(MI), houve a mesma tendncia dos picos relacionados MO, com intensidades maiores

nos grupos irradiados (IIA e IIB) enquanto que no grupo imobilizado (I) a intensidade
apresentou valores menores (Figura 4.2).

Aps 15 dias de imobilizao

1450

intensidade (u.a.)

17000

1680

---IIIB

---IIA

7000

---C
--- I
-3000
800

1200

1600

deslocamento Raman (cm-1)

Figura 4.2: Mdias dos Espectros Raman obtidos de cartilagens articular aps 15 dias
de imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle sem
imobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm2 .

Nos espectros das cartilagens com 7 e 13 dias (Figuras 4.3 e 4.4) aps a retirada
da imobilizao, os grupos imobilizados e irradiados (IIA e IIB) apresentaram uma
reduo das intensidades dos picos espectrais da MO em comparao ao controle (C) e
ao grupo imobilizado sem irradiao (I), sendo que esse ltimo apresentou um discreto
aumento da intensidade. Nos espectros das cartilagens aps 19 dias da retirada da
imobilizao (Figura. 4.5) as alteraes das intensidades citadas com 7 e 13 dias aps a
retirada da imobilizao foram mais acentuadas, principalmente com relao ao grupo
imobilizado sem irradiao (I) que apresentou um grande aumento da intensidade, sendo
superior a todos os grupos experimentais. Com relao s intensidades do pico 961 cm1
da MI foram obtidos nos resultados a mesma tendncia dos picos da MO em todos os
perodos aps a retirada da imobilizao.

Recuperao: 7 dias aps a retirada da imobilizao

1450

16500

1680

intensidade (u.a)

-IIIB

--IIA

6500

---C

--- I
-3500
800

1200

1600

deslocamento Raman (cm -1)

Figura 4.3: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 7 dias aps a
retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle sem
imobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm 2 .

13 dias aps a retirada da imobilizao

intensidade (u.a.)

17000

1450

1680
---IIB

---IIA
7000

---C

---I
-3000

800

1200

1600

-1

deslocamento Raman (cm )

Figura 4.4: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com13 dias aps
a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle sem
imobilizao e sem irradiao; IIA: grupo imobilizado irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado irradiado com densidade de energia em
720 J/cm 2 .
19 dias aps a retirada da imobilizao
1450

1680
---IIB

intensidade (u.a.)

16000

---IIA

---C

6000

---I
-4000
800

1200

1600

-1

deslocamento Raman (cm )

Figura 4.5: Espectros Raman filtrados obtidos de cartilagens articular com 19 dias aps
aa retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e sem irradiao; C: grupo controle
sem imobilizao sem irradiao; IIA: grupo imobilizado irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm 2 e IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm 2 .

4.3. Anlise estatstica dos resultados Raman

4.3.1. Matriz orgnica
As mdias das intensidades do pico espectral em 1680 cm

referente MO

obtidas de espectros Raman das cartilagens aps 15 dias de imobilizao articular

(Grfico 4.1) apresentaram diferenas estatisticamente significativas entre o grupo
imobilizado e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p<0.05), entre o grupo imobilizado
e irradiado (IIB) e o grupo controle (C) (p< 0.001), e entre os grupos imobilizados e
irradiados (IIA e IIB) e o grupo imobilizado e no irradiado (I) (p<0.001). No foram
encontradas diferenas significantes entre os grupos imobilizados e irradiados com
diferentes densidades de energia, IIA com 80 J/cm 2 e IIB com 720 J/cm

(p>0.05). As

intensidades da MO do grupo controle (C) mostrou-se mais elevada comparadas ao

grupo imobilizado no irradiado (I), porm a diferena mostrada no estatisticamente
significativa (p>0.05).
Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO) com 15 dias de
imobilizao
*

intensidade (u.a.)

3000

2000

1000

IIA

IIB

grupos

Grfico 4.1: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1
(MO) aps 15 dias de imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo no
imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm2 , * estatisticamente significante (p<0.05).

Com 7 dias aps a retirada da imobilizao (Grfico 4.2) no foram observadas

diferenas significativas entre todos os grupos (p=0.3338), assim como no perodo de
13 dias aps a retirada da imobilizao (p=0.1931, Grfico 4.3). Porm no perodo de
19 dias aps a retirada da imobilizao (Grfico 4.4) foram observadas diferenas
significativas entre o grupo imobilizado e no irradiado (I) e o grupo imobilizado e
irradiado (IIA) (p<0.01) e tambm entre o grupo imobilizado e no irradiado (I) e o
grupo imobilizado e irradiado (IIB) (p< 0.05), enquanto que outra diferena
significativa encontrada foi entre o grupo imobilizado e irradiado (IIA) e o grupo
controle (C) (p<0.05). Entre os demais grupos no foram observadas diferenas
significativas. Com relao ao outro pico espectral da MO em 1450 cm

foi observada

a mesma tendncia mencionada no pico espectral em 1680 cm 1 (Grfico 4.5 e 4.6).

Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO) com 7 dias

aps a retirada da imobilizao

intensidade (u.a.)

2250

1500

750

0
I

IIA

IIB

grupos

Grfico 4.2: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1
(MO) com 7 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado;
C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com
densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 720 J/cm2 .

-1

Pico espectral Raman 1680 cm (MO) com 13 dias aps a

retirada da imobilizao

intensidade (u.a.)

2250

1500

750

0
I

IIA

IIB

grupos

Grfico 4.3: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1
(MO) com 13 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado;
C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com
densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 720 J/cm2 .
-1

Pico espectral Raman 1680 cm (MO) com 19 dias aps a

retirada da imobilizao

intensidade (u.a.)

2250
*

IIA

IIB

1500

750

0
I

C
grupos

Grfico 4.4: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1
(MO) com 19 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado;
C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com
densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 720 J/cm2 .

Pico espectral Raman 1680 cm -1 (MO)

*

intensidade (u.a.)

3000

*
*

2000

I
C
IIA
IIB

1000

0
0

13

19

tempo (dias)

Grfico 4.5: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1680 cm-1
(MO) em relao ao tempo (dias). 0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a
retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo no
imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm2 , * estatisticamente significante (p<0.05).

-1

3000

Pico espectral Raman 1450 cm (MO)

*

intensidade (u.a.)

2000

I
C
IIA

1000
IIB

0
0

13

19

tempo (dias)

Grfico 4.6: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 1450 cm-1
(MO) em relao ao tempo (dias). 0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a
retirada da imobilizao. I: grupo imobilizado e no irradiado; C: grupo no
imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de
energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em
720 J/cm2 , * estatisticamente significante (p<0.05).
4.3.2. Matriz inorgnica
As intensidades do pico espectral em 961 cm

referente MI obtidos das

cartilagens aps 15 dias de imobilizao articular apresentaram diferenas significativas

entre o grupo imobilizado e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p<0.001), entre o
grupo imobilizado e irradiado (IIB) e o grupo controle (C) (p< 0.001) e entre os grupos
imobilizados e irradiados (IIA e IIB) e o grupo imobilizado e no irradiado (I)
(p<0.001). No foram encontradas diferenas significantes entre o grupo imobilizado e
no irradiado (I) e o grupo controle (C) (p>0.05), assim como, quando comparados os
valores de intensidades entre os grupos imobilizados e irradiados com diferentes
densidades de energia, IIA com 80 J/cm 2 e IIB com 720 J/cm 2 (p>0.05).
Com 7 dias aps a retirada da imobilizao no foram observadas diferenas
significativas entre os grupos (p=0.1194). No perodo de 13 dias aps a retirada da
imobilizao foram encontradas diferenas significantes entre o grupo imobilizado e
no irradiado (I) e o grupo controle (C) (p< 0.05), e tambm entre o grupo imobilizado

e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p< 0.05). No perodo de 19 dias aps a retirada
da imobilizao foram observadas diferenas significativas entre o grupo imobilizado e
no irradiado (I) e o grupo imobilizado e irradiado (IIA) (p<0.001), entre o grupo
imobilizado e no irradiado (I) e o grupo imobilizado e irradiado (IIB) (p< 0.001) e
entre o grupo imobilizado e irradiado (IIA) e o grupo controle (C) (p<0.01 Grfico 4.7).

Pico espectral Raman 961 cm-1 (MI)

*

intensidade (u.a.)

9000

6000

3000

I
C
IIA
IIB

0
0

13

19

tempo (dias)

Grfico 4.7: Mdias das intensidades dos sinais Raman no pico espectral 961 cm-1 (MI)
em relao ao tempo (dias). I: grupo imobilizado e no irradiado; 0: 15 dias de
imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao C: grupo no imobilizado e
no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80
J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2 ,
* estatisticamente significante (p<0.05).

Pico
Tempo
cm-1

168
0

145
0

Pico
cm-1

0
7
13
19

mdia
s
1389 *
1924
1654
2313 *

0
7
13
19

mdia
s
1785 *
2223
1970
2476 *

Tempo

I vs C
I vs IIA
I vs IIB
C vs IIA
1680 C vs IIB
IIA vs IIB
Teste de
normalidad
e
I vs C
I vs IIA
I vs IIB
C vs IIA
1450 C vs IIB
IIA vs IIB
Teste de
normalidad
e

DP

mdias

743
945
738
1142

1759 *
2240
2131
2120 *

DP

mdias

866
985
664
850

1940 *
2228
2176
2156

0
P>0.05
P<0.001 *
P<0.001 *
P<0.05 *
P<0.001 *
P>0.05
sim
P>0.05
P<0.001 *
P<0.01 *
P<0.01 *
P<0.05 *
P>0.05
sim

IIA
DP

mdia
s
623 2479 *
1266 1730
1058 1692
918 1459 *
DP

IIB

mdia
s
570 2690 *
1089 1984
992
2133
593 1744 *

DP mdia
s
912 2966 *
727 1850
784 1929.
579 1540 *
DP mdia
s
637 2549 *
648 1965
748 2275
563 1798 *

DP
956
992
823
699
DP
840
745
725
615

07

13

19

P = 0.3388
P = 0.3388
P = 0.3388
P = 0.3388
P = 0.3388
P = 0.3388

P =0.1931
P =0.1931
P =0.1931
P =0.1931
P =0.1931
P =0.1931

P>0.05
P<0.01 *
P<0.05 *
P<0.05 *
P>0.05
P>0.05

sim

sim

sim

P = 0.5887
P = 0.5887
P = 0.5887
P = 0.5887
P = 0.5887
P = 0.5887

P = 0.6070
P = 0.6070
P = 0.6070
P = 0.6070
P = 0.6070
P = 0.6070

P>0.05
P<0.01 *
P<0.01 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05

sim

sim

sim

Tabela 4.1: Valores das mdias e desvio padro das intensidades dos sinais Raman nos
picos espectrais 1450 cm-1 (MO) e 1680 cm-1 (MO) em relao ao tempo (dias). Teste
de probabilidade em relao ao tempo (dias) com diferena significante * para p<0,05.
0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo
imobilizado e no irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo
imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado
e irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2 .

Pico
cm-1

961

tempo
0
7
13
19

I
mdias
5626 *
6837
6752
6913 *

Tempo
I vs C
I vs IIA

IIA

IIB

DP mdias DP mdias DP mdias DP

1881 5626 * 1881 8824 * 2625 8862 * 3025
3332 6837 3332 5130 1633 5299 2196
2601 6752 2601 5015 1579 5516 1439
2227 6913 * 2227 4217 * 1504 5331 * 2178
0
P>0.05
P<0.001 *

07
P = 0.1194
P = 0.1194

I vs IIB

P<0.001 *

P = 0.1194

C vs IIA
C vs IIB
IIA vs IIB
Teste de
normalidade

P<0.001 *
P<0.001 *
P>0.05
sim

P = 0.1194
P = 0.1194
P = 0.1194
sim

13

19

P<0.05 *
P>0.05

P>0.05
P<0.001
*
P>0.05
P<0.001
*
P<0.05 * P<0.01 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim
sim

Tabela 4.2: Valores das mdias e desvio padro das intensidades dos sinais Raman no
pico espectral 961 cm-1 (MI) em relao ao tempo (dias). Teste de probabilidade em
relao ao tempo (dias) com diferena significante * para p<0,05.
0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo
imobilizado e no irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo
imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado
e irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2 .

Pico
(cm-1)

1680

1450

961

Tempo
0 vs 07
0 vs 13
0 vs 19
07 vs 13
07 vs 19
13 vs 19
Teste de
normalidad
e
0 vs 07
0 vs 13
0 vs 19
07 vs 13
07 vs 19
13 vs 19
Teste de
normalidad
e
0 vs 07
0 vs 13
0 vs 19
07 vs 13
07 vs 19
13 vs 19
Teste de
normalidad
e

I
P>0.05
P>0.05
P<0.01 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim
P>0.05
P>0.05
P<0.05 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim

P>0.05
P>0.05
P<0.001*
P>0.05
P<0.05 *
P<0.001 *
sim

IIA

IIB

P = 0.3681
P = 0.3681
P = 0.3681
P = 0.3681
P = 0.3681
P = 0.3681

P<0.01 *
P<0.01 *
P<0.001 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05

P<0.001 *
P<0.001 *
P<0.001 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05

sim

sim

sim

P = 0.6554
P = 0.6554
P = 0.6554
P = 0.6554
P = 0.6554
P = 0.6554
sim

P<0.01 *
P<0.05 *
P<0.001 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim

P<0.05 *
P>0.05
P<0.01 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim

P = 0.2655
P = 0.2655
P = 0.2655
P = 0.2655
P = 0.2655
P = 0.2655
sim

P<0.001 *
P<0.001 *
P<0.001 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
sim

P<0.001 *
P<0.001 *
P<0.001 *
P>0.05
P>0.05
P>0.05
Sim

Tabela 4.3: Teste de probabilidade das mdias das intensidades dos sinais Raman nos
picos espectrais em 961 cm-1 (MI), 1450 cm-1 (MO) e 1680 cm-1 (MO) no mesmo grupo
em relao ao tempo (dias) com diferena significante * para p<0,05.
0: 15 dias de imobilizao; 7, 13 e 19 dias aps a retirada da imobilizao. I: grupo
imobilizado e no irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo
imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado
e irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2 .

4.4. Anlise histolgica

Para a anlise histolgica das lminas foi verificada a variao da intensidade de

colorao do PAS por meio de microscopia ptica. A rea correspondente cartilagem
que apresentou colorao mais intensa foi diretamente relacionada com uma maior
concentrao de GAGs da MO. Nas lminas do perodo aps 15 dias de imobilizao,
os grupos IIA e IIB que permaneceram imobilizados e irradiados apresentaram a
colorao PAS mais intensa (figuras 4.6 e 4.7) em comparao com o grupo I que
permaneceu imobilizado e no irradiado (figura 4.8), sendo que o grupo controle (C)
tambm apresentou colorao de maior intensidade (figura 4.9). No perodo de 19 dias
aps a retirada da imobilizao articular as lminas de todos os grupos apresentaram
colorao PAS semelhantes que sugere concentraes similares de GAGs entre todos os
grupos experimentais.

CA

Figura 4.6: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e irradiado

com densidade de energia de 80J/cm2 (IIA) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22),
CA: cartilagem

CA

Figura 4.7: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e irradiado

com densidade de energia de 720J/cm2 (IIB) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22),
CA: cartilagem

CA

Figura 4.8: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e no

irradiado (I) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22), CA: cartilagem.

CA

Figura 4.9: Corte histolgico de cartilagem articular do grupo imobilizado e no

irradiado (C) aps 15 dias de imobilizao (10x/0.22), CA: cartilagem.
Para a anlise por meio do software LEICA QWIN

foi utilizada a escala do

cinza para investigar a intensidade de colorao. Os valores dessa escala variam de 0 a

254 (u.a.), sendo que o menor valor (0) corresponde mxima intensidade do cinza e o
maior valor (254) a mnima intensidade do cinza. Portanto, nos resultados apresentados,
quanto menor o valor da escala do cinza, maior foi a intensidade de colorao do corte
histolgico pelo PAS representando maior concentrao das GAGs da MO da
cartilagem. Foram obtidas intensidades da escala do cinza em 3 reas de cada corte
histolgico, sendo que cada grupo era formado por 3 animais e cada animal
representado por 3 lminas, constituindo um total de 27 medidas analisadas por grupo
experimental. Aps a realizao da mdia da intensidade da escala do cinza de cada
grupo, no perodo de 15 dias aps a imobilizao articular foram apresentados nos
resultados, valores menores nos grupos imobilizados e irradiados (IIA e IIB) quando
comparados com os valores do grupo imobilizado e no irradiado (I), enquanto que o
grupo controle (C) apresentou valores da escala do cinza tambm menores
demonstrando existir uma concentrao maior de GAGs (Grfico 4.8). No perodo de 19
dias aps a retirada da imobilizao articular, entre todos os grupos foram apresentados
valores semelhantes que sugerem concentrao similares de GAGs da MO da
cartilagem articular entre todos os grupos (Grfico 4.9).

intensidade (u.a)

Aps 15 dias de imobilizao

140

50
I

IIA

IIB

grupos

Grfico 4.8: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza. Os valores so
inversamente proporcionais s concentraes de GAGs, as menores intensidades
representam maiores concentraes de GAGs na MO. I: grupo imobilizado e no
irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo imobilizado e irradiado
com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado e irradiado com
densidade de energia em 720 J/cm2 .

intensidade (u.a.)

Recuperao: aps 19 dias da retirada da imobilizao

140

50
I

IIA

IIB

grupos
Grfico 4.9: Mdias das intensidades dos valores da escala do cinza. I: grupo
imobilizado e no irradiado; C: grupo no imobilizado e no irradiado; IIA: grupo
imobilizado e irradiado com densidade de energia em 80 J/cm2 ; IIB : grupo imobilizado
e irradiado com densidade de energia em 720 J/cm2 .

6. Concluses

6. Concluses
-

A espectroscopia Raman no infravermelho prximo detectou alteraes nas

cartilagens articulares;

Aps o perodo de imobilizao articular ocorreu uma reduo nas

concentraes das substncias GAGs na MO da cartilagem identificada pela
espectroscopia Raman no infravermelho prximo;

O tratamento com laser de baixa potncia promoveu a bioestimulao com o

aumento nas concentraes das substncias GAGs na MO da cartilagem no
perodo timo de 15 dias aps a imobilizao articular;

As diferentes densidades de energia (80 e 720 J/cm2 ) utilizadas promoveram

efeitos similares quanto as concentraes de GAGs na MO.

7. Referncias Bibliogrficas

7. Referncias Bibliogrficas

AKAI, M.; USUBA, M.; MAESHIMA, T.; SHIRASAKI, Y.; YASUOKA, S. Laser
Effect on bone and cartilage change induced by joint immobilization in experiment with
animal model. Laser Surg. Med.,v.21, p.480-484, 1997.

AKESON, W.H.; AMIEL, D.; ABEL, M.F.; GARFIN, S.R.; WOO, L.Y. Effects of
immobilization on joint. Clin. Orthop. Rel. Res., v. 219, p .28-37,1987.

AILIOAIE, C.; AILIOAIE, L.M.L. Benefical effects of laser therapy in early stages of
rheumatoid arthritis onset. Laser Therapy, v.11, p.79-87, 1999.

ALLAN, D. A. Structure and Physiology of Joints and Their Relationship to Repetitive

Strain Injuries. Clin. Orthop., v.351, p.32-38, 1998.
AMANO, A.; MIYAGI, K.; AZUMA, T.; ISHIHARA, Y.; KATSUBE, S. AOYAMA,
I.A.; SAITO, I. Histological studies on the rheumatoid synovial membrane irradiated
with a low energy laser. Laser Surg. Med.., v.15. p. 290-294, 1994.

APPELL, H.J. Skeletal muscle atrophy during immobilization. Int. J. Sports Med.,
v.7, p.01-15, 1986.

ASADA, K.; YUTANI, Y.; SHIMIZU, A. Diode laser therapy for rheumatoid arthritis:
a clinical evaluation of 102 joints treated witch low reactive-level laser therapy (LLLT).
Laser Therapy, v.1, p.147-151, 1989.

BASFORD, J.R.; SHEFFIELD, C.G.; MAIR, S.D.; ILSTRUP, D.M. Low-energy

helium neon laser treatment of thumb osteoarthritis. Arch. Phys. Med. Rehabil., v.68,
p.794-797, 1987.

BARBERIS, G.; GAMORON, S.; ACEVEDO, G.; CADILE, I.; JURI, H.;
CAMPANA, V.; CASTEL, A.; ONETTI, C.M.; PALMA, J.K. J. Clin. Laser Med.
Surg., v.14: p.175-180, 1996.

BAXTER, G.D. Therapeutic laser. Churchill Livingstone, 1997.

BENICHOU, C.; WIROTIUS, J.M.; Articular cartilage atrophy in lower limb

amputees. Arthrritis Rheum., v.25, p.80-82, 1980.

BLIDDAL, H.; HELESSEN, C.; DITLEVSEN, P.; ASSELBER,G.H.S.; LYAGER, L.

Soft laser therapy of rheumatoid arthritis. Scand. J. Rheum.,v.16, p.225-228, 1987.

BONASSAR, L.J.; FRANK, E.H.; MURRAY, J.C.; PAGUIO, C.G; MOORE, V.;
LARK, M.W.; SANDY, J.D.;WU, J.J.; EYRE, D.R.;GRODZINSKY, A.J. Change in
cartilage composition and physical properties due to stromelysin degradation. Arthritis
Rheum., v.38, n.32, p. 173-83, 1995.

BRAND, H.S.; KONING, M.H.M.T.; VAN KAPEN, G.P.J.; VAN DER KORST, J.K.
Age related changes in the turnover of proteoglycans from explants of bovine articular
cartilage. J. Rheum., v.18, n.4, p.599-605, 1991.

BRENNAN, J.F.; WANG, Y.; DASARI, R.R.; FELD, M.S. Near-infrared Raman
spectrometer system for human tissue studies. Appl. Spectroscopy, v.51, n.2, 201-208,
1997.
BROSSEAU, L.; WELCH, V.; WELLS, G.; TUGWELL, P. Low level laser therapy for
osteoarthritis and rheumatoid arthritis: a analysis. J. Rheum., v.27, n.8, p.1961-1969, 2000.

CALATRAVA, I.R; VALENZUELA, J.M.S; VILLAMANDOS, R.J.G.; REDONDO,

J.I.; VILLAMANDOS, J.C.G; JURADO, A. Histological and clinical responses of
articular cartilage to low-level laser therapy: experimental study. Laser Med. Sci.,
v.12, p.117-121, 1997.

CALL, J.P; GOSSELIN, M.P.; PZOLET, M. Laser Raman study of internally

perfused muscle fibers effect of Mg

2+

, ATP and Ca

2+

. Bioch. Bioph. Acta. v.758,

p.121-127, 1983.

CARDEN, A.; MORRIS, M.D. Application of vibration spectroscopy to the study of

mineralized tissues (review). J. Biomedic. Optics., v.5, n.3, p.259-268, 2000.
COHEN, N.P.; FOSTER, R.J.; MOW, V.C. Composition and dynamics of articular cartilage:
structure, function and maintaining healthy state. J Orhop. Sports Phys. Ther., v.28, n.4, p.202
215, 1998.

COLOV, H.; PALMGREN, N.; JENSEN, G.; KAAE, K.; WINDELIN, M. Convincing
clinical improvement of rheumatoid arthritis by soft laser therapy. Laser Surg. Med.,
v.7, p.77, 1987.

CURRIER, P.D.; NELSON, M.R. Dynamics of human biologic tissues. F. A Davis,

1992.

DANGELO, J.G.; FATTINI,C.A. Anatomia humana bsica. So Paulo: Atheneu,

1988.

DOUGLAS, C.R. Tratado de fisiologia aplicada fisioterapia, So Paulo: Robe,

2002.

DUNHAM, J.; SHACKELETON, D.R.; BILLINGHAM, M.E.;BITENSKY,L.;

CHAYEN, J.; MUIR, H. A reappraisal of structure of normal canine articular cartilage.
J. Anat., v.157, p.89-99, 1988.

EBERT, D.W.; ROBERTS, C.; FARRAR, S.K.; JOHNSTON, W.M.; LITSKY, A.S.;
BERTONE, A.L. Articular cartilage optical properties in the spectral range 300-850
nm. J Biom. Opt. ,v.3, p.316-322, 1998.

ELDER,

S.H.;

KIMURA,

J.H.;

SOSLOWSKY,

L.J.;

LAVAGNINO,

M.;

GOLDSTEIN, A.S. Effect of compressive loading on chondrocyte differentiation in

agarose cultures of chick limb-bud cells. J Orthopaedic Research, v.18, p.78 - 91,
2000.

EYRE, D.R. The collagens of articular cartilage. Sem. Arthritis Rheum., v.22, n.3,
supl.2, p.2-11, 1991.

FU, L.L.; MAFFULLI, N.; YIP, K.M.; CHAN, K.M. Articular cartilage lesions of the
knee following immobilization or destabilisation for 6 or 12 weeks in rabbits. Clin
Rheumatol., v.17, n.13, p.227 - 233, 1998.

GREVE, J.M.D.; PLAPER, P.G.; SEGUCHI, H.H.; PASTORE, E.H.; BATTISTELA,

L.R. Cinesioterapia na osteoartrose. Rev. Med. Reab., v.31, p.5-9, 1992.

GUERINO, M.R.; BARANAUSKAS, V.; GUERINO, A.C.; PARIZOTTO, N. Laser

treatment of experimentally induced chronic arthritis. Applied Surface Science, v.154155, p. 561-564, 2000

HAAPALA, J.; AROKOSKI, J.P.; RONKKO, S.; AGREN, U.; KOSMA, V.M.;
LOHMANDER, L.S.; TAMMI, M.; HELMINEN, H.J.; KIVIRANTA, I. Decline after
immobilization and recovery after remobilisation of synovial fluid IL1, TIMP, and
chondroitin sulphate levels in young beagle dogs. Ann Rheum Dis, v.60, n.1, p.55-60,
2001.

HANLON, E.R. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Phys. Med. Biol., v.45,
p.1-59, 2000.

HAYASHI, K.; NIECKARZ, J.A.; THABIT, G.; BOGDANSKE, J.J.; COOLEY, A.J.;
MARKEL, M.D. Effect of nonablative laser energy on the joint capsule: na in vivo
rabbit study using a holmium: YAG laser. Laser Surg. Med., v.20, p.164-171, 1997.

HENDRICH, C.; SIEBERT, W. Photodynamic therapy for rheumatoid arthritis? Laser

Surg. Med., v.21, p.359-364, 1997.

HERMAN, J.H.; KHOSLA, R.C. In vitro effects of Nd: yag Laser radiation on cartilage
metabolism. The J. Rheum., v.15, n.12, p.1818-1826, 1988.

HONMURA, A.; YANASE, M.; OBATA, J.; HARUKI, E. Therapeutic effect of GaAl-As diode laser irradiation on experimentally induced inflammation in rats. Laser
Surg. Med., v.12, p.441-449, 1992.

JORTIKKA, M.O; INKINEN, R.I.; TAMMI, M.I; PARKKINEN J.J; HAAPALA, J.;
KIVIRANTA, I.; HELMINEN, H.J.; LAMMI, M.J. Immobilisation causes longlasting
matrix changes both in the immobilised and contralateral joint cartilage. Ann. Rheum.
Dis. V.56, n.4, p.255-261, 1997.

JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO,J. Histlogia bsica, Rio de Janeiro:Guanabara

Koogan, 1995.

KANNUS, P. Immobilization or early mobilization after an acute soft-tissue injury.

The Physician and Sportsmedicine . v. 28, n.3, p.55 63, 2000.

KARU, T. Photobiological fundamental of low-power laser therapy. J.Quantum

Eletro., v.23, n.10, 1987.

KARU, T.I.

Molecular mechanism of the therapeutic effect of low-level laser

irradiation. Lasers Life Science. v. 2, p.53-74, 1988.

KARU, T. Primary and secondary mecanisms of action visible to near-IR radiation on

cells. J. Photoch. Photob. B. Biology, v.49, p.1-17, 1999.

KARU, T. The science of low-power laser therapy. Australia: Gordon and Breach
Science Publishers, 1998.

KING, P.R. Low level laser therapy A review. Lasers in Medical Science, v.4,
p.141-150, 1989.

KITCHEN, S.S; PARTRIDGE, C.J. A review of low level laser therapy: part I.
Physiotherapy, v.77, p.161-168, 1991.

KIVIRANTA, I.; JURVELIN, J.; TAMMI, M.; SAAMANEN, A.M.; HELMINEN,

H.J. Weight bearing controls glycosaminoglycan concentration and articular cartilage
thickness in knee joint of young beagles dogs. Arthritis Rheum., v.30, n.7, p.801-809,
1987.

KONTOYANNIS, C.G.; VAGENAS, N.V. FT-Raman spectroscopy: A tool for

monitoring the demineralization of bones. Applied Spectroscopy, v.54, n.11, p.16051609, 2000.

KUETTNER, K.E.; AYDELOTTE, M.B.; THONAR, E.J.M.A. Articular matrix and

struture: a minireview. J. Rheum., v.38, n.2, p.173-83, 1995.

LAAKSO, L.; RICHARDSON, C.; CRAMOND, T.; Quality of light is laser

necessary for effective photobiostimulation? Australian Physioterapy, n.39, p.87-92,
1993.

LABAJOS, M.T.; GUSMAN, M.A.; LABAJOS, M.; MARTNEZ, M. Efectos de la

irradiacin lser de He-Ne sobre el cartlago de crecimiento. Rehabilitacin. v.24,
p.211-214, 1990.

LIMA, C.J.; SATHAIAH, S.; SILVEIRA Jr, L.; ZANGARO, R.; PACHECO, M.T.T.
Development of catheters with low fiber background signals for Raman spectroscopic
diagnosis applications. Artif. Organs , v.24, p.231-234, 2000.

LONAUER, G. Controlled double blind study on the efficacy of He-Ne laser beam x
He-Ne + infrared laser beams in the therapy of activated OA of finger joint. Laser
Surg. Med., v.6,p172, 1986.

LOPES, C.B. Cicatrizao ssea periimplantar aps laser em 830 nm

Microscopia eletrnica de varredura e Espectroscopia Raman no infravermelho
prximo. So Jos dos Campos, 2002. Dissertao (Mestrado em Engenharia
Biomdica) Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do
Paraba.

LUBART, R.; WOLLMAN, Y.; FRIENDMAN, H; ROCHKIND, S.; LAULICHT, I.

Effects of visible and near-infrared lasers on cell cultures. J. Photoch. Photobiol. B.,
v.12,n.3,p.305-310,1992.

MANZANARES, M.T.L; VEGA, J.M.P.; PORTERO, F.S.; FERNANDEZ, L.D.L.P.;

CLAROS, M.L.; MORILLO, M.M. Morfometra del cartlago de crecimiento de ratas
wistar irradiadas com laser de baja potencia (He-Ne). Rehabilitacin, v.26, p.68-73,
1992.

MIRON, B.G.; TEODORO, W.R.; VELOSA, A.P.; WITZEL, S.S.; YOSHINARI, N.H.
Anlise morfolgica da cartilagem articular de coelhos submetidos a meniscectomia
parcial. Rev. Bras. Reum., v.39, p.119-122, 1999.

MOSEKILDE, L.I.; THOMSEN, J.S.; MACKEY, M.S.; PHIPPS, R.J. Treatment with
risedronate or alendronate prevents hind-limb immobilization-induced loss of bone
density and strength in adult female rats. Bone , v. 27, n.5, p.639-645, 2000.

NISCHIDA, J. Histological evaluation of the effect of helium-neon laser irradiation on

the synovial membrane in rheumatoide arthritis Jap. Rheum. Ass., v.28, n.2, p.109119, 1988.

NICOLAU, R.A. Efeito do laser de baixa potncia (As-Ga-Al) em tecido sseo de

rato submetido leso, analisado por histomorfometria ssea. So Jos dos
Campos, 2001. Dissertao (Mestrado em Engenharia Biomdica) Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraba.

NORDIN, M.; FRANKEL, V.H. Basic Biomechanics of the musculoskeletal system.

Philadelphia: Lea and Febiger, 1989.

NORKIN, C; LEVANGIE P. Articulaes estrutura e funo. So Paulo: Revinter,

2001.

ODRISCOLL, S.W.; KEELEY, F.W.; SALTER, R.B. The chondrogenic potential of

free autogenous peristeal grafts for biological resurfacing of major full thickness
defects in joints surfaces under the influence of continuous passive motion: an
experimental investigation in the rabbit. J Bone Joint. Surg. v.68, p.1017 1035,
1986.

OHSHIRO, T; CALDERHEAD, R.G. Low-level laser therapy: A practical

application. Chichester: John Wiley & Sons, 1991.

OLIVEIRA FILHO, J. Automatizao do processo de anlise e classificao de

espectros Raman para o diagnstico de leses dentrias. So Jos dos Campos,
2003. Dissertao (Mestrado em Engenharia Biomdica) Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraba.

ORTIZ, M.C.S.; CARRINHO, P.M.; SANTOS, A.A.S.; PARIZOTTO, N.A. Laser de

baixa intensidade: princpios e generalidades parte 1. Fisiot. Bras., v.2, p.221-240,
2001.

OTERO, E.P.U. Raman spectroscopy for diagnosis of calcification in human heart

valves. So Jos dos Campos, 2002. 76p. Dissertao (Mestrado em Engenharia

Biomdica) Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do

Paraba.

PALMGREN, N.; JENSEN, G.F.; KAAE, K.; WINDELIN, M.; COLOV, H. Low
power laser therapy in rheumatoid arthritis. Lasers in Medical Science, v.4, p.193-196,
1989.

PALMOSKI, M.J.; COLYER, R.A.; BRANDT, K.A. Joint motion in the absence of
normal loading does not maintain normal articular cartilage. Arthritis Rheum., v.23,
p.325-334, 1980.

PILOTO, S.; PACHECO, M.T.T.; SILVEIRA Jr, L.; BALBIN, A; ZANGARO, R.

Analysis of near-infrared Raman spectroscopy as a new technique for a transcutaneous
non-invasive diagnosis of blood components. Lasers Med. Sci., v.16, p.2-9, 2001.

RADIN, E.L.; KELMAN, J.L.; PAUL, I.L.; ROSE, R.M. Effect of prolonged walking
on concrete on the knees of sheep. J Biomech., v.15, p.487-492, 1982.

RAMOS, A.M.O.; SOARES, M.L.M.; ROCHA, F.A.C.; JERONIMO, S.M.B.;

PATRICIO, F.R.S. Artrite induzida por zymosan em ratos: estudo histopatolgico,
histoqumico e bioqumico dos glicoconjugados da cartilagem articular. Rev. Bras.
Reum., v.41, p. 205-212, 2001.

RAUNEST, J.; SCHWARZMAIER, H.J. Optical properties of human articular tissue as

implication for a selective laser application in arthroscopic surgery. Laser Surg. Med.,
v.16, p.253-261, 1995.

RAVA, R.P.; BARAGA, J.J.; FELD, M.S.; Near-infrared Fourier-transform Raman

spectroscopy of human artery. Spectrochem. Acta A., v.47, p.509-512, 1991.

RIGAU, J. Accin de la luz lser a baja intensidad en la modulacin de la funcin

celular. 1996. 211p. Tese (Doutorado). Universitat Rovira i Virgili.

RIVERO, M.G.C.; TEODORO, W.R.; VELOSA, A.P.; WITZEL, S.S.; YOSHINARI,

N.H. Caracterizao bioqumica do colgeno do tipo VI na osteoartrose exprimental.
Rev. Bras. Reum., v.40, p.65-70, 2000

ROOIJ, P.P.; SIEBRECHT, M.A.N.; TAGIL, M.; ASPENBERG, P. The fate of

mechanically induced cartilage in an unload environment. J Biomech., v.34, p.961-966,
2001.

ROTH, V.; MOW, V.C. The intrinsic tensile behavior of the matrix of bovine articular
cartilage and its variation with age. J Bone Joint Surg., v.62, n.7, p.1102-17, 1980.

SALA, O. Fundamentos da espectroscopia Raman e no infravermelho. So Paulo:

Unesp, 1995.
SATHAIAH, S. Diagnosis of human coronary with near infrared Raman spectroscopy.
IN: ICORS, v.15, p.1120-1121,1996.

SCHULTZ, R.; KRISHNAMURTHY, S.; THELMO, W.; RODRIGUEZ, J.;

HARVEY, G. Effects of varing intensities of laser energy on articular cartilage. . Laser
Surg. Med., v.5,p.577-588, 1985.

SCHWARTZ, M.H.; LEO, P.H.; LEWIS, J.L.; A microstructural model for the elastic
response of articular cartilage. J. Biomechanics, v.27, n.7, p.865-873, 1994.

SETTON, L. A. Altered mechanics of tibial cartilege following joint immobilization in

canine model. Osteo. Cartil., v.5, p.1-16, 1997.

SHIN, S.W. Determination of degree of cure of dental resins using Raman and FTRaman spectroscopy. Dental Materials, v.9, p.317-324, 1993.
SILVEIRA JUNIOR, L. Correlao entre a tcnica de espectroscopia Raman e a anlise
histolgica das placas ateromatosas em artrias coronrias humanas , So Paulo, 2001 Tese
(Doutorado) Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo.

SILVEIRA, L.; SATHAIAH, S.; CHAVANTES, M.C.; ZANGARO, R.A.; PACHECO, M.T.T.;
PASQUALUCCI, C.A.G. Correlation between near-infrared Raman spectroscopy and
histological analysis of atheromatous plaque in human coronary arteries. Laser Surg. Med.,
v.30, n.4, p.290-297, 2002.

SMITH, R.L.; TRINDADE, M.C.D.; IKENOUE, T.; MOHTAI, M.; CARTER, D.R.;
GOODMAN, S.B.; SCHURMAN, D.J. Effects of shear stress on articular chondrocyte
metabolism. Biorheology v. 37, p.95 107, 2000 .

SPENCE, A.P. Anatomia bsica humana, So Paulo: Manole, 1991.

SUCH, J.K.; BAEK, G.H.; AROEN, A.; MALIN, C.M.; NIYIBIZI, C.; EVANS, C.H.;
WATERHAUSEN-LARSON, A. Intermittent sub-ambient interstitial hydrostatic
pressure as a potential mechanical stimulator for chondrocyte

metabolism.

Osteoarthritis and Cartilage, v.7, p.71-80, 1999.

TAGIL, M; ASPENBERG, P. Cartilage induction by controlled mechanical stimulation

in vivo. Journal of Orthopaedic Research, v.17, p. 200 204, 1999.

THOMAS, J.T.; AYAD, S.; GRANT, M.E. Cartilage collagens strategies for the study
of their organization and expression in the extracellular matrix . Ann. Rheum. Dis.,
v.53, p.488-496, 1994.

TIMLIN, J.A.; CARDEN, A.; MORRIS, M.D. Chemical microstructure of cortical

bone probe by Raman transects. Applied Spectroscopy, v.53, n.11, p.1429-1435, 1999.

TORRICELLI, P.; GIAVARESI, G.; FINI, M.; GUZZARDELLA, G.A.; MORRONE,

G.; CAPRI, A.; GIARDINO, R. Laser biostimulation of cartilage: in vitro evaluation.
Biomed. Pharmac., v.55, p.117-120, 2001.

TRAUNER, K.; EDWARDS, R.G.; BAMBERG, M.; NISHIOKA, N.S.; FLOTTE, T,

AUTRY, S.; HASAN, T. Influence of litht delivery on photodynamic Synovectomy im

an antigen-induced arthritis model for rheumatoid arthritis. Laser Surg. Med., v.22,
p.147-156, 1998.

USUBA, M.; AKAI, M.; SHIRASAKI, Y. Effect of low-level laser therapy (LLLT) on
viscoelasticity of the contracted knee joint: comparison with whirlpool treatment in
rats. Laser Surg. Med., v.22, p.81-85, 1998.

VOLPI, M.; KATZ, E.P. On the adaptive structures of collagen fibrils of bone and
cartilage. J. biomech., v.24, suppl.1, p.67-77, 1991.

WALKER, J.B.; AKHANJEE, L.K.; COONEY, M.M., Laser therapy for pain of
rheumatoid arthritis. The Clin. J. Pain, v.3, p.54-59, 1987.

WANG, Y.N.; GALIOTIS, C.; BADER, D.L. Determination of molecular changes in

soft tissues strain using laser Raman microscopy. J Biomech., v.33, n.4, p.483-486,
2000.

WILSON, C.J., DAHNERS, L.E. An examination of the mechanism of ligament

contracture . Clin Orthop., v.227, p.286-291,1988.

WOLLMAN, S.T.; BOHN, P.W. Evaluation of polynomial fitting functions use with
CCD arrays in Raman spectroscopy. Applied Spectroscopy, v.47, n.1, p. 125-126,
1993.

YOUN, J.; TELENKOV, A.S.; KIN, E.; BHAVARAJU, N.C.; WONG, B.J.F.;
VALVANO, J.W.; MILNER, T.E. Optical and Thermal Properties of Nasal Septal
Cartilage. Laser Surg. Med., v.27, p.119-128, 2000.

ZAIA, J.; LIU, B.; BOYNTON, R.; BARRY, F. Structural Analysis of Cartilage
Proteoglycans and Glycoproteins Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Time-of-Flight Mass Spectrometry Analytical Biochemistry, v.277, p.94103, 2000.