Bioqumica Geral

SEPARAO DE COMPOSTOS BIOLGICOS POR CROMATOGRAFIA

1 sesso

I.

Cromatografia de filtrao em gel

I.1. Introduo
O mtodo de filtrao em gel, baseado no efeito de peneira molecular, um mtodo usado para a
separao de substncias de acordo com o tamanho e forma moleculares. Estas peneiras moleculares so
redes porosas tridimensionais, constitudas por cadeias lineares de polmeros que se entrecruzam e formam
a matriz do gel. Os gis mais usados so os obtidos pela polimerizao de cadeias de polissacridos
(Sephadex) ou os constitudos pela polimerizao de cadeias de poliacrilamida (Biogel). Quando estas
peneiras moleculares se colocam em gua, incham e formam o gel. As partculas que formam o gel tm
poros e o tamanho dos poros funo do grau de entrecruzamento das cadeias de polmeros. A
possibilidade de variar o tamanho do poro torna este mtodo til para a separao de diferentes substncias
e a sua utilizao na determinao das massas moleculares das mesmas.
A facilidade de uma molcula de soluto penetrar na rede do gel funo do seu tamanho e forma molecular.
Quando as molculas so demasiado grandes para penetrar na matriz do gel, elas passam somente no
volume de lquido fora do leito (Vo). Quando as molculas so suficientemente pequenas elas podem
penetrar em quase todo o volume interior do leito (Vi).
Se o volume das partculas de gel for (Vg), ento o volume total (Vt) do leito ser:
Vt = Vo + Vi + Vg
Se for colocada uma mistura de macromolculas na parte superior de uma coluna cheia de gel, e se se deitar
tampo para provocar a sua eluio, as molculas comearo a sair da coluna com o tampo em fraces
diferentes e por ordem decrescente do seu tamanho molecular. A filtrao em gel pois uma tcnica muito
usada na separao de misturas de macromolculas de massas moleculares diferentes e especialmente
utilizada no isolamento e purificao de protenas.

TABELA 1. ALGUNS TIPOS DE SEPHADEX E RESPECTIVOS LIMITES DE EXCLUSO
MOLECULAR

Tipo de Sephadex

Massa Molecular (kDa)

Limite Inferior

Limite Superior

G-10

0,7

G-15

1,5

G-25

5,0

G-50

1,5

30,0

G-75

3,0

70,0

G-100

4,0

150,0

G-150

5,0

400,0

G-200

5,0

800,0

Comercialmente encontram-se preparaes de gis com vrios tamanhos de poro permitindo separar
macromolculas de diferentes massas moleculares. Na tabela 1 so apresentados vrios tipos de Sephadex
utilizados na separao de protenas. Por exemplo, o Sephadex G-25 tem poros relativamente pequenos e

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exclui molculas de massas moleculares (MM) superiores a 5000 Da. um gel til na separao de molculas
de MM compreendidas entre 1000 e 5000 Da. O Sephadex G-200 s exclui molculas com MM superiores a
800000 Da e utilizado na separao de massas moleculares entre 5000 e 800000 Da. Entre estes dois
tamanhos existe uma grande gama intermdia de poros que permite a separao mais fina dentro de gamas
de MM mais estreitas.
Numa separao as macromolculas so eludas em fraces diferentes e por ordem decrescente da sua
MM podendo estabelecer-se relaes empricas entre o volume de solvente necessrio para a sua eluio
(Ve) e a respectiva MM. Esta relao emprica e varia para as diferentes classes de macromolculas
(polissacridos, protenas globulares, etc.). Para as protenas globulares verificou-se que essa relao
traduzida por:
Ve = A log10(MM) + B
em que A e B so constantes, tendo A um valor negativo. Esta relao s vlida num domnio restrito de
MM. Assim Ve ter um valor mnimo igual ao Vo quando a protena tem uma MM superior ao limite mximo
de excluso do gel. Para protenas com MM dentro dos limites de excluso do gel, o volume Ve aumentar
com a diminuio da massa molecular. Protenas com MM inferior ao limite mnimo de excluso do gel so
eludas com o volume Ve=Vo+Vi. As constantes A e B so determinadas por calibrao da coluna com pelo
menos duas protenas globulares de massa molecular conhecida.










I.2. Cromatografia de filtrao em gel e sua utilizao no tratamento qumico de protenas
A cromatografia de filtrao em gel tambm frequentemente utilizada no tratamento de protenas com
determinados reagentes (de MM muito inferior ao das macromolculas). Assim, podemos carregar uma
zona da coluna com um determinado reagente de modo que, a protena ao mover-se e ao atravessar essa
zona v contactando sucessivamente com camadas de reagente novo tornando o processo de reaco mais
eficiente. A separao entre a protena e o excesso de reagente pode ser feita por eluio contnua.

I.3.

Objectivo do trabalho

Neste trabalho vamos utilizar a tcnica de filtrao em gel com dois objectivos distintos:
i)

Utilizao do gel como suporte para uma reaco qumica entre uma protena e reagentes qumicos,
conseguindo-se detectar as diferentes formas da hemoglobina.

ii) Separao entre a protena e os reagentes.

Nesta experincia a oxihemoglobina (vermelho vivo) tratada com ferricianeto de potssio (Fe(CN)63-) e
transforma-se em metahemoglobina (castanha). Esta mistura aplicada na coluna cromatogrfica para
separao. A metahemoglobina posteriormente tratada na coluna com ditionito de sdio (Na2S2O4)

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resultando na converso em desoxihemoglobina (prpura) que oxigenada medida que percorre o gel,
contactando com o oxignio molecular que a se encontra, dando origem a oxihemoglobina (vermelho vivo).

AS DIFERENTES FORMAS DE HEMOGLOBINA
A funo da hemoglobina (MM = 64500 Da) a de transportar oxignio dos pulmes para os tecidos e
dixido de carbono e H+ dos tecidos para os pulmes. A hemoglobina contm um grupo prosttico hemo. O
hemo contm um io ferroso que est quelado no centro de um anel de porfirina. Os ies Fe2+ so mais
estveis quando satisfeito um nmero de coordenao 6. Quatro das posies de coordenao so
preenchidas pelos tomos de azoto do anel de porfirina, outra posio pela base de histidina (His) da cadeia
polipeptdica da protena e, na oxihemoglobina, a sexta posio preenchida por oxignio molecular.

Grupos
propionato

Anel pirrlico

Grupos metilo

Grupos vinilo

Desoxihemoglobina

Oxihemoglobina

Nesta experincia vo ser observadas trs formas de hemoglobina:
Metahemoglobina - nesta forma o io Fe2+ no centro do anel de porfirina oxidado forma frrica
com ferricianeto. Esta forma no liga O2 e rapidamente reconhecida pela sua cor castanha;
Desoxihemoglobina - esta forma tem cor prpura (roxo);
Oxihemoglobina - hemoglobina oxigenada. Esta forma apresenta uma colorao vermelho viva.
As trs formas podem ser interconvertidas de acordo com o esquema seguinte:
Reduo Na2S2O4

Oxigenao

Metahemoglobina desoxihemoglobina Oxihemoglobina

Oxidao Fe(CN)63-

I.4. Procedimento experimental
Reagentes
Sephadex G-50 equilibrada em 50 mM tampo fosfato pH=7, 0
50 mM Tampo fosfato pH = 7,0 (19,5 mL NaH2PO4 1 M, 30,5 mL Na2HPO4 1M, para 1 L)
Ditionito de sdio: Soluo 10 mg/mL preparada no tampo fosfato
Ferricianeto de potssio (MM 329 g/mol)
Soluo de hemoglobina

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Preparao da coluna
Com a torneira fechada, transfira um pouco de tampo para a coluna e verifique que esta no se encontra
entupida. Transfira para a coluna com a ajuda de uma vareta a suspenso de gel devidamente diluda com
tampo. Abra lentamente a torneira e observe o empacotamento do gel. V adicionando mais gel, sem
deixar formar interface, at que a zona j empacotada atinja uma altura de aproximadamente 20 cm. Feche
a torneira. Depois de devidamente cheia a coluna deve ser lavada com tampo. Utilizando uma pipeta de
Pasteur, deite o tampo cuidadosamente no topo da coluna e abra a torneira para deixar escorrer o excesso
de tampo atravs do gel at que o nvel esteja mesmo acima da superfcie do leito. Feche a torneira.
muito importante no deixar secar a coluna durante todo este processo. Pipete cuidadosamente
aproximadamente 0,2 mL da soluo de ditionito de sdio para a superfcie do gel. Abra a torneira para
deixar o ditionito entrar na coluna at que o menisco atinja a superfcie do gel. Feche a torneira. Logo a
seguir pipete cuidadosamente 0,2 mL de tampo para a superfcie da coluna. Abra a torneira para deixar o
tampo entrar na coluna at que o menisco atinja a superfcie do gel. Feche a torneira.

Tampo
Ditionito de sdio

Gel

Preparao e eluio da soluo de metahemoglobina
Adicionar 50 mg de ferricianeto de potssio slido soluo de hemoglobina. Agitar bem. Pipete
cuidadosamente 0,5 ml de soluo de metahemoglobina para a superfcie da coluna. Abra a torneira e
depois da amostra penetrar no gel, inicie a eluio adicionando tampo pelo topo da coluna (a soluo
eluente contem sais, para diminuir qualquer adsoro de protena ou reagentes ao gel). Comece a recolher o
eludo num copo limpo. Deixe a amostra percorrer as partculas do gel e anote as mudanas de cor
observadas. Repare ainda na banda amarela do ferricianeto de potssio que se atrasa e separa da banda da
hemoglobina. Para determinar os volumes de eluio da hemoglobina e do ferricianeto a recolha do eludo
feita em dois copos; desde o incio at sada de metade da banda vermelha num copo e desde a at
sada de metade da banda amarela noutro copo. Mea os volumes recolhidos com uma proveta.
Lave a coluna com tampo at esta ficar de novo branca para recuperao do gel.

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2 sesso

II.

Cromatografia de permuta inica

II.1. Introduo
As protenas podem ser separadas por adsoro diferencial em materiais de permuta inica. Alguns destes
materiais so convenientemente preparados introduzindo grupos inicos na celulose. A
dietilaminoetilcelulose (DEAE-C) um destes materiais e contm grupos OCH2CH2N(C2H5)2 em vez de
alguns grupos OH da celulose original. Estes grupos adquirem uma carga positiva quando o tomo de azoto
se combina com um proto para se tornar NH+R2. A DEAE-C uma resina aninica pois as suas cargas
positivas atraem anies.
A soluo de protenas a separar aplicada numa coluna de DEAE-C e as diferentes protenas so eludas
passando atravs da coluna solues tampo com composies diferentes. Baixando o pH elui-se mais
protena pois vai-se diminuindo o nmero total de cargas negativas da molcula de protena diminuindo a
sua interaco com a DEAE-C carregada positivamente. Por outro lado, o aumento da concentrao de sal no
tampo facilita a eluio de mais protena pois h mais anies no meio para competir com a protena para as
cargas positivas da DEAE-C.
Neste trabalho vamos separar duas protenas a catalase (protena verde) e o citocromo c (protena
vermelha). A primeira uma enzima que catalisa a reaco:

H2O2 H2O + O2
O citocromo c medeia a transferncia de electres entre os complexos III e IV da cadeia respiratria:

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II.2. Procedimento experimental

Reagentes
Mistura de citocromo c e catalase em gua
Resina aninica DEAE-C equilbrada com tampo A
Tampo A: tampo 20 mM acetato de sdio, 5 mM cido actico
Tampo B: tampo 20 mM acetato de sdio, 5 mM cido actico, 1 M NaCl
Ferricianeto de potssio
Ditionito de sdio
Perxido de hidrognio (10 vol.)


Preparao da coluna de permuta inica
A forma de preparao da coluna semelhante anterior, sendo utilizado neste caso o tampo A. Transfira
a resina DEAE-C para a coluna com a ajuda de uma vareta, de modo a ficar com uma altura de
aproximadamente 10 cm. Esta resina foi previamente equilibrada no tampo A. Verifique se a superfcie da
coluna est plana. Lave a coluna com tampo A, tendo o cuidado para no perturbar a superfcie.
importante que a coluna no seque.

Separao da mistura de protenas
Deixe entrar todo o tampo A na coluna antes de introduzir cuidadosamente 3 mL da soluo de protena.
Observe a concentrao de material corado no topo da coluna. Depois de deixar entrar a soluo de
protena na coluna, continue a adicionar o tampo inicial (tampo A) at eluir completamente a primeira
protena. Note que a banda avermelhada no se adsorve superfcie comeando a descer imediatamente na
coluna. Recolha o eluido em tubos de ensaio desde o incio at ao fim da eluio das duas protenas (recolha
um volume de cerca de 3 mL por tubo). Completada a eluio da banda vermelha, mude para o tampo B,
para eluir a 2 protena. Repare que a banda esverdeada desce na coluna, continue a recolha do eluido em
tubos de ensaio at ela sair.

Identificao das protenas coradas
1. Verifique quais as fraces mais concentradas
em protena, medindo a absorvncia das
fraces recolhidas a 280 nm. Represente
graficamente a absorvncia a 280 nm em
funo do nmero de fraco.
2. Com as fraces mais concentradas e com o
objectivo de identificar as protenas divida cada
fraco em duas partes. A uma das partes
adicione H2O2 (a 10 volumes) e verifique se h
libertao de bolhas. outra adicione ditionito
(Na2S2O4) para reduzir a protena e trace o
espectro de visvel entre 350 e 700 nm.
Compare os espectros com os da figura em que
se apresentam os espectros de visvel do
citocromo c e da catalase na forma oxidada (a)
e na forma reduzida (b).

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Preparao da aula prtica

Cromatografia de filtrao em gel
1.

Qual a base do mtodo de separao por cromatografia de filtrao em gel?

2.

Quais so os componentes separados na coluna de Sephadex neste trabalho?

3.

Ser possvel determinar a massa molecular da hemoglobina por cromatografia de filtrao em gel
utilizando Sephadex G-25? Em caso negativo diga qual o tipo de Sephadex que escolheria.

Cromatografia de permuta inica

1.

Calcule o pH e a fora inica (I = Ci(Zi)2) dos dois tampes utilizados sabendo que o pKa do cido
actico igual a 4,7.

2.

Qual a base do mtodo de separao por cromatografia de permuta inica?

3.

Sabendo que apenas a banda verde adsorve resina DEAE-C ao pH do tampo A o que pode concluir
acerca do pI do citocromo c de cavalo? E acerca do pI da catalase?

4.

A banda verde eluda por aumento de fora inica do tampo de eluio (fora inica do tampo B >
fora inica do tampo A). Sugira um mtodo alternativo para a eluio desta protena mantendo
constante a fora inica. Explique como procederia.

Anlise dos resultados

Separao de compostos biolgicos por cromatografia de filtrao em gel

1.

Explique a sucesso de cores observada na coluna de Sephadex.

2.

Usando os volumes de eludo recolhidos (volume recolhido at sada de metade da banda vermelha e o
volume recolhido no segundo copo) diga qual a relao entre os volumes de eluio da hemoglobina
(MM = 64500 Da) e do ferricianeto (MM = 329 g/mol) e os volumes Vo e Vi, tendo em considerao os
limites de excluso molecular do gel utilizado na aula. Justifique.

3.

Determine Vo e Vi para a coluna que utilizou na aula.

Separao de compostos biolgicos por cromatografia de permuta inica

1.

Com base na representao grfica da absorvncia medida a 280 nm em funo do nmero das
fraces recolhidas, comente a eficincia da separao.