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Desenvolvimento de formulaes
tpicas contendo papana para o
tratamento de feridas
Ribeiro Preto
2007
UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO
Ribeiro Preto
2007
Ribeiro Preto
2007
Assinatura:________________________
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Muitas pessoas estaro nestas pginas. Com toda certeza, tm os seus
crebros e coraes iluminados com alegria, pois todas contriburam para este
trabalho, cada uma sua maneira. No sei se saberei expressar toda a minha
gratido, e talvez tenha esquecido de citar algum, mas tenham certeza de que cada
um de vocs tem um lugar no meu corao e serei eternamente grata.
Deus, pela famlia maravilhosa que me deu, por ter colocado o Felipe na
minha vida, por permitir que sempre estivesse rodeada de boas pessoas, por ter me
guiado, permitindo que eu chegasse at aqui.
Aos meus guias espirituais e aos amigos do Centro Esprita Anjos da Guarda
(Santa Teresa-ES), pela assistncia, intuio, auxlio, oraes, que fortaleceram
minha alma, indicando os caminhos a seguir.
Ao meu pai, Jorge, que desde cedo me ensinou que o conhecimento a
nica coisa que nunca nos ser tirado. Obrigada por ser esse exemplo de vida, pelo
pai presente e maravilhoso que voc , pela dedicao que tem por ns, seus filhos.
No sei o que seria de mim sem voc.
Ao Felipe, meu noivo, com quem divido todos os momentos, pelo amor,
carinho, amizade, companheirismo, compreenso. Ao seu lado, nenhum obstculo
foi to grande que no pudesse ser transposto, nenhum momento foi to difcil que
no pudesse ser superado. Vivendo juntos, aprendemos que juntos queremos viver.
Obrigada por tudo, amor!
Liana, Mariana e Rodrigo, irmos que amo tanto, que sempre
compreenderam a minha ausncia, me apoiaram e, com seu amor, transmitiram
fora e um carinho sem igual, essenciais para a minha caminhada. Obrigada por
existirem!
minha me Luziana, que me educou e sempre me estimulou a estudar, meu
carinho e gratido eternos.
Tia Mad, presena constante nesses ltimos anos, que, mesmo a
quilmetros de distncia, me aconselhou, incentivou e me deu amor.
Aos meus primos Daniel, Ricardo, Lorena, Leonardo, Lohan, Vincius e
Nicole, turminha especial, que, com carinho, me auxiliaram a superar as saudades.
Aos meus avs Amlia, Maria e Jos, que, com suas oraes, fortaleceram
meu esprito e me ajudaram a superar as dificuldades. Amo vocs.
Dodora, minha sogra, e V Tina, pelas oraes e bons fluidos que enviam
sempre para ns.
Cidinha, que, com seu amor incondicional, me adotou como filha. No
tenho palavras para agradecer. No foi por acaso que nos encontramos nesta vida.
Liza, minha amiga-irm, que me deu fora nesta reta final, pela amizade,
pelas oraes e pelas boas risadas, que me ajudam a enfrentar os momentos mais
difceis.
Aos meus amigos da Turma MKT 12, pela fora e carinho. Vocs so
maravilhosos!
Sonia Cassiolato, que contribuiu muito para a minha formao profissional,
como farmacutica hospitalar que sou, e tambm pela grande amizade que
construmos. No sei como agradecer por tudo.
equipe da Farmcia UE, especialmente Carlos Alberto, Rosangela, Vera,
Malu e Miguel, que me ajudaram trocando plantes, apoiando e dizendo palavras
incentivadoras. Aos amigos que no esto mais l e que foram muito importantes
nesta etapa: Cristina, Douglas e Alessandro. Muito obrigada pela fora! Nunca
esquecerei vocs!
equipe do Centro Integrado da Qualidade, especialmente Fernanda e
Susana, que permitiram a adequao de horrios para que eu pudesse finalizar esse
trabalho.
Profa.
Dra.
Maria
Jos,
pela
orientao,
pelos
conhecimentos
compartilhados, e pela amizade. Essa etapa da minha vida foi fundamental para que
eu assumisse um novo papel na vida profissional. Isso s foi possvel pela
oportunidade que me deu, em conhecer a pesquisa cientfica e, mais que isso, pelo
exemplo de dedicao pesquisa que voc . Muito obrigada!
Profa. Dra. Vera, da Escola de Farmcia da UFOP, pela amizade, pela
ajuda e confiana, e porque fez despertar em mim o interesse pelo Controle de
Qualidade.
Profa. Maria Jos, da Escola de Farmcia da UFOP, pelo auxlio to
importante durante a minha formao na graduao e pela confiana que teve em
mim.
s Profa. Dra. Marilisa Guimares Lara e Profa. Dra. Carem Gledes Vargas
Rechia, que formaram a comisso julgadora da minha qualificao, pelas
orientaes, sugestes e discusses que foram muito importantes para a concluso
deste trabalho.
s companheiras de laboratrio Ana Luiza, Carlinha, Franciane, Rbia,
Viviane e Yris, que me apoiaram, pela convivncia sempre alto astral. Agradeo
especialmente Fabiana e Sandra, que contriburam muito para o meu trabalho
com seus conhecimentos, e tambm foram essenciais me apoiando, estimulando, e
proporcionando momentos de grande alegria, tornando-se amigas para a vida toda.
Ftima, pela colaborao constante na confeco deste trabalho e
discusses to enriquecedoras.
Aos tcnicos do laboratrio, Jos Roberto Jabor e Luiz Henrique Cenzi, pela
ajuda durante os experimentos e pela amizade.
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto da Universidade
de So Paulo e aos professores desta faculdade, pelos conhecimentos
compartilhados e pelos bons momentos.
Aos funcionrios da seo de ps-graduao, Ana, Carlos, Eleni e Rosana,
pelos auxlios e boa convivncia.
Zanini, Curtis Ltda e Special Pharma, pela doao de material para o
desenvolvimento do trabalho.
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SUMRIO
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................
LISTA DE QUADROS.............................................................................................
iii
LISTA DE TABELAS...............................................................................................
iv
vi
RESUMO................................................................................................................
vii
ABSTRACT.............................................................................................................
viii
1. INTRODUO................................................................................................... 1
PAPANA: UMA PROTENA DE USO FARMACUTICO....................................... 1
1.1. Caracterizao da papana..............................................................................
14
2. OBJETIVOS......................................................................................................
28
A. OBJETIVO GERAL............................................................................................. 28
B. OBJETIVOS ESPECFICOS..............................................................................
29
3. MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 30
3.1.
Material........................................................................................................
30
3.1.1. Reagentes.....................................................................................................
30
3.1.2. Equipamentos...............................................................................................
30
3.2.
Mtodos......................................................................................................
32
32
34
36
de
37
38
41
41
43
45
45
45
46
48
4. RESULTADOS...................................................................................................
49
51
54
58
65
66
74
6. CONCLUSES...................................................................................................
90
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................................
91
_______________________________________________________|t wx Y|zt________
LISTA DE FIGURAS
Figura 2 - (A) Papana: resduos do stio cataltico (Cis 25 e His 159); (B)
Configurao tridimensional da papana.........................................................
18
25
33
48
50
50
57
59
59
60
62
_______________________________________________________|t wx Y|zt________
65
69
Figura 16 - Medida da atividade proteoltica (U) da papana na matriaprima A e veiculada nas formulaes gis de Pluronic F127 e de
Carbopol 940 em funo do tempo, armazenados a 4C, 30C/70%UR e
40C/70%UR....................................................................................................
71
73
ii
______________________________________________________|t wx dtw________
LISTA DE QUADROS
43
48
iii
_______________________________________________________|t wx gtuxt________
LISTA DE TABELAS
iv
_______________________________________________________|t wx gtuxt________
64
cm (1 x 10-2 m)..............................
centmetros
mm (1 x 10-3 m).............................
milmetros
mililitros
molar
g (1 x 10-3 Kg)..
grama
micrograma
p/p.................................................. peso/peso
p/v..................................................
peso/volume
q.s.p. .............................................
HCl................................................
cido clordrico
TEMED..........................................
N, N, N, N, tetrametiletilenodiamina
Tris................................................. Tris(hidroximetil)amino-metanohidrocloreto
TCA................................................ cido Tricloractico
UV.................................................. Ultra - violeta
vi
______________________________________________________________ex______ vii
RESUMO
______________________________________________________________Tutv______ viii
ABSTRACT
___________________________________________________________\w______
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1.1. Caracterizao da papana
inevitavelmente,
rompem
os
veios
de
ltex,
liberando-o
(ROTH;
CLAUNSITZER, 1972).
O ltex do papaia um fluido tixotrpico, com uma aparncia leitosa, que
contm cerca de 15% de matria seca. Quarenta por cento dessa matria
constitudo por enzimas, principalmente cistenas endopeptidases, que, somadas,
correspondem a mais de 80% da frao total de enzimas (AZARKAN et al., 2003).
As endopeptidases do papaia constituem um perigo em potencial para a
planta. Entretanto, esto presentes nos veios do ltex como pr-formas inativas que,
___________________________________________________________\w______
extremas,
que
permitiram,
em
1970,
caracteriz-la
cintica
___________________________________________________________\w______
_______________
LIGHT, A.; FRATER, R.; KIMMEL, J.R.; SMITH, E.L.. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.. v. 52, p. 1276, 1964.
___________________________________________________________\w______
_______________
___________________________________________________________\w______
(A)
(B)
Figura 2 (A) Papana: resduos do stio cataltico (Cis 25 e His 159). (TURK,B.; TURK,V.;
TURK,D., 19973).
(B) Configurao tridimensional da papana, na qual est representada a
Cistena 25, do stio ativo da papana. (UNIVERSIT FRANOIS RABELAIS4)
_______________
3,5
TURK,B.; TURK,V.; TURK,D.. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their
protein inhibitors. Biol. Chem. v. 378, p. 141-150.1997.
4
UNIVERSIT FRANOIS RABELAIS, pesquisa realizada em 15/05/2006.
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/pap.jpeg
___________________________________________________________\w______
padro
para
ativao
da
papana
para
evitar
sua
inativao,
___________________________________________________________\w______
___________________________________________________________\w______
___________________________________________________________\w______
___________________________________________________________\w______ 10
ruptura dessas ligaes, fazendo com que os aminocidos se disponham em
cadeias lineares, evitando, assim, a formao de quelides, que um aglomerado
aleatrio de fibras que formam o tecido conjuntivo.
Flindt (1978) sugere que a papana aja apenas no tecido lesado, devido
ausncia de uma anti-protease plasmtica, a 1-anti-tripsina, que impede a ao
proteoltica da enzima em tecidos sadios.
Otuka, Pedrazzani e Pioto (1996) afirmaram que solues extemporneas de
papana so de grande auxlio no tratamento da lcera plantar, acelerando ou
evoluindo o processo de cicatrizao. Leses, contendo ou no tecido necrosado,
cicatrizam mais rapidamente utilizando a papana, como o caso de lceras
diabticas, de presso ou venosas (MEKKES, 1997; METRIONE, 1981; MONETTA,
1987, 1990, 1992; UDOD; STOROJUK, 1981, apud SANCHEZ NETO, 19916).
Rocha, Gurjo, Brito Junior (2005) e Sanchez Neto (1991), ressaltam que as feridas
tratadas com a enzima apresentam maior nmero de fibroblastos e que a matriz
colgena organizada, o que muito importante na fora de tenso e integridade
local da reparao.
No tratamento de queimaduras, tambm tem sido utilizado enzimas
proteolticas e, dentre elas, a papana, que demonstrou bons resultados na
cicatrizao deste tipo de ferimento, incluindo pacientes com as chamadas
queimaduras eltricas (FERREIRA, 2003; KLASEN, 2000; MASINI; CALAMO, 1986;
ZCAN, 2002; PIEPER; CALIRI, 2003). Com o uso de uma soluo contendo 0,2%
da enzima em reas feridas, Udod e Storojuk7 (1981 apud SANCHEZ NETO, 1991)
observaram que a papana abreviou o tempo de limpeza das feridas e das massas
necrticas, facilitando a liquefao e retirada de secreo purulenta em todos os
_______________
6,7
UDOD, V.M.; STOROJUK, V.T.. Use of papain in treating suppurative portoperative soft tissue complications
and diseases. Khirurgiia, Moskou. V. 5, p. 99-101. 1981.
___________________________________________________________\w______ 11
pacientes, ativando os processos de regenerao e encurtando o perodo de
cicatrizao. Alm disso, constataram uma reao inflamatria menos intensa, com
reduo do edema.
A papana demonstra ter diversas vantagens sobre os outros agentes tpicos
empregados: fcil aplicao, nica em cada dia de tratamento para a maioria dos
pacientes, o que facilita os cuidados da enfermagem; bem tolerada por crianas,
que so as maiores vtimas de queimaduras; alm da vantagem econmica, em
virtude do seu baixo custo (PIEPER; CALIRI, 2003; SERRA, 1995; STARLEY, 1999).
Entretanto, a maior vantagem desde o incio do uso tpico da papana em
queimaduras que, mesmo em queimaduras mais densas, o desbridamento
cirrgico raramente necessrio (STARLEY, 1999). A papana se enquadra no
conceito de desbridamento ideal de Rosemberg et al. (2004), pois um agente
tpico que propicia resultados rpidos, seguro e desbrida tecidos necrticos com
pouco ou nenhum dano ao tecido sadio.
A papana pode ser adquirida como uma preparao magistral, sendo utilizada
em p ou pasta. Na forma de p deve ser preparada imediatamente antes da
realizao do curativo em concentraes que variam de acordo com a caracterstica
da ferida (BLANES, 2004). Concentraes diferentes de papana, para cada fase de
uma leso tecidual, so importantes para a obteno de um resultado final
satisfatrio com a cicatrizao e reepitelizao da rea lesada (ROCHA; GURJO;
BRITO Junior, 2005). Alm disso, gel de papana a 3% utilizado para o prtratamento das feridas (desbridamento qumico), antes de serem administrados
alguns medicamentos (GODOY; PRADO, 2005).
Vrias so as formas farmacuticas utilizadas para o auxlio da cicatrizao de
leses da pele, como soluo contendo papana de 2% a 5% (KLASEN, 2000) e gel,
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de 1% a 4% (PIEPER; CALIRI, 2003). H hospitais que utilizam papana em forma
de p e gel, como o caso do Hospital Santa Marcelina, localizado na zona norte de
So Paulo, que utiliza o gel nas concentraes de 2%, 4%, 6% e 8% (HOSPITAL
SANTA MARCELINA, 2005), e do Hospital do Servidor Pblico Estadual, tambm de
So Paulo, que utiliza o p de papana para o desbridamento qumico, que
aplicado em necrose preta ou amarela por 15 minutos, lavando com soro e, em
seguida, aplicando o gel de papana. O gel utilizado o Carboximetilcelulose (CMC)
a 2%, 4%, 6% e 10%. Lobo8 afirma que utilizada a papana por sua ao
bactericida e bacteriosttica,
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famlias carentes (informao verbal)9,10,11. As formulaes, geralmente contendo de
1% a 4% de papana, so comercializadas, principalmente, para o tratamento e
preveno de escaras, mas tambm no auxlio da cicatrizao de feridas crnicas,
como as do p diabtico, infectadas ou no, alm de queimaduras de pequena
extenso (informao verbal)12,13.
Em algumas prefeituras da regio, so feitos curativos em pacientes das
unidades bsicas de sade com gel contendo papana. Os curativos so feitos nos
casos de escaras, ferimentos com a cicatrizao comprometida e em pacientes com
p diabtico. Ribeiro (2006) afirma que a cicatrizao dos ferimentos alcanada
com xito (informao verbal)14.
O Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da
Universidade de So Paulo (HCFMRP/USP) referncia na regio no tratamento de
queimaduras, possuindo uma unidade para o tratamento de pacientes queimados
localizada na Unidade de Emergncia (U.E.) desse hospital. O primeiro uso da
papana nessa unidade foi pela utilizao de mamo verde ralado, na dcada de 80.
Esse uso foi descontinuado pelas dificuldades de encontrar e preparar o mamo
verde, alm de no ser uma aplicao assptica, condio necessria para o
tratamento desse tipo de leso. A comercializao da papana em p permitiu,
ento, a substituio do mamo ralado, sendo aplicado diretamente nas
queimaduras. Utilizava-se a papana nos casos de necrose em queimaduras de 2
grau profundo e com presena de fibrina. Ferreira (2006) afirma que havia melhora
desses ferimentos. Hoje no usada a enzima na Unidade de Queimados do
_______________
___________________________________________________________\w______ 14
HCFMRP/USP, porm h o interesse no estudo de novas formulaes com
princpios ativos naturais e menos onerosos, pois os medicamentos utilizados esto
entrando em desuso e o hospital est encontrando dificuldades em substitu-los
(informao verbal)15, e, ainda, h a inteno de testar a papana e padroniz-la
nesse hospital para a preveno de escaras (informao verbal)16.
Apesar de ser proposto o uso da papana em diversas formulaes, h
poucos estudos que controlam as condies sob as quais esses produtos devem ser
utilizados (PIEPER; CALIRI, 2003).
transformao
ocorrida
na
produo
de
medicamentos
com
_______________
15
16
___________________________________________________________\w______ 15
fornecem indicaes sobre o comportamento do produto frente a condies
ambientais a que possa ser submetido, em determinado intervalo de tempo. As
informaes geradas so utilizadas na determinao do prazo de validade dos
frmacos e produtos, alm das recomendaes de armazenamento dos mesmos
(SINGH, 1999a).
Os parmetros de estabilidade de um medicamento podem ser influenciados
pelas condies ambientes de armazenamento (temperatura, luminosidade,
oxignio, e umidade), bem como pelos componentes da embalagem (DAGAR, 1990;
USP XXIX, 2006). A temperatura um dos principais fatores causadores da
instabilidade dos frmacos e produtos farmacuticos, pois pode fornecer energia
para acelerar as reaes qumicas de degradao.
As protenas so mais suscetveis instabilidade fsica e qumica, quando
comparada aos frmacos tradicionais, devido sua complexa estrutura molecular.
Todas as molculas proticas so formadas por cadeias heterogneas no
ramificadas de aminocidos, que se denominam estrutura primria. As cadeias
polipeptdicas sofrem um processo qumico de dobramento que envolve o arranjo
espacial de aminocidos (AAs) prximos entre si, na seqncia primria de AAs,
formando a estrutura secundria. A estrutura terciria formada pelo arranjamento
de aminocidos distantes entre si na cadeia polipetdica e a estrutura quaternria
pelo arranjamento espacial de mais de uma cadeia de AAs, as subunidades da
molcula.
A seqncia especfica de AAs na estrutura primria e o meio ambiente so o
que determinam o processo de dobramento. O nmero de possveis conformaes
de uma cadeia polipeptdica dobrada cerca de 1080 (JAENICKE, 1991). A
conformao tridimensional de uma protena um estado flutuante de um nmero
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limitado de conformaes preferenciais (TANG; DILL, 1998). A conformao mais
estvel de uma protena o seu estado nativo, que detm a sua atividade biolgica.
Muitas foras esto envolvidas no dobramento de protenas incluindo
interaes hidrofbicas, que so interaes repulsivas entre gua e resduos no
polares em protenas, levando a uma hidratao mnima na poro hidrofbica, e
interaes intermoleculares ou foras de Van der Waals (on-dipolo, dipolo-dipolo,
disperso e ligaes de hidrognio). A ligao de hidrognio a mais intensa de
todas as foras intermoleculares. Dentre as foras envolvidas no dobramento das
protenas, a aparentemente predominante a interao hidrofbica.
A protena na forma dobrada, adequada para exercer sua funo biolgica
(configurao funcional, estado nativo), no estvel por tempo indeterminado. As
protenas podem sofrer um processo de desnaturao, devido a alteraes qumicas
ou fsicas da estrutura molecular, proporcionando mudanas conformacionais, que
podem conduzir a uma perda da atividade biolgica.
Assim, um dos maiores problemas para a utilizao de protenas como
princpio ativo em produtos farmacuticos a sua instabilidade fsica e qumica.
A instabilidade fsica de protenas envolve mudanas na estrutura secundria,
terciria ou quaternria da molcula, por processos de desnaturao, agregao,
precipitao e adsoro em superfcie, que podem levar perda ou reduo da
atividade biolgica, reduo da solubilidade e alterao da imunogenicidade
(BURGESS, 1993).
A agregao o mais importante evento para a instabilidade fsica.
Evidncias recentes sugerem que a agregao pode ocorrer por interao especfica
de certas conformaes intermedirias de protenas, e no por agregao no
especfica. As protenas agregam-se para minimizar interaes no favorveis
___________________________________________________________\w______ 17
termodinamicamente, entre solventes e resduos hidrofbicos de protenas (WANG,
1999).
A interao hidrofbica, a resistncia de exposio de grupos polares gua,
considerada a maior fora diretriz para agregao e dobramento de protenas. A
agregao e o dobramento de protenas representam um balano entre exposio e
acobertamento de reas superficiais hidrofbicas. O balano to delicado que a
mudana de um aminocido na protena pode alterar substancialmente seu
comportamento de agregao (FIELDS et al., 1992).
Vrios fatores fsicos, como temperatura, fora inica, agitao, adsoro
superfcie/interface, exposio luz, podem induzir a agregao de protenas. O
fator de crescimento do queratincito humano recombinante, por exemplo, sofre leve
desdobramento em temperatura elevada, levando a imediata agregao e
precipitao (CHEN et al., 1994). A agregao protica pode ser tambm devido
degradao ou modificao qumica com subseqente exposio de superfcies
hidrofbicas (ENGLAND, 1998). Protenas podem formar diretamente agregados
covalentes, como a insulina, a papana e outras protenas (KLIBANOV; SCHEFILITI,
2004; STRICKLEY, ANDERSON, 1997). Ligaes dissulfeto contribuem para a
formao de estruturas tercirias e a estabilizao de estruturas secundrias
(TAKANO et al., 1988). Troca de ligaes dissulfeto possvel em ligaes cistenacistena, levando a agregao da macromolcula (Figura 4).
A formao de agregados covalentes pode ocorrer indiretamente, depois da
oxidao de resduos de histidina e metionina, como observado para relaxina
humana (LI et al., 1995). Os agregados proticos usualmente possuem atividade
biolgica reduzida ou so isentos de atividade (CONSTANTINO; LANGER;
KLIBANOV, 1994; WEERT et al., 2002).
___________________________________________________________\w______ 18
_______________
17
TURK,B.; TURK,V.; TURK,D.. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their
protein inhibitors. Biol. Chem. v. 378, p. 141-150.1997.
___________________________________________________________\w______ 19
amplificam o nmero de processos qumicos que podem ocorrer (CONSTANTINO;
LANGER; KLIBANOV, 1994). Fatores tais como pH, fora inica, composio de
tampo, outros excipientes, luz, oxignio atmosfrico, ons metlicos e temperatura
podem afetar o mecanismo de degradao (CLELAND; POWEL; SHIRE, 1994;
FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
A estrutura primria de uma protena pode indicar como a molcula ser
degradada. A deaminao, degradao da cadeia lateral amida dos aminocidos
glutamina e asparagina, parece ser o processo de instabilidade qumica mais
comum em protenas farmacuticas. A deaminao pode ser reduzida em pH abaixo
da neutralidade. A estabilidade mxima de resduos de asparagina em peptdeos e
protenas encontrada entre pH 2-5, e, em pH 5-12, a reao ocorre rapidamente
(WANG, 1999).
Cadeias laterais de triptofano, metionina e cistena, e, em menor extenso,
tirosina e histidina, so stios potenciais de oxidao, e a oxidao significativa em
pH neutro e alcalino. Metionina, em particular, propenso oxidao por oxignio
atmosfrico (MANNING; PATEL; BORCHARDT, 1989). A oxidao destes stios
pode ser catalisada por ons metlicos (processo stio-especfico) ou aumentado por
oxidantes ou exposio luz (processo stio no-especfico). Os stios mais
facilmente oxidveis so os grupo tiis, presentes nos aminocidos metionina e
cistena. A fcil oxidao de resduos de metionina ocorre porque ela um dos
resduos mais flexveis em protenas, sendo levemente polar ou no polar
(RICHARDS, 1997).
O pH da formulao pode afetar a velocidade de oxidao por mudar o
potencial de oxidao dos oxidantes, por alterar a afinidade da ligao entre ons
___________________________________________________________\w______ 20
metais catalticos e os aminocidos ionizveis, e por interferir na instabilidade de
intermedirios da oxidao.
O triptofano um dos resduos de aminocidos em protenas mais
fotossensveis, enquanto a ligao lisina-treonina indica a susceptibilidade
clivagem induzida pelo cobre. A hidrlise da ligao peptdica possvel nas
ligaes asparagina-prolina e asparagina-tirosina, sugerindo que estas seqncias
so cido-lbeis (INGLIS, 1983).
A estabilidade de protenas o resultado do balano entre foras
estabilizantes e desestabilizantes. Fatores como temperatura, pH da formulao,
adsoro, sais, ons metlicos, agentes quelantes, agitao, agentes desnaturantes,
solventes no aquosos, fonte e pureza de protenas, morfismo protico e alta
presso podem romper este delicado mecanismo.
O mais importante fator que afeta a estabilidade a temperatura.
Infelizmente, no h mecanismo geral para descrever o efeito da temperatura sobre
a estrutura e funo de protenas, devido sua complexa estrutura. Em geral, maior
temperatura leva a menor estabilidade de protenas.
Quando a temperatura
___________________________________________________________\w______ 21
CALVERY, 1933). Em pHs extremos, longe do ponto isoeltrico (pI) de protenas,
aumentam repulses eletrostticas entre cargas iguais, resultando em uma
tendncia de desdobramento (DILL, 1990). O pH da formulao pode afetar a
estabilidade fsica e qumica das protenas. Diferentes degradaes qumicas podem
ser facilitadas em diferentes pHs. Isso explica porque produtos de degradao so
diferentes em diferentes pHs para a mesma protena (GIETZ et al., 1998). Sob
condies bsicas, muitas reaes podem ocorrer, tais como hidrlise de ligaes
peptdicas, deaminao, hidrlise de arginina a ornitina, -eliminao, racemizao e
formao de dupla ligao.
Desenvolvimento de protenas farmacuticas tem mostrado ser desafiante
pela complexidade de produo e purificao, e pela limitada estabilidade qumica e
fsica delas. A instabilidade desse frmaco uma das maiores razes pelas quais as
protenas so tradicionalmente administradas atravs de injees e no por via oral,
como os frmacos quimicamente menores (SANCHEZ-RUIZ; MAKATDZE, 2001;
WANG, 1996).
A aplicao tpica de macromolculas indicada quando sua ao ser
superficial, como no caso da papana, pois, devido ao seu tamanho molecular, no
possvel a penetrao atravs do estrato crneo.
A natureza hidroflica e o grande tamanho molecular das protenas versus o
carter lipoflico do estrato crneo so as maiores barreiras na aceitabilidade da
epiderme como um stio potencial de liberao e ao de protenas farmacuticas. A
aplicao de produtos biofarmacuticos pele est restrita a uma ao bem
superficial, como a ao de desbridamento da papana sobre queimaduras e feridas.
Muitas macromolculas possuem tempo de meia vida relativamente curto em
meio aquoso, que pode conduzir a pobre biodisponibilidade e uma pobre
___________________________________________________________\w______ 22
estabilidade do produto final. Para melhorar a biodisponibilidade e a estabilidade, as
protenas podem ser veiculadas em injees oleosas, produtos de liberao
sustentada, sistema de liberao particulado, implantes ou disperses (emulses e
gis). Esses tipos de formas farmacuticas possuem a vantagem de melhorar a
estabilidade frente a uma formulao aquosa. Assim, a estabilidade de protenas
pode ser aumentada pela excluso de gua do produto ou pela adio de
excipientes estabilizantes.
Para o desenvolvimento de produtos biotecnolgicos alguns componentes
como sais, ons metlicos, polilcoois, tesoativos, agentes redutores e agentes
quelantes, outras protenas, aminocidos, cidos graxos, polmeros e fosfolipdeos,
podem melhorar a estabilidade de polipeptdeos e protenas.
Tensoativos aninicos e no inicos so frequentemente adicionados para
estabilizar macromolculas, por prevenirem a adsoro de protenas s superfcies,
e porque reduzem a agregao induzida pela agitao e a precipitao (BAM;
RANDOLPH; CLELAND, 1995). Alguns estudos tm investigado o efeito da
concentrao de tensoativos sobre a agregao de protenas, sugerindo que a ao
protetora coincide com a concentrao micelar mnima para tensotaivo. Estes dados
suportam a teoria da formao de uma monocamada na interface gua-ar, como
sendo o mecanismo de ao (WANG; JOHNSTONE, 1993). Entretanto, altas
concentraes de tensoativos podem desestabilizar a macromolcula (KATAKAM;
BELL; BANGA, 1995).
A dificuldade de se obter frmulas farmacuticas e cosmticas estveis
contendo protenas leva pesquisadores a buscarem a modificao da sua estrutura,
a sua imobilizao, o controle da ao, como o sistema desenvolvido por Weert et
al. (2002), que utilizou um polmero de poli-orto-ster para encapsulao de protena
___________________________________________________________\w______ 23
semi-slida. Esses tipos de estudos tambm tm sido realizados com a papana e
demonstram que, geralmente, h aumento da sua estabilidade, porm nem sempre
a atividade maior do que quando comparada papana livre em meio aquoso
(KHAPARDE; SINGHAL, 2001; MIYAMOTO, 2004; SIM et al., 2000; VICENTE;
AIRES-BARROS; EMPIS, 1994). Essas pesquisas so importantes para que se
consiga o aumento da estabilidade da papana em sistemas bifsicos, os mais
utilizados em cosmetologia, j que h indcios de que a tenso interfacial nesses
sistemas desestabiliza essa proteinase (FAN et al., 2001). Alm disso, a associao
com outros compostos como a uria, esto sendo testados a fim de aumentar a
estabilidade da papana em formulaes (EDWIN; SHARMA; JAGANNADHAM,
2002).
Estudos na modificao dos grupos de aminocidos da enzima para uso em
meio alcalino tm mostrado o aumento das propriedades catalticas e na resistncia
inativao trmica e autoltica (SANGEETHA; ABRAHAM, 2006). J os solventes
orgnicos diminuem a atividade da papana (SZABELSKI; STACHOWIAK; WICZK,
2001).
As mudanas, fsicas ou qumicas, podem resultar em perda da atividade
biolgica, podendo ocorrer gradualmente durante o armazenamento da formulao,
fato que tem limitado a vida de
___________________________________________________________\w______ 24
ferramentas para essa avaliao de formulaes com protenas (DI MAMBRO;
BORIN; FONSECA, 2003).
Uma alternativa para as formulaes de uso tpico contendo papana a
forma farmacutica gel, que uma disperso coloidal predominantemente hidroflica
(FARMACOPIA BRASILEIRA, 2003), empregando polmeros inertes, qumica e
fisicamente estveis (EXCIPIENTES, 1998), o que pode minimizar as interaes
hidrofbicas com a protena.
Os gis possuem penetrao pequena, pois no tm afinidade pelo sebo
cutneo, formando uma pelcula aps a evaporao da gua, o que mantm os
ativos sobre a pele (MOSQUEIRA, 1996). O uso de gis em produtos tpicos tem
sido estabelecido no comrcio de cosmticos e tratamento pessoal. O interesse no
uso farmacutico foi despertado pelo esforo em reduzir a exposio dos frmacos
aos sistemas que os veiculam. Diversos antiinflamatrios no esteroidais esto
sendo incorporados em gis para terapia tpica. Esses produtos, contendo
carbmeros ou poloxmeros
proporcionar adequados nveis dos frmacos no tecido onde foram aplicados (ZATZ;
KUSHIA, 1996).
O Carbopol 940, que um polmero sinttico derivado do cido poliacrlico,
forma gis de alta viscosidade e com boa aparncia, mas sensveis a variaes do
pH do meio. Esse polmero utilizado como agente formador de gel em sistemas
aquosos, agente regulador da viscosidade e estabilizador de emulses. O Natrosol
HHR
250,
polmero
no
inico
derivado
da
celulose,
apresenta
maior
___________________________________________________________\w______ 25
tambm como agente regulador da viscosidade, estabilizador de emulso,
espessante, formador de filmes e ligante (MERCK Index., 1996; TRAVERSA, 2003).
Os poloxmeros so usados em formulaes farmacuticas como tensoativos,
agentes emulsionantes, agentes solubilizadores, agentes dispersivos e promotores
de absoro in vivo.
Os poloxmeros so polmeros sintticos formados por trs blocos poli(oxietileno)-poli(oxipropileno)-poli(oxietileno) (PEO PPO PEO). Todos os
poloxmeros possuem estruturas qumicas semelhantes, diferenciando-se pela
massa molecular e a composio do bloco de PEO hidroflico (x) e do bloco PPO
hidrofbico (y) (Figura 5). Os dois poloxmeros mais comumente utilizados so o
poloxmero 188 (x=80, y=27) com massa molecular variando entre 7680 a 9510 Da,
e o poloxmero 407 (x=101, y=56), que possui massa molecular variando entre 9840
a 14600 Daltons (ENGLAND, 1998; MAO et al., 2004).
O poloxamer 407 (Pluronic F127 ou PF-127) mais solvel em gua fria que
em quente, o que se tem atribudo s extensas ligaes de hidrognio entre as
molculas de gua e os tomos de oxignio do ter do polmero (FLORENCE;
ATTWOOD, 2003). O decrscimo na solubilidade, com o aumento da temperatura,
___________
18
___________________________________________________________\w______ 26
devido menor hidratao a altas temperaturas, causado pela quebra das ligaes
de hidrognio. A baixa toxicidade dos poloxmeros e sua capacidade de formar gis
claros em meio aquoso torna-os teis, particularmente em formulaes de uso tpico
(SAKASHITA et al., 1995). O PF-127 tem sido particularmente interessante pelo fato
desse polmero ser uma soluo, em baixas temperaturas, e forma gel, em
temperaturas fisiolgicas (37C) (FANG et al., 2002; OH et al.,2005; ZATZ; KUSHIA,
1996). Em solues aquosas, com o aumento da temperatura, os poloxmeros se
agregam em micelas para minimizar a energia livre da soluo. Essa propriedade da
reverso trmica do PF-127 exibida em concentraes entre 20-35% (CABANA;
AIT-KADI; JUHSZ, 1997; MORISHITA et al., 2001).
Uma importante caracterstica do PF-127 o aumento da estabilidade de
protenas veiculadas dentro da matriz do gel, prevenindo adsoro de protenas em
superfcies e tambm por sua habilidade em inibir a agregao, precipitao e
desnaturao das protenas (BAM; RANDOLPH; CLELAND; 1995; ENGLAND, 1998;
MORISHITA et al., 2001; RAICHE; PULEO, 2003). O gel de PF-127 forma duas
regies anfiflicas distintas depois da hidratao. A partio dos frmacos entre
esses dois segmentos da cadeia do polmero conhecida por influenciar a difuso e
a liberao dos frmacos a partir dos gis de PF-127. Tem sido relatado que a
incorporao de aditivos hidroflicos em formulaes com gel de PF-127 acelera a
liberao dos frmacos. Por outro lado, substncias pouco hidroflicas diminuem a
taxa de liberao do frmaco a partir do gel (MORISHITA et al., 2001).
Hidrogis preparados a partir de polmeros esto sendo empregados como
veculos modernos no uso tpico de vrios frmacos. Os gis de Carbopol 940 e
Pluronic F-127 em formulaes tpicas apresentam baixa reao de sensibilidade,
isto , reduzido aparecimento de eritema quando comparado a outros veculos de
___________________________________________________________\w______ 27
frmacos para utilizao na pele (FANG et al., 2002). Por comparao com outros
poloxmeros, o PF-127 notavelmente menos txico quando administrado tanto por
via intravenosa, quanto pela intramuscular (BOHORQUEZ et al., 1999; RAICHE;
PULEO, 2003). Essas caractersticas so desejveis para o uso em feridas e
queimaduras, sendo o PF-127 uma alternativa atraente para o uso nesse tipo de
leso. Alm disso, o fato de a formulao com o gel de PF-127 ser lquida a 5C,
favorece a aplicao do medicamento e a minimiza a dor do paciente, visto que no
ser necessrio o contato das mos para a administrao do gel, podendo,
perfeitamente, ser utilizado na forma de spray.
Devido ao uso difundido da papana no Brasil, e aos poucos estudos sobre a
estabilidade das formulaes e matrias-primas comercializadas contendo essa
enzima, tornam-se necessrios o desenvolvimento de formulaes estveis e o
estudo da estabilidade das mesmas.
___________________________________________________________bu}x|________ 28
2. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GERAL:
B. OBJETIVOS ESPECFICOS:
Avaliao
da
estabilidade
da
atividade
proteoltica
da
papana
___________________________________________________________bu}x|________ 29
______________________________________________________`tx|t x `w______ 30
3. MATERIAL E MTODOS
3.1.
Material:
3.1.1. Reagentes:
3.1.2. Equipamentos:
______________________________________________________`tx|t x `w______ 31
Centrfuga Excelsa Baby I modelo 206-R, potncia 440 Watts - Fanem
Destilador de gua - Quimis Q 341 - 210
Espectrofotmetro CE-1021 - 1000 Series - CECIL
Fonte eltrica para eletroforese - modelo F.E. 1000
Incubadora BOD MA 415 Marconi
Liofilizador
pH metro - DMPH-2 Digimed
Sistema de eletroforese
______________________________________________________`tx|t x `w______ 32
3.2. Mtodos:
Em
intervalos de 1 minuto entre cada tubo, 1,0 mL de soluo de casena 1% (p/v) foi
adicionado. Aps agitao, os tubos permaneceram em repouso por 10 minutos em
banho de gua a 37C. Alquotas de 3,0 mL de soluo de cido tricloractico 10%
(p/v) foram adicionadas aos tubos, que permaneceram em repouso por 15 minutos,
temperatura ambiente, para interromper a reao enzimtica e precipitar a
______________________________________________________`tx|t x `w______ 33
protena ntegra. Em seguida, todos os tubos foram centrifugados a uma rotao de
3000 rpm (1660g) por 10 minutos, em centrfuga Excelsa Baby I modelo 206-R,
potncia 440 Watts, Fanem. Assim, a frao sobrenadante resultante foi empregada
para medida da atividade enzimtica.
A concentrao do produto de hidrlise da casena pela papana foi
determinada pela medida da absorvncia da frao sobrenadante a 280 nm, em
espectrofotmetro CE-1021. Uma unidade de atividade enzimtica foi definida como
a quantidade de papana que aumenta em 0,01 unidade a absorvncia da frao
sobrenadante a 280 nm, por minuto de reao. Para esse clculo, foi usada a
tangente da primeira parte da curva de absorvncia por minuto versus quantidade de
protena (ARNON, 1970), assim como demonstra a Figura 6.
Abs/ min
0,02
0,01
C1 C2
papana (g/mL)
______________________________________________________`tx|t x `w______ 34
3.2.3. Validao do mtodo de medida de atividade proteoltica:
3.2.3.1. Linearidade/Faixa:
minuto
versus
concentrao
de
papana
(g/mL)
foi
expressa
______________________________________________________`tx|t x `w______ 35
3.2.3.2. Preciso e exatido intra e inter ensaio:
CV (%) = S x 100
x
______________________________________________________`tx|t x `w______ 36
A exatido intra e interensaio, para as trs concentraes de papana, foi
expressa matematicamente como a porcentagem de recuperao (R).
R (%) = Xm x 100
______________________________________________________`tx|t x `w______ 37
3.2.4. Caracterizao qumica, fsica e da atividade proteoltica das matriasprimas papana:
O teor de protena foi determinado pelo mtodo descrito por LOWRY et al.
(1951), utilizando a protena soro albumina bovina como padro e, para a leitura da
absorvncia das amostras, o comprimento de onda utilizado foi o de 660 nm.
______________________________________________________`tx|t x `w______ 38
entre cada tubo, 1,0 mL de soluo de casena 1% (p/v) foi adicionado. Aps
agitao, os tubos permaneceram em repouso por 10 minutos em banho-maria, a
37C. A atividade proteoltica foi determinada como discutido no item 3.2.2..
GEL DE SEPARAO
GEL DE CONCENTRAO
15%
3%
1650 L
200 L
--------
250 L
1125 L
--------
10 L
20 L
TEMED
5 L
10 L
1710 L
1520 L
COMPONENTES
gua destilada
______________________________________________________`tx|t x `w______ 39
Na preparao das amostras para eletroforese, a soluo-me da papana do
fabricante A foi dialisada contra gua deionizada, e, em seguida, essa soluo foi
liofilizada.
Solues contendo 4 mg de MP/mL das matrias-primas foram preparadas com
as amostras de papana do fabricante A liofilizada, papana do fabricante B e
papana padro. Essas solues foram diludas na proporo de 1:1 (v/v) em
sistema diluente, constitudo de tampo Tris/HCl 62,5 mM, pH 6,8, 2% de SDS e
20% de glicerol. Alquotas de 15 L das solues diludas foram aplicadas placa
de gel de poliacrilamida. Como indicador da migrao das amostras pelo gel, foi
empregada a soluo aquosa do corante azul de bromofenol a 0,003% diluda 1:1 no
sistema diluente.
Nas cubas, superior e inferior, foi utilizado tampo Tris/Glicina (0,025 M/ 0,192
M, respectivamente), pH 8,5, contendo 0,1 % de SDS (LAEMMLI, 1970). A
eletroforese foi desenvolvida a uma corrente constante de 8 mA, a 4C, at o
corante migrar totalmente pelo gel de separao.
O gel foi corado com soluo 0,1% de Coomassie Brilliant Blue R350, obtida
pela solubilizao do corante em soluo de isopropanol (25%) e cido actico
(10%). O gel foi mantido nessa soluo por aproximadamente 2 horas e, ento, o
excesso do corante foi removido com soluo de cido actico 20%, durante 30
minutos e sob agitao constante. Em seguida, o gel foi lavado rapidamente com
soluo de cido actico 7%, para permitir maior nitidez das bandas de protenas.
______________________________________________________`tx|t x `w______ 40
3.2.4.3.2. Determinao das massas moleculares relativas das bandas
proticas:
A curva de
calibrao foi utilizada para determinao das massas moleculares relativas das
bandas proticas separadas durante a anlise eletrofortica das amostras de
papana (matrias-primas e padro).
______________________________________________________`tx|t x `w______ 41
3.2.6. Preparao de formulaes tpicas do tipo gel contendo papana:
3.2.6.1.
Componentes
gua destilada
Pluronic F127
Nipaguard
EDTA
Cloridrato de Cistena
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Papana
Formulao base
(g %)
qsp 100,00
20,00
0,80
0,04
0,16
qsp pH 6,5
---
Formulao adicionada da
enzima (g %)
qsp 100,00
20,00
0,80
0,04
0,16
qsp pH 6,5
1,00
O gel de Pluronic F127 foi preparado pelo mtodo a frio descrito por Cabana
et al. (1997). No preparo da formulao gel de Pluronic F127 20% (p/p) pesou-se
exatamente 20 g do polmero, 0,80g do conservante e 59,20g de gua destilada
previamente resfriada em geladeira. Um bquer contendo essa quantidade de gua
e do conservante foi colocado em banho de gelo e a temperatura foi mantida em
torno de 5C. Sob agitao constante, com auxlio de um agitador, o polmero foi
adicionado lentamente. O polmero sofre hidratao e dispersa na gua fria, sob
agitao constante, e, para isso, a soluo ficou agitando por um perodo de 2
______________________________________________________`tx|t x `w______ 42
horas. Nesse processo pode ocorrer formao de espuma. Aps as duas horas, a
soluo teve o pH acertado para 8,0. Pesou-se, ento, o cloridrato de cistena e o
EDTA, que foram dissolvidos em 10,0 gramas de gua destilada. Em seguida, essa
soluo foi adicionada soluo do Pluronic F127, sem que a agitao do mesmo
fosse interrompida. Ainda sob agitao constante, a Papana foi adicionada
lentamente, previamente dissolvida em 10 gramas de gua destilada. O gel
permaneceu em banho de gelo e sob agitao constante por mais quatro horas. O
pH foi conferido no final do processo, obtendo-se pH em torno de 6,5. Aps as seis
horas, a formulao permaneceu em repouso por 12 horas, em refrigerador (5C
2C). Uma soluo verdadeira formada no perodo de seis a doze horas.
As formulaes, com e sem papana, foram acondicionadas em potes plsticos
(polietileno de alta densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa,
preenchendo todo o volume do pote.
3.2.6.2.
Componentes
gua destilada
Carbopol 940
Nipaguard
Soluo de EDTA 1% (p/v)
Propilenoglicol
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Cloridrato de Cistena
Papana
Formulao base
(g %)
qsp 100,00
0,60
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
---
Formulao
adicionada da enzima
(g %)
qsp 100,00
0,60
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
1,00
______________________________________________________`tx|t x `w______ 43
No preparo da formulao gel de Carbopol 940 foram adicionados em um
bquer contendo 20 g de gua destilada o propilenoglicol, a soluo de EDTA 1%
(p/v) e o Nipaguard. O Carbopol 940 foi disperso nessa soluo, que permaneceu
em repouso por 24 horas, para total disperso do p de Carbopol 940 na soluo.
Aps essas 24 horas, o gel formado foi agitado com uma esptula at completa
homogeneizao. O pH foi acertado para 6,5 com a soluo de NaOH 10%. Em um
bquer parte, 10 g de gua destilada foram utilizados para solubilizar 160 mg de
cloridrato de cistena. Essa soluo foi adicionada ao gel sob agitao constante.
Em outro bquer, 20 g de gua destilada foram utilizados para solubilizar a papana.
Aos poucos e sob agitao manual constante, essa soluo foi adicionada ao gel. O
restante da gua destilada (38 g) foi adicionado lentamente e sob agitao
constante, de modo que mantivesse a estabilidade do gel.
As formulaes foram acondicionadas em potes plsticos (polietileno de alta
densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa, preenchendo todo o volume
do pote.
3.2.6.3.
gua destilada
Natrosol 250 HHR
Nipaguard
Soluo de EDTA 1% (p/v)
Propilenoglicol
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Cloridrato de Cistena
Papana
Formulao base
(g %)
qsp 100,00
1,50
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
---
Formulao
adicionada da enzima
(g %)
qsp 100,00
1,50
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
1,00
______________________________________________________`tx|t x `w______ 44
Na preparao da formulao gel de Natrosol 250 HHR, os componentes
propilenoglicol, soluo de EDTA 1% (p/v) e o Natrosol 250 HHR foram
adicionados em um bquer de vidro. Dezenove gramas de gua destilada foram
aquecidos a 50C e acrescentados mistura anterior, sob agitao constante. Aps
resfriamento do gel, foram adicionados 0,80g de Nipaguard, homogeneizando com
auxlio de esptula plstica. O pH foi acertado para 6,5 com a soluo de NaOH
10%. O gel foi reservado. Dez gramas da gua destilada foram utilizados para
solubilizar a cistena, em um bquer de vidro parte. Essa soluo foi acrescentada
ao gel, homogeneizando constante e rapidamente, a fim de no desestabilizar a
disperso. Em outro bquer, 20 g de gua destilada foram utilizados para dissolver a
papana. Aos poucos e sob agitao manual constante, essa soluo foi adicionada
ao gel. Os outros 19 g de gua destilada foram adicionados lentamente e sob
agitao constante ao gel.
As formulaes foram acondicionadas em potes plsticos (polietileno de alta
densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa, preenchendo todo o volume
do pote.
______________________________________________________`tx|t x `w______ 45
3.2.7.1.
Avaliao visual:
3.2.7.2.
Determinao do pH:
______________________________________________________`tx|t x `w______ 46
homogeneizadas em quantidade suficiente para 25,0 gramas de gua destilada. As
suspenses
foram
centrifugadas
por
30
minutos.
Alquotas
das
fraes
3.2.10. Estudos
de
estabilidade
fsica,
fsico-qumica
da
atividade
proteoltica:
______________________________________________________`tx|t x `w______ 47
amostras das formulaes estveis foram analisadas quanto sua estabilidade
fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica.
______________________________________________________`tx|t x `w______ 48
testadas, de forma que se obtivesse uma circunferncia de aproximadamente 2 cm
de dimetro (Figura 7). Foi avaliada a eficcia do p de papana, formulao
extempornea (soluo aquosa de papana 1%), formulao gel de Pluronic F127
e formulao gel de Carbopol 940 contendo a enzima a 1%. As placas foram
colocadas em banho de gua a 37C por 6 horas. Aps esse tempo, o excesso de
formulao sobre os gis foi retirado com algodo umedecido com gua, para que
se procedesse com a colorao dos mesmos. A colorao do gel foi feita de acordo
com o item 3.2.4.3.1.a., a fim de avaliar a ao proteoltica da papana frente ao
substrato. O excesso de corante foi retirado com soluo de cido actico 7%.
Quantidade em L
3300 L
Gelatina 0,2%
4000 L
20 L
TEMED
10 L
gua destilada
3670 L
Placa de Petri
2,0 cm
6,0 cm
Formulao teste
6,5 cm
_________________________________________________________extw________ 49
4. RESULTADOS
0,12
0,06
0,1
0,05
0,08
0,04
Abs/min
Abs/min
_________________________________________________________extw________ 50
0,06
0,03
0,04
0,02
0,02
0,01
y = 0,0038x + 0,0014
R 2 = 0,9977
0
0
10
20
30
40
50
10
15
da
concentrao
de
papana
no meio reacional.
Tabela 1 - Resultados da anlise de regresso linear dos dados da curva obtida pela
relao entre o aumento da absorvncia por minuto de reao (280 nm)
em funo da concentrao de papana (g/mL) no meio reacional.
Parmetros Estatsticos
Equao da regresso
y = 0,0038x + 0,0014
Coeficiente de regresso (r)
r = 0,9988
Erro padro do slope
0
Erro padro do intercepto
0,000178
2,78
13,90
Faixa de concentrao (g/mL)
(a)
(a)
_________________________________________________________extw________ 51
A atividade proteoltica da papana, definida como a quantidade de enzima que
aumenta em 0,01 a absorvncia em 280 nm por minuto de reao, foi calculada da
seguinte forma:
0,02 Abs/min
4,89 g/mL
0.01 Abs/min
2,26 g/mL
0,01 Abs/min
2,63 g/mL
_________________________________________________________extw________ 52
Tabela 2 - Determinao da repetibilidade do mtodo de medida da atividade
proteoltica da papana, empregando a casena como substrato (3
concentraes com 10 rplicas).
N de
Anlises
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Sa
CV (%)b
EP (%)c
Amostra 1
(8,34 g/mL)
Amostra 2
(11,12 g/mL)
Amostra 3
(13,90 g/mL)
Abs/min
Concentrao
Calculada
Abs/min
Concentrao
Calculada
Abs/min
Concentrao
Calculada
0,0339
0,0336
0,0338
0,0341
0,0336
0,0339
0,0338
0,0337
0,0339
0,0343
0,0339
0,00022
0,65
0,00007
8,55
8,50
8,50
8,60
8,50
8,55
8,50
8,50
8,55
8,65
8,54
0,0512
0,60
0,0162
0,0440
0,0437
0,0441
0,0444
0,0440
0,0438
0,0452
0,0439
0,0440
0,0442
0,0441
0,0004
0,91
0,00013
11,21
11,13
11,23
11,31
11,21
11,58
11,52
11,18
11,21
11,26
11,28
0,1484
1,32
0,0469
0,0543
0,0538
0,0544
0,0546
0,0543
0,0535
0,0540
0,0543
0,0544
0,0551
0,0543
0,00044
0,81
0,00014
13,92
13,80
13,95
14,00
13,92
13,71
13,84
13,92
13,95
14,13
13,91
0,1140
0,0082
0,0361
Desvio Padro
Coeficiente de Variao
c
Erro Padro
b
Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Abs/min
Abs/min
Abs/min
0,0339
0,0342
0,0340
0,0335
0,0341
0,0355
0,0343
0,0348
0,0338
0,0333
0,0340
0,0343
0,0002
0,0009
0,56
2,62
0,0001
0,0004
Preciso Intermediria (%) 1,56
0,0341
0,0346
0,0339
0,0344
0,0340
0,0342
0,0003
0,85
0,0001
_________________________________________________________extw________ 53
Tabela 4 - Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da atividade
proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 11,12 g/mL de papana, com 5 rplicas.
N de Anlises
1
2
3
4
5
Mdia
Sb
CV (%)c
EP (%)d
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Abs/min
Abs/min
Abs/min
0,0440
0,0448
0,0437
0,0436
0,0451
0,0440
0,0444
0,0443
0,0435
0,0441
0,0441
0,0442
0,00063
0,00044
1,43
0,99
0,0003
0,0002
Preciso Intermediria (%) 1,06
0,0445
0,0449
0,0446
0,0443
0,0445
0,0446
0,00022
0,49
0,0001
Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b
Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Abs/min
Abs/min
Abs/min
0,0532
0,0545
0,0538
0,0552
0,0544
0,0539
0,0546
0,0542
0,0543
0,0534
0,0541
0,0542
0,0006
0,0007
1,03
1,29
0,0003
0,0003
Preciso Intermediria (%) 0,92
0,0543
0,0537
0,0545
0,0542
0,0537
0,0541
0,0004
0,74
0,0002
_________________________________________________________extw________ 54
Concentraes
Terica (g/mL)
Concentraes
Calculada (g/mL)
Ativ.Proteolticaa
Terica (U)
Ativ. Proteolticaa
Calculada (U)
Recup. Mdia (%)b
Sc
CV (%)d
ER%e
Exatido interensaio
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
Amostra
8,34
11,12
13,90
8,34
11,12
13,90
8,54
11,24
13,92
8,62
11,28
13,87
3,17
4,23
5,29
3,17
4,23
5,29
3,25
4,27
5,29
3,28
4,29
5,27
102,46
0,68
0,66
2,52
101,08
1,00
0,99
0,95
100,01
0,83
0,83
0,00
103,4
1,68
1,62
3,47
101,45
1,12
1,10
1,42
99,74
0,94
0,94
0,38
Atividade Proteoltica
Recuperao Mdia
c
Desvio Padro
d
Coeficiente de Variao
e
Erro Relativo
b
_________________________________________________________extw________ 55
O limite de deteco determinado para a medida de atividade proteoltica foi
de 1,2 g de papana por mL de meio reacional. Esta concentrao de papana
proporcionou uma medida de absorvncia em 280 nm, que, descontada da
absorvncia do branco (meio reacional sem papana), deu uma leitura de
absorvncia de 0,06, em 10 minutos de reao, que pode ser detectada com
segurana pelo espectrofotmetro utilizado.
Interensaio (n=15)
3,21
115,5
7,0
6,0
15,0
Desvio Padro
Coeficiente de Variao
c
Erro Relativo
b
_________________________________________________________extw________ 56
mg de protena/ mg de MP
0,119
0,847
%
11,9
84,7
Para a medida da atividade proteoltica, quantidades diferentes das matriasprimas comercializadas pelos fabricantes A e B foram empregadas nos ensaios
enzimticos, de modo a obter-se, para ambas as matrias-primas, a mesma
quantidade de protena no meio reacional (Tabela 9 e Figura 9).
A
Absorvncia
a 280 nm/ minuto
0,0206
0,0347
0,0469
0,0595
0,0701
0,0755
0,0806
0,0845
B
Absorvncia
a 280 nm/ minuto
0,0186
0,0356
0,0467
0,0577
0,0655
0,0728
0,0798
0,0813
_________________________________________________________extw________ 57
C
0,09
0,08
0,07
Abs/min
0,06
0,05
SP Farma
0,04
Acros
0,03
0,02
0,01
0
0
20
40
60
_________________________________________________________extw________ 58
Atividade especfica da
papana
0,4
0,4
Unidade de Atividade(U)/mg de
matria-prima
48,80
336,00
_________________________________________________________extw________ 59
Figura 10 Anlise eletrofortica em placa de gel de poliacrilamida com SDS, da papana padro
sigma (2), da papana matria-prima A (3), da papana matria-prima B (4) e da
mistura de padres proticos de MMr (1).
4,9
4,8
y = -1,0277x + 4,987
4,7
R = 0,997
4,6
4,5
4,4
4,3
4,2
4,1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Rf
_________________________________________________________extw________ 60
Papana Padro
Papana A Liofilizada
Papana B
Rf
MMr
Rf
MMr
Rf
MMr
0,16
66461,17
0,14
69682,22
0,14
69682,22
0,36
41402,63
0,36
41402,63
0,45
33460,70
0,42
35922,45
0,42
35922,45
0,45
33460,70
0,45
33460,70
0,73
17249,60
0,87
12385,14
0,87
12385,14
0,87
12385,14
_________________________________________________________extw________ 61
A Figura 13 mostra o comportamento da atividade proteoltica das matriasprimas papana aps armazenamento a 4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, por
diferentes tempos. Observa-se que no houve perda de atividade proteoltica da
papana matria-prima de ambos fabricantes, quando armazenadas a 4C. Nas
condies de armazenamento a 30C/70%UR e a 40C/70%UR, houve uma perda
considervel da atividade (maior que 10%) j a partir do 15 dia de armazenamento,
para a matria-prima papana A. A matria-prima B mostrou-se pouco mais
resistente temperaturas elevadas, porm tambm houve perda significativa da
atividade proteoltica da papana nas condies extremas de estocagem
(40C/70%UR).
Tempo Zero
15 dias
30 dias
(A)
(B)
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
Abs/min
Abs/min
_________________________________________________________extw________ 62
Tempo Zero
15 dias
30 dias
20
40
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
Tempo Zero
15 dias
30 dias
60
Tempo Zero
15 dias
30 dias
40
Abs/min
Abs/ min
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
20
60
Tempo Zero
15 dias
30 dias
40
60
Tempo Zero
15 dias
30 dias
60
protena
(m icrogram as/m L)
Abs/ min
Abs/ min
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
40
20
protena
(m icrogram as/m L)
20
60
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
protena
(m icrogram as/m L)
40
20
protena
(m icrogram as/m L)
protena
(m icrogram as/m L)
0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
Tempo Zero
15 dias
30 dias
20
40
60
protena
(m icrogram as/m L)
_________________________________________________________extw________ 63
Tempo de
Armazenamento
Atividade
(Dias)
(U/mg)
30C/70% UR
Perda de
Atividade
(%)
Atividade
(U/mg)
Perda de
Atividade
(%)
40C/70% UR
Atividade
(U/mg)
Perda de
Atividade
(%)
48,80
---
48,80
---
48,80
---
15
48,80
0,00
27,11
44,45
30,50
37,5
30
48,80
0,00
20,35
58,40
18,77
61,54
Tempo de
Armazenamento Atividade
(Dias)
(U/mg)
336,00
30C 70% UR
Perda de
Atividade
(%)
Atividade
(U/mg)
Perda de
Atividade
(%)
40C 70% UR
Atividade
(U/mg)
Perda de
Atividade
(%)
---
336,00
---
336,00
---
15
336,00
0,00
280,00
16,67
210,00
37,50
30
336,00
0,00
258,50
23,06
152,73
54,54
_________________________________________________________extw________ 64
4.5. Preparo e avaliao fsica, fsico-qumica, da atividade proteoltica das
formulaes contendo papana e avaliao in vitro da eficcia da ao
proteoltica da papana nas formulaes:
pH
sem Papana
7,08
com Papana
6,20
sem Papana
6,38
com Papana
6,15
sem Papana
6,60
com Papana
6,33
_________________________________________________________extw________ 65
4.5.2. Avaliao da atividade proteoltica:
Absorvncia em 280 nm
0,0185
0,0182
0,018
0,0174
0,0175
0,017
0,0167
0,0168
0,0165
0,016
0,0155
1 0,05M
Tampo Tris-HCl
gua + gel base Pluronic F127
gua + gel base Carbopol 940
gua + gel base Natrosol 250 HHR
_________________________________________________________extw________ 66
4.5.2.2. Dosagem de atividade proteoltica das formulaes:
Formulaes Gel
Pluronic F127
Carbopol 940
Natrosol 250 HHR
* mdia de triplicatas
Abs/min
0,0259
0,0290
0,0004
Atividade
proteoltica/mL
de meio reacional
(U/mL)*
3,00
3,44
0,24
Atividade
proteoltica/grama
de formulao
(U/g)
380,0
430,0
30,0
Formulaes
contendo
1 % de Papana A
Atividade proteoltica
adicionada/grama de
formulao
(U/g)
Atividade
proteoltica
recuperada/grama
de formulao
(U/g)
% de
Recuperao
Pluronic F127
Carbopol 940
Natrosol 250 HHR
4800,0
4800,0
4800,0
380,0
430,0
30,0
7,92
8,96
0,63
_________________________________________________________extw________ 67
4.5.2.3. Avaliao da uniformidade de contedo de atividade proteoltica das
formulaes:
Amostras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Sa
CV(%)b
a
b
Formulao gel de
Pluronic F127
U/g de
Abs/min
formulao
0,0236
343,55
0,0242
353,22
0,0240
350,00
0,0263
387,10
0,0251
367,74
0,0259
380,65
0,0262
385,48
0,0259
380,65
0,0255
374,19
0,0257
377,42
0,0252
370,00
0,0010
15,70
3,97
4,24
Desvio Padro
Coeficiente de Variao
Formulao gel de
Carbopol 940
U/g de
Abs/min
formulao
0,0286
424,19
0,0283
419,35
0,0275
406,45
0,0303
451,61
0,0286
424,19
0,0307
458,06
0,0309
461,29
0,0318
475,81
0,0299
445,16
0,0301
448,39
0,0297
441,45
0,0013
21,92
4,38
4,96
_________________________________________________________extw________ 68
4.5.3. Estudo da estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica
das formulaes com e sem a matria-prima papana A:
_________________________________________________________extw________ 69
Tempo Zero
15 dias
60 dias
30 dias
Figura 15 Avaliao visual das formulaes gis de Pluronic F127 (X) e Carbopol 940 (Y)
contendo 1% de papana A, submetidas a diferentes condies de armazenamento,
nos tempos zero, 15, 30 e 60 dias.
_________________________________________________________extw________ 70
4C
30C/70% UR
40C/70% UR
Perodo de
Armazenamento
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias
Formulao X
pH
Com
Base
Papana
7,02
6,20
7,05
6,17
7,03
6,10
7,01
6,16
7,02
6,20
7,03
6,18
7,05
6,15
6,99
6,20
7,02
6,20
7,02
6,15
7,08
6,13
7,03
6,10
Formulao Y
pH
Com
Base
Papana
6,38
6,15
6,33
6,10
6,34
6,12
6,35
6,07
6,38
6,15
6,30
6,13
6,32
6,14
6,33
6,09
6,38
6,15
6,32
6,10
6,35
6,08
6,30
6,12
_________________________________________________________extw________ 71
(X)
Unidade de atividade por
grama de formulao
400
350
300
250
4C
200
30C
150
40C
100
50
0
1
Meses
Unidade de Atividade
Proteoltica por grama de
formulao
(Y)
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
4C
30C
40C
Meses
Unidade de Atividade
Proteoltica por grama de
matria-prima
(Z)
60000
50000
40000
4C
30000
30C
20000
40C
10000
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Meses
Figura 16 Medida da atividade proteoltica (U) da papana na matria-prima A (Z) e veiculada nas
formulaes gis de Pluronic F127 (X) e de Carbopol 940 (Y) em funo do tempo,
armazenados a 4C, 30C/70%UR e 40C/70%UR.
_________________________________________________________extw________ 72
4.5.4. Avaliao in vitro da eficcia da ao proteoltica da papana em
formulaes tpicas:
_________________________________________________________extw________ 73
(P)
(S)
(X)
(Y)
__________________________________________________________W|v________ 74
5. DISCUSSO
__________________________________________________________W|v________ 75
XXIX, 2006; VANDENPLAS et al.,1996). A proporo de diluente para protena
maior, cerca de 5 vezes, na papana A (88:12), do que na B (16:84).
Na caracterizao eletrofortica em condies dissociantes, os perfis
eletroforticos das matrias-primas A e B foram comparados ao perfil da papana
padro (Sigma), com 99% de pureza. Durante a adequao do procedimento
eletrofortico, foi verificado que a quantidade de protena da matria-prima A no foi
suficiente para a deteco ntida das bandas proticas no gel de poliacrilamida com
SDS.
Na tentativa de melhorar o perfil eletrofortico da papana do fabricante A,
uma soluo me mais concentrada dessa matria-prima foi utilizada, visando a
adio de maior quantidade de protena placa de eletroforese. No entanto, houve
grande deformao das bandas proticas, devido, provavelmente, interferncia do
diluente presente. Assim, a soluo-me dessa matria-prima foi dialisada contra
gua deionizada, a fim eliminar o diluente presente, caso esse fosse de baixa massa
molecular relativa. Aps a dilise, a soluo me foi liofilizada para a concentrao
do material. Em uma dilise, as partculas menores em soluo so capazes de
passar atravs da membrana, por manter um alto gradiente de concentrao das
molculas difusveis atravs da membrana e por se fazer trocas do lquido de
tempos em tempos (KAYES, 1988; VOET, 1995). Com esse procedimento, foi
possvel aumentar cerca de seis vezes a concentrao de protena por miligrama de
matria-prima A. Esse resultado sugere que o diluente foi eliminado durante a
dilise, podendo, assim, afirmar que o diluente possui baixa massa molecular
relativa.
Os dados da anlise eletrofortica mostraram uma banda protica larga e
bem ntida (Banda 6 Figura 10), com massa molecular de 12,4 kDa, detectada na
__________________________________________________________W|v________ 76
papana padro e em ambas matrias-primas. Para as trs amostras de papana, a
mesma quantidade de protena foi aplicada na placa de gel de poliacrilamida. As
protenas detectadas na Banda 6 (Figura 10), com massa molecular menor do que a
papana (23,4kDa), pode ser a papana cistatina, o principal contaminante da
papana e quimopapana (AZARKAN et al., 2003). O DNA que codifica a papana
cistatina foi seqenciado por Zerhoumi et al (1998). A seqncia de aminocidos
revelou uma cadeia polipeptdica nica com 98 aminocidos e massa molecular
relativa de 11131 Daltons (AZARKAN et al., 2003).
Nas matrias-primas A e B, alm da banda 6, outras trs bandas bem ntidas
foram detectadas, com massas moleculares superiores quela da banda 6 (Figura
10). Essas bandas podem ser enzimas proteolticas, pois o ltex do Carica papaya
constitudo por uma mistura dessas enzimas. Kamnski e Bushuk (1968) detectaram
quatro bandas de atividade proteoltica, quando a papana purificada foi submetida
eletroforese em gel de amido. Por outro lado, essas bandas poderiam ser
resultantes do desdobramento da estrutura molecular da papana na presena de
SDS. No entanto, com a amostra de papana padro, que foi tratada da mesma
forma que as amostras de matria-prima, estas bandas no foram detectadas, o que
descarta essa possibilidade.
A atividade proteoltica das papanas matrias-primas e padro, assim como
das formulaes, foi determinada usando casena como substrato, de acordo com o
mtodo descrito por Arnon (1970), que uma modificao do mtodo descrito na
USP XXIX (2006).
O mtodo de medida de atividade proteoltica foi validado de acordo com os
parmetros: linearidade, preciso e exatido intra e interensaio, e limites de
deteco e quantificao. A faixa de linearidade encontrada foi de 2,78 g/mL a
__________________________________________________________W|v________ 77
13,90 g de papana por mL de meio reacional, e a equao de regresso linear
igual a y= 0,0038x + 0,0014 (r = 0,9988). A preciso intra e interensaio
permaneceram abaixo de 2%, sendo considerado preciso pelas normas do ICH
(2001). O mtodo mostrou ser exato nas concentraes de 8,34; 11,12 e 13,90
microgramas de papana por mililitro de meio reacional, com uma recuperao
mdia de 102,46%, 101,08% e 100,01% (intraensaio), e de 103,4%, 101,45% e
99,74% (interensaio), respectivamente.
Os limites de deteco e quantificao determinados foram de 1,2 g/mL e de
2,78 g/mL, respectivamente. O mtodo analtico em seu limite de quantificao de
2,78 g/mL apresentou uma preciso intra e interensaio com um coeficiente de
variao inferior a 2%. Normalmente, para o limite de quantificao fixado para
preciso um coeficiente de variao de, no mximo, 10%, podendo ser aceito at
20%, em funo das caractersticas do mtodo analtico (EURACHEN, 1993). No
entanto, a exatido intra e interensaio do mtodo de medida de atividade
proteoltica, em seu limite de quantificao foi de 113% e 115%, respecitivamente. A
faixa de variao aceitvel de 98-107% para uma concentrao do analito na
amostra de 10% (AOAC, 1993), caso da matria-prima papana A, cuja
concentrao de protena na matria-prima de 12%. A exatido est fora da faixa
aceitvel devido, provavelmente, s caractersticas do mtodo analtico.
Sankalia et al. (2005) validaram o mtodo de medida de atividade proteoltica
da papana descrito na Farmacopia Indiana, empregando um volume total de 5,0
mL de meio reacional, contendo 10 mg/mL de casena, e o tempo de incubao foi
de 60 minutos, a 40C. Os autores encontraram a faixa de linearidade de 3 a 100
g/mL, equao da regresso linear y = 0,0042x + 0,0033, os limites de deteco
(0,77 g/mL) e de quantificao (2,57 g/mL). A faixa de linearidade encontrada
__________________________________________________________W|v________ 78
pelos autores difere daquela obtida em nossos experimentos (2,78 a 13,90 g/mL).
Os autores mencionaram que a papana empregada a purificada da Farmacopia
Indiana, mas no mencionaram o seu grau de pureza e nem o contedo de protena.
Quando as matrias-primas papana A e B foram analisadas quanto s suas
atividades proteolticas, a mesma quantidade de protena foi adicionada ao meio
reacional. Apesar da grande diferena do contedo de diluente observada para
essas matrias-primas (88% na A e 16% na B), os perfis de atividade proteoltica de
ambas as matrias-primas foram similares, como demonstra a Figura 9C, e muito
semelhantes ao perfil da papana padro (99%).
A atividade proteoltica encontrada para as papanas A e B foi de 0,4 U por
micrograma de protena (Tabela 10) e a encontrada para o padro de 0,380 U por
micrograma de protena. No entanto, para que 0,4 U/mg de protena fosse obtido
para a papana A, uma quantidade 7 vezes maior de matria-prima foi utilizada em
comparao papana B. Este resultado evidencia a importncia da caracterizao
de matrias-primas macromoleculares pela medida das quantidades de atividade
biolgica e de protena por grama de matria-prima.
A papana, ainda hoje, utilizada nos hospitais em solues aquosas
extemporneas, preparadas com o p de papana e gua para injetveis. A
preparao da formulao no momento do uso exige pessoal treinado e qualificado,
para que sejam evitados erros na concentrao da soluo, como tambm seja
evitada a contaminao microbiana do produto. Alm de demandar tempo para o
preparo dessa formulao, solues aquosas possuem baixa viscosidade, no se
restringindo, quando aplicada, rea afetada pela leso.
Devido a esses fatos, formulaes gis de Natrosol 250 HHR e Carbopol
940, adicionadas de papana a 3% ou em concentraes superiores, esto sendo
__________________________________________________________W|v________ 79
comercializadas para uso hospitalar, principalmente, para o tratamento de leses de
escaras. A escolha de formulao gel para veiculao de protena se deve ao fato
de que essas macromolculas so, geralmente, incompatveis com formulaes
contendo agentes emulsionantes, que podem proporcionar a deformao da
estrutura molecular da protena, levando perda da atividade enzimtica (BAM;
RANDOLPH; CLELAND, 1995; FAN et al., 2001; SANCHEZ-RUIZ; MAKATDZE,
2001). Outra vantagem de se utilizar gel hidroflico para veicular protenas a
hidrossolubilidade dessas macromolculas (MORISHITA et al., 2001).
Assim, trs formulaes gis adicionadas de 3% de matria-prima papana A
foram preparadas: gel de Pluronic F127, gel de Carbopol 940 e gel de Natrosol
250 HHR. No entanto, aps um perodo de repouso, foi observada a formao de
precipitado na formulao com o Pluronic F127. Nas outras duas formulaes, foi
observada a diminuio da viscosidade, indicando instabilidade fsica, que poderia
levar perda de atividade enzimtica mais acentuada. Dessa forma, as trs
formulaes foram reformuladas com adio de 1% da matria-prima papana A.
A atividade proteoltica das formulaes foi medida pelo mesmo mtodo
utilizado para a anlise das matrias-primas. Entretanto, para a realizao das
determinaes da atividade proteoltica das formulaes foi verificado se os
componentes dos gis tambm absorviam em 280 nm. Os resultados indicaram uma
pequena interferncia dos componentes, sendo essa interferncia maior para a
formulao com Natrosol 250 HHR (absorvncia/minuto do tampo no meio
reacional foi igual a 0,0167 e da formulao base do gel de Natrosol 250 HHR igual
a 0,0182). A interferncia observada no foi suficiente para invalidar o mtodo da
atividade proteoltica das formulaes gis (Figura 15).
__________________________________________________________W|v________ 80
Os resultados da medida da atividade proteoltica da papana adicionada s
formulaes gis de Pluronic F127, gel de Carbopol 940 e gel de Natrosol 250
HHR mostraram baixa recuperao: 7,92%; 8,96%; e 0,63%, respectivamente
(Tabela 16).
A baixa recuperao observada pode ser devido ao aprisionamento da
molcula da enzima nas malhas do gel, que no se desfez totalmente durante a
preparao da amostra, dificultando o acesso do substrato macromolecular.
Borin (2003) observou uma recuperao de 70% da atividade da superxido
dismutase (SOD), adicionada formulao gel creme de Carbopol 940. Esse maior
nvel de recuperao obtido pode ser devido baixa massa molecular do substrato,
o nion superxido, comparado ao substrato utilizado nesse estudo, a casena. Esse
fator pode ser determinante na recuperao, j que o nion superxido pode
penetrar na malha do gel mais facilmente e reagir com a enzima, enquanto que a
molcula de casena, por ser bem maior, tem dificuldades de interagir com a
papana retida nas formulaes.
A baixa recuperao pode ser devida, tambm, s interaes qumicas da
enzima com os componentes das formulaes, proporcionando perda total da
atividade proteoltica, ou uma reduo da velocidade da reao enzimtica, de modo
que o tempo de dez minutos de incubao no tenha sido suficiente para atuao da
frao enzimtica ligada. Di Mambro (2004) em formulaes de gel de Natrosol
250 HHR adicionada de SOD obteve baixa recuperao da enzima. Vrias tentativas
de extrao da enzima, acompanhadas por medida do contedo de protena e
atividade enzimtica, foram executadas. A autora no detectou protena na frao
extrada, indicando interao entre a SOD e os componentes da formulao gel de
Natrosol 250 HHR.
__________________________________________________________W|v________ 81
Finalmente, a baixa recuperao da atividade proteoltica das formulaes
preparadas pode ser devido ao prprio procedimento metodolgico, uma vez que a
casena no hidrolisada precipitada, por ao do cido tricloractico. A
precipitao da casena associada com os agentes de consistncia poderia arrastar
os oligopeptdeos gerados durante a hidrlise do substrato, proporcionando menor
medida de absorvncia da frao sobrenadante, em 280 nm.
A baixa recuperao da papana das formulaes para o meio reacional no
indica, necessariamente, perda da eficincia proteoltica das formulaes in vivo. A
medida da atividade proteoltica das formulaes gis de Pluronic F127 e
Carbopol 940 in vitro sugere que essas formulaes apresentam uma frao do
contedo de papana livre que pode exercer prontamente o efeito proteoltico sobre
o tecido necrosado. A outra frao de papana, que pode ter interagido com os
componentes das formulaes, atuaria como um depsito da enzima, prolongando a
ao enzimtica, desde, claro, que essa interao no tenha determinado perda
da atividade proteoltica. Alguns trabalhos na literatura mostram que gis de
Pluronic F127 e Carbopol 940 aumentam a estabilidade das protenas,
prevenindo a adsoro em superfcies e inibindo a agregao, precipitao e
desnaturao dessas macromolculas (BAM; RANDOLPH; CLELAND; 1995;
ENGLAND, 1998; FANG et al., 2002; MORISHITA et al., 2001; RAICHE; PULEO,
2003). Alm disso, o Pluronic F127 tem sido utilizado para veicular protenas em
formulaes de liberao controlada, diminuindo, assim, a velocidade de liberao
delas a partir das formulaes (MORISHITA et al., 2001; RAICHE e PULEO, 2003).
As formulaes gis podem ter efeito proteoltico e de hidratao mais
prolongados
que
as
formulaes
extemporneas.
Quando
formulao
__________________________________________________________W|v________ 82
proporcionando sofrimento do paciente, risco de contaminao e aumento de
trabalho na enfermaria. Com o uso de formulaes gis, a troca de curativo poderia
ser a cada 24 horas.
As formulaes gis de Pluronic F127 e de Carbopol 940 foram avaliadas
quanto uniformidade de contedo da papana (Tabela 17). Os resultados indicaram
homogeneidade de contedo do princpio ativo nas formulaes e a reprodutibilidade
da frao de papana recuperada no meio reacional.
Na adequao do mtodo foi avaliada a diferena da interferncia na leitura a
280 nm da suspenso formada pela diluio de 1 grama de formulao em 25
gramas de gua destilada e quando a mesma foi submetida a centrifugao,
utilizando apenas o sobrenadante para prosseguir a reao. Os resultados
mostraram que no h diferena significativa entre as leituras da suspenso e do
sobrenadante na recuperao da atividade da enzima para as trs formulaes gis.
Esses resultados favorecem a hiptese de que a poro relativa atividade
recuperada aquela de papana livre na suspenso da formulao em gua.
Quando foram realizados os mesmos testes com formulaes contendo 3% de
papana, h um aumento significativo da atividade recuperada, porm no h
diferena significativa entre centrifugar ou no a suspenso. Esse teste s pode ser
realizado com as formulaes de Carbopol 940 e Natrosol 250 HHR, devido
precipitao do ativo na formulao de Pluronic F127, j citada anteriormente. A
diferena entre as formulaes contendo 1% e 3% de papana, foi de 42 unidades
de atividade por grama de formulao gel de Carbopol 940, e de 26 unidades de
atividade por grama de formulao gel de Natrosol 250 HHR. O aumento da
atividade recuperada era esperado diante dos indcios de que a poro livre de
papana seria a responsvel por tal atividade, visto que, aumentando a quantidade
__________________________________________________________W|v________ 83
de enzima, o meio ficaria saturado, obtendo, assim, uma poro maior da protena
livre na suspenso.
Os parmetros de temperatura e umidade relativa do ar para os estudos de
estabilidade foram afixados como 4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, j que o
Brasil se encontra na Zona Climtica IV (quente e mida) (USP XXIX, 2006; SINGH,
1999a, 1999B). BRASIL (2005) recomenda que as cmaras climticas devam ser
requalificadas para umidade de 75% a partir da data de publicao da ResoluoRE n 1 (29 de julho de 2005), ficando a critrio dos pesquisadores reiniciar ou no
estes estudos. Os estudos de estabilidade desse trabalho foram mantidos com a
umidade relativa previamente determinada (70%).
A estabilidade da atividade proteoltica da papana matria-prima A e B, e da
frao de papana livre nas formulaes gis Pluronic F127 e Carbopol 940, foi
avaliada pelo mtodo validado de medida de atividade proteoltica e que demonstrou
ser adequado para os ensaios de estabilidade. As dosagens de atividade enzimtica
foram realizadas para as matrias-primas e formulaes estocadas a 4C, 30C/70%
UR e 40C/70% UR. Os resultados para as matrias-primas esto demonstrados na
Figura 14 e Tabelas 12 e 13. Os dados obtidos para as formulaes encontram-se
na Figura 17.
A perda de atividade proteoltica ocorreu mais acentuadamente nas
temperaturas de 30C/70% UR e 40C/70% UR, tanto para as matrias-primas,
quanto para as formulaes. Os dados da Figura 17 sugerem que, a 30C/70% UR,
a enzima na forma de matria-prima menos estvel que a papana adicionada s
formulaes. Esses resultados diferem daqueles obtidos por Borin (2003) para a
SOD, nos quais a matria-prima apresentou-se mais estvel que a enzima
adicionada formulao. Essa diferena pode ser devido ao fato de que a SOD
__________________________________________________________W|v________ 84
matria-prima estabilizada com polietilenoglicol. Comparando os resultados de
estabilidade para a papana matria-prima e em formulaes queles obtidos para a
SOD, notada a maior estabilidade da SOD, tanto em matria-prima, quanto em
formulaes. Isso confirma, mais uma vez, a importncia da estabilizao de
protenas para veiculao em formulaes.
Os estudos de estabilidade das formulaes contendo papana por avaliao
visual acompanham os resultados de perda de atividade, pois h o escurecimento
da formulao, que pode estar relacionado deteriorao da enzima com o tempo e
o aumento da temperatura, provavelmente devido a uma oxidao dos grupos
sulfidrila da papana (Figura 16). Isso se aplica tambm matria-prima pura, pois,
aps 30 dias estocada a 40C, o p escurece consideravelmente, e, aps 60 dias, o
p se liquefaz, liberando um odor caracterstico de enxofre, o que implica em
destruio das ligaes dissulfeto que a estabilizam enzima, como afirmaram Hwang
e Yvy (1951). A Figura 12 mostra o escurecimento da matria-prima papana a
40C, por um perodo de 30 dias.
Estudos esto sendo feitos para a estabilizao da molcula de papana de
diversas maneiras, como a reao com polietilenoglicol, por imobilizao, e at
mesmo por obteno de uma molcula mais estvel utilizando a tecnologia do DNA
recombinante (LEI et al., 2004; ZHUANG; BUTTERFIELD, 1992; WANG, 1999).
Os resultados dos estudos de estabilidade indicam que tanto a papana
matria-prima, quanto as formulaes adicionadas da enzima, foram estveis por 6
meses, armazenados a 4C, sendo o gel de Carbopol 940 o que proporcionou
maior estabilidade da enzima (Figura 16).
As diferentes formas como a papana pode ser usada para o desbridamento
de feridas de queimaduras, como o p, soluo aquosa e adicionada formulaes,
__________________________________________________________W|v________ 85
foram avaliadas quanto eficcia da sua ao proteoltica in vitro, quando aplicadas
topicamente.
O mtodo desenvolvido em nosso laboratrio teve como princpio a
capacidade da papana de hidrolisar protenas. A protena utilizada como substrato
foi a gelatina. Um gel de poliacrilamida contendo a gelatina foi desenvolvido baseado
em estudos de eletroforese, pois uma placa contendo apenas gel de gelatina no se
manteve fisicamente estvel, quando submetida s condies do ensaio (banhomaria a 37C). O princpio da colorao de protenas nos gis de eletroforese definiu
a forma de avaliao da ao proteoltica da enzima sobre o gel, ou seja, nos locais
onde a papana agisse, no seriam corados pelo Coomassie Brilliant Blue, que
capaz de complexar com protenas em quantidades de microgramas (VOET, 1995).
O tempo de durao do ensaio foi definido em testes preliminares, sendo
avaliados os tempos de 6, 12 e 24 horas, que so os tempos mdios de trocas de
curativos em hospitais e unidades bsicas de sade. O tempo de 6 horas foi
suficiente para a ao da papana, que no aumentou significativamente em 24
horas. Alm disso, o gel tende a ressecar-se a 37C por mais de 6 horas, sendo uma
limitao desse mtodo de anlise.
Os resultados mostraram que o mtodo permite a avaliao da ao
proteoltica da papana pura e veiculada em diferentes formulaes.
A figura 18 mostra que a formulao gel de Carbopol 940 contendo papana
foi mais eficaz do que a formulao gel de Pluronic F127, formulao
extempornea e o p. Nos dois ltimos casos, observou-se um maior ressecamento
do gel, o que explica sua menor eficcia, j que a papana necessita de gua para
degradar as protenas (KIMMEL; SMITH, 1970; NIIMAK et al., 1993).
__________________________________________________________W|v________ 86
Os gis contendo papana mostraram-se eficazes, porm os melhores
resultados foram obtidos com o gel de Carbopol 940. Esses resultados diferem
daqueles obtidos para o mtodo usando casena como substrato, que indicaram que
a atividades proteolticas recuperadas das duas formulaes so muito semelhantes.
Provavelmente, essa diferena acontece porque na hidrlise da casena, a reao
ocorre em um tempo de 10 minutos, e na avaliao da eficcia da ao tpica, em 6
horas, sugerindo que ocorre, alm da ao da papana livre, uma maior liberao da
enzima pelo gel de Carbopol 940, do que foi liberado pelo gel de Pluronic F127.
A maior interao desse gel com a papana pode ter ocorrido por ligaes de
hidrognio entre a protena e o polmero (FLORENCE; ATTWOOD, 2003),
principalmente porque a concentrao do Pluronic F127 na formulao (20%)
muito maior do que a concentrao do Carbopol 940 na outra formulao
(0,6%).Alm disso, observa-se que esse gel limitou-se ao local de aplicao,
enquanto que o gel de Pluronic F127 no teve o mesmo comportamento, j que
tem menor viscosidade que o primeiro.
As afirmaes de que os polmeros dos gis interagem com a papana e que
parte da atividade proteoltica recuperada seja devido quantidade de papana livre
nas formulaes, so mais fundamentadas a partir do teste de eficcia proteoltica in
vitro. Pode-se questionar, portanto, a utilizao de formulaes muito concentradas
de papana (3%, 4% e 8%), j que, para veicular a enzima nestas concentraes,
no ser possvel utilizar o Carbopol 940 a 0,6% e nem o Pluronic F127, que
perdem a estabilidade fsica, reduzindo a viscosidade do primeiro e formando
precipitado na formulao gel de PF-127. Para isso, a formulao deveria ter a
concentrao de Carbopol 940 aumentada, aumentando, assim, a probabilidade
__________________________________________________________W|v________ 87
de interao da protena com o polmero, e, apesar de a papana estar em maior
concentrao, no necessariamente a formulao ser mais eficaz.
O gel de Carbopol 940 demonstrou ser a forma farmacutica mais adequada
para a veiculao da papana. Formulaes gel desse polmero contendo diferentes
concentraes de papana so desenvolvidas e utilizadas no Hospital das Clnicas
de So Paulo (HCSP), em todos os seus institutos, para o tratamento de escaras de
decbito, principalmente, feridas e queimaduras. BORI (2006), afirma que o
consumo do gel de papana aumentou significativamente em 2006 no HCSP e que,
no servio de farmacovigilncia do Instituto do Corao (InCor) desse hospital, ainda
no recebeu nenhuma notificao de reao adversa a esse medicamento. Esse
relato indica que o uso de gel de Carbopol contendo papana eficaz e seguro.
Estudos de controle de qualidade e estabilidade microbiolgica das
formulaes devero ser realizados, a fim de avaliar a provvel ao antibacteriana
da papana e, assim, determinar a necessidade de adicionar conservantes s
formulaes.
O desenvolvimento de formulaes tpicas contendo papana importante
para a qualidade da assistncia ao paciente, seja no atendimento ambulatorial, seja
no hospitalar. A avaliao da qualidade das matrias-primas contendo papana
imprescindvel para determinao da concentrao da mesma nos produtos, a fim
de desenvolver um medicamento eficaz e seguro. Sendo assim, fabricantes de
produtos contendo essa enzima devem, tambm, qualificar seus fornecedores e, em
contrapartida, deveria haver discusses com os rgos de Vigilncia Sanitria, e,
principalmente, com a Anvisa (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria), acerca da
necessidade de constar nos laudos de controle de qualidade das matrias-primas o
teor de protenas.
__________________________________________________________W|v________ 88
Alm da melhoria da qualidade da assistncia ao paciente, o desenvolvimento
de formulaes contendo papana reduz os riscos ocupacionais que ocorrem,
comprovadamente, com a exposio ao p de papana, seja na aplicao do
mesmo, seja no preparo de pastas e solues extemporneas nas enfermarias, o
que pode ser evitado em uma estrutura adequada de manipulao e produo de
medicamentos, como as farmcias e indstrias (CHAMBERS et al., 1998; FL et al.,
2006; MAPP, 2001; NIINIMKI et al., 1993; QUIONES et al., 1999; SOTO-MERA et
al., 2000; VANDENPLAS; VANDEZANDE, 1996). Adicionalmente, a formulao
pronta facilitaria a prestao de servios pela equipe de sade, podendo ser
acondicionada em embalagens de uso individual, como bisnagas, favorecendo a
aplicao do produto e evitando erros de medicao, j que os riscos de erros na
preparao do medicamento extemporneo sero eliminados. A administrao de
uma formulao acondicionada em embalagem de uso nico tambm favorece o
paciente, evitando que a mesma seja contaminada. Outra vantagem da formulao
em relao soluo extempornea que, na aplicao das mesmas, a formulao
fica delimitada rea em que foi aplicada. O uso da embalagem do tipo bisnaga a
melhor opo, visto que no ser necessrio o uso de esptulas ou o contato da
mo de quem for administrar o medicamento com a ferida, minimizando a dor do
paciente e o risco de contaminao cruzada entre os pacientes.
Assim, a formulao gel de Carbopol 940 contendo papana, desenvolvida
durante este trabalho, mostrou ter estabilidade fsica e funcional (atividade
proteoltica), quando armazenada a 4oC, por um perodo de 6 meses. Alm disso, foi
a que apresentou maior eficcia proteoltica no teste in vitro de eficcia para uso
tpico. Dessa forma, esta formulao poder ser empregada para auxiliar no
processo de cicatrizao de feridas e queimaduras, nos diferentes nveis
__________________________________________________________W|v________ 89
assistenciais de sade (unidades bsicas de sade, clnicas e hospitais), com
garantia de eficcia, segurana, e qualidade de cada lote dos produtos, o que no
pode ser garantido quando preparaes extemporneas so empregadas.
__________________________________________________________Vvx________ 90
6. CONCLUSES
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
6.5.
6.6.
6.7.
6.8.
________________________________________________exyxv|t U|u|zy|vt________ 91
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS19
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