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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

HELAINE CARNEIRO CAPUCHO

Desenvolvimento de formulaes
tpicas contendo papana para o
tratamento de feridas

Ribeiro Preto
2007

UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS DE RIBEIRO PRETO

HELAINE CARNEIRO CAPUCHO

Desenvolvimento de formulaes tpicas contendo papana


para o tratamento de feridas

Ribeiro Preto
2007

HELAINE CARNEIRO CAPUCHO

Desenvolvimento de formulaes tpicas contendo papana


para o tratamento de feridas

Dissertao de mestrado apresentada


ao Programa de Ps-Graduao em
Cincias Farmacuticas da Faculdade
de Cincias Farmacuticas de Ribeiro
Preto da Universidade de So Paulo,
para a obteno do ttulo de mestre.

rea de Concentrao: Medicamentos e Cosmticos


Orientadora: Profa. Dra. Maria Jos Vieira Fonseca

Ribeiro Preto
2007

Capucho, Helaine Carneiro.


Desenvolvimento de formulaes contendo papana para
o tratamento de feridas / Helaine Carneiro Capucho;
orientadora: Profa Dra Maria Jos Vieira Fonseca. Ribeiro
Preto SP, 2007.
102 f.
Dissertao (Mestrado Programa de Ps-Graduao
em Cincias Farmacuticas. rea de concentrao:
Frmacos e Medicamentos) Faculdade de Cincias
Farmacuticas de Ribeiro Preto da Universidade de So
Paulo.
1. Desbridamento Queimaduras e feridas. 2. Papana
Atividade proteoltica.
3. Formulaes tpicas
Desenvolvimento.

Helaine Carneiro Capucho

Desenvolvimento de formulaes tpicas contendo


papana para o tratamento de feridas

Dissertao apresentada Faculdade de


Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto
da Universidade de So Paulo para
obteno do ttulo de mestre.
rea de concentrao: Frmacos e
Medicamentos

Trabalho apresentado e aprovado pela Banca Examinadora em ___/___/2007.

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Instituio: _________________________Assinatura:________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________


Instituio: _________________________Assinatura:________________________

Profa. Dra. Maria Jos Vieira Fonseca - Orientadora


Instituio: FCFRP USP

Assinatura:________________________

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Muitas pessoas estaro nestas pginas. Com toda certeza, tm os seus
crebros e coraes iluminados com alegria, pois todas contriburam para este
trabalho, cada uma sua maneira. No sei se saberei expressar toda a minha
gratido, e talvez tenha esquecido de citar algum, mas tenham certeza de que cada
um de vocs tem um lugar no meu corao e serei eternamente grata.

Deus, pela famlia maravilhosa que me deu, por ter colocado o Felipe na
minha vida, por permitir que sempre estivesse rodeada de boas pessoas, por ter me
guiado, permitindo que eu chegasse at aqui.
Aos meus guias espirituais e aos amigos do Centro Esprita Anjos da Guarda
(Santa Teresa-ES), pela assistncia, intuio, auxlio, oraes, que fortaleceram
minha alma, indicando os caminhos a seguir.
Ao meu pai, Jorge, que desde cedo me ensinou que o conhecimento a
nica coisa que nunca nos ser tirado. Obrigada por ser esse exemplo de vida, pelo
pai presente e maravilhoso que voc , pela dedicao que tem por ns, seus filhos.
No sei o que seria de mim sem voc.
Ao Felipe, meu noivo, com quem divido todos os momentos, pelo amor,
carinho, amizade, companheirismo, compreenso. Ao seu lado, nenhum obstculo
foi to grande que no pudesse ser transposto, nenhum momento foi to difcil que
no pudesse ser superado. Vivendo juntos, aprendemos que juntos queremos viver.
Obrigada por tudo, amor!
Liana, Mariana e Rodrigo, irmos que amo tanto, que sempre
compreenderam a minha ausncia, me apoiaram e, com seu amor, transmitiram

fora e um carinho sem igual, essenciais para a minha caminhada. Obrigada por
existirem!
minha me Luziana, que me educou e sempre me estimulou a estudar, meu
carinho e gratido eternos.
Tia Mad, presena constante nesses ltimos anos, que, mesmo a
quilmetros de distncia, me aconselhou, incentivou e me deu amor.
Aos meus primos Daniel, Ricardo, Lorena, Leonardo, Lohan, Vincius e
Nicole, turminha especial, que, com carinho, me auxiliaram a superar as saudades.
Aos meus avs Amlia, Maria e Jos, que, com suas oraes, fortaleceram
meu esprito e me ajudaram a superar as dificuldades. Amo vocs.
Dodora, minha sogra, e V Tina, pelas oraes e bons fluidos que enviam
sempre para ns.
Cidinha, que, com seu amor incondicional, me adotou como filha. No
tenho palavras para agradecer. No foi por acaso que nos encontramos nesta vida.
Liza, minha amiga-irm, que me deu fora nesta reta final, pela amizade,
pelas oraes e pelas boas risadas, que me ajudam a enfrentar os momentos mais
difceis.
Aos meus amigos da Turma MKT 12, pela fora e carinho. Vocs so
maravilhosos!
Sonia Cassiolato, que contribuiu muito para a minha formao profissional,
como farmacutica hospitalar que sou, e tambm pela grande amizade que
construmos. No sei como agradecer por tudo.
equipe da Farmcia UE, especialmente Carlos Alberto, Rosangela, Vera,
Malu e Miguel, que me ajudaram trocando plantes, apoiando e dizendo palavras
incentivadoras. Aos amigos que no esto mais l e que foram muito importantes
nesta etapa: Cristina, Douglas e Alessandro. Muito obrigada pela fora! Nunca
esquecerei vocs!
equipe do Centro Integrado da Qualidade, especialmente Fernanda e
Susana, que permitiram a adequao de horrios para que eu pudesse finalizar esse
trabalho.

Profa.

Dra.

Maria

Jos,

pela

orientao,

pelos

conhecimentos

compartilhados, e pela amizade. Essa etapa da minha vida foi fundamental para que
eu assumisse um novo papel na vida profissional. Isso s foi possvel pela
oportunidade que me deu, em conhecer a pesquisa cientfica e, mais que isso, pelo
exemplo de dedicao pesquisa que voc . Muito obrigada!
Profa. Dra. Vera, da Escola de Farmcia da UFOP, pela amizade, pela
ajuda e confiana, e porque fez despertar em mim o interesse pelo Controle de
Qualidade.
Profa. Maria Jos, da Escola de Farmcia da UFOP, pelo auxlio to
importante durante a minha formao na graduao e pela confiana que teve em
mim.
s Profa. Dra. Marilisa Guimares Lara e Profa. Dra. Carem Gledes Vargas
Rechia, que formaram a comisso julgadora da minha qualificao, pelas
orientaes, sugestes e discusses que foram muito importantes para a concluso
deste trabalho.
s companheiras de laboratrio Ana Luiza, Carlinha, Franciane, Rbia,
Viviane e Yris, que me apoiaram, pela convivncia sempre alto astral. Agradeo
especialmente Fabiana e Sandra, que contriburam muito para o meu trabalho
com seus conhecimentos, e tambm foram essenciais me apoiando, estimulando, e
proporcionando momentos de grande alegria, tornando-se amigas para a vida toda.
Ftima, pela colaborao constante na confeco deste trabalho e
discusses to enriquecedoras.
Aos tcnicos do laboratrio, Jos Roberto Jabor e Luiz Henrique Cenzi, pela
ajuda durante os experimentos e pela amizade.
Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto da Universidade
de So Paulo e aos professores desta faculdade, pelos conhecimentos
compartilhados e pelos bons momentos.
Aos funcionrios da seo de ps-graduao, Ana, Carlos, Eleni e Rosana,
pelos auxlios e boa convivncia.
Zanini, Curtis Ltda e Special Pharma, pela doao de material para o
desenvolvimento do trabalho.

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SUMRIO

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................

LISTA DE QUADROS.............................................................................................

iii

LISTA DE TABELAS...............................................................................................

iv

LISTA DE SIGLAS E SMBOLOS ..........................................................................

vi

RESUMO................................................................................................................

vii

ABSTRACT.............................................................................................................

viii

1. INTRODUO................................................................................................... 1
PAPANA: UMA PROTENA DE USO FARMACUTICO....................................... 1
1.1. Caracterizao da papana..............................................................................

1.2. Aplicaes da Papana....................................................................................

1.3. Estabilidade das protenas em formulaes....................................................

14

2. OBJETIVOS......................................................................................................

28

A. OBJETIVO GERAL............................................................................................. 28
B. OBJETIVOS ESPECFICOS..............................................................................

29

3. MATERIAL E MTODOS.................................................................................. 30
3.1.

Material........................................................................................................

30

3.1.1. Reagentes.....................................................................................................

30

3.1.2. Equipamentos...............................................................................................

30

3.2.

Mtodos......................................................................................................

32

3.2.1. Preparo das solues me das papanas.....................................................

32

3.2.2. Avaliao da atividade proteoltica da papana pela hidrlise do substrato


casena......................................................................................................... 32
3.2.3. Validao do mtodo de medida de atividade proteoltica............................ 34
3.2.3.1. Linearidade/Faixa.....................................................................................

34

3.2.3.2. Preciso e exatido intra e inter ensaio.................................................... 35

3.2.3.3. Limites de deteco e quantificao........................................................

36

3.2.4. Caracterizao qumica, fsica e da atividade proteoltica das matriasprimas papana............................................................................................. 37


3.2.4.1.

Determinao da quantidade de protena pelo Mtodo


Lowry..........................................................................................

de
37

3.2.4.2. Avaliao da atividade proteoltica das matrias-primas papana, por


hidrlise do substrato casena.................................................................. 37
3.2.4.3. Anlise eletrofortica em condies dissociantes das matrias-primas
papana..................................................................................................... 38
3.2.4.3.1. Procedimento eletrofortico..................................................................

38

3.2.4.3.1.a.Colorao do gel de poliacrilamida para deteco de protenas..........


39
3.2.4.3.2. Determinao das massas moleculares relativas das bandas
proticas................................................................................................ 40
3.2.5. Estudo da estabilidade da atividade proteoltica da matria-prima papana
frente a diferentes condies de temperatura e umidade............................ 40
3.2.6. Preparao de formulaes tpicas do tipo gel contendo papana..............

41

3.2.6.1. Formulao gel de Pluronic F127.......................................................

41

3.2.6.2. Formulao gel de Carbopol 940........................................................ 42


3.2.6.3. Formulao gel de Natrosol HHR.......................................................

43

3.2.7. Avaliao prvia da estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade


proteoltica das formulaes........................................................................ 44
3.2.7.1. Avaliao visual........................................................................................

45

3.2.7.2. Determinao do pH.................................................................................

45

3.2.8. Avaliao da atividade proteoltica das formulaes estveis......................

45

3.2.9. Uniformidade de contedo da atividade proteoltica nas formulaes.......... 46


3.2.10. Estudos de estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica..

46

3.2.10.1. Estabilidade fsico-qumica das formulaes estocadas.......................... 47


3.2.10.2. Estabilidade da atividade proteoltica da papana incorporada s
formulaes............................................................................................ 47
3.2.10.3. Avaliao da eficcia da papana para uso tpico in vitro.......................

48

4. RESULTADOS...................................................................................................

49

4.1. Mtodo de medida da atividade proteoltica da papana padro/Validao


do mtodo........................................................................................................ 49
4.1.1. Medida da atividade proteoltica/Curva de Calibrao.................................. 49
4.1.2. Preciso e exatido intra e interensaio.........................................................

51

4.1.3. Determinao dos limites de deteco e quantificao................................

54

4.2. Caracterizao fsica, qumica e da atividade proteoltica da papana nas


matrias-primas............................................................................................... 55
4.3. Anlise eletrofortica em condies dissociantes da papana padro Sigma
e das matrias-primas papana dos fabricantes A e B....................................

58

4.4. Estudo da estabilidade da atividade proteoltica das matrias-primas


papana armazenada em diferentes condies de temperatura e umidade.... 60
4.5. Preparo e avaliao fsica, fsico-qumica, da atividade proteoltica das
formulaes contendo papana e avaliao in vitro da eficcia da ao 64
proteoltica da papana nas formulaes.........................................................
4.5.1. Avaliao fsica e fsico-qumica das formulaes........................................ 64
4.5.2. Avaliao da atividade proteoltca................................................................

65

4.5.2.1. Interferncia dos componentes das formulaes na medida da


absorvncia em 280 nm........................................................................... 65
4.5.2.2. Dosagem de atividade proteoltica das formulaes.................................

66

4.5.2.3. Avaliao da uniformidade de contedo de atividade proteoltica das


formulaes.............................................................................................. 67
4.5.3. Estudo da estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica
das formulaes com e sem a matria-prima papana A............................. 68
4.5.4. Avaliao in vitro da eficcia da ao proteoltica da papana em
formulaes tpicas.................................................................................... 73
5. DISCUSSO.......................................................................................................

74

6. CONCLUSES...................................................................................................

90

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS......................................................................

91

_______________________________________________________|t wx Y|zt________
LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Configurao tridimensional da papana, na qual esto


representados os dois domnios da cadeia principal e o stio cataltico ao
meio.................................................................................................................

Figura 2 - (A) Papana: resduos do stio cataltico (Cis 25 e His 159); (B)
Configurao tridimensional da papana.........................................................

Figura 3 - Esquema bi-dimensional da ligao de um substrato ao stio


ativo da Papana..............................................................................................

Figura 4 - Esquema da formao de agregados da Papana........................

18

Figura 5 - Estrutura qumica dos poloxmeros...............................................

25

Figura 6 - Variao da absorvncia a 280 nm por minuto de reao em


funo da concentrao de papana no meio reacional (em
microgramas/mL).............................................................................................

33

Figura 7 - Esquema da montagem do gel para avaliao da eficcia in vitro


da papana para uso tpico.............................................................................

48

Figura 8a - Curva representativa do aumento da absorvncia a 280 nm por


minuto de reao em funo da concentrao de papana (g/mL) no meio
reacional..........................................................................................................

50

Figura 8b - Relao linear entre aumento da absorvncia em 280 nm em


funo da concentrao de papana (g/mL) no meio reacional.....................

50

Figura 9 - Representao grfica do aumento da absorvncia por minuto


de reao em funo da concentrao de protena para as matrias-primas
papana dos fabricantes A e B e das duas matrias-primas ..........................

57

Figura 10 - Anlise eletrofortica em placa de gel de poliacrilamida com


SDS, da papana padro sigma, da papana matria-prima A, da papana
matria-prima B e da mistura de padres proticos de MMr...........................

59

Figura 11 - Relao linear entre o logartimo das MMr dos padres


proticos e as respectivas mobilidades eletroforticas (Rf).............................

59

Figura 12 - Aspecto visual da matria-prima papana A armazenada a


40C/ 70% UR, nos tempos zero, 15 e 30 dias de armazenamento...............

60

Figura 13 - Medida do aumento de absorvncia por minuto de reao em


funo da concentrao de papana A e papana B no meio reacional
(g/mL), armazenadas a 4C, 30C-70%UR e 40C-70%UR, nos tempos
zero, 15 e 30 dias............................................................................................

62

_______________________________________________________|t wx Y|zt________

Figura 14 - Interferncia dos componentes das formulaes na medida da


absorvncia em 280 nm...................................................................................

65

Figura 15 - Avaliao visual das formulaes gis de Pluronic F127 e


Carbopol 940 contendo 1% de papana A, submetidas a diferentes
condies de armazenamento, nos tempos zero, 15, 30 e 60 dias.................

69

Figura 16 - Medida da atividade proteoltica (U) da papana na matriaprima A e veiculada nas formulaes gis de Pluronic F127 e de
Carbopol 940 em funo do tempo, armazenados a 4C, 30C/70%UR e
40C/70%UR....................................................................................................

71

Figura 17 - Avaliao in vitro da eficcia da ao proteoltica da papana


em formulaes tpicas pela degradao da gelatina adicionada a gel de
poliacrilamida...................................................................................................

73

ii

______________________________________________________|t wx dtw________
LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Componentes dos gis de concentrao e separao para a


eletroforese em condies dissociantes. .......................................................... 38
Quadro 2 - Componentes utilizados no preparo das formulaes de
Poloxamer 407 (Pluronic F127) contendo papana...................................... 41
Quadro 3 - Componentes utilizados no preparo das formulaes de
Carboximetilcelulose (Carbopol 940).............................................................. 42
Quadro 4 - Componentes utilizados no preparo das formulaes com
Hidroxietilcelulose (Natrosol 250 HHR)...........................................................

43

Quadro 5 - Componentes do gel para os estudos de eficcia in vitro...............

48

iii

_______________________________________________________|t wx gtuxt________
LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Resultados da anlise de regresso linear dos dados da curva


obtida pela relao entre o aumento da absorvncia por minuto de reao
(280 nm) em funo da concentrao de papana (g/mL) no meio reacional 50
Tabela 2- Determinao da repetibilidade do mtodo de medida da atividade
proteoltica da papana, empregando a casena como substrato (3
concentraes com 10 rplicas)...................................................................... 52
Tabela 3- Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da
atividade proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 8,34 g/mL de papana, com 5 rplicas................................. 52
Tabela 4- Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da
atividade proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 11,12 g/mL de papana, com 5 rplicas............................... 53
Tabela 5- Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da
atividade proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 13,90 g/mL de papana, com 5 rplicas............................... 53
Tabela 6- Determinao da exatido intraensaio (n=10) e interensaio (n=5)
do mtodo de medida da atividade proteoltica da papana, empregando a
casena como substrato, para trs concentraes de papana......................... 54
Tabela 7- Valores de preciso e exatido intra e interensaio calculados para
o limite de quantificao determinado experimentalmente pelo mtodo de
medida da atividade proteoltica da papana, utilizando a casena como
substrato............................................................................................................ 55
Tabela 8- Medida da concentrao de protena total nas matrias-primas
papana comercializadas pelos fabricantes A e B............................................. 56
Tabela 9- Medida do aumento da absorvncia por minuto de reao em
funo da concentrao de protena (g/mL), no meio reacional, para
matrias-primas dos fabricantes A e B............................................................. 56
Tabela 10- Medidas de atividade proteoltica em unidades de atividade
proteoltica (U) da papana dos fabricantes A e B, por microgramas de
protena e miligramas de matria-prima............................................................ 58
Tabela 11- Massa molecular relativa (MMr) obtida para os componentes
proticos detectados para as diferentes amostras de papana........................ 61
Tabela 12- Medida da atividade proteoltica em unidade de atividade (U) por
miligrama da matria-prima A, armazenada a 4C, 30C/70%UR e
40C/70%UR, em diferentes tempos................................................................ 63

iv

_______________________________________________________|t wx gtuxt________

Tabela 13- Medida da atividade proteoltica em unidade de atividade (U) por


miligrama da matria-prima B, armazenada a 4C, 30C/70%UR e
40C/70%UR, em diferentes tempos................................................................ 63
Tabela 14- pH das formulaes preparadas com 1% de papana A................

64

Tabela 15- Quantidade de unidade de atividade proteoltica extrada de 1


grama das formulaes.................................................................................... 66
Tabela 16- Recuperao da atividade proteoltica adicionada s formulaes 66
Tabela 17- Uniformidade do contedo de atividade proteoltica das
formulaes gel Pluronic F127 e de Carbopol 940...................................... 67
Tabela 18- Determinao dos valores de pH das formulaes gis de
Pluronic F127 e Carbopol 940 durante o perodo de armazenamento a
4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR.................................................................. 70

______________________________________________|t wx Tux|tt xf|zt ________

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

cm (1 x 10-2 m)..............................

centmetros

mm (1 x 10-3 m).............................

milmetros

L (1 x 10-3 m3) litros


mL (1 x 10-3 L)..

mililitros

mM (1 x 10-3 mol x L-1). milimolar


M (1 x mol x L-1)

molar

g (1 x 10-3 Kg)..

grama

mg (1 x 10-6 Kg)... miligrama


g (1 x 10-9 Kg).............................

micrograma

p/p.................................................. peso/peso
p/v..................................................

peso/volume

q.s.p. .............................................

quantidade suficiente para

rpm................................................. rotao por minuto


C................................................... graus Celsius
EDTA.............................................

cido etilenodiaminotetractico (cido edtico)

HCl................................................

cido clordrico

NaOH............................................. Hidrxido de Sdio


SDS...............................................

Dodecil sulfato de sdio (lauril sulfato)

TEMED..........................................

N, N, N, N, tetrametiletilenodiamina

Tris................................................. Tris(hidroximetil)amino-metanohidrocloreto
TCA................................................ cido Tricloractico
UV.................................................. Ultra - violeta

vi

______________________________________________________________ex______ vii
RESUMO

CAPUCHO, H.C. Desenvolvimento de formulaes tpicas contendo papana


para o tratamento de feridas. 2007. 102 f. Dissertao (Mestrado) Faculdade de
Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Ribeiro
Preto, 2007.

O presente trabalho avaliou, por medida de contedo protico, anlise


eletrofortica, por determinao da atividade proteoltica e verificao da
estabilidade dessa atividade, matrias-primas papana de dois fabricantes.
Formulaes gis de Carbopol 940, Natrosol 250 HHR e Pluronic F127,
contendo matria-prima papana a 1%, foram desenvolvidas e avaliadas quanto
estabilidade e a eficcia in vitro da atividade proteoltica. Os estudos de estabilidade
foram conduzidos por medida da atividade proteoltica da papana, utilizando a
casena como substrato, em amostras armazenadas sob diferentes condies de
temperatura e umidade. A eficcia da ao proteoltica in vitro foi avaliada em gel de
poliacrilamida, contendo gelatina como substrato. A matria-prima do fabricante B
apresentou maior contedo protico e maior atividade proteoltica do que a matriaprima do fabricante A. Ambas matrias-primas demonstraram estabilidade da
atividade funcional, quando armazenadas a 4C, por um perodo de 6 meses.
Quando armazenadas a 30C/70%UR e a 40C/70%UR, houve perda acentuada
dessa atividade. A medida da atividade proteoltica das formulaes, aps 48 horas
de sua preparao, mostrou que apenas 8% da atividade funcional total foi
detectada. Este resultado pode indicar interao entre a papana e os componentes
das formulaes, levando a uma perda da atividade proteoltica, ou uma reduo da
velocidade da reao enzimtica. Os estudos da estabilidade da atividade funcional
mostraram que ambas formulaes foram estveis, quando armazenadas a 4C, por
6 meses. Entretanto, quando armazenadas a 30C/70%UR e a 40C/70%UR, foi
observada rpida reduo da atividade proteoltica, em funo do tempo de
armazenamento. A avaliao da atividade proteoltica das formulaes em gel de
poliacrilamida, adicionado de gelatina como substrato, aps 6 horas de incubao a
37C, demonstrou que a formulao gel de Carbopol 940 foi a mais eficaz, at
mesmo superior formulao extempornea de matria-prima papana 1%, em
soluo aquosa. Este resultado evidencia que esse polmero foi o mais adequado
para veicular a papana. Alm disso, foi o que apresentou maior eficcia proteoltica
no teste in vitro. Dessa forma, esta formulao poder ser empregada para auxiliar o
processo de cicatrizao de feridas e queimaduras, nos diferentes nveis
assistenciais de sade, com garantia de eficcia, segurana e qualidade.

Palavras-chave: papana, atividade proteoltica, estabilidade, feridas.

______________________________________________________________Tutv______ viii
ABSTRACT

CAPUCHO, H.C. Development of topical formulations containing papain to


wounds treatment. 2007. 102 f. Dissertation (Master) Faculdade de Cincias
Farmacuticas de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, 2007.

The present work evaluated by content of protein measurement,


electrophoresis, proteolytic activity determination and verification of this activity
stability, raw materials of papain obtained from two manufacturers. Gel formulations
of Carbopol 940, Natrosol 250 HHR and Pluronic F127, and containing 1% of
papain, were developed and evaluated with regard to stability and in vitro efficacy of
proteolytic activity. The stability studies were conducted by papain proteolytic activity
measurement, using casein as substrate and the samples were stored under
different conditions of temperature and humidity. The in vitro efficacy of proteolytic
activity was evaluated using polyacrylamide gel containing gelatin as substrate. The
raw material obtained from manufacturer B showed higher content of protein and
higher proteolytic activity than the one from manufacturer A. Both raw materials
showed functional stability when stored at 4C during 6 months. When stored at
30C/70% RH and at 40C/70% RH, there was significant loss of these activities. The
measure of formulations proteolytic activity, after 48 hours from its preparation,
showed that only 8% of the total activity was detected. This result might indicate
possible interactions between papain and formulation components, which lead to a
loss in the proteolytic activity or a reduction in the speed of enzymatic reaction. The
functional stability studies showed that all formulations were stable when stored at
4C during 6 months. However, when stored at 30C/70%RH and 40C/70%RH, it
was observed fast decrease in the proteolytic activity as a function of storage time.
The evaluation of formulations proteolytic activity in polyacrylamide gel, added with
gelatin as substrate, after 6 hours of incubation at 37C, showed that Carbopol 940
gel formulation was the most efficient, being also better than the formulation recently
prepared with 1% of papain raw material in aqueous solution. This result
demonstrates that this polymer was the most adequate to be incorporated with
papain. Besides this, it was the one that showed higher proteolytic efficacy in the in
vitro test. Then, this formulation might be employed to help in the wound and burns
cicatrisation process, in the different levels of health assistance, with efficacy,
security and quality guarantee.

Keywords: papain, proteolytic activity, stability, wounds.

___________________________________________________________\w______

1. INTRODUO E REVISO BIBLIOGRFICA:

ctttM t xt wx yttv|v
1.1. Caracterizao da papana

Uma variedade de plantas produz endopeptidases como parte do seu


metabolismo protico. O ltex do fruto verde do Carica papaya Linne, por exemplo,
contm uma mistura de cistenas endopeptidases, como a papana (EC 3.4.22.2), as
quimopapanas A e B (EC 3.4.22.6), a endopeptidase papaia III, a endopeptidase
papaia IV e, acredita-se que, uma outra designada como endopeptidase
(MORAES; TERMIGNONI; SALAS, 1994).
Carica papaya L. intensamente cultivada nas regies do trpico e
subtrpico, por possuir frutos comestveis e enzimas estocadas em seus veios de
ltex. Os veios de ltex esto arranjados em todas as partes areas da planta,
formando uma densa rede de estruturas articuladas. Danos s folhas da planta do
papaia,

inevitavelmente,

rompem

os

veios

de

ltex,

liberando-o

(ROTH;

CLAUNSITZER, 1972).
O ltex do papaia um fluido tixotrpico, com uma aparncia leitosa, que
contm cerca de 15% de matria seca. Quarenta por cento dessa matria
constitudo por enzimas, principalmente cistenas endopeptidases, que, somadas,
correspondem a mais de 80% da frao total de enzimas (AZARKAN et al., 2003).
As endopeptidases do papaia constituem um perigo em potencial para a
planta. Entretanto, esto presentes nos veios do ltex como pr-formas inativas que,

___________________________________________________________\w______

rapidamente, so convertidas em enzimas ativas, depois da liberao do ltex pela


planta (SILVA et al., 1997; MOUTIM et al., 1999).
Embora a papana (EC 3.4.22.2) seja o menor constituinte (cerca de 8%)
dentre as endopeptidases do mamo, foi a mais facilmente purificada. O interesse
pela papana foi estimulado pela observao de que o cianeto exercia um efeito de
ativao sobre a enzima. O estudo deste efeito culminou com a idia acerca da
importncia dos grupos tiis na ao enzimtica, como, tambm, possibilitou o
desenvolvimento do conhecimento a respeito da especificidade das proteinases
(MITCHEL; CHAIKEN; SMITH, 1970).
A papana foi cristalizada a partir do ltex fresco por Balls, Lineweaver e
Thompson, em 1937. Este processo foi melhorado, em escala preparativa, por Balls
e Lineweaver (1939), porm no foi intensamente usado devido escassez e ao alto
custo do ltex fresco (MONETTA, 1987; ROGENSKI et al., 1995). O princpio ativo
proveniente do ltex das folhas e frutos do mamo verde adulto do Carica papaya
Linne (famlia Caricaceae), foi primeiramente denominado de carnicina e, em 1876,
Peckolt isolou esse princpio ativo e o denominou de papaiotina. Entretanto, coube
a Wutz, em 1880, empregar a denominao papana (HWANG; IVY, 1951;
KLASEN, 2000; MONETTA, 1987).
Kimmel e Smith (1957) obtiveram a papana cristalina do ltex seco, de forma
rpida e econmica, em bom nvel de pureza, por modificao do procedimento
descrito por Balls e Lineweaver (1939). Outras propriedades da papana foram
determinadas, como a baixa massa molecular e a baixa estabilidade enzimtica, sob
condies

extremas,

que

permitiram,

em

1970,

caracteriz-la

cintica

estruturalmente. A papana uma tiol proteinase constituda de uma nica cadeia


polipeptdica contendo 212 resduos de aminocidos, com uma massa molecular de

___________________________________________________________\w______

23400 Daltons e um ponto isoeltrico de 9,5 (SANGEETHA; ABRAHAM, 2006).


Estudos bioqumicos e biofsicos, tais como cristalografia de raio-x, mapa de
densidade eletrnica e seqncia de aminocidos, e extensivos estudos cinticos
tm permitido a elucidao da sua estrutura funcional.
A molcula da papana consiste de uma cadeia polipeptdica simples. Light et
al. (1964, apud ARNON, 1970)1 foram os primeiros a reportar a seqncia de
aminocidos dessa enzima, descrevendo a indicao da posio das ligaes
dissulfetos na molcula, bem como do grupo sulfidrila ativo. A estrutura cristalina
tridimensional da papana indica que a cadeia polipeptdica dobrada em dois
domnios de tamanhos semelhantes, mas com conformaes completamente
diferentes, formando uma fenda sobre a superfcie da enzima, onde est localizado
o seu stio ativo (Figura 1) (FERHST, 1980; KAMPHUIS et al., 1984; NAEEM;
FATIMA; KHAN, 2006). Os resduos de aminocidos cistena na posio 25 (Cis 25),
histidina na posio 159 (His 159) e asparagina (Asn 175) na posio 175 esto
localizados na superfcie dessa fenda entre os dois domnios da molcula. O grupo
sulfidrlico est localizado na posio Cis 25, enquanto que os outros seis resduos
de cistena formam trs ligaes dissulfeto (SZAB et al., 2006).
A conformao estrutural da papana estabilizada por essas ligaes
dissulfeto que, uma vez destrudas, levam reduo da atividade biolgica,
cataltica e imunolgica da enzima (ZHUANG; BUTTERFIELD, 1991). A papana
cliva, preferencialmente, ligaes peptdicas envolvendo aminocidos bsicos e,
tambm, possui atividade estersica.

_______________

LIGHT, A.; FRATER, R.; KIMMEL, J.R.; SMITH, E.L.. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.. v. 52, p. 1276, 1964.

___________________________________________________________\w______

Figura 1 - Configurao tridimensional da papana, na qual


esto representados os dois domnios da cadeia
principal (em verde) e o stio cataltico ao meio (em
azul). (UNIVERSITY OF RONINGEN2)

Na papana, a parte da cadeia em que se localiza a Cis 25 e His 159 o stio


ativo da enzima (Figura 2), e a interao entre esses aminocidos responsvel
pelo mecanismo cataltico sobre o substrato (Figura 3) (BROCKELEHURST, 1990;
GOLAN et al., 2000). Os autores Sangeetha e Abraham (2006), entretanto, afirmam
que o centro cataltico da enzima formado por uma trade composta pelos resduos
de aminocidos Cis 25, His 159 e Asn 175.

_______________

UNIVERSITY OF RONINGEN, pesquisa realizada em 16/05/2006.


http://www.rug.nl/scheikunde/onderzoek/programmas/proteinCrystallography/gallery/index?lang=en

___________________________________________________________\w______
(A)

(B)

Figura 2 (A) Papana: resduos do stio cataltico (Cis 25 e His 159). (TURK,B.; TURK,V.;
TURK,D., 19973).
(B) Configurao tridimensional da papana, na qual est representada a
Cistena 25, do stio ativo da papana. (UNIVERSIT FRANOIS RABELAIS4)

Figura 3 - Esquema bi-dimensional da ligao de um substrato ao stio ativo


da Papana. (TURK,B.; TURK,V.; TURK,D., 19975).

_______________
3,5

TURK,B.; TURK,V.; TURK,D.. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their
protein inhibitors. Biol. Chem. v. 378, p. 141-150.1997.
4
UNIVERSIT FRANOIS RABELAIS, pesquisa realizada em 15/05/2006.
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/Images/pap.jpeg

___________________________________________________________\w______

As enzimas da classe da cistena, na qual a papana est includa, formam


uma ligao covalente tioster entre um grupamento acila do substrato e o
grupamento sulfidrlico de um resduo especfico de cistena, no stio ativo da enzima
(LEHNINGER, 2000). A papana uma enzima que requer esse grupo sulfidrila livre
para a sua ao cataltica. A ativao pode ser conseguida com a adio de um
agente redutor como a cistena, sulfitos, ciamida, cianeto de hidrognio, glutationa
reduzida e tioglicolato. A inativao dessa protena, por sua vez, pode acontecer na
presena de ar, cidos concentrados, aumento de temperatura, e acelerada pela
presena de metais pesados. Um meio contendo cistena e EDTA tem sido usado
como

padro

para

ativao

da

papana

para

evitar

sua

inativao,

respectivamente (KIMMEL; SMITH, 1954; ARNON, 1970; MONETTA, 1988; MERCK


INDEX, 1996; USP XXIX, 2006).
A papana destaca-se por sua especificidade relativa a protenas e substratos
de baixa massa molecular. Pesquisas demonstraram que a maioria das ligaes
peptdicas hidrolisada com intensidade variada pela papana, sendo as mais
suscetveis aquelas formadas por grupos -amino substitudo (KIMMEL; SMITH,
1954).
A papana purificada encontrada sob a forma de um p higroscpico, de
colorao variando desde o branco at o amarelado. Apresenta-se, comercialmente,
diluda com lactose ou outros diluentes (MERCK INDEX, 1996; USP XXIX, 2006).
Solvel em gua, a papana origina soluo incolor ou amarelada, pouco
opalescente. praticamente insolvel em lcool, clorofrmio e ter. Uma soluo a
2% (p/v) de papana tem pH entre 4,8 a 6,2 (USP XXIX, 2006).

___________________________________________________________\w______

1.2. Aplicaes da Papana

A papana, devido sua atividade, tem aplicao em diversas indstrias, na


medicina, na odontologia e como ferramenta em pesquisas.
Na indstria de alimentos utilizada na fabricao de queijos e biscoitos,
como amaciante de carne e clareador de cervejas (BERSIN, 1957; CHAMBERS et
al., 1998; MARTINDALE, 2005; MONETTA, 1987; PARK et al., 1980; SAID; PIETRO,
2004; SASMITO; DEMEESTER; BRACKE, 1982). Na produo de detergentes a
papana adicionada para aumentar o poder de limpeza pela degradao hidroltica
de protenas presentes em manchas de sangue, ovo, chocolate, entre outras. Na
industrializao do couro, a papana empregada no processo de remoo dos
plos e amaciamento do couro, agindo na degradao do colgeno (SASMITO;
DEMEESTER; BRACKE, 1982).
Na indstria cosmtica, a papana um potente ingrediente ativo adicionado
s preparaes esfoliantes, devido sua capacidade de hidrolisar ligaes
peptdicas de colgeno e queratina no estrato crneo da pele, removendo, assim, os
debris celulares da epiderme (NIINIMAK et al., 1993). A aplicao da papana foi
estudada por Traversa (2003) como agente depilatrio, e j est sendo utilizada para
peeling (SANTOS, 2001), alm do uso associado a alfa-hidroxicidos e ao cido
acetilsaliclico no tratamento de rugas, flacidez e ressecamento da pele (OZLEN,
1996). No mercado existem produtos contendo papana combinada com outras
substncias, tais como uria e clorofila. Essa preparao est sendo comercializada
com o nome de Panafil (KLASEN, 2000). Alm dessa, h a Accuzime, adicionada
de papana e uria, e o produto italiano NouriFusion, contendo papana e as
vitaminas A, C e E.

___________________________________________________________\w______

LOPES (2003) menciona que a enzima segura e eficaz quando utilizada


como promotor de absoro cutneo. Um possvel mecanismo de ao da papana
no estrato crneo poderia ser a competio entre a papana e a transglutaminase,
responsvel pela formao do envelope cornificado ao redor dos cornecitos.
Na odontologia, a papana est sendo incorporada formulao gel para
remoo qumica da crie, principalmente para aplicao na odontopediatria. No
comrcio existe o produto Papacrie, que promove a remoo do tecido cariado e
infectado, preservando, ao mximo, os tecidos sadios adjacentes do dente, sem
ocasionar qualquer dano aos tecidos da boca (SILVA, 2005). Duarte et al. (2001)
defendem a utilizao da papana na odontologia como agente tpico irrigador em
tratamento de canais. Outra utilizao da enzima na remoo do trtaro, pelo
amolecimento do mesmo e diminuindo, assim, o desconforto do procedimento
(DAVANO, 2004).
A indstria farmacutica tem explorado as propriedades proteolticas da
papana, principalmente em medicamentos de usos oral e tpico. Os medicamentos
de uso oral contendo papana so comercializados como digestivos, auxiliando na
degradao das protenas da dieta, como o Filogaster, contendo pancreatina,
diastase e papana (DEF, 2002; WALSH; HEADON, 1994). Tem sido estudado,
ainda, o uso oral dessa enzima na preveno de aderncias intrabdominais psoperatrias, por se tratar de um agente fibrinoltico (HELFEBREKERS et al., 2000),
no tratamento da mucosite, como antiinflamatrio (MALHOTRA; VARMA, 2002), no
tratamento de infeces de vsceras, atuando como promotor de absoro de
antibiticos (BOCK et al., 1998; GUGGI; BERNKOP-SCHNRCH, 2005; ROGENSKI
et al., 1995).

___________________________________________________________\w______

A maior parte das aplicaes clnicas da papana de uso tpico objetiva o


desbridamento de feridas e de queimaduras, de modo a acelerar o processo de
cicatrizao dessas leses.
O desbridamento com proteases tem sido proposto para uma rpida remoo,
no traumtica, do material protico no desejvel das leses, apresentando a
vantagem de oferecer poucos riscos ao paciente (AYELLO; CUDDIGAN, 2004;
LAIDET; LETOUNEUR, 1993; MONETTA, 1990).
A retirada de tecidos desvitalizados de fundamental importncia na
cicatrizao de feridas e queimaduras, pois a maior ameaa para o paciente a
presena de tecido invivel que abriga, aquece e estimula a proliferao de
microrganismos, os quais retardam a regenerao do tecido e podem determinar
sepse invasiva (PELLON, 1995; OZCAN et al., 2002).
Embora a reparao tecidual seja um processo sistmico, necessrio
favorecer as condies locais por terapia tpica.
O uso de enzimas exgenas para o desbridamento de feridas pode acelerar a
limpeza e o processo de cicatrizao. Isso diminui o tempo de hospitalizao e a
necessidade de interveno cirrgica (TIRAS et al., 2005). Mandelbaum S., Santis e
Mandelbam M. (2003) indicam a papana em todas as fases do processo de
cicatrizao, sejam feridas secas ou exsudativas, colonizadas ou infectadas, com ou
sem reas de necrose.
A papana promove o alinhamento das fibras que compem o colgeno,
proporcionando o crescimento uniforme do tecido, resultando em uma cicatriz mais
plana (MONETTA, 1990; SANCHEZ NETO, 1991). Masini e Calano (1986) afirmam
que isso acontece porque a papana neutraliza as interaes entre os aminocidos
aglomerados em forma espiralar e que se dispem aleatoriamente, intervindo na

___________________________________________________________\w______ 10
ruptura dessas ligaes, fazendo com que os aminocidos se disponham em
cadeias lineares, evitando, assim, a formao de quelides, que um aglomerado
aleatrio de fibras que formam o tecido conjuntivo.
Flindt (1978) sugere que a papana aja apenas no tecido lesado, devido
ausncia de uma anti-protease plasmtica, a 1-anti-tripsina, que impede a ao
proteoltica da enzima em tecidos sadios.
Otuka, Pedrazzani e Pioto (1996) afirmaram que solues extemporneas de
papana so de grande auxlio no tratamento da lcera plantar, acelerando ou
evoluindo o processo de cicatrizao. Leses, contendo ou no tecido necrosado,
cicatrizam mais rapidamente utilizando a papana, como o caso de lceras
diabticas, de presso ou venosas (MEKKES, 1997; METRIONE, 1981; MONETTA,
1987, 1990, 1992; UDOD; STOROJUK, 1981, apud SANCHEZ NETO, 19916).
Rocha, Gurjo, Brito Junior (2005) e Sanchez Neto (1991), ressaltam que as feridas
tratadas com a enzima apresentam maior nmero de fibroblastos e que a matriz
colgena organizada, o que muito importante na fora de tenso e integridade
local da reparao.
No tratamento de queimaduras, tambm tem sido utilizado enzimas
proteolticas e, dentre elas, a papana, que demonstrou bons resultados na
cicatrizao deste tipo de ferimento, incluindo pacientes com as chamadas
queimaduras eltricas (FERREIRA, 2003; KLASEN, 2000; MASINI; CALAMO, 1986;
ZCAN, 2002; PIEPER; CALIRI, 2003). Com o uso de uma soluo contendo 0,2%
da enzima em reas feridas, Udod e Storojuk7 (1981 apud SANCHEZ NETO, 1991)
observaram que a papana abreviou o tempo de limpeza das feridas e das massas
necrticas, facilitando a liquefao e retirada de secreo purulenta em todos os
_______________

6,7

UDOD, V.M.; STOROJUK, V.T.. Use of papain in treating suppurative portoperative soft tissue complications
and diseases. Khirurgiia, Moskou. V. 5, p. 99-101. 1981.

___________________________________________________________\w______ 11
pacientes, ativando os processos de regenerao e encurtando o perodo de
cicatrizao. Alm disso, constataram uma reao inflamatria menos intensa, com
reduo do edema.
A papana demonstra ter diversas vantagens sobre os outros agentes tpicos
empregados: fcil aplicao, nica em cada dia de tratamento para a maioria dos
pacientes, o que facilita os cuidados da enfermagem; bem tolerada por crianas,
que so as maiores vtimas de queimaduras; alm da vantagem econmica, em
virtude do seu baixo custo (PIEPER; CALIRI, 2003; SERRA, 1995; STARLEY, 1999).
Entretanto, a maior vantagem desde o incio do uso tpico da papana em
queimaduras que, mesmo em queimaduras mais densas, o desbridamento
cirrgico raramente necessrio (STARLEY, 1999). A papana se enquadra no
conceito de desbridamento ideal de Rosemberg et al. (2004), pois um agente
tpico que propicia resultados rpidos, seguro e desbrida tecidos necrticos com
pouco ou nenhum dano ao tecido sadio.
A papana pode ser adquirida como uma preparao magistral, sendo utilizada
em p ou pasta. Na forma de p deve ser preparada imediatamente antes da
realizao do curativo em concentraes que variam de acordo com a caracterstica
da ferida (BLANES, 2004). Concentraes diferentes de papana, para cada fase de
uma leso tecidual, so importantes para a obteno de um resultado final
satisfatrio com a cicatrizao e reepitelizao da rea lesada (ROCHA; GURJO;
BRITO Junior, 2005). Alm disso, gel de papana a 3% utilizado para o prtratamento das feridas (desbridamento qumico), antes de serem administrados
alguns medicamentos (GODOY; PRADO, 2005).
Vrias so as formas farmacuticas utilizadas para o auxlio da cicatrizao de
leses da pele, como soluo contendo papana de 2% a 5% (KLASEN, 2000) e gel,

___________________________________________________________\w______ 12
de 1% a 4% (PIEPER; CALIRI, 2003). H hospitais que utilizam papana em forma
de p e gel, como o caso do Hospital Santa Marcelina, localizado na zona norte de
So Paulo, que utiliza o gel nas concentraes de 2%, 4%, 6% e 8% (HOSPITAL
SANTA MARCELINA, 2005), e do Hospital do Servidor Pblico Estadual, tambm de
So Paulo, que utiliza o p de papana para o desbridamento qumico, que
aplicado em necrose preta ou amarela por 15 minutos, lavando com soro e, em
seguida, aplicando o gel de papana. O gel utilizado o Carboximetilcelulose (CMC)
a 2%, 4%, 6% e 10%. Lobo8 afirma que utilizada a papana por sua ao
bactericida e bacteriosttica,

ao antiinflamatria, por auxiliar acelerando a

angiognese e a migrao dos fibroblastos para o local, contribuindo para um


processo de cicatrizao mais rpido. O gel a 2% utilizado em tecido de
granulao tipo 2 e 4, o gel a 6% utilizado em esfacelo e trocado a cada 12
horas, e o 10 % utilizado em necrose seca. A Prefeitura de Londrina (Paran)
possui em sua relao de medicamentos, distribudos populao, o gel creme
contendo papana a 4% (LONDRINA, 2005).
A aplicao da papana em queimaduras feita na forma do p diretamente na
leso, p misturado com gel, gua estril ou soluo salina (PIEPER; CALIRI, 2003),
e at mesmo em misturas mais complexas, como a de trietanolamina, cido olico,
cido esterico e leo mineral (KLASEN, 2000).
Atualmente, na regio de Ribeiro Preto, o uso da papana bastante
difundido, seja na forma de p puro ou em preparaes extemporneas com gua
para injeo, seja veiculada em cremes, pomadas ou gis. Grandes farmcias de
manipulao de Ribeiro Preto produzem essas formulaes para hospitais do
municpio e regio, para asilos, entidades que cuidam de pessoas deficientes e de
_______________

Informao fornecida por Lobo, em So Paulo, 2007.

___________________________________________________________\w______ 13
famlias carentes (informao verbal)9,10,11. As formulaes, geralmente contendo de
1% a 4% de papana, so comercializadas, principalmente, para o tratamento e
preveno de escaras, mas tambm no auxlio da cicatrizao de feridas crnicas,
como as do p diabtico, infectadas ou no, alm de queimaduras de pequena
extenso (informao verbal)12,13.
Em algumas prefeituras da regio, so feitos curativos em pacientes das
unidades bsicas de sade com gel contendo papana. Os curativos so feitos nos
casos de escaras, ferimentos com a cicatrizao comprometida e em pacientes com
p diabtico. Ribeiro (2006) afirma que a cicatrizao dos ferimentos alcanada
com xito (informao verbal)14.
O Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto da
Universidade de So Paulo (HCFMRP/USP) referncia na regio no tratamento de
queimaduras, possuindo uma unidade para o tratamento de pacientes queimados
localizada na Unidade de Emergncia (U.E.) desse hospital. O primeiro uso da
papana nessa unidade foi pela utilizao de mamo verde ralado, na dcada de 80.
Esse uso foi descontinuado pelas dificuldades de encontrar e preparar o mamo
verde, alm de no ser uma aplicao assptica, condio necessria para o
tratamento desse tipo de leso. A comercializao da papana em p permitiu,
ento, a substituio do mamo ralado, sendo aplicado diretamente nas
queimaduras. Utilizava-se a papana nos casos de necrose em queimaduras de 2
grau profundo e com presena de fibrina. Ferreira (2006) afirma que havia melhora
desses ferimentos. Hoje no usada a enzima na Unidade de Queimados do

_______________

Informao fornecida por Gallo, em Ribeiro Preto, 2006.


Informao fornecida por Silva, em Ribeiro Preto, 2006.
11
Informao fornecida por Oliveira, em Ribeiro Preto, 2006.
12
Informao fornecida por Seixas, em Ribeiro Preto, 2006.
13
Informao fornecida por Santos Junior, em Ribeiro Preto, 2006.
14
Informao fornecida por Ribeiro, em Ribeiro Preto, 2006.
10

___________________________________________________________\w______ 14
HCFMRP/USP, porm h o interesse no estudo de novas formulaes com
princpios ativos naturais e menos onerosos, pois os medicamentos utilizados esto
entrando em desuso e o hospital est encontrando dificuldades em substitu-los
(informao verbal)15, e, ainda, h a inteno de testar a papana e padroniz-la
nesse hospital para a preveno de escaras (informao verbal)16.
Apesar de ser proposto o uso da papana em diversas formulaes, h
poucos estudos que controlam as condies sob as quais esses produtos devem ser
utilizados (PIEPER; CALIRI, 2003).

1.3. Estabilidade das protenas em formulaes

transformao

ocorrida

na

produo

de

medicamentos

com

desenvolvimento da indstria farmacutica aps a Segunda Guerra Mundial,


acarretou grandes mudanas sob o ponto de vista da estabilidade dos produtos
farmacuticos (EV, 2001).
O termo estabilidade, em relao forma farmacutica, refere-se
integridade qumica e fsica da unidade dosada e, quando apropriado, habilidade
da forma farmacutica em manter a proteo contra a contaminao microbiolgica
(USP XXIX, 2006). Os estudos de estabilidade so necessrios a todos os produtos
farmacuticos, para que a pureza, inocuidade, potncia e eficcia de um produto
sejam garantidos at o momento de sua utilizao (CARVALHO et al., 2005). Esses
estudos constituem parte integrante do desenvolvimento de formas farmacuticas e

_______________

15
16

Informao fornecida por Ferreira, em Ribeiro Preto, 2006.


Informao fornecida por Cassiolato, em Ribeiro Preto, 2006.

___________________________________________________________\w______ 15
fornecem indicaes sobre o comportamento do produto frente a condies
ambientais a que possa ser submetido, em determinado intervalo de tempo. As
informaes geradas so utilizadas na determinao do prazo de validade dos
frmacos e produtos, alm das recomendaes de armazenamento dos mesmos
(SINGH, 1999a).
Os parmetros de estabilidade de um medicamento podem ser influenciados
pelas condies ambientes de armazenamento (temperatura, luminosidade,
oxignio, e umidade), bem como pelos componentes da embalagem (DAGAR, 1990;
USP XXIX, 2006). A temperatura um dos principais fatores causadores da
instabilidade dos frmacos e produtos farmacuticos, pois pode fornecer energia
para acelerar as reaes qumicas de degradao.
As protenas so mais suscetveis instabilidade fsica e qumica, quando
comparada aos frmacos tradicionais, devido sua complexa estrutura molecular.
Todas as molculas proticas so formadas por cadeias heterogneas no
ramificadas de aminocidos, que se denominam estrutura primria. As cadeias
polipeptdicas sofrem um processo qumico de dobramento que envolve o arranjo
espacial de aminocidos (AAs) prximos entre si, na seqncia primria de AAs,
formando a estrutura secundria. A estrutura terciria formada pelo arranjamento
de aminocidos distantes entre si na cadeia polipetdica e a estrutura quaternria
pelo arranjamento espacial de mais de uma cadeia de AAs, as subunidades da
molcula.
A seqncia especfica de AAs na estrutura primria e o meio ambiente so o
que determinam o processo de dobramento. O nmero de possveis conformaes
de uma cadeia polipeptdica dobrada cerca de 1080 (JAENICKE, 1991). A
conformao tridimensional de uma protena um estado flutuante de um nmero

___________________________________________________________\w______ 16
limitado de conformaes preferenciais (TANG; DILL, 1998). A conformao mais
estvel de uma protena o seu estado nativo, que detm a sua atividade biolgica.
Muitas foras esto envolvidas no dobramento de protenas incluindo
interaes hidrofbicas, que so interaes repulsivas entre gua e resduos no
polares em protenas, levando a uma hidratao mnima na poro hidrofbica, e
interaes intermoleculares ou foras de Van der Waals (on-dipolo, dipolo-dipolo,
disperso e ligaes de hidrognio). A ligao de hidrognio a mais intensa de
todas as foras intermoleculares. Dentre as foras envolvidas no dobramento das
protenas, a aparentemente predominante a interao hidrofbica.
A protena na forma dobrada, adequada para exercer sua funo biolgica
(configurao funcional, estado nativo), no estvel por tempo indeterminado. As
protenas podem sofrer um processo de desnaturao, devido a alteraes qumicas
ou fsicas da estrutura molecular, proporcionando mudanas conformacionais, que
podem conduzir a uma perda da atividade biolgica.
Assim, um dos maiores problemas para a utilizao de protenas como
princpio ativo em produtos farmacuticos a sua instabilidade fsica e qumica.
A instabilidade fsica de protenas envolve mudanas na estrutura secundria,
terciria ou quaternria da molcula, por processos de desnaturao, agregao,
precipitao e adsoro em superfcie, que podem levar perda ou reduo da
atividade biolgica, reduo da solubilidade e alterao da imunogenicidade
(BURGESS, 1993).
A agregao o mais importante evento para a instabilidade fsica.
Evidncias recentes sugerem que a agregao pode ocorrer por interao especfica
de certas conformaes intermedirias de protenas, e no por agregao no
especfica. As protenas agregam-se para minimizar interaes no favorveis

___________________________________________________________\w______ 17
termodinamicamente, entre solventes e resduos hidrofbicos de protenas (WANG,
1999).
A interao hidrofbica, a resistncia de exposio de grupos polares gua,
considerada a maior fora diretriz para agregao e dobramento de protenas. A
agregao e o dobramento de protenas representam um balano entre exposio e
acobertamento de reas superficiais hidrofbicas. O balano to delicado que a
mudana de um aminocido na protena pode alterar substancialmente seu
comportamento de agregao (FIELDS et al., 1992).
Vrios fatores fsicos, como temperatura, fora inica, agitao, adsoro
superfcie/interface, exposio luz, podem induzir a agregao de protenas. O
fator de crescimento do queratincito humano recombinante, por exemplo, sofre leve
desdobramento em temperatura elevada, levando a imediata agregao e
precipitao (CHEN et al., 1994). A agregao protica pode ser tambm devido
degradao ou modificao qumica com subseqente exposio de superfcies
hidrofbicas (ENGLAND, 1998). Protenas podem formar diretamente agregados
covalentes, como a insulina, a papana e outras protenas (KLIBANOV; SCHEFILITI,
2004; STRICKLEY, ANDERSON, 1997). Ligaes dissulfeto contribuem para a
formao de estruturas tercirias e a estabilizao de estruturas secundrias
(TAKANO et al., 1988). Troca de ligaes dissulfeto possvel em ligaes cistenacistena, levando a agregao da macromolcula (Figura 4).
A formao de agregados covalentes pode ocorrer indiretamente, depois da
oxidao de resduos de histidina e metionina, como observado para relaxina
humana (LI et al., 1995). Os agregados proticos usualmente possuem atividade
biolgica reduzida ou so isentos de atividade (CONSTANTINO; LANGER;
KLIBANOV, 1994; WEERT et al., 2002).

___________________________________________________________\w______ 18

Figura 4 - Esquema da formao de agregados da Papana.


(TURK,B.; TURK,V.; TURK,D., 1997)17.

As interaes das protenas com o SDS so muito estudadas na


desnaturao de protenas, principalmente no seu uso em eletroforese SDS-PAGE.
A interao entre o SDS e a papana bem conhecida. O agregado formado pela
papana e o SDS resulta em cargas negativas na extenso da cadeia polipeptdica,
causando a desnaturao da protena. Existe a probabilidade de que, na regio
desnaturada, as pores hidrofbicas da cadeia peptdica da enzima se liguem aos
agregados de protenas e SDS, formando pequenas micelas que estabilizam os
grupos de agregao, e formam um invlucro em torno desses grupos. Esse modelo
dos agregados de papana e SDS chamado de colar de contas (GHOSH, 2005).
Muitos frmacos proticos so inativados por muitas reaes qumicas, cujo
mecanismos incluem deaminao, racemizao, hidrlise, oxidao, quebra e
formao de ligaes dissulfeto, isomerizao, succinimidao, ligaes cruzadas
no dissulfeto, deglicosilao e por reao de Maillard (JAENICKE, 2000; LAI;
TOPP, 1999). A grande variedade de grupos funcionais presentes nas protenas

_______________
17

TURK,B.; TURK,V.; TURK,D.. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their
protein inhibitors. Biol. Chem. v. 378, p. 141-150.1997.

___________________________________________________________\w______ 19
amplificam o nmero de processos qumicos que podem ocorrer (CONSTANTINO;
LANGER; KLIBANOV, 1994). Fatores tais como pH, fora inica, composio de
tampo, outros excipientes, luz, oxignio atmosfrico, ons metlicos e temperatura
podem afetar o mecanismo de degradao (CLELAND; POWEL; SHIRE, 1994;
FLORENCE; ATTWOOD, 2003).
A estrutura primria de uma protena pode indicar como a molcula ser
degradada. A deaminao, degradao da cadeia lateral amida dos aminocidos
glutamina e asparagina, parece ser o processo de instabilidade qumica mais
comum em protenas farmacuticas. A deaminao pode ser reduzida em pH abaixo
da neutralidade. A estabilidade mxima de resduos de asparagina em peptdeos e
protenas encontrada entre pH 2-5, e, em pH 5-12, a reao ocorre rapidamente
(WANG, 1999).
Cadeias laterais de triptofano, metionina e cistena, e, em menor extenso,
tirosina e histidina, so stios potenciais de oxidao, e a oxidao significativa em
pH neutro e alcalino. Metionina, em particular, propenso oxidao por oxignio
atmosfrico (MANNING; PATEL; BORCHARDT, 1989). A oxidao destes stios
pode ser catalisada por ons metlicos (processo stio-especfico) ou aumentado por
oxidantes ou exposio luz (processo stio no-especfico). Os stios mais
facilmente oxidveis so os grupo tiis, presentes nos aminocidos metionina e
cistena. A fcil oxidao de resduos de metionina ocorre porque ela um dos
resduos mais flexveis em protenas, sendo levemente polar ou no polar
(RICHARDS, 1997).
O pH da formulao pode afetar a velocidade de oxidao por mudar o
potencial de oxidao dos oxidantes, por alterar a afinidade da ligao entre ons

___________________________________________________________\w______ 20
metais catalticos e os aminocidos ionizveis, e por interferir na instabilidade de
intermedirios da oxidao.
O triptofano um dos resduos de aminocidos em protenas mais
fotossensveis, enquanto a ligao lisina-treonina indica a susceptibilidade
clivagem induzida pelo cobre. A hidrlise da ligao peptdica possvel nas
ligaes asparagina-prolina e asparagina-tirosina, sugerindo que estas seqncias
so cido-lbeis (INGLIS, 1983).
A estabilidade de protenas o resultado do balano entre foras
estabilizantes e desestabilizantes. Fatores como temperatura, pH da formulao,
adsoro, sais, ons metlicos, agentes quelantes, agitao, agentes desnaturantes,
solventes no aquosos, fonte e pureza de protenas, morfismo protico e alta
presso podem romper este delicado mecanismo.
O mais importante fator que afeta a estabilidade a temperatura.
Infelizmente, no h mecanismo geral para descrever o efeito da temperatura sobre
a estrutura e funo de protenas, devido sua complexa estrutura. Em geral, maior
temperatura leva a menor estabilidade de protenas.

Quando a temperatura

aumenta, interaes eletrostticas no so muito afetadas, ligaes de hidrognio


tornam-se fracas e as interaes hidrofbicas so fortemente afetadas, at a
temperatura de cerca de 110C, quando a gua no solvata grupos no polares em
protenas (JAENICKE, 1990). Temperatura tambm acelera degradao qumica,
como o aumento da hidrlise de resduos de asparagina, deaminao de resduos
de asparagina ou glutamina em RNase A e lisozimas (KINSELLA, 1991).
Protenas so frequentemente estveis em uma estreita faixa de pH, tais
como pH 6,5-7,0 para fator recombinante VIII, pH 6,0-7,0 para uroquinase de baixa
massa molecular (URKEJAN, 1994) e 7,0-8,0 para a papana (MARTIN, 1957;

___________________________________________________________\w______ 21
CALVERY, 1933). Em pHs extremos, longe do ponto isoeltrico (pI) de protenas,
aumentam repulses eletrostticas entre cargas iguais, resultando em uma
tendncia de desdobramento (DILL, 1990). O pH da formulao pode afetar a
estabilidade fsica e qumica das protenas. Diferentes degradaes qumicas podem
ser facilitadas em diferentes pHs. Isso explica porque produtos de degradao so
diferentes em diferentes pHs para a mesma protena (GIETZ et al., 1998). Sob
condies bsicas, muitas reaes podem ocorrer, tais como hidrlise de ligaes
peptdicas, deaminao, hidrlise de arginina a ornitina, -eliminao, racemizao e
formao de dupla ligao.
Desenvolvimento de protenas farmacuticas tem mostrado ser desafiante
pela complexidade de produo e purificao, e pela limitada estabilidade qumica e
fsica delas. A instabilidade desse frmaco uma das maiores razes pelas quais as
protenas so tradicionalmente administradas atravs de injees e no por via oral,
como os frmacos quimicamente menores (SANCHEZ-RUIZ; MAKATDZE, 2001;
WANG, 1996).
A aplicao tpica de macromolculas indicada quando sua ao ser
superficial, como no caso da papana, pois, devido ao seu tamanho molecular, no
possvel a penetrao atravs do estrato crneo.
A natureza hidroflica e o grande tamanho molecular das protenas versus o
carter lipoflico do estrato crneo so as maiores barreiras na aceitabilidade da
epiderme como um stio potencial de liberao e ao de protenas farmacuticas. A
aplicao de produtos biofarmacuticos pele est restrita a uma ao bem
superficial, como a ao de desbridamento da papana sobre queimaduras e feridas.
Muitas macromolculas possuem tempo de meia vida relativamente curto em
meio aquoso, que pode conduzir a pobre biodisponibilidade e uma pobre

___________________________________________________________\w______ 22
estabilidade do produto final. Para melhorar a biodisponibilidade e a estabilidade, as
protenas podem ser veiculadas em injees oleosas, produtos de liberao
sustentada, sistema de liberao particulado, implantes ou disperses (emulses e
gis). Esses tipos de formas farmacuticas possuem a vantagem de melhorar a
estabilidade frente a uma formulao aquosa. Assim, a estabilidade de protenas
pode ser aumentada pela excluso de gua do produto ou pela adio de
excipientes estabilizantes.
Para o desenvolvimento de produtos biotecnolgicos alguns componentes
como sais, ons metlicos, polilcoois, tesoativos, agentes redutores e agentes
quelantes, outras protenas, aminocidos, cidos graxos, polmeros e fosfolipdeos,
podem melhorar a estabilidade de polipeptdeos e protenas.
Tensoativos aninicos e no inicos so frequentemente adicionados para
estabilizar macromolculas, por prevenirem a adsoro de protenas s superfcies,
e porque reduzem a agregao induzida pela agitao e a precipitao (BAM;
RANDOLPH; CLELAND, 1995). Alguns estudos tm investigado o efeito da
concentrao de tensoativos sobre a agregao de protenas, sugerindo que a ao
protetora coincide com a concentrao micelar mnima para tensotaivo. Estes dados
suportam a teoria da formao de uma monocamada na interface gua-ar, como
sendo o mecanismo de ao (WANG; JOHNSTONE, 1993). Entretanto, altas
concentraes de tensoativos podem desestabilizar a macromolcula (KATAKAM;
BELL; BANGA, 1995).
A dificuldade de se obter frmulas farmacuticas e cosmticas estveis
contendo protenas leva pesquisadores a buscarem a modificao da sua estrutura,
a sua imobilizao, o controle da ao, como o sistema desenvolvido por Weert et
al. (2002), que utilizou um polmero de poli-orto-ster para encapsulao de protena

___________________________________________________________\w______ 23
semi-slida. Esses tipos de estudos tambm tm sido realizados com a papana e
demonstram que, geralmente, h aumento da sua estabilidade, porm nem sempre
a atividade maior do que quando comparada papana livre em meio aquoso
(KHAPARDE; SINGHAL, 2001; MIYAMOTO, 2004; SIM et al., 2000; VICENTE;
AIRES-BARROS; EMPIS, 1994). Essas pesquisas so importantes para que se
consiga o aumento da estabilidade da papana em sistemas bifsicos, os mais
utilizados em cosmetologia, j que h indcios de que a tenso interfacial nesses
sistemas desestabiliza essa proteinase (FAN et al., 2001). Alm disso, a associao
com outros compostos como a uria, esto sendo testados a fim de aumentar a
estabilidade da papana em formulaes (EDWIN; SHARMA; JAGANNADHAM,
2002).
Estudos na modificao dos grupos de aminocidos da enzima para uso em
meio alcalino tm mostrado o aumento das propriedades catalticas e na resistncia
inativao trmica e autoltica (SANGEETHA; ABRAHAM, 2006). J os solventes
orgnicos diminuem a atividade da papana (SZABELSKI; STACHOWIAK; WICZK,
2001).
As mudanas, fsicas ou qumicas, podem resultar em perda da atividade
biolgica, podendo ocorrer gradualmente durante o armazenamento da formulao,
fato que tem limitado a vida de

prateleira de produtos farmacuticos contendo

protenas (BURGESS, 1993; SANCHEZ-RUIZ; MAKHATADZE, 2001).


Para desenvolver formulaes estveis contendo protenas necessrio o
maior conhecimento das interaes delas com os vrios componentes de uma
formulao, e os efeitos na sua estabilidade (BAM; RANDOLPH; CHELAND, 1995).
Assim, estudos de estabilidade em condies aceleradas esto sendo usados como

___________________________________________________________\w______ 24
ferramentas para essa avaliao de formulaes com protenas (DI MAMBRO;
BORIN; FONSECA, 2003).
Uma alternativa para as formulaes de uso tpico contendo papana a
forma farmacutica gel, que uma disperso coloidal predominantemente hidroflica
(FARMACOPIA BRASILEIRA, 2003), empregando polmeros inertes, qumica e
fisicamente estveis (EXCIPIENTES, 1998), o que pode minimizar as interaes
hidrofbicas com a protena.
Os gis possuem penetrao pequena, pois no tm afinidade pelo sebo
cutneo, formando uma pelcula aps a evaporao da gua, o que mantm os
ativos sobre a pele (MOSQUEIRA, 1996). O uso de gis em produtos tpicos tem
sido estabelecido no comrcio de cosmticos e tratamento pessoal. O interesse no
uso farmacutico foi despertado pelo esforo em reduzir a exposio dos frmacos
aos sistemas que os veiculam. Diversos antiinflamatrios no esteroidais esto
sendo incorporados em gis para terapia tpica. Esses produtos, contendo
carbmeros ou poloxmeros

como formadores de gel, tm demonstrado

proporcionar adequados nveis dos frmacos no tecido onde foram aplicados (ZATZ;
KUSHIA, 1996).
O Carbopol 940, que um polmero sinttico derivado do cido poliacrlico,
forma gis de alta viscosidade e com boa aparncia, mas sensveis a variaes do
pH do meio. Esse polmero utilizado como agente formador de gel em sistemas
aquosos, agente regulador da viscosidade e estabilizador de emulses. O Natrosol
HHR

250,

polmero

no

inico

derivado

da

celulose,

apresenta

maior

compatibilidade com o pH do meio e com a presena de eletrlitos, embora ocorra


maior risco de contaminao microbiolgica. O Natrosol HHR 250 utilizado

___________________________________________________________\w______ 25
tambm como agente regulador da viscosidade, estabilizador de emulso,
espessante, formador de filmes e ligante (MERCK Index., 1996; TRAVERSA, 2003).
Os poloxmeros so usados em formulaes farmacuticas como tensoativos,
agentes emulsionantes, agentes solubilizadores, agentes dispersivos e promotores
de absoro in vivo.
Os poloxmeros so polmeros sintticos formados por trs blocos poli(oxietileno)-poli(oxipropileno)-poli(oxietileno) (PEO PPO PEO). Todos os
poloxmeros possuem estruturas qumicas semelhantes, diferenciando-se pela
massa molecular e a composio do bloco de PEO hidroflico (x) e do bloco PPO
hidrofbico (y) (Figura 5). Os dois poloxmeros mais comumente utilizados so o
poloxmero 188 (x=80, y=27) com massa molecular variando entre 7680 a 9510 Da,
e o poloxmero 407 (x=101, y=56), que possui massa molecular variando entre 9840
a 14600 Daltons (ENGLAND, 1998; MAO et al., 2004).

Figura 5 Estrutura qumica dos poloxmeros. (PHARMTECH)18.

O poloxamer 407 (Pluronic F127 ou PF-127) mais solvel em gua fria que
em quente, o que se tem atribudo s extensas ligaes de hidrognio entre as
molculas de gua e os tomos de oxignio do ter do polmero (FLORENCE;
ATTWOOD, 2003). O decrscimo na solubilidade, com o aumento da temperatura,
___________
18

PHARMTECH, pesquisa realizada em 15/05/2006.


http://www.pharmtech.uni-erlangen.de/wahlpflichfach/Mayer_06.pdf

___________________________________________________________\w______ 26
devido menor hidratao a altas temperaturas, causado pela quebra das ligaes
de hidrognio. A baixa toxicidade dos poloxmeros e sua capacidade de formar gis
claros em meio aquoso torna-os teis, particularmente em formulaes de uso tpico
(SAKASHITA et al., 1995). O PF-127 tem sido particularmente interessante pelo fato
desse polmero ser uma soluo, em baixas temperaturas, e forma gel, em
temperaturas fisiolgicas (37C) (FANG et al., 2002; OH et al.,2005; ZATZ; KUSHIA,
1996). Em solues aquosas, com o aumento da temperatura, os poloxmeros se
agregam em micelas para minimizar a energia livre da soluo. Essa propriedade da
reverso trmica do PF-127 exibida em concentraes entre 20-35% (CABANA;
AIT-KADI; JUHSZ, 1997; MORISHITA et al., 2001).
Uma importante caracterstica do PF-127 o aumento da estabilidade de
protenas veiculadas dentro da matriz do gel, prevenindo adsoro de protenas em
superfcies e tambm por sua habilidade em inibir a agregao, precipitao e
desnaturao das protenas (BAM; RANDOLPH; CLELAND; 1995; ENGLAND, 1998;
MORISHITA et al., 2001; RAICHE; PULEO, 2003). O gel de PF-127 forma duas
regies anfiflicas distintas depois da hidratao. A partio dos frmacos entre
esses dois segmentos da cadeia do polmero conhecida por influenciar a difuso e
a liberao dos frmacos a partir dos gis de PF-127. Tem sido relatado que a
incorporao de aditivos hidroflicos em formulaes com gel de PF-127 acelera a
liberao dos frmacos. Por outro lado, substncias pouco hidroflicas diminuem a
taxa de liberao do frmaco a partir do gel (MORISHITA et al., 2001).
Hidrogis preparados a partir de polmeros esto sendo empregados como
veculos modernos no uso tpico de vrios frmacos. Os gis de Carbopol 940 e
Pluronic F-127 em formulaes tpicas apresentam baixa reao de sensibilidade,
isto , reduzido aparecimento de eritema quando comparado a outros veculos de

___________________________________________________________\w______ 27
frmacos para utilizao na pele (FANG et al., 2002). Por comparao com outros
poloxmeros, o PF-127 notavelmente menos txico quando administrado tanto por
via intravenosa, quanto pela intramuscular (BOHORQUEZ et al., 1999; RAICHE;
PULEO, 2003). Essas caractersticas so desejveis para o uso em feridas e
queimaduras, sendo o PF-127 uma alternativa atraente para o uso nesse tipo de
leso. Alm disso, o fato de a formulao com o gel de PF-127 ser lquida a 5C,
favorece a aplicao do medicamento e a minimiza a dor do paciente, visto que no
ser necessrio o contato das mos para a administrao do gel, podendo,
perfeitamente, ser utilizado na forma de spray.
Devido ao uso difundido da papana no Brasil, e aos poucos estudos sobre a
estabilidade das formulaes e matrias-primas comercializadas contendo essa
enzima, tornam-se necessrios o desenvolvimento de formulaes estveis e o
estudo da estabilidade das mesmas.

___________________________________________________________bu}x|________ 28
2. OBJETIVOS

A. OBJETIVO GERAL:

Esse trabalho teve por objetivo a caracterizao fsica, fsico-qumica e a


avaliao da estabilidade da papana matria-prima de diferentes procedncias,
a preparao e a avaliao fsica, fsico-qumica, da estabilidade da atividade
proteoltica de formulaes em gel contendo papana e de sua eficcia para uso
tpico in vitro.

B. OBJETIVOS ESPECFICOS:

Padronizao e validao do mtodo analtico para medida da atividade


proteoltica da papana e das formulaes adicionadas da enzima;

Anlise eletrofortica da papana em gel de poliacrilamida, em condies


no-dissociantes;

Avaliao

da

estabilidade

da

atividade

proteoltica

da

papana

comercializada para uso farmacutico e cosmtico armazenada em


diferentes condies de temperatura e umidade;

Desenvolvimento de formulaes tpicas, do tipo gel, estveis, para


incorporar a papana;

___________________________________________________________bu}x|________ 29

Avaliao a estabilidade fsica dessas formulaes e a estabilidade da


atividade proteoltica frente a diferentes condies de temperatura e
umidade;

Avaliao da eficcia das formulaes consideradas estveis para uso


tpico in vitro.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 30
3. MATERIAL E MTODOS

3.1.

Material:

3.1.1. Reagentes:

Foram utilizados reagentes de grau analtico em todas as anlises realizadas. A


papana utilizada como padro foi a da Sigma, extrada e purificada do ltex do
mamo verde Carica papaya L. (E.C. 3.4.22.2). Para o preparo das formulaes
foram utilizados reagentes de grau farmacutico. As matrias-primas papana foram
adquiridas dos fabricantes A e B. O polmero Pluronic F127 utilizado para o
desenvolvimento de um dos gis e o Nipaguard, foram gentilmente doados pela
Zanini, Curtis & CIA LTDA e pela Special Farma, respectivamente.

3.1.2. Equipamentos:

Agitador magntico MAG-MULTI, MARTE


Agitador de emulses FISATOM 713D
Balana Analtica AG204 DeltaRange, Mettler Toledo
Balana eletrnica - Modelo AS 2000C - MARTE
Banho de gua com temperatura controlada - Banho Maria 100, FANEM
Banho de gua com temperatura controlada -180 series WATER BATH PRECISION
Bomba a vcuo Fabbe Primar mod. 141

______________________________________________________`tx|t x `w______ 31
Centrfuga Excelsa Baby I modelo 206-R, potncia 440 Watts - Fanem
Destilador de gua - Quimis Q 341 - 210
Espectrofotmetro CE-1021 - 1000 Series - CECIL
Fonte eltrica para eletroforese - modelo F.E. 1000
Incubadora BOD MA 415 Marconi
Liofilizador
pH metro - DMPH-2 Digimed
Sistema de eletroforese

______________________________________________________`tx|t x `w______ 32
3.2. Mtodos:

3.2.1. Preparo das solues-me das papanas:

Solues-me da papana matria-prima e padro foram preparadas no


momento do experimento, a fim de evitar a perda de atividade enzimtica. Amostras
de 50 mg da papana, foram pesados e solubilizados em 50,0 mL de gua destilada,
em balo volumtrico. As solues tiveram concentrao final de 1 mg/mL.

3.2.2. Avaliao da atividade proteoltica da papana:

A avaliao da atividade proteoltica da papana matria-prima, papana padro


(Sigma) ou da papana adicionada s formulaes na forma de gel foi realizada
usando a casena como substrato. Solues me das papanas, matria-prima e
padro, foram preparadas. Em tubos de ensaio de 10,0 mL foram adicionados
volumes crescentes das solues-me (0,1 mL a 0,8 mL). Em seguida, foram
acrescentados 0,2 mL de uma soluo ativadora, constituda por 0,05 M de cistena,
0,02 M de EDTA, ajustada para pH 8,0 com NaOH 0,1 M. O volume de cada tubo foi
completado para 1,0 mL com soluo tampo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0.

Em

intervalos de 1 minuto entre cada tubo, 1,0 mL de soluo de casena 1% (p/v) foi
adicionado. Aps agitao, os tubos permaneceram em repouso por 10 minutos em
banho de gua a 37C. Alquotas de 3,0 mL de soluo de cido tricloractico 10%
(p/v) foram adicionadas aos tubos, que permaneceram em repouso por 15 minutos,
temperatura ambiente, para interromper a reao enzimtica e precipitar a

______________________________________________________`tx|t x `w______ 33
protena ntegra. Em seguida, todos os tubos foram centrifugados a uma rotao de
3000 rpm (1660g) por 10 minutos, em centrfuga Excelsa Baby I modelo 206-R,
potncia 440 Watts, Fanem. Assim, a frao sobrenadante resultante foi empregada
para medida da atividade enzimtica.
A concentrao do produto de hidrlise da casena pela papana foi
determinada pela medida da absorvncia da frao sobrenadante a 280 nm, em
espectrofotmetro CE-1021. Uma unidade de atividade enzimtica foi definida como
a quantidade de papana que aumenta em 0,01 unidade a absorvncia da frao
sobrenadante a 280 nm, por minuto de reao. Para esse clculo, foi usada a
tangente da primeira parte da curva de absorvncia por minuto versus quantidade de
protena (ARNON, 1970), assim como demonstra a Figura 6.

Abs/ min

0,02

0,01

C1 C2

papana (g/mL)

Figura 6 - Variao da absorvncia a 280 nm por minuto de


reao em funo da concentrao de papana no
meio reacional (em microgramas/mL).

______________________________________________________`tx|t x `w______ 34
3.2.3. Validao do mtodo de medida de atividade proteoltica:

O mtodo de medida de atividade proteoltica foi validado quanto aos


parmetros: linearidade, preciso e exatido intra e interensaio, limites de deteco
(LD) e de quantificao (LQ), empregando papana padro da Sigma.

3.2.3.1. Linearidade/Faixa:

Para a avaliao da linearidade do mtodo uma soluo me de papana


padro (139,0 g/mL) foi preparada em gua destilada e, desta soluo, foram
retiradas alquotas de volumes variados (0,04 a 0,8 mL) para medida de atividade
proteoltica, como descrito no item 3.2.2.. Uma curva relacionando a absorvncia por
minuto versus os microgramas de papana por mililitro de meio reacional foi
construda. Desta curva, cinco diferentes concentraes de papana (2,78; 5,56;
8,34; 11,12 e 13,9 g/mL) foram escolhidas e submetidas medida de atividade
proteoltica em triplicata (k=5; nmero de rplicas=3). A relao entre a absorvncia
por

minuto

versus

concentrao

de

papana

(g/mL)

foi

expressa

matematicamente como uma reta de regresso tipo y= bx + a, obtida pelo mtodo de


ajuste dos mnimos quadrados.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 35
3.2.3.2. Preciso e exatido intra e inter ensaio:

A preciso e a exatido da medida da atividade proteoltica foram determinadas


no mesmo dia, com um nmero de repeties igual a 10 (intra-ensaio) e em trs dias
alternados, com um nmero de repeties igual a cinco (inter ensaio). Para cada dia
de experimento uma curva de calibrao foi construda, como descrito no item
3.2.3.1., e trs solues de papana padro, nas concentraes de 8,34; 11,12 e
13,9 g/mL, foram preparadas e as atividades proteolticas determinadas de acordo
como item 3.2.2..
A preciso intra e interensaio do mtodo de medida de atividade proteoltica,
para as trs concentraes de papana, foram calculadas matematicamente pela
frmula:

CV (%) = S x 100
x

Onde: CV = coeficiente de varincia


S = desvio padro das diferenas de absorvncia (absorvncia da amostra
subtrada da absorvncia do branco)
x = mdia aritmtica das diferenas das absorvncias

______________________________________________________`tx|t x `w______ 36
A exatido intra e interensaio, para as trs concentraes de papana, foi
expressa matematicamente como a porcentagem de recuperao (R).

R (%) = Xm x 100

Onde: xm = valor mdio da atividade proteoltica encontrado


= valor aceitvel como real da atividade proteoltica

3.2.3.3. Limites de deteco e quantificao:

Os limites de deteco e quantificao foram determinados experimentalmente,


por meio da medida de atividade proteoltica das amostras de papana de
concentraes conhecidas e decrescentes, seguido pelas anlises dos parmetros
de preciso e exatido, para o limite de quantificao. O limite de deteco foi
definido como a menor concentrao de papana cuja diferena entre as
absorvncias da amostra e do branco foi de aproximadamente 0,06, aps a reao
proteoltica.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 37
3.2.4. Caracterizao qumica, fsica e da atividade proteoltica das matriasprimas papana:

Duas matrias-primas papana, procedentes dos fabricantes A e B, foram


adquiridas no comrcio e analisadas quanto aos teores de protena, quanto
quantidade de atividade proteoltica e quanto ao nmero de componentes proticos
e suas respectivas massas moleculares, por eletroforese em gel de poliacrilamida.

3.2.4.1. Determinao da quantidade de protena pelo mtodo de Lowry:

O teor de protena foi determinado pelo mtodo descrito por LOWRY et al.
(1951), utilizando a protena soro albumina bovina como padro e, para a leitura da
absorvncia das amostras, o comprimento de onda utilizado foi o de 660 nm.

3.2.4.2. Avaliao da atividade proteoltica das matrias-primas papana:

Para a avaliao da atividade proteoltica, solues-me foram preparadas pela


dissoluo de amostras das matrias-primas, contendo o equivalente a 0,1 mg de
protena, em 1,0 mL de gua destilada (item 3.2.1.). Em tubos de ensaio de 10,0 mL,
foram adicionadas quantidades crescentes das solues-me (0,1 a 0,8 mL) e 0,2
mL da soluo ativadora (constituda por 0,05 M de Cistena, 0,02 M de EDTA e o
pH foi ajustado para 8,0 com NaOH). O volume de cada tubo foi completado para
1,0 mL com soluo tampo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0. Em intervalos de 1 minuto

______________________________________________________`tx|t x `w______ 38
entre cada tubo, 1,0 mL de soluo de casena 1% (p/v) foi adicionado. Aps
agitao, os tubos permaneceram em repouso por 10 minutos em banho-maria, a
37C. A atividade proteoltica foi determinada como discutido no item 3.2.2..

3.2.4.3. Anlise eletrofortica em condies dissociantes das matrias-primas


papana:

3.2.4.3.1. Procedimento eletrofortico:

A placa de gel de poliacrilamida foi preparada de acordo com HEUSSEN e


DOWDLE (1980) e as modificaes feitas por MICHAUD, FAYE e YELLE (1993)
para a papana. A placa foi montada com gel de concentrao (3% - pH 6,8) e gel de
separao contendo acrilamida 15% (pH 8,8), de acordo com o Quadro 1.

GEL DE SEPARAO

GEL DE CONCENTRAO

15%

3%

1650 L

200 L

--------

250 L

1125 L

--------

Persulfato de Amnio 10%

10 L

20 L

TEMED

5 L

10 L

1710 L

1520 L

COMPONENTES

Acrilamida (30%) / Bisacrilamida (1%)


Tris/HCl 0,5 M/pH 6,8
contendo SDS 0,4%
Tris/HCl 1,5 M/pH 8,8
contendo SDS 0,4%

gua destilada

Quadro 1 - Componentes dos gis de concentrao e separao para a eletroforese


em condies dissociantes.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 39
Na preparao das amostras para eletroforese, a soluo-me da papana do
fabricante A foi dialisada contra gua deionizada, e, em seguida, essa soluo foi
liofilizada.
Solues contendo 4 mg de MP/mL das matrias-primas foram preparadas com
as amostras de papana do fabricante A liofilizada, papana do fabricante B e
papana padro. Essas solues foram diludas na proporo de 1:1 (v/v) em
sistema diluente, constitudo de tampo Tris/HCl 62,5 mM, pH 6,8, 2% de SDS e
20% de glicerol. Alquotas de 15 L das solues diludas foram aplicadas placa
de gel de poliacrilamida. Como indicador da migrao das amostras pelo gel, foi
empregada a soluo aquosa do corante azul de bromofenol a 0,003% diluda 1:1 no
sistema diluente.
Nas cubas, superior e inferior, foi utilizado tampo Tris/Glicina (0,025 M/ 0,192
M, respectivamente), pH 8,5, contendo 0,1 % de SDS (LAEMMLI, 1970). A
eletroforese foi desenvolvida a uma corrente constante de 8 mA, a 4C, at o
corante migrar totalmente pelo gel de separao.

3.2.4.3.1. a. Colorao do gel de poliacrilamida para deteco de protenas:

O gel foi corado com soluo 0,1% de Coomassie Brilliant Blue R350, obtida
pela solubilizao do corante em soluo de isopropanol (25%) e cido actico
(10%). O gel foi mantido nessa soluo por aproximadamente 2 horas e, ento, o
excesso do corante foi removido com soluo de cido actico 20%, durante 30
minutos e sob agitao constante. Em seguida, o gel foi lavado rapidamente com
soluo de cido actico 7%, para permitir maior nitidez das bandas de protenas.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 40
3.2.4.3.2. Determinao das massas moleculares relativas das bandas
proticas:

Padres de protena com massas moleculares conhecidas [-lactoalbumina


(14,2 kDa), gliceraldedo 3-fosfato (36,0 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa) e a soro
albumina bovina (66,0 kDa)], foram submetidos eletroforese. Aps a corrida das
amostras pelo gel, o Rf de cada banda protica foi determinado e relacionado ao
logaritmo (log) da massa molecular relativa, para a construo de uma curva de
calibrao (Rf da banda protica versus log da massa molecular).

A curva de

calibrao foi utilizada para determinao das massas moleculares relativas das
bandas proticas separadas durante a anlise eletrofortica das amostras de
papana (matrias-primas e padro).

3.2.5. Estudo da estabilidade da atividade proteoltica da matria-prima papana


frente a diferentes condies de temperatura e umidade:

A estabilidade da atividade proteoltica da papana, enquanto matria-prima, foi


avaliada pelo mtodo discutido na seo 3.2.1., submetida, anteriormente, a
diferentes condies de temperatura e umidade relativa (UR) durante o perodo de
estocagem (4C , 30C 70% UR e 40C 70% UR).

______________________________________________________`tx|t x `w______ 41
3.2.6. Preparao de formulaes tpicas do tipo gel contendo papana:

Diferentes formulaes tpicas, forma farmacutica do tipo gel, foram


desenvolvidas no Laboratrio de Controle de Qualidade. A enzima papana foi
adicionada s formulaes, a uma concentrao de 1%.

3.2.6.1.

Formulao gel de Pluronic F127:

Componentes
gua destilada
Pluronic F127
Nipaguard
EDTA
Cloridrato de Cistena
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Papana

Formulao base
(g %)
qsp 100,00
20,00
0,80
0,04
0,16
qsp pH 6,5
---

Formulao adicionada da
enzima (g %)
qsp 100,00
20,00
0,80
0,04
0,16
qsp pH 6,5
1,00

Quadro 2 - Componentes utilizados no preparo das formulaes de Pluronic


F127 contendo papana.

O gel de Pluronic F127 foi preparado pelo mtodo a frio descrito por Cabana
et al. (1997). No preparo da formulao gel de Pluronic F127 20% (p/p) pesou-se
exatamente 20 g do polmero, 0,80g do conservante e 59,20g de gua destilada
previamente resfriada em geladeira. Um bquer contendo essa quantidade de gua
e do conservante foi colocado em banho de gelo e a temperatura foi mantida em
torno de 5C. Sob agitao constante, com auxlio de um agitador, o polmero foi
adicionado lentamente. O polmero sofre hidratao e dispersa na gua fria, sob
agitao constante, e, para isso, a soluo ficou agitando por um perodo de 2

______________________________________________________`tx|t x `w______ 42
horas. Nesse processo pode ocorrer formao de espuma. Aps as duas horas, a
soluo teve o pH acertado para 8,0. Pesou-se, ento, o cloridrato de cistena e o
EDTA, que foram dissolvidos em 10,0 gramas de gua destilada. Em seguida, essa
soluo foi adicionada soluo do Pluronic F127, sem que a agitao do mesmo
fosse interrompida. Ainda sob agitao constante, a Papana foi adicionada
lentamente, previamente dissolvida em 10 gramas de gua destilada. O gel
permaneceu em banho de gelo e sob agitao constante por mais quatro horas. O
pH foi conferido no final do processo, obtendo-se pH em torno de 6,5. Aps as seis
horas, a formulao permaneceu em repouso por 12 horas, em refrigerador (5C
2C). Uma soluo verdadeira formada no perodo de seis a doze horas.
As formulaes, com e sem papana, foram acondicionadas em potes plsticos
(polietileno de alta densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa,
preenchendo todo o volume do pote.

3.2.6.2.

Formulao gel de Carbopol 940:

Componentes
gua destilada
Carbopol 940
Nipaguard
Soluo de EDTA 1% (p/v)
Propilenoglicol
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Cloridrato de Cistena
Papana

Formulao base
(g %)
qsp 100,00
0,60
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
---

Formulao
adicionada da enzima
(g %)
qsp 100,00
0,60
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
1,00

Quadro 3 - Componentes utilizados no preparo das formulaes de Carbopol 940.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 43
No preparo da formulao gel de Carbopol 940 foram adicionados em um
bquer contendo 20 g de gua destilada o propilenoglicol, a soluo de EDTA 1%
(p/v) e o Nipaguard. O Carbopol 940 foi disperso nessa soluo, que permaneceu
em repouso por 24 horas, para total disperso do p de Carbopol 940 na soluo.
Aps essas 24 horas, o gel formado foi agitado com uma esptula at completa
homogeneizao. O pH foi acertado para 6,5 com a soluo de NaOH 10%. Em um
bquer parte, 10 g de gua destilada foram utilizados para solubilizar 160 mg de
cloridrato de cistena. Essa soluo foi adicionada ao gel sob agitao constante.
Em outro bquer, 20 g de gua destilada foram utilizados para solubilizar a papana.
Aos poucos e sob agitao manual constante, essa soluo foi adicionada ao gel. O
restante da gua destilada (38 g) foi adicionado lentamente e sob agitao
constante, de modo que mantivesse a estabilidade do gel.
As formulaes foram acondicionadas em potes plsticos (polietileno de alta
densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa, preenchendo todo o volume
do pote.

3.2.6.3.

Formulao gel de Natrosol 250 HHR:


Componentes

gua destilada
Natrosol 250 HHR
Nipaguard
Soluo de EDTA 1% (p/v)
Propilenoglicol
Soluo de NaOH 10 % (p/v)
Cloridrato de Cistena
Papana

Formulao base
(g %)
qsp 100,00
1,50
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
---

Formulao
adicionada da enzima
(g %)
qsp 100,00
1,50
0,80
4,00
5,00
qsp pH 6,5
0,16
1,00

Quadro 4 - Componentes utilizados no preparo das formulaes com Natrosol 250


HHR.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 44
Na preparao da formulao gel de Natrosol 250 HHR, os componentes
propilenoglicol, soluo de EDTA 1% (p/v) e o Natrosol 250 HHR foram
adicionados em um bquer de vidro. Dezenove gramas de gua destilada foram
aquecidos a 50C e acrescentados mistura anterior, sob agitao constante. Aps
resfriamento do gel, foram adicionados 0,80g de Nipaguard, homogeneizando com
auxlio de esptula plstica. O pH foi acertado para 6,5 com a soluo de NaOH
10%. O gel foi reservado. Dez gramas da gua destilada foram utilizados para
solubilizar a cistena, em um bquer de vidro parte. Essa soluo foi acrescentada
ao gel, homogeneizando constante e rapidamente, a fim de no desestabilizar a
disperso. Em outro bquer, 20 g de gua destilada foram utilizados para dissolver a
papana. Aos poucos e sob agitao manual constante, essa soluo foi adicionada
ao gel. Os outros 19 g de gua destilada foram adicionados lentamente e sob
agitao constante ao gel.
As formulaes foram acondicionadas em potes plsticos (polietileno de alta
densidade) brancos de fundo falso, boca larga e tampa, preenchendo todo o volume
do pote.

3.2.7. Avaliao prvia da estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade


proteoltica das formulaes:

As formulaes, aps 48 horas de sua preparao, tempo necessrio para


estabilizao do sistema, foram avaliadas quanto sua estabilidade por
caractersticas fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica.

______________________________________________________`tx|t x `w______ 45
3.2.7.1.

Avaliao visual:

As formulaes preparadas, adicionadas ou no de papana, foram observadas


visualmente, a fim de detectar alteraes de cor e homogeneidade (MAIA CAMPOS;
BRADA, 1992).

3.2.7.2.

Determinao do pH:

As formulaes preparadas tiveram o pH determinado para verificar a


compatibilidades dessas com o pH da pele e com o pH timo para a atividade
proteoltica da papana. Amostras das formulaes foram diludas a 10% em gua
deionizada, para que fosse determinado o pH de cada uma (MAIA CAMPOS;
BRADA, 1992). Foi utilizado o pHmetro DMPH-2 Digimed e as amostras foram
preparadas em triplicatas.

3.2.8. Avaliao da atividade proteoltica das formulaes estveis:

As formulaes preparadas que apresentaram pH compatvel com o pH da pele e


pH timo para atividade proteoltica da papana e homogeneidade visual foram
analisadas quanto s suas atividades proteolticas, de acordo com a metodologia
descrita na seo 3.2.2..
Para a anlise da atividade proteoltica das formulaes estveis, adicionadas
ou no de papana, alquotas de 1,0 grama das formulaes foram pesadas e

______________________________________________________`tx|t x `w______ 46
homogeneizadas em quantidade suficiente para 25,0 gramas de gua destilada. As
suspenses

foram

centrifugadas

por

30

minutos.

Alquotas

das

fraes

sobrenadantes obtidas foram retiradas e a atividade proteoltica determinada de


acordo com o mtodo descrito no item 3.2.2., empregando como branco a frao
sobrenadante da formulao base. A porcentagem de atividade proteoltica
recuperada na frao sobrenadante foi determinada considerando como 100% a
quantidade de unidades de atividade proteoltica tericas contidas em 1,0 grama de
formulao.

3.2.9. Uniformidade de contedo de atividade proteoltica nas formulaes:

Para a avaliao da uniformidade de contedo de atividade proteoltica nas


formulaes, dez alquotas de 1,0 grama de cada uma das formulaes, adicionadas
ou no de papana, foram pesadas, preparadas, e a atividade enzimtica medida de
acordo com o procedimento descrito no item 3.2.7..

3.2.10. Estudos

de

estabilidade

fsica,

fsico-qumica

da

atividade

proteoltica:

As formulaes que apresentaram, nas condies experimentais testadas,


atividade proteoltica da papana foram submetidas a diferentes condies de
estocagem: a 4C, 30C e 70% UR, e 40C e 70% UR. Em tempos determinados,

______________________________________________________`tx|t x `w______ 47
amostras das formulaes estveis foram analisadas quanto sua estabilidade
fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica.

3.2.10.1. Estabilidade fsico-qumica das formulaes estocadas:

Alquotas das formulaes estocadas foram avaliadas quanto sua


estabilidade por avaliao visual e por determinao do pH.

3.2.10.2. Estabilidade da atividade proteoltica da papana incorporada s


formulaes:

Alquotas das formulaes estocadas sob as diferentes condies de


temperatura e umidade relativa foram preparadas e analisadas quanto sua
atividade proteoltica de acordo com a seo 3.2.8., padronizada para anlise das
formulaes.

3.2.10.3. Avaliao da eficcia da papana para uso tpico in vitro:

A eficcia da papana para o uso tpico foi avaliada in vitro, utilizando-se a


gelatina como substrato. Foram preparados gis contendo gelatina conforme o
Quadro 5, com dimenses de 6,0 x 6,5 cm, que foram colocados em diferentes
placas de Petri. Sobre cada gel, foi adicionada uma alquota das amostras a serem

______________________________________________________`tx|t x `w______ 48
testadas, de forma que se obtivesse uma circunferncia de aproximadamente 2 cm
de dimetro (Figura 7). Foi avaliada a eficcia do p de papana, formulao
extempornea (soluo aquosa de papana 1%), formulao gel de Pluronic F127
e formulao gel de Carbopol 940 contendo a enzima a 1%. As placas foram
colocadas em banho de gua a 37C por 6 horas. Aps esse tempo, o excesso de
formulao sobre os gis foi retirado com algodo umedecido com gua, para que
se procedesse com a colorao dos mesmos. A colorao do gel foi feita de acordo
com o item 3.2.4.3.1.a., a fim de avaliar a ao proteoltica da papana frente ao
substrato. O excesso de corante foi retirado com soluo de cido actico 7%.

Quadro 5 - Componentes do gel para os estudos de eficcia in vitro.


COMPONENTES

Quantidade em L

Acrilamida (30%) /Bis-acrilamida (1%)

3300 L

Gelatina 0,2%

4000 L

Persulfato de Amnio 10%

20 L

TEMED

10 L

gua destilada

3670 L

Placa de Petri

2,0 cm

Gel contendo gelatina

6,0 cm

Formulao teste

6,5 cm

Figura 7 Esquema da montagem do gel para avaliao da


eficcia in vitro da papana para uso tpico.

_________________________________________________________extw________ 49
4. RESULTADOS

4.1. Mtodo de medida da atividade proteoltica da papana padro/ Validao


do mtodo:

4.1.1. Medida da atividade proteoltica/ Curva de Calibrao:

A atividade proteoltica da papana foi determinada pelo aumento da


absorvncia do meio reacional, em 280 nm, em funo da hidrlise do substrato
casena. Foram realizadas medidas de atividade proteoltica empregando volumes
de 0,04 a 0,8 mL de soluo de papana 139,0 g/mL para a obteno da curva
representada na Figura 8a. Os resultados permitiram definir a linearidade do mtodo
analtico na faixa de 2,78 a 13,90 g/mL de papana. A curva de calibrao foi
construda plotando a absorvncia a 280 nm por minuto versus quantidade de
papana (g/mL). A representao grfica de curva de calibrao e o coeficiente de
correlao linear foram determinados pela anlise da regresso linear e esto
apresentados na Figura 8b e Tabela 1, respectivamente. A curva de calibrao
apresentou boa linearidade e a equao representativa foi y= 0,0038x + 0,0014
(n=5, r= 0,9988).

0,12

0,06

0,1

0,05

0,08

0,04
Abs/min

Abs/min

_________________________________________________________extw________ 50

0,06

0,03

0,04

0,02

0,02

0,01

y = 0,0038x + 0,0014
R 2 = 0,9977

0
0

10

20

30

40

50

10

15

papana (m icrogram as/m L)

papana (m icrogram as/m L)

Figura 8. a - Curva representativa do aumento

Figura 8. b Relao linear entre aumento da

da absorvncia a 280 nm por

absorvncia em 280 nm em funo

minuto de reao em funo da

da

concentrao de papana (g/mL)

(g/mL) no meio reacional.

concentrao

de

papana

no meio reacional.

Tabela 1 - Resultados da anlise de regresso linear dos dados da curva obtida pela
relao entre o aumento da absorvncia por minuto de reao (280 nm)
em funo da concentrao de papana (g/mL) no meio reacional.
Parmetros Estatsticos
Equao da regresso
y = 0,0038x + 0,0014
Coeficiente de regresso (r)
r = 0,9988
Erro padro do slope
0
Erro padro do intercepto
0,000178
2,78
13,90
Faixa de concentrao (g/mL)
(a)

(a)

Baseados em quatro curvas de calibrao


y = absorvncia a 280 nm por minuto de reao

_________________________________________________________extw________ 51
A atividade proteoltica da papana, definida como a quantidade de enzima que
aumenta em 0,01 a absorvncia em 280 nm por minuto de reao, foi calculada da
seguinte forma:

0,02 Abs/min

4,89 g/mL

0.01 Abs/min

2,26 g/mL

0,01 Abs/min

2,63 g/mL

Ento, 0,01 Abs/min = 1 unidade de atividade (U) = 2,63 g/mL.

Portanto, 2,63 g/mL de papana padro Sigma tm 1 unidade de atividade


enzimtica.

4.1.2. Preciso e exatido intra e interensaio:

Os resultados da preciso intra e interensaio para as trs concentraes de


papana (8,34; 11,12 e 13,90 g/mL) esto representados nas Tabelas 2, 3, 4 e 5.
Os dados de recuperao intra e interensaio para as trs concentraes de papana
esto mostrados na Tabela 6.

_________________________________________________________extw________ 52
Tabela 2 - Determinao da repetibilidade do mtodo de medida da atividade
proteoltica da papana, empregando a casena como substrato (3
concentraes com 10 rplicas).
N de
Anlises
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Sa
CV (%)b
EP (%)c

Amostra 1
(8,34 g/mL)

Amostra 2
(11,12 g/mL)

Amostra 3
(13,90 g/mL)

Abs/min

Concentrao
Calculada

Abs/min

Concentrao
Calculada

Abs/min

Concentrao
Calculada

0,0339
0,0336
0,0338
0,0341
0,0336
0,0339
0,0338
0,0337
0,0339
0,0343
0,0339
0,00022
0,65
0,00007

8,55
8,50
8,50
8,60
8,50
8,55
8,50
8,50
8,55
8,65
8,54
0,0512
0,60
0,0162

0,0440
0,0437
0,0441
0,0444
0,0440
0,0438
0,0452
0,0439
0,0440
0,0442
0,0441
0,0004
0,91
0,00013

11,21
11,13
11,23
11,31
11,21
11,58
11,52
11,18
11,21
11,26
11,28
0,1484
1,32
0,0469

0,0543
0,0538
0,0544
0,0546
0,0543
0,0535
0,0540
0,0543
0,0544
0,0551
0,0543
0,00044
0,81
0,00014

13,92
13,80
13,95
14,00
13,92
13,71
13,84
13,92
13,95
14,13
13,91
0,1140
0,0082
0,0361

Desvio Padro
Coeficiente de Variao
c
Erro Padro
b

Tabela 3 - Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da atividade


proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 8,34 g/mL de papana, com 5 rplicas.
N de Anlises
1
2
3
4
5
Mdia
Sb
CV (%)c
EP (%)d
a

Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Abs/min

Abs/min

Abs/min

0,0339
0,0342
0,0340
0,0335
0,0341
0,0355
0,0343
0,0348
0,0338
0,0333
0,0340
0,0343
0,0002
0,0009
0,56
2,62
0,0001
0,0004
Preciso Intermediria (%) 1,56

0,0341
0,0346
0,0339
0,0344
0,0340
0,0342
0,0003
0,85
0,0001

_________________________________________________________extw________ 53
Tabela 4 - Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da atividade
proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 11,12 g/mL de papana, com 5 rplicas.
N de Anlises
1
2
3
4
5
Mdia
Sb
CV (%)c
EP (%)d

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Abs/min

Abs/min

Abs/min

0,0440
0,0448
0,0437
0,0436
0,0451
0,0440
0,0444
0,0443
0,0435
0,0441
0,0441
0,0442
0,00063
0,00044
1,43
0,99
0,0003
0,0002
Preciso Intermediria (%) 1,06

0,0445
0,0449
0,0446
0,0443
0,0445
0,0446
0,00022
0,49
0,0001

Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b

Tabela 5 - Determinao da preciso interensaio do mtodo de medida da atividade


proteoltica da papana, empregando a casena como substrato, na
concentrao de 13,90 g/mL de papana, com 5 rplicas.
N de Anlises
1
2
3
4
5
Mdia
Sb
CV (%)c
EP (%)d
a

Concentrao Calculada
Desvio Padro
c
Coeficiente de Variao
d
Erro Padro
b

Dia 1

Dia 2

Dia 3

Abs/min

Abs/min

Abs/min

0,0532
0,0545
0,0538
0,0552
0,0544
0,0539
0,0546
0,0542
0,0543
0,0534
0,0541
0,0542
0,0006
0,0007
1,03
1,29
0,0003
0,0003
Preciso Intermediria (%) 0,92

0,0543
0,0537
0,0545
0,0542
0,0537
0,0541
0,0004
0,74
0,0002

_________________________________________________________extw________ 54

Tabela 6 - Determinao da exatido intraensaio (n=10) e interensaio (n=5) do


mtodo de medida da atividade proteoltica da papana, empregando a
casena como substrato, para trs concentraes de papana.
Exatido intraensaio

Concentraes
Terica (g/mL)
Concentraes
Calculada (g/mL)
Ativ.Proteolticaa
Terica (U)
Ativ. Proteolticaa
Calculada (U)
Recup. Mdia (%)b
Sc
CV (%)d
ER%e

Exatido interensaio

Amostra

Amostra

Amostra

Amostra

Amostra

Amostra

8,34

11,12

13,90

8,34

11,12

13,90

8,54

11,24

13,92

8,62

11,28

13,87

3,17

4,23

5,29

3,17

4,23

5,29

3,25

4,27

5,29

3,28

4,29

5,27

102,46
0,68
0,66
2,52

101,08
1,00
0,99
0,95

100,01
0,83
0,83
0,00

103,4
1,68
1,62
3,47

101,45
1,12
1,10
1,42

99,74
0,94
0,94
0,38

Atividade Proteoltica
Recuperao Mdia
c
Desvio Padro
d
Coeficiente de Variao
e
Erro Relativo
b

4.1.3. Determinao dos limites de deteco e quantificao:

O limite de quantificao foi determinado experimentalmente, atravs da


preparao de uma srie de amostras com quantidades decrescentes de papana e
cada uma foi analisada 5 vezes consecutivamente, como indicado por Eurachen
(1993). O limite de quantificao encontrada para o mtodo foi de 2,78 g de
papana por mL de meio reacional, apresentando um coeficiente de variao de 6%
para a preciso intra e interensaio e uma recuperao de 113% e de 115% para a
exatido intra e interensaio (Tabela 7).

_________________________________________________________extw________ 55
O limite de deteco determinado para a medida de atividade proteoltica foi
de 1,2 g de papana por mL de meio reacional. Esta concentrao de papana
proporcionou uma medida de absorvncia em 280 nm, que, descontada da
absorvncia do branco (meio reacional sem papana), deu uma leitura de
absorvncia de 0,06, em 10 minutos de reao, que pode ser detectada com
segurana pelo espectrofotmetro utilizado.

Tabela 7 Valores de preciso e exatido intra e interensaio calculados para o


limite de quantificao determinado experimentalmente pelo mtodo de
medida da atividade proteoltica da papana, utilizando a casena como
substrato.
Papana (2,78 g/mL)
Intraensaio (n=5)
3,14
Concentrao Calculada (g/mL)
113,0
Recuperao (%)
6,53
Sa
6,0
CV (%)b
c
12,9
ER (%)

Interensaio (n=15)
3,21
115,5
7,0
6,0
15,0

Desvio Padro
Coeficiente de Variao
c
Erro Relativo
b

4.2. Caracterizao fsica, qumica e da atividade proteoltica da papana nas


matrias-primas:

As matrias-primas papana dos fabricantes A e B foram caracterizadas


quimicamente pela medida do teor de protena (Tabela 8).

_________________________________________________________extw________ 56

Tabela 8 Medida da concentrao de protena total nas matrias-primas papana


comercializadas pelos fabricantes A e B.
Fabricantes
A
B

mg de protena/ mg de MP
0,119
0,847

%
11,9
84,7

Para a medida da atividade proteoltica, quantidades diferentes das matriasprimas comercializadas pelos fabricantes A e B foram empregadas nos ensaios
enzimticos, de modo a obter-se, para ambas as matrias-primas, a mesma
quantidade de protena no meio reacional (Tabela 9 e Figura 9).

Tabela 9 Medida do aumento da absorvncia por minuto de reao em funo da


concentrao de protena (g/mL), no meio reacional, para matriasprimas papana dos fabricantes A e B.
Concentrao de
papana (g/mL)
5
10
15
20
25
30
35
40

A
Absorvncia
a 280 nm/ minuto
0,0206
0,0347
0,0469
0,0595
0,0701
0,0755
0,0806
0,0845

B
Absorvncia
a 280 nm/ minuto
0,0186
0,0356
0,0467
0,0577
0,0655
0,0728
0,0798
0,0813

_________________________________________________________extw________ 57

C
0,09
0,08
0,07
Abs/min

0,06
0,05

SP Farma

0,04

Acros

0,03
0,02
0,01
0
0

20

40

60

papana (m icrogram as/m L)

Figura 9- Representao grfica do aumento da absorvncia por minuto de reao em funo


da concentrao de protena para as matrias-primas papana dos fabricantes A e
B e das duas matrias-primas (C) .

As atividades proteolticas da papana dos fabricantes A e B determinadas em


unidades de atividade por micrograma de protena e por miligrama de matria-prima
esto demonstradas na Tabela 10.

_________________________________________________________extw________ 58

Tabela 10 Medidas de atividade proteoltica em unidades de atividade proteoltica


(U) da papana dos fabricantes A e B, por microgramas de protena e
miligramas de matria-prima.
Fornecedores
SP Farma
Acros

Atividade especfica da
papana
0,4
0,4

Unidade de Atividade(U)/mg de
matria-prima
48,80
336,00

4.3. Anlise eletrofortica em condies dissociantes da papana padro Sigma


e das matrias-primas papana dos fabricantes A e B:

O nmero de componentes proticos presentes nas matrias-primas papana


dos fabricantes A e B , com suas respectivas massas moleculares relativas (MMr),
foram determinados por eletroforese em gel de poliacrilamida em condies
dissociantes e comparados aos componentes proticos da papana padro Sigma.
Os resultados da anlise eletrofortica podem ser vistos na Figura 10.
A Figura 11 mostra a relao linear entre o logartimo (log) das massas
moleculares relativas dos padres proticos e as respectivas mobilidades
eletroforticas (Rf), como tambm a equao da reta e o coeficiente de regresso
linear (R2). As MMr calculadas para os componentes proticos detectados pela
anlise eletrofortica, presentes em ambas matrias-primas, esto apresentadas na
Tabela 11.

_________________________________________________________extw________ 59

Figura 10 Anlise eletrofortica em placa de gel de poliacrilamida com SDS, da papana padro
sigma (2), da papana matria-prima A (3), da papana matria-prima B (4) e da
mistura de padres proticos de MMr (1).

Log massa molecular

4,9
4,8

y = -1,0277x + 4,987

4,7

R = 0,997

4,6
4,5
4,4
4,3
4,2
4,1
0

0,2

0,4

0,6

0,8

Rf

Figura 11 Relao linear entre o logartimo

das MMr dos

padres proticos e as respectivas mobilidades


eletroforticas (Rf).

_________________________________________________________extw________ 60

Tabela 11 Massa molecular relativa (MMr) obtida para os componentes proticos


detectados para as diferentes amostras de papana.
Banda

Papana Padro

Papana A Liofilizada

Papana B

Rf

MMr

Rf

MMr

Rf

MMr

0,16

66461,17

0,14

69682,22

0,14

69682,22

0,36

41402,63

0,36

41402,63

0,45

33460,70

0,42

35922,45

0,42

35922,45

0,45

33460,70

0,45

33460,70

0,73

17249,60

0,87

12385,14

0,87

12385,14

0,87

12385,14

4.4. Estudo da estabilidade da atividade proteoltica das matrias-primas


papana armazenada em diferentes condies de temperatura e umidade:

A avaliao da atividade proteoltica da papana foi determinada usando


casena como substrato, segundo a metodologia descrita na seo 3.2.2..
A matria-prima papana A foi analisada visualmente quanto alterao de
colorao, durante o perodo de armazenamento, a 4C, 30C/70% UR e 40C/70%
UR. Os resultados mostram mudanas na colorao do p no 15 dia, e essa
mudana se intensificou at o 30 dia (Figura 12). O escurecimento da matria-prima
foi acompanhado por perda de atividade proteoltica. Resultados semelhantes foram
observados para a matria-prima papana B.

_________________________________________________________extw________ 61
A Figura 13 mostra o comportamento da atividade proteoltica das matriasprimas papana aps armazenamento a 4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, por
diferentes tempos. Observa-se que no houve perda de atividade proteoltica da
papana matria-prima de ambos fabricantes, quando armazenadas a 4C. Nas
condies de armazenamento a 30C/70%UR e a 40C/70%UR, houve uma perda
considervel da atividade (maior que 10%) j a partir do 15 dia de armazenamento,
para a matria-prima papana A. A matria-prima B mostrou-se pouco mais
resistente temperaturas elevadas, porm tambm houve perda significativa da
atividade proteoltica da papana nas condies extremas de estocagem
(40C/70%UR).

Tempo Zero

15 dias

30 dias

Figura 12 Aspecto visual da matria-prima papana A armazenada a 40C/ 70%


UR, nos tempos zero, 15 e 30 dias de armazenamento.

As quantidades de atividade proteoltica, em unidades de atividade, das


matrias-primas papana dos fabricantes A e B, armazenados nas diferentes
condies de temperatura e umidade, foram calculadas a partir dos grficos
mostrados na Figura 13. Os dados de quantidade de atividade proteoltica e a
porcentagem de perda desta atividade nos diferentes tempos de armazenamento a
4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, esto apresentados nas Tabelas 12 e 13.

(A)

(B)

Arm azenam ento: 4C

Arm azenam ento: 4C

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0

Abs/min

Abs/min

_________________________________________________________extw________ 62

Tempo Zero
15 dias
30 dias

20

40

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0

Tempo Zero
15 dias
30 dias

60

Tempo Zero
15 dias
30 dias

40

Abs/min

Abs/ min

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
20

60

Tempo Zero
15 dias
30 dias

40

60

Arm azenam ento: 40C - 70% UR

Tempo Zero
15 dias
30 dias

60

protena
(m icrogram as/m L)

Abs/ min

Abs/ min

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
40

20

protena
(m icrogram as/m L)

Arm azenam ento: 40C - 70 % UR

20

60

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0

protena
(m icrogram as/m L)

40

Arm azenam ento: 30C - 70% UR

Arm azenam ento: 30C - 70% UR

20

protena
(m icrogram as/m L)

protena
(m icrogram as/m L)

0,09
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0

Tempo Zero
15 dias
30 dias

20

40

60

protena
(m icrogram as/m L)

Figura 13 Medida do aumento de absorvncia por minuto de reao em funo da concentrao da


papana A e papana B no meio reacional (g/mL), armazenadas a 4C, 30C/70%UR e
40C/70%UR, nos tempos zero, 15 e 30 dias.

_________________________________________________________extw________ 63

Tabela 12- Medida da atividade proteoltica em unidade de atividade (U) por


miligrama da matria-prima papana A, armazenada a 4C,
30C/70%UR e 40C/70%UR, em diferentes tempos.
4C

Tempo de
Armazenamento

Atividade

(Dias)

(U/mg)

30C/70% UR

Perda de
Atividade
(%)

Atividade
(U/mg)

Perda de
Atividade
(%)

40C/70% UR
Atividade
(U/mg)

Perda de
Atividade
(%)

48,80

---

48,80

---

48,80

---

15

48,80

0,00

27,11

44,45

30,50

37,5

30

48,80

0,00

20,35

58,40

18,77

61,54

Tabela 13- Medida da atividade proteoltica em unidade de atividade (U) por


miligrama da matria-prima papana B, armazenada a 4C,
30C/70%UR e 40C/70%UR, em diferentes tempos.
4C

Tempo de
Armazenamento Atividade
(Dias)
(U/mg)

336,00

30C 70% UR

Perda de
Atividade
(%)

Atividade
(U/mg)

Perda de
Atividade
(%)

40C 70% UR
Atividade
(U/mg)

Perda de
Atividade
(%)

---

336,00

---

336,00

---

15

336,00

0,00

280,00

16,67

210,00

37,50

30

336,00

0,00

258,50

23,06

152,73

54,54

_________________________________________________________extw________ 64
4.5. Preparo e avaliao fsica, fsico-qumica, da atividade proteoltica das
formulaes contendo papana e avaliao in vitro da eficcia da ao
proteoltica da papana nas formulaes:

4.5.1. Avaliao fsica e fsico-qumica das formulaes:

Na avaliao prvia do aspecto visual das formulaes, a formulao base


manteve-se lmpida e as trs formulaes adicionadas de papana apresentaram-se
opacas, levemente amareladas.
As formulaes gis de Pluronic F127, Carbopol 940, e Natrosol 250 HHR,
que foram preparadas como descrito na metodologia (item 3.2.6.), contendo 1% da
matria-prima A (12 mg de protena/g de formulao), tiveram seus pH determinados
depois de 48 horas de preparo. Os resultados esto demonstrados na Tabela 14.
Das trs formulaes, a formulao base de gel de Pluronic F127 foi a que sofreu
maior variao de pH com a adio de 1% de papana.

Tabela 14 - pH das formulaes preparadas com 1% de papana A.


FORMULAES
A

pH

sem Papana

7,08

com Papana

6,20

sem Papana

6,38

com Papana

6,15

sem Papana

6,60

com Papana

6,33

_________________________________________________________extw________ 65
4.5.2. Avaliao da atividade proteoltica:

4.5.2.1. Interferncia dos componentes das formulaes na medida da


absorvncia em 280 nm:

Para verificar a influncia dos componentes das formulaes na medida da


absorvncia em 280 nm, dois controles foram empregados: tampo Tris-HCl 0,05M,
pH 8,0, e outro as formulaes gis base homogeneizadas em gua destilada, na
proporo de 1 g de formulao para 25 g de gua. O espectrofotmetro foi zerado

Absorvncia em 280 nm

com gua destilada. Os resultados obtidos esto demonstrados na Figura 14.

0,0185

0,0182

0,018
0,0174

0,0175
0,017

0,0167

0,0168

0,0165
0,016
0,0155
1 0,05M
Tampo Tris-HCl
gua + gel base Pluronic F127
gua + gel base Carbopol 940
gua + gel base Natrosol 250 HHR

Figura 14 - Interferncia dos componentes das formulaes na medida


da absorvncia em 280 nm.

_________________________________________________________extw________ 66
4.5.2.2. Dosagem de atividade proteoltica das formulaes:

A quantidade de atividade proteoltica da papana nas formulaes foi medida.


Para isso, 1,0 grama de formulao foi homogeneizada em 25,0 gramas de gua
destilada, por 30 minutos e alquotas da suspenso foram utilizadas para medida de
atividade proteoltica, como descrito na metodologia no item 3.2.8.. As mdias dos
resultados obtidos encontram-se na Tabela 15, e a recuperao da atividade
proteoltica em relao atividade adicionada s formulaes, est demonstrada na
Tabela 16.

Tabela 15 - Quantidade de unidade de atividade proteoltica extrada de 1 grama


das formulaes.

Formulaes Gel
Pluronic F127
Carbopol 940
Natrosol 250 HHR
* mdia de triplicatas

Abs/min
0,0259
0,0290
0,0004

Atividade
proteoltica/mL
de meio reacional
(U/mL)*
3,00
3,44
0,24

Atividade
proteoltica/grama
de formulao
(U/g)
380,0
430,0
30,0

Tabela 16 - Recuperao da atividade proteoltica adicionada s formulaes.

Formulaes
contendo
1 % de Papana A

Atividade proteoltica
adicionada/grama de
formulao
(U/g)

Atividade
proteoltica
recuperada/grama
de formulao
(U/g)

% de
Recuperao

Pluronic F127
Carbopol 940
Natrosol 250 HHR

4800,0
4800,0
4800,0

380,0
430,0
30,0

7,92
8,96
0,63

_________________________________________________________extw________ 67
4.5.2.3. Avaliao da uniformidade de contedo de atividade proteoltica das
formulaes:

Para a avaliao da uniformidade de contedo de atividade proteoltica das


formulaes gel de Pluronic F127 e de Carbopol 940 dez amostras de 1,0 grama
de cada formulao foram avaliadas quanto a quantidade de atividade proteoltica
recuperada, como descrito em mtodos, seo 3.2.8.. Os resultados esto
apresentados na Tabela 17.

Tabela 17 - Uniformidade do contedo de atividade proteoltica das formulaes gel


de Pluronic F127 e de Carbopol 940.

Amostras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Sa
CV(%)b
a
b

Formulao gel de
Pluronic F127
U/g de
Abs/min
formulao
0,0236
343,55
0,0242
353,22
0,0240
350,00
0,0263
387,10
0,0251
367,74
0,0259
380,65
0,0262
385,48
0,0259
380,65
0,0255
374,19
0,0257
377,42
0,0252
370,00
0,0010
15,70
3,97
4,24

Desvio Padro
Coeficiente de Variao

Formulao gel de
Carbopol 940
U/g de
Abs/min
formulao
0,0286
424,19
0,0283
419,35
0,0275
406,45
0,0303
451,61
0,0286
424,19
0,0307
458,06
0,0309
461,29
0,0318
475,81
0,0299
445,16
0,0301
448,39
0,0297
441,45
0,0013
21,92
4,38
4,96

_________________________________________________________extw________ 68
4.5.3. Estudo da estabilidade fsica, fsico-qumica e da atividade proteoltica
das formulaes com e sem a matria-prima papana A:

Os testes preliminares da avaliao da atividade proteoltica da papana


mostraram baixa recuperao da atividade enzimtica para as trs formulaes gis,
principalmente para a formulao gel de Natrosol 250 HHR. Apesar da baixa
recuperao, os estudos de estabilidade foram realizados com as formulaes gis
de Pluronic F127 e de Carbopol 940.
As formulaes gis de Pluronic F127 e de Carbopol 940, armazenadas a
4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, foram avaliadas visualmente quanto mudana
de cor e presena de precipitado, e quanto a alterao do pH. Os resultados esto
apresentados na Figura 15 e na Tabela 18.
A formulao gel de Pluronic F127 mostra alterao de cor j no 15 dia de
armazenamento a 40 C/70% UR, enquanto que nas demais condies de
temperatura e umidade, no foi observada mudana de cor. No entanto, no 60 dia
houve leve e intensa alterao da colorao do gel quando armazenado a 30C/70%
UR e 40C/70% UR, respectivamente. Por outro lado, a formulao gel de
Carbopol 940 mostrou uma leve alterao de cor aps 60 dias de armazenamento
a 40C/70% UR. Os resultados da avaliao da estabilidade das formulaes, pela
alterao de cor, indicam uma maior estabilidade da formulao gel de Carbopol
940.
Os resultados de medida de valores de pH mostraram, apesar da variao da
leitura observada, que na formulao gel de Pluronic F127 armazenada a
40C/70% UR foi observada uma queda constante dos valores de pH em funo do
tempo de armazenamento, acompanhando a alterao de cor.

_________________________________________________________extw________ 69
Tempo Zero

15 dias

60 dias

30 dias

Figura 15 Avaliao visual das formulaes gis de Pluronic F127 (X) e Carbopol 940 (Y)
contendo 1% de papana A, submetidas a diferentes condies de armazenamento,
nos tempos zero, 15, 30 e 60 dias.

_________________________________________________________extw________ 70

Tabela 18 Determinao dos valores de pH das formulaes gis de Pluronic


F127 (X) e Carbopol 940 (Y) durante o perodo de armazenamento a
4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR.
Condies de
Armazenamento

4C

30C/70% UR

40C/70% UR

Perodo de
Armazenamento
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias
48 horas (inicial)
15 dias
30 dias
60 dias

Formulao X
pH
Com
Base
Papana
7,02
6,20
7,05
6,17
7,03
6,10
7,01
6,16
7,02
6,20
7,03
6,18
7,05
6,15
6,99
6,20
7,02
6,20
7,02
6,15
7,08
6,13
7,03
6,10

Formulao Y
pH
Com
Base
Papana
6,38
6,15
6,33
6,10
6,34
6,12
6,35
6,07
6,38
6,15
6,30
6,13
6,32
6,14
6,33
6,09
6,38
6,15
6,32
6,10
6,35
6,08
6,30
6,12

As formulaes adicionadas da papana A foram submetidas dosagem de


atividade proteoltica em tempo inicial de preparo das formulaes (48 horas), e
depois do armazenamento a 4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, em diferentes
intervalos de tempo. Os resultados dos estudos de estabilidade da atividade
proteoltica das formulaes e da papana matria-prima (para comparao) esto
apresentados na Figura 16.

_________________________________________________________extw________ 71

(X)
Unidade de atividade por
grama de formulao

400
350
300
250

4C

200

30C

150

40C

100
50
0
1

Meses

Unidade de Atividade
Proteoltica por grama de
formulao

(Y)
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

4C
30C
40C

Meses

Unidade de Atividade
Proteoltica por grama de
matria-prima

(Z)
60000
50000
40000

4C

30000

30C

20000

40C

10000
0
1 2 3 4 5 6 7 8
Meses

Figura 16 Medida da atividade proteoltica (U) da papana na matria-prima A (Z) e veiculada nas
formulaes gis de Pluronic F127 (X) e de Carbopol 940 (Y) em funo do tempo,
armazenados a 4C, 30C/70%UR e 40C/70%UR.

_________________________________________________________extw________ 72
4.5.4. Avaliao in vitro da eficcia da ao proteoltica da papana em
formulaes tpicas:

A eficcia da ao proteoltica da papana para o uso tpico foi avaliada in vitro,


pela adio das formulaes a um gel de poliacrilamida contendo gelatina como
substrato. A eficcia proteoltica da papana foi avaliada in vitro por meio da
formao de uma rea translcida, aps aplicao das formulaes superfcie do
gel de poliacrilamida contendo gelatina, seguido por um perodo de incubao e
colorao com Coomassie Brilliant Blue R350. Alm das formulaes gis de
Pluronic F127 e de Carbopol 940, foram testados o ps de papana e a soluo
aquosa de papana (soluo extempornea).
A formulao gel de Carbopol 940 proporcionou o aparecimento de um halo
mais ntido, devido a maior degradao da gelatina, indicando possuir uma melhor
eficcia da ao proteoltica, seguido pela formulao gel de Pluronic F127 (Figura
17).

_________________________________________________________extw________ 73

(P)

(S)

(X)

(Y)

Figura 17 Avaliao in vitro da eficcia da ao proteoltica da papana em formulaes


tpicas pela degradao da gelatina adicionada a gel de poliacrilamida. (P) P
de papana (Matria-prima A); (S) Formulao Extempornea (Soluo de
Papana 1%); (X) Formulao Gel Pluronic F127; (Y) Formulao Gel
Carbopol 940.

__________________________________________________________W|v________ 74
5. DISCUSSO

Papana uma enzima proteoltica ou uma mistura de enzimas proteolticas,


constituda, principalmente, de papana e quimopapana, preparada a partir do ltex
do mamo verde Carica papaya (Caricaceae). Essas enzimas hidrolisam ligaes
peptdicas, amidas e steres, especialmente em ligaes envolvendo aminocidos
bsicos, como a leucina ou a glicina (MARTINDALE, 2005). A principal aplicao da
papana na medicina como agente de desbridamento de tecido necrosado,
auxiliando e acelerando o processo de cicatrizao.
No comrcio, existem matrias-primas papana de diferentes procedncias,
provenientes de diferentes processos de purificao. No desenvolvimento deste
trabalho foi utilizada a matria-prima papana de dois fabricantes distintos: A e B.
Essas matrias-primas foram caracterizadas quanto aos teores de protena, por
anlise eletrofortica e por medida de atividade proteoltica, usando a casena como
substrato.
Os resultados da dosagem de protena mostraram que a papana do
fabricante A contm 0,12 miligramas de protena por miligrama de matria-prima, ou
seja, 12% da composio da matria-prima corresponde a protena, que,
provavelmente, est relacionado ao teor de papana. A matria-prima papana do
fabricante B contm, por sua vez, 84% de protena (0,84 mg de protena por
miligrama de matria-prima).
Os teores de protena, 12% e 84%, indicam que ambas as matrias-primas
so adicionadas de diluentes, como a lactose, que citada na literatura como sendo
o diluente encontrado na papana (MERCK INDEX, 1996; TRAVERSA, 2003; USP

__________________________________________________________W|v________ 75
XXIX, 2006; VANDENPLAS et al.,1996). A proporo de diluente para protena
maior, cerca de 5 vezes, na papana A (88:12), do que na B (16:84).
Na caracterizao eletrofortica em condies dissociantes, os perfis
eletroforticos das matrias-primas A e B foram comparados ao perfil da papana
padro (Sigma), com 99% de pureza. Durante a adequao do procedimento
eletrofortico, foi verificado que a quantidade de protena da matria-prima A no foi
suficiente para a deteco ntida das bandas proticas no gel de poliacrilamida com
SDS.
Na tentativa de melhorar o perfil eletrofortico da papana do fabricante A,
uma soluo me mais concentrada dessa matria-prima foi utilizada, visando a
adio de maior quantidade de protena placa de eletroforese. No entanto, houve
grande deformao das bandas proticas, devido, provavelmente, interferncia do
diluente presente. Assim, a soluo-me dessa matria-prima foi dialisada contra
gua deionizada, a fim eliminar o diluente presente, caso esse fosse de baixa massa
molecular relativa. Aps a dilise, a soluo me foi liofilizada para a concentrao
do material. Em uma dilise, as partculas menores em soluo so capazes de
passar atravs da membrana, por manter um alto gradiente de concentrao das
molculas difusveis atravs da membrana e por se fazer trocas do lquido de
tempos em tempos (KAYES, 1988; VOET, 1995). Com esse procedimento, foi
possvel aumentar cerca de seis vezes a concentrao de protena por miligrama de
matria-prima A. Esse resultado sugere que o diluente foi eliminado durante a
dilise, podendo, assim, afirmar que o diluente possui baixa massa molecular
relativa.
Os dados da anlise eletrofortica mostraram uma banda protica larga e
bem ntida (Banda 6 Figura 10), com massa molecular de 12,4 kDa, detectada na

__________________________________________________________W|v________ 76
papana padro e em ambas matrias-primas. Para as trs amostras de papana, a
mesma quantidade de protena foi aplicada na placa de gel de poliacrilamida. As
protenas detectadas na Banda 6 (Figura 10), com massa molecular menor do que a
papana (23,4kDa), pode ser a papana cistatina, o principal contaminante da
papana e quimopapana (AZARKAN et al., 2003). O DNA que codifica a papana
cistatina foi seqenciado por Zerhoumi et al (1998). A seqncia de aminocidos
revelou uma cadeia polipeptdica nica com 98 aminocidos e massa molecular
relativa de 11131 Daltons (AZARKAN et al., 2003).
Nas matrias-primas A e B, alm da banda 6, outras trs bandas bem ntidas
foram detectadas, com massas moleculares superiores quela da banda 6 (Figura
10). Essas bandas podem ser enzimas proteolticas, pois o ltex do Carica papaya
constitudo por uma mistura dessas enzimas. Kamnski e Bushuk (1968) detectaram
quatro bandas de atividade proteoltica, quando a papana purificada foi submetida
eletroforese em gel de amido. Por outro lado, essas bandas poderiam ser
resultantes do desdobramento da estrutura molecular da papana na presena de
SDS. No entanto, com a amostra de papana padro, que foi tratada da mesma
forma que as amostras de matria-prima, estas bandas no foram detectadas, o que
descarta essa possibilidade.
A atividade proteoltica das papanas matrias-primas e padro, assim como
das formulaes, foi determinada usando casena como substrato, de acordo com o
mtodo descrito por Arnon (1970), que uma modificao do mtodo descrito na
USP XXIX (2006).
O mtodo de medida de atividade proteoltica foi validado de acordo com os
parmetros: linearidade, preciso e exatido intra e interensaio, e limites de
deteco e quantificao. A faixa de linearidade encontrada foi de 2,78 g/mL a

__________________________________________________________W|v________ 77
13,90 g de papana por mL de meio reacional, e a equao de regresso linear
igual a y= 0,0038x + 0,0014 (r = 0,9988). A preciso intra e interensaio
permaneceram abaixo de 2%, sendo considerado preciso pelas normas do ICH
(2001). O mtodo mostrou ser exato nas concentraes de 8,34; 11,12 e 13,90
microgramas de papana por mililitro de meio reacional, com uma recuperao
mdia de 102,46%, 101,08% e 100,01% (intraensaio), e de 103,4%, 101,45% e
99,74% (interensaio), respectivamente.
Os limites de deteco e quantificao determinados foram de 1,2 g/mL e de
2,78 g/mL, respectivamente. O mtodo analtico em seu limite de quantificao de
2,78 g/mL apresentou uma preciso intra e interensaio com um coeficiente de
variao inferior a 2%. Normalmente, para o limite de quantificao fixado para
preciso um coeficiente de variao de, no mximo, 10%, podendo ser aceito at
20%, em funo das caractersticas do mtodo analtico (EURACHEN, 1993). No
entanto, a exatido intra e interensaio do mtodo de medida de atividade
proteoltica, em seu limite de quantificao foi de 113% e 115%, respecitivamente. A
faixa de variao aceitvel de 98-107% para uma concentrao do analito na
amostra de 10% (AOAC, 1993), caso da matria-prima papana A, cuja
concentrao de protena na matria-prima de 12%. A exatido est fora da faixa
aceitvel devido, provavelmente, s caractersticas do mtodo analtico.
Sankalia et al. (2005) validaram o mtodo de medida de atividade proteoltica
da papana descrito na Farmacopia Indiana, empregando um volume total de 5,0
mL de meio reacional, contendo 10 mg/mL de casena, e o tempo de incubao foi
de 60 minutos, a 40C. Os autores encontraram a faixa de linearidade de 3 a 100
g/mL, equao da regresso linear y = 0,0042x + 0,0033, os limites de deteco
(0,77 g/mL) e de quantificao (2,57 g/mL). A faixa de linearidade encontrada

__________________________________________________________W|v________ 78
pelos autores difere daquela obtida em nossos experimentos (2,78 a 13,90 g/mL).
Os autores mencionaram que a papana empregada a purificada da Farmacopia
Indiana, mas no mencionaram o seu grau de pureza e nem o contedo de protena.
Quando as matrias-primas papana A e B foram analisadas quanto s suas
atividades proteolticas, a mesma quantidade de protena foi adicionada ao meio
reacional. Apesar da grande diferena do contedo de diluente observada para
essas matrias-primas (88% na A e 16% na B), os perfis de atividade proteoltica de
ambas as matrias-primas foram similares, como demonstra a Figura 9C, e muito
semelhantes ao perfil da papana padro (99%).
A atividade proteoltica encontrada para as papanas A e B foi de 0,4 U por
micrograma de protena (Tabela 10) e a encontrada para o padro de 0,380 U por
micrograma de protena. No entanto, para que 0,4 U/mg de protena fosse obtido
para a papana A, uma quantidade 7 vezes maior de matria-prima foi utilizada em
comparao papana B. Este resultado evidencia a importncia da caracterizao
de matrias-primas macromoleculares pela medida das quantidades de atividade
biolgica e de protena por grama de matria-prima.
A papana, ainda hoje, utilizada nos hospitais em solues aquosas
extemporneas, preparadas com o p de papana e gua para injetveis. A
preparao da formulao no momento do uso exige pessoal treinado e qualificado,
para que sejam evitados erros na concentrao da soluo, como tambm seja
evitada a contaminao microbiana do produto. Alm de demandar tempo para o
preparo dessa formulao, solues aquosas possuem baixa viscosidade, no se
restringindo, quando aplicada, rea afetada pela leso.
Devido a esses fatos, formulaes gis de Natrosol 250 HHR e Carbopol
940, adicionadas de papana a 3% ou em concentraes superiores, esto sendo

__________________________________________________________W|v________ 79
comercializadas para uso hospitalar, principalmente, para o tratamento de leses de
escaras. A escolha de formulao gel para veiculao de protena se deve ao fato
de que essas macromolculas so, geralmente, incompatveis com formulaes
contendo agentes emulsionantes, que podem proporcionar a deformao da
estrutura molecular da protena, levando perda da atividade enzimtica (BAM;
RANDOLPH; CLELAND, 1995; FAN et al., 2001; SANCHEZ-RUIZ; MAKATDZE,
2001). Outra vantagem de se utilizar gel hidroflico para veicular protenas a
hidrossolubilidade dessas macromolculas (MORISHITA et al., 2001).
Assim, trs formulaes gis adicionadas de 3% de matria-prima papana A
foram preparadas: gel de Pluronic F127, gel de Carbopol 940 e gel de Natrosol
250 HHR. No entanto, aps um perodo de repouso, foi observada a formao de
precipitado na formulao com o Pluronic F127. Nas outras duas formulaes, foi
observada a diminuio da viscosidade, indicando instabilidade fsica, que poderia
levar perda de atividade enzimtica mais acentuada. Dessa forma, as trs
formulaes foram reformuladas com adio de 1% da matria-prima papana A.
A atividade proteoltica das formulaes foi medida pelo mesmo mtodo
utilizado para a anlise das matrias-primas. Entretanto, para a realizao das
determinaes da atividade proteoltica das formulaes foi verificado se os
componentes dos gis tambm absorviam em 280 nm. Os resultados indicaram uma
pequena interferncia dos componentes, sendo essa interferncia maior para a
formulao com Natrosol 250 HHR (absorvncia/minuto do tampo no meio
reacional foi igual a 0,0167 e da formulao base do gel de Natrosol 250 HHR igual
a 0,0182). A interferncia observada no foi suficiente para invalidar o mtodo da
atividade proteoltica das formulaes gis (Figura 15).

__________________________________________________________W|v________ 80
Os resultados da medida da atividade proteoltica da papana adicionada s
formulaes gis de Pluronic F127, gel de Carbopol 940 e gel de Natrosol 250
HHR mostraram baixa recuperao: 7,92%; 8,96%; e 0,63%, respectivamente
(Tabela 16).
A baixa recuperao observada pode ser devido ao aprisionamento da
molcula da enzima nas malhas do gel, que no se desfez totalmente durante a
preparao da amostra, dificultando o acesso do substrato macromolecular.
Borin (2003) observou uma recuperao de 70% da atividade da superxido
dismutase (SOD), adicionada formulao gel creme de Carbopol 940. Esse maior
nvel de recuperao obtido pode ser devido baixa massa molecular do substrato,
o nion superxido, comparado ao substrato utilizado nesse estudo, a casena. Esse
fator pode ser determinante na recuperao, j que o nion superxido pode
penetrar na malha do gel mais facilmente e reagir com a enzima, enquanto que a
molcula de casena, por ser bem maior, tem dificuldades de interagir com a
papana retida nas formulaes.
A baixa recuperao pode ser devida, tambm, s interaes qumicas da
enzima com os componentes das formulaes, proporcionando perda total da
atividade proteoltica, ou uma reduo da velocidade da reao enzimtica, de modo
que o tempo de dez minutos de incubao no tenha sido suficiente para atuao da
frao enzimtica ligada. Di Mambro (2004) em formulaes de gel de Natrosol
250 HHR adicionada de SOD obteve baixa recuperao da enzima. Vrias tentativas
de extrao da enzima, acompanhadas por medida do contedo de protena e
atividade enzimtica, foram executadas. A autora no detectou protena na frao
extrada, indicando interao entre a SOD e os componentes da formulao gel de
Natrosol 250 HHR.

__________________________________________________________W|v________ 81
Finalmente, a baixa recuperao da atividade proteoltica das formulaes
preparadas pode ser devido ao prprio procedimento metodolgico, uma vez que a
casena no hidrolisada precipitada, por ao do cido tricloractico. A
precipitao da casena associada com os agentes de consistncia poderia arrastar
os oligopeptdeos gerados durante a hidrlise do substrato, proporcionando menor
medida de absorvncia da frao sobrenadante, em 280 nm.
A baixa recuperao da papana das formulaes para o meio reacional no
indica, necessariamente, perda da eficincia proteoltica das formulaes in vivo. A
medida da atividade proteoltica das formulaes gis de Pluronic F127 e
Carbopol 940 in vitro sugere que essas formulaes apresentam uma frao do
contedo de papana livre que pode exercer prontamente o efeito proteoltico sobre
o tecido necrosado. A outra frao de papana, que pode ter interagido com os
componentes das formulaes, atuaria como um depsito da enzima, prolongando a
ao enzimtica, desde, claro, que essa interao no tenha determinado perda
da atividade proteoltica. Alguns trabalhos na literatura mostram que gis de
Pluronic F127 e Carbopol 940 aumentam a estabilidade das protenas,
prevenindo a adsoro em superfcies e inibindo a agregao, precipitao e
desnaturao dessas macromolculas (BAM; RANDOLPH; CLELAND; 1995;
ENGLAND, 1998; FANG et al., 2002; MORISHITA et al., 2001; RAICHE; PULEO,
2003). Alm disso, o Pluronic F127 tem sido utilizado para veicular protenas em
formulaes de liberao controlada, diminuindo, assim, a velocidade de liberao
delas a partir das formulaes (MORISHITA et al., 2001; RAICHE e PULEO, 2003).
As formulaes gis podem ter efeito proteoltico e de hidratao mais
prolongados

que

as

formulaes

extemporneas.

Quando

formulao

extempornea utilizada, a troca de curativo ocorre, geralmente, a cada 12 horas,

__________________________________________________________W|v________ 82
proporcionando sofrimento do paciente, risco de contaminao e aumento de
trabalho na enfermaria. Com o uso de formulaes gis, a troca de curativo poderia
ser a cada 24 horas.
As formulaes gis de Pluronic F127 e de Carbopol 940 foram avaliadas
quanto uniformidade de contedo da papana (Tabela 17). Os resultados indicaram
homogeneidade de contedo do princpio ativo nas formulaes e a reprodutibilidade
da frao de papana recuperada no meio reacional.
Na adequao do mtodo foi avaliada a diferena da interferncia na leitura a
280 nm da suspenso formada pela diluio de 1 grama de formulao em 25
gramas de gua destilada e quando a mesma foi submetida a centrifugao,
utilizando apenas o sobrenadante para prosseguir a reao. Os resultados
mostraram que no h diferena significativa entre as leituras da suspenso e do
sobrenadante na recuperao da atividade da enzima para as trs formulaes gis.
Esses resultados favorecem a hiptese de que a poro relativa atividade
recuperada aquela de papana livre na suspenso da formulao em gua.
Quando foram realizados os mesmos testes com formulaes contendo 3% de
papana, h um aumento significativo da atividade recuperada, porm no h
diferena significativa entre centrifugar ou no a suspenso. Esse teste s pode ser
realizado com as formulaes de Carbopol 940 e Natrosol 250 HHR, devido
precipitao do ativo na formulao de Pluronic F127, j citada anteriormente. A
diferena entre as formulaes contendo 1% e 3% de papana, foi de 42 unidades
de atividade por grama de formulao gel de Carbopol 940, e de 26 unidades de
atividade por grama de formulao gel de Natrosol 250 HHR. O aumento da
atividade recuperada era esperado diante dos indcios de que a poro livre de
papana seria a responsvel por tal atividade, visto que, aumentando a quantidade

__________________________________________________________W|v________ 83
de enzima, o meio ficaria saturado, obtendo, assim, uma poro maior da protena
livre na suspenso.
Os parmetros de temperatura e umidade relativa do ar para os estudos de
estabilidade foram afixados como 4C, 30C/70% UR e 40C/70% UR, j que o
Brasil se encontra na Zona Climtica IV (quente e mida) (USP XXIX, 2006; SINGH,
1999a, 1999B). BRASIL (2005) recomenda que as cmaras climticas devam ser
requalificadas para umidade de 75% a partir da data de publicao da ResoluoRE n 1 (29 de julho de 2005), ficando a critrio dos pesquisadores reiniciar ou no
estes estudos. Os estudos de estabilidade desse trabalho foram mantidos com a
umidade relativa previamente determinada (70%).
A estabilidade da atividade proteoltica da papana matria-prima A e B, e da
frao de papana livre nas formulaes gis Pluronic F127 e Carbopol 940, foi
avaliada pelo mtodo validado de medida de atividade proteoltica e que demonstrou
ser adequado para os ensaios de estabilidade. As dosagens de atividade enzimtica
foram realizadas para as matrias-primas e formulaes estocadas a 4C, 30C/70%
UR e 40C/70% UR. Os resultados para as matrias-primas esto demonstrados na
Figura 14 e Tabelas 12 e 13. Os dados obtidos para as formulaes encontram-se
na Figura 17.
A perda de atividade proteoltica ocorreu mais acentuadamente nas
temperaturas de 30C/70% UR e 40C/70% UR, tanto para as matrias-primas,
quanto para as formulaes. Os dados da Figura 17 sugerem que, a 30C/70% UR,
a enzima na forma de matria-prima menos estvel que a papana adicionada s
formulaes. Esses resultados diferem daqueles obtidos por Borin (2003) para a
SOD, nos quais a matria-prima apresentou-se mais estvel que a enzima
adicionada formulao. Essa diferena pode ser devido ao fato de que a SOD

__________________________________________________________W|v________ 84
matria-prima estabilizada com polietilenoglicol. Comparando os resultados de
estabilidade para a papana matria-prima e em formulaes queles obtidos para a
SOD, notada a maior estabilidade da SOD, tanto em matria-prima, quanto em
formulaes. Isso confirma, mais uma vez, a importncia da estabilizao de
protenas para veiculao em formulaes.
Os estudos de estabilidade das formulaes contendo papana por avaliao
visual acompanham os resultados de perda de atividade, pois h o escurecimento
da formulao, que pode estar relacionado deteriorao da enzima com o tempo e
o aumento da temperatura, provavelmente devido a uma oxidao dos grupos
sulfidrila da papana (Figura 16). Isso se aplica tambm matria-prima pura, pois,
aps 30 dias estocada a 40C, o p escurece consideravelmente, e, aps 60 dias, o
p se liquefaz, liberando um odor caracterstico de enxofre, o que implica em
destruio das ligaes dissulfeto que a estabilizam enzima, como afirmaram Hwang
e Yvy (1951). A Figura 12 mostra o escurecimento da matria-prima papana a
40C, por um perodo de 30 dias.
Estudos esto sendo feitos para a estabilizao da molcula de papana de
diversas maneiras, como a reao com polietilenoglicol, por imobilizao, e at
mesmo por obteno de uma molcula mais estvel utilizando a tecnologia do DNA
recombinante (LEI et al., 2004; ZHUANG; BUTTERFIELD, 1992; WANG, 1999).
Os resultados dos estudos de estabilidade indicam que tanto a papana
matria-prima, quanto as formulaes adicionadas da enzima, foram estveis por 6
meses, armazenados a 4C, sendo o gel de Carbopol 940 o que proporcionou
maior estabilidade da enzima (Figura 16).
As diferentes formas como a papana pode ser usada para o desbridamento
de feridas de queimaduras, como o p, soluo aquosa e adicionada formulaes,

__________________________________________________________W|v________ 85
foram avaliadas quanto eficcia da sua ao proteoltica in vitro, quando aplicadas
topicamente.
O mtodo desenvolvido em nosso laboratrio teve como princpio a
capacidade da papana de hidrolisar protenas. A protena utilizada como substrato
foi a gelatina. Um gel de poliacrilamida contendo a gelatina foi desenvolvido baseado
em estudos de eletroforese, pois uma placa contendo apenas gel de gelatina no se
manteve fisicamente estvel, quando submetida s condies do ensaio (banhomaria a 37C). O princpio da colorao de protenas nos gis de eletroforese definiu
a forma de avaliao da ao proteoltica da enzima sobre o gel, ou seja, nos locais
onde a papana agisse, no seriam corados pelo Coomassie Brilliant Blue, que
capaz de complexar com protenas em quantidades de microgramas (VOET, 1995).
O tempo de durao do ensaio foi definido em testes preliminares, sendo
avaliados os tempos de 6, 12 e 24 horas, que so os tempos mdios de trocas de
curativos em hospitais e unidades bsicas de sade. O tempo de 6 horas foi
suficiente para a ao da papana, que no aumentou significativamente em 24
horas. Alm disso, o gel tende a ressecar-se a 37C por mais de 6 horas, sendo uma
limitao desse mtodo de anlise.
Os resultados mostraram que o mtodo permite a avaliao da ao
proteoltica da papana pura e veiculada em diferentes formulaes.
A figura 18 mostra que a formulao gel de Carbopol 940 contendo papana
foi mais eficaz do que a formulao gel de Pluronic F127, formulao
extempornea e o p. Nos dois ltimos casos, observou-se um maior ressecamento
do gel, o que explica sua menor eficcia, j que a papana necessita de gua para
degradar as protenas (KIMMEL; SMITH, 1970; NIIMAK et al., 1993).

__________________________________________________________W|v________ 86
Os gis contendo papana mostraram-se eficazes, porm os melhores
resultados foram obtidos com o gel de Carbopol 940. Esses resultados diferem
daqueles obtidos para o mtodo usando casena como substrato, que indicaram que
a atividades proteolticas recuperadas das duas formulaes so muito semelhantes.
Provavelmente, essa diferena acontece porque na hidrlise da casena, a reao
ocorre em um tempo de 10 minutos, e na avaliao da eficcia da ao tpica, em 6
horas, sugerindo que ocorre, alm da ao da papana livre, uma maior liberao da
enzima pelo gel de Carbopol 940, do que foi liberado pelo gel de Pluronic F127.
A maior interao desse gel com a papana pode ter ocorrido por ligaes de
hidrognio entre a protena e o polmero (FLORENCE; ATTWOOD, 2003),
principalmente porque a concentrao do Pluronic F127 na formulao (20%)
muito maior do que a concentrao do Carbopol 940 na outra formulao
(0,6%).Alm disso, observa-se que esse gel limitou-se ao local de aplicao,
enquanto que o gel de Pluronic F127 no teve o mesmo comportamento, j que
tem menor viscosidade que o primeiro.
As afirmaes de que os polmeros dos gis interagem com a papana e que
parte da atividade proteoltica recuperada seja devido quantidade de papana livre
nas formulaes, so mais fundamentadas a partir do teste de eficcia proteoltica in
vitro. Pode-se questionar, portanto, a utilizao de formulaes muito concentradas
de papana (3%, 4% e 8%), j que, para veicular a enzima nestas concentraes,
no ser possvel utilizar o Carbopol 940 a 0,6% e nem o Pluronic F127, que
perdem a estabilidade fsica, reduzindo a viscosidade do primeiro e formando
precipitado na formulao gel de PF-127. Para isso, a formulao deveria ter a
concentrao de Carbopol 940 aumentada, aumentando, assim, a probabilidade

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de interao da protena com o polmero, e, apesar de a papana estar em maior
concentrao, no necessariamente a formulao ser mais eficaz.
O gel de Carbopol 940 demonstrou ser a forma farmacutica mais adequada
para a veiculao da papana. Formulaes gel desse polmero contendo diferentes
concentraes de papana so desenvolvidas e utilizadas no Hospital das Clnicas
de So Paulo (HCSP), em todos os seus institutos, para o tratamento de escaras de
decbito, principalmente, feridas e queimaduras. BORI (2006), afirma que o
consumo do gel de papana aumentou significativamente em 2006 no HCSP e que,
no servio de farmacovigilncia do Instituto do Corao (InCor) desse hospital, ainda
no recebeu nenhuma notificao de reao adversa a esse medicamento. Esse
relato indica que o uso de gel de Carbopol contendo papana eficaz e seguro.
Estudos de controle de qualidade e estabilidade microbiolgica das
formulaes devero ser realizados, a fim de avaliar a provvel ao antibacteriana
da papana e, assim, determinar a necessidade de adicionar conservantes s
formulaes.
O desenvolvimento de formulaes tpicas contendo papana importante
para a qualidade da assistncia ao paciente, seja no atendimento ambulatorial, seja
no hospitalar. A avaliao da qualidade das matrias-primas contendo papana
imprescindvel para determinao da concentrao da mesma nos produtos, a fim
de desenvolver um medicamento eficaz e seguro. Sendo assim, fabricantes de
produtos contendo essa enzima devem, tambm, qualificar seus fornecedores e, em
contrapartida, deveria haver discusses com os rgos de Vigilncia Sanitria, e,
principalmente, com a Anvisa (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria), acerca da
necessidade de constar nos laudos de controle de qualidade das matrias-primas o
teor de protenas.

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Alm da melhoria da qualidade da assistncia ao paciente, o desenvolvimento
de formulaes contendo papana reduz os riscos ocupacionais que ocorrem,
comprovadamente, com a exposio ao p de papana, seja na aplicao do
mesmo, seja no preparo de pastas e solues extemporneas nas enfermarias, o
que pode ser evitado em uma estrutura adequada de manipulao e produo de
medicamentos, como as farmcias e indstrias (CHAMBERS et al., 1998; FL et al.,
2006; MAPP, 2001; NIINIMKI et al., 1993; QUIONES et al., 1999; SOTO-MERA et
al., 2000; VANDENPLAS; VANDEZANDE, 1996). Adicionalmente, a formulao
pronta facilitaria a prestao de servios pela equipe de sade, podendo ser
acondicionada em embalagens de uso individual, como bisnagas, favorecendo a
aplicao do produto e evitando erros de medicao, j que os riscos de erros na
preparao do medicamento extemporneo sero eliminados. A administrao de
uma formulao acondicionada em embalagem de uso nico tambm favorece o
paciente, evitando que a mesma seja contaminada. Outra vantagem da formulao
em relao soluo extempornea que, na aplicao das mesmas, a formulao
fica delimitada rea em que foi aplicada. O uso da embalagem do tipo bisnaga a
melhor opo, visto que no ser necessrio o uso de esptulas ou o contato da
mo de quem for administrar o medicamento com a ferida, minimizando a dor do
paciente e o risco de contaminao cruzada entre os pacientes.
Assim, a formulao gel de Carbopol 940 contendo papana, desenvolvida
durante este trabalho, mostrou ter estabilidade fsica e funcional (atividade
proteoltica), quando armazenada a 4oC, por um perodo de 6 meses. Alm disso, foi
a que apresentou maior eficcia proteoltica no teste in vitro de eficcia para uso
tpico. Dessa forma, esta formulao poder ser empregada para auxiliar no
processo de cicatrizao de feridas e queimaduras, nos diferentes nveis

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assistenciais de sade (unidades bsicas de sade, clnicas e hospitais), com
garantia de eficcia, segurana, e qualidade de cada lote dos produtos, o que no
pode ser garantido quando preparaes extemporneas so empregadas.

__________________________________________________________Vvx________ 90
6. CONCLUSES

6.1.

o mtodo de dosagem que utiliza a casena como substrato para a papana


pode ser utilizado para a quantificao da atividade proteoltica da enzima
presente nas formulaes, pois as interferncias na dosagem da papana
que as formulaes base causam no influenciaram nos resultados, aps a
metodologia sofrer as devidas adaptaes;

6.2.

o mtodo de determinao da atividade proteoltica robusto e pode ser


facilmente empregado nos laboratrios de controle de qualidade de
farmcias de manipulao e indstrias;

6.3.

a condio mais adequada para a estocagem da matria-prima papana


sob refrigerao (4C);

6.4.

as formulaes preparadas contendo papana, no so fisicamente estveis


quando submetidas condies de armazenamento tais como temperaturas
de 30C e 40C;

6.5.

a condio mais adequada para a estocagem dos gis de Pluronic F127 e


Carbopol 940 contendo papana 1% (p/p) sob refrigerao (4C);

6.6.

o tempo de armazenamento dos gis de Pluronic F127 e Carbopol 940


contendo papana 1% (p/p) sob refrigerao (4C) de seis meses;

6.7.

as formulaes gis de Pluronic F127 e Carbopol 940 contendo papana


demonstraram ter eficcia (in vitro) para uso tpico;

6.8.

a formulao de Carbopol 940 a mais adequada para veicular a papana.

________________________________________________exyxv|t U|u|zy|vt________ 91
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