Engenharia Qumica

Microbiologia Experimental
Tcnicas de Contagem

Prof Flvia Duta

Alunos:
Luana Fafies
Mariana Magalhes
Rackel Silvestre
Thamiris Corra
Rio de Janeiro, 17 de Maio de 2016
1. Objetivos
Quantificar o nmero de colnias para diferentes diluies a
partir de uma suspenso de fermento biolgico utilizando tcnicas de
plaqueamento distintas e estimar o nmero de UFC/mL.
2. Introduo
2.1

Leveduras

Leveduras so micro-organismos cujo crescimento dominante se

d na forma unicelular, no possuem flagelos ou outros rgos de
locomoo. A reproduo assexuada por brotamento multilateral e
polar ou por fisso, e sexuada por meio de esporos. As caractersticas
morfolgicas das leveduras determinadas por microscopia mostram
formas esfricas e ovides, pra, cilndrica e mesmo alongadas em
pseudomiclio. Em geral, as clulas de leveduras so maiores do que
das bactrias, mas as menores leveduras no so to grandes como
as

maiores

bactrias.

Esses

microrganismos

variam

consideravelmente, no que se refere s suas dimenses, com limites

desde 1 a 5 de largura e 5 a 30 de comprimento. (KONEMAN;
ALLEN; JANDA et al., 2001; TORTORA; FUNKE; CASE, 2002).

Cada espcie tem uma forma caracterstica, mas, mesmo em

culturas puras, h considerveis variaes de tamanho e de forma
das clulas individuais, dependendo da idade e do ambiente.
Apresentam
vacolos,

partes

glbulos

visveis
de

como

gordura,

parede

grnulos

celular,
e

citoplasma,

ncleo

(CECCATO

ANTONINI,2000).
Devido importncia econmica dos processos biotecnolgicos
envolvendo a levedura Saccharomyces, na panificao, produo de
cerveja, vinho e outras bebidas alcolicas, querem como no caso no
Brasil, na produo de um combustvel alternativo e renovvel, tal
organismo pode ser considerado o eucaritico mais estudado e cujo
metabolismo o mais conhecido entre a espcie (AQUARONE; LIMA;
BORZANI, 2001).
Tendo em vista a importncia apresentadas pelas leveduras, as
linhagens

desses

micro-organismos

foram

sendo

selecionadas

segundo caractersticas desejveis ao processo e ao produto. A

produtividade e a eficincia de fermentao, a tolerncia ao etanol e
temperatura, a resistncia s altas concentraes de acares, a
habilidade de flocular e de produzir ou no certos componentes do
aroma das bebidas e a propriedade de produzir metablitos anticontaminantes so constantes fontes de interesse (HAMMOND, 1995).
Ceccato-Antonini (2004) adverte que alm da escolha e da
preparao do fermento, algumas condies timas devem ser
mantidas

durante

produtividade

processo

mxima

de

industrial

etanol

no

sentido

partir

dos

de

obter

acares

fermentescveis. Entre os parmetros a serem considerados, devem

figurar, o teor de fermento na dorna, a viabilidade celular, a
ocorrncia de infeces, o pH, a temperatura e a concentrao de
acares redutores totais no mosto. H, dessa forma, necessidade de
um rigoroso controle do processo de fermentao, envolvendo a
avaliao

dos

rendimentos

monitoramento microbiolgico.

prticos

simultaneamente

O estudo da reciclagem das leveduras durante o processo

industrial torna-se de vital importncia quando da anlise dos teores
de compostos txicos fermentao, visto que, se eles so
produzidos durante o processo e podem acumular-se no inculo
promovendo

perdas

de

viabilidade,

abaixando

eficincia

comprometendo a produtividade industrial (OKOLO, 1987).

Alm do rendimento industrial, outro ponto a ser considerado na
manuteno da viabilidade das leveduras, assim como da qualidade
desses micro-organismos a possibilidade de comercializao para
utilizao na nutrio de animais.
As

leveduras

renem

caractersticas

favorveis

para

seu

emprego como complemento nutricional animal principalmente pelo

alto contedo de nutrientes
facilmente assimilados pelo organismo e de alto valor nutricional,
sendo um excelente componente alimentar e de rpido crescimento
(COPYRIGHT, 2005).
Segundo dados da Embrapa (1991), a levedura de destilaria de
lcool de cana-de acar um alimento rico em protena de alto valor
biolgico e uma boa fonte de lisina, leucina, treonina, vitaminas do
complexo B, carboidratos, lipdios e minerais.
2.2

Contagem de Leveduras

Ceccato-Antonini (2004) explica que a estimativa de clulas

viveis importante tambm para estabelecer a tolerncia da
levedura ao seu produto.
Para estimar a proporo de clulas viveis, mtodos baseados
no plaqueamento ou observao microscpica tm sido utilizados. Os
mtodos de contagem direta no microscpio so rpidos e simples,
exigem um mnimo de equipamento, permitindo que seja observada,
simultaneamente, a morfologia celular (CECCATO-ANTONINI, 2004).
2.3

Contagem por plaqueamento

O mtodo de contagem de micro-organismos em placas um

mtodo geral e verstil que pode ser utilizado tanto para a contagem
de grandes grupos microbianos, como aerbios mesfilos, aerbios
psicrotrfilos, bolores e leveduras e clostrdios sulfito redutores, como
tambm para a contagem de gneros e espcies em particular, como
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens.
Variando

tipo

de

meio

(enriquecimento,

seletivo,

seletivo-

diferencial) e as condies de incubao (temperatura e atmosfera),

possvel selecionar o grupo, gnero ou espcie que se deseja contar
(SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA,1997).
A contagem-padro em placas determina o nmero de clulas
viveis expressa em unidades formadoras de colnias (UFC). Por este
mtodo

pores

de

amostras

so

homogeneizadas,

diludas

serialmente em um diluente apropriado, plaqueadas sobre ou dentro

de um meio gar adequado, o qual incubado sob temperatura
apropriada por um determinado tempo, conforme apresentado na
Figura 1. Aps o tempo estabelecido todas as colnias visveis so
contadas manualmente ou por um contador de colnias eletrnico
(JAY, 2005).
Considera-se que cada colnia crescida proveniente de um
micro-organismo vivel. A contagem preferencialmente feita dentro
do intervalo de 30 a 300 colnias para uma placa de 9 cm de
dimetro. O fator de diluio e o volume do inculo so considerados
para o clculo do resultado final (BORZANI, 2001).

Figura 1: Esquema explicativo do procedimento para execuo da tcnica de

diluies seriada e plaqueamento em placas e contagem. Fonte: adaptado de
Romeiro (2002).

mtodo

de

microbiologia

clssico

de

contagem

de

microrganismos viveis o da inoculao em placas de Petri

contendo meio de cultura adequado com incubao por um perodo
de at 72 horas, tempo que necessrio para conseguir contagem
mais precisa, mas em razo do tempo necessrio para a leitura, esse
mtodo no usado nas usinas.
Em razo deste obstculo, o mtodo padronizado e adotado
pelas usinas o descrito por Lee; Robinson; Wang (1981) que utiliza
azul de metileno como corante seguido de contagem em cmara de
Neubauer, usando um microscpio ptico, em aumento de 400X.
2.4

Contagem pela cmara de Neubauer

A Cmara de Neubauer consiste de uma lmina de microscopia,

bem mais alta do que uma lmina normal, onde existe uma cmara
gravada no vidro (as duas partes indicadas por setas no centro da
Figura 2 cada lmina contm geralmente duas cmaras). Ao lado da
cmara existem dois suportes (as duas barras cinza claras ao lado da
cmara na Figura 2) que mantm uma lamnula especial de quartzo
exatamente a 10-1 mm acima da base da cmara. Portanto, quando
se coloca uma soluo na cmara e se cobre a mesma com a

lamnula, a profundidade da soluo conhecida (LUCARINI; SILVA;

BIANCHI, 2004).

Figura 2- Cmara de Neubauer

No centro desta lmina existem vrias linhas perpendiculares

com marcaes em quadrantes. Ao analisar em microscpico com
aumento de 100x, pode-se perceber que existem trs tipos de
quadrantes, conforme ilustrado na Figura 3A, que juntos formam um
quadrado maior. No caso de contagem de leveduras os quadrantes
utilizados so os que esto dentro do crculo, de acordo apresentado
na Figura 3B. Em lminas padro esses quadrantes centrais totalizam
25. Cada quadrante composto por 16 retculos, como mostrado na
Figura 3C. Estes quadrantes so utilizados para fazer as contagens e
assim determinar a concentrao de clulas em um determinado
volume de amostra, e deste modo calcular a concentrao total de
clulas de leveduras.

Figura 3- Esquema do quadrante e retculos da Cmara de Neubauer

A tcnica de colorao com azul de metileno consiste na mistura

de partes iguais da suspenso de leveduras, se necessrio diluda, e
da soluo corante azul de metileno. As clulas com alta atividade
fisiolgica

no

se

colorem

enquanto

que

as

clulas

inativas

apresentar-se-o coloridas de azul. A porcentagem ou o nmero de

clulas viveis determinado transferindo-se com uma pipeta de
Pasteur a amostra para cmara de Neubauer (CECCATO-ANTONINI,
2004).
Na

literatura

existem

poucos

trabalhos

realizados

com

comparao entre
mtodos de contagens.
Os resultados apresentados por Castro; Cereda; Brasil (1982) que
compararam a contagem de leveduras viveis por plaqueamento em
Agar Batata com o de corante vital, usando azul de metileno e
eritrosina, em laboratrio, com levedura comercial, indicaram que
havia correlao entre o mtodo de plaqueamento e as contagens
pelos dois corantes, pois no diferiram entre si. Segundo esses
autores a seleo do corante seria apenas uma questo de acuidade
visual e preferncia pessoal.
Trevors et al. (1983), em trabalho com quatro linhagens de
Saccharomyces cultivadas em meio MYGP (extrato de malte, peptona
e glicose) e incubadas a 25C, utilizando oito mtodos para a
contagem de clulas, relatam que a contagem de clulas de levedura

com

corante

azul

de

metileno

em

cmara

de

Neubauer

proporcionou correlao aceitvel, comparando-se com a tcnica

padro de contagem em placa. Portanto esses mesmos autores
destacam

que

dependendo

do

objetivo

da

utilizao

desses

microrganismos principalmente em fermentaes em escala industrial

pode ser necessrio usar uma tcnica de contagem diferente para as
espcies ou variedades.
Logo Koch et al. (1986) advertem que a contagem de clulas de
levedura pela cmara de Neubauer em nveis mais baixos de
contagens, apresenta falta de preciso.
Apesar da importncia desta anlise, ela tem sido feita de forma
manual e
demorada que causa cansao visual, podendo levar impreciso, e
ainda exige um tcnico treinado. Entretanto essa tcnica apresenta
baixo rendimento e sujeito interferncia por acuidade visual.
O rendimento das usinas na produo do etanol pode ser
incrementado de forma considervel, com o incremento de um
sistema para a contagem automtica de clulas de leveduras viveis
e inviveis em imagens microscpicas digitalizadas.
2.5

Mtodo pour plate

O mtodo pour plate, ou semeadura em profundidade,

empregado para obter colnias isoladas pela mistura do inculo com
gar liquefeito resfriado e distribudo numa placa de Petri estril
(PELCZAR et al.; 1997). O inculo realizado diretamente na placa de
Petri. O meio nutritivo mantido em banho maria a 50C para impedir
a solidificao do gar e vertido sobre a amostra, seguido por um
perodo de agitao. Esta metodologia permite o crescimento das
colnias dentro do gar nutriente, assim como na superfcie da placa
de gar nutriente (TORTORA et al.; 2000).
2.6

Contagem automatizada

A automao j alcanou alguns setores da microbiologia

aplicada. So disponveis no mercado equipamentos que possibilitam
a contagem de clulas de leveduras de forma automtica, tais como o
1Nucleo Counter YC-100 da
empresa Chemometec da Dinamarca. O equipamento consta de um
microscpio de fluorescncia integrada, projetado para detectar sinais
do corante fluorescente, iodeto de propdio que se liga ao DNA da
levedura. Quando entra em contato com as clulas o iodeto de
propdio dissolvido e o DNA celular corado. Outro equipamento
disponvel o 2Vi-CELL um analisador de viabilidade celular fabricada
por Beckman Coulter, situada nos Estados Unidos. O Vi-CELL realiza
automaticamente a contagem utilizando o corante azul de tripan,
utilizando uma clula de fluxo contnuo e um sistema de anlise de
imagem. Um terceiro equipamento o 3Nalco Yeast Activity Monitor,
fabricado pela empresa americana National Aluminate Corporation,
este equipamento extrai sua energia de reao,atravs da reao
entre enzimas da levedura e das molculas de emisso bioqumica. O
equipamento dotado de uma sonda que colocada em contato
diretamente com a amostra preparada, proporcionando as taxas de
atividade metablica das leveduras.
Corra et al. (1990) realizaram a anlise de viabilidade de clulas
fngicas em amostras coradas com soluo de diacetato de
fluorescena e brometo de etdio, posteriormente examinadas em
microscpio de fluorescncia. Os autores concluram que o tempo de
colorao ideal foi de 30 minutos para que houvesse a perfeita
diferenciao entre clulas viveis e no viveis, no entanto, o
mtodo oneroso, apesar de se mostrar sensvel e simples.
A automao na anlise de amostras biolgicas foi tema do
trabalho

de

Lamprecht;

Sabatini;

Carpenter

(2007)

que

desenvolveram um software de cdigo aberto que pode reconhecer

as partculas por diferentes atributos das regies de interesse (ROI),
tais como a morfologia, cor, textura, entre outros, com diferentes
tcnicas de viso computacional.

Sharma et al., (2009) desenvolveram tecnologia para aplicaes

laboratoriais na rea farmacutica, que permitem a deteco e
reconhecimento de microorganismo dentro de fluidos.

3. Materiais

Autoclave

Tubos de Ensaio

Balo Volumtrico

gua Destilada

Fermento Biolgico

Pipeta Graduada

Ala de Drigalski

Placa de Petri

Bico de Bnsen

lcool Etlico 70%

Meio gar Sabouraud

4. Procedimento Experimental
4.1.

Preparao de uma srie de diluies decimais de uma

cultura da levedura Saccharomyces cerevisiae

Para preparao da diluio da cultura da levedura, os tubos de
ensaio contendo 9 ml de gua destilada, as pipetas e as placas de
petri utilizadas foram esterilizadas em autoclave a uma temperatura
de 120C a 1 atm durante 20 minutos.
Para uma diluio 1:100, pesou-se 1,0 g de fermento biolgico
que foi diludo em um bcher contendo 100 ml de gua estril. Com o
auxlio de uma pipeta estril foi retirado 1 ml da suspenso
microbiana, que ento foi adicionado ao primeiro tubo de diluio (10 1

). A cada diluio a soluo foi homogeneizada por agitao.

Aps a homogeneizao, com uma nova pipeta estril, retirou-

se 1 ml da primeira diluio, 10 -1, e a transferiu para outro tubo

contendo os 9 ml de gua estril para obteno da diluio 10 -2. Foi
realizado o mesmo procedimento para as diluies seguintes at a
obteno da diluio 10-6.

4.2.

Inoculao da cultura da levedura Saccharomyces

cerevisiae por espalhamento em meio slido

Para inoculao da levedura, foram selecionadas as trs ltimas
diluies da suspenso de fermento biolgico, 10 -4, 10-5 e 10-6. As
suspenses foram homogeneizadas por vagarosa agitao, para
prosseguir com a inoculao.
Trs placas de petri foram entreabertas e preenchidas com o
meio gar sabouraud prximas a temperatura de chama do bico de
Bunsen, que ento foram colocadas na bancada ainda prximo
chama at sua solidificao. Aps a solidificao, da mesma forma,

foram entreabertas e pipetadas com 1 ml de cada uma das trs

diluies.
Para espalhamento da suspenso na superfcie do meio,
utilizou-se um espalhador esterilizado pela chama do bico de Bunsen,
inicialmente introduzido em meio alcolico. Ento, cuidadosamente, o
espalhador foi passado pela superfcie do meio at uma possvel
identificao de resistncia a movimentao indicando a absoro do
inculo pelo meio. Aps o termino do espalhamento, as placas foram
incubadas temperatura ambiente por 1 semana.
4.3.

Inoculao da cultura da levedura Saccharomyces

cerevisiae por incorporao (pour-plate)

Para inoculao da cultura da levedura por incorporao, as trs
ltimas diluies, 10-4, 10-5 e 10-6 da suspenso do fermento biolgico
foram cuidadosamente agitadas e igualmente pipetadas, para trs
placas de petri entreabertas prximo a chama do bico de Bunsen. O
meio gar sabouraud fundido foi ento adicionado s placas e
delicadamente misturados com movimentos giratrios em forma de 8.
Da mesma maneira, as placas foram incubadas a temperatura
ambiente por 1 semana.

5. Resultados e Discusses
5.1.

Mtodos de Contagem

O nmero de clulas totais podem ser contadas diretamente

com o uso de um microscpio a partir de amostras secas em lminas

ou amostras lquidas. As amostras secas podem ser coradas, pelo

mtodo de Gram, por exemplo, para aumento de contraste, enquanto
que para as lquidas so utilizadas cmaras especiais [1].
Apesar do uso do microscpio proporcionar a observao
morfolgica

dos

micro-organismos,

contagem

microscpica

apresenta algumas limitaes. Sem o uso de corantes especficos no

possvel distinguir clulas mortas de clulas vivas, cuja viabilidade
est relacionada com a integridade da membrana citoplasmtica. E se
amostra no estiver corada necessrio o uso de microscpios de
contraste de fase, entre outras [1].
Em muitos casos, o objetivo principal somente a contagem do
nmero de clulas viveis. Assim, o mtodo da contagem em placa
pressupe que cada clula capaz de se multiplicar originando uma
colnia em um meio slido adequado para o micro-organismo de
escolha, sendo o nmero de colnias e o nmero de clulas
proporcionais [2].
De acordo com o mtodo, cada colnia deve ser originada a
partir de uma nica clula vivel, o que nem sempre acontece. Nas
prprias placas foram observadas colnias agregadas formadas por
duas

ou

mais

clulas

consequentemente

de

tamanhos

diferenciados.
Foram utilizados dois mtodos para a contagem das colnias. O
mtodo de inoculao por espalhamento ou spread plate, no qual o
crescimento das colnias ocorre exclusivamente na superfcie, em
razo da amostra ser espalhada no meio de cultura j solidificado.
O tempo de solidificao importante, pois caso a superfcie
esteja muito mida, a absoro da suspenso dificultada e as
clulas acabam se deslocando. Volumes de amostra superiores a 0,1
mL devem ser evitados, j que o excesso no absorvido provocando
aglutinao das clulas e dificultando a contagem [1].
No mtodo de inoculao em profundidade ou pour plate, o
meio de cultura vertido ainda fundido, e somente aps a adio da
supenso na placa. Isso permite que os micro-organismos cresam na

superfcie e abaixo desta. O meio e a suspenso devem ser bem

misturados, porm com movimentos delicados para no comprometer
o crescimento das colnias, que assumem formas no arredondadas,
o que foi tambm observado em uma das placas.
Ao utilizar esta tcnica deve-se saber de antemo se o microorganismo suporta a temperatura no qual o meio se liquefaz, e se
meio de cultura for vertido na placa ainda muito quente as clulas
podem ser inviabilizadas. O ideal trabalhar com o meio em torno de
45 a 50 C [2].
Seja qual for a metodologia utilizada, por espalhamento ou em
profundidade, os resultados so normalmente expressos em Unidades
Formadoras de Colnias (UFC).
5.2.

Diluio da Suspenso

O ponto mais crtico desta prtica est relacionado com o

preparo da suspenso, ou seja, o quanto de fermento deve ser
solubilizado para uma dada quantidade de gua, visto que as
diluies so feitas com base na amostra a ser quantificada antes de
realizar os plaqueamentos.
Se aps o perodo de incubao for obtido uma distribuio
uniforme das colnias, a contagem em placa oferece resultados mais
precisos quando comparado com a contagem miscroscpica. Como
erros experimentais esto envolvidos, o valor de UFC/mL calculado
baseado em uma estimativa, no qual o nmero de colnias no pode
ser muito elevado, pois as clulas sem agrupam induzindo erros de
contagem, e nem muito baixo, pois a importncia estatstica da
contagem reduzida. O ideal selecionar placas que possuam entre
30 e 300 colnias buscando reduzir ao mximo os erros embutidos na
metodologia [1,6].
No entanto, chegar nessa faixa de valores uma das maiores
dificuldades do mtodo. Durante a primeira prtica foram pesados 15
mg de fermento biolgico para 100 mL de gua estril, o que

impossibilitou a contagem e a repetio do experimento foi inevitvel.

J na prtica seguinte, o valor foi reduzido para 1 g em 100 mL de
gua estril, porm, ainda assim, gerou-se placas com mais de 1000
colnias.
Partindo de uma suspenso original mais diluda consegue-se
reduzir o nmero de dilues sucessivas necessrias, economizando
tempo, alm de resultar em uma contagem mais confivel.

5.3.

Contagem das Colnias e Determinao do Nmero de

UFC/mL
Uma das formas de minimizar os erros de contagem realizar o
procedimento em triplicata ou duplicata sempre que possvel, assim
como usar pipetas distintas para cada etapa da diluio. A utilizao
de nica pipeta pode acarretar problemas de diluio, mesmo que
mnimos, pois arrasta para os tubos seguintes pequenas quantidades
da suspenso mais concentrada aumentando a quatidade de clulas
disponveis no inculo e consequentemente no nmero de colnias
que so geradas.
Mesmo com as tcnicas executadas corretamente, o nmero de
colnias ainda depende de outros fatores como quantidade de
inculo, da qualidade e do preparo do meio de cultura e das
condioes de incubao (tempo e temperatura) [1].
O quadro 1 mostra o nmero de colnias contadas para as trs
ltimas diluies e os respectivos mtodos de plaqueamento.
Quadro 1 - Nmero de colnias obtidas aps a contagem

Diluio
1x10-4
1x10-5
1x10-6

Contagem (Colnia/Placa)
Spread Plate
Pour Plate
1.132
407
161
226
133
1068

Cada colnia que pode ser contada chamada de unidade

formadora de colnia. Por extrapolao, este nmero pode ser usado
para calcular o nmero de UFC na amostra original. De maneira geral,
para encontrar o nmero de unidade formadora de colnias por mL, o
nmero de colnias (referente uma placa que contenha entre 30 e
300 colnias) multiplicado pelo fator de diluio da placa escolhida.
Como o resultado dado em mililitro, no caso de uma alquota de 0,1
mL, necessrio multiplicar o resultado encontrado por 10 [7].

Spread Plate:
UFC /mL=n de colnias x 10 x Fator de diluio

Quando duas diluies consecutivas apresentam contagem

dentro do padro, calcula-se o nmero de UFC para cada diluio, os
resultados devem ser expressos com o mesmo exponte, e estes so
comparados. Se um dos resultados no ultrapassar o dobro do outro,
ambos os valores so considerados e o resultado final a mdia das
contagens. Caso um dos resultados seja maior que o dobro do outro,
considerado apenas a menor contagem [5].
UFC
=161 x 10 x 105 =1,61.108
mL

UFC
=133 x 10 x 10 6=13,3.10 8
mL
13,3.10 8>1,61. 108 x 2=3,22. 108
UFC /mL=1,33.109

Pour Plate:

UFC /mL=n de colnias x Fator de diluio

Se a contagem foi feita em uma placa inoculada com diluio a

10-1 ou maior, e sem duplicata, escolher a placa com nmero de
colnias entre 30 e 300 e efetuar o clculo. Como o volume da
alquota era de 1 mL no necessrio o fator de correro [5].
UFC
5
7
=226 x 10 =2,26. 10
mL

Nota-se pelo quadro 1, e pelas figuras 4, 5 e 6, que para o plaqueamento em

superfcie, o nmero de colnias diminui na medida em que o fator de diluio aumenta.
Assumindo que as diluies foram feitas nas melhores condies possveis e que a fonte
das alquotas a serem inoculadas possuem a mesma procedncia, era esperado que essa
tendncia se repetisse para a mtodo por incorporao. Contudo, este comportamento
numrico no constatado sugerindo uma possvel contaminao.

Entretanto, visualmente, ntido a reduo do nmero de colnias de uma placa

para outra, como pode ser visto nas figuras 7, 8 e 9. Assim, no pode ser descartada a
possibilidade de inverso na hora de nomear as placas. Se isto de fato ocorreu, o quadro
1 deve ser apresentado conforme o quadro 2:
Quadro 2 - Quadro 1 corrigido

Diluio
1x10-4
1x10-5
1x10-6

Contagem (Colnia/Placa)
Spread Plate
Pour Plate
1.132
1068
161
407
133
266

Por conseguinte, o clculo para determinao do nmero de

UFC/mL tambm ser alterado para o mtodo pour plate.
UFC
=226 x 106=2,26. 108
mL

Figura 4 - Spread Plate Diluio 10-4

Figura 5 - Spread Plate Diluio 10-5

Figura 6 - Spread Plate Diluio 10-6

Figura 7 - Pour Plate Diluio 10-6

Figura 8 - Pour Plate Diluio 10-4

Figura 9 - Pour Plate Diluio 10-5

5.4.

Comparao entre os Mtodos Quanto ao Crescimento das

Leveduras.

Os meios de cultura slidos imobilizam as clulas, que crescem

originando massas isoladas e vsiveis, permitindo que a pureza da
cultura seja observada [1].
As colnias podem exibir vrias formas e tamanhos, podendo
ser

coloridas

devido

produo

de

pigmentos.

Os

fungos

filamentosos formam colnias rugosas diferentemente das leveduras,

que apesar de eucariontes so unicelulares, assim como as bactrias,
dando origem colnias lisas brilhantes e de bordas regulares [2]. As
colnias

de

Saccharomyces

cerevisiae

apresentaram

as

caractersticas macroscpicas citadas na literatura, alm de uma

colorao esbranquiada.
Os
presena

micro-organismos
de

oxignio.

Os

podem

ser

aerbios

classificados
requerem

quanto

oxignio

para

crescimento, podendo crescer mais lentamente se este for limitado.

Os facultativos so aqueles que crescem na presena de ar
atmosfrico, porm crescem tambm em anaerobiose. Os anaerbios
estritos podem ser mortos na presena de O 2, no crescem na
presena do ar e no utilizam oxignio para as reaes de produo
de

energia.

Anaerbios

aerotolerantes,

que

toleram

pequanas

quantidade de oxigno, porm sem utiliz-lo. E os microaerfilos, que

utilizam o oxignio, mas o contrrio dos aerbios, no resistem aos
nveis de O2 presentes na atmosfera [2].
De posse dessas informaes pressupe-se que o mtodo de
inoculao em superfcie pode ser utilizado para micro-organismos
aerbios e facultativos, equanto que o mtodo em profundidade pode
ser utilizado para os micro-organismos microaerfilos, pois abaixo da
superfcie fornecido um ambiente deficiente em oxignio, porm
isso no impede que micro-organismos aerbios ou facultativos
cresam na superfcie onde h maior disponibilidade de O2.
Os micro-organismos anaerbios, por sua vez, precisam de uma
atmosfera livre de oxignio. Para isso, so utilizadas incubadoras
especiais chamada de camra de anaerobiose. A atmosfera no

interior da camra uma mistura de hidrognio, dixido de carbono e

nitrognio. Qualquer resduo de O2 removido pela reao com o H 2
na presena do paldio como catalisador [2].
A Saccharomyces cerevisiae uma levedura facultativa, ou
seja, possui a capacidade de se ajustar metabolicamente tanto em
condies de aerobiose quanto de anaerobiose. Aps a gliclise, as
molculas de glicose so transformadas em piruvato atravs de uma
srie de reaes catalisadas por enzimas. Na presena de oxignio, a
Saccharomyces cerevisiae realiza respirao aerbia e o produto final
CO2 e H2O. Em situao de hipxia ou de total ausncia de oxignio,
esta levedura no capaz de efeturar a respirao anaerbia e como
alternativa realizam fermentao alcolica, e o piruvato convertido
em etanol e CO2 [4].
A capacidade da levedura de fermentar o acar em etanol no
implica a capacidade de crescer em condies anaerbicas. Na
verdade, a maioria das leveduras facultativas no crescem bem na
ausncia completa de oxignio nem mesmo em meio complexos.
Logo, o oxignio um importante fator na regulao do metabolismo
do acar nos fermentos [3].
Na presena de altas concentraes de oxignio, as leveduras
crescem eficientemente, pois a produo de energia muito maior e
novas clulas so formadas. Entretanto, em situaes de hipxia a
produo de novas clulas reduzida [2].
Com este embasamento terico, no mtodo pour plate, era
previsto maiores quantidades de colnias na superfcie, visto que
abaixo desta a quatidade de oxignio dissolvido no meio limitado e
a multiplicao das clulas no to efetiva. Pelas mesmas
justificativas, tambm era esperado um maior crescimento das
clulas de levedura no mtodo por espalhamento quando comparado
diretamente com o mtodo anterior. Porm, conforme o quadro 1,
este no foi o resultado obtido.
6. Concluso

A partir dos resultados encontrados, pode-se concluir que a

diferena identificada no nmero de colnias, ou clulas viveis, para
os mtodos de inoculao por espalhamento e de inoculao em
profundidade no se deve erros de preparo da suspenso do
fermento biolgico nem de suas diluies, pois para o mtodo de
espalhamento em superfcie, o resultado se apresentou coerente com
relao s diluies, ou seja, obteve-se a diminuio do nmero de
colnias com o aumento da diluio.
Por outro lado, o resultado para o mtodo de inoculao em
profundidade se apresentou incoerente, que alm de ter sido obtido o
aumento do nmero de colnias com o aumento da diluio, o
nmero se demonstrou aleatrio. Como a diferena no nmero de
colnias nas trs placas pode ser observado a olho n, o erro por
contagem no pode ser considerado. Dessa forma, uma possibilidade
para tal erro est no momento de identificao das placas, um erro do
operador.
Cabe-se ressaltar, que ainda que fosse gerado um resultado no
aleatrio mas da mesma forma invertido para o mtodo de inoculao
em profundidade, nada se pode concluir sobre tal mtodo pois a
levedura Saccharomyces cerevisiae classificada como anaerbia
facultativa,

no

sendo

afetada

pela

quantidade

de

oxignio,

permanecendo com um resultado no esperado para o experimento.

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