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OBJECTIVOS ESPECÍFICOS
1. Inserir um “Tag” numa sequência de um cDNA específico.
2. Subclonar este fragmento modificado do gene Cerl2 de ratinho no vector plamídico
de expressão pCS2+.
3. Transformar a estirpe XL-1 de E. coli com o DNA recombinante e seleccionar as
colónias transformadas.
4. Induzir a expressão/inactivação desta proteína recombinante em Reticulócitos de
coelho .
5. Análise de proteínas em gel de poliacrilamida.
Objectivos
Adquirir experiência em:
• isolar DNA plasmídico em pequena escala.
• utilizar enzimas de restrição e DNA ligase.
• transformação de bactérias
• sequenciação de DNA
• produção/inactivação de proteínas em bactérias.
• visualisação de proteínas em geis de poliacrilamida.
• planeamento de experiências e interpretação de resultados.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho isolar o vector plasmídico contendo o cDNA (pBS-Cerl2;
ver Anexo 3 e 4), que estão presentes em células transformadas de E. coli.
Introdução
Existem vários métodos de extracção de DNA plasmídico. O método utilizado neste
trabalho consiste numa modificação do método de lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979).
O processo, que permite a extracção de DNA plamídico de células de bactéria, consiste
em provocar a lise destas numa solução fortemente alcalina (de hidróxido de sódio)
contendo SDS (dodecil sulfato de sódio). Esta solução causa simultaneamente a
dissolução da membrana plasmática, a desnaturação de macromoléculas (proteínas e
DNA) e a hidrólise do RNA. As macromoleculas são depois precipitadas por adição de
acetato de potássio (KAc), e devido ao pH ácido desta solução o pH do lisado é
neutralisado. O reequilíbrio do pH permite a renaturação do DNA plasmídico,
restabelecendo a sua conformação original. O DNA genómico, devido às suas dimensões
e estrutura, não consegue voltar à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de
agregados complexos. Após a adição do KAc é pois possivel, por centrifugação, separar
um sedimento, constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico, de um
sobrenadante onde o DNA plamídico se encontra dissolvido. Uma desproteinização mais
profunda desse sobrenadante pode posteriormente ser levada a cabo utilizando-se uma
mistura de fenol-clorofórmio (1:1), de modo a obter DNA plasmídico suficientemente
puro e assim adequado a servir de substrato para os enzimas de restrição. No final, o
DNA plasmídico purificado é precipitado com etanol, seco sob vácuo, e ressuspenso em
tampão TE.
Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.
Em cada tubo:
Soluções:
TE:
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10 mM Tris
1 mM EDTA, pH 8.0
RESTRICÇÃO E ELECTROFORÉSE DE DNA DE PLASMÍDEO
Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) HindIII (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)
DNA p 1.0 0.5/0.5 ----- 1.5 11.5 15.0
DNA p 1.0 ----- 0.5 1.5 12.0 15.0
DNA p 1.0 ----- ----- 1.5 12.5 15.0
DNAp – DNA plasmídico
2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
Soluções:
NOTA: Para fácil referência, há uma dupla de bandas mais afastadas das outras, a 2,000 e
a 1,650 pb. A banda de 1,650 pb contém aproximadamente 10% do total de DNA
presente em todas as bandas.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho inserir um “tag” no porção 3’ do cDNA presente no vector
plasmídico pBS-Cerl2.
O método de PCR, introduzido inicialmente por Saiki et al. (1985) e Mullis & Faloona
(1987), foi utilizado para tentar obter uma ampliação selectiva de genes de interesse.
Este método utiliza uma enzima DNA polimerase termoestável para copiar in vitro uma
determinada região da molécula de DNA, região esta que é condicionada pelo uso de
pequenos “primers” que hibridam com locais individualizados dos cadeias de DNA
delimitando assim o fragmento a amplificar. Este técnica permite amplificar uma
molécula vários biliões de vezes em poucas horas (Eidne, 1991), sendo particularmente
útil quando se analisa tipos de mRNA pouco abundantes ou quando as quantidades de
tecido disponível são limitadas (Dallman & Porter, 1993).
O PCR é um processo cíclico em que os seguintes passos, são repetidos durante um
número determinado de vezes: A cadeia dupla de DNA é desnaturada por aquecimento,
obtendo-se duas cadeias simples; os primers introduzidos na reacção ligam-se com zonas
homologas em cada uma destas cadeias; a DNA polimerase cataliza a produção de novas
cadeias complementares. Cada uma destes ciclos, que demora apenas alguns minutos,
duplica a quantidade da DNA pretendida, deixando-a como uma cadeia dupla.
Os reagentes necessários são, para além da enzima, primers e DNA, nucleótidos livres
(dNTP) para construção das cadeias e uma solução-tampão da reacção buffer, que
estabelece as condições óptimas para a enzima.
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O “tag” a adicionar, na região 3’’ do cDNA de Cerl2, vai codificar para o epitopo
designado “FLAG” (contra o qual existe um anticorpo monoclonal), cuja sequência de
aminoácidos é: DYKDDDDK. Para visualização do produto final pretendido ver Anexo5.
Objectivos:
• Aprendizagem da técnica PCR
• Adicionar uma sequencia de nucleotídeos ao cDNA de Cerl2 contido no
plasmideo pBS SK.
Protocolo
PRIMERS UTILIZADOS:
Primer Forward: T3 – AATTAACCCTCACTAAAGGG
Primer Reverse: cerl2-Flag-XhoI (5’CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCT
CCTCCTCCCAGCTTCGGGCGGCACTGACACTTCTGG-3’).
-------------------------------
2- O volume total das amostras obtidas pela reação de PCR são introduzidas no gel.
Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora.
13- Usar 2.0µl deste DNA + 1 µl de GLB + 7.0µl H2O. Correr em gel de agarose
para verificar a eficiência da extração.
Pretende-se agora digerir o produto de PCR e o vector de expressão pCS2+ com enzimas
de restrição de modo a que se possa proceder á clonagem do fragmento no novo vector.
Amostra DNA (ul) EcoRI (ul) XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)
PCR 10.0 1.0 1.0 2.0 6.0 20.0
DNA p 5.0 1.0 1.0 2.0 11.0 20.0
DNAp – DNA plasmídico pCS2+; PCR- fragmento de PCR.
2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
2- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da aula Prática 2, são
adicionadas introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a
100V durante 1 hora.
REACÇÃO DE LIGAÇÃO
TUBO PCR (ul) vector (ul) DNA ligase (ul) Buffer 5x (ul) H2O (ul) Total (ul)
Certas estirpes de E. coli podem-se tornar competentes para transformação com DNA
plasmídico através de tratamento com catiões, tais como Ca2+, Mn2+ ou Co3+. Uma
solução 0.1M de CaCl2 é utilizada frequentemente para este fim. O objectivo deste
trabalho é a obtenção de células competentes de E. coli para transformação genética.
1. Preparar uma cultura de E. coli em meio LB com uma densidade óptica a 550 nm
(A550) de 0.4-0.6, o que corresponde à fase logarítmica de crescimento. (Requer a
inoculação da cultura no dia anterior e diluição 1:500 no dia de utilização.)
1. Cada grupo vai fazer três transformações- com a reacção de ligação da Prática 3 , um
controlo constituído por células competentes com DNA circular e um controlo
constituído por células competentes sem DNA. Descongelar/utilizar portanto, 3 tubos
com 200 µl de células competentes, no gelo.
2. Etiquetar cada tubo e adicionar 10.0µl do DNA ou H2O no fundo de cada tubo,
“mexendo” brevemente com a ponta. Incubar no gelo durante 30 min.
4. Adicionar 700 µl de meio SOC a cada tubo, e incubar a 37° C durante 45 min. Este é
o período de recuperação das células.
Meio de cultura LB
(1l):
Triptona 10 g
Extracto de levedura 5g
NaCl 10g
Cada grupo vai fazer 2 extracções (2 tubos Eppendorf iniciais) de duas colónias
individuais resultantes da reação de ligação/transformação da aula Prática 4.
Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)
DNA p 1.0 0.5/0.5 1.5 11.5 15.0
DNAp – DNA plasmídico
5- Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
7- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da no ponto 5, são
introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante
1 hora.
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA
recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag.
Introdução
A determinação da sequência de nucleótidos que compõem um fragmento de
DNA clonado representa um dos processos finais na análise de DNA. A capacidade de
sequenciar DNA rapidamente teve um impacto revolucionário na Biologia. Crucial para
os processos de sequenciação, foi o desenvolvimento de electroforese em gel de
acrilamida vertical que permite separar cadeias de DNA com centenas de nucleótidos e
com apenas um nucleótido de diferença entre elas (a mais ou a menos). O método
laboratorial mais comum de sequenciação de DNA, conhecido como o método de
Sanger ou método de terminação de cadeias. Este envolve a síntese de novo de uma série
de cadeias simples de DNA, usando como molde a cadeia de DNA que se quer
sequenciar. As cadeias sintetizadas são terminadas prematuramente nos vários tamanhos
possíveis. A síntese começa sempre num ponto definido (por um primer) e termina por
incorporação de nucleótidos terminadores. Estes são derivados didesoxi dos nucleótidos
normais que, não possuindo um grupo hidroxilo na posição 3’ da desoxirribose, impedem
as ligações fosfodiestéricas do DNA. Consequentemente, termina a incorporação de
nucleótidos à cadeia de DNA que está a ser sintetizada. Os quatro terminadores serão
abreviadamente designados ddA, ddC, ddG e ddT.
Um fragmento de DNA clonado num plasmídeo representa um substrato típico
para sequenciação. O primeiro passo é a separação (desnaturação) das cadeias de DNA.
Em seguida, um pequeno oligonucleótido primer (aproximadamente 20 resíduos) é
emparelhado numa zona adjacente ao DNA clonado, normalmente em sequências
conhecidas do plasmídeo. Uma DNA polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir
do primer.
Hoje em dia, para que o DNA fique marcado utilizam-se compostos que emitem
fluorescência a cores diferentes em cada um dos terminadores utilizados e depois são
analisados num aparelho chamado “Sequenciador Automático”. A função deste aparelho
é resolver as diferentes emissões que vão passando ao longo do tempo num detector
Laser e interpretar assim a sequência de nucleotides continda na amostra de DNA
analisada.
Este protocolo utiliza uma mistura de reacção (BigDye Terminator v1.1) que por adição
da amostra e primers especificos, permite a determinação da sequência de nucleótidos
após uma reacção de PCR e análise num Sequenciador Automático
TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA
recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag.
Pretendese depois utilizar este cDna recombinante num sistema de transcrição/tradução in
vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína e sua inactivação
por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos.
Introdução
Quando a região codificante de um cDNA é clonada num plasmídeo, adjacente a
um promotor, a respectiva proteína pode ser expressa in vitro por sistemas de transcrição
e tradução. Estes sistemas são menos eficientes do que a expressão in vivo, obtendo-se
muito menos proteína. No entanto, a proteína pode ser marcada por incorporação de
aminoácidos radioactivos, uma marcação que é específica e facilita a sua detecção. Nos
sistemas de transcrição são utilizados promotores víricos, como os dos fagos T7, T3 e
SP6, pois as RNA polimerases envolvidas actuam exclusiva e eficientemente nos
respectivos promotores. O mRNA, codificado pelo cDNA, é sintetizado numa reacção in
vitro que contém o plasmídeo recombinante isolado e a correspondente RNA polimerase
purificada. A transcrição na presença de nucleótidos radioactivos permite a marcação do
mRNA, com alta actividade específica, e a sua utilização como sonda em experiências de
hibridação. Alternativamente, o mRNA pode ser traduzido in vitro para produzir a
respectiva proteína. Os sistemas de tradução utilizam extractos celulares, como lisados de
reticulócitos de coelho, que contêm grandes quantidades de todos os componentes
necessários à síntese de proteínas. A utilização destes extractos celulares envolve um
tratamento prévio para destruir o mRNA endógeno que eles possuem. Assim, quando um
mRNA específico é adicionado aos extractos, como o obtido por transcrição de um
plasmídeo recombinante, apenas é produzida a proteína desejada. Estas proteínas
marcadas podem ser usadas em diversos tipos de experiências, tais como estudos de
processamento, interacções com outras proteínas ou moléculas, distribuição celular e
muitas outras.
Estes são compostos sintéticos de bases ribonucleicas. Isto confere bastante estabilidade a
estes pequenos oligos de RNA. Ver o WebSite http://www.gene-tools.com/.
Desenhando um oligo, normalmente 19-25 mer, com a sequência anti-sense do mRNA
que queremos inibir, este oligo ao emparelhar com o mRNA (Figura 1) vai impedir a sua
tradução a nivel dos ribossomas não havendo assim produção da respectiva proteína
(Figura 2). Este é um metodo que começa a ser cada vez mais utilizado em estudos de
actividae genética pois permite inferir de um modo bastante acessivel, o resultado da falta
de actividade de um determinado produto genético.
Figura 1
Figura 2
3- Parar a reacção de digestão juntando 5 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um
dos tubos.
4- Guardar a –20ºC.
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LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
TRABALHO PRÁTICO 8
TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO
Objectivos
Pretende-se com este trabalho determinar a eficiência do sistema de transcrição/tradução
in vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína recombinante e
sua inactivação por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos.
Introdução
As proteínas celulares constituem uma vasta classe de biomoléculas que
desempenham na célula funções muito diversas. Para analisar simultaneamente um tão
grande e variado grupo de compostos, é necessário recorrer a técnicas que utilizem uma
propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem
pequenas variações no seu comportamento, de modo a que as várias moléculas sejam
diferenciadas.
As técnicas de electroforese caem nesta categoria, e são largamente utilizadas pois
baseiam-se no facto de todas as proteínas apresentarem uma carga eléctrica global
quando colocadas num meio de pH diferente do seu ponto isoeléctrico. Deste modo é
possivel provocar a migração de proteínas sugeitando-as a um campo electrico. Essa
migração variará de acordo com a proteína, uma vez que é influenciada pelo tamanho,
carga, forma e composição química de cada molécula. Grosseiramente, pode-se
considerar que a migração electroforética duma molécula é apenas função da sua
densidade de carga, ou seja , da respectiva razão carga/massa. Assim as proteínas separar-
se-ão de acordo com o respectivo valor desta razão: quanto maior ela for, maior será a
velocidade de migração da molécula.
O gel em placa é, na realidade, constituido por dois geis: o gel de separação, no qual
as proteínas são separadas, e o gel de concentração (ou “stacking gel”), no qual se dá a
compressão da amostra antes desta entrar no gel de separação. Por isso se chama a este
sistema um sistema descontínuo. Devido à elevada resolução obtida com os sistemas
descontínuos, o sistema SDS-descontinuo (um sistema em que o detergente aniónico
dodecilsulfato de sódio é adicionado a todas as soluções), é normalmente escolhido para a
separação de elevada resolução de misturas proteicas. Nesta técnica as misturas são
primeiramente desnaturadas por aquecimento, a cerca de 100ºC, durante 2-5min, na
presença dum excesso de SDS e dum reagente tiólico (b-mercaptoetanol, que desfaz a
maior parte das ligações persulfureto presentes nas moléculas proteicas). O SDS liga-se
fortemente às proteínas desnaturando-as. Estudos realizados mostram que este detergente,
quando presente em largo excesso, liga-se às proteínas numa proporção constante de 1,4g
de SDS para 1g de proteína. Isto equivale aproximadamente a uma molécula de SDS para
cada dois resíduos de aminoácidos na proteína. Esta elevada taxa de ligação, e sendo as
moléculas de SDS carregadas negativamente, faz com que a carga intrínseca da proteína
se torne insignificante quando comparada com a carga total proveniente do SDS a ela
ligado. Simultaneamente, como esta taxa de ligação é constante, os diferentes complexos
SDS-proteína possuem densidades de carga essencialmente idênticas migrando , nos geis
de poliacrilamida, em função do respectivo valor de massa molecular. A separação de
uma mistura de proteínas no sistema SDS-PAGE é pois um reflexo da diferença dos
respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteína(s) em questão pode ser estimada
por comparação da respectiva mobilidade electroforética (Rf), com a de proteínas de
massa molecular conhecida (padrões).
1 2 3
1 – PROTEÍNAS PADRÃO
2 – mistura complexa
3 – proteína pura
220kDa -
160kDa -
97kDa -
54kDa -
18 kDa -
1. Limpe muito bem, com a mistura etanol-éter (2:1, v/v), todo o material de
electroforese, onde vai formar os geis (placas de vidro e de alumina, espaçadores
e pentes).
2. Monte as diferentes sanduíches, constituidas por duas placas (uma de vidro e
outra de alumina), intercaladas com um par de espaçadores. Coloque as molas
que apertam o sistema.
3. Introduza o pente na sanduíche até os dentes entrarem completamente e marque,
na placa de vidro, um traço 0,5cm abaixo do nível inferior do pente.
4. Prepare as soluções, de resolução e de concentração, sem adicionar os agentes
polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos
quadros 1 e 2.
(Atenção: a acrilamida é neurotóxica, portanto deve ser tomado o
cuidado máximo na manipulação das soluções deste composto. É
aconselhável o uso de luvas. Uma vez polimerizada a acrilamida não é
tóxica.)
5. Transfira a solução do gel resolvente para um goblet e adicione os agentes
polimerizantes (TEMED e PSA). Agite. Coloque imediatamente a solução, com
auxílio de uma pipeta e evitando a formação de bolhas, entre as placas de vidro
até à marca traçada préviamente.
6. Muito devagar, coloque com auxílio de uma seringa, um pouco de água destilada
sobre a superfície da solução do gel de resolução. (A água vai evitar que a
superfície de polimerização fique irregular).
7. Deixe em repouso até a acrilamida polimerizar (vísivel pela formação de uma
linha de interfase gel-água (demora cerca de 10min)).
8. Uma vez polimerizado o gel, inverta a sanduiche, de modo a escorrer toda a
água que se encontra na superfície do gel.
9. Transfira a solução do gel de concentração para um gobelet e adicione os
agentes polimerizantes TEMED e PSA. Agite. Deite imediatamente na
sanduiche até ao cimo (ou seja até começar a escorrer por fora).
10. Deixe em repouso até polimerizar (cerca de 15 min). (Aqui não é necessário
adicionar água para obter uma superfície de polimerização lisa).
11. Após o gel ter polimerizado retire o pente (com cuidado para não destruir os
poços).
1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo solução corante com azul
de Coomassie.
2. Deixe a corar durante 15-20min.
3. Retire o gel para outra caixa contendo água destilada. Escorra a água e lave
novamente com água destilada.
4. Escorra a água e adicine solução descorante. Agite durante 5-10min.
5. Repita o ponto anterior até observar nítidamente as bandas correspondendo às
várias proteínas.
6. Coloque o gel sobre um pedaço de papel de filtro grosso (3MM), cubra com
“Larfilm” e seque no secador de geis.
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Quadro 1 – Solução do gel de resolução
10ml
Tris-HCl 1.5M pH8,8 2,5ml
SDS 10% (p/v) 0.1ml
1
Sol. Acri-Bis 3.3ml
Água destilada 4.1ml
TEMED 6µl
PSA 10% (p/v) 20µl
1
Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)
TEMED 26µl
PSA 10% (p/v) 40µl
1
Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)
Soluções
Tampão para as amostras: 2ml glicerol, 1ml b-mercaptoetanol, 5ml SDS 10%, 2.5ml
tampão gel de concentração, 2mg azul de bromofenol.
Solução corante: Coomassie Blue R-250 0.3%, ácido acético 5%, metanol 25%.
Objectivos:
Execução:
ANEXO 1
ANEXO 2
ANEXO 3
ANEXO 4
G AAT
TCA ACT CTC AAG CTG CTT CCA GGA ACA GTA TAA AAA GCA GAC CTC
TGA GGG CCG CAC TCC ACA CAC TAG ACA GCA GGG CCC ACT GCG AAG
GAC CCT GAG CCC ATT TTA AGA CAA ACA GAC AAA CGA CTG CAC AGC
CAA GTG ATG TTC CGT AGC CAG TTC ACC ACG CTG CTG GGT CTG TTC
M F R S Q F T T L L G L F
AGT GGG GCC TGG CTA CCC ACA GGC TCA GGG AGG CCT GGG GCC CCA
S G A W L P T G S G R P G A P
GCG ACC CCT GTT CAG TCC GGG ACT GCT ATC AAT CAG AGC TGG ACT
A T P V Q S G T A I N Q S W T
CTG GAT CCC CTG GTG CCC ATC TCT GCC CTG GGT AGC TGG GAG GCC
L D P L V P I S A L G S W E A
TTC CTG GGC CTG CAG AAC AAA CAG CAG GGG ACA GGT GAG CTG CAG
F L G L Q N K Q Q G T G E L Q
GGA GGA GGG CAG AGA GTA GCT GCT GGT GTG CCT TTG CCC TTG GCT
G G G Q R V A A G V P L P L A
CCT CAA GAA GTG CTT CAG GAG ACT TGT AAA GCT CTG TCC TTT GTT
P Q E V L Q E T C K A L S F V
CAG GTG ATC TCC AGG CCT GGT TGC ACA AGT GCC CGG GTC CTT AAT
Q V I S R P G C T S A R V L N
CAT CTC TGT TTT GGC CGC TGT TCC TCC TTC TAC ATT CCC AGC TCA
H L C F G R C S S F Y I P S S
GAT CCC ACC CCT GTA GTC TTC TGC AAC AGC TGT GTG CCG GCT CGA
D P T P V V F C N S C V P A R
AAG CGC TGG ACA TCG GTG ACG CTG TGG TGT GGA GCT GGC CAA TTA
K R W T S V T L W C G A G Q L
GCC TCC CCT CGG CGG GTG AGG ATT TCC ACG GTA TTG GTC CAG AAG
A S P R R V R I S T V L V Q K
TGT CAG TGC CGC CCG AAG CTG TGA GCT GAG CAT CCT AGA GGA ATG
C Q C R P K L *
CGC AGG ACA TGA ATG AAC CTT GGC AAG AAG CAG GAG ACG CAA TAG
ATC TAG A
ANEXO 5
mCer2-flag cDNA
GAATTCAACT CTCAAGCTGC TTCCAGGAAC AGTATAAAAA GCAGACCTCT
GAGGGCCGCA CTCCACACAC TAGACAGCAG GGCCCACTGC GAAGGACCCT
GAGCCCATTT TAAGACAAAC AGACAAACGA CTGCACAGCC AAGTGATGTT
CCGTAGCCAG TTCACCACGC TGCTGGGTCT GTTCAGTGGG GCCTGGCTAC
CCACAGGCTC AGGGAGGCCT GGGGCCCCAG CGACCCCTGT TCAGTCCGGG
ACTGCTATCA ATCAGAGCTG GACTCTGGAT CCCCTGGTGC CCATCTCTGC
CCTGGGTAGC TGGGAGGCCT TCCTGGGCCT GCAGAACAAA CAGCAGGGGA
CAGGTGAGCT GCAGGGAGGA GGGCAGAGAG TAGCTGCTGG TGTGCCTTTG
CCCTTGGCTC CTCAAGAAGT GCTTCAGGAG ACTTGTAAAG CTCTGTCCTT
TGTTCAGGTG ATCTCCAGGC CTGGTTGCAC AAGTGCCCGG GTCCTTAATC
ATCTCTGTTT TGGCCGCTGT TCCTCCTTCT ACATTCCCAG CTCAGATCCC
ACCCCTGTAG TCTTCTGCAA CAGCTGTGTG CCGGCTCGAA AGCGCTGGAC
ATCGGTGACG CTGTGGTGTG GAGCTGGCCA ATTAGCCTCC CCTCGGCGGG
TGAGGATTTC CACGGTATTG GTCCAGAAGT GTCAGTGCCG CCCGAAGCTG
CCAGAAGT GTCAGTGCCG CCCGAAGCTG
TGAGCTGAGC
GGAGGAGGAG ATTACAAGGA TGACGACGAT AAGTGACTCG AGCGG
mcer2-flag-prot
MFRSQFTTLL GLFSGAWLPT GSGRPGAPAT PVQSGTAINQ SWTLDPLVPI
SALGSWEAFL GLQNKQQGTG ELQGGGQRVA AGVPLPLAPQ EVLQETCKAL
SFVQVISRPG CTSARVLNHL CFGRCSSFYI PSSDPTPVVF CNSCVPARKR
WTSVTLWCGA GQLASPRRVR ISTVLVQKCQ CRPKLGGGDYKDDDDK
ANEXO 6